JPH0698769A

JPH0698769A - コンドロイチナーゼ及びその遺伝子

Info

Publication number: JPH0698769A
Application number: JP25301692A
Authority: JP
Inventors: Nobuyuki Sato; 信行佐藤; Masahiko Shimada; 昌彦島田; Koji Oda; 浩司織田; Seiji Kimura; 省二木村
Original assignee: Maruha Corp
Current assignee: Maruha Corp
Priority date: 1992-09-22
Filing date: 1992-09-22
Publication date: 1994-04-12

Abstract

(57)【要約】【目的】コンドロイチナーゼＡＢＣを有するプロテウ
ス属細菌のなかでも代表的なプロテウスブルガリスの
コンドロイチナーゼを単離・精製し、かかるコンドロイ
チナーゼのＮ末端配列その他の理化学的性質を明らかに
すること、さらには当該コンドロイチナーゼをコードす
る遺伝子の構造を明らかにして、これを遺伝子工学的手
法によって、純粋な形で安価かつ大量に提供する手段を
確立すること。【構成】作用、至適ｐＨ、熱安定性、分子量、金属イ
オンの影響、Ｎ末端のアミノ酸配列、及び精製方法によ
り明らかにされるコンドロイチナーゼ、並びに当該コン
ドロイチナーゼの遺伝子の構造。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、コンドロイチナーゼ活
性を有する新規な酵素、及び当該酵素蛋白をコードする
遺伝子に関する。

【０００２】

【従来の技術】コンドロイチナーゼは、ムコ多糖の一種
である、コンドロイチン硫酸Ａ、同Ｂ、同Ｃ、及びヒア
ルロン酸を不飽和二糖に分解する活性を有する酵素であ
る。かかるコンドロイチナーゼは、上記基質の用途に応
じた低分子化や種々の研究用試薬として用いられてい
る。

【０００３】コンドロイチナーゼは、現在までに多くの
微生物においてその存在が知られている。例えば、プロ
テウス属、フラボバクテリュウム属、バクテロイデス
属、アルスロバクター属、シュウドモナス属、コリネバ
クテリュウム属、ビブリオ属、マイクロコッカス属、ア
エロモナス属、ベネキア属、ストレプトコッカス属、バ
チルス属等においてコンドロイチナーゼの存在が確認さ
れている。ただし、これらのコンドロイチナーゼは、各
々の微生物によって基質特異性や阻害物質が微妙に異な
っている。

【０００４】上記のなかでもプロテウス属については、
古くからコンドロイチナーゼの存在が確認されており
（ジャーナルオブバイオケミストリー，243 ，1523
(1968)、ジャーナルオブジェネラルマイクロバイ
オロジー ,80,515(1974)、バイオケミカルジャーナル,1
45,397(1975)) 、発明者等も「ジャーナルオブバイ
オケミストリー,50,1057(1986)」でプロテウスブルガ
リスにおけるコンドロイチナーゼの存在を明らかにして
いる。このコンドロイチナーゼは、「コンドロイチナー
ゼＡＢＣ」とよばれるコンドロイチン硫酸Ａ、同Ｂ、及
び同Ｃをすべて分解する能力を有するコンドロイチナー
ゼの範疇に属する酵素であることはすでに明らかにされ
ている。そして、さらに当該コンドロイチナーゼの単離
・精製が試みられているが、多数の報告における分子量
は統一されておらず、確立した見解を得るには至ってい
ない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明の課題
は、コンドロイチナーゼＡＢＣを有するプロテウス属細
菌のなかでも代表的なプロテウスブルガリスのコンド
ロイチナーゼを単離・精製し、かかるコンドロイチナー
ゼのＮ末端配列その他の理化学的性質を明らかにするこ
と、さらには当該コンドロイチナーゼをコードする遺伝
子の構造を明らかにして、これを遺伝子工学的手法によ
って、純粋な形で安価かつ大量に提供する手段を確立す
ることにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題の
解決のために鋭意検討を重ねた結果、プロテウスブル
ガリスの生産するコンドロイチナーゼを完全な形で分離
・精製し、その理化学的性質、さらには当該コンドロイ
チナーゼをコードする遺伝子の構造を明らかにすること
に成功した。

