JPH07213287A - 耐熱性ブランチングエンザイム遺伝子、それを含有する組換えプラスミド並びに耐熱性ブランチングエンザイム。 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】耐熱性ブランチングエンザイム遺伝子、それを
含有する組換えプラスミド並びに耐熱性ブランチングエ
ンザイムを得る。 【構成】配列表の配列番号１に示された塩基配列、また
はそれと実質的に同等な配列を有する耐熱性ブランチン
グエンザイム遺伝子。配列表の配列番号１に示された耐
熱性ブランチングエンザイム遺伝子、またはそれと実質
的に同等な遺伝子を含有する組換えプラスミド。配列表
の配列番号１に示されたアミノ酸配列、またはそれと実
質的に同等な配列を有する耐熱性ブランチングエンザイ
ム。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はバチルス ステアロサー
モフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＴＲＢＥ１４株由来の耐熱性ブラン
チングエンザイム（以下、本酵素という）をコードする
本酵素遺伝子、それを含有する組換えプラスミド並びに
本酵素に関する。

【０００２】

【従来の技術】ブランチングエンザイムはα−１，４グ
ルカンに作用し、その結合を切断しグルカン鎖を同一分
子内または他の分子にα−１，６−グルコシド結合で転
移させる反応を触媒する酵素である。すなわち例えばア
ミロース様多糖をアミロペクチン様あるいはグリコーゲ
ン様多糖に変える作用を持った酵素である。でん粉を含
む物質の加工においてでん粉の老化は大きな問題となっ
ている。例えば食品中のでん粉の老化は保存性の低下や
消化率の減少をもたらすことが知られている。この老化
の原因の大半はでん粉中に含まれるアミロース分子の会
合、それにつづく不溶化に起因している。一方、でん粉
溶液中にブランチングエンザイムを作用させると、でん
粉中のアミロースおよびアミロペクチン分子にα−１，
６−グルコシド結合による枝分かれ構造を増加させるこ
とができ、このことによってでん粉の老化を抑制するこ
とができる（澱粉化学、第３０巻、第２号、第２２３
頁）。従来ブランチングエンザイムを生産させ得る遺伝
子として動物、植物及び微生物由来のものが知られてい
るが、いずれも酵素生産量は少なく、さらに５０℃以上
で有効な活性を有するものはなかった。

【０００３】

【本発明が解決しようとする課題】でん粉の溶液にブラ
ンチングエンザイムを作用させるときは、５０℃以上の
高温で行なうのが望まれていた。これは高温下作用させ
ることによりでん粉溶液が雑菌に汚染されにくいからで
あり、基質となるα化でん粉の量が多くなるからであ
る。また、でん粉の老化を抑制するためにその溶液中に
ブランチングエンザイムを作用させたとき、その中にで
ん粉分解酵素（特にα−アミラーゼ）が含まれている
と、でん粉中のα−１，４−結合の一部が分解され、分
子量の小さいでん粉となる。従って耐熱性のあるブラン
チングエンザイムの獲得が望まれていた。また高純度の
耐熱性のブランチングエンザイムを工業的に生産するた
めに、その遺伝子の獲得が望まれていた。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、これらの
課題を解決すべくバチルス ステアロサーモフィラス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ）ＴＲＢＥ１４株由来の本酵素を獲得した。さら
にそれを生産する遺伝子を単離し、これを遺伝子組換え
技術を用いて微生物に導入し、本酵素遺伝子を発現させ
た。さらにバチルス ステアロサーモフィラスＴＲＢＥ
１４株由来の本酵素遺伝子の構造が配列番号１における
ＤＮＡ塩基配列４０２〜２，３５７として示されること
を確認した。以下に、本発明の本酵素遺伝子の単離及び
塩基配列決定の方法、ならびにそれら塩基配列の特徴等
について詳細に説明する。

