JP2961245B2 - 耐熱性アシルペプチド加水分解酵素、及びそれをコードする遺伝子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、耐熱性アシルペプ
チド加水分解酵素、及びそれをコードする遺伝子に関す
る。本発明の酵素は、アミノ末端がアシル化されている
蛋白質およびペプチドからアシルアミノ酸のみを遊離す
る反応を触媒し、アミノ基末端分析に有効である。

【０００２】

【従来の技術】従来、アシル化されているタンパク質や
ペプチドのアミノ末端の分析は哺乳類由来のアシルペプ
チド加水分解酵素を使用して行われている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従来の酵素は、高温下
で不安定であるため、上記の反応は比較的低温で行うこ
とが必要であった。しかし，高温下で上記の反応を行う
ことにより、反応効率の向上、混入微生物の除去等、多
くの利点が考えられる。そこで、高温で使用でき、さら
に、高温下で安定な酵素が渇望されている。本発明は、
このような技術的背景の下になされたものであり、その
目的とするところは、耐熱性のアシルペプチド加水分解
酵素を提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者は、以上のよう
な課題を解決すべく、90〜100℃で生育する超高熱性細
菌に着目し、その遺伝子配列から本酵素活性を示すと推
測される遺伝子を見い出した。さらに、大腸菌を使って
その遺伝子から酵素を生産し、この酵素が高温（90〜95
℃）で安定でかつアシルペプチド加水分解酵素活性を示
すことを確認し、これらの知見に基づき本発明を完成す
るに至った。

【０００５】即ち、本発明は下記の性質を有する酵素で
ある。 （１）アシルペプチドを加水分解する （２）至適温度は90〜95℃ （３）至適pHは5.0 〜6.0 （４）95℃で３時間加熱（pH 7.5）しても活性を失わな
い （５）分子量は60,000（ＳＤＳポリアクリルアミド電気
泳動法） また、本発明は以下の(a) 又は(b) のタンパク質をコー
ドする遺伝子である。 (a) 配列番号１記載のアミノ酸配列からなるタンパク質 (b) 配列番号１記載のアミノ酸配列において１若しくは
数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ
酸配列からなり、かつアシルペプチドを加水分解する能
力を有するタンパク質

【０００６】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の酵素は、以下のような性質を有する。 （１）アシルペプチトを基質とし、これを加水分解す
る。 （２）温度変化に伴う酵素活性の変化は図１に示す通り
である。この図が示すように本発明の酵素の至適温度は
90〜95℃、最適温度は90℃である。 （３）至適pHは5.0 〜5.5 であり、最適pHは5.5 であ
る。 （４）耐熱性の酵素で、95℃で３時間加熱（pH 7.5）し
ても活性を失わない （５）ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法により測定
されたる分子量は約60,000であり、その長さは400nm で
ある。

【０００７】また、本発明の酵素のアミノ酸配列は、配
列番号１記載のアミノ酸配列、又は配列番号１において
１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列により表わすことができる。ここで、
「１若しくは数個」とは、部位特異的変移誘発法（Nucl
eic Acid Research, Vol.10, No.20, p6487-6500）によ
り欠失等させることができる範囲をいう。

【０００８】本発明の酵素は、微生物中に含まれるの
で、これから得ることができる。具体的には、微生物の
菌体を破砕した後、緩衝液中に懸濁し、遠心分離により
得られる上清を、その酵素活性を指標として各種クロマ
トグラフィーにより精製することにより得られる。使用
する微生物としては、硫黄代謝高熱古細菌であるパイロ
コッカス・ホリコシ（理化学研究所微生物系統保存施設
（ＪＣＭ）番号9974、以下「JCM 9974」と略記する）を
使用することができるが、本発明の酵素を生産できる微
生物であればどのようなものでもよく、例えば、後述す
る本発明の遺伝子を導入した微生物を使用してもよい。
使用する緩衝液、遠心分離の条件、使用するクロマトグ
ラフィーは、微生物菌体より酵素を精製する際に常用さ
れるものでよい。酵素活性の有無は、例えば、アシル化
アミノ酸p-ニトロアニリドを基質として、加水分解によ
り生じるp-ニトロアリンの吸収を検出することで判定で
きる。

