CN108795918A

CN108795918A - 一种外切型硫酸软骨素酶abc及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN108795918A
Application number: CN201810792833.4A
Authority: CN
Inventors: 李晔; 周朝; 兰蓉; 辛秀兰; 袁其朋
Original assignee: Beijing Polytechnic
Current assignee: Beijing Polytechnic
Priority date: 2018-07-18
Filing date: 2018-07-18
Publication date: 2018-11-13

Abstract

本发明提供一种外切型硫酸软骨素酶ABC，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供一种外切型硫酸软骨素酶ABC融合蛋白，该融合蛋白融合有上述外切型硫酸软骨素酶ABC和纯化标签。同时，本发明还提供一种含有上述外切型硫酸软骨素酶ABC的重组载体和转化体。本发明提供的外切型硫酸软骨素酶ABC的DNA序列对大肠杆菌的偏好性达0.97，从而提高了硫酸软骨素酶ABC的DNA序列在大肠杆菌中的表达效率，进而直接降低了外切型硫酸软骨素酶ABC的生产成本。另外，本发明还提供一种上述外切型硫酸软骨素酶ABC的制备方法和应用。

Description

一种外切型硫酸软骨素酶ABC及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体地，涉及一种外切型硫酸软骨素酶ABC及其制备方法与应用。

背景技术

硫酸软骨素酶(chondroitinase或chondroitin sulfateyase，简称为“ChSase”)是一类能将硫酸软骨素、软骨素、透明质酸等糖胺聚糖降解为不饱和二糖(ΔDi及寡糖)的裂解酶。根据其作用底物的差异主要分为ChSase ABC、ChSase AC、ChSase B及ChSase C等类型。

目前，ChSase ABC为特异性最为广泛的一类硫酸软骨素裂解酶。近几年，国际上对ChSase ABC的关注越来越多，相关学术论文的数量迅速增长。而且研究表明ChSase ABC有多种重要用途，在基础研究中它用来构建二糖和寡糖的基因文库；研究糖胺多糖结构和性质；在临床领域，用来治疗一些疾病。另外有两项新增应用非常重要：一是作为（chondroitin sulfate, 简称为“CS”）的检测试剂，2010版药典规定CS原料药进行含量测定时需要进行如下操作：用ChSase ABC酶解待检测CS，测定双糖总含量。二是在酶法生产低分子量CS中作为催化剂应用。大量研究发现，当将CS的分子量降低至2～10kD时，其药效更为明显，对防止动脉粥样硬化、风湿性炎症和伤口愈合有更好的疗效。目前对低分子量CS的制备常采用酸水解法、离子交换法和酶解法。比较而言，酶解法需要的条件不高且容易控制，因而具备较大的优势。酶解法的关键在于获得大量、廉价的硫酸软骨素裂解酶。

因此，ChSase ABC具有生物学作用，应用前景广阔。然而，目前国内没有产品供应，全部依靠进口，而且由于当前酶的提取效率、重组表达效率及亲和纯化能力普遍较低，使其在国际市场的价格居高不下。较低的生产能力和过高的价格是制约其功能研究和应用开发的重要因素。所以，开发ChSase ABC的新型高效表达和纯化技术具有极其重要的研究价值，其成功研制对提升我国ChSase ABC生物表达的技术水平及拓展其应用领域具有重要的科学意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种外切型硫酸软骨素酶ABC及其制备方法与应用，以解决上述问题。

具体地，本发明采取如下技术方案：

一种外切型硫酸软骨素酶ABC，它的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

一种外切型硫酸软骨素酶ABC融合蛋白，它融合有外切型硫酸软骨素酶ABC和纯化标签，其中，所述外切型硫酸软骨素酶ABC的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，所述纯化标签为His标签、MBP标签或GST标签。

基于上述，所述外切型硫酸软骨素酶ABC融合蛋白的分子量为114～154.8 kDa。

基于上述，以硫酸软骨素A及硫酸软骨素C的混合物为底物时，所述外切型硫酸软骨素酶ABC融合蛋白的酶活为1553～5968IU/L发酵液。

一种重组载体，它包括载体和与所述载体连接的上述的外切型硫酸软骨素酶ABC融合蛋白，其中，所述载体为pET-28a、PMAL-C2X或pGEX-4T1。

一种转化体，它是将上述的重组载体转化到宿主细胞中进行表达而得到的，其中，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21、大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌Trans109。

本发明还提供一种外切型硫酸软骨素酶ABC的制备方法，其步骤包括：从普通变形杆菌中获取硫酸软骨素酶ABC的原始DNA序列；对所述原始DNA序列进行密码子优化，得到如SEQ ID NO.1所示的DNA序列；扩增如SEQ ID NO.1所示的DNA序列，并和载体进行重组构建，得到重组载体；将所述重组载体转化至大肠杆菌表达，获得转化体；培养所述转化体，并进行物理破碎处理，得到所述外切型硫酸软骨素酶ABC。

基于上述，所述培养所述转化体的步骤包括：采用LB培养基在37℃培养所述转化体1～3 h，加入终浓度为0.3～0.6 mM的IPTG诱导，然后在16℃～20℃培养18～24 h。

本发明还提供一种外切型硫酸软骨素酶ABC的应用，其包括采用外切型硫酸软骨素酶AC对类肝素原料中硫酸软骨素进行降解的步骤，其中，所述外切型硫酸软骨素酶AC的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

基于上述，它包括：以水为缓冲溶液，在温度为32～42℃、pH值为7.5～8.5的条件下，采用所述外切型硫酸软骨素酶ABC对类肝素原料中硫酸软骨素进行降解。

与现有技术相比，本发明具有突出的实质性特点和显著进步。具体的说，本发明提供的外切型硫酸软骨素酶ABC的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，该DNA序列在大肠杆菌主中的密码子适应性增大至0.97并且其偏好密码子的频率显著提高，从而提高了外切型硫酸软骨素酶ABC的DNA序列在大肠杆菌中的表达效率；当以硫酸软骨素A及硫酸软骨素C的混合物为底物时，所述外切型硫酸软骨素酶ABC的酶活为1553～5968IU/L发酵液，因此，本发明提供的外切型硫酸软骨素酶ABC生产成本比较低，有利于外切型硫酸软骨素酶ABC的推广应用。

本发明提供一种所述外切型硫酸软骨素酶ABC的制备方法，该制备方法主要是通过从普通变形杆菌中获取外切型硫酸软骨素酶ABC的原始DNA序列，并对该原始DNA序列进行密码子优化，针对常用酶切位点pstI进行了优化，避免了3个polyA（AAAAAAA）结构，2个poly（TTTTTT）结构，以及对2136处的重组序列，使得由该方法得到的如SEQ ID NO.1所示的外切型硫酸软骨素酶ABC的DNA序列在大肠杆菌主中的密码子适应性增大至0.97并且其偏好密码子的频率显著提高，从而提高了外切型硫酸软骨素酶ABC在大肠杆菌中的表达效率，而且该方法比较简单，成本比较低。

同时，本发明还提供该外切型硫酸软骨素酶ABC的应用，采用外切型硫酸软骨素酶ABC对类肝素原料中硫酸软骨素和硫酸皮肤素进行降解的步骤，该外切型硫酸软骨素酶ABC具有高选择性，可以充分分解类肝素原料中硫酸软骨素和硫酸皮肤素而留下肝素和硫酸乙酰肝素重新利用；进一步，所述外切型硫酸软骨素酶ABC具有较强的稳定性，可以以水为缓冲溶液对硫酸软骨素进行降解，避免采用Tris或其他盐类缓冲溶液对肝素造成污染，增加分离步骤。本发明提供的外切型硫酸软骨素酶ABC有一定的耐酒精性。

附图说明

图1为本发明实施例提供的外切型硫酸软骨素酶ABC的DNA序列的密码子适应性指标图。

图2为本发明实施例提供的外切型硫酸软骨素酶ABC的DNA序列的高频密码子分布图。

图3为本发明实施例使用的硫酸软骨素酶ABC的原始DNA序列的密码子适应性指标图。

图4为本发明实施例使用的硫酸软骨素酶ABC的原始DNA序列的高频密码子分布图。

图5为本发明实施例中外切型硫酸软骨素酶ABC的电泳图，其中：从左至右泳道1为Blue plus IVmarker；泳道2为pet28a-His-ch ABC II Bl21(de3)全细胞；泳道3为全细胞破碎后上清液；泳道4为全细胞破碎后沉淀；泳道5为纯化后外切型硫酸软骨素酶ABC。

图6是肝素酶I降解HP的HPLC图谱。

图7是肝素酶 III降解HS的HPLC图谱。

图8是外切型硫酸软骨素酶ABC降解HP的HPLC图谱。

图9是外切型硫酸软骨素酶ABC降解HS的HPLC图谱。

图10是外切型硫酸软骨素酶ABC降解CS的HPLC图谱。

图11是外切型硫酸软骨素酶ABC降解DS的HPLC图谱。

序列表中：

SEQ ID NO.1为本发明实施例提供的外切型硫酸软骨素酶ABC的DNA序列。

SEQ ID NO.2为本发明实施例采用的外切型硫酸软骨素酶ABC的原始DNA序列。

具体实施方式

下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

实施例

本实施例提供一种外切型硫酸软骨素酶ABC，该外切型硫酸软骨素酶ABC的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。由金斯瑞（GenScript）公司提供的检测报告显示：该外切型硫酸软骨素酶ABC的DNA序列的密码子适应性指标如图1所示，高频密码子分布如图2所示，该DNA序列在大肠杆菌中的密码子适应性达到0.97。所述外切型硫酸软骨素酶ABC的分子量大小为111.7。所述外切型硫酸软骨素酶ABC可以与纯化标签His标签、MBP标签或GST标签融合，形成外切型硫酸软骨素酶ABC融合蛋白。

所述外切型硫酸软骨素酶ABC的制备方法包括：

1）获取普通变形杆菌中硫酸软骨素酶ABC的原始DNA序列如SEQ ID NO.2所示，根据其在大肠杆菌表达载体中的密码子偏好性进行密码子优化得到如SEQ ID NO.1所示的DNA序列，其中，由金斯瑞（GenScript）公司提供的检测报告显示：该原始序列的密码子适应性指标如图3所示、高频密码子分布如图4所示；在密码子优化过程中，针对常用酶切位点pstI进行了优化，避免了3个poly A（AAAAAAA）结构，2个poly（TTTTTT）结构，以及对2136处的重组序列，使ch ABC II（本文中“ch ABC II”表示外切型硫酸软骨素酶ABC的DNA序列）在大肠杆菌主中的密码子适应性从SEQ ID NO.2所示的原始序列的0.35增加到如SEQ ID NO.1所示的DNA序列的0.97并且其偏好密码子的频率显著提高；

2）对所述DNA序列进行PCR然后连接到载体pET-28a进行基因重组构建，得到重组载体pET-28a-His-ch ABC II；其中，选用酶切位点NdeI、BamHI，上游引物Ch ABC II-F-NdeI（F）为gggaaacatatgCTGCCGACCCTGAGCCACGAAG，下游引物Ch ABC II-R-BamHI（R）为gggaaaggatccTTATTTCACCAGGTTGATAACGGTCGG；在其他的实施例中所述载体也可选用PMAL-C2X或pGEX-4T1，以及其它纯化标签，从而得到其它重组载体，比如PMAL-C2X-MBP-ch ABCII、pGEX-4T1-GST-ch ABC II；

3）将所述重组载体pET-28a-His-ch ABC II转化至大肠杆菌BL21 (DE3)菌株，得到转化体，所述转化体在带有卡纳抗性的LB试管中，37℃培养2 h，转接至50 mL TB培养基中，接种量为1%，加入0.5 mM IPTG 诱导后20℃培养20 h，在温度为4℃，转速为6000 rpm离心10min，倒掉上清，得到完全离心的菌体沉淀，用15 mL Tris-HCL 缓冲溶液重悬，重悬液进行超声破碎10 min(功率150 W，每超声3 s后暂停5 s)后，在温度为4℃，转速为6000 rpm再次进行离心10 min后，所得上清即为带有His标签的硫酸软骨素酶ABC粗酶液，其产量为1612±114.04IU/L发酵液；在其他的实施例中，宿主细胞可选为大肠杆菌BL21或大肠杆菌Trans109；

4）所述外切型硫酸软骨素酶ABC粗酶液用镍柱进行纯化，并进行SDS-PAGE 分析验证，验证结果参见图5，其分子大小为114kDa，电泳（30微升菌液）沉淀条带很浅，说明本实施例提供优化后的硫酸软骨素酶ABCII的可溶性很高。纯化后的外切型硫酸软骨素酶ABC用20%甘油1：1混合后保存至-80℃。

在其它实施例中，在重组构建的步骤中，当采用MBP标签时，最后得到带有MBP标签的硫酸软骨素酶ABC的分子大小为154.8 kDa；当采用GST标签时，最后得到带有MBP标签的硫酸软骨素酶ABC的分子大小为138 kDa。

性能表征

试验下面以本发明实施例得到的带有His标签的外切型硫酸软骨素酶ch ABC的粗酶液，且其酶活为2000IU/30ml的酶液为代表，进行外切型硫酸软骨素酶ABC的性能试验。

对比试验1 缓冲溶液对外切型硫酸软骨素酶ABC降解性能的影响

对比试验1 取 50g 的类肝素原料，使用去离子水配置成质量百分浓度为10%的溶液，使用稀盐酸调节pH值至7.4，得到溶液1；然后，在室温（30 ℃）下，磁力搅拌进行反应溶液1在前3 h内，每小时添加0.5 ml上述ch ABC II粗酶液，一共添加3次，总的添加量1.5ml(100IU)。

对比试验2 取 100g 的内肝素原料，使用 pH值为7.5的缓冲溶液(20mM Trisbuffer(20mM Tris ，200mM NaCl) 200mM NaCl)水配置成10%的溶液，使用稀盐酸调节pH值至7.4得到溶液2；溶液2在前3 h内，每小时添加 1.0 ml的上述ch ABC II粗酶液，一共添加3，总的添加量 3.0ml(200IU)

然后，分别监测溶液1和2在231nm下的光吸收度A₂₃₁，使用去离子水调零，其中，监测数据参见下表1。为了监测光吸收度的准确性，将紫外分光度计数控制0.1～0.8。由下表可以看出：溶液1和溶液2反应24 h后的A₂₃₁，由于稀释待测溶液时有一定误差1和2的A₂₃₁近似相等，初步判定缓冲液对酶解没有影响。溶液1和溶液2的23 h和24 h的A₂₃₁没有明显增加，说24 h是可以反应彻底的，即过了24 h后外切型硫酸软骨素酶ABC不起作用。

表1 溶液1和溶液2反应时在231 nm下的光吸收度A₂₃₁

对比试验2 温度对外切型硫酸软骨素酶ABC降解性能的影响

试验1

10 g 类肝素原料，100 ml 水和0.15 ml 上述外切型硫酸软骨素酶ABC的粗酶液，在32℃水浴中搅拌反应24 h，当环境温度超过32℃时，向水浴中加少许冰，整个反应过程不控制pH。

试验2

10 g 类肝素原料、100 ml水和0.15 ml上述外切型硫酸软骨素酶ABC的粗酶液，在42℃水浴中搅拌反应24 h，当环境温度超过32℃时，向水浴中加少许冰，整个反应过程不控制pH。

随着反应时间增加，试验1和试验2反应时溶液在231 nm光吸收度A₂₃₁变化参见表2，考虑到溶液稀释 4000 倍及紫外分光光度计检测带来的误差，32℃反应20 h与42℃反应20 h得到231 nm光吸收度A₂₃₁无明显变化，说明在反应温度区间32-42℃，酶的作用效果无明显差异。

表2 试验1和试验2反应时溶液在231 nm时的光吸收度A₂₃₁

对比试验3 pH值对外切型硫酸软骨素酶ABC降解性能的影响

试验1

100g 类肝素原料、1000ml 水和149.7μl 的上述外切型硫酸软骨素酶ABC粗酶溶液混合，在室温下搅拌反应，初始pH值为7.52，整个反应过程不调节pH值。

试验2：

100g 类肝素原料、1000ml水和149.7μl 的上述外切型硫酸软骨素酶ABC粗酶溶液混合，调节初始pH值至8.5，在室温下搅拌反应，整个反应过程不调节pH值。

试验3：

100g 类肝素原料、1000ml 水和149.7μl 的上述外切型硫酸软骨素酶ABC粗酶溶液混合，调节初始pH值至8.5，在室温下搅拌反应，每0.5 h 调节 pH 至 8.5。

初始光吸收度 A=0.625×100，随着反应时间增加，试验1、试验2和试验3反应时溶液在231 nm光吸收度A₂₃₁变化参见表3，试验1、试验2和试验3反应时溶液的pH值变化参见表4。对比表3和表4，考虑到溶液稀释1000倍测232 nm光吸收存在误差，可以认为反应25 h溶液试验1、试验2和试验3光吸收值没有明显差异，从而推出控制溶液pH值对酶解效果没有明显差异。

表3 试验1、试验2和试验3反应时溶液在232 nm时的光吸收度A₂₃₁

表4 试验1、试验2和试验3反应时溶液pH值

对比试验4 本发明外切型硫酸软骨素酶ABC的专属性

外切型硫酸软骨素酶ABC的专属性包括两方面：1.外切型硫酸软骨素酶ABC能降解CS和DS；2.外切型硫酸软骨素酶ABC不能降解HP和HS。

首先，外切型硫酸软骨素酶ABC不能降解肝素（HP）和硫酸乙酰肝素（HS）的试验设计：肝素酶I、HP和缓冲溶液，反应 48 h；肝素酶III、HS和缓冲溶液，反应 48 h；然后 HPLC检测 HP和 HS 对应的二糖，试验结果参见图6和图7，图6和图7表明HPLC均检测到了对应的二糖，说明酶解体系和 HPLC 分析系统是正常的。实施例1中得到的外切型硫酸软骨素酶ABC的粗酶液、HP和水，反应48 h，实施例1中得到的外切型硫酸软骨素酶ABC的粗酶液、HS和水，反应48 h，然后 HPLC 检测 HP 和 HS 对应的二糖，测试结果参见图8和图9，图8和图9表明未检测到了对应的二糖，说明本发明提供的外切型硫酸软骨素酶ABC不能降解 HP 和HS。

其次，为了证明外切型硫酸软骨素酶ABC能降解 CS和DS，实施例1中得到的外切型硫酸软骨素酶ABC的粗酶液、CS和水混合，在 37℃水浴反应 1 h，HPLC 检测CS对应的二糖，测试结果参见图10，图10表明 CS二糖 B、C、A都被检测到了，说明本发明提供的外切型硫酸软骨素酶ABC可以降解CS，20min 后的杂峰有可能是未彻底降解的CS，说明相对于外切型硫酸软骨素酶ABC的酶量，底物CS是过量的；实施例1中得到的外切型硫酸软骨素酶ABC的粗酶液、DS和水混合，在 37℃水浴反应 1 h，HPLC 检测DS对应的二糖，测试结果参见图11，图11表明 DS二糖被检测到了，说明本发明提供的外切型硫酸软骨素酶ABC可以降解CS，20min后的杂峰有可能是未彻底降解的DS，说明相对于外切型硫酸软骨素酶ABC的酶量，底物DS是过量的。

对比试验5 本发明外切型硫酸软骨素酶ABC和市售产品的降解能力比较

为了比较本发明提供的外切型硫酸软骨素酶ABC与Sigma公司市售硫酸软骨素酶AC和硫酸软骨素酶B的降解能力，进行了以下试验。

试验1：100g类肝素原料加入去离子水稀释至10%，加入200IU的外切型硫酸软骨素酶ABC粗酶，在室温（30℃）下，磁力搅拌下进行反应24 h，然后加入1000 ml无水乙醇沉淀，取沉淀冻干检测CS和DS的百分含量，冻干后质量25.01g。

试验2：100g类肝素原料按照加入去离子水稀释至10%，加入205IU的硫酸软骨素酶B粗酶和60IU的硫酸软骨素酶AC粗酶，在室温（30℃）下，磁力搅拌下进行反应24 h，然后加入1000 ml无水乙醇沉淀，取沉淀冻干检测CS和DS的百分含量，冻干后质量24.65 g，检测结果参见表5。

表5 本发明外切型硫酸软骨素酶ABC和市售产品降解性能对比

由表5可知：100g类肝素原料中CS质量21.60 g，试验1中本发明提供的外切型硫酸软骨素酶ABC处理后CS的含量降为0.7%，DS的含量降为2.4%，试验2中酶B和AC处理后CS的含量降为3.65%，DS的含量降为10.15%，因此，本发明提供的外切型硫酸软骨素酶ABC的降解能力大于市售硫酸软骨素酶AC和硫酸软骨素酶B的组合。

最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。

序列表

<110> 北京电子科技职业学院

<120>一种外切型硫酸软骨素酶ABC及其制备方法与应用

<130> 2017

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2973

<212> DNA

<213> 硫酸软骨素酶chABCII

<400> 1

CTGCCGACCC TGAGCCACGA AGCGTTCGGC GACATCTACC TGTTCGAGGG

TGAACTGCCG AACACCCTGA CCACCAGCAA CAACAACCAG CTGAGCCTGA

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CCACAACAAC AACACCCTGA TCACCACCAC CACCATTCAA GCGACCCCGA

CCGTTATCAA CCTGGTGAAA TAA

<210> 2

<211> 2973

<212> DNA

<213> 硫酸软骨素酶 ABC

<400> 2

TTACCCACTC TGTCTCATGA AGCTTTCGGC GATATTTATC TTTTTGAAGG

CGAATTACCC AATATCCTTA CCACTTCAAA TAATAATCAA TTATCGCTAA

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GCTGATGGCT CAATCACAGG AAAAGCCCTT GATCACCCTA ACCGGCAACA

TTTTATGAAA GTCGAAGGTG TATTTAGTGA GGGGACTCAA AAAGCATTAC

TTGATGCCAA TATGCTAAGA GATGTGGGCA AAACGCTTCT TCAAACTGCT

ATTTACTTGC GTAGCGATTC ATTATCAGCA ACTGGTAGAA AAAAATTAGA

AGAGCGCTAT TTATTAGGTA CTCGTTATGT CCTTGAACAA GGTTTTACAC

GAGGAAGTGG TTATCAAATT ATTACTCATG TTGGTTACCA AACCAGAGAA

CTTTTTGATG CATGGTTTAT TGGCCGTCAT GTTCTTGCAA AAAATAACCT

TTTAGCCCCC ACTCAACAAG CTATGATGTG GTACAACGCC ACAGGACGTA

TTTTTGAAAA AGATAATGAA ATTGTTGATG CAAATGTCGA TATTCTCAAT

ACTCAATTGC AATGGATGAT AAAAAGCTTA TTGATGCTAC CGGATTATCA

ACAACGTCAA CAAGCCTTAG CGCAACTGCA AAGTTGGCTA AATAAAACCA

TTCTAAGCTC AAAAGGTGTT GCTGGCGGTT TCAAATCTGA TGGTTCTATT

TTTCACCATT CACAACATTA CCCCGCTTAT GCTAAAGATG CATTTGGTGG

TTTAGCACCC AGTGTTTATG CATTAAGTGA TTCACCTTTT CGCTTATCTA

CTTCAGCACA TGAGCATTTA AAAGATGTTT TGTTAAAAAT GCGGATCTAC

ACCAAAGAGA CACAAATTCC TGTGGTATTA AGTGGTCGTC ATCCAACTGG

GTTGCATAAA ATAGGGATCG CGCCATTTAA ATGGATGGCA TTAGCAGGAA

CCCCAGATGG CAAACAAAAG TTAGATACCA CATTATCCGC CGCTTATGCA

AACTTAGACA ACAAAACGCA TTTTGAAGGC ATTAACGCTG AAAGTGAGCC

AGTCGGCGCA TGGGCAATGA ATTATGCATC AATGGCAATA CAACGAAGAG

CATCGACCCA ATCACCACAA CAAAGCTGGC TCGCCATAGC GCGCGGTTTT

AGCCGTTATC TTGTTGGTAA TGAAAGCTAT GAAAATAACA ACCGTTATGG

TCGTTATTTA CAATATGGAC AATTGGAAAT TATTCCAGCT GATTTAACTC

AATCAGGGTT TAGCCATGCT GGATGGGATT GGAATAGATA TCCAGGTACA

ACAACTATTC ATCTTCCCTA TAACGAACTT GAAGCAAAAC TTAATCAATT

ACCTGCTGCA GGTATTGAAG AAATGTTGCT TTCAACAGAA AGTTACTCTG

GTGCAAATAC CCTTAATAAT AACAGTATGT TTGCCATGAA ATTACACGGT

CACAGTAAAT ATCAACAACA AAGCTTAAGG GCAAATAAAT CCTATTTCTT

ATTTGATAAT AGAGTTATTG CTTTAGGCTC AGGTATTGAA AATGATGATA

AACAACATAC GACCGAAACA ACACTATTCC AGTTTGCCGT CCCTAAATTA

CAGTCAGTGA TCATTAATGG CAAAAAGGTA AATCAATTAG ATACTCAATT

AACTTTAAAT AATGCAGATA CATTAATTGA TCCTGCCGGC AATTTATATA

AGCTCACTAA AGGACAAACT GTAAAATTTA GTTATCAAAA ACAACATTCA

CTTGATGATA GAAATTCAAA ACCAACAGAA CAATTATTTG CAACAGCTGT

TATTTCTCAT GGTAAGGCAC CGAGTAATGA AAATTATGAA TATGCAATAG

CTATCGAAGC ACAAAATAAT AAAGCTCCCA AATACACAGT ATTACAACAT

AATGATCAGC TCCATGCGGT AAAAGATAAA ATAACCCAAG AAGAGGGATA

TGGTTTTTTT GAAGCCACTA AGTTAAAATC AGCGGATGCA ACATTATTAT

CCAGTGATGC GCCGGTTATG GTCATGGCTA AAATACAAAA TCAGCAATTA

ACATTAAGTA TTGTTAATCC TGATTTAAAT TTATATCAAG GTAGAGAAAA

AGATCAATTT GATGATAAAG GTAATCAAAT CGAAGTTAGT GTTTATTCTC

GTCATTGGCT TACAGCAGAA TCGCAATCAA CAAATAGTAC TATTACCGTA

AAAGGAATAT GGAAATTAAC GACACCTCAA CCCGGTGTTA TTATTAAGCA

CCACAATAAC AACACTCTTA TTACGACAAC AACCATACAG GCAACACCTA

CTGTTATTAA TTTAGTTAAG TAA

Claims

1. 一种外切型硫酸软骨素酶ABC，其特征在于，它的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

2. 一种外切型硫酸软骨素酶ABC融合蛋白，它融合有外切型硫酸软骨素酶ABC和纯化标签，其特征在于，所述外切型硫酸软骨素酶ABC的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，所述纯化标签为His标签、MBP标签或GST标签。

3. 根据权利要求2所述的外切型硫酸软骨素酶ABC融合蛋白，其特征在于，它的分子量为114～154.8 kDa。

4. 根据权利要求2所述的外切型硫酸软骨素酶ABC，其特征在于，以硫酸软骨素A及硫酸软骨素C的混合物为底物时，所述外切型硫酸软骨素酶ABC融合蛋白的酶活为 1553～5968 IU/L发酵液。

5.一种重组载体，其特征在于，它包括载体和与所述载体连接的权利要求2或3或4所述的外切型硫酸软骨素酶ABC融合蛋白，其中，所述载体为pET-28a、PMAL-C2X或pGEX-4T1。

6.一种转化体，其特征在于，它是将权利要求5所述的重组载体转化到宿主细胞中进行表达而得到的，其中，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21、大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌Trans109。

7. 一种外切型硫酸软骨素酶ABC的制备方法，其步骤包括：从普通变形杆菌中获取硫酸软骨素酶ABC的原始DNA序列；对所述原始DNA序列进行密码子优化，得到如SEQ ID NO.1所示的DNA序列；扩增如SEQ ID NO.1所示的DNA序列，并和载体进行重组构建，得到重组载体；将所述重组载体转化至大肠杆菌表达，获得转化体；培养所述转化体，并进行物理破碎处理，得到所述外切型硫酸软骨素酶ABC。

8. 根据权利要求7所述的外切型硫酸软骨素酶ABC的制备方法，其特征在于，所述培养所述转化体的步骤包括：采用LB培养基在37℃培养所述转化体1～3 h，加入终浓度为0.3～0.6 mM的IPTG诱导，然后在16℃～20℃培养18～24 h。

9. 一种外切型硫酸软骨素酶ABC的应用，其包括采用外切型硫酸软骨素酶AC对类肝素原料中硫酸软骨素进行降解的步骤，其中，所述外切型硫酸软骨素酶AC的DNA序列如SEQ IDNO.1所示。

10.根据权利要求9所述的外切型硫酸软骨素酶ABC的应用，其特征在于，它包括：以水为缓冲溶液，在温度为32～42℃、pH值为7.5～8.5的条件下，采用所述外切型硫酸软骨素酶ABC对类肝素原料中硫酸软骨素进行降解。