CN111518822B - 一种硫酸软骨素abc裂解酶突变体及其分泌表达的方法 - Google Patents

一种硫酸软骨素abc裂解酶突变体及其分泌表达的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111518822B
CN111518822B CN201910588540.9A CN201910588540A CN111518822B CN 111518822 B CN111518822 B CN 111518822B CN 201910588540 A CN201910588540 A CN 201910588540A CN 111518822 B CN111518822 B CN 111518822B
Authority
CN
China
Prior art keywords
chondroitin sulfate
fermentation
culture medium
mutant
abc lyase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910588540.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111518822A (zh
Inventor
康振
张琳
堵国成
陈坚
王浩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN201910588540.9A priority Critical patent/CN111518822B/zh
Publication of CN111518822A publication Critical patent/CN111518822A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111518822B publication Critical patent/CN111518822B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/02—Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on polysaccharides (4.2.2)
    • C12Y402/0202—Chondroitin-sulfate-ABC endolyase (4.2.2.20)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/02—Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on polysaccharides (4.2.2)
    • C12Y402/02021—Chondroitin-sulfate-ABC exolyase (4.2.2.21)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种硫酸软骨素ABC裂解酶突变体及其分泌表达的方法，属于生物工程技术领域。本发明将普通变形杆菌来源的硫酸软骨素ABC裂解酶进行了定点突变，通过融合信号肽加强了其分泌表达，对表达酶的菌株进行了外膜蛋白敲除，并进一步提供了菌株的培养策略。

Description

一种硫酸软骨素ABC裂解酶突变体及其分泌表达的方法
技术领域
本发明涉及一种硫酸软骨素ABC裂解酶突变体及其分泌表达的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
硫酸软骨素，是共价连接在蛋白质上形成蛋白聚糖的一类糖胺聚糖。硫酸软骨素广泛分布于动物组织的细胞外基质和细胞表面，糖链由交替的葡萄糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺（又称N-乙酰氨基半乳糖）二糖单位组成，通过一个似糖链接区连接到核心蛋白的丝氨酸残基上。
硫酸软骨素表现出高的生物活性，如抗癌症、抗动脉粥样硬化作用、抗炎、免疫调节、抗氧化等，不仅在细胞转移、分化、增殖、识别以及组织形成等生物过程中起到了重要的作用，还应用于医药及临床。由于硫酸软骨素的分子量大，生物利用度低，在治疗脊柱损伤、轴突再生、抑制肿瘤发生时，硫酸软骨素的很多功效不能得到有效的发挥。
近年来有实验证明分子量在3500-5300Da的硫酸软骨素，其药理活性最强，对防治风湿性炎症以及伤口愈合等具有更好的疗效。因此，制备低分子量的硫酸软骨素是非常有必要的。
目前，制备低分子量的硫酸软骨素的方法主要有：（1）酸法降解，酸降解是指将硫酸软骨素溶解于酸溶液（如磯酸、盐酸）中在一定的溫度下进行降解，酸降解由于反应比较剧烈会导致硫酸根含量的降低，而且寡糖的自由基清除的能力也会降低；（2）氧化降解法，氧化降解法中最常用的方法是过氧化氢降解法，采用氧化降解法的优点是产物无毒，不需要特殊的后处理，对双糖的结构破坏比较小；（3）酶解法，酶解法是指利用硫酸软骨素酶或透明质酸酶等软骨素降解酶对硫酸软骨素酶解获得寡糖。其中，酶解法因条件温和、专一性强，是目前最常用的降解硫酸软骨素的方法。
硫酸软骨素裂解酶(chondroitinase或chondroitinsulfateyase，简称为“ChSase”)是一类能将硫酸软骨素、软骨素、透明质酸等糖胺聚糖降解为不饱和二糖(ΔDi及寡糖)的裂解酶。其中，硫酸软骨素ABC裂解酶，为特异性最为广泛的一类硫酸软骨素裂解酶。近几年，国际上对硫酸软骨素ABC裂解酶的关注越来越多，主要集中在提高酶的稳定性。而在硫酸软骨素ABC裂解酶的表达制备方面，目前只能实现胞内表达且胞内表达量很低，不能满足硫酸软骨素寡糖的生产需求。
发明内容
[技术问题]
为了解决上述问题，本发明提供了一种硫酸软骨素ABC裂解酶突变体构建及其分泌表达的方法。
[技术方案]
本发明首先提供了一种硫酸软骨素ABC裂解酶突变体，编码所述突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述突变体，以硫酸软骨素A为底物时，突变体的催化效率可达352±21(min-1)。
