JP2000041683A - ヘキシュロースリン酸シンターゼおよびヘキシュロースリン酸イソメラーゼの製造法 - Google Patents
ヘキシュロースリン酸シンターゼおよびヘキシュロースリン酸イソメラーゼの製造法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヘキシュロースリン酸シンターゼ及びヘキシ
ュロースリン酸イソメラーゼをともに効率良く発現しう
る微生物およびその利用方法を提供する。 【解決手段】 バチラス ズブチリスのヘキシュロース
リン酸シンターゼ遺伝子及びヘキシュロースリン酸イソ
メラーゼ遺伝子を含む配列表の配列番号９に示す塩基配
列を有するＤＮＡ断片が導入されて形質転換された微生
物を培地で培養し、ヘキシュロースリン酸シンターゼお
よびヘキシュロースリン酸イソメラーゼを培養物中に生
成蓄積させる。
ュロースリン酸イソメラーゼをともに効率良く発現しう
る微生物およびその利用方法を提供する。 【解決手段】 バチラス ズブチリスのヘキシュロース
リン酸シンターゼ遺伝子及びヘキシュロースリン酸イソ
メラーゼ遺伝子を含む配列表の配列番号９に示す塩基配
列を有するＤＮＡ断片が導入されて形質転換された微生
物を培地で培養し、ヘキシュロースリン酸シンターゼお
よびヘキシュロースリン酸イソメラーゼを培養物中に生
成蓄積させる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヘキシュロースリ
ン酸シンターゼ遺伝子、ヘキシュロースリン酸シンター
ゼおよびヘキシュロースリン酸イソメラーゼの酵素活性
が共に増強された細菌、及びヘキシュロースリン酸シン
ターゼおよびヘキシュロースリン酸イソメラーゼを製造
する方法に関する。
ン酸シンターゼ遺伝子、ヘキシュロースリン酸シンター
ゼおよびヘキシュロースリン酸イソメラーゼの酵素活性
が共に増強された細菌、及びヘキシュロースリン酸シン
ターゼおよびヘキシュロースリン酸イソメラーゼを製造
する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】メチロトローフ細菌のＣ１代謝には、リ
ブロースモノリン酸経路が知られている。この経路は、
リブロース ５−リン酸によるホルムアルデヒドの固定
に始まり、フルクトース ６−リン酸の開裂、リブロー
ス ５−リン酸の再生の３つの段階により構成されてい
る。リブロースモノリン酸経路は、いくつかの代謝系と
共役した経路であり、この経路に関与する各酵素の遺伝
子構造に興味が持たれていたが、本経路に関する報告は
少なく、遺伝子的な解析も殆どなされていない。
ブロースモノリン酸経路が知られている。この経路は、
リブロース ５−リン酸によるホルムアルデヒドの固定
に始まり、フルクトース ６−リン酸の開裂、リブロー
ス ５−リン酸の再生の３つの段階により構成されてい
る。リブロースモノリン酸経路は、いくつかの代謝系と
共役した経路であり、この経路に関与する各酵素の遺伝
子構造に興味が持たれていたが、本経路に関する報告は
少なく、遺伝子的な解析も殆どなされていない。
【０００３】リブロースモノリン酸経路の初発反応を触
媒するヘキシュロースリン酸シンターゼ（３−ヘキシュ
ロース−６−リン酸シンターゼ、3-hexulose-6-phospha
te synthase、以下「HPS」ともいう。）については、グ
ラム陰性の偏性メタノール資化菌であるメチロモナス
アミノファシエンス（Methylomonas aminofaciens）に
おいて既に精製され、これをコードする遺伝子がクロー
ニングされ、一次構造が報告されている（Yanase, H. e
t al., FEMS Microbiol. Lett., 135, 201-205(199
6)）。また最近、グラム陽性の通性メタノール資化細菌
であるマイコバクテリウム ガストリ（Mycobacterium
gastri）においてもHPSが精製され、この遺伝子構造が
報告された（１９９７年度 日本農芸化学会大会講演要
旨集第８３頁）。
媒するヘキシュロースリン酸シンターゼ（３−ヘキシュ
ロース−６−リン酸シンターゼ、3-hexulose-6-phospha
te synthase、以下「HPS」ともいう。）については、グ
ラム陰性の偏性メタノール資化菌であるメチロモナス
アミノファシエンス（Methylomonas aminofaciens）に
おいて既に精製され、これをコードする遺伝子がクロー
ニングされ、一次構造が報告されている（Yanase, H. e
t al., FEMS Microbiol. Lett., 135, 201-205(199
6)）。また最近、グラム陽性の通性メタノール資化細菌
であるマイコバクテリウム ガストリ（Mycobacterium
gastri）においてもHPSが精製され、この遺伝子構造が
報告された（１９９７年度 日本農芸化学会大会講演要
旨集第８３頁）。
【０００４】また、リブロースモノリン酸経路において
HPSの触媒反応の次の反応を触媒する酵素であるヘキシ
ュロースリン酸イソメラーゼ（hexulose-phosphate iso
meraseあるいはphosphohexuloisomerase、以下「HPI」
ともいう。）についてもHPSの解析に引き続き行われ、
上記両メタノール資化細菌のHPS遺伝子（hps）及びHPI
遺伝子（hpi）の遺伝子構造が明らかになっている（１
９９７年度 日本農芸化学会大会講演要旨集第８３
頁）。
HPSの触媒反応の次の反応を触媒する酵素であるヘキシ
ュロースリン酸イソメラーゼ（hexulose-phosphate iso
meraseあるいはphosphohexuloisomerase、以下「HPI」
ともいう。）についてもHPSの解析に引き続き行われ、
上記両メタノール資化細菌のHPS遺伝子（hps）及びHPI
遺伝子（hpi）の遺伝子構造が明らかになっている（１
９９７年度 日本農芸化学会大会講演要旨集第８３
頁）。
【０００５】また、ゲノム上の両遺伝子の配置は、マイ
コバクテリウム ガストリMB19株では、hpiの下流にhps
が位置しており、メチロモナス アミノファシエンス77
a株では、hpsとhpiの間にIS10Rというトランスポゾンが
挿入された遺伝子配置になっている。しかしながら、現
在まで、両酵素HPS、HPIの遺伝子構造が明らかになって
いるのは上述の二つのメタノール資化細菌のみである。
コバクテリウム ガストリMB19株では、hpiの下流にhps
が位置しており、メチロモナス アミノファシエンス77
a株では、hpsとhpiの間にIS10Rというトランスポゾンが
挿入された遺伝子配置になっている。しかしながら、現
在まで、両酵素HPS、HPIの遺伝子構造が明らかになって
いるのは上述の二つのメタノール資化細菌のみである。
【０００６】ところで、目的化合物分子上の特異的な位
置が、安定同位元素炭素13（13C）で標識されている生
化学物質は、生物代謝経路の研究に役立つ。更に近年、
代謝産物の生体内での様子を、炭素13-NMRの技術を用い
て調べることは、いろいろな病気の診断や日々の健康診
断において、大変重要な手法になってきている。そのよ
うな新しい技術には、分子のある目的の位置を炭素13で
標識した化合物が、安価に提供できることが必要であ
り、また望まれていた。
置が、安定同位元素炭素13（13C）で標識されている生
化学物質は、生物代謝経路の研究に役立つ。更に近年、
代謝産物の生体内での様子を、炭素13-NMRの技術を用い
て調べることは、いろいろな病気の診断や日々の健康診
断において、大変重要な手法になってきている。そのよ
うな新しい技術には、分子のある目的の位置を炭素13で
標識した化合物が、安価に提供できることが必要であ
り、また望まれていた。
【０００７】Yanaseらは、メタノール資化菌のホルムア
ルデヒド固定経路を利用し、炭素13標識のメタノールか
ら、[1-13C]Ｄ−グルコース ６−リン酸の調製方法を確
立していたが、目的化合物の合成収率はあまり高くなか
った（Biosci. Biotech. Biochem. 57, 308-312 (199
3)）。
ルデヒド固定経路を利用し、炭素13標識のメタノールか
ら、[1-13C]Ｄ−グルコース ６−リン酸の調製方法を確
立していたが、目的化合物の合成収率はあまり高くなか
った（Biosci. Biotech. Biochem. 57, 308-312 (199
3)）。
【０００８】そこで、目的産物のみを効率よく生産させ
る系が望まれていた。そのような系のひとつとして、標
識ホルムアルデヒドとリブロース ５−リン酸を用い、
標識Ｄ−フルクトース ６−リン酸を合成する一連の各
酵素を調製し、これらを用いた反応系で、効率よい目的
標識化合物の調製を行うという方法が考えられる。その
反応の重要な酵素であるHPSとHPIは、上述したようにメ
チロモナス アミノファシエンスやマイコバクテリウム
ガストリといったメタノール資化菌では、それら両酵
素の遺伝子構造は知られているものの、両遺伝子を一度
に、同一細胞内で発現増強させ、両酵素を取得できる方
法については報告されていない。更に、これら両酵素の
遺伝子は、既にメタノール資化菌について知られている
のみで、メタノールを資化しない細菌での、両酵素の存
在については、全く知られていないし、予期もされてい
ない。
る系が望まれていた。そのような系のひとつとして、標
識ホルムアルデヒドとリブロース ５−リン酸を用い、
標識Ｄ−フルクトース ６−リン酸を合成する一連の各
酵素を調製し、これらを用いた反応系で、効率よい目的
標識化合物の調製を行うという方法が考えられる。その
反応の重要な酵素であるHPSとHPIは、上述したようにメ
チロモナス アミノファシエンスやマイコバクテリウム
ガストリといったメタノール資化菌では、それら両酵
素の遺伝子構造は知られているものの、両遺伝子を一度
に、同一細胞内で発現増強させ、両酵素を取得できる方
法については報告されていない。更に、これら両酵素の
遺伝子は、既にメタノール資化菌について知られている
のみで、メタノールを資化しない細菌での、両酵素の存
在については、全く知られていないし、予期もされてい
ない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】上記のような状況下
で、効率よい目的標識化合物の調製系を確立するには、
HPS及びHPIが共に、一度に効率よく発現しうる酵素生産
系を提供することが有効であると本発明者は考えた。本
発明は、かかる観点からなされたものであり、HPS、HPI
をともに効率良く発現しうる細菌およびその利用方法を
提供することを課題とする。
で、効率よい目的標識化合物の調製系を確立するには、
HPS及びHPIが共に、一度に効率よく発現しうる酵素生産
系を提供することが有効であると本発明者は考えた。本
発明は、かかる観点からなされたものであり、HPS、HPI
をともに効率良く発現しうる細菌およびその利用方法を
提供することを課題とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、メタノー
ル資化菌ではないバチラス ズブチリス（Bacillus sub
tilis）のゲノム上の各種遺伝子配列について研究して
いたところ、偶然にもこの株がHPS及びHPIをコードしう
る遺伝子（各々yckG, yckFと命名されている）を持って
いること、そして、その遺伝子のゲノム上での配置が、
今まで全く知られていなかったhps(yckG)の下流にhpi(y
ckF)が位置する（hps(yckG)-hpi(yckF)）という遺伝子
の並び方であり、これをエシェリヒア コリ（Escheric
hia coli）内で強制発現させたところ、両酵素活性が共
に検出できることを発見し、本発明に至った。
ル資化菌ではないバチラス ズブチリス（Bacillus sub
tilis）のゲノム上の各種遺伝子配列について研究して
いたところ、偶然にもこの株がHPS及びHPIをコードしう
る遺伝子（各々yckG, yckFと命名されている）を持って
いること、そして、その遺伝子のゲノム上での配置が、
今まで全く知られていなかったhps(yckG)の下流にhpi(y
ckF)が位置する（hps(yckG)-hpi(yckF)）という遺伝子
の並び方であり、これをエシェリヒア コリ（Escheric
hia coli）内で強制発現させたところ、両酵素活性が共
に検出できることを発見し、本発明に至った。
【００１１】即ち、本発明は、下記（Ａ）又は（Ｂ）に
示すタンパク質であるヘキシュロースリン酸シンターゼ
をコードするＤＮＡ断片（以下、「第一の本発明のＤＮ
Ａ」ともいう。）である。 （Ａ）配列表の配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有
するタンパク質。 （Ｂ）配列表の配列番号１０に記載のアミノ酸配列にお
いて、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、
付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ヘ
キシュロースリン酸シンターゼ活性を有するタンパク
質。
示すタンパク質であるヘキシュロースリン酸シンターゼ
をコードするＤＮＡ断片（以下、「第一の本発明のＤＮ
Ａ」ともいう。）である。 （Ａ）配列表の配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有
するタンパク質。 （Ｂ）配列表の配列番号１０に記載のアミノ酸配列にお
いて、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、
付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ヘ
キシュロースリン酸シンターゼ活性を有するタンパク
質。
【００１２】本発明はまた、前記ＤＮＡと、下記（Ｃ）
又は（Ｄ）に示すタンパク質であるヘキシュロースリン
酸イソメラーゼをコードするＤＮＡとを含むＤＮＡ断片
（以下、「第二の本発明のＤＮＡ」ともいう。）を提供
する。 （Ｃ）配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有
するタンパク質。 （Ｄ）配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列にお
いて、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、
付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ヘ
キシュロースリン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク
質。
又は（Ｄ）に示すタンパク質であるヘキシュロースリン
酸イソメラーゼをコードするＤＮＡとを含むＤＮＡ断片
（以下、「第二の本発明のＤＮＡ」ともいう。）を提供
する。 （Ｃ）配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有
するタンパク質。 （Ｄ）配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列にお
いて、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、
付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ヘ
キシュロースリン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク
質。
【００１３】本発明はさらに、前記第一の本発明のＤＮ
Ａが導入されて形質転換された微生物（以下、「第一の
本発明の微生物」ともいう。）を提供する。また本発明
は、ヘキシュロースリン酸シンターゼ活性およびヘキシ
ュロースリン酸イソメラーゼ活性が増強された微生物
（以下、「第二の本発明の微生物」ともいう。）を提供
する。
Ａが導入されて形質転換された微生物（以下、「第一の
本発明の微生物」ともいう。）を提供する。また本発明
は、ヘキシュロースリン酸シンターゼ活性およびヘキシ
ュロースリン酸イソメラーゼ活性が増強された微生物
（以下、「第二の本発明の微生物」ともいう。）を提供
する。
【００１４】さらに本発明は、第一の本発明の微生物を