【０００５】１．本酵素遺伝子の単離 本酵素を多量に生成する好熱菌であるバチルス ステア
ロサーモフィラスＴＲＢＥ１４株（寄託番号Ｐ−１３９
１６）を培養してその菌体を回収し、その染色体ＤＮＡ
を常法により調製する。これを制限酵素、例えばＳａｕ
３ＡＩで部分分解し密度勾配超遠心法により処理して１
０ｋｂから２０ｋｂの大きさのＤＮＡ断片を得る。この
断片をストラタジーン社製ＢａｍＨＩ処理済みλＥＭＢ
Ｌ３ベクターにＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。
この反応物を用いて常用されるインビトロパッケージン
グ法によりファージ粒子とし、大腸菌Ｐ２３９２株（ス
トラタジーン社製）と接触させ適当量をＮＺＹ寒天培地
上に重層法によりひろげ３７℃で一夜保温することでλ
ファージによるプラークが点在するプレートを得る。こ
のプレートよりプラークをナイロンメンブレンに通常の
アルカリブロッティング法によりうつしとってブロット
を準備する。一方、先に調製した染色体ＤＮＡと図１に
示す２種の合成ＤＮＡプライマー、すなわちプライマー
１とプライマー４とを混合し、例えばＴｔｈＤＮＡポリ
メラーゼ（東洋紡（株）製）を用いて常法によりＤＮＡ
断片増幅反応を行なうと約５６０ｂｐのＤＮＡ断片が得
られる。このＤＮＡ断片をプローブとし、先のブロット
を用いて常用されるプラークハイブリダイゼーションを
行なうことにより、本酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片のク
ローン化されたλ−ファージを選別することができる。
以上の手法により、図２に示す制限酵素地図を有する組
換えλ−ファージが得られ、λ−ＴＢＥ１０２と名付け
た。

【０００６】２．λ−ＴＢＥ１０２中の本酵素遺伝子の
位置の特定 一般にブランチングエンザイムの分子量は７万から８万
程度であることから、その構造遺伝子の大きさは２ｋｂ
ｐ程度と予想される。通常λＥＭＢＬ３ベクターには１
０ｋｂ以上の大きさのＤＮＡ断片がクローン化されるた
め、塩基配列決定のためには本酵素遺伝子の位置を特定
することが必要となる。これは得られた組換えλ−ファ
ージを制限酵素、例えばＳａｌＩで処理しアガロースゲ
ル電気泳動に供した後先にプラークハイブリダイゼーシ
ョンに用いた約５６０ｂｐのＤＮＡ断片をプローブとし
て常法によりサザンハイブリダイゼーションを行なうこ
とにより特定することができる。このようにして特定さ
れたＤＮＡ断片およびその周辺のＤＮＡ断片中に存在す
る本酵素遺伝子を以下に示す塩基配列決定に用いる。

【０００７】３．本酵素遺伝子の塩基配列の決定 組換えλ−ファージλ−ＴＢＥ１０２上の本酵素遺伝子
の塩基配列は、サンガー （Ｓａｎｇｅｒ）のジデオキ
シチェーンターミネーション法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，９４，４４１（１９７５）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９
７７）に従って決定することができる。即ち、例えば、
大腸菌ＭＶ１１８４株とｐＵＣ１１８及びｐＵＣ１１９
０宿主ベクター系（宝酒造（株）製）を用いて本酵素遺
伝子のサブクローニングを行なう。次いでヘルパーファ
ージＭ１３ＫＯ７（宝酒造（株）製）を各サブクローン
に感染させることにより、対象とするＤＮＡ断片を含有
する一本鎖ＤＮＡがファージ粒子に包み込まれ、該ファ
ージ粒子がサブクローンの菌体外に放出される。このフ
ァージ粒子をフェノール処理し、常法により塩基配列決
定に必要な高純度の一本鎖ＤＮＡが得られる。このＤＮ
Ａを用いて、サンガーのジデオキシチェーンターミネー
ション法に基いて塩基配列の決定を行なうことができ
る。

【０００８】４．塩基配列の特徴 上記の塩基配列決定法により、配列表の配列番号１に示
すＤＮＡ塩基配列が得られた。開始コドンＴＴＧで始ま
り、終止コドンＴＡＡで終る、１，９５６ｂｐからなる
オープンリーディングフレームが見出された。このオー
プンリーディングフレームに対応するアミノ酸配列を配
列番号１に示した。