本发明还提供一种通过融合信号肽提高所述突变体分泌的方法，所述信号肽包括PelB、PhoA或OmpA。
本发明还提供一种通过敲除菌株外膜蛋白提高所述突变体分泌的方法，所述外膜蛋白包括外膜A蛋白（OMPA）、脂蛋白（LPP）或微孔蛋白（Porins）。
本发明还提供一种重组基因工程菌，是将融合了来源于大肠杆菌的信号肽OmpA的编码硫酸软骨素ABC裂解酶突变体的基因连接到pET-28a质粒的XhoI和NdeI酶切位点上，导入敲除了外膜蛋白OMPA的Escherichia coliBL21（DE3）中得到基因工程菌。编码硫酸软骨素ABC裂解酶突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供一种制备所述硫酸软骨素ABC裂解酶突变体的方法，是将重组基因工程菌接种到含50mL LB培养基的250mL摇瓶中，37℃、220rpm过夜培养后转接到3L发酵罐中进行发酵培养，发酵罐的装液量为1L，发酵培养基为LB培养基，初始转速600rpm，发酵温度30℃，转速与溶氧偶联，控制发酵过程中DO在30%以上（溶氧100%是未接种时，培养基中的溶氧水平），30℃培养1h后加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导培养20h。
[有益效果]
本发明提供了一种硫酸软骨素ABC裂解酶突变体L102T，相比突变前，突变体的酶活提高了50%。
与现有的硫酸软骨素ABC裂解酶的胞内表达的情况相比，本发明提供的硫酸软骨素ABC裂解酶可以实现胞外分泌表达，并且胞外酶活可以达到2.96 U/mL。
附图说明
图1所示为实施例1中构建的各个突变体的酶活。
图2所示为实施例2中融合各种信号肽后的酶活。
图3所示为实施例3中敲除外膜蛋白后酶活的变化情况。
图4所示为实施例4中的摇瓶水平各条件对酶活的影响，其中，图4a：诱导剂浓度，图4b：接种量。
图5所示为实施例5中的不同发酵时间的酶活。
具体实施方式
序列表中为相关核苷酸序列信息：
SEQ ID NO.1是编码硫酸软骨素ABC裂解酶的基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO.2是编码硫酸软骨素ABC裂解酶突变体的基因的核苷酸序列。
硫酸软骨素酶ABC的酶活的测定方法：
以硫酸软骨素为底物，底物浓度为5 g/L，用Tris-HCl缓冲液 (pH7.4)溶解底物。酶活测定的反应体系为1 mL，含40 μL酶液和960 μL硫酸软骨素底物溶液。30℃反应1 min，通过分光光度计测定在232 nm处的吸光值变化。酶活定义单位：每分钟转化1 μmol底物所需要的酶量为1 U。
硫酸软骨素酶ABC的相对酶活的计算方法：相对酶活=突变体酶活/野生型酶活。
实施例1硫酸软骨素ABC裂解酶突变体的制备方法
合成普通变形杆菌来源的硫酸软骨素酶ABC，编码的该硫酸软骨素酶ABC的原始DNA序列如SEQ ID NO.1所示。通过序列对比选取第125、154、322、309位氨基酸位点，分别进行饱和突变。将编码原始硫酸软骨素酶ABC的基因或者经过PCR突变后所得到的基因连接到pET-28a质粒XhoI和NdeI酶切位点上，导入Escherichia coliBL21（DE3）中，获得表达原始硫酸软骨素酶ABC或硫酸软骨素酶ABC突变体的重组大肠杆菌菌株。将所得重组菌株接种于LB培养基中，37℃过夜培养后转接于装有LB培养基的250mL三角摇瓶，30℃培养1h，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导后，置于27℃培养20h。
从重组大肠杆菌中获取酶的过程：培养完成后，将发酵液于4℃、6800rpm离心10min，弃掉上清，用20mM Tris-HCl重悬菌体2-3次，用超声细胞破碎仪破碎后12000rpm高速离心20min，获得胞内粗酶，胞内粗酶液过膜后用100mM咪唑洗脱获得原始硫酸软骨素酶ABC或硫酸软骨素酶ABC突变体的纯酶。测定原始硫酸软骨素酶ABC或硫酸软骨素酶ABC突变体的活力，结果如图1所示，突变体L102T具有最高的酶活，相比于突变前，突变体L102T的活力提高了50%。
实施例2 将酶基因与信号肽融合实现胞外分泌表达人工序列
实验过程：从大肠杆菌BL21基因组中克隆出信号肽PelB、PhoA、OmpA，分别融合到编码突变体的基因中，使得翻译的氨基酸序列的N端融合有信号肽。将所得融合基因连接到pET-28a质粒XhoI和NdeI酶切位点上，导入Escherichia coliBL21（DE3）中，获得重组大肠杆菌菌株。以表达没有融合信号肽的基因的重组菌为对照组。将所得重组菌株接种于LB培养基中，37℃过夜培养后转接于装有LB培养基的250mL三角摇瓶，30℃培养1h，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导后，置于27℃培养20h。
用于测定胞内酶活的酶液的收集方法：培养完成后，将发酵液于4℃、6800rpm离心10min，弃掉上清，用20mM Tris-HCl重悬菌体2-3次，用超声细胞破碎仪破碎后12000 rpm高速离心20min，获得胞内粗酶。
用于测定胞外酶活的酶液的收集方法：培养完成后，将发酵液于4℃、6800rpm离心10min，取上清即为胞外粗酶。
分别测定胞内粗酶、胞外粗酶的活力，结果如图2所示，未融合信号肽的对照组没有检测到胞外酶活，全部为胞内酶活。PelB、PhoA、OmpA这三种信号肽中，融合信号肽OmpA时，取得的胞外酶活最高，可以达到0.3U/mL。
实施例3 敲除菌株外膜蛋白提高酶的胞外分泌表达量
实验过程：将pCas9质粒化转到BL21（DE3）感受态细胞，涂布卡那霉素平板，30℃培养。提取上述平板的单菌落，接种于含卡那霉素的SOB培养基中，30℃过夜培养12h。以2%接种量转接含卡那霉素的SOB液体培养基中，30℃培养至OD600为0.1时，加入终浓度为10mmol/L的阿拉伯糖诱导重组酶表达。继续培养至OD为0.6时，冰浴菌液10min，4℃、4000r/min离心5min，收集菌体细胞。用预冷的10%甘油洗涤菌体细胞3次，浓缩100倍，制备得到电转化感受态细胞。