培地で培養し、ヘキシュロースリン酸シンターゼを培養
物中に生成蓄積させることを特徴とするヘキシュロース
リン酸シンターゼの製造法を提供する。
培地で培養し、ヘキシュロースリン酸シンターゼを培養
物中に生成蓄積させることを特徴とするヘキシュロース
リン酸シンターゼの製造法を提供する。
【００１５】また本発明は、第二の本発明の微生物を培
地で培養し、ヘキシュロースリン酸シンターゼおよびヘ
キシュロースリン酸イソメラーゼを培養物中に生成蓄積
させることを特徴とするヘキシュロースリン酸シンター
ゼおよびヘキシュロースリン酸イソメラーゼの製造法を
提供する。
地で培養し、ヘキシュロースリン酸シンターゼおよびヘ
キシュロースリン酸イソメラーゼを培養物中に生成蓄積
させることを特徴とするヘキシュロースリン酸シンター
ゼおよびヘキシュロースリン酸イソメラーゼの製造法を
提供する。
【００１６】尚、本発明において、「ヘキシュロースリ
ン酸シンターゼ活性」とはホルムアルデヒドとＤ−リブ
ロース ５−リン酸とを縮合し、Ｄ−アラビノ−３−ヘ
キシュロース ６−リン酸（以下、ヘキシュロース ６−
リン酸ともいう。）を形成する反応を触媒する活性をい
う。また、「ヘキシュロースリン酸イソメラーゼ活性」
とは、３−ヘキシュロース−６−リン酸とフルクトース
−６−リン酸との間の異性化反応を触媒する活性をい
う。
ン酸シンターゼ活性」とはホルムアルデヒドとＤ−リブ
ロース ５−リン酸とを縮合し、Ｄ−アラビノ−３−ヘ
キシュロース ６−リン酸（以下、ヘキシュロース ６−
リン酸ともいう。）を形成する反応を触媒する活性をい
う。また、「ヘキシュロースリン酸イソメラーゼ活性」
とは、３−ヘキシュロース−６−リン酸とフルクトース
−６−リン酸との間の異性化反応を触媒する活性をい
う。
【００１７】最近、いくつかの細菌ゲノムの全塩基配列
が決定され、発表されている。そこで、本発明者らは、
既知であるマイコバクテリウム ガストリMB19由来HPS
のアミノ酸配列情報を基に、構造既知の遺伝子について
コードするアミノ酸レベルで相同性のあるものを検索し
たところ、その中の一つに、バチラス ズブチリスでの
機能未知遺伝子yckGが高い相同性を有していることが判
明した。
が決定され、発表されている。そこで、本発明者らは、
既知であるマイコバクテリウム ガストリMB19由来HPS
のアミノ酸配列情報を基に、構造既知の遺伝子について
コードするアミノ酸レベルで相同性のあるものを検索し
たところ、その中の一つに、バチラス ズブチリスでの
機能未知遺伝子yckGが高い相同性を有していることが判
明した。
【００１８】また、バチラス ズブチリスのゲノム解読
プロジェクトが発表した論文にも、このyckGがメチロモ
ナス アミノファシエンス77a由来のHPS（あるいは、
「Ｄ−アラビノ−３−ヘキシュロース ６−リン酸ホル
ムアルデヒドリアーゼ」ともいう。）とアミノ酸配列が
似ているとの記載がある（Nature, 390, p249 (199
7)）。本発明者らは、更に、この遺伝子yckGの下流に存
在する遺伝子yckFのコードするアミノ酸配列を調べたと
ころ、これは、マイコバクテリウム ガストリMB19株の
HPIのアミノ酸配列（１９９７年度 日本農芸化学会大会
講演要旨集第８３頁）と相同性があることを見い出し
た。
プロジェクトが発表した論文にも、このyckGがメチロモ
ナス アミノファシエンス77a由来のHPS（あるいは、
「Ｄ−アラビノ−３−ヘキシュロース ６−リン酸ホル
ムアルデヒドリアーゼ」ともいう。）とアミノ酸配列が
似ているとの記載がある（Nature, 390, p249 (199
7)）。本発明者らは、更に、この遺伝子yckGの下流に存
在する遺伝子yckFのコードするアミノ酸配列を調べたと
ころ、これは、マイコバクテリウム ガストリMB19株の
HPIのアミノ酸配列（１９９７年度 日本農芸化学会大会
講演要旨集第８３頁）と相同性があることを見い出し
た。
【００１９】しかしながら、メタノールを資化しないバ
チラス ズブチリスが、ヘキシュロースリン酸シンター
ゼやヘキシュロースリン酸イソメラーゼのようなメタノ
ール資化の代謝に関与する酵素の遺伝子を、かつ、そこ
から活性をもつ酵素を発現し得る形でゲノム上に保持
し、現在まで進化してきているとは、当初、全く考えら
れなかった。
チラス ズブチリスが、ヘキシュロースリン酸シンター
ゼやヘキシュロースリン酸イソメラーゼのようなメタノ
ール資化の代謝に関与する酵素の遺伝子を、かつ、そこ
から活性をもつ酵素を発現し得る形でゲノム上に保持
し、現在まで進化してきているとは、当初、全く考えら
れなかった。
【００２０】本発明者らは、しかしながら、この機能未
知遺伝子yckGおよびyckFが、実際に酵素活性を発揮しう
るHPSおよびHPIをコードしているか否かを敢えて検証す
る目的で、この両オープンリーディングフレーム（以
下、「ORF」ともいう。）領域をクローニングし、エシ
ェリヒア コリを宿主とする強制発現系にて発現させ
た。その後、その菌体破砕物中の酵素活性を測定したと
ころ、なんと、HPS, HPIの両酵素活性が検出できたので
ある。
知遺伝子yckGおよびyckFが、実際に酵素活性を発揮しう
るHPSおよびHPIをコードしているか否かを敢えて検証す
る目的で、この両オープンリーディングフレーム（以
下、「ORF」ともいう。）領域をクローニングし、エシ
ェリヒア コリを宿主とする強制発現系にて発現させ
た。その後、その菌体破砕物中の酵素活性を測定したと
ころ、なんと、HPS, HPIの両酵素活性が検出できたので
ある。
【００２１】以上の実験結果は、メタノール資化性とは
本来関係のないバチラス ズブチリスに、メタノール資
化菌の多くに見られるメタノール資化経路であるリブロ
ースモノリン酸経路が存在していることを示した。この
ことは、全く予想だにしなかったことである。
本来関係のないバチラス ズブチリスに、メタノール資
化菌の多くに見られるメタノール資化経路であるリブロ
ースモノリン酸経路が存在していることを示した。この
ことは、全く予想だにしなかったことである。
【００２２】また、ゲノム上の両遺伝子の配置は、yckG
(hps)-yckF(hpi)の順となっており、この配列構造は全
く新規であった。マイコバクテリウム ガストリMB19株
では、hpi-hpsであり、メチロモナス アミノファシエ
ンス77a株では、hpsとhpiの間にIS10Rというトランスポ
ゾンが挿入された遺伝子配置になっている（１９９７年
度 日本農芸化学会大会講演要旨集第８３頁）ことが知
られている。
(hps)-yckF(hpi)の順となっており、この配列構造は全
く新規であった。マイコバクテリウム ガストリMB19株
では、hpi-hpsであり、メチロモナス アミノファシエ
ンス77a株では、hpsとhpiの間にIS10Rというトランスポ
ゾンが挿入された遺伝子配置になっている（１９９７年
度 日本農芸化学会大会講演要旨集第８３頁）ことが知
られている。
【００２３】一方、上記と同様なエシェリヒア コリの
遺伝子発現系へマイコバクテリウムガストリMB19株のhp
i-hps領域を組み込み、同様に強制発現を行っても、こ
の場合、上流に位置するhpiのみが発現産生され、下流
に位置するhpsの同時発現生産は認められなかった。
遺伝子発現系へマイコバクテリウムガストリMB19株のhp
i-hps領域を組み込み、同様に強制発現を行っても、こ
の場合、上流に位置するhpiのみが発現産生され、下流
に位置するhpsの同時発現生産は認められなかった。
【００２４】以上のことは、上記バチラス ズブチリス
のhps(yckG)-hpi(yckF)遺伝子構造が、両遺伝子産物の
組換え技術による量産化にとって大変有利な構造を有し
ていることを示している。
のhps(yckG)-hpi(yckF)遺伝子構造が、両遺伝子産物の
組換え技術による量産化にとって大変有利な構造を有し
ていることを示している。
【００２５】また、バチラス ズブチリス以外の細菌に
おいても、HPSとアミノ酸配列の相同性を有する蛋白質
として、エシュリヒア コリのYiaQ、YjfV等が知られて
いる。そこで、これらの遺伝子についても強制発現を行
い、これら遺伝子産物の酵素活性を測定したが、これら
からは全くHPS活性は認められなかった（後記実施例参
照）。この結果は、アミノ酸の相同性からだけで、その
遺伝子産物の酵素活性は必ずしも特定できないことを示
している。
おいても、HPSとアミノ酸配列の相同性を有する蛋白質
として、エシュリヒア コリのYiaQ、YjfV等が知られて
いる。そこで、これらの遺伝子についても強制発現を行
い、これら遺伝子産物の酵素活性を測定したが、これら
からは全くHPS活性は認められなかった（後記実施例参
照）。この結果は、アミノ酸の相同性からだけで、その
遺伝子産物の酵素活性は必ずしも特定できないことを示
している。
【００２６】
【発明の実施の形態】以下、本発明について、詳細に説
明する。本発明のＤＮＡの第一の形態は、下記（Ａ）又
は（Ｂ）に示すタンパク質であるHPSをコードするＤＮ
Ａ断片（以下、「第一の本発明のＤＮＡ」ともいう。）
である。 （Ａ）配列表の配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有
するタンパク質。 （Ｂ）配列表の配列番号１０に記載のアミノ酸配列にお
いて、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、
付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、HP
S活性を有するタンパク質。
明する。本発明のＤＮＡの第一の形態は、下記（Ａ）又
は（Ｂ）に示すタンパク質であるHPSをコードするＤＮ
Ａ断片（以下、「第一の本発明のＤＮＡ」ともいう。）
である。 （Ａ）配列表の配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有
するタンパク質。 （Ｂ）配列表の配列番号１０に記載のアミノ酸配列にお
いて、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、
付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、HP
S活性を有するタンパク質。
【００２７】上記ＤＮＡとして具体的には、下記（ａ）
又は（ｂ）に示すＤＮＡ断片が挙げられる。 （ａ）配列表の配列番号９に示す塩基配列のうち、少な
くとも塩基番号１〜６３０からなる塩基配列を有するＤ
ＮＡ。 （ｂ）配列表の配列番号９に示す塩基配列のうち、少な
くとも塩基番号１〜６３０からなる塩基配列とストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、HPS活性
を有するタンパク質をコードするバチルス属細菌由来の
ＤＮＡ。
又は（ｂ）に示すＤＮＡ断片が挙げられる。 （ａ）配列表の配列番号９に示す塩基配列のうち、少な
くとも塩基番号１〜６３０からなる塩基配列を有するＤ
ＮＡ。 （ｂ）配列表の配列番号９に示す塩基配列のうち、少な
くとも塩基番号１〜６３０からなる塩基配列とストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、HPS活性
を有するタンパク質をコードするバチルス属細菌由来の
ＤＮＡ。
【００２８】第一の本発明のＤＮＡは、バチラス属細
菌、例えばバチラス ズブチリスの染色体ＤＮＡから、
ＰＣＲ法又はハイブリダイゼーション法によって単離す
ることができる。ハイブリダイゼーションに用いるプロ
ーブとしては、配列表の配列番号９に示す塩基配列のう
ち、塩基番号１〜６３０からなる塩基配列もしくはその
一部を用いることができる。また、ＰＣＲに用いるプラ
イマーとしては、該塩基配列の上流または下流の領域の
塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが、具体的には配
列表の配列番号１及び配列番号２に示す塩基配列を有す
るオリゴヌクレオチドが挙げられる。
菌、例えばバチラス ズブチリスの染色体ＤＮＡから、
ＰＣＲ法又はハイブリダイゼーション法によって単離す
ることができる。ハイブリダイゼーションに用いるプロ
ーブとしては、配列表の配列番号９に示す塩基配列のう
ち、塩基番号１〜６３０からなる塩基配列もしくはその
一部を用いることができる。また、ＰＣＲに用いるプラ
イマーとしては、該塩基配列の上流または下流の領域の
塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが、具体的には配
列表の配列番号１及び配列番号２に示す塩基配列を有す
るオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００２９】配列表の配列番号９に示す塩基配列のう
ち、塩基番号１〜６３０からなる塩基配列は、バチラス
ズブチリスの機能未知遺伝子yckGとして知られていた
が、本発明によりHPSをコードしていることが初めて明
らかにされた。
ち、塩基番号１〜６３０からなる塩基配列は、バチラス
ズブチリスの機能未知遺伝子yckGとして知られていた
が、本発明によりHPSをコードしていることが初めて明
らかにされた。
【００３０】上記ＤＮＡは、コードされるHPSの活性が
損なわれない限り、１若しくは複数の位置での１若しく
は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位
を含むHPSをコードするものであってもよい。ここで、
「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造に
おける位置や種類によっても異なる。それは、イソロイ
シンとバリンのように、アミノ酸によっては、類縁性の
高いアミノ酸が存在し、そのようなアミノ酸の違いが、
蛋白質の立体構造に大きな影響を与えないことに由来す
る。
損なわれない限り、１若しくは複数の位置での１若しく
は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位
を含むHPSをコードするものであってもよい。ここで、
「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造に
おける位置や種類によっても異なる。それは、イソロイ
シンとバリンのように、アミノ酸によっては、類縁性の
高いアミノ酸が存在し、そのようなアミノ酸の違いが、
蛋白質の立体構造に大きな影響を与えないことに由来す
る。
【００３１】上記のようなHPSと実質的に同一のタンパ
ク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法に
よって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位を含むように塩基配列を改変するこ
とによって得られる。また、上記のような改変されたＤ
ＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され
得る。変異処理としては、HPSをコードするＤＮＡをヒ
ドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及びHP
SをコードするＤＮＡを保持する微生物、例えばエシェ
リヒア属細菌を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニ
トロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等
の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理す
る方法が挙げられる。
ク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法に
よって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位を含むように塩基配列を改変するこ
とによって得られる。また、上記のような改変されたＤ
ＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され
得る。変異処理としては、HPSをコードするＤＮＡをヒ
ドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及びHP
SをコードするＤＮＡを保持する微生物、例えばエシェ
リヒア属細菌を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニ
トロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等
の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理す
る方法が挙げられる。
【００３２】また、上記のような塩基の置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位等には、バチルス属細菌の菌株や種
の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又
はvariant）も含まれる。
入、付加、又は逆位等には、バチルス属細菌の菌株や種
の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又
はvariant）も含まれる。
【００３３】上記のような変異を有するＤＮＡを、適当
な細胞で発現させ、発現産物のHPS活性を調べることに
より、HPSと実質的に同一のタンパク質をコードするＤ
ＮＡが得られる。また、変異を有するHPSをコードする
ＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例えば配列表の
配列番号９に記載の塩基配列のうち、塩基番号１〜６３
０からなる塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェント
な条件下でハイブリダイズし、かつ、HPS活性を有する
タンパク質をコードするＤＮＡを単離することによって
も、HPSと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮ
Ａが得られる。ここでいう「ストリンジェントな条件」
とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特
異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条
件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せ
ば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上の相同
性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相
同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あ
るいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条
件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好まし
くは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃
度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
な細胞で発現させ、発現産物のHPS活性を調べることに
より、HPSと実質的に同一のタンパク質をコードするＤ
ＮＡが得られる。また、変異を有するHPSをコードする
ＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例えば配列表の
配列番号９に記載の塩基配列のうち、塩基番号１〜６３
０からなる塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェント
な条件下でハイブリダイズし、かつ、HPS活性を有する
タンパク質をコードするＤＮＡを単離することによって
も、HPSと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮ
Ａが得られる。ここでいう「ストリンジェントな条件」
とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特
異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条
件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せ
ば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上の相同
性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相
同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あ
るいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条
件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好まし
くは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃
度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００３４】このような条件でハイブリダイズする遺伝
子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活
性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、そ
れらについては、市販の活性発現ベクターにつなぎHPS
活性を前記の方法で測定することによって容易に取り除
くことができる。
子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活
性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、そ
れらについては、市販の活性発現ベクターにつなぎHPS
活性を前記の方法で測定することによって容易に取り除
くことができる。
【００３５】本発明のＤＮＡの第二の形態は、上記第一
の本発明のＤＮＡと、下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すタン
パク質であるHPIをコードするＤＮＡとを含むＤＮＡ断
片である。 （Ｃ）配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有
するタンパク質。 （Ｄ）配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列にお
いて、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、
付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ヘ
キシュロースリン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク
質。
の本発明のＤＮＡと、下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すタン
パク質であるHPIをコードするＤＮＡとを含むＤＮＡ断
片である。 （Ｃ）配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有
するタンパク質。 （Ｄ）配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列にお
いて、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、
付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ヘ
キシュロースリン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク
質。
【００３６】上記ＤＮＡとして具体的には、下記（ｃ）
又は（ｄ）に示すＤＮＡが挙げられる。 （ｃ）配列表の配列番号９に記載の塩基配列に示す塩基
配列のうち、少なくとも塩基番号６３９〜１１９３から
なる塩基配列を含むＤＮＡ。 （ｄ）配列表の配列番号９に記載の塩基配列に示す塩基
配列のうち、少なくとも塩基番号６３９〜１１９３から
なる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズし、かつ、ヘキシュロースリン酸イソメラーゼ活性
を有するタンパク質をコードするバチルス属細菌由来の
ＤＮＡ。
又は（ｄ）に示すＤＮＡが挙げられる。 （ｃ）配列表の配列番号９に記載の塩基配列に示す塩基
配列のうち、少なくとも塩基番号６３９〜１１９３から
なる塩基配列を含むＤＮＡ。 （ｄ）配列表の配列番号９に記載の塩基配列に示す塩基
配列のうち、少なくとも塩基番号６３９〜１１９３から
なる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズし、かつ、ヘキシュロースリン酸イソメラーゼ活性
を有するタンパク質をコードするバチルス属細菌由来の
ＤＮＡ。
【００３７】上記HPIをコードするＤＮＡは、バチラス
属細菌、例えばバチラス ズブチリスの染色体ＤＮＡか
ら、ＰＣＲ法又はハイブリダイゼーション法によって単
離することができる。ハイブリダイゼーションに用いる
プローブとしては、配列表の配列番号９に示す塩基配列
のうち、塩基番号６３９〜１１９３からなる塩基配列も
しくはその一部を用いることができる。また、ＰＣＲに
用いるプライマーとしては、該塩基配列の上流または下
流の領域の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが、具
体的には配列表の配列番号３及び配列番号４に示す塩基
配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
属細菌、例えばバチラス ズブチリスの染色体ＤＮＡか
ら、ＰＣＲ法又はハイブリダイゼーション法によって単
離することができる。ハイブリダイゼーションに用いる
プローブとしては、配列表の配列番号９に示す塩基配列
のうち、塩基番号６３９〜１１９３からなる塩基配列も
しくはその一部を用いることができる。また、ＰＣＲに
用いるプライマーとしては、該塩基配列の上流または下
流の領域の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが、具
体的には配列表の配列番号３及び配列番号４に示す塩基
配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００３８】配列表の配列番号９に示す塩基配列のう
ち、塩基番号６３９〜１１９３からなる塩基配列は、バ
チラス ズブチリスの機能未知遺伝子yckFとして知られ
ていたが、本発明者らにより、HPIをコードしているこ
とが明らかにされた。
ち、塩基番号６３９〜１１９３からなる塩基配列は、バ
チラス ズブチリスの機能未知遺伝子yckFとして知られ
ていたが、本発明者らにより、HPIをコードしているこ
とが明らかにされた。
【００３９】上記ＤＮＡは、コードされるHPIの活性が
損なわれない限り、１若しくは複数の位置での１若しく
は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位
を含むHPIをコードするものであってもよい。ここで、
「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造に
おける位置や種類によっても異なる。それは、イソロイ
シンとバリンのように、アミノ酸によっては、類縁性の
高いアミノ酸が存在し、そのようなアミノ酸の違いが、
蛋白質の立体構造に大きな影響を与えないことに由来す
る。
損なわれない限り、１若しくは複数の位置での１若しく
は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位
を含むHPIをコードするものであってもよい。ここで、
「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造に
おける位置や種類によっても異なる。それは、イソロイ
シンとバリンのように、アミノ酸によっては、類縁性の
高いアミノ酸が存在し、そのようなアミノ酸の違いが、
蛋白質の立体構造に大きな影響を与えないことに由来す
る。
【００４０】上記のようなHPIと実質的に同一のタンパ
ク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法に
よって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位を含むように塩基配列を改変するこ
とによって得られる。また、上記のような改変されたＤ
ＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され
得る。変異処理としては、HPIをコードするＤＮＡをヒ
ドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及びHP
IをコードするＤＮＡを保持する微生物、例えばエシェ
リヒア属細菌を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニ
トロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等
の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理す
る方法が挙げられる。
ク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法に
よって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位を含むように塩基配列を改変するこ
とによって得られる。また、上記のような改変されたＤ
ＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され
得る。変異処理としては、HPIをコードするＤＮＡをヒ
ドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及びHP
IをコードするＤＮＡを保持する微生物、例えばエシェ
リヒア属細菌を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニ
トロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等
の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理す
る方法が挙げられる。
【００４１】また、上記のような塩基の置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位等には、バチルス属細菌の菌株や種
の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又
はvariant）も含まれる。
入、付加、又は逆位等には、バチルス属細菌の菌株や種
の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又
はvariant）も含まれる。
【００４２】上記のような変異を有するＤＮＡを、適当
な細胞で発現させ、発現産物のHPI活性を調べることに
より、HPIと実質的に同一のタンパク質をコードするＤ
ＮＡが得られる。また、変異を有するHPIをコードする
ＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例えば配列表の
配列番号９に記載の塩基配列のうち、塩基番号６３９〜
１１９３からなる塩基配列を有するＤＮＡとストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、HPI活性を
有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することに
よっても、HPIと実質的に同一のタンパク質をコードす
るＤＮＡが得られる。ここでいう「ストリンジェントな
条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成さ
れ、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をい
う。この条件を明確に数値化することは困難であるが、
一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％
以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、
それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしな
い条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーション
の洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤ
Ｓ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相
当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
な細胞で発現させ、発現産物のHPI活性を調べることに
より、HPIと実質的に同一のタンパク質をコードするＤ
ＮＡが得られる。また、変異を有するHPIをコードする
ＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例えば配列表の
配列番号９に記載の塩基配列のうち、塩基番号６３９〜
１１９３からなる塩基配列を有するＤＮＡとストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、HPI活性を
有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することに
よっても、HPIと実質的に同一のタンパク質をコードす
るＤＮＡが得られる。ここでいう「ストリンジェントな
条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成さ
れ、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をい
う。この条件を明確に数値化することは困難であるが、
一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％
以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、
それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしな
い条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーション
の洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤ
Ｓ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相
当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００４３】このような条件でハイブリダイズする遺伝
子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活
性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、そ
れらについては、市販の活性発現ベクターにつなぎHPI
活性を前記の方法で測定することによって容易に取り除
くことができる。
子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活
性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、そ
れらについては、市販の活性発現ベクターにつなぎHPI
活性を前記の方法で測定することによって容易に取り除
くことができる。
【００４４】第二の本発明のＤＮＡは、上記第一の本発
明のＤＮＡ（HPSをコードするＤＮＡ断片：HPS遺伝子）
と、HPIをコードするＤＮＡ断片（HPI遺伝子）とを連結
することによって得られる。また、第二の本発明のＤＮ
Ａは、バチラス属細菌、例えばバチラス ズブチリスの
染色体ＤＮＡから、ＰＣＲ法又はハイブリダイゼーショ
ン法によって単離することができる。ＰＣＲに用いるプ
ライマーとしては、配列表の配列番号９に示す塩基配列
のうち、塩基番号１〜１１９３からなる塩基配列の上流
又は下流の領域の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
が、具体的には配列表の配列番号１及び配列番号４に示
す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
このようにして得られる第二の本発明のＤＮＡとして具
体的には、配列表の配列番号９に示す塩基配列を有する
ＤＮＡ断片が挙げられる。
明のＤＮＡ（HPSをコードするＤＮＡ断片：HPS遺伝子）
と、HPIをコードするＤＮＡ断片（HPI遺伝子）とを連結
することによって得られる。また、第二の本発明のＤＮ
Ａは、バチラス属細菌、例えばバチラス ズブチリスの
染色体ＤＮＡから、ＰＣＲ法又はハイブリダイゼーショ
ン法によって単離することができる。ＰＣＲに用いるプ
ライマーとしては、配列表の配列番号９に示す塩基配列
のうち、塩基番号１〜１１９３からなる塩基配列の上流
又は下流の領域の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
が、具体的には配列表の配列番号１及び配列番号４に示
す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
このようにして得られる第二の本発明のＤＮＡとして具
体的には、配列表の配列番号９に示す塩基配列を有する
ＤＮＡ断片が挙げられる。
【００４５】第一の本発明のＤＮＡを発現可能な形態で
微生物に導入し、得られる形質転換体を培地で培養し、
該ＤＮＡを発現させることによって、HPSを培養物中に
生成蓄積させることができる。また、HPS活性およびHPI
活性が増強された微生物を培地で培養することによっ
て、HPSおよびHPIを培養物中に生成蓄積させることがで
きる。ここで、HPS活性およびHPI活性の増強とは、HPS
活性またはHPI活性を持たない微生物にこれらの酵素活
性を持たせること、及びもともとHPS活性またはHPI活性
を持つ微生物のこれらの酵素活性を上昇させることのい
ずれをも含む。
微生物に導入し、得られる形質転換体を培地で培養し、
該ＤＮＡを発現させることによって、HPSを培養物中に
生成蓄積させることができる。また、HPS活性およびHPI
活性が増強された微生物を培地で培養することによっ
て、HPSおよびHPIを培養物中に生成蓄積させることがで
きる。ここで、HPS活性およびHPI活性の増強とは、HPS
活性またはHPI活性を持たない微生物にこれらの酵素活
性を持たせること、及びもともとHPS活性またはHPI活性
を持つ微生物のこれらの酵素活性を上昇させることのい
ずれをも含む。
【００４６】HPI活性及びHPS活性の増強は、HPS遺伝子
及びHPI遺伝子を、それぞれ発現可能な形態で微生物に
導入することによって行うことができる。これは、各々
の酵素をコードする各々の遺伝子を別々のプロモーター
により強制発現させる手法でも、あるいは、一つのプロ
モーターの制御下で両該遺伝子を強制発現させることで
も可能である。また、これらの遺伝子がプラスミド上に
ある場合でも、あるいは、染色体上に存在する場合であ
っても、これらの遺伝子のプロモーター等の発現調節配
列を強化することによって、又は翻訳効率を改善するこ
とによって、発現を強化してもよい。あるいは、染色体
上の遺伝子数を増幅することによっても酵素活性を増強
することができる。更に、比活性を上昇させた改変酵素
をコードするように変化させたHPS又はHPIをコードする
遺伝子を用いることによって、これらの酵素活性の増強
は達成される。
及びHPI遺伝子を、それぞれ発現可能な形態で微生物に
導入することによって行うことができる。これは、各々
の酵素をコードする各々の遺伝子を別々のプロモーター
により強制発現させる手法でも、あるいは、一つのプロ
モーターの制御下で両該遺伝子を強制発現させることで
も可能である。また、これらの遺伝子がプラスミド上に
ある場合でも、あるいは、染色体上に存在する場合であ
っても、これらの遺伝子のプロモーター等の発現調節配
列を強化することによって、又は翻訳効率を改善するこ
とによって、発現を強化してもよい。あるいは、染色体
上の遺伝子数を増幅することによっても酵素活性を増強
することができる。更に、比活性を上昇させた改変酵素
をコードするように変化させたHPS又はHPIをコードする
遺伝子を用いることによって、これらの酵素活性の増強
は達成される。
【００４７】本発明のＤＮＡ断片を導入する微生物とし
ては、エシェリヒア コリ等のエシェリヒア属細菌をは
じめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス セレビ
シエ（Saccharomyces cerevisiae）をはじめとする種々
の真核細胞、動物細胞、植物細胞が挙げられるが、これ
らの中では原核細胞、特にエシェリヒア コリが好まし
い。
ては、エシェリヒア コリ等のエシェリヒア属細菌をは
じめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス セレビ
シエ（Saccharomyces cerevisiae）をはじめとする種々
の真核細胞、動物細胞、植物細胞が挙げられるが、これ
らの中では原核細胞、特にエシェリヒア コリが好まし
い。
【００４８】上記の宿主に本発明のＤＮＡを導入するた
めのベクターとしては、例えばpUC19、pUC18、pBR322、
pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW11
9、pMW118、pMW219、pMW218等が挙げられる。他にもフ
ァージＤＮＡのベクターも利用できる。これらのベクタ
ーに本発明のＤＮＡを連結して得られる組換えベクター
で上記宿主を形質転換することによって、本発明のＤＮ
Ａを導入することができる。また、本発明のＤＮＡを、
トランスダクション、トランスポゾン（Berg,D.E. and
Berg,C.M.,Bio/Technol.,1,417(1983)）、Ｍｕファージ
（特開平２−１０９９８５号）または相同性組換え（Ex
periments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbo
r Lab.(1972)）を用いた方法で宿主のゲノムに組み込ん
でもよい。
めのベクターとしては、例えばpUC19、pUC18、pBR322、
pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW11
9、pMW118、pMW219、pMW218等が挙げられる。他にもフ
ァージＤＮＡのベクターも利用できる。これらのベクタ
ーに本発明のＤＮＡを連結して得られる組換えベクター
で上記宿主を形質転換することによって、本発明のＤＮ
Ａを導入することができる。また、本発明のＤＮＡを、
トランスダクション、トランスポゾン（Berg,D.E. and
Berg,C.M.,Bio/Technol.,1,417(1983)）、Ｍｕファージ
（特開平２−１０９９８５号）または相同性組換え（Ex
periments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbo
r Lab.(1972)）を用いた方法で宿主のゲノムに組み込ん
でもよい。
【００４９】また、遺伝子発現を効率的に実施するため
に、HPS遺伝子又はHPI遺伝子の上流に、宿主細胞内で働
くｌａｃ、ｔｒｐ、ＰL等のプロモーターを連結しても
よい。ベクターとして、プロモーターを含むベクターを
用いると、本発明のＤＮＡと、ベクター及びプロモータ
ーとの連結を一度に行うことができる。このようなベク
ターとしては、ｔｒｐプロモーターを含むpT13sNco（J.
Biochem. 104, 30-34(1988)に記載）が挙げられる。
に、HPS遺伝子又はHPI遺伝子の上流に、宿主細胞内で働
くｌａｃ、ｔｒｐ、ＰL等のプロモーターを連結しても
よい。ベクターとして、プロモーターを含むベクターを
用いると、本発明のＤＮＡと、ベクター及びプロモータ
ーとの連結を一度に行うことができる。このようなベク
ターとしては、ｔｒｐプロモーターを含むpT13sNco（J.
Biochem. 104, 30-34(1988)に記載）が挙げられる。
【００５０】形質転換は、例えば、エシェリヒア コリ
K-12について報告されているような、受容菌細胞を塩
化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（ M
andel,M.and Higa,A.,J.Mol.,Biol.,53,159(1970) ）
や、バチルス ズブチリスについて報告されているよう
な、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤ
ＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Yo
ung,F.E.,Gene,1,153(1977) ）を用いることができる。
あるいは、バチルス ズブチリス、放線菌類および酵母
について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、
組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはス
フェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容
菌に導入する方法（ Chang,S.and Choen,S.N.,Molec.Ge
n.,Genet.,168.111(1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hop
wood,O.A.,Nature,274,398(1978);Hinnen,A.,Hicks,J.
B.and Fink,G.R.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75 1929(197
8)）も応用できる。これらの方法は、宿主として用いる
細胞に応じて適宜選択すればよい。
K-12について報告されているような、受容菌細胞を塩
化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（ M
andel,M.and Higa,A.,J.Mol.,Biol.,53,159(1970) ）
や、バチルス ズブチリスについて報告されているよう
な、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤ
ＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Yo
ung,F.E.,Gene,1,153(1977) ）を用いることができる。
あるいは、バチルス ズブチリス、放線菌類および酵母
について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、
組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはス
フェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容
菌に導入する方法（ Chang,S.and Choen,S.N.,Molec.Ge
n.,Genet.,168.111(1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hop
wood,O.A.,Nature,274,398(1978);Hinnen,A.,Hicks,J.
B.and Fink,G.R.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75 1929(197
8)）も応用できる。これらの方法は、宿主として用いる
細胞に応じて適宜選択すればよい。
【００５１】培養に用いる培地は、用いる宿主に応じて
適宜選択すればよい。宿主としてエシェリヒア コリを
用い、HPS遺伝子、又はHPS遺伝子及びHPI遺伝子をｔｒ
ｐプロモーターで発現させる場合には、M9−カザミノ酸
−グルコース培地が好ましい。培養は、37℃で行い、培
養開始後数時間後に、ｔｒｐプロモーターの誘導剤であ
るインドールアクリル酸（IAA）を終濃度25μg/mlにな
るよう添加し、更に培養を続けると、菌体内にHPS、又
はHPS及びHPIが蓄積する。また、適当な分泌系を用いて
これらの酵素を細胞外に分泌生産させる場合には、これ
らの酵素は培地中に蓄積する。
適宜選択すればよい。宿主としてエシェリヒア コリを
用い、HPS遺伝子、又はHPS遺伝子及びHPI遺伝子をｔｒ
ｐプロモーターで発現させる場合には、M9−カザミノ酸
−グルコース培地が好ましい。培養は、37℃で行い、培
養開始後数時間後に、ｔｒｐプロモーターの誘導剤であ
るインドールアクリル酸（IAA）を終濃度25μg/mlにな
るよう添加し、更に培養を続けると、菌体内にHPS、又
はHPS及びHPIが蓄積する。また、適当な分泌系を用いて
これらの酵素を細胞外に分泌生産させる場合には、これ
らの酵素は培地中に蓄積する。
【００５２】後記実施例に示すように、配列番号１及び
配列番号４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
をプライマーとして、バチラス ズブチリスの染色体Ｄ
ＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片
は、エシェリヒア コリで強制発現させたときに、該エ
シェリヒア コリの細胞抽出液は、HPI活性およびHPS活
性のいずれをも示した。
配列番号４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
をプライマーとして、バチラス ズブチリスの染色体Ｄ
ＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片
は、エシェリヒア コリで強制発現させたときに、該エ
シェリヒア コリの細胞抽出液は、HPI活性およびHPS活
性のいずれをも示した。
【００５３】上記のようにして製造されるHPS、又はHPS
及びHPIは、必要に応じて、菌体抽出液又は培地からイ
オン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフ
ィー、吸着クロマトグラフィー、溶媒沈殿等、通常の酵
素の精製法を用いて精製することができる。
及びHPIは、必要に応じて、菌体抽出液又は培地からイ
オン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフ
ィー、吸着クロマトグラフィー、溶媒沈殿等、通常の酵
素の精製法を用いて精製することができる。
【００５４】本発明により得られるHPS、又はHPS及びHP
Iは、炭素13標識のメタノールから、［1-13C］Ｄ−グル
コース ６−リン酸を調製するのに利用することができ
る。この［1-13C］Ｄ−グルコース ６−リン酸の調製
は、例えば次のようにして行うことができる。メタノー
ル資化酵母キャンジダ ボイジニーより調製したアルコ
ールオキシダーゼを用いてメタノールをホルムアルデヒ
ドに酸化する。得られたホルムアルデヒドはHPSの作用
で、リブロース ５−リン酸とアルドール縮合してアラ
ビノ−３−ヘキシュロース ６−リン酸を生成させる。
この場合、リブロース ５−リン酸は不安定であるの
で、同じ反応系内でリボース ５−リン酸よりホスホリ
ボイソメラーゼの作用でリブロース ５−リン酸に異性
化し、HPS反応に供する。上記反応で生成したアラビノ
−３−ヘキシュロース ６−リン酸はHPIの作用で、フル
クトース ６−リン酸に変換され、更に、これはグルコ
ース ６−リン酸イソメラーゼの作用で、グルコース ６
−リン酸に変換される。
Iは、炭素13標識のメタノールから、［1-13C］Ｄ−グル
コース ６−リン酸を調製するのに利用することができ
る。この［1-13C］Ｄ−グルコース ６−リン酸の調製
は、例えば次のようにして行うことができる。メタノー
ル資化酵母キャンジダ ボイジニーより調製したアルコ
ールオキシダーゼを用いてメタノールをホルムアルデヒ
ドに酸化する。得られたホルムアルデヒドはHPSの作用
で、リブロース ５−リン酸とアルドール縮合してアラ
ビノ−３−ヘキシュロース ６−リン酸を生成させる。
この場合、リブロース ５−リン酸は不安定であるの
で、同じ反応系内でリボース ５−リン酸よりホスホリ
ボイソメラーゼの作用でリブロース ５−リン酸に異性
化し、HPS反応に供する。上記反応で生成したアラビノ
−３−ヘキシュロース ６−リン酸はHPIの作用で、フル
クトース ６−リン酸に変換され、更に、これはグルコ
ース ６−リン酸イソメラーゼの作用で、グルコース ６
−リン酸に変換される。
【００５５】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明する。
明する。
【００５６】＜１＞マイコバクテリウム ガストリ MB1
9株でのヘキシュロースリン酸シンターゼ遺伝子(hps)と
アミノ酸配列の相同性を有する遺伝子の検索 マイコバクテリウム ガストリ MB19株のHPSのアミノ酸
配列は既に公知である（１９９７年度日本農芸化学大会
講演要旨集第８３頁）。このアミノ酸配列を基に、蛋白
質データベースであるSWISS-PROT (European Bioinform
atics Institute (EBI)) Release 34.0 に対して、Gene
tyx-Macシステム（ソフトウエア開発株式会社）を用い
て、アミノ酸配列の相同性検索を行ったところ、バチラ
ス ズブチリスの機能未知遺伝子yckGやエシェリヒア
コリの機能未知遺伝子yjfV, yiaQが高いスコアーで、相
同性があるものとして呈示された。そこで、これらの遺
伝子を、エシェリヒア コリを宿主にして強制発現さ
せ、本当にこれらの遺伝子がHPSとして機能を有する酵
素を産生できるのかどうかを検証することとした。
9株でのヘキシュロースリン酸シンターゼ遺伝子(hps)と
アミノ酸配列の相同性を有する遺伝子の検索 マイコバクテリウム ガストリ MB19株のHPSのアミノ酸
配列は既に公知である（１９９７年度日本農芸化学大会
講演要旨集第８３頁）。このアミノ酸配列を基に、蛋白
質データベースであるSWISS-PROT (European Bioinform
atics Institute (EBI)) Release 34.0 に対して、Gene
tyx-Macシステム（ソフトウエア開発株式会社）を用い
て、アミノ酸配列の相同性検索を行ったところ、バチラ
ス ズブチリスの機能未知遺伝子yckGやエシェリヒア
コリの機能未知遺伝子yjfV, yiaQが高いスコアーで、相
同性があるものとして呈示された。そこで、これらの遺
伝子を、エシェリヒア コリを宿主にして強制発現さ
せ、本当にこれらの遺伝子がHPSとして機能を有する酵
素を産生できるのかどうかを検証することとした。
【００５７】＜２＞エシェリヒア コリyjfV, yiaQのク
ローニングとエシェリヒア コリでのyjfV, yiaQの強制
発現 既に報告されているエシェリヒア コリのゲノム塩基配
列の情報を基に、yjfVあるいはyiaQのオープンリーディ
ングフレーム(ORF)を含む領域を、PCR法にて増幅した。
用いたDNAプライマーはyjfVに対してはEc-yjfV-1（配列
表の配列番号５）及びEc-yjfW-2（配列表の配列番号
６）であった。また、yiaQに対してはEc-yiaQ-1（配列
表の配列番号７）およびEc-yiaQ-2（配列表の配列番号
８）であった。なお、Ec-yjfV-1及び Ec-yiaQ-1 はその
５’端近くに制限酵素ClaIの認識配列を組み込んでい
る。またEc-yjfW-2及び Ec-yiaQ-2はその５’端近くに
制限酵素BamHIの認識配列を組み込んでいる。
ローニングとエシェリヒア コリでのyjfV, yiaQの強制
発現 既に報告されているエシェリヒア コリのゲノム塩基配
列の情報を基に、yjfVあるいはyiaQのオープンリーディ
ングフレーム(ORF)を含む領域を、PCR法にて増幅した。
用いたDNAプライマーはyjfVに対してはEc-yjfV-1（配列
表の配列番号５）及びEc-yjfW-2（配列表の配列番号
６）であった。また、yiaQに対してはEc-yiaQ-1（配列
表の配列番号７）およびEc-yiaQ-2（配列表の配列番号
８）であった。なお、Ec-yjfV-1及び Ec-yiaQ-1 はその
５’端近くに制限酵素ClaIの認識配列を組み込んでい
る。またEc-yjfW-2及び Ec-yiaQ-2はその５’端近くに
制限酵素BamHIの認識配列を組み込んでいる。
【００５８】一方、ゲノムは常法（Biochim. Biophy. A
cta, 72, 619-629 (1963)）により、エシェリヒア・コ
リW3110株より調製した。PCR反応は、ポリメラーゼとし
てLA-Taq（宝酒造（株）製)を用いて行い、またPCR条件
は94℃、90秒の熱処理の後、98℃-10秒、58℃-20秒、70
℃-2分10秒を28サイクル行い、その後72℃で3分間保温
するというものであった。この反応により目的の大きさ
のDNA断片を、各々取得した。そしてこれらyiaQ遺伝子
あるいは YjfV遺伝子を含むDNA断片を精製後、制限酵素
ClaI及びBamHIにて処理し、各々、それらの切断端を両
端に持つDNA断片を得た。
cta, 72, 619-629 (1963)）により、エシェリヒア・コ
リW3110株より調製した。PCR反応は、ポリメラーゼとし
てLA-Taq（宝酒造（株）製)を用いて行い、またPCR条件
は94℃、90秒の熱処理の後、98℃-10秒、58℃-20秒、70
℃-2分10秒を28サイクル行い、その後72℃で3分間保温
するというものであった。この反応により目的の大きさ
のDNA断片を、各々取得した。そしてこれらyiaQ遺伝子
あるいは YjfV遺伝子を含むDNA断片を精製後、制限酵素
ClaI及びBamHIにて処理し、各々、それらの切断端を両
端に持つDNA断片を得た。
【００５９】次に、上記DNA断片を発現させる為の高発
現用プラスミドとして、トリプトファンプロモーター(P
trp)を有するプラスミドpT13sNco（J. Biochem., 104,
30-34 (1988)に記載）を用いた。pT13sNcoを制限酵素Cl
aI及びBamHIにて切断し、得られる大きいDNA断片（ベク
ター部分）を調製した。これに、上記yiaQ断片あるいは
yjfV断片をT4-DNAリガーゼにて連結することで、yiaQの
発現プラスミドpT-Ec-yiaQ1、及び、yjfVの発現プラス
ミドpT-Ec-yjfV1をそれぞれ構築した。
現用プラスミドとして、トリプトファンプロモーター(P
trp)を有するプラスミドpT13sNco（J. Biochem., 104,
30-34 (1988)に記載）を用いた。pT13sNcoを制限酵素Cl
aI及びBamHIにて切断し、得られる大きいDNA断片（ベク
ター部分）を調製した。これに、上記yiaQ断片あるいは
yjfV断片をT4-DNAリガーゼにて連結することで、yiaQの
発現プラスミドpT-Ec-yiaQ1、及び、yjfVの発現プラス
ミドpT-Ec-yjfV1をそれぞれ構築した。
【００６０】このpT-Ec-yiaQ1あるいはpT-Ec-yjfV1を用
いてエシェリヒア コリ JM109株を常法により形質転換
し、形質転換体JM109/pT-Ec-yiaQ1あるいはJM109/pT-Ec
-yjfV1を得た。一方、DNA断片yckGを含まないプラスミ
ドで形質転換した対照株としては、pT13sNcoのベクター
部分であるpTTNcoを保持するエシェリヒア コリ JM109
株(JM109/pTTNco) を用いた。
いてエシェリヒア コリ JM109株を常法により形質転換
し、形質転換体JM109/pT-Ec-yiaQ1あるいはJM109/pT-Ec
-yjfV1を得た。一方、DNA断片yckGを含まないプラスミ
ドで形質転換した対照株としては、pT13sNcoのベクター
部分であるpTTNcoを保持するエシェリヒア コリ JM109
株(JM109/pTTNco) を用いた。
【００６１】これらの形質転換体を、M9-カザミノ酸-グ
ルコース培地(M9-CA-Glc培地)で、37℃にて培養し、約
２時間後に、Ptrpからの転写の誘導剤であるインドール
アクリル酸(IAA)を終濃度25μg/mlになるように添加
し、更に培養を６時間続け、その後、培養液４mlを集菌
した。この菌体へ、懸濁用の緩衝液（50mMリン酸カリウ
ム(pH7.6)、 3mM塩化マグネシウム、1mMジチオスレイト
ール）を1ml添加して菌体を懸濁した。次に、菌体を超
音波破砕後、遠心分離（15000rpm、30分）し、可溶性画
分を酵素標品とした。
ルコース培地(M9-CA-Glc培地)で、37℃にて培養し、約
２時間後に、Ptrpからの転写の誘導剤であるインドール
アクリル酸(IAA)を終濃度25μg/mlになるように添加
し、更に培養を６時間続け、その後、培養液４mlを集菌
した。この菌体へ、懸濁用の緩衝液（50mMリン酸カリウ
ム(pH7.6)、 3mM塩化マグネシウム、1mMジチオスレイト
ール）を1ml添加して菌体を懸濁した。次に、菌体を超
音波破砕後、遠心分離（15000rpm、30分）し、可溶性画
分を酵素標品とした。
【００６２】上記酵素標品について、HPS活性を測定し
た。活性測定法はホルムアルデヒドの同化を、最終的に
グルコース−６−リン酸脱水素酵素による酸化型ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP+）の還
元化を測定するという方法を用いた（Methods in Enzym
ology, vol.188, p391に記載の方法に基づく）。
た。活性測定法はホルムアルデヒドの同化を、最終的に
グルコース−６−リン酸脱水素酵素による酸化型ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP+）の還
元化を測定するという方法を用いた（Methods in Enzym
ology, vol.188, p391に記載の方法に基づく）。
【００６３】具体的には、反応液〔50mMリン酸カリウム
(pH7.6)、3mM塩化マグネシウム、3mM リボース ５−リ
ン酸、2.5mM NADP+、3U/ml ホスホリボイソメラーゼ
（シグマ社製）、3.5U/ml ホスホグルコイソメラーゼ
（ベーリンガー社製)、3.5U/ml グルコース−６−リン
酸脱水素酵素（ベーリンガー社製）、3U/ml HPI〕を、
0.9mlずつ分光光度計用のキュベット（標品用と対照
用）に入れ、37℃で５分間保温した。その後、標品用の
キュベットに菌体可溶性画分を0.05ml添加、混合し、吸
光度の上昇が、この成分のみでは起こらないことを確認
した。つづいて、対照用のキュベットに水0.1mlを、標
品用のキュベットには0.1Mホルムアルデヒドを0.05ml加
えることで反応を開始し、NADP+の還元に伴う340nm波長
光の吸光度上昇を指標にHPS活性を測定した。
(pH7.6)、3mM塩化マグネシウム、3mM リボース ５−リ
ン酸、2.5mM NADP+、3U/ml ホスホリボイソメラーゼ
（シグマ社製）、3.5U/ml ホスホグルコイソメラーゼ
（ベーリンガー社製)、3.5U/ml グルコース−６−リン
酸脱水素酵素（ベーリンガー社製）、3U/ml HPI〕を、
0.9mlずつ分光光度計用のキュベット（標品用と対照
用）に入れ、37℃で５分間保温した。その後、標品用の
キュベットに菌体可溶性画分を0.05ml添加、混合し、吸
光度の上昇が、この成分のみでは起こらないことを確認
した。つづいて、対照用のキュベットに水0.1mlを、標
品用のキュベットには0.1Mホルムアルデヒドを0.05ml加
えることで反応を開始し、NADP+の還元に伴う340nm波長
光の吸光度上昇を指標にHPS活性を測定した。
【００６４】なお、HPIは、メタノールで増殖させたメ
チロモナス アミノファシエンス77a株からDEAE-セファ
セルのイオン交換クロマトグラフィーの精製法によっ
て、部分精製が可能である（文献Appl. Microbiol. Bio
technol., 37巻, 301-304頁, (1992年)）。
チロモナス アミノファシエンス77a株からDEAE-セファ
セルのイオン交換クロマトグラフィーの精製法によっ
て、部分精製が可能である（文献Appl. Microbiol. Bio
technol., 37巻, 301-304頁, (1992年)）。
【００６５】その活性測定の結果、いずれの形質転換体
から得られた細胞抽出液を用いた場合も、対照株JM109/
pTTNcoの場合と比較して、有意なHPS活性を検出できな
かった。なお、両遺伝子産物YiaQ及びYjfVはともに菌体
内で高発現し、可溶性画分に存在したことを、測定に供
した酵素標品中のタンパク質をSDS-PAGEで展開し、各遺
伝子産物がそこにあることによって確認した。このこと
は、アミノ酸配列の相同性のみで、活性も予測するとい
う方法には限界があることを示している。
から得られた細胞抽出液を用いた場合も、対照株JM109/
pTTNcoの場合と比較して、有意なHPS活性を検出できな
かった。なお、両遺伝子産物YiaQ及びYjfVはともに菌体
内で高発現し、可溶性画分に存在したことを、測定に供
した酵素標品中のタンパク質をSDS-PAGEで展開し、各遺
伝子産物がそこにあることによって確認した。このこと
は、アミノ酸配列の相同性のみで、活性も予測するとい
う方法には限界があることを示している。
【００６６】＜３＞バチラス ズブチリスyckG-yckF領
域のクローニングとエシェリヒア コリでのyckG-yckF
の強制発現 マイコバクテリウム ガストリMB19株のHPSのアミノ酸
配列と相同性があるYckGに関連し、更に、この遺伝子yc
kGの下流に存在する遺伝子yckFのコードするアミノ酸配
列を調べたところ、これは、マイコバクテリウム ガス
トリMB19株のHPIのアミノ酸配列（１９９７年度 日本農
芸化学会大会講演要旨集第８３頁）と相同性があること
を見い出した。そこで、このyckFについても、yckGと同
時に強制発現を行い、これらが活性のあるHPI、HPSをコ
ードしているものかどうかについての検討を行った。
域のクローニングとエシェリヒア コリでのyckG-yckF
の強制発現 マイコバクテリウム ガストリMB19株のHPSのアミノ酸
配列と相同性があるYckGに関連し、更に、この遺伝子yc
kGの下流に存在する遺伝子yckFのコードするアミノ酸配
列を調べたところ、これは、マイコバクテリウム ガス
トリMB19株のHPIのアミノ酸配列（１９９７年度 日本農
芸化学会大会講演要旨集第８３頁）と相同性があること
を見い出した。そこで、このyckFについても、yckGと同
時に強制発現を行い、これらが活性のあるHPI、HPSをコ
ードしているものかどうかについての検討を行った。
【００６７】上記と同様にバチラス ズブチリス168株
のゲノムDNAに対してDNAプライマーBsYck-G1（配列番号
１）及びBsYck-F2（配列番号４）を用いて、Long-PCRを
行った。なお、プライマーBsYck-G1は、yckG遺伝子の開
始コドンから下流の領域に結合するように、また、プラ
イマーBsYckF-F2は、yckF遺伝子下流域の非翻訳領域に
結合するよう設計した。なおBsYck-G1はその５’端近く
に制限酵素ClaIの認識配列を、またBsYck-F2はその５’
端近くに制限酵素BamHIの認識配列を組み込んだ。PCR反
応に使用したポリメラーゼはLA-Taq（宝酒造（株）製)
で、反応条件は94℃、90秒の熱処理の後、98℃-10秒、5
8℃-20秒、70℃-1分50秒を28サイクル行い、その後73℃
で５分間保温するというものであった。この反応により
目的の大きさ(約1200bp)のDNA断片を取得した。このDNA
断片を精製後、制限酵素ClaI及びBamHIにて処理し、そ
れらの切断端を両端にもつDNA断片(A)を得た。
のゲノムDNAに対してDNAプライマーBsYck-G1（配列番号
１）及びBsYck-F2（配列番号４）を用いて、Long-PCRを
行った。なお、プライマーBsYck-G1は、yckG遺伝子の開
始コドンから下流の領域に結合するように、また、プラ
イマーBsYckF-F2は、yckF遺伝子下流域の非翻訳領域に
結合するよう設計した。なおBsYck-G1はその５’端近く
に制限酵素ClaIの認識配列を、またBsYck-F2はその５’
端近くに制限酵素BamHIの認識配列を組み込んだ。PCR反
応に使用したポリメラーゼはLA-Taq（宝酒造（株）製)
で、反応条件は94℃、90秒の熱処理の後、98℃-10秒、5
8℃-20秒、70℃-1分50秒を28サイクル行い、その後73℃
で５分間保温するというものであった。この反応により
目的の大きさ(約1200bp)のDNA断片を取得した。このDNA
断片を精製後、制限酵素ClaI及びBamHIにて処理し、そ
れらの切断端を両端にもつDNA断片(A)を得た。
【００６８】一方、上記DNA断片を発現させる為に、前
記のyjfV及びyiaQの発現に用いたのと同じ高発現用プラ
スミドpT13sNco (J. Biochem., 104, 30-34 (1988)に記
載）を用いた。pT13sNcoを制限酵素ClaI及びBamHIにて
切断し、得られる大きいDNA断片を調製した。これに上
記DNA断片(A)をT4-DNAリガーゼにて連結することで、yc
kG及びyckF用の発現プラスミドpT-Bsb-yckGF1を構築し
た。
記のyjfV及びyiaQの発現に用いたのと同じ高発現用プラ
スミドpT13sNco (J. Biochem., 104, 30-34 (1988)に記
載）を用いた。pT13sNcoを制限酵素ClaI及びBamHIにて
切断し、得られる大きいDNA断片を調製した。これに上
記DNA断片(A)をT4-DNAリガーゼにて連結することで、yc
kG及びyckF用の発現プラスミドpT-Bsb-yckGF1を構築し
た。
【００６９】このpT-Bsb-yckGF1を用いてエシェリヒア
コリ JM109株を常法により形質転換し、形質転換体JM
109/pT-Bsb-yckGF1を得た。この形質転換体JM109/pT-Bs
b-yckGF1はプライベートナンバーAJ13469が付与され、
平成10年７年６日より、通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所（郵便番号305-8566 日本国茨城県つく
ば市東一丁目１番３号）に寄託されており、受託番号FE
RM P-16873が付与されている。一方、対照株としては、
pT13sNcoのベクター部分であるpTTNcoを保持するエシェ
リヒア コリ JM109株(JM109/pTTNco）を用いた。
コリ JM109株を常法により形質転換し、形質転換体JM
109/pT-Bsb-yckGF1を得た。この形質転換体JM109/pT-Bs
b-yckGF1はプライベートナンバーAJ13469が付与され、
平成10年７年６日より、通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所（郵便番号305-8566 日本国茨城県つく
ば市東一丁目１番３号）に寄託されており、受託番号FE
RM P-16873が付与されている。一方、対照株としては、
pT13sNcoのベクター部分であるpTTNcoを保持するエシェ
リヒア コリ JM109株(JM109/pTTNco）を用いた。
【００７０】これらの形質転換体を、上記と同様にM9-
カザミノ酸-グルコース培地（M9-CA-Glc培地）で、37℃
にて培養し、約２時間後に、Ptrpからの転写の誘導剤で
あるインドールアクリル酸(IAA)を終濃度25μg/mlにな
るように添加し、更に培養を６時間続け、その後、培養
液４mlを集菌した。この菌体へ、懸濁用の緩衝液（50mM
リン酸カリウム(pH7.6)、 3mM塩化マグネシウム、1mMジ
チオスレイトール）を1ml添加し菌体を懸濁した。次
に、菌体を超音波破砕後、遠心分離（15000rpm、30分）
し、可溶性画分を酵素標品とした。
カザミノ酸-グルコース培地（M9-CA-Glc培地）で、37℃
にて培養し、約２時間後に、Ptrpからの転写の誘導剤で
あるインドールアクリル酸(IAA)を終濃度25μg/mlにな
るように添加し、更に培養を６時間続け、その後、培養
液４mlを集菌した。この菌体へ、懸濁用の緩衝液（50mM
リン酸カリウム(pH7.6)、 3mM塩化マグネシウム、1mMジ
チオスレイトール）を1ml添加し菌体を懸濁した。次
に、菌体を超音波破砕後、遠心分離（15000rpm、30分）
し、可溶性画分を酵素標品とした。
【００７１】上記酵素標品について、上記と同様にHPS
活性を測定した。その結果、JM109/pT-Bsb-yckGF1から
得られた細胞抽出液を用いた場合、対照株JM109/pTTNco
の場合と比較して、有意なHPS活性を検出できた。この
ことから、バチラス ズブチリスのyckGは活性あるHPS
をコードする遺伝子であることが初めて示された。
活性を測定した。その結果、JM109/pT-Bsb-yckGF1から
得られた細胞抽出液を用いた場合、対照株JM109/pTTNco
の場合と比較して、有意なHPS活性を検出できた。この
ことから、バチラス ズブチリスのyckGは活性あるHPS
をコードする遺伝子であることが初めて示された。
【００７２】更に、本発明者らは、上記のJM109/pT-Bsb
-yckGF1から得られた細胞抽出液中には、HPSのみならず
HPIの活性も存在することを、偶然にも発見した。上記
の酵素活性測定の反応液からHPIを除いた反応緩衝液を
用いて、JM109/pT-Bsb-yckGF1の細胞抽出液を添加した
ところ、340nmの吸光度の上昇がみられ、この粗抽出液
中にはHPS並びにHPIが同時に存在していることが判明し
た。このことから、バチラス ズブチリスのyckG及びyc
kFを用いることで、リブロースモノリン酸経路上の主要
酵素HPS及びHPIが同時に生産できることが判明した。
-yckGF1から得られた細胞抽出液中には、HPSのみならず
HPIの活性も存在することを、偶然にも発見した。上記
の酵素活性測定の反応液からHPIを除いた反応緩衝液を
用いて、JM109/pT-Bsb-yckGF1の細胞抽出液を添加した
ところ、340nmの吸光度の上昇がみられ、この粗抽出液
中にはHPS並びにHPIが同時に存在していることが判明し
た。このことから、バチラス ズブチリスのyckG及びyc
kFを用いることで、リブロースモノリン酸経路上の主要
酵素HPS及びHPIが同時に生産できることが判明した。
【００７３】＜４＞yckG遺伝子単独のクローニング 上記と同様に、 DNAプライマ−としてBsYck-G1（配列表
の配列番号１）及びBsYck-G6（配列表の配列番号２）を
用いたPCR法にて増幅したDNA断片を制限酵素ClaI及びBa
mHIにて処理し、それらの切断端を両端にもつyckG断片
を得た。次に、これをAccI及びBamHIで処理したpUC19ベ
クターへ常法に従って組み入れた。これをエシェリヒア
コリJM109株へ形質転換し、JM109/pUC19-yckG1を得
た。
の配列番号１）及びBsYck-G6（配列表の配列番号２）を
用いたPCR法にて増幅したDNA断片を制限酵素ClaI及びBa
mHIにて処理し、それらの切断端を両端にもつyckG断片
を得た。次に、これをAccI及びBamHIで処理したpUC19ベ
クターへ常法に従って組み入れた。これをエシェリヒア
コリJM109株へ形質転換し、JM109/pUC19-yckG1を得
た。
【００７４】＜５＞yckF遺伝子単独のクローニング バチルス ズブチリスの全ゲノム塩基配列の公知のは決
定されているため（Nature, Vol.390, pp249, 1997）、
その塩基配列情報を基に、yckFを含むDNA断片をPCRにて
増幅した。上記と同様に、DNAプライマーとしてBsYck-F
1（配列番号３）、及びBsYck-F2（配列番号４） を用
いたPCR法にて増幅したDNA断片を制限酵素ClaI及びBamH
Iにて処理し、それらの切断端を両端にもつyckF断片を
得た。pT13sNcoを制限酵素ClaI及びBamHIにて切断し、
得られる大きいDNA断片を調製した。これに上記yckF断
片をT4-DNAリガーゼにて連結することで、プラスミドpT
-Bsb-yckF1を構築した。
定されているため（Nature, Vol.390, pp249, 1997）、
その塩基配列情報を基に、yckFを含むDNA断片をPCRにて
増幅した。上記と同様に、DNAプライマーとしてBsYck-F
1（配列番号３）、及びBsYck-F2（配列番号４） を用
いたPCR法にて増幅したDNA断片を制限酵素ClaI及びBamH
Iにて処理し、それらの切断端を両端にもつyckF断片を
得た。pT13sNcoを制限酵素ClaI及びBamHIにて切断し、
得られる大きいDNA断片を調製した。これに上記yckF断
片をT4-DNAリガーゼにて連結することで、プラスミドpT
-Bsb-yckF1を構築した。
【００７５】このpT-Bsb-yckFを用いて、エシェリヒア
コリ JM109株を常法により形質転換し、形質転換体JM
109/ pT-Bsb-yckF1を得た。尚、JM109/ pT-Bsb-yckF1
は、プライベートナンバーAJ13441が付与され、平成１
０年５月８日より、通商産業省工業技術院生命工学工業
技術研究所（郵便番号３０５−８５６６ 日本国茨城県
つくば市東一丁目１番３号）に寄託されており、受託番
号ＦＥＲＭ ＢＰ−６３４５が付与されている。
コリ JM109株を常法により形質転換し、形質転換体JM
109/ pT-Bsb-yckF1を得た。尚、JM109/ pT-Bsb-yckF1
は、プライベートナンバーAJ13441が付与され、平成１
０年５月８日より、通商産業省工業技術院生命工学工業
技術研究所（郵便番号３０５−８５６６ 日本国茨城県
つくば市東一丁目１番３号）に寄託されており、受託番
号ＦＥＲＭ ＢＰ−６３４５が付与されている。
【００７６】＜６＞配列表の説明 配列表に記載した各配列は、下記のとおりである。 配列番号１ yckGの上流側プライマー（BsYck-G1） 配列番号２ yckGの下流側プライマー（BsYck-G6） 配列番号３ yckFの上流側プライマー（BsYck-F1） 配列番号４ yckFの下流側プライマー（BsYck-F2） 配列番号５ yjfVの上流側のプライマー（Ec-yjfV-1） 配列番号６ yjfVの下流側のプライマー（Ec-yjfW-2） 配列番号７ yiaQの上流側のプライマー（Ec-yiaQ-1） 配列番号８ yiaQの下流側のプライマー（Ec-yiaQ-2） 配列番号９ yckG-yckFの塩基配列 配列番号10 YckGのアミノ酸配列 配列番号11 YckFのアミノ酸配列
【００７７】
【発明の効果】本発明方法によれば、ヘキシュロースリ
ン酸シンターゼ活性、又はヘキシュロースリン酸シンタ
ーゼ及びヘキシュロースリン酸イソメラーゼの両酵素活
性が増強された微生物が得られ、これらの酵素を効率よ
く生産することが可能となる。特に、両酵素活性が増強
された微生物を用いると、これらの酵素を同時に生産す
ることが可能となる。このことから、ひいては医療や生
化学的基礎研究に重要で必要となる標識化合物を大量に
安価に提供できることになる。
ン酸シンターゼ活性、又はヘキシュロースリン酸シンタ
ーゼ及びヘキシュロースリン酸イソメラーゼの両酵素活
性が増強された微生物が得られ、これらの酵素を効率よ
く生産することが可能となる。特に、両酵素活性が増強
された微生物を用いると、これらの酵素を同時に生産す
ることが可能となる。このことから、ひいては医療や生
化学的基礎研究に重要で必要となる標識化合物を大量に
安価に提供できることになる。
【００７８】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 味の素株式会社(Ajinomoto Co., Inc.) <120> ヘキシュロースリン酸シンターゼ活性およびヘキシュロースリン酸イソメ ラーゼの製造法 <130> P-5840 <141> 1998-08-04 <160> 10 <170> PatentIn Ver. 2.0
【００７９】 <210> 1 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer BsYck-G1 <400> 1 gagtatcgat aaaatggaat tacagcttgc attagacctc gt 42
【００８０】 <210> 2 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer BsYck-G6 <213> Artificial Sequence <400> 2 aattgtggat cccattgaga atttccgcta cgtattcagt cg 42
【００８１】 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer BsYck-F1 <213> Artificial Sequence <400> 3 aagcatcgat aaaatgaaaa cgactgaata cgtagcggaa 40
【００８２】 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer BsYck-F2 <400> 4 atcttggatc cggttgtgtg atgttattca aggtttgcg 39
【００８３】 <210> 5 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer Ec-yjfV-1 <400> 5 agaacatcga taaaatgtca ttaccgatgt tgcaagtcgc gct 43
【００８４】 <210> 6 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer Ec-yjfW-2 <400> 6 cgccgggatc cccagccccg cctgcgccca tgcggtggca tg 42
【００８５】 <210> 7 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer Ec-yiaQ-1 <400> 7 gagcatcgat tatgagccga ccacttctgc aactggccct cga 43
【００８６】 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer Ec-yiaQ-2 <400> 8 cgacgggatc ccaacacctg tttcgatcat cgcggcaac 39
【００８７】 <210> 9 <211> 1210 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220> <221> CDS <222> (1)..(630) <220> <221> CDS <222> (639)..(1193) <400> 9 atg gaa tta cag ctt gca tta gac ctc gtc aac atc ccg gaa gcc att 48 Met Glu Leu Gln Leu Ala Leu Asp Leu Val Asn Ile Pro Glu Ala Ile 1 5 10 15 gag ctt gtc aaa gag gta gaa caa tac atc gac gta gtt gaa atc gga 96 Glu Leu Val Lys Glu Val Glu Gln Tyr Ile Asp Val Val Glu Ile Gly 20 25 30 aca ccg gtc gtc atc aat gaa ggc cta aga gcc gtt aaa gaa ata aaa 144 Thr Pro Val Val Ile Asn Glu Gly Leu Arg Ala Val Lys Glu Ile Lys 35 40 45 gaa gca ttt cct caa ttg aag gtt ctt gca gac ctg aaa atc atg gat 192 Glu Ala Phe Pro Gln Leu Lys Val Leu Ala Asp Leu Lys Ile Met Asp 50 55 60 gcc gga ggc tac gaa att atg aaa gcg tcg gaa gca ggc gct gac atc 240 Ala Gly Gly Tyr Glu Ile Met Lys Ala Ser Glu Ala Gly Ala Asp Ile 65 70 75 80 atc acc gtt tta ggg gct aca gac gat gca acg att aaa ggc gca gta 288 Ile Thr Val Leu Gly Ala Thr Asp Asp Ala Thr Ile Lys Gly Ala Val 85 90 95 gaa gaa gcc aaa aaa caa aag aag aaa atc tta gtg gac atg att aac 336 Glu Glu Ala Lys Lys Gln Lys Lys Lys Ile Leu Val Asp Met Ile Asn 100 105 110 gtg aaa gat atc gaa tcc cgt gcg aaa gaa att gac gca ctc ggt gtt 384 Val Lys Asp Ile Glu Ser Arg Ala Lys Glu Ile Asp Ala Leu Gly Val 115 120 125 gac tac atc tgc gtc cac act ggc tat gat ctt caa gca gag ggc aaa 432 Asp Tyr Ile Cys Val His Thr Gly Tyr Asp Leu Gln Ala Glu Gly Lys 130 135 140 aac tct ttc gaa gaa tta acg aca atc aaa aat acc gta aaa aac gca 480 Asn Ser Phe Glu Glu Leu Thr Thr Ile Lys Asn Thr Val Lys Asn Ala 145 150 155 160 aaa acc gca atc gcg ggc ggc atc aaa ctt gat aca ctg cca gaa gtg 528 Lys Thr Ala Ile Ala Gly Gly Ile Lys Leu Asp Thr Leu Pro Glu Val 165 170 175 atc cag caa aag cct gac ctt gtc att gtc ggg ggc gga att aca agc 576 Ile Gln Gln Lys Pro Asp Leu Val Ile Val Gly Gly Gly Ile Thr Ser 180 185 190 gca gct gat aag gcg gaa aca gct tca aaa atg aag cag ctg att gtc 624 Ala Ala Asp Lys Ala Glu Thr Ala Ser Lys Met Lys Gln Leu Ile Val 195 200 205 caa gga taactccg atg aaa acg act gaa tac gta gcg gaa att ctc aat 674 Gln Gly Met Lys Thr Thr Glu Tyr Val Ala Glu Ile Leu Asn 210 1 5 10 gag tta cac aat tca gca gct tat att tct aat gaa gaa gct gac cag 722 Glu Leu His Asn Ser Ala Ala Tyr Ile Ser Asn Glu Glu Ala Asp Gln 15 20 25 ctt gcc gat cac att ctt tca tcc cac caa att ttc acc gcg ggt gcg 770 Leu Ala Asp His Ile Leu Ser Ser His Gln Ile Phe Thr Ala Gly Ala 30 35 40 ggg cgg tct ggc ctg atg gca aaa tcc ttc gcg atg aga ctg atg cac 818 Gly Arg Ser Gly Leu Met Ala Lys Ser Phe Ala Met Arg Leu Met His 45 50 55 60 atg ggc ttc aac gcc cat ata gta ggt gag att ctc act ccg ccg ctc 866 Met Gly Phe Asn Ala His Ile Val Gly Glu Ile Leu Thr Pro Pro Leu 65 70 75 gcc gaa gga gat cta gtt att atc ggc tca gga tca ggc gag aca aag 914 Ala Glu Gly Asp Leu Val Ile Ile Gly Ser Gly Ser Gly Glu Thr Lys 80 85 90 agc ttg att cat acc gca gca aaa gca aaa agc tta cac gga att gtt 962 Ser Leu Ile His Thr Ala Ala Lys Ala Lys Ser Leu His Gly Ile Val 95 100 105 gcc gct tta acc atc aat ccg gaa tca agc atc gga aaa caa gcg gac 1010 Ala Ala Leu Thr Ile Asn Pro Glu Ser Ser Ile Gly Lys Gln Ala Asp 110 115 120 ctc atc atc aga atg cct ggt tcc cct aaa gac cag tct aac gga agc 1058 Leu Ile Ile Arg Met Pro Gly Ser Pro Lys Asp Gln Ser Asn Gly Ser 125 130 135 140 tat aaa acc att cag cca atg gga tca tta ttt gaa caa act ttg ctg 1106 Tyr Lys Thr Ile Gln Pro Met Gly Ser Leu Phe Glu Gln Thr Leu Leu 145 150 155 ctc ttc tat gat gca gtg att tta aaa ctc atg gag aaa aaa ggt ctc 1154 Leu Phe Tyr Asp Ala Val Ile Leu Lys Leu Met Glu Lys Lys Gly Leu 160 165 170 gat tct gaa act atg ttc act cac cac gca aac ctt gaa tagcatcaca 1203 Asp Ser Glu Thr Met Phe Thr His His Ala Asn Leu Glu 175 180 185 caaccgg 1210
【００８８】 <210> 10 <211> 210 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 10 Met Glu Leu Gln Leu Ala Leu Asp Leu Val Asn Ile Pro Glu Ala Ile 1 5 10 15 Glu Leu Val Lys Glu Val Glu Gln Tyr Ile Asp Val Val Glu Ile Gly 20 25 30 Thr Pro Val Val Ile Asn Glu Gly Leu Arg Ala Val Lys Glu Ile Lys 35 40 45 Glu Ala Phe Pro Gln Leu Lys Val Leu Ala Asp Leu Lys Ile Met Asp 50 55 60 Ala Gly Gly Tyr Glu Ile Met Lys Ala Ser Glu Ala Gly Ala Asp Ile 65 70 75 80 Ile Thr Val Leu Gly Ala Thr Asp Asp Ala Thr Ile Lys Gly Ala Val 85 90 95 Glu Glu Ala Lys Lys Gln Lys Lys Lys Ile Leu Val Asp Met Ile Asn 100 105 110 Val Lys Asp Ile Glu Ser Arg Ala Lys Glu Ile Asp Ala Leu Gly Val 115 120 125 Asp Tyr Ile Cys Val His Thr Gly Tyr Asp Leu Gln Ala Glu Gly Lys 130 135 140 Asn Ser Phe Glu Glu Leu Thr Thr Ile Lys Asn Thr Val Lys Asn Ala 145 150 155 160 Lys Thr Ala Ile Ala Gly Gly Ile Lys Leu Asp Thr Leu Pro Glu Val 165 170 175 Ile Gln Gln Lys Pro Asp Leu Val Ile Val Gly Gly Gly Ile Thr Ser 180 185 190 Ala Ala Asp Lys Ala Glu Thr Ala Ser Lys Met Lys Gln Leu Ile Val 195 200 205 Gln Gly 210
【００８９】 <210> 11 <211> 185 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 11 Met Lys Thr Thr Glu Tyr Val Ala Glu Ile Leu Asn Glu Leu His Asn 1 5 10 15 Ser Ala Ala Tyr Ile Ser Asn Glu Glu Ala Asp Gln Leu Ala Asp His 20 25 30 Ile Leu Ser Ser His Gln Ile Phe Thr Ala Gly Ala Gly Arg Ser Gly 35 40 45 Leu Met Ala Lys Ser Phe Ala Met Arg Leu Met His Met Gly Phe Asn 50 55 60 Ala His Ile Val Gly Glu Ile Leu Thr Pro Pro Leu Ala Glu Gly Asp 65 70 75 80 Leu Val Ile Ile Gly Ser Gly Ser Gly Glu Thr Lys Ser Leu Ile His 85 90 95 Thr Ala Ala Lys Ala Lys Ser Leu His Gly Ile Val Ala Ala Leu Thr 100 105 110 Ile Asn Pro Glu Ser Ser Ile Gly Lys Gln Ala Asp Leu Ile Ile Arg 115 120 125 Met Pro Gly Ser Pro Lys Asp Gln Ser Asn Gly Ser Tyr Lys Thr Ile 130 135 140 Gln Pro Met Gly Ser Leu Phe Glu Gln Thr Leu Leu Leu Phe Tyr Asp 145 150 155 160 Ala Val Ile Leu Lys Leu Met Glu Lys Lys Gly Leu Asp Ser Glu Thr 165 170 175 Met Phe Thr His His Ala Asn Leu Glu 180 185
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 杉本 愼一 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社発酵技術研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA07 CA03 DA06 EA04 GA11 GA19 HA01 HA14 4B050 CC03 DD02 LL03 4B065 AA19Y AA26X AA26Y AB01 AC14 BB13 BD01 BD15 CA27 CA46
Claims (10)
- 【請求項１】 下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質
であるヘキシュロースリン酸シンターゼをコードするＤ
ＮＡ断片。 （Ａ）配列表の配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有
するタンパク質。 （Ｂ）配列表の配列番号１０に記載のアミノ酸配列にお
いて、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、
付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ヘ
キシュロースリン酸シンターゼ活性を有するタンパク
質。 - 【請求項２】 下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであ
る請求項１記載のＤＮＡ断片。 （ａ）配列表の配列番号９に示す塩基配列のうち、少な
くとも塩基番号１〜６３０からなる塩基配列を有するＤ
ＮＡ。 （ｂ）配列表の配列番号９に示す塩基配列のうち、少な
くとも塩基番号１〜６３０からなる塩基配列とストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヘキシュ
ロースリン酸シンターゼ活性を有するタンパク質をコー
ドするバチルス属細菌由来のＤＮＡ。 - 【請求項３】 請求項１記載のＤＮＡと、下記（Ｃ）又
は（Ｄ）に示すタンパク質であるヘキシュロースリン酸
イソメラーゼをコードするＤＮＡとを含むＤＮＡ断片。 （Ｃ）配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有
するタンパク質。 （Ｄ）配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列にお
いて、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、
付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ヘ
キシュロースリン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク
質。 - 【請求項４】 前記ヘキシュロースリン酸イソメラーゼ
をコードするＤＮＡが、下記（ｃ）又は（ｄ）に示すＤ
ＮＡである請求項３記載のＤＮＡ断片。 （ｃ）配列表の配列番号９に記載の塩基配列に示す塩基
配列のうち、少なくとも塩基番号６３９〜１１９３から
なる塩基配列を含むＤＮＡ。 （ｄ）配列表の配列番号９に記載の塩基配列に示す塩基
配列のうち、少なくとも塩基番号６３９〜１１９３から
なる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズし、かつ、ヘキシュロースリン酸イソメラーゼ活性
を有するタンパク質をコードするバチルス属細菌由来の
ＤＮＡ。 - 【請求項５】 配列表の配列番号９に示す塩基配列を有
する請求項３記載のＤＮＡ断片。 - 【請求項６】 請求項１記載のＤＮＡが導入されて形質
転換された微生物。 - 【請求項７】 ヘキシュロースリン酸シンターゼ活性お
よびヘキシュロースリン酸イソメラーゼ活性が増強され
た微生物。 - 【請求項８】 請求項３記載のＤＮＡが導入されたこと
によりヘキシュロースリン酸シンターゼ活性およびヘキ
シュロースリン酸イソメラーゼ活性が増強されたことを
特徴とする請求項７記載の微生物。 - 【請求項９】 請求項６記載の微生物を培地で培養し、
ヘキシュロースリン酸シンターゼを培養物中に生成蓄積
させることを特徴とするヘキシュロースリン酸シンター
ゼの製造法。 - 【請求項１０】 請求項７記載の細胞を培地で培養し、
ヘキシュロースリン酸シンターゼおよびヘキシュロース
リン酸イソメラーゼを培養物中に生成蓄積させることを
特徴とするヘキシュロースリン酸シンターゼおよびヘキ
シュロースリン酸イソメラーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22088198A JP3945031B2 (ja) | 1998-08-04 | 1998-08-04 | ヘキシュロースリン酸シンターゼおよびヘキシュロースリン酸イソメラーゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22088198A JP3945031B2 (ja) | 1998-08-04 | 1998-08-04 | ヘキシュロースリン酸シンターゼおよびヘキシュロースリン酸イソメラーゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000041683A true JP2000041683A (ja) | 2000-02-15 |
| JP3945031B2 JP3945031B2 (ja) | 2007-07-18 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22088198A Expired - Fee Related JP3945031B2 (ja) | 1998-08-04 | 1998-08-04 | ヘキシュロースリン酸シンターゼおよびヘキシュロースリン酸イソメラーゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3945031B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1170371A1 (en) * | 2000-07-07 | 2002-01-09 | Ajinomoto Co., Ltd. | Phosphohexuloisomerase and gene therefor |
| FR2826021A1 (fr) * | 2001-06-13 | 2002-12-20 | Centre Nat Rech Scient | Procede de detection et d'identification de la presence de matieres biologiques provenant de poissons, et oligonucleotides pour sa mise en oeuvre |
| FR2858631A1 (fr) * | 2004-09-24 | 2005-02-11 | Centre Nat Rech Scient | Procede de detection et d'identification de la presence de matieres biologiques provenant de poissons, et oligonucleotides pour sa mise en oeuvre |
-
1998
- 1998-08-04 JP JP22088198A patent/JP3945031B2/ja not_active Expired - Fee Related
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