【０００９】以下に本遺伝子、プラスミド並びに本酵素
の製法の一例を記す。

【実施例】

１．使用菌株及びファージ並びにプラスミド バチルス ステアロサーモフィラスＴＲＢＥ１４株（寄
託番号Ｐ−１３９１６）を本酵素遺伝子の供与体として
用いた。クローニングの為の宿主としては大腸菌Ｐ２３
９２株を用い、ベクターはλ−ＥＭＢＬ３を使用した。
また得られた本酵素遺伝子の発現の為の宿主としては大
腸菌ＴＧ−１株を用い、ベクターはプラスミドｐＵＣ１
１８を使用した。

【００１０】２．培地および培養条件 バチルス ステアロサーモフィラスＴＲＢＥ１４株はＬ
培地（１％バクトトリプトン、０．５％イーストエキ
ス、０．５％ＮａＣｌ、ｐＨ７．３）を用いて５０から
６０℃で１０から１５時間振とう培養した。大腸菌Ｐ２
３９２株の培養にはＮＺＹ培地（１％ＮＺアミン、０．
５％イーストエキス、０．５％ＮａＣｌ）を用いた。大
腸菌ＴＧ−１株の培養にはＬ培地を用い、プラスミドを
保持する菌の場合にはアンピシリンを１００μｇ／ｍｌ
になるように添加した。

【００１１】３．染色体ＤＮＡのλＥＭＢＬ３への挿入 まずバチルス ステアロサーモフィラスＴＲＢＥ１４株
を１００ｍｌＬ培地を含む５００ｍｌ容フラスコ中で一
夜、５０℃で培養した。これを遠心集菌し、染色体ＤＮ
Ａをフェノール法（斎藤、三浦、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ
ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、７２、６１
９ （１９６３））により調製した。これの約１００μ
ｇを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ，０．６Ｕにて３７℃で１時
間部分分解した後、ＮａＣｌ密度勾配遠心（ＮａＣｌ濃
度：５−２５％、３７，０００ｒｐｍ、４．５時間）に
かけ１０ｋｂ以上のＤＮＡ断片からなる画分を得た。こ
のＤＮＡ断片画分０．６μｇとＢａｍＨＩ処理済みλＥ
ＭＢＬ３ベクター（ストラタジーン社製）とをＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いて連結した。この反応液をインビトロ
パッケージングキット（ストラタジーン社製）を用いて
処理し組換えλ−ファージ粒子溶液を得た。

【００１２】４．組換えλ−ファージの大腸菌Ｐ２３９
２への導入 大腸菌Ｐ２３９２を一白金耳とり１００ｍｌ容フラスコ
に入れた２０ｍｌＮＺＹ倍地（１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２を
含む）に添加し、３７℃で６５０ｎｍの濁度が０．５前
後になるまで振とう培養した。菌体を遠心分離により集
め１０ｍｌの１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２に懸濁した。この菌
体溶液と３で調製した組換えλ−ファージ粒子溶液０．
５μｌとを混合し、３７℃で２０分間保温した後、ＮＺ
Ｙ寒天培地に重層法によりひろげ、３７℃で一晩保温す
ることによりλ−ファージによる溶菌斑が点在するプレ
ートを得た。

【００１３】５．本酵素遺伝子単離のためのプローブの
作製 数種の起源の異なるブランチングエンザイムを比較する
ことにより、ブランチングエンザイムのアミノ酸配列中
にはα−アミラーゼ等に見出されている４つの保存領域
（保存領域１、２、３、および４）が存在する（Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７、１８４４７）。これらの
領域、およびその周辺に含まれるアミノ酸残基はブラン
チングエンザイムの機能上重要な役割を果たしていると
考えられることから、対応するＤＮＡ配列も保存性が高
いと考えられた。そこで図１に示す保存領域１および４
付近の配列に対応する２種のＤＮＡプライマー（それぞ
れプライマー１および４）を合成した。この２種の合成
ＤＮＡプライマー、各１ｎｍｏｌと３で調製した染色体
ＤＮＡ０．２μｇとを用いてＤＮＡ断片増幅反応を行な
った。すなわち、これらＤＮＡ混合物に各２０μｍｏｌ
のデオキシアデニン３リン酸、デオキシグアニン３リン
酸、デオキシシチジン３リン酸、及びデオキシチミジン
３リン酸、を加えさらに２ＵのＴｔｈＤＮＡポリメラー
ゼ（東洋紡（株）製）と１０μｌＴｔｈＤＮＡポリメラ
ーゼ用１０倍濃度緩衝液を加えて最終１００μｌとし、
これを９４℃、１分；４５℃、１分；７２℃、１分を１
サイクルとして３０サイクル繰り返した。この反応によ
り本酵素の保存領域１と４付近の配列にはさまれる約５
６０ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。このＤＮＡ断片を
アガロ ースゲル電気泳動により単離し、制限酵素Ｓｍ
ａＩで処理したｐＵＣ１９（宝酒造（株）製）と混合し
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し組換えプラスミドｐ
ＴＢＥ３を得た。これを用いて、マルチプライム法ＤＮ
Ａラベリングキット（ファルマシア社製）を利用して放
射能ラベルされた本酵素遺伝子単離のためのプローブを
作製した。

【００１４】６．本酵素遺伝子を含む組換えλ−ファー
ジの選択 ４で作製したプレートにナイロンフィルター（アマーシ
ャム社製）を密着させ、その後フィルターをアルカリ処
理することにより、溶菌斑中の組換えλ−ファージＤＮ
Ａを変性させ、フィルターに固定した。このフィルター
を５で作製したプローブの溶液に浸し、６５℃で１６時
間ハイブリダイゼーションを行なった。プローブの溶液
から取り出したフィルターをよく洗浄した後、Ｘ線フィ
ルムに密着させこれを感光させることによって本酵素遺
伝子を含む組換えλ−ファージを選択した。得られた組
換えλ−ファージは約１７ｋｂｐの染色体由来のＤＮＡ
断片を含んでおり、λ−ＴＢＥ１０２と命名された。そ
の制限酵素切断点地図は図２に示した。

【００１５】７．λ−ＴＢＥ１０２中の本酵素遺伝子を
含む領域の特定 ブランチングエンザイムの分子量は約７万であるのでそ
の遺伝子は約２ｋｂｐと予想される。λ−ＴＢＥ１０２
には約１７ｋｂＰのＤＮＡ断片が挿入されており、本酵
素遺伝子の塩基配列決定、および発現のためには本酵素
遺伝子を含む領域を特定する必要があった。そこでλ−
ＴＢＥ１０２を制限酵素ＳａｌＩで分解し、アガロース
ゲル電気泳動を行なった。電気泳動後アルカリ処理によ
って、ゲル中のＤＮＡを変成させ、ナイロンフィルター
に移し固定した。このフィルターを５で作製したプロー
ブの溶液に浸し、６５℃で１６時間ハイブリダイゼーシ
ョンを行なった。プローブの溶液から取り出したフィル
ターをよく洗浄した後、Ｘ線フィルムに密着させこれを
感光させることによって図２に示す４ｋｂｐのＤＮＡ断
片中に本酵素の保存領域１と４付近の配列にはさまれる
約５６０ｂｐのＤＮＡ配列が含まれることが判った。こ
の領域の塩基配列を予備的に決定することにより、図２
に示すＡｏｒ５１ＨＩとＥｃｏＲＩで切り出される約
２．４ｋｂｐのＤＮＡ断片中に本酵素遺伝子の全体が存
在していることが予想された。

【００１６】８．本酵素遺伝子の全体を含むプラスミド
の作製 本酵素遺伝子の全体を含むプラスミドの作製を図３に示
す方法で行なった。すなわちまず図２に示す４ｋｂｐの
ＳａｌＩ−ＤＮＡ断片をＳａｌＩで切断したプラスミド
ｐＢＲ３２２（宝酒造（株）製）と連結し、ｐＴＢＥ３
１を作製した。次にｐＴＢＥ３１より１．４ｋｂｐのＳ
ａｌＩ−ＥｃｏＲＩ−ＤＮＡ断片を単離し、ＳａｌＩ−
ＥｃｏＲＩ処理したプラスミドｐＵＣ１１８と連結し、
ｐＵＣ１１８ＳＥを作製し、さらにそれをＥｃｏＲＩで
切断後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて切断部分を平滑
化した後、ＨｉｎｄＩＩＩリンカー（宝酒造（株）製）
を連結してｐＵＣ１１８ＳＥＨを作製した。一方、前述
の４ｋｂｐＳａｌＩ−ＤＮＡ断片と重複して存在する約
５ｋｂｐのＸｈｏＩ−ＤＮＡ断片をＳａｌＩで切断した
プラスミドｐＢＲ３２２と連結し、ｐＴＢＥ５１を作製
した。これより約１ｋｂｐのＡｏｒ５１ＨＩ−ＳａｌＩ
−ＤＮＡ断片を、ＳｍａＩ−ＳａｌＩ処理したｐＵＣ１
１８と連結し、ｐＵＣ１１８ＡＳを作製した。ｐＵＣ１
１８ＡＳより約１ｋｂｐのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ−ＤＮ
Ａ断片を単離してＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ処理したｐＵＣ
１１８ＳＥＨと連結し、本酵素遺伝子の全体を含むプラ
スミドｐＴＢＥ８２１を作製した。

【００１７】９．大腸菌による本酵素の生産 ８で作製したプラスミドｐＴＢＥ８２１を大腸菌ＴＧ−
１株に導入し、２１容のサカグチフラスコに入った５０
０ｍｌのＬ培地で培養後、菌体を遠心分離により集め
た。この菌体を５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含
む５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、約５０
ｍｌで洗浄し、１０ｍｌの同緩衝液に懸濁した。この菌
体溶液をクボタ製インソネーターモデル２００Ｍを用い
て４℃で１０分間超音波処理した後、１５，０００ｒｐ
ｍで３０分間遠心分離して沈殿を除き菌体抽出液を得
た。この菌体抽出液を６０℃で１５分間加熱した後、遠
心分離により沈殿を除き粗酵素液とした。この加熱処理
により大腸菌細胞由来の不純物の大部分を簡単に除くこ
とができた。このようにして得られた粗酵素液５０μｌ
を０．１％アミロース（シグマ製）５０μｌと混合し、
５０℃で３０分保温した後、２ｍｌのヨウ素溶液（０．
１％ＫＩ、０．０１％Ｉ_２、及び３．８５ｍＭ ＨＣｌ
を含む）を添加して６６０ｎｍの吸光度を測定すると、
酵素液を加えない場合に比較して減少した。この反応に
伴う還元糖量の増加は認められず、本酵素の作用により
アミロース分子に分岐が生じた結果、６６０ｎｍの吸光
度が減少したと考えられた。さらに粗酵素液を以下の手
順により精製した。５０ｍＭＦトリス−塩酸（ｐＨ７．
５、５ｍＭ２−メルカプトエタノールを含む）により平
衡化したＱ−セファロース（ファルマシア社製）に吸着
させ、０．２ＭＮａＣｌを含む同緩衝液で洗浄した後、
０．４ＭＮａＣｌを含む同緩衝液で溶出される両分を回
収し、同緩衝液に対して透析した。終濃度０．３４Ｍに
なるように（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を添加し、同じく０．３
４Ｍを（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４含む緩衝液により平衡化した
フェニルトヨパール（東ソー（株）製）に吸着させ５０
ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５、５ｍＭ２−メルカプト
エタノールを含む）により溶出される画分を回収し、同
緩衝液に対して透析した。得られた精製酵素をＳＤＳ−
ポリアクリルアミド電気泳動し、クマシープリリアント
ブルーにより染色すると単一バンドが検出された（図
４）。精製酵素を終濃度０．５％のアミロースに作用さ
せた後、イソアミラーゼ（林原生物化学研究所（株）
製）で処理し、薄層クロマトグラフィーで展開すると生
じた分岐に由来するオリゴ糖が検出された（図５）。一
方、イソアミラーーゼで処理しない場合にはそのような
オリゴ糖は検出されず、精製酵素がα−１，６−グルコ
シド結合の合成を触媒していることが証明された。以上
のようにプラスミドｐＴＢＥ８２１にクローン化された
約２．４ｋｂｐのＡｏｒ５１ＨＩ−ＥｃｏＲＩ−ＤＮＡ
断片中に本酵素遺伝子がコードされることが証明され
た。

【００１８】１０．本酵素の耐熱性の確認 ９で精製した本酵素を種々の温度で基質に作用させ、本
酵素の耐熱性の確認を行なった。基質として、合成アミ
ロースＡＳ−７０（中埜酢店（株）製）を常法により還
元したものを終濃度０．５％にして用いた。活性測定は
最も定量性が高い方法とされるブランチリンケージ法
（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２４０、２５３，（１
９９３））を一部改変して以下のように行なった。１０
μｌの本酵素溶液と９０μｌの還元したアミロース溶液
を基質終濃度０．５％になるように混合し、適当温度で
３０分間保温した。１００℃で２分間加熱して反応を停
止し、１０μｌの１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）と５μ
ｌの１００倍希釈したイソアミラーゼ（林原生物化学研
究所（株）製）を添加して４５℃、４５分間加熱するこ
とにより生じたα−１，６−結合を加水分解した。これ
に４６０μｌのエタノールを添加し遠心分離により多糖
を回収した。これを８μｌの１Ｍ水酸タトリウムと３９
２μｌの蒸留水をこの順に加えて溶解させ、改変パーク
ジョンソン法（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２４０，
２５３，（１９９３））により還元糖量を測定した。対
照としてイソアミラーゼの代わりに等量の水を加えたも
のを同様に処理した。１分間に１μｍｏｌのグルコース
に相当する還元糖を生ずる酵素量を一単位とした。上の
方法を用い３０〜７０℃で活性を測定したところ、反応
温度５０℃のときが最も活性が高かった。５０℃のとき
の活性を１００％としたときの各温度での相対的な活性
を図６に示した。５０℃が反応最適温度であったが６５
℃までその８０％以上の活性を示した。

【００１９】１１．本酵素遺伝子の塩基配列の決定 組換えプラスミドｐＴＢＥ８２１上の本酵素遺伝子の塩
基配列をサンガーのジデオキシチェーンターミネーショ
ン法により決定した。まず大腸菌ＭＶ１１８４株とｐＵ
Ｃ１１８、１１９の宿主ベクター系を用いて本酵素遺伝
子のサブクローニングを行なった。続いてヘルパーファ
ージＭ１３ＫＯ７を用いて一本鎖ＤＮＡを調製した。す
なわち、サブクローニングしたプラスミドを保持する大
腸菌ＭＶ１１８４株をＬ培地４ｍｌを用いて３７℃、約
１０時間培養した。その培養液２０μｌに２０μｌのＭ
１３ＫＯ７、ファージ液を加え、３７℃で２０分間保持
し、感染を行なった。次に２ｍｌの２ＸＹＴ培地（１．
６％バクトトリプトン、１％イーストエキス、０．５％
ＮａＣｌ）を加え、３７℃で一夜培養した。１ｍｌの培
養液をとり、遠心分離にて菌体を除いた上清に２００μ
ｌのＰＥＧ溶液（２０％ポリエチレングリコール、１５
％ＮａＣｌ）を加え、ファージ粒子を沈殿させた。沈殿
をＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス・塩酸、１ｍＭＥＤＴ
Ａ、ｐＨ８）に懸濁後フェノール処理にてタンパク質を
除き、エタノールにて沈殿濃縮し、一本鎖ＤＮＡを得
た。こうして調製した本酵素遺伝子の部分断片について
その塩基配列をシーケナーゼキット（東洋紡（株）製）
を用い、サンガーのジデオキシチェーンターミネーショ
ン法により決定した。結果は配列番号１の通りである。

【００２０】１２．塩基配列の特徴 開始コドンＴＴＧ（４０２番目の塩基）で始まり、終止
コドンＴＡＡ（２，３５８番目の塩基）で終る１，９５
６ｂｐからなるオープンリーディングフレームが見出さ
れたまた。開始コドンの９塩基上流にはリボソーム結合
部位と思われる配列（ＡＡＡＧＧＡＴＧ）が認められ
た。オープンリーディングフレームから予想されるアミ
ノ酸配列は６５２残基からなり、大腸菌由来（Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１，８７３８，（１９８６）、お
よびバチルス ステアロサーモフィラス１５０３Ｒ．ｖ
ａｒ．４由来（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅ．，２３０，
１３６，（１９９１））のブランチングエンザイムとの
相同性はそれぞれ約４０％、８０％であった。

【００２１】

【発明の効果】本発明により新規な本酵素遺伝子、それ
を含有する組換えプラスミド並びに本酵素を得た。本酵
素が得られたため５０℃以上のでん粉溶液中で反応を行
なうことができるようになった。５０℃以上のでん粉溶
液は雑菌の汚染が起こりにくく、常温より基質となるα
化でん粉の量が多い。本酵素遺伝子を含有する組換えプ
ラスミドが得られたため、本酵素は大腸菌をはじめとす
る常温菌中で生産することができる。本酵素が耐熱性を
有することと、常温菌中で生産することができることに
より、粗酵素液（耐熱性のないでん粉分解酵素を含む）
を熱処理することで本酵素の純度を高めることができ
る。たとえば常温菌を破砕して得た粗酵素液を６０℃で
１５分間熱処理し、沈殿を除くくことにより常温菌由来
の不純物、特にアミラーゼ活性を簡単に除くことができ
る。本発明で明らかにされた本酵素遺伝子の塩基配列に
基づき、他の発現効率の高い本酵素遺伝子を開発するこ
ともできる。

【００２２】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】本酵素遺伝子を単離するためのプローブ調製に
用いる２種のプライマーの設計過程を示した。すなわち
設計に利用した種々のブランチングエンザイムとα−ア
ミラーゼにおける保存領域、およびそのうちの領域１と
４に対応する２種のプライマーの構造を示す。

【図２】組換えλ−ファージ、λ−ＴＢＥ１０２の構造
を、太線は染色体由来ＤＮＡ断片、細線はベクター由来
ＤＮＡ断片として示す。ａは４ｋｂｐのＳａｌＩ−ＤＮ
Ａ断片を、ｂは５ｋｂｐのＸｈｏＩ−ＤＮＡ断片を示
す。

【図３】プラスミドｐＴＢＥ３１、ｐＴＢＥ５１、ｐＵ
Ｃ１１８ＳＥ、ｐＵＣ１１８ＳＥＨ、ｐＵＣ１１８Ａ
Ｓ、およびｐＴＢＥ８２１の作製ルートを示す摸式図を
示す。

【図４】精製された本酵素のＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動し、クマシーブリリアントブルー染色を
行なった写真の写しである。

【図５】精製された本酵素をアミロースに作用させた
後、半分量は無処理で他の半分量はイソアミラーゼ処理
して、薄層クロマトグラフィーを行なった結果である。

【図６】精製された本酵素の各温度における活性を５０
℃のときを１００％として示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 9/26 Ｚ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:07）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列表の配列番号１に示された塩基配列、
   またはそれと実質的に同等な配列を有する耐熱性ブラン
   チングエンザイム遺伝子。
2. 【請求項２】配列表の配列番号１に示された耐熱性ブラ
   ンチングエンザイム遺伝子、またはそれと実質的に同等
   な遺伝子を含有する組換えプラスミド。
3. 【請求項３】配列表の配列番号１に示されたアミノ酸配
   列、またはそれと実質的に同等な配列を有する耐熱性ブ
   ランチングエンザイム。