将连接有编码L102T突变体的、融合有信号肽OmpA的基因的pET-28a质粒大导入电转化感受态细胞进行电转，对转化子进行PCR验证以及DNA测序验证以确定基因组改造的正确性。之后将质粒pCas9和pTargetF消除。然后，将敲除菌株外膜蛋白，且消除了质粒pCas9和pTargetF的重组菌株接种于LB培养基中，37℃过夜培养后按10%接种量转接于装有LB培养基的250mL三角摇瓶，30℃培养1h，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导后，置于27℃培养20h。
用于测定胞外酶活的酶液的收集方法：摇瓶培养完成后，将发酵液于4℃、6800rpm离心10min，取上清即为胞外粗酶。结果如图3所示，敲除OMPA外膜蛋白所得菌株胞外酶活最高，可以达到0.68U/mL。
实施例4 摇瓶发酵优化
实验过程：
关于诱导剂的浓度：将用于表达突变体L102T的重组大肠杆菌（E. coliBL21（DE3）-pET-28a-L102T）接种于LB培养基，37℃过夜培养后按10%接种量转接于250 mL三角摇瓶，30℃培养1 h，分别加入终浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mMIPTG诱导后，置于27℃培养20h。
关于接种量：将用于表达突变体L102T的重组大肠杆菌（E. coliBL21（DE3）-pET-28a-L102T）接种于LB培养基，37℃过夜培养后按1%、4%、10%接种量转接于250 mL三角摇瓶，30℃培养1 h，加入终浓度为0.5mMIPTG诱导后，置于27℃培养20h。
结果：如图4所示，接种量10%，IPTG浓度0.5mM，酶活最高，可以达到1.46U/mL。
实施例5 发酵罐发酵培养
3L发酵罐培养：将实施例3构建的利用信号肽OmpA表达L102T突变体的敲除了OMPA外膜蛋白的重组菌株接种于含50mL LB培养基的250mL摇瓶中，37℃、220rpm过夜培养后转接到3L发酵罐中进行发酵培养，发酵罐的装液量为1L，发酵培养基为LB培养基，初始转速600rpm，发酵温度30℃，转速与溶氧偶联，控制发酵过程中DO在30%以上（溶氧100%是未接种时，培养基中的溶氧水平），30℃培养1h后加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导培养20h，发酵结束后，4℃、6800rpm离心10min收集发酵上清液。
结果：如图5所示，诱导培养20h，发酵上清液中的酶活力最高，为2.96 U/mL。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种硫酸软骨素ABC裂解酶突变体及其分泌表达的方法
<130> BAA190514A
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2994
<212> DNA
<213> 普通变形杆菌
<400> 1
atggccacca gcaatcctgc atttgatcct aaaaatctga tgcagtcaga aatttaccat 60
tttgcacaaa ataacccatt agcagacttc tcatcagata aaaactcaat actaacgtta 120
tctgataaac gtagcattat gggaaaccaa tctcttttat ggaaatggaa aggtggtagt 180
agctttactt tacataaaaa actgattgtc cccaccgata aagaagcatc taaagcatgg 240
ggacgctcat ctacccccgt tttctcattt tggctttaca atgaaaaacc gattgatggt 300
tatctgacta tcgatttcgg agaaaaactc atttcaacca gtgaggctca ggcaggcttt 360
aaagtaaaat tagatttcac tggctggcgt gctgtgggag tctctttaaa taacgatctt 420
gaaaatcgag agatgacctt aaatgcaacc aatacctcct ctgatggtac tcaagacagc 480
attgggcgtt ctttaggtgc taaagtcgat agtattcgtt ttaaagcgcc ttctaatgtg 540
agtcagggtg aaatctatat cgaccgtatt atgttttctg tcgatgatgc tcgctaccaa 600
tggtctgatt atcaagtaaa aactcgctta tcagaacctg aaattcaatt tcacaacgta 660
aagccacaac tacctgtaac acctgaaaat ttagcggcca ttgatcttat tcgccaacgt 720
ctaattaatg aatttgtcgg aggtgaaaaa gagacaaacc tcgcattaga agagaatatc 780
agcaaattaa aaagtgattt cgatgctctt aatattcaca ctttagcaaa tggtggaacg 840
caaggcagac atctgatcac tgataaacaa atcattattt atcaaccaga gaatcttaac 900
tcccaagata aacaactatt tgataattat gttattttag gtaattacac gacattaatg 960
tttaatatta gccgtgctta tgtgctggaa aaagatccca cacaaaaggc gcaactaaag 1020
cagatgtact tattagtgac aaagcattta ttagatcaag gctttgttaa agggagtgct 1080