【０００９】本発明の酵素は、 アミノ末端がアシル化
されているタンパク質およびペプチドからアシルアミノ
酸のみを遊離する反応を触媒するので、アミノ基末端分
析に有効である。本発明の遺伝子は、配列番号１記載の
アミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１記載
のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠
失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、か
つアミノアシラーゼ活性およびカルボキシペプチダーゼ
活性を有するタンパク質をコードする。ここで、「１若
しくは数個」とは、上記と同様に部位特異的変移誘発法
により欠失等させることができる範囲をいう。

【００１０】本発明の遺伝子は、例えば、以下のように
して得ることができる。まず、本発明の遺伝子を有する
微生物からＤＮＡを抽出し、これを制限酵素で部分分解
し、ベクターに挿入する。この組換えベクターを、適当
な宿主微生物に導入し、ＤＮＡのシークエンスを行う。
得られたシークエンスデータから本酵素のホモロジー領
域を調べ、本酵素の構造遺伝子を見つけだす。本酵素構
造遺伝子の両末端に結合するプライマーを合成し、ＰＣ
Ｒで本酵素遺伝子だけを増幅させる。これにより、本発
明の遺伝子を得ることができる。ここで、使用する微生
物としては、JCM 9974を挙げることができるが、これに
限定されるわけではない。ＤＮＡの抽出は、特別な方法
を使用する必要はなく、常法に従って行うことができ、
市販のキット等を使用することも可能である。使用する
制限酵素は、特に限定されないが、HindIII 、EcoRI 、
XhoI等を使用するのが好ましい。使用するベクターとし
ては、pBAC108L、pFOS1 、pUC19 、M13 等を例示できる
が、これらに限定されるわけではない。使用する宿主微
生物としては、大腸菌、酵母等を例示することができる
が、これらに限定されるわけでない。宿主微生物への導
入手段は、使用するベクターに応じて決めればよく、例
えば、pBAC108Lを使用する場合は、電気孔窄法が好まし
く、pFOS1 を使用する場合は、λファージ等を利用する
のが好ましい。なお、本発明の遺伝子を含む大腸菌BL21
(DE3) は、工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番
号FERM P-16050として寄託されている（寄託日：平成９
年１月27日）。

【００１１】本発明の遺伝子は、上記本発明の酵素をコ
ードするので、これを微生物に導入し、発現させること
により、本発明の酵素を大量に生産することができる。
遺伝子を発現させるために使用するベクターとしては、
pET-11a 、pET-15a 、pET-15b 等を例示することがで
き、遺伝子を導入する微生物としては、大腸菌 BL21(DE
3)、大腸菌XL1-Blue MR 等を挙げることができる。

【００１２】以下、実施例により本発明を更に詳細に説
明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施例に限
定されるものではない。

【００１３】

【実施例】

（実施例１）（菌の培養） JCM9974 は次の方法で培養した。13.5ｇの食塩、４ｇの
Na₂SO₄ 、0.７ｇのKCl 、0.２ｇのNaHCO₃ 、0.１ｇのKB
r 、30mgのH₃BO₃ 、10ｇのMgCl₂ ・ 6H₂O 、1.５ｇのCaC
l₂ 、25mgのSrCl₂ 、1.０mlのレザスリン溶液（0.２g/
L)、1.０ｇの酵母エキス、５ｇのバクトペプトンを１Ｌ
の水に溶かし、この溶液のpHを6.８に調整し加圧殺菌し
た。ついで、乾熱滅菌した元素硫黄を0.２％となるよう
に加え、この培地をアルゴンで飽和して嫌気性とした
後、JCM9974 を植菌した。培地が嫌気性となったか否か
はNa₂S 溶液を加えて、培養液中でNa₂S によるレザスリ
ン溶液のピンク色が着色しないことにより確認した。こ
の培養液を95℃で２〜４日培養し、その後遠心分離し集
菌した。

【００１４】（実施例２）染色体ＤＮＡの調整 JCM9974 の染色体ＤＮＡは以下の方法により調製した。
培養終了後5000rpm 、10分間の遠心分離により菌体を集
菌する。菌体を10mM Tris (pH7.5)-１mM EDTA溶液で２
回洗浄後 In Cert Agarose (ＦＭＣ社製）ブロック中に
封入する。このブロックを１％ N-ラウロイルサルコシ
ンと１mg/ml プロテアーゼＫを含む溶液中で処理し、染
色体ＤＮＡをアガロースブロック中に分離調製した。