【０００７】すなわち、本願は以下の発明を提供するも
のである。Ａ．以下の理化学的性質を有するコンドロイチナーゼ (1) 作用：コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸
Ｂ、コンドロイチン硫酸Ｃ、及びヒアルロン酸を分解
して、不飽和二糖に分解する。 (2) 至適ｐＨ：8.0 付近 (3) 熱安定性：10分間のインキュベートで40℃まで安
定。活性は30℃において安定。 (4) 分子量：SDS-ポリアクリドアミドゲル電気泳動によ
る測定において、90,000〜96,000。 (5) 金属イオンの影響性：酵素活性は１mMのFeCl₂の存
在下で、10％の酵素活性の増大が認められるが、１mM
のZnCl₂とNiCl₂によって完全に酵素活性が阻害され
る。 (6) Ｎ末端のアミノ酸配列：配列番号１に示されるアミ
ノ酸配列を有する。 (7) 精製方法：コンドロイチナーゼ生産培地で培養し
たプロテウスブルガリス（Ｐroteus vulgaris ：IF
O 3988) の菌体を破砕する。

【０００８】硫酸アンモニウム沈澱（70％飽和）によ
って得られた沈澱をリン酸緩衝液（10mM pH8．5)で溶解
後、当該緩衝液で透析する。イオン交換クロマトグラフィーで活性画分を分画す
る。ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーで活
性画分を分画する。亜鉛をリガンドとしたアフィニティクロマトラフィー
で活性画分を分画する。

【０００９】ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグ
ラフィーで活性画分を分画する。Ｂ．以下の特徴を有するコンドロイチナーゼの遺伝子 (1) 配列番号２に示す塩基配列を含む。 (2) 制限酵素地図：

【００１０】

【化２】

【００１１】１．本発明コンドロイチナーゼの単離・精
製本発明のコンドロイチナーゼの起源となるプロテウス
ブルガリスは、菌株として、すでに確立したものを入手
してそのまま前培養して用いることができる。具体的に
は、プロテウスブルガリス IFO 3988や同 NCTC 4636
等を用いることができる。

【００１２】菌の培養方法は、プロテウスブルガリス
においてコンドロイチナーゼの生産を企図する方法とし
て確立している方法を採用することができる。すなわ
ち、培地として、炭素源、窒素源、無機イオンを基本的
構成成分として含み、必要に応じて硝酸塩、リン酸塩、
ビタミン類、補酵素等が添加されたものを用いて、好気
条件下で培養することができる。上記において、培地の
炭素源としては、炭素源として通常用いられる成分、例
えばグルコース、グルコースを含有するでんぷんの加水
分解物、糖蜜等を用いることもできる。しかしながら、
本発明においては、各種のコンドロイチン硫酸を炭素源
として用いるのがコンドロイチナーゼの効率的誘導をす
るうえで好ましい。さらに、窒素源としては、ポリペプ
トン、トリプトン、肉エキス、酵母エキス等を用いるこ
とができる。また、培地のpHは中性域に調整するのが好
ましいが、必ずかかる調整が必要というわけではない。
この培養は菌体中のコンドロイチナーゼ活性が最高にな
るまで行う。

【００１３】なお、このコンドロイチナーゼ活性、すな
わちコンドロイチナーゼＡＢＣ活性の測定は、既に確立
している方法を用いることで行うことができる。例え
ば、ライジッヒらの方法（Reissig et al,ジャーナル
オブバイオロジカルケミストリー,217,959(1955))
等に従って行うことができる。次に、本発明のコンドロ
イチナーゼの単離・精製は、菌体の破砕→塩拆→
イオン交換クロマトグラフィーによる分離→ヒドロキ
シアパタイトカラムクロマトグラフィーによる分離→
亜鉛をリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィ
ーによる分離→ヒドロキシアパタイトカラムクロマト
グラフィーによる分離という手順に従って行われる。

【００１４】菌体の破砕・塩拆プロテウスブルガリスの菌体の破砕は、通常菌体の破
砕法として用いられる手段、例えば、破砕器を用いた破
砕、超音波による破砕、浸透圧ショックによる破砕等の
手段を用いることできる。上記破砕法により得られた破
砕物は、通常遠心分離にかけられ、その上清を塩拆法に
処するが、塩拆の前提として、必ず当該操作が必要とい
うわけではない。

【００１５】塩拆において、硫酸アンモニウムを用いる
場合には、70％飽和程度で塩拆を実行するのが好まし
い。イオン交換クロマトグラフィーによる分離かかる分離に際して用いられるカラムの充填剤は、イオ
ン交換による分離が可能である樹脂であるならば、陽イ
オン交換樹脂であると、陰イオン交換樹脂であるとを問
わない。ただし、少量で所望のコンドロイチナーゼを多
量に吸着することが可能という点から、強陰イオン交換
体を用いるのが好ましい。強陰イオン交換体としては、
例えば、QAE A-25、Sephadex A-50(ファルマシア社製)
、AG1(バイオラッド社製) 等を挙げることができる。