ttagtgacaa cccatcactg gggatacagt tctcgttggt ggtatatttc cacgttatta 1140
atgtctgatg cactaaaaga agcgaaccta caaactcaag tttatgattc attactgtgg 1200
tattcacgtg agtttaaaag tagttttgat atgaaagtaa gtgctgatag ctctgatcta 1260
gattatttca ataccttatc tcgccaacat ttagccttat tattactaga gcctgatgat 1320
caaaagcgta tcaacttagt taatactttc agccattata tcactggcgc attaacgcaa 1380
gtgccaccgg gtggtaaaga tggtttacgc ctgatggtac agcatggcga catgaaggca 1440
actatccggg ttactctttc ccagccttta aaaatgcctc tcagcttatt tatttattac 1500
gcgatacacc atttccagtt gggtgaaagt ggttggaata acctgaaaaa agcgatggtt 1560
tcagcgtgga tctacagtaa tccagaagtt ggattaccgc ttgcaggaag acaccctttt 1620
aactcacctt cgttaaaatc agtcgctcaa ggctattact ggcttgccat gtctgcaaaa 1680
tcatcgcctg ataaaacact tgcatctatt tatcttgcga ttagtgataa aacacaaaat 1740
gaatcaactg ctatttttgg agaaactatt acaccagcgt ctttacctca aggtttctat 1800
gcctttaatg gcggtgcttt tggtattcat cgttggcaag ataaaatggt gacactgaaa 1860
gcttataaca ccaatgtttg gtcatctgaa atttataaca aagataaccg ttatggccgt 1920
taccaaagtc atggtgtcgg tcaaatagtg agtaatggct cgcagctttc acagggctat 1980
cagcaagaag gttgggattg gaatagaatg caaggggcaa ccactattca ccttcctctt 2040
aaagacttag acagtcctaa acctcatacc ttaatgcaac gtggagagcg tggatttagc 2100
ggaacatcat cccttgaagg tcaatatggc atgatggcat tcgatcttat ttatcccgcc 2160
aatcttgagc gttttgatcc taatttcact gcgaaaaaga gtgtattagc cgctgataat 2220
cacttaattt ttattggtag caatataaat agtagtgata aaaataaaaa tgttgaaacg 2280
accttattcc aacatgccat tactccaaca ttaaataccc tttggattaa tggacaaaag 2340
atagaaaaca tgccttatca aacaacactt caacaaggtg attggttaat tgatagcaat 2400
ggcaatggtt acttaattac tcaagcagaa aaagtaaatg taagtcgcca acatcaggtt 2460
tcagcggaaa ataaaaatcg ccaaccgaca gaaggaaact ttagctcggc atggatcgat 2520
cacaggactc gccccaaaga tgccagttat gagtatatgg tctttttaga tgcgacacct 2580
gaaaaaatgg gagagatggc acaaaaattc cgtgaaaata atgggttata tcaggttctt 2640
cgtaaggata aagacgttca tattattctc gataaactca gcaatgtaac gggatatgcc 2700
ttttatcagc cagcatcaat tgaagacaaa tggatcaaaa aggttaataa acctgcaatt 2760
gtgatgactc atcgacaaaa agacactctt attgtcagtg cagttacacc tgatttaaat 2820
atgactcgcc aaaaagcagc aactcctgtc accatcaatg tcacgattaa tggcaaatgg 2880
caatctgctg ataaaaatag tgaagtgaaa tatcaggttt ctggtgataa cactgaactg 2940
acgtttacga gttactttgg tattccacaa gaaatcaaac tctcgccact ccct 2994
<210> 2
<211> 2994
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atggccacca gcaatcctgc atttgatcct aaaaatctga tgcagtcaga aatttaccat 60
tttgcacaaa ataacccatt agcagacttc tcatcagata aaaactcaat actaacgtta 120
tctgataaac gtagcattat gggaaaccaa tctcttttat ggaaatggaa aggtggtagt 180
agctttactt tacataaaaa actgattgtc cccaccgata aagaagcatc taaagcatgg 240