【００１５】（実施例３）染色体ＤＮＡを含むライブラ
リークローンの作製 実施例２で得られた染色体ＤＮＡを制限酵素HindIII に
より部分分解後アガロースゲル電気泳動により約40kb長
の断片を調製した。このＤＮＡ断片と制限酵素HindIII
によって完全分解した BacベクターpBAC108L（Stratage
ne製）及びpFOS1 （Stratagene製）とをT4リガーゼを用
いて結合させた。前者のベクターを用いた場合には結合
終了後のＤＮＡをただちに大腸菌内へ電気孔搾法により
導入した。後者のベクターpFOS1 を用いた場合には結合
終了後のＤＮＡをGIGA Pack Gold(ストラタジーン社
製）により試験管内でλファージ粒子内に詰め込み、こ
の粒子を大腸菌に感染させることによりＤＮＡを大腸菌
内に導入した。これらの方法により得られた抗生物質ク
ロラムフェニコール耐性の大腸菌集団をＢＡＣ及びFosm
idライブラリーとした。ライブラリーからJCM9974 の染
色体をカバーするのに適したクローンを選択して、クロ
ーンの整列化を行った。

【００１６】（実施例４）各ＢＡＣ或いはFosmidクロー
ンの塩基配列決定 整列化されたＢＡＣ或いはFosmidクローンについて順次
以下の方法で塩基配列を決定していった。大腸菌より回
収した各ＢＡＣ或いはFosmidクローンのＤＮＡを超音波
処理することにより断片化し、アガロースゲル電気泳動
により１kb及び２kb長のＤＮＡ断片を回収した。この断
片をプラスミドベクターpUC118（タカラ製）のHincII制
限酵素部位に挿入したショットガンクローンを各ＢＡＣ
或いはFosmidクローン当たり 500クローン作製した。各
ショットガンクローンの塩基配列をパーキンエルマー、
ＡＢＩ社製自動塩基配列読み取り装置373 または377 を
用いて決定していった。各ショットガンクローンから得
られた塩基配列を塩基配列自動連結ソフトSequencherを
用いて連結編集し、各ＢＡＣ或いはFosmidクローンの全
塩基配列を決定していった。

【００１７】（実施例５）本発明の遺伝子の同定 上記で決定された各ＢＡＣ或いはFosmidクローンの塩基
配列の大型計算機による解析を行い、本発明の遺伝子の
塩基配列を決定した。塩基配列は、配列番号２に、それ
から推定されるアミノ酸配列は、配列番号１に示す。

【００１８】（実施例６）発現プラスミドの構築 本発明の遺伝子の構造遺伝子領域の前後に制限酵素（Nd
eIとXhoI) サイトを構築する目的で下記のＤＮＡプライ
マーを合成し、ＰＣＲでその遺伝子の前後に制限酵素サ
イトを導入した。 upper Primer：5'-TTTTGAATTCTTACATATGGGCAAGGGGCTTTC
A-3' lower Primer：5'-TTTTGGTACCTTTGGATCCTTAAGGGTTTAGCT
ATCCTTT-3' ＰＣＲ反応後、制限酵素（NdeIとXhoI) で完全分解（37
℃で２時間）した後、その構造遺伝子を精製した。

【００１９】pET-11a 、(Novagen社製) を制限酵素NdeI
とXhoIで切断・精製した後、上記の構造遺伝子とT4リガ
ーゼで16℃、２時間反応させ連結した。連結したＤＮＡ
の一部をE.coli-XL1-BlueMRF' のコンピテントセルに導
入し形質転換体のコロニーを得た。得られたコロニーか
ら発現プラスミドをアルカリ法で精製した。

【００２０】（実施例７）組換え遺伝子の発現 この発現プラスミドを用いて大腸菌（E.coli BL21(DE
3)、Novagen 社製) を形質転換した。当形質転換体をア
ンピシリンを含む２ＹＴ培地で600nm の吸収が１に達す
るまで培養した後、ＩＰＴＧ（Isopropyl-b-D-thiogala
ctopyranoside)を加えさらに６時間培養した。培養後遠
心分離（6,000rpm、20min)で集菌した。

【００２１】（実施例８）耐熱性酵素の精製 集菌した菌体の２倍量のアルミナを加え、菌体を粉砕し
た後、５倍量の10mMトリス塩酸緩衝液（pH8.０）を加え
懸濁液を得た。得られた懸濁液を85℃で30min加熱後遠
心分離（11,000rpm 、20min)し、上澄をHiTrapQ(ファル
マシア社製）カラムに吸着させ活性画分を得た。得られ
た活性画分溶液をセントリコン（アミコン社製）で濃縮
後ゲル濾過カラムSuperdex200(ファルマシア社製）に通
すことにより精製酵素を得た。