【００１６】ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグ
ラフィーによる分離かかる分離に際して用いられるヒドロキシアパタイトカ
ラムは、一般的に当該分離に用いられる市販品を広く用
いることができる。溶出条件等は、後述の実施例におい
て、具体的に記載する。亜鉛をリガンドとしたアフィニティークロマトグラフ
ィーによる分離かかるアフィニティークロマトグラフィーの調製方法等
は、特開昭62-122588号公報に記載の方法に従うことに
より、実行可能である。

【００１７】最後のヒドロキシアパタイトカラムクロ
マトグラフィーによる分離については、前記とほぼ同
様に実行することができる。上記により、単離・精製し
たコンドロイチナーゼの理化学的性質については、後記
実施例において説明する。２．本発明遺伝子の構造の解析本発明遺伝子は、通常公知の方法を用いて単離すること
ができる。すなわち、プロテウスブルガリスの菌体よ
り、直接全ＤＮＡを抽出して、これを適切なベクターに
導入する。次に、かかる導入ベクターをそのベクターの
種類に対応した宿主に導入して、プロテウスブルガリ
スの全ＤＮＡについての遺伝子ライブラリーを調製す
る。そして、当該遺伝子ライブラリーから、本発明遺伝
子を含むクローンを選択する。かかる選択手段として
は、例えば、前記において単離・精製したコンドロイチ
ナーゼの有するアミノ酸配列の全部又は一部解析して、
当該アミノ酸配列に対応した塩基配列を有するポリヌク
レオチド鎖をプローブとして選択する方法を例示するこ
とができる。更に、当該塩基配列に応じたプローブを用
いて、所望の遺伝子をPCR 法(Saiki,R et al.,Ａm.J.Ｈ
um. Ｇenet.,37,172(1985)) に従って増幅して単離する
ことも可能である。

【００１８】上記クローンの塩基配列の決定は、通常公
知の方法、例えばマキサム- ギルバート法( Ｍaxam-Gil
bert. ，Ｍeth.Ｅnzym,65 ,499-560(1980)) や、M13 フ
ァージをもちいる、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法(M
essing. Ｊ. and Vieire.,Gene,19, 269-276(1982)) 等
により実行することができる。なお、既存の各種の制限
酵素を用いて、制限酵素地図を作成して、本発明遺伝子
の全体構造を明らかにすることもできる。

【００１９】このようにして、一旦決定された塩基配列
を有する本発明遺伝子を再度、プロテウスブルガリス
から調製することも可能であるが、これを直接ＤＮＡ合
成機で化学合成することもできる。

【００２０】

【実施例】以下、本発明を実施例を用いて説明する。

【００２１】

【実施例１】 (1) プロテウスブルガリス（Proteus vulgaris:IFO 3
988)の培養上記プロテウスブルガリスを10l のLB培地( ペプトン
10g,酵母エキス5g, 塩化ナトリウム10g)で30℃で12時間
前培養し、これを集菌後、コンドロイチン６硫酸10g を
含むコンドロイチナーゼＡＢＣ生産培地（リン酸二カリ
ウム0.7 ％, リン酸一カリウム0.3 ％, 硫酸マグネシウ
ム0.01％, 硫酸アンモニウム0.1 ％, ニコチン酸1mg)20
l に移し、30℃下で30時間培養した。 (2) コンドロイチナーゼＡＢＣの精製精製したコンドロイチナーゼＡＢＣの活性の測定は、
ライジッヒらの方法（Reissig et al,ジャーナルオブ
バイオロジカルケミストリー, 217, 959(1955)）に
従って行った。すなわち、N-アセチルヘキソサミンを含
む試料0.5ml を試験管にとり、0.1ml のほう酸塩溶液
(4.95gのほう酸を50mlの水に溶かし、1Nの水酸化ナトリ
ウムでpHを9.1 に調製したものを、水で100ml にしたも
の）を加えて、3 分間沸騰水中で反応させた。反応液を
水冷後、3.0ml のパラメジメチルアミノベンズアルデヒ
ド試薬( パラメジメチルアミノベンズアルデヒド10g を
10Nの塩酸12.5mlと酢酸87.5mlの混合液に溶かし、使用
するとき酢酸で10倍に希釈したもの) を加えた。これを
攪拌後、37℃下で20分間放置して、これを冷水で10分間
冷したものの585nm の吸光度を測定した。

【００２２】上記(1) で得た培養液より、集菌(120g)
後、当該菌体をダイノミルで破砕し、硫安で塩拆を1 時
間行った(70 ％飽和) 。これにより生じた沈澱を遠心分
離により集め、少量のリン酸緩衝液(10mM 、pH8.5)に溶
解後、同緩衝液で一晩透析した。この透析の後、同緩衝
液で平衡化した、Q-セファロースカラムクロマトグラフ
ィー(Fast Flow: φ5.5 ×26.0cm)(ファルマシア社製)
に試料を供し、10-800mMの塩化ナトリウム直線勾配で溶
出させて、活性画分を集めた。当該活性画分を、ポアサ
イズ30000 の限外ろ過膜であるミニタン( ミリジエン社
製) で濃縮した後、リン酸緩衝液(10mM 、pH7.2)で3 時
間透析を行った。当該試料をFPLCシステム( ファルマシ
ア社製) を用いたセラミックヒドロキシアパタイト( 東
燃社製)カラムクロマトグラフィー( φ6.2 ×12.5cm)
(リン酸緩衝液(10mM 、pH7.2)で平衡化させた) に供し
た。そして、10-600mMリン酸緩衝液の直線勾配で溶出し
て活性画分を集めた。当該活性画分を前出のミニタンで
濃縮後、10ｍM トリス緩衝液(pH8.0) に5 時間透析し
て、亜鉛をリガンドとしたアフィニティークロマトグラ
フィー( 特開昭62-122588 号公報) に供した。当該アフ
ィニティークロマトグラフィーのカラム( φ2.0 ×12.5
cm) は、予め亜鉛をキレートし、20ｍM トリス緩衝液(
pH8.0)で平衡化した。これを、0.5M塩化ナトリウムを含
む、20mM HEPES,20mM MES,20mM酢酸緩衝液(pH 8.0)で洗
浄後、同じ組成の緩衝液( 但し、pH 4.0)とのpH勾配で
溶出を行った。直ちに、当該溶出液中の活性画分を集
め、10ｍM リン酸緩衝液でこれを透析した。最後に、か
かる透析画分を、本実施例中前記したと同じ条件で、ヒ
ドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーに供し
た。そして、当該クロマトグラフィーにより得た活性画
分を、コンドロイチナーゼの最終酵素標品とした。この
標品は電気泳動的に単一であり、当該分子量は、SDS-ポ
リアクリルアミド電気泳動で、94,000と予測された。

【００２３】表１に、上記コンドロイチナーゼの精製の
結果をまとめて記載する。

【００２４】

【表１】

【００２５】(3) コンドロイチナーゼのＮ末端アミノ酸
配列 (2) において精製したコンドロイチナーゼを自動アミノ
酸配列分析装置に供して、当該コンドロイチナーゼのＮ
末端アミノ酸配列を確認した結果、配列番号３に示され
るアミノ酸配列が、本発明のコンドロイチナーゼに存在
することが判明した。 (4) ｐＨの影響 (2) において精製したコンドロイチナーゼの種々の緩衝
液中(0.1M)におけるpHの影響を検討した。検討した緩衝
液とpHは、以下の通りである。

【００２６】 pH 4.0, 5.0, 6.0 ( 酢酸緩衝液) pH 6.0, 7.0 ( リン酸緩衝液) pH 7.0, 8.0, 9.0 ( トリス緩衝液) pH 9.0, 10.0, 11.0 ( グリシン-KOH緩衝液) この結果、コンドロイチナーゼＡＢＣ活性は、緩衝液の
pHが8.0 のとき最大であった。 (5) 至適温度及び熱安定性コンドロイチナーゼの至適温度を測定するために、2
0, 25, 30, 35, 37, 40, 45, 50, 60℃において、トリ
ス緩衝液(pH8.0) 中で、コンドロイチナーゼＡＢＣ活性
の測定を行った。その結果、30℃で最大のコンドロイチ
ナーゼＡＢＣ活性が認められた。

【００２７】コンドロイチナーゼの熱安定性を検討す
るために、予め、30, 35, 40, 45,50, 60℃中で10分間
インキュベートした酵素液で、コンドロイチナーゼＡＢ
Ｃ活性の測定を行った。その結果、40℃までは、上記30
℃における当該活性に対して、90％以上活性が維持さ
れることが判明した。 (6) 金属イオンの影響性酵素反応液中（コンドロイチン硫酸Ｃ 0.5％, トリス緩
衝液(pH8.0) ）に、１mMのMgCl₂,MnCl₂,CuCl₂,FeCl₂,Ni
Cl₂,CoCl₂,ZnCl₂をそれぞれ添加して、添加しない系と
のコンドロイチナーゼＡＢＣ活性の比較を行った。

【００２８】その結果、FeCl₂を添加したものは、約10
％活性が増加した。しかしながら、他の金属イオンを添
加したものは活性を阻害する傾向にあることが判明し
た。特に、ZnCl₂とNiCl₂ を添加したものは、ほぼ、10
0 ％活性を阻害した。

【００２９】

【実施例２】 (1) プロテウスブルガリスのGenomic ＤＮＡの調製プロテウスブルガリス（Proteus vulgaris:IFO 3988)
の菌体２ｇを５mlの50mMトリス(pH 8.0)-50mM EDTA に
懸濁して、これを−20℃で凍結した。これを融解後、0.
25M トリス(pH 8.0)中に、10mg／mlの濃度でリゾチーム
を含む溶液0.5ml を添加し、これを45分間氷上に放置し
た。次いで、６mlの 0.5％SDS 、50mMトリス(pH 8.0)、
0.4M EDTA を添加後、50℃で１時間処理を行った。当該
処理後、６mlの水飽和フェノールを添加し、これを攪拌
後遠心分離に処し、水層を除去した。この水層に 0.1倍
量の3M酢酸ナトリウムを加えた後、２倍量のエタノール
を加えて、糸状に現れるＤＮＡをガラス棒で回収した。
回収したＤＮＡは、乾燥後、10mMトリス(pH 8.0)-1mM E
DTA 液に溶解した。 (2) ファージライブラリーの作成上記(1) で得た、プロテウスブルガリスのGenomic Ｄ
ＮＡ(200μg ／ml) に10μL のＨバッファー( 宝酒造社
製) 及び制限酵素Sau 3AI(宝酒造社製) を添加して、全
量を100μL にした。これを、37℃で５分間反応させた
後、75℃に系をシフトアップして反応を停止させて、こ
れをエタノール沈澱に供した。このエタノール沈澱によ
り得られたＤＮＡをλファージEMBL3 キット( ストラタ
ジーン社製) に挿入した。なお、この挿入方法は当該キ
ットの解説書に従った。次いで、挿入済のＤＮＡ溶液
を、ギガパックゴールド( ストラタジーン社製) を用い
たインビトロパッケージングに供し、所望のＤＮＡラ
イブラリーを調製した。なお、この調製方法は解説書に
従った。 (3) 合成ＤＮＡプローブの作成配列番号１に示した、決定されたＮ末端アミノ酸配列を
基にして、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列
番号６、配列番号７、配列番号８に示された塩基配列を
有する合成ＤＮＡプローブを等しい割合で含む、ミック
スプローブを調製した。なお、各々のＤＮＡプローブ
は、アプライドバイオシステムズ社製のＤＮＡ合成装
置で合成した。

【００３０】上記ミックスプローブ 0.5μｇに５μL の
10×T4ポリヌクレオチドバッファー( 東洋紡社製 )、9.
25MBq のγ³²P-ATP(アマーシャム社製) を８μL 、及び
T4ポリヌクレオチドキナーゼを３μL 加え、滅菌水で全
量を50μL に調製した。次いで、この系において、37℃
で１時間リン酸化反応を行った。当該反応後、バイオス
ピンカラム( バイオラッド社製) に供して5'末端がアイ
ソトープラベルされたオリゴヌクレオチドプローブを得
た。 (4) スクリーニングインビトロパッケージングキット( ストラタジーン社
製) の使用書に記載された方法で、(2) で得られた組換
えλファージを大腸菌P2392 に感染させ、NZYプレート
上に塗布した。このNZY プレートを37℃で一晩培養し、
溶菌プラーク数がプレート当たり、約20000個になった
ものを、４℃下で１時間放置した。その後、当該プレー
トの表面に、９×4.5cm のナイロンメンブラン( アマー
シャム社製) を密着させて、λファージを当該フィルタ
ー上に移し、このフィルターを変性溶液(0.5M NaOH,1.5
M NaCl) に２分、続いて中和溶液(0.5M トリス(pH 8.
0),1.5M NaCl) に２分、更に0.3M NaCl, 0.03Mクエン酸
三ナトリウム(2×SSC)(pH 7.4)及び2mM EDTAでリンス
後、これを１時間風乾した。次いで、これをトランスイ
ルミネター上で紫外線処理を行った。

【００３１】この紫外線処理済のフィルター１枚当たり
２mlになるように、ラピッドハイブリダイゼーションバ
ッファー( アマーシャム社製) を加え、60℃下で30分間
処理した。これに次いで、(3) で作成したアイソトープ
ラベルを施した、合成ミックスプローブを当該ナイロン
メンブラン一枚当たり、50万cpm となるように添加し
て、２時間のハイブリダイゼーションを行った。

【００３２】ハイブリダイズ終了後、２×SSC 及び 0.1
％SDS で10分間、１×SSC 及び0.1％SDS で15分間、反
応済フィルターを洗浄した。そして、最後にこれを風乾
後、オートラジオグラフにとった。その結果、８個の陽
性シグナルを与えるクローンを得た。 (5) 制限酵素地図の作成制限酵素地図の作成は、以下の制限酵素を用いて行っ
た。なお、各々の酵素反応は宝酒造社の使用書に従って
行った。

【００３３】 EcoRI, BamHI, EcoRV, ClaI, PmaCI, SalI その結果を図１に示す。なお、本発明遺伝子を含む組換
えλファージから、上記制限酵素地図で示した遺伝子
（EcoRI −EcoRV 断片) を切り出したものを、シャロミ
ド９−36( 日本ジーン社製) に挿入し(pSOS 10) 、かか
るプラスミドによって大腸菌DH1 を形質転換した(E.col
i DH1/pSOS 10)。この形質転換体は、工業技術院微生物
工業研究所に、微工研菌寄第13057 号(FERM P-13057)と
して寄託されている。 (6) 塩基配列の決定上記E.coli DH1/pSOS 10から、通常公知の方法に従って
プラスミドpSOS 10 を分離して、当該プラスミドpSOS 1
0)１μg を、BamHI 及びEcoRI(共に宝酒造社製) で消化
し、この制限断片にアガロースゲル電気泳動を施し、約
5Kbpの断片を回収した。当該断片を制限酵素Sau 3AI(宝
酒造社製 )１ユニットで15分間反応させて、部分分解物
を調製した。この部分分解物の5'末端をCIP(ベーリンガ
ーマンハイム山之内社製) で処理した。この処理済部分
分解物に制限酵素Sau 3AI で完全分解したベクタープラ
スミドpBluescript SK⁺( 東洋紡社製)100ngに挿入し
た。この様々な、Sau 3AI 断片を含む組換えプラスミド
のなかで、最大の挿入断片を含むものを選択して、(3)
において示したミックスプローブと親和性の高い領域で
の塩基配列をＴth DNA シーケンスキット( 東洋紡社
製) を用いたジデオキシ法でコンドロイチナーゼをコー
ドする遺伝子の塩基配列を決定した。

【００３４】かかる塩基配列の決定により、当該コンド
ロイチナーゼをコードする遺伝子には、潜在的な−35領
域( ヌクレオチド番号161,255)、−10領域( ヌクレオチ
ド番号169,268)、SD配列(213) が存在する。また、297
−398 の領域にコンドロイチナーゼＡＢＣと相同なアミ
ノ酸をコードする塩基配列が存在する。当該遺伝子の全
体構造を図２に示し、配列番号２に具体的な塩基配列を
示す。そして、さらに当該塩基配列から推定されるアミ
ノ酸配列を配列番号９に示す。

【００３５】

【発明の効果】本発明により、分子量的に均一なコンド
ロイチナーゼの精製品の提供が可能になり、さらに、当
該コンドロイチナーゼの遺伝子構造の解析により、大量
のコンドロイチナーゼの提供が可能になった。

【００３６】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：３４配列の型：アミノ酸トポロジー：不明配列の種類：ペプチド配列の起源：プロテウスブルガリスコンドロイチナ
ーゼ配列：Ala Thr Ser Asn Pro Ala Phe Asp Pro Lys 10 Asn Leu Met Gln Ser Glu Ile Tyr His Phe 20 Ala Gln Asn Asn Pro Leu Ala Asp Phe Ser 30 Ser Asp Lys Asn 34 配列番号：２配列の長さ：１５９６配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列の起源：プロテウスブルガリスコンドロイチナ
ーゼ配列：GATATCAATCAACGCCACAGCCTACCTATTTAATACAGCGGCAAGTAC 48 CTTGATATTAAAGGAAATACCGTTGGTGGTGACATTATTAGTGCGGAA 96 TTAGGTGCAAATCTCGATATCACTCAATCATTAAATTTAGGCACAACG 144 ATGGGCTATCAGCGTTATGACAAATTTAATGAAGGACGCATTGGTTTC 192 ACTGTTAGCCAGCGTTTCTAAGGAGAAAAATAATGCCGATATTTCGTT 240 TTACTGCACTTGCAATGACATTGGGGCTATTATCAGCGCCTTATAACG 288 CG 290 ATG GCA GCC ACC AGC AAT CCT GCA TTT GAT CCT AAA 326 AAT CTG ATG CAG TCA GAA ATT TAC CAT TTT GCA CAA 362 AAT AAC CCA TTA GCA GAC TTC TCA TCA GAT AAA AAC 398 TCA ATA CTA ACG TTA TCT GAT AAA CGT AGC ATT ATG 434 GGA AAC CAA TCT CTT TTA TGG AAA TGG AAA GGT GGT 470 AGT AGC TTT ACT TTA CAT AAA AAA CTG ATT GTC CCC 506 ACC GAT AAA GAA GCA TCT AAA GCA TGG GGA CGC TCA 542 TCT ACC CCC GTT TTC TCA TTT TGG CTT TAC AAT GAA 578 AAA CCG ATT GAT GGT TAT CCT ACT ATC GAT TTC GGA 614 GAA AAA CTC ATT TCA ACC AGT GAG GCT CAG GCA GGC 650 TTT AAA GTA AAA TTA GAT TTC ACT GGC TGG CGT GCT 686 GTG GGA GTC TCT TTA AAT AAC GAT CTT GAA AAT CGA 722 CTT GAA AAT CGA GAG ATG ACC TTA AAT GCA ACC AAT 758 ACC TCC TCT GAT GGT ACT CAA GAC AGC ATT GGG CGT 794 TCT TTA GGT GCT AAA GTC GAT AGT ATT CGT TTT AAA 830 GCG CCT TCT AAT GTG AGT CAG GGT GAA ATC TAT ATC 866 GAC CGT ATT ATG TTT TCT GTC GAT GAT GCT CGC TAC 902 CAA TGG TCT GAT TAT CAA GTA AAA ACT CGC TTA TCA 938 GAA CCT GAA ATT CAA TTT CAC AAC AAT TTA GCG GCC 974 ATT GAT CTT ATT CGC CAA CGT CTA ATT AAT GAA TTT 1010 GTC GGA GGT GAA AAA GAG ACA AAC CTC GCA TTA GAA 1046 GAG AAT ATC AGC AAA TTA AAA AGT GAT TTC GAT GCT 1082 CTT AAT ATT CAC ACT TTA GCA AAT GGT GGA ACG CAA 1118 GGC AGA CAT CTG ATC ACT GAT AAA CAA ATC ATT ATT 1154 TAT CAA CCA GAG AAT CTT AAC TCC CAA GAT AAA CAA 1190 CTA TTT GAT AAT TAT GTT ATT TTA GGT AAT TAC ACG 1226 ACA TTA ATG TTT AAT ATT AGC CGT GCT TAT GTG CTG 1262 GAA AAA GAT CCC ACA CAA AAG GCG CAA CTA AAG CAG 1298 ATG TAC TTA TTA GTG ACA AAG CAT TTA TTA GAT CAA 1334 GGC TTT GTT AAA GGG AGT GCT TTA GTG ACA ACC CAT 1370 CAC TGG GGA TAC AGT TCT CGT TGG TGG TAT ATT TCC 1406 ACG TTA TTA ATG TCT GAT GCA CTA AAA GAA GCG AAC 1442 CTA CAA ACT CAA GTT TAT GAT TCA TTA CTG TGG TAT 1478 TCA CGT GAG TTT AAA AGT AGT TTT GAT ATG AAA GTA 1514 AGT GCT GAT AGC TCT GAT CTA GAT TAT TTC AAT ACC 1550 TTA TCT CGC CAA CAT TTA GCC TTA TTA TTA CTA GAG 1586 CCT GAT GAT C 1596 配列番号：３配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡプライマー配列：GCU ACU UCU AAU CCU GC 配列番号：４配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡプライマー配列：GCC ACC UCC AAC CCC GC 配列番号：５配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡプライマー配列：GCA ACA UCA AAU CCA GC 配列番号：６配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡプライマー配列：GCG ACG UCG AAU CCG GC 配列番号：７配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡプライマー配列：GCU ACU AGU AAU CCU GC 配列番号：８配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡプライマー配列：GCU ACU UCC AAU CCU GC 配列番号：９配列の長さ：４４１配列の型：アミノ酸トポロジー：不明配列の種類：タンパク質配列の起源：プロテウスブルガリスコンドロイチナ
ーゼ配列： Met Ala Ala Thr Ser Asn Pro Ala Phe Asp 10 Pro Lys Asn Leu Met Gln Ser Glu Ile Tyr 20 His Phe Ala Gln Asn Asn Pro Leu Ala Asp 30 Phe Ser Ser Asp Lys Asn Ser Ile Leu Thr 40 Leu Ser Asp Lys Arg Ser Ile Met Gly Asn 50 Gln Ser Leu Leu Trp Lys Trp Lys Gly Gly 60 Ser Ser Phe Thr Leu His Lys Lys Leu Ile 70 Val Pro Thr Asp Lys Glu Ala Ser Lys Ala 80 Trp Gly Arg Ser Ser Thr Pro Val Phe Ser 90 Phe Trp Leu Tyr Asn Glu Lys Pro Ile Asp 100 Gly Tyr Pro Thr Ile Asp Phe Gly Glu Lys 110 Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ala Gln Ala Gly 120 Phe Lys Val Lys Leu Asp Phe Thr Gly Trp 130 Arg Ala Val Gly Val Ser Leu Asn Asn Asp 140 Leu Glu Asn Arg Glu Met Thr Leu Asn Ara 150 Thr Asn Thr Ser Ser Asp Gly Thr Gln Asp 160 Ser Ile Gly Arg Ser Leu Gly Ala Lys Val 170 Asp Ser Ile Arg Phe Lys Ara Pro Ser Asn 180 Val Ser Gln Gly Glu Ile Tyr Ile Asp Arg 190 Ile Met Phe Ser Val Asp ASP Ala Arg Tyr 200 Gln Trp Ser Asp Tyr Gln Val Lys Thr Arg 210 Leu Ser Glu Pro Glu Ile Gln Phe His Asn 220 Val Lys Pro Gln Leu Pro val thr Pro Glu 230 Asn Leu Ala Ala Ile Asp Leu Ile Arg Gln 240 Arg Leu Ile Asn Glu Phe Val Gly Gly Glu 250 Lys Glu Thr Asn Leu Ala Leu Glu Glu Asn 260 Ile Ser Lys Leu Lys Ser Asp Phe Asp Ala 270 Leu Asn Ile His Thr Leu Ala Asn Gly Gly 280 Thr Gln Gly Arg His leu Ile Thr Asp Lys 290 Gln Ile Ile Ile Tyr Gln Pro Glu Asn Leu 300 Asn Ser Gln Asp Lys Gln Leu Phe Asp Asn 310 Tyr Val Ile Leu Gly Asn Tyr Thr Thr Leu 320 Met Phe Asn Ile Ser Arg Ala Tyr Val Leu 330 Glu Lys Asp Pro Thr Gln Lys Ala Gln Leu 340 Lys Gln Met Tyr Leu Leu Val Thr Lys His 350 Leu Leu Asp Gln Gly Phe Val Lys Gly Ser 360 Ala Leu Val Thr Thr His His Trp Gly Tyr 370 Ser Ser Arg Trp Trp Tyr Ile Ser Thr Leu 380 Leu Met Ser Asp Ala Leu Lys Glu Ala Asn 390 Leu Gln Thr Gln Val Tyr Asp Ser Leu Leu 400 Trp Tyr Ser Arg Glu Phe Lys Ser Ser Phe 410 Asp Met Lys Val Ser Ala Asp Ser Ser Asp 420 Leu Asp Tyr Phe Asn Thr Leu Ser Arg Gln 430 His Leu Ala Leu Leu Leu Leu Glu Pro Asp 440 Asp 441

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明コンドロイチナーゼ遺伝子の制限酵素地
図。

【図２】本発明コンドロイチナーゼ遺伝子の全体構造。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:37） (72)発明者木村省二茨城県つくば市和台16−２大洋漁業株式会社中央研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の理化学的性質を有するコンドロイ
チナーゼ (1) 作用：コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸
Ｂ、コンドロイチン硫酸Ｃ、及びヒアルロン酸を分解し
て、不飽和二糖に分解する。 (2) 至適ｐＨ：8.0 付近 (3) 熱安定性：10分間のインキュベートで40℃まで安
定。活性は30℃において安定。 (4) 分子量：SDS-ポリアクリドアミドゲル電気泳動によ
る測定において、90,000〜96,000。 (5) 金属イオンの影響性：酵素活性は１mMのFeCl₂の存
在下で、10％の酵素活性の増大が認められるが、１mMの
ZnCl₂とNiCl₂によって完全に酵素活性が阻害される。 (6) Ｎ末端のアミノ酸配列：配列番号１に示されるアミ
ノ酸配列を有する。 (7) 精製方法：コンドロイチナーゼ生産培地で培養し
たプロテウスブルガリス（Proteus vulgaris：IFO 39
88) の菌体を破砕する。硫酸アンモニウム沈澱（70％飽和）によって得られた
沈澱をリン酸緩衝液（10mM pH8.5) で溶解後、当該緩衝
液で透析する。イオン交換クロマトグラフィーで活性画分を分画す
る。ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーで活
性画分を分画する。亜鉛をリガンドとしたアフィニティクロマトラフィー
で活性画分を分画する。ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーで活
性画分を分画する。
【請求項２】以下の特徴を有するコンドロイチナーゼ
の遺伝子 (1) 配列番号２に示す塩基配列を含む。 (2) 制限酵素地図：【化１】