ggacgctcat ctacccccgt tttctcattt tggctttaca atgaaaaacc gattgatggt 300
tatacaacta tcgatttcgg agaaaaactc atttcaacca gtgaggctca ggcaggcttt 360
aaagtaaaat tagatttcac tggctggcgt gctgtgggag tctctttaaa taacgatctt 420
gaaaatcgag agatgacctt aaatgcaacc aatacctcct ctgatggtac tcaagacagc 480
attgggcgtt ctttaggtgc taaagtcgat agtattcgtt ttaaagcgcc ttctaatgtg 540
agtcagggtg aaatctatat cgaccgtatt atgttttctg tcgatgatgc tcgctaccaa 600
tggtctgatt atcaagtaaa aactcgctta tcagaacctg aaattcaatt tcacaacgta 660
aagccacaac tacctgtaac acctgaaaat ttagcggcca ttgatcttat tcgccaacgt 720
ctaattaatg aatttgtcgg aggtgaaaaa gagacaaacc tcgcattaga agagaatatc 780
agcaaattaa aaagtgattt cgatgctctt aatattcaca ctttagcaaa tggtggaacg 840
caaggcagac atctgatcac tgataaacaa atcattattt atcaaccaga gaatcttaac 900
tcccaagata aacaactatt tgataattat gttattttag gtaattacac gacattaatg 960
tttaatatta gccgtgctta tgtgctggaa aaagatccca cacaaaaggc gcaactaaag 1020
cagatgtact tattagtgac aaagcattta ttagatcaag gctttgttaa agggagtgct 1080
ttagtgacaa cccatcactg gggatacagt tctcgttggt ggtatatttc cacgttatta 1140
atgtctgatg cactaaaaga agcgaaccta caaactcaag tttatgattc attactgtgg 1200
tattcacgtg agtttaaaag tagttttgat atgaaagtaa gtgctgatag ctctgatcta 1260
gattatttca ataccttatc tcgccaacat ttagccttat tattactaga gcctgatgat 1320
caaaagcgta tcaacttagt taatactttc agccattata tcactggcgc attaacgcaa 1380
gtgccaccgg gtggtaaaga tggtttacgc ctgatggtac agcatggcga catgaaggca 1440
actatccggg ttactctttc ccagccttta aaaatgcctc tcagcttatt tatttattac 1500
gcgatacacc atttccagtt gggtgaaagt ggttggaata acctgaaaaa agcgatggtt 1560
tcagcgtgga tctacagtaa tccagaagtt ggattaccgc ttgcaggaag acaccctttt 1620
aactcacctt cgttaaaatc agtcgctcaa ggctattact ggcttgccat gtctgcaaaa 1680
tcatcgcctg ataaaacact tgcatctatt tatcttgcga ttagtgataa aacacaaaat 1740
gaatcaactg ctatttttgg agaaactatt acaccagcgt ctttacctca aggtttctat 1800
gcctttaatg gcggtgcttt tggtattcat cgttggcaag ataaaatggt gacactgaaa 1860
gcttataaca ccaatgtttg gtcatctgaa atttataaca aagataaccg ttatggccgt 1920
taccaaagtc atggtgtcgg tcaaatagtg agtaatggct cgcagctttc acagggctat 1980
cagcaagaag gttgggattg gaatagaatg caaggggcaa ccactattca ccttcctctt 2040
aaagacttag acagtcctaa acctcatacc ttaatgcaac gtggagagcg tggatttagc 2100
ggaacatcat cccttgaagg tcaatatggc atgatggcat tcgatcttat ttatcccgcc 2160
aatcttgagc gttttgatcc taatttcact gcgaaaaaga gtgtattagc cgctgataat 2220
cacttaattt ttattggtag caatataaat agtagtgata aaaataaaaa tgttgaaacg 2280
accttattcc aacatgccat tactccaaca ttaaataccc tttggattaa tggacaaaag 2340
atagaaaaca tgccttatca aacaacactt caacaaggtg attggttaat tgatagcaat 2400
ggcaatggtt acttaattac tcaagcagaa aaagtaaatg taagtcgcca acatcaggtt 2460