【００２２】（実施例９）酵素の諸性質 （１）至適pH 酵素活性の至適pHの測定は、50mM酢酸ナトリウム緩衝
液、50mMリン酸緩衝液および50mMほう酸緩衝液でpH４〜
９までの基質（アシル-Leu-p- ニトロアニリド、アシル
ペプチド加水分解酵素）20mM溶液を調整し、85℃で酵素
の加水分解活性の初速度を測定することにより求めた。
pH5.５近傍で最大初速度が得られたため、最適pHは5.５
と結論した。

【００２３】（２）至適温度 基質として20mM Acyl-Leu-p-nitroanilideを使用し、50
mMリン酸緩衝液（pH7.５) 中に一定量の酵素を加えて15
分反応させ、相対活性を調べた。最大活性（至適温度）
は90℃であった（図１）。 （３）耐熱性 当該酵素溶液（0.１mg/mL)を50mMリン酸緩衝液（pH5.
５) 中、95℃で３時間加熱後、温度を85℃に低下させ残
存活性を調べたが、活性の低下は見られなかった。ま
た、円偏向二色性（ＣＤ）の測定を25〜90℃で測定した
が、スペクトルに変化は見られなかった。

【００２４】

【発明の効果】本発明は、耐熱性アシルペプチド加水分
解酵素を提供する。この酵素により、高温下での、アシ
ル化タンパク質やペプチドのアミノ末端分析ができるよ
うになる。また、この酵素は、酵素分子が安定であると
いうことから耐有機溶媒性の向上も期待できる。

【００２５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：６３２ 配列の型：タンパク質 トポロジー：不明 起源： 生物名：パイロコッカス・ホリコシ 配列 Met Gly Lys Gly Leu Ser Glu Lys Asp Leu Gly Lys Phe Lys Leu Val 1 5 10 15 Gly Asn Val Asp Val Phe Lys Gly Lys Ala Val Phe Gln Val Thr Glu 20 25 30 Ile Ser Leu Lys Asp Asp Asp Tyr Phe Ser Lys Leu Tyr Leu Tyr Asp 35 40 45 Gly Lys Arg Val Lys Pro Phe Thr Ser Gly Asn Lys Asp Ser Asn Pro 50 55 60 Arg Phe Ser Pro Asn Gly Lys Leu Ile Ala Phe Thr Ser Lys Arg Asp 65 70 75 80 Lys Glu Gly Lys Glu Ser Glu Leu Tyr Val Ile Pro Thr Asp Gly Gly 85 90 95 Glu Ala Arg Leu Leu Ala Lys Phe Lys Tyr Gly Ile Lys Asn Leu Arg 100 105 110 Phe Thr Glu Asp Gly Lys Ser Ile Ala Val Val Thr Pro Ile Asp Val 115 120 125 Glu Lys Lys Gly Asn Asp Asp Val His Ile Ile Arg Glu Ile Pro Phe 130 135 140 Trp Phe Asn Gly Val Gly Trp Ile Tyr Gly Lys Arg Asn Val Val Tyr 145 150 155 160 Leu Val Asp Val Glu Ser Gly Lys Lys Lys Arg Leu Thr Pro Lys Asn 165 170 175 Leu Asn Val Asp Gln Ile Arg Phe His Asn Gly Arg Leu Tyr Phe Thr 180 185 190 Ala Gln Glu Asp Arg Glu Arg Lys Pro Leu Ile Ser Asp Leu Tyr Val 195 200 205 Leu Glu Asn Arg Lys Val Arg Lys Leu Thr Pro Gly Lys Trp Arg Ile 210 215 220 Leu Asp Phe Leu Pro Leu Asp Asp Gly Ser Phe Val Leu Lys Ala Asn 225 230 235 240 Thr Leu Glu Arg Gly Ile Pro Thr Asn Ala His Ile Tyr His Tyr Asp 245 250 255 Pro Lys Thr Gly Glu Leu Lys Lys Leu Thr Lys Asp Leu Asp Arg Asn 260 265 270 Ala Tyr Asn Ser Leu Asn Ser Asp Val Arg Gly Ser Gln Arg Ala Glu 275 280 285 Leu Val Tyr Lys Glu Gly Trp Ile Tyr Tyr Val Ala Thr Asp Gly Pro 290 295 300 Arg Ala Asn Leu Phe Arg Val Asn Leu Asp Gly Lys Ile Glu Arg Val 305 310 315 320 Ile Gly Gly Asp Arg Ser Val Glu Ser Phe Asp Ile Gly Asp Tyr Ile 325 330 335 Ala Phe Thr Ala Gln Asp Ala Val Thr Pro Thr Glu Leu Tyr Ile Tyr 340 345 350 Arg Asp Gly Lys Glu Lys Lys Val Thr Asp Phe Asn Lys Trp Ile Lys 355 360 365 Gly Tyr Thr Leu Ser Lys Pro Glu His Phe Lys Val Lys Ala Ser Asp 370 375 380 Gly Val Glu Ile Asp Ala Trp Val Met Lys Pro Val Asn Phe Arg Lys 385 390 395 400 Gly Lys Lys Tyr Pro Ala Ile Leu Glu Ile His Gly Gly Pro Lys Thr 405 410 415 Ala Tyr Gly Tyr Ala Phe Met His Glu Phe His Val Leu Thr Ser Lys 420 425 430 Gly Phe Val Val Ile Phe Ser Asn Pro Arg Gly Ser Asp Gly Ty rGly 435 440 445 Glu Glu Phe Ala Asp Ile Arg Gly His Tyr Gly Glu Arg Asp Tyr Gln 450 455 460 Asp Leu Met Glu Val Val Asp Glu Ala Leu Arg Arg Phe Asp Phe Ile 465 470 475 480 Asp Gly Glu Arg Leu Gly Val Thr Gly Gly Ser Tyr Gly Gly Phe Met 485 490 495 Thr Asn Trp Ile Val Gly His Thr Asn Arg Phe Lys Ala Ala Val Thr 500 505 510 Gln Arg Ser Ile Ser Asn Trp Ile Ser Phe Phe Gly Thr Thr Asp Ile 515 520 525 Gly Tyr Tyr Phe Ala Pro Asp Gln Ile Gly Lys Asp Pro Trp Ser Asn 530 535 540 Leu Glu Gly Tyr Trp Glu Lys Ser Pro Leu Lys Tyr Ala Pro Asn Val 545 550 555 560 Glu Thr Pro Leu Leu Ile Ile His Ser Thr Glu Asp Tyr Arg Cys Trp 565 570 575 Leu Pro Glu Ala Leu Gln Leu Phe Ile Ser Leu Lys Tyr Leu Gly Lys 580 585 590 Arg Val Glu Leu Ala Ile Phe Pro Gly Glu Asn His Asp Leu Ser Arg 595 600 605 Ser Gly Lys Pro Lys His Arg Val Lys Arg Leu Glu Leu Ile Ala Gly 610 615 620 Trp Met Glu Lys Trp Leu Lys Gly 625 ６３０

【００２６】配列番号：２ 配列の長さ：１８９６ 配列の型：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ トポロジー：直鎖状 起源： 生物名：パイロコッカス・ホリコシ 配列 ATG GGC AAG GGG CTT TCA GAG AAA GAT TTA GGG AAG TTC AAG CTT GTG GGT AAT GTA GAT GTA TTT AAG GGA AAA GCG GTC TTT CAA GTA ACG GAG ATA AGC CTC AAA GAC GAT GAT TAC TTC TCT AAG CTT TAC CTC TAC GAT GGA AAG AGG GTA AAA CCC TTC ACC TCA GGG AAC AAG GAT TCT AAT CCA AGG TTC TCT CCA AAT GGG AAG CTT ATA GCA TTT ACC TCA AAG AGG GAT AAG GAA GGA AAG GAA TCA GAG CTC TAC GTG ATT CCA ACG GAT GGG GGA GAG GCC AGA CTT TTA GCA AAG TTC AAA TAC GGG ATA AAG AAC CTG CGC TTT ACC GAG GAT GGG AAA AGT ATA GCC GTG GTT ACC CCT ATA GAC GTT GAG AAA AAA GGG AAT GAT GAC GTT CAC ATT ATA AGG GAA ATA CCA TTC TGG TTT AAT GGA GTT GGC TGG ATC TAC GGA AAA AGA AAC GTT GTC TAC CTT GTT GAC GTT GAG AGC GGG AAG AAA AAG AGA CTA ACT CCA AAG AAC CTA AAT GTT GAT CAG ATA AGG TTC CAC AAC GGT AGA CTA TAC TTC ACG GCC CAA GAG GAT AGG GAA AGG AAA CCT CTG ATA TCC GAT CTT TAC GTC CTC GAG AAT AGA AAA GTT AGG AAG CTG ACC CCA GGG AAG TGG AGG ATA CTC GAC TTC CTC CCC CTT GAT GAC GGA AGC TTC GTA CTT AAG GCT AAC ACT TTA GAA AGG GGA ATC CCA ACC AAC GCC CAC ATC TAC CAC TAC GAT CCC AAG ACA GGA GAA CTT AAG AAG CTC ACA AAG GAT TTA GAC AGG AAC GCT TAC AAC TCC TTA AAC TCC GAT GTT CGA GGA AGT CAG AGG GCC GAG CTT GTG TAC AAG GAG GGG TGG ATC TAC TAT GTC GCA ACG GAT GGC CCT AGG GCA AAC CTC TTT AGG GTC AAC TTA GAT GGA AAG ATT GAA AGG GTA ATA GGT GGA GAT AGA AGC GTT GAA AGC TTC GAT ATA GGG GAT TAC ATA GCT TTC ACG GCT CAA GAT GCT GTA ACC CCA ACT GAG CTG TAC ATA TAC AGG GAT GGA AAG GAG AAG AAG GTT ACC GAC TTT AAC AAA TGG ATA AAG GGT TAC ACC CTT TCA AAA CCT GAA CAC TTT AAG GTT AAA GCA AGT GAC GGG GTT GAA ATA GAT GCC TGG GTA ATG AAA CCG GTG AAC TTC AGG AAA GGA AAG AAG TAT CCA GCT ATT CTA GAG ATC CAC GGT GGT CCT AAA ACC GCT TAC GGT TAC GCT TTT ATG CAC GAG TTC CAC GTT TTA ACC TCT AAA GGC TTC GTC GTG ATA TTC TCA AAT CCT AGA GGG AGC GAT GGC TAC GGA GAG GAG TTC GCG GAT ATA AGG GGA CAC TAT GGG GAG AGG GAT TAC CAG GAT TTA ATG GAG GTA GTC GAT GAA GCA TTA AGG AGA TTT GAC TTC ATA GAT GGG GAA AGG CTA GGA GTT ACC GGG GGT TCC TAT GGT GGC TTC ATG ACG AAC TGG ATA GTC GGA CAT ACC AAC AGG TTC AAA GCC GCT GTA ACC CAG AGA TCA ATT TCA AAT TGG ATA AGC TTC TTC GGG ACA ACG GAT ATA GGT TAT TAC TTT GCT CCA GAT CAA ATA GGA AAA GAT CCC TGG AGC AAC TTG GAA GGT TAT TGG GAA AAG AGC CCA TTA AAG TAC GCT CCC AAC GTT GAA ACT CCC CTG CTT ATA ATC CAC TCT ACC GAA GAC TAC AGG TGT TGG CTT CCC GAG GCA TTG CAA CTC TTC ATA TCC CTA AAA TAC CTG GGG AAG AGA GTT GAA TTG GCA ATA TTC CCA GGA GAA AAT CAT GAC CTA AGT AGA TCT GGG AAG CCA AAG CAC AGG GTT AAA AGA CTT GAA CTA ATA GCA GGA TGG ATG GAG AAA TGG CTT AAA GGA

【図面の簡単な説明】

【図１】 温度変化に伴う酵素活性の変化を示す図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 小杉 佳次 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技 術院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 樋口 勝彦 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技 術院生命工学工業技術研究所内 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/09 C07H 21/04 C12N 9/78 C12Q 1/37 C12N 9/78 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＧｅｎＢａｎｋ ＤＤＢＪ ＥＭＢＬ ＰＩＲ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｇｅｎｅｓｅｑ

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の性質を有する酵素。 （１）アシルペプチドを加水分解する （２）至適温度は90〜95℃ （３）至適pHは5.0 〜6.0 （４）95℃で３時間加熱（pH 7.5）しても活性を失わな
   い （５）分子量は60,000（ＳＤＳポリアクリルアミド電気
   泳動法）
2. 【請求項２】 配列番号１記載のアミノ酸配列、又は配
   列番号１において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置
   換若しくは付加されたアミノ酸配列により表される請求
   項１記載の酵素。
3. 【請求項３】 以下の(a) 又は(b) のタンパク質をコー
   ドする遺伝子。 (a) 配列番号１記載のアミノ酸配列からなるタンパク質 (b) 配列番号１記載のアミノ酸配列において１若しくは
   数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ
   酸配列からなり、かつアシルペプチドを加水分解する能
   力を有するタンパク質