tcagcggaaa ataaaaatcg ccaaccgaca gaaggaaact ttagctcggc atggatcgat 2520
cacaggactc gccccaaaga tgccagttat gagtatatgg tctttttaga tgcgacacct 2580
gaaaaaatgg gagagatggc acaaaaattc cgtgaaaata atgggttata tcaggttctt 2640
cgtaaggata aagacgttca tattattctc gataaactca gcaatgtaac gggatatgcc 2700
ttttatcagc cagcatcaat tgaagacaaa tggatcaaaa aggttaataa acctgcaatt 2760
gtgatgactc atcgacaaaa agacactctt attgtcagtg cagttacacc tgatttaaat 2820
atgactcgcc aaaaagcagc aactcctgtc accatcaatg tcacgattaa tggcaaatgg 2880
caatctgctg ataaaaatag tgaagtgaaa tatcaggttt ctggtgataa cactgaactg 2940
acgtttacga gttactttgg tattccacaa gaaatcaaac tctcgccact ccct 2994
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tataagtatg ttacctcctg attcatacgg ataatctac 39
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggtaacatac ttatatgtca agcgaatgca tt 32
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ggtaacatac ttataatgca agcgaatgca tt 32
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggtaacatac ttatagttca agcgaatgca tt 32
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cgcaacgata ccgatatgat agtggag 27
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tatcggtatc gttgcgacgt tctacgagg 29
<210> 9
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ataagcacta agtgaattag aagcatcatt actcttg 37
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
aattcactta gtgcttatcc tcataaccag cca 33
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
agtacacaca cctgaatcag ggaaaaaat 29
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ggtgtgtgta ctgtttatac cagcggt 27

Claims (2)

1.一种制备硫酸软骨素ABC裂解酶突变体的方法，其特征在于，是将重组基因工程菌接种到含50mL LB培养基的250mL摇瓶中，37℃、220rpm过夜培养后转接到3L发酵罐中进行发酵培养，发酵罐的装液量为1L，发酵培养基为LB培养基，初始转速600rpm，发酵温度30℃，转速与溶氧偶联，控制发酵过程中培养基中的溶氧量是通气搅拌开始后、接种前的培养基中的饱和溶氧量的30%以上，30℃培养1h后加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导培养20h；
所述重组基因工程菌的宿主是敲除了外膜A蛋白OMPA的Escherichia coli BL21（DE3），所述重组基因工程菌携带了表达载体，所述表达载体是以pET-28a质粒为骨架，并在XhoI和NdeI酶切位点插入了融合了来源于大肠杆菌的信号肽OmpA的编码硫酸软骨素ABC裂解酶突变体的基因，编码硫酸软骨素ABC裂解酶突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述信号肽替换为PelB或PhoA。
CN201910588540.9A 2019-07-02 2019-07-02 一种硫酸软骨素abc裂解酶突变体及其分泌表达的方法 Active CN111518822B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910588540.9A CN111518822B (zh) 2019-07-02 2019-07-02 一种硫酸软骨素abc裂解酶突变体及其分泌表达的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910588540.9A CN111518822B (zh) 2019-07-02 2019-07-02 一种硫酸软骨素abc裂解酶突变体及其分泌表达的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111518822A CN111518822A (zh) 2020-08-11
CN111518822B true CN111518822B (zh) 2022-08-09

Family

ID=71900250

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910588540.9A Active CN111518822B (zh) 2019-07-02 2019-07-02 一种硫酸软骨素abc裂解酶突变体及其分泌表达的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111518822B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112877316A (zh) * 2021-01-25 2021-06-01 南京汉欣医药科技有限公司 新硫酸软骨素酶及表达硫酸软骨素酶的乳酸乳球菌
CN114457061A (zh) * 2022-02-21 2022-05-10 中国海洋大学 一种透明质酸裂解酶及其应用

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0698769A (ja) * 1992-09-22 1994-04-12 Maruha Corp コンドロイチナーゼ及びその遺伝子
CN101374949A (zh) * 2006-01-31 2009-02-25 国立水产科学院 通过信号序列和分泌增强子生产可溶的天然形式的重组蛋白质
CN101897953A (zh) * 2009-05-27 2010-12-01 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 无创性高穿透性表皮生长因子及其应用
CN104711245A (zh) * 2015-03-20 2015-06-17 北京电子科技职业学院 一种硫酸软骨素abc酶突变体融合蛋白及应用
CN106148265A (zh) * 2016-07-15 2016-11-23 江南大学 一种产硫酸软骨素裂解酶的重组枯草芽孢杆菌及其应用
CN108795918A (zh) * 2018-07-18 2018-11-13 北京电子科技职业学院 一种外切型硫酸软骨素酶abc及其制备方法与应用
CN109988723A (zh) * 2018-11-27 2019-07-09 常熟理工学院 一株产硫酸软骨素abc裂解酶的重组酵母菌及其构建方法与应用
WO2020087051A1 (en) * 2018-10-26 2020-04-30 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Targeted chondroitinase abc fusion proteins and complexes thereof
CN112251426A (zh) * 2020-10-18 2021-01-22 山东大学 一种硫酸软骨素裂解酶及其编码基因与应用
CN112430589A (zh) * 2020-11-26 2021-03-02 江南大学 高热稳定性的硫酸软骨素abc裂解酶突变体及其应用
WO2021159205A1 (en) * 2020-02-10 2021-08-19 The Governing Council Of The University Of Toronto Chondroitinase abc mutants and methods of manufacture and use thereof

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4155779B2 (ja) * 2002-01-31 2008-09-24 生化学工業株式会社 糖鎖硫酸化剤
GB0315021D0 (en) * 2003-06-26 2003-07-30 Chiron Srl Immunogenic gonococcal compositions
JP5391069B2 (ja) * 2006-10-10 2014-01-15 アコーダ セラピューティクス、インク． コンドロイチナーゼａｂｃｉ変異体を使用する組成物及び方法
CN103648489A (zh) * 2011-05-11 2014-03-19 儿童医疗中心有限公司 多抗原提呈免疫原性组合物及其方法和用途
CN104962576B (zh) * 2015-07-08 2018-01-09 中国科学院水生生物研究所 一种柱状黄杆菌基因定向敲除质粒及应用
CN108220213A (zh) * 2017-03-13 2018-06-29 安徽安龙基因医学检验所有限公司 一种缺失ompA基因鸭疫里默氏杆菌CH3减毒菌株的构建方法

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0698769A (ja) * 1992-09-22 1994-04-12 Maruha Corp コンドロイチナーゼ及びその遺伝子
CN101374949A (zh) * 2006-01-31 2009-02-25 国立水产科学院 通过信号序列和分泌增强子生产可溶的天然形式的重组蛋白质
CN101897953A (zh) * 2009-05-27 2010-12-01 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 无创性高穿透性表皮生长因子及其应用
CN104711245A (zh) * 2015-03-20 2015-06-17 北京电子科技职业学院 一种硫酸软骨素abc酶突变体融合蛋白及应用
CN106148265A (zh) * 2016-07-15 2016-11-23 江南大学 一种产硫酸软骨素裂解酶的重组枯草芽孢杆菌及其应用
CN108795918A (zh) * 2018-07-18 2018-11-13 北京电子科技职业学院 一种外切型硫酸软骨素酶abc及其制备方法与应用
WO2020087051A1 (en) * 2018-10-26 2020-04-30 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Targeted chondroitinase abc fusion proteins and complexes thereof
CN109988723A (zh) * 2018-11-27 2019-07-09 常熟理工学院 一株产硫酸软骨素abc裂解酶的重组酵母菌及其构建方法与应用
WO2021159205A1 (en) * 2020-02-10 2021-08-19 The Governing Council Of The University Of Toronto Chondroitinase abc mutants and methods of manufacture and use thereof
CN112251426A (zh) * 2020-10-18 2021-01-22 山东大学 一种硫酸软骨素裂解酶及其编码基因与应用
CN112430589A (zh) * 2020-11-26 2021-03-02 江南大学 高热稳定性的硫酸软骨素abc裂解酶突变体及其应用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Proteus vulgaris strain ATCC 6896 chondroitin sulfate ABC endolyase gene, partial cds;Tam,K.W.等;《GENBANK》;20160624;Accession no.GQ996964.1 *
Secretory expression of biologically active chondroitinase ABC I for production of chondroitin sulfate oligosaccharides;Hao Wang等;《Carbohydrate Polymers》;20190802;第224卷;第1-6页 *
Tam,K.W.等.Proteus vulgaris strain ATCC 6896 chondroitin sulfate ABC endolyase gene, partial cds.《GENBANK》.2016, *
The Prophage-encoded Hyaluronate Lyase Has Broad Substrate Specificity and Is Regulated by the N-terminal Domain;Sudhir Kumar Singh等;《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》;20141219;第289卷(第51期);第35225–35236页 *
不同连接肽在硫酸软骨素酶ABC I重组表达中的应用研究;李晔等;《中国酿造》;20200925;第39卷(第9期);第121-125页 *
微生物硫酸软骨素裂解酶的研究进展;蔡苏兰等;《沈阳药科大学学报》;20040120;第1卷;第76-80页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111518822A (zh) 2020-08-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110157654B (zh) 一种纳豆芽孢杆菌重组菌及其构建方法与应用
CN111607623A (zh) 一种代谢工程改造大肠杆菌制备α-酮异戊酸的方法
CN111518822B (zh) 一种硫酸软骨素abc裂解酶突变体及其分泌表达的方法
CN113122490B (zh) 双基因缺陷型工程菌及其在提高n-乙酰氨基葡萄糖产量的应用
CN109234299B (zh) 一种表达制备乳二糖磷酸化酶的方法
CN112430589B (zh) 高热稳定性的硫酸软骨素abc裂解酶突变体及其应用
CN108315289B (zh) 一种提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法
CN111748535A (zh) 一种丙氨酸脱氢酶突变体及其在发酵生产l-丙氨酸中的应用
CN113151135A (zh) 一种食品安全级枯草芽孢杆菌及其在生产几丁二糖脱乙酰酶中的应用
CN109897812B (zh) 一种表达软骨素4-硫酸转移酶基因的重组菌及其应用
JP2023534879A (ja) Ｎ－アセチルグルコサミン産生菌株並びにその構築方法及び使用
CN115896082A (zh) 褐藻酸裂解酶突变体及其应用
CN113249288B9 (zh) 一种表达glp-1类似物的重组菌及其应用
CN105602878A (zh) 一种透明质酸酶细胞表面展示系统及其制备和应用
CN113528495A (zh) 一种稳定表达几丁二糖脱乙酰酶的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用
CN107083375B (zh) 一种中温α-淀粉酶及其基因和应用
CN114746548A (zh) 用于生产来自日本曲霉的果糖基转移酶的核酸、载体、宿主细胞和方法
CN114606172B (zh) 一种提高血红素产量的解淀粉芽胞杆菌工程菌及其构建方法
CN110923223A (zh) 一种新型腈水解酶及其应用
CN115232805B (zh) 一种硫酸软骨素裂解酶及其重组菌株和应用
CN117946984B (zh) 泛酸合成酶突变体及其制备方法、构建体及其构建方法、泛酸生产菌株和应用及泛酸的制备方法
CN116042687B (zh) 一种载体、低分子量透明质酸合成菌株、构建方法及应用
CN109777816A (zh) 硫酸软骨素abc酶蛋白的制备方法及其应用
TWI844975B (zh) 一種高產透明質酸酶的工程酵母菌株及其應用
CN115786296B (zh) 一种内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶突变体及生产方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant