JPH022364A - 細胞膜結合型アルデヒド脱水素酸素の構造遺伝子、これを含むプラスミド、形質転換した酢酸菌及び酢酸発酵法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はアセトバクター属の微生物に由来する細胞膜結
合型アルデヒド脱水素酵素の構造遺伝子、これを含むプ
ラスミドおよびその利用に関するものである。

アセトバクター属に属する微生物の生産する′細胞膜結
合型アルデヒド脱水素酵素は、ピロロキノリンキノンを
補欠分子族とし、アルデヒドを対応する酸に酸化する酵
素である。該酵素は、酢酸発酵でのエタノールから酢酸
を生成する酸化発酵に関与しており、また、アルデヒド
の定量や食品の不快臭の原因物質であるアルデヒドの酸
化分解に利用され、産業上有用な酵素である。

また、該酵素を菌体内に多量産生する酢酸菌は酢酸発酵
の速度が速くなり、酢酸の生産効率を高めることができ
るので、本発明は酢酸発酵界に益するところ大なるもの
がある。

〔従来の技術及び問題点〕

従来、細胞膜結合型アルデヒド脱水素酵素は。

アセトバクター属やグルコノバクタ−属の微生物を培養
し、培養菌体そのまま又は菌体から抽出精製され利用さ
れてきた（アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカ
ル・ケミストリー、第４４巻。

第５０３頁、　１９８０年、第４５巻、第１８８９頁、
　１９８１年）。

しかし、該酵素は、菌体中の含量が低く、また不安定な
酵素であるため、抽出精製の操作中に失活してしまい、
十分な収率で精製できず、多量に調製することが困難で
あった。一方、変異処理により、菌体中の酵素含量の高
くなった変異株を取得することも考えられるが、いまだ
十分量の酵素含量に達しているとの報告はない。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、上述した問題点を解決するため、遺伝子
組み換え技術により菌体中の酵素含量を高める方法を鋭
意検討した結果、細胞膜結合型アルデヒド脱水素酵素の
構造遺伝子を単離し、プラスミドに含ませることに成功
した。さらに単離した遺伝子を含むプラスミドを用いる
ことにより、該酵素の菌体内含量を高め、酢酸発酵の効
率を高めることができることを見出し、本発明を完成す
るに至った。

すなわち、本発明はアセトバクター属の微生物に由来し
、分子サイズが約３．６キロベースである細胞膜結合型
アルデヒド脱水素酵素の構造遺伝子を含むプラスミドお
よび該プラスミドによって形質転換されたアセトバクタ
ー属またはグルコノバクタ−属の微生物に関し、更には
該微生物を用いて酢酸発酵する方法に関するものである
。

本発明における細胞膜結合型アルデヒド脱水素酵素（以
下ＡＬＤＨと略）は特開昭６３−１２２７９に記載され
る新規なアルデヒドデヒドロゲナーゼ複合体で、分子量
が約７５，０００の蛋白質をさし、アルデヒドデヒドロ
ゲナーゼ複合体の活性の本体を−なす酵素である。該酵
素は、アセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４
（ＦＥＲＭ　ＢＰ−４９１）に代表される一群のアセト
バクター属の微生物によって生産される。該酵素の構造
遺伝子を含む遺伝子断片は、該酵素を生産するアセトバ
クター属の微生物の保有する全ＤＮＡから単離すること
ができる。全ＤＮＡは１例えば特開昭６０−９４８９に
開示された方法により、調製することができる。この全
ＤＮＡから、たとえば、実施例１に示されているような
方法、すなわち該酵素に対する抗体を調製し、抗原抗体
反応を利用して目的の遺伝子をもつクローンを選択する
方法などにより、Ａ　Ｌ　Ｄ　Ｉ＋構造遺伝子を含む遺
伝子断片を単層することができる。

該酵素に対する抗体は、特開昭６３−１２２７９に開示
された方法により、精製されたアルデヒドデヒドロゲナ
ーゼ複合体をＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法により、２つのサブユニットに分離後、分子ｉ７５，
０００に相当する蛋白質をゲルから抽出し、抗原として
用いて作成することができる。具体的には、たとえば”
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”第７３
巻、第４６頁（１９８１年）の方法に従えば、抗ＡＬＤ
Ｈ抗体を得ることができる。最初の免疫から約２週間後
、２回目の免疫をおこなうことにより、１力月ないし１
力月半でＡＬ叶に特異的な抗体の生成がみられる。抗体
は血清を硫安分画などにより粗精製するか、さらにイオ
ン交換グロマトグラフィーにより精製度の高い標品を調
製できるが、遺伝子の単離に用いる場合には、血清を適
宜希釈して使用することも可能である。

一方、全ＤＮＡを適当な制限酵素で切断したものと発現
ベクターを全ＤＮＡと連結可能な制限酵素で切断したも
のとをＴ４　ＤＮＡリガーゼにより連結し、その連結物
を大腸菌宿主に形質転換する。この場合の発現ベクター
としては、たとえばＰＯＣｌ２のような大腸菌の　β−
ガラクトシダーゼ遺伝子のオペレーター、プロモーター
をもつベクターのプロモーターの下流に融合蛋白として
生成させ、イソプロピルベーターＤ−チオガラクトピラ
ノシドにより、遺伝子の誘導発現が可能なベクターがあ
げられる。

大腸菌の形質転換は常法にしたがえばよいが、なるべく
遺伝子導入効率の高い形質転換法（たとえば、“ＤＮＡ
　ｃｌｏｎｉｎｇ”第１巻、第１０９頁、ＩＲＬＰｒｅ
ｓｓ（１９８５）に記載の方法）で形質転換した方が望
ましい。得られた形質転換株の中から、目的とする遺伝
子をもつ株の検出は、たとえば、ジーン、第３７巻、第
２６７頁（１９８５年）の方法に準じておこなえばよい
。すなわち、得られた形質転換株の菌体破砕物を抗体と
反応させ、特異的な反応性を示す株を検出することによ
って可能である。このようにして得られた抗体と反応性
を示す株は、目的とする遺伝子全長を有する場合もある
が、遺伝子の一部しか有していない場合もある。

一部の遺伝子しか有していない場合には、さらに得られ
ている遺伝子をプローブとしてサザン・ハイブリダイゼ
ーションなどの手法により、プローブと相同性を示す断
片を単離することによって遺伝子全長を得ることができ
る。

このようにして単離したＡＬＤＨの構造遺伝子を含む遺
伝子断片を用いて、ＡＬＤＨを生産するためには、通常
遺伝子断片と宿主内で機能するプロモーター活性をもつ
遺伝子とを発現可能な形で連結させる必要がある。アセ
トバクター属やグルコノバクタ−属の微生物内でＡＬＤ
Ｈ蛋白を生成させるために用いるプロモーターとしては
、Ａ　Ｌ　Ｄ　Ｈ遺伝子本来のプロモーターも使用でき
るが、酢酸菌由来の他のプロモーター活性をもつ遺伝子
や酢酸菌で発現可能な大腸菌のプロモーターも使用でき
る。大腸菌プロモーターとしては、大腸菌プラスミドρ
ＢＲ３２２のアンピシリン耐性遺伝子や大腸菌プラスミ
ドρＡＣＹＣ１７７のカナマイシン耐性遺伝子、大腸菌
プラスミドρＡＣＹＣ１８４のクロラムフェニコール耐
性遺伝子、大腸菌の　β−ガラクトシダーゼ遺伝子のプ
ロモーターなどが使用できる。過剰量にＡＬＤＩ（が生
産されて宿主の生育等に影響を及ぼす場合には、遺伝子
の発現量をコントロールするため、適当なプロモーター
を選択する必要がある。また１発現させた場合、本来の
ＡＬ叶の分子量と大きさの異なる蛋白の生成が見られる
場合がある。これは、ＡＬＤＨ蛋白と他の蛋白が融合し
た融合蛋白の形で宿主内で生産されているためであるが
、酵素活性が発現できるような形で融合蛋白が生成して
いれば、なんら差しつかえない。

また、酢酸菌内にＡＬＤＨの構造遺伝子を含む遺伝子断
片を保持させるためのベクターとしては、たとえば、特
開昭６０−９４８８に開示されているｐＴＡ５００１（
Ａ）、　ｐＴＡ５００１　（Ｂ）や酢酸菌に導入可能な
広宿主域ベクターＲＰ４：：Ｍｕ、　ＲＰ４．　ｐＲＫ
２０１３．　Ｒ３ＦＩＯＩＯなどが利用できる。

以上のようにして、ＡＬＤＨの構造遺伝子を含むプラス
ミドを単離することができ、形質転換した後、遺伝子を
発現することにより、ＡＬＤＨ蛋白を菌体内に著量生産
させることができる。

ＡＬＤＨを生産させる宿主として、大腸菌、枯草菌など
遺伝子組み換え技術が確立されている微生物を用いるこ
ともできるが、Ａ　Ｌ　Ｄ　１１をもともと生産する能
力を有する酢酸菌、すなわちアセトバクター属およびタ
ルコノバクター属の微生物を用いる方が有利である。

ＡＬＤＨは、ＰＱＱを補欠分子族としてもっており、活
性型の酵素を生産させるためには、培地等にＰＱＱを加
え、ＡＬＤＨ蛋白を生産させることもできるが、宿主が
ＰＱＱ合成能を有している方が有利である。アグリカル
チュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー、第
４８巻、第５６１頁（１９８４年）に記載のごとく、大
腸菌や枯草菌のＰＱＱ合成能は低く、酢酸菌の合成能力
が高いことが明らかになっている。また、酵素反応を効
率的に進めるためには、補欠分子族であるＰＱＱの酸化
型と還元型のリサイクリングがうまく進行することが必
要で、酸化反応により生成する電子が、電子伝達系と共
役して効率よくリサイクリングしている酢酸菌を宿主と
することが有利である。

又、酢酸発酵においてＡＬＤＨは、アセトアルデヒドを
酢酸に酸化する反応を担っている。このため。

酢酸菌体内のＡＬＤＨの量を高めることにより、酢酸発
酵の効率化が期待できる。実施例３に示すごとく、酢酸
菌の形質転換株を用いることによりＡＬＤＨ活性を高め
ることにより、酢酸発酵の効率化ができる。

〔発明の効果〕

本発明を用いれば、従来、菌の生産性が低いため精震単
離が困難であったＡＬ叶を容易に調製することができ、
定量用酵素や脱臭用酵素としての途を開くことができる
。また、該酵素の含量の高まった酢酸菌を用いることに
より、ＡＬＤＨの効率的な生産のみならず、酢酸発酵の
効率化が可能となる。

（実施例１） 〔抗ＡＬＤＨ抗体の調製法〕 アセトバクター・アルトアセチゲネスＭｌｌ−２４（Ｆ
ＥＲＭ　ＢＰ−４９１）株をグルコース３％、エタノー
ル４％（Ｖ／Ｖ）、酢酸６％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス（
大五栄養化学株式会社製）０．５％、ポリペプトン（大
五栄養化学株式会社、ｉ）０．２％を加えた培地で３０
℃にて振どう培養した。培養後、遠心分離により菌体を
得た後、常法（特開昭６３−１２２７９に開示された方
法）により、ＡＬ叶複合体４ｍｇを得た。この複合体を
５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、分子
量約７５．０００の蛋白質と分子量約２０，０００の蛋
白質とに分離後、７５，０００の位置にある蛋白質をゲ
ルから溶出させ、ＡＬＤＩＩ標品とした。

得られたＡＬＤＨ００１ｍｇを完全フロイントのアジュ
バントと共にウサギの皮下に注射した。約２週間後、さ
らに０．１ｍｇのＡ　Ｌ　Ｄ　ＩＩ標品を注射した。最
初の注射から１力月後、ウサギの血液を耳から抜きとり
、遠心分離し得た血清とＡ　Ｌ　Ｄ　Ｈとの反応性を見
たところ、沈降反応が認められ、また、５Ｏ５−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動後、ウェスタン法にてその特
異性を調へたところ、Ａ　Ｌ　Ｄ　Ｈ以外の蛋白との反
応性はほとんど見られず、特異性の高い抗ＡＬＤＨ抗体
が生産されていた。

（ＡＬＤＩＩ構造遺伝子の一部の単離〕上記と同様な方
法で培養して得たアセトバクター・アルトアセチゲネス
ＭＨ−２４の菌体から、常法（特開昭６０−９４８９に
開示された方法）により、全ＤＮＡを調製した。調製し
た全ＤＮＡを制限酵素Ｐｓｔ　Ｉ　（宝酒造株式会社製
）で切断後、同じく制限酵素Ｐｓｔ　１で切断した後、
細菌性アルカリホスファターゼ（宝酒造株式会社製）で
脱リン酸化した大腸菌ベクターｐＵｃ１８（宝酒造株式
会社製）とＴ４　ＤＮＡリガーゼ（宝酒造株式会社製）
を用いて連結した。連結反応液を大腸菌宿主Ｅ、ｃｏｌ
ｉ　ＪＭ　１０９にＨａｎａｈａｎの方法（“ＤＮＡ　
ｃｌｏｎｉｎｇ、”第１巻、第１０９頁、ＩＲＬ　Ｐｒ
ｅｓｓ（１９８５年））で形質転換した後、形質転換株
をアン　ピシリン３０μｇ／ｍＱの濃度で含むＬＢ寒天
培地（“Ａ　　Ｍａｎｕａｔ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃ
　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、”第２０１頁、　　Ｃｏｌ
ｄＳｐｒｊｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
、　１９８０年）で選択した。

この時の組み換え体の出現頻度は、約６０％であった。

　Ｗａｎｇら　（Ｇｅｎｅ＋第３７巻、第２６７頁、　
（１９８５年））の方法に準じて、得られた形質転換株
約５，０００株について抗ＡＬＤＩ＋抗体との反応性を
みた。まず、ＬＢ寒天培地上に生育させた形質転換株を
ニトロセルロースフィルターにレプリカし、３７℃で３
〜５時間、フィルター上でコロニーを生育させた後、１
０ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラク
トピラノシド）水溶液で湿めらせρＵＣ１ｇのもつｌａ
ｃのプロモーターを誘導し、宿主大腸菌に融合蛋白を著
量生産させるようにした。ＴＰＴＧによる誘導を３７°
Ｃで３〜５時間おこなった後、フィルターをクロロホル
ムの蒸気に１０分間さらし、コロニーを弱く溶解させた
後、５ｍＭ　ＭｇＣ１，，５μｇ／ｎ＋Ｑ　ＤＮａｓｅ
、　０．１ｍｇ／ｍ（ｌのリゾチームおよび０．５％の
ＢＳＡを含むバッファ　−Ａ　（５０ｍＭ　トリス−塩
酸、　１５０ｍＭ　ＮａＣ１，ｐ＋１７．５）中で一晩
放置し、コロニーを完全に溶解させ、ニトロセルロース
フィルターに菌体蛋白を吸着させ、同時にブロッキング
反応をおこなった。反応終了後、バッファーＡで３回フ
ィルターを洗浄し、上記方法で調製した抗ＡＬ叶抗体を
１　、０００倍希釈しくバッファーＡで希釈）、希釈液
中で室温で５時間反応させた。　抗体との反応終了後、
フィルターをバッファーＡで５回洗浄した後、抗原抗体
反応の有無を検出するため、２次抗体として、パーオキ
シダーゼ標識した抗つサギＩｇＧ抗体（バイオランド社
製）の２　、０００倍希釈液をフィルターに室温で１時
間反応させた。反応後、バッファーＡで３回フィルター
を洗浄し、発色剤として過酸化水素と４−クロロ−１−
ナフトールを含む反応液にフィルターを浸し、発色をみ
た。アンピシリン耐性株約５゜０００株から反応性を示
すコロニーが２つ得られた。

これら２株のプラスミドをアルカリ溶菌法（Ｎｕｃｌｅ
ｊ、ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、第７巻、第１５１３頁、
　（１９７９年））で抽出し、制限酵素で切断し解析し
たところ、２株ともベクターのｐＵｃ１８のＰｓｔ　１
部位に約２．０キロベースのＤＮＡ断片を有していた。

また、形質転換株をＬＢ培地にアンピシリン３０　ｐ　
ｇ／ｍＱ、ＩＰＴＧｌｏｍＭを加えた液体培地でｌＩＩ
’ｉ！３７°Ｃで培養して得られた菌体を超音波破砕し
、得られた菌体破砕液を上記した５Ｏ５−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動に供し、ウェスタン法（Ａｎａｌ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、第１１２巻、第１９５頁（１９８
１年））で抗Ａ　Ｌ　Ｄ　Ｈ抗体と反応する蛋白質の分
子量を調べたところ、約４万の分子量の蛋白が抗体と反
応した。ＡＬ叶の分子量は７５，０００であり１分離し
た遺伝子は、Ａ　Ｌ　Ｄ　ｉ蛋白の約半分をコードする
遺伝子であることがわかった。

（ＡＬＤＩ＋構造遺伝子全長を含む遺伝子断片の単離〕
上記の方法で得たＡＬ叶の構造遺伝子の一部を含む遺伝
子（大きさ約２．０キロ・ベース）をプローブとしてサ
ザン・ハイブリダイゼーション法（Ｊ、Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、第９８巻、第５０３頁（１９７５年））によ
り、以下のようにして全長を含む遺伝子を単離した。ま
ず、上記した方法でアセトバクター・アルトアセチゲネ
スＭｌｌ−２４の全ＤＮＡを調製し、制限酵素Ｂａｍ　
ＨＩで部分分解した。この時の部分分解は、分解により
生成するＤＮＡ断片が、主に２０〜３０キロベースの大
きさとなるような条件でおこなった。一方、大腸菌コス
ミドベクターｐＨｃ７９　（Ｇｅｎｅ、第１１巻、第２
９１頁。

（１９８０年））をＩ３ａｍ旧で切断し、全ＤＮＡの部
分分解物とＴ４　ＤＮＡリガーゼにより連結した。次に
連結物をイン・ビトロ・パッケージング・キット（プロ
メガバイオチック社製）を用いてパッケージングした。

大腸菌宿主Ｅ、ｃｏｌｉ　ＩＩＢＩＯＩをＬＢ培地にマ
ルトース０．２％　を力「えた液体培地で３０℃で１晩
培養し、遠心分に後、ＬＢ培地にＭｇ　Ｃ１２１０ｍＭ
を含む培地に菌体を懸濁した。この菌体懸濁液０．５ｍ
Ｑにパッケージング反応物０．５ｍＱを加え、軽く混合
し、室温で２０分間静置した。その後、この混合物に４
ｍＱのＬＢ培地を加え、３７℃で１時間振どう培養し、
培養液をアンピシリン３０μｇ／ＩＩ＋１２の濃度で含
むＬＢ寒天培地に塗抹した。３７℃で１晩培養し生育し
てきた形質転換株のうち、約１，０００株について、サ
ザンハイプリダイゼーション法でプローブとハイブリダ
イズするプラスミドを有する形質転換株を調べた。

１　、０００株のうち、３株がプローブとハイブリダイ
ズするＤＮＡを含んでおり、そのうちの１株から、ＡＬ
叶の構造遺伝子全長を含む断片のクローン化をおこなっ
た。サザンハイプリダイゼーションにより、約１０キロ
ベースのＥｃｏＲＩで切断される遺伝子断片にプローブ
ＤＮＡ部分が存在していることから、まず約１０キロベ
ースのＥｃｏＲＩで切り出される断片をｐｌＪｃ１８　
をベクターとして単離した。さらに、このＥＣ０ＲＩで
切り出される断片の制限酵素解析をおこない、ＡｖａＩ
で部分分解することにより。

ＡＬＤＨ構造遺伝子の全長を含む断片を単離した。単に
した遺伝子断片は大きさ約３．６キロベースで、第１図
に示すような制限酵素地図であった。この遺伝子断片は
、大腸菌ベクターｐＵｃ１８のＥｃｏＲＩ−Ａｖａ１部
位に組みこまれ、大腸菌宿主Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９
に形質転換され、　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＡＬ２５菌株名で微
工研にＦＥＲＭ　ＢＰ−２２８８（ＦＥＲＭ　Ｐ−９９
１１）として寄託されている。第１図に示す遺伝子断片
をｐＵｃ１８のＡｖａ　Ｉ部位にｌａｃブローモーター
の制御がかかる方向に組みこみ、　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭ
１０９に上記した方法で形質転換した。形質転換株をＬ
Ｂ培地にアンピシリン３０μｇ／ｍｎ、　ＩＰＴＧＩＯ
ｍＭを含む液体培地で３７℃１晩培養した菌体をウェス
タン法にて解析したところ、分子量約７９，０００の抗
ＡＬＤＨ抗体と特異的に反応する蛋白を著址生産してい
た。ＩＰＴＧを加えないと特異的な蛋白の生産はみとめ
られなかったことから、形質転換株では、ｌａｃプロモ
ーターの制御下でＡ　Ｌ　Ｄ　Ｈ蛋白が合成されている
と認められる。又ＡＬＤ）Ｉの本来の分子量よりも生産
された蛋白の分子量が大きいのは、ＡＬＤＨ蛋白がｌａ
ｃプロモーターのすぐ後にある遺伝子の一部に由来する
蛋白との融合蛋白の形で生産されているためと考えられ
る。大腸菌形質転換株のＡＬＤＨの酵素活性を酢酸菌の
方法（アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・
ケミストリー、第４４巻、第５０３頁、　（１９８０年
））に準じて測定したが、活性は検出できなかった。

（実施例２） （ＡＬＤＨ構造遺伝子を含む遺伝子断片の酢酸菌宿主へ
の形質転換〕 実施例１で単離した第１図で示すＡＬＤＨの構造遺伝子
を含む遺伝子断片をｐＵｃ１８のＡｖａＩ部位に、Ａ　
Ｌ　Ｄ　Ｈ蛋白が合成されるような方向で組みこんだ。

次に、アセトバクター・アセチ・サブスピーシズ・キシ
リナムＩＦ０３２８８の有するプラスミドのうち、分子
サイズ約２．１キロベースのプラスミドを調製し制限酵
素ＡｃｃＩで切断し、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼで切断
末端を平滑化した。一方、ｐＵｃ１８に第１図で示され
る遺伝子断片を組みこんだ組み換えプラスミドを制限酵
素５ａｌｌで切断し、同じ＜Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで
切断末端を平滑化した。両者をＴ４ＤＮＡリガーゼによ
り、連結し組み換え体を得た後、アセトバクター・アセ
チＮα１１０２３（ＦＥＲＢＰ−２２８７（ＦＥＲＭ　
Ｐ−７１２２））からアグリカルチュラル・アンド・バ
イオロジカル・ケミストリー第４９巻、第２４８５頁（
１９８５年）に開示された方法により得られたＡ　Ｌ　
Ｄ　１１活性の低下した変異株１０−８１２株に、アグ
リカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリ
ー第４９巻、第２０９１頁、　（１９８５年）に記載の
方法にしたがい、形質転換した。形質転換株は、アンピ
シリン５０μｇ／ｎ＋Ｑ　を含むＹＰＧ寒天培地（グル
コース３％、酵母エキス０．５％、ポリペプトン０．２
％、寒天２％、ｐＨ６，５）で選択した。選択培地に生
育したアンピシリン耐性株のプラスミドをアグリカルチ
ュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリ−５第４
９巻。

第２０８３頁、（１９８５年）の方法に準じて調べた。

導入されたプラスミドの大きさは約８．３キロベースで
、制限酵素解析より、ρＬＩＣ１８と第１図に示された
遺伝子断片およびアセトバクター・アセチ・サブスピー
シズ・キシリナムＩＦ０３２８８の約２．１キロベース
の大きさのプラスミドの３者のキメラプラスミドである
ことを確認した。

〔酢酸菌形質転換株の性質〕

上記で得られたアセトバクター・アセチの形質転換株に
ついて、ウェスタン法でＡＬ叶蛋白の生成量を調べた。

まず、　ＹＰＧ液体培地（上記のＹＰＧ寒天培地から寒
天を除いた組成の培地）に３０μｇ／ｒｎＱの濃度でア
ンピシリンを加え、３０℃で３６時間振とぅＭＷした。

＠養液、集菌し、マクイルバインバッファー（ｐＨ６，
０）に菌体を懸濁し、フレンチ・プレスで菌体を破砕し
た。破砕液から、未破砕菌体を遠心分離（５，００Ｏｒ
ｐｍ、　１０分）で除き、　５Ｏ５−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動に供した。泳動後、ウェスタン法で、抗
Ａ　Ｌ　Ｄ　Ｈ抗体と特異的に反応する蛋白質の生成を
調べたところ、分子量約７９　、０００の蛋白と抗体が
強く反応していた６一方、プラスミドを有しない株では
、抗体と反応する蛋白の生成はほとんど見られなかった
。また、形質転換株のＡＬＤＨの酵素活性を実施例１に
記載の方法で測定したところ、プラスミドをもたない株
の比活性が０．１５に対し、形質転換株では、０．４３
であり、約３倍の活性の上昇が認められた。生産された
抗ＡＬＤＨ抗体と反応する蛋白の分子量が本来のＡＬＤ
Ｈの分子量より大きいのは、実施例１の大腸菌と同じく
融合蛋白の形で生産されているためと考えられる。分子
量は、本来の大きさよりも大きいが、酵素活性を示して
おり、実用上問題はない。上記のごとく酢酸菌をＡ　Ｌ
　Ｄ　ｌ−１の構造遺伝子を含む遺伝子で形質転換する
ことにより、活性をもったＡＬＤ）Ｉの菌体含量を高め
ることができる。

（実施例３） 〔酢酸菌形質転換株を用いた酢酸発酵〕実施例２で得ら
れたＡＬＤＨの構造遺伝子を含む遺伝子断片と大腸菌プ
ラスミドｐＵｃ１８と酢酸菌プラスミドの３者のキメラ
・プラスミドをアセトバクター・アセチ・サブスピーシ
ズ・キシリナムＩＦＯ３２８８にアグリカルチュラル・
アンド・バイオロジカル・ケミストリー、第４９巻、第
２０９１頁（１９８５年）に記載の方法にしたがい、形
質転換した。形質転換株は、アンピシリン５００μｇ／
ｍ１２を含む実施例２で組成の示されているＹＰＧ寒天
培地で選択した。

選択培地に生育したアンピシリン耐性株のプラスミドを
実施例２の方法に準じて調べたところ、約８．３キロベ
ースの大きさのキメラプラスミドを保持していることを
確認した。キメラプラスミドを保持する形質転換株とプ
ラスミドをもたない元株との酢酸発酵能を比較した。５
Ω容ミニ・ジャーでの発酵経過を第２図に示す。

培地は、実施例２のＹＰＧ寒天培地にエタノール。

酢酸を適当量添加したものを使用した。ジャーの実液量
は３Ｑとし、５００ｒｐｍ、　０．２ｖｖｍの条件で通
気攪拌培養した。培養温度は、３０℃であった。第２図
の発酵経過の結果から、形質転換株と元株の酢酸発酵能
を比較した。第１表に示すように、菌の比増殖速度、単
位液量あたりの土酸速度、最終到達酸度のいずれにおい
ても形質転換株では、顕著に向上していた。また、酸度
４％で連続酢酸発酵をおこなったところ１元株では、毎
時１５０ｍＱの流量で、定常状態になったのに対し、形
質転換株では、毎時２５０ｍＱの流量まで連続発酵が可
能であった。

第　　１　　表 （１）酸度３％の時 （２）酸度２％の時 実施例４．細胞膜結合型アルデヒド脱水素酵素の構造遺
伝子の塩基配列およびアミノ酸配列の決定実施例１で得
た大腸菌形質転換株Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＡＬ２５の保有す
るプラスミドを実施例１のアルカリ溶菌法で抽出し得た
。得られたプラスミドをＥｃｏ　ＲＩで切断して得られ
る第１図に制限酵素地図を示す約３．６キロベースの遺
伝子断片についてＭ１３ファージを用いたジデオキシ法
（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｏ＋ｏｌｏｇｙ＋第
１０巻、第２０頁、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、
　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

１９８３年）によって、その塩基配列を決定した。決定
した塩基配列をもとに翻訳可能領域を検索したところ、
第３図に示すようなＡＴＧ翻訳開始コドンから翻訳され
る２３１９塩基からなるアミノ酸７７３残基（分子量８
４，１３５）をコードする翻訳可能領域が見出された。

（第３図の塩基配列から決定されたアミノ酸配列を第３
図の塩基配列の下段に示した。）第３図の塩基配列で示
されるポリペプチドが１本発明の細胞膜結合型アルデヒ
ド脱水素酵素と一致することは、精衷した本発明の細胞
膜結合型アルデヒド脱水素酵素をエドマン分解によって
決定されたアミノ末端側アミノ酸配列１０個（Ａｇｎ−
ＧＩｎ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａ
ｒｇ−５ｅｒ−Ｌｅｕ）と塩基配列から見出されたアミ
ノ末端側から第４５番目以降のアミノ酸配列と完全に一
致することから、確認された。

塩基配列から見出されたアミノ末端側から第４４番目ま
でのアミノ酸配列は、エドマン分解によって決定された
アミノ酸配列には見られないことから。

細胞膜結合型アルデヒド脱水素酵素の分泌に関与する領
域と思われた。

【図面の簡単な説明】

第１図は細胞膜結合型アルデヒド脱水素酵素の構造遺伝
子の制限酵素地図を示し、第２図は実施例３における元
株と形質転換株の酢酸発酵の比較を示す図であり、第３
図は、上段は細胞膜結合型アルデヒド脱水素酵素の構造
遺伝子の塩基配列を示す図で、下段は細胞膜結合型アル
デヒド脱水素酵素の構造遺伝子のアミノ酸配列を示す図
である。 アミノ酸配列における略記号の意味は次のとおりである
。 メチオニン アルギニン アスパラギン酸 グルタミン クリシン イソロイシン リジン プロリン スレオニン チロシン ｌａ ｓｎ ｙｓ １ｕ ｔ（ｉ　ｓ ｅｕ ｈｅ ｅｒ ｒｐ ａｌ アラニン アスパラギン システィン グルタミン酸 ヒスチジン ロイシン フェニルアラニン セリン トリプトファン バリン

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アセトバクター属の微生物に由来し、分子サイズが
   約３．６キロベースであり、制限酵素地図が第１図で示
   される細胞膜結合型アルデヒド脱水素酵素の構造遺伝子
   。 ２、アセトバクター属の微生物に由来し、分子サイズが
   約３．６キロベースであり、制限酵素地図が第１図で示
   される細胞膜結合型アルデヒド脱水素酵素の構造遺伝子
   を含むプラスミド。 ３、アセトバクター属の微生物に由来し、分子サイズが
   約３．６キロベースであり、制限酵素地図が第１図で示
   される細胞膜結合型アルデヒド脱水素酵素の構造遺伝子
   を含むプラスミドによって形質転換した酢酸菌。 ４、アセトバクター属の微生物に由来し、分子サイズが
   約３．６キロベースであり、制限酵素地図が第１図で示
   される細胞膜結合型アルデヒド脱水素酵素の構造遺伝子
   を含むプラスミドによって形質転換したアセトバクター
   属またはグルコノバクター属の微生物を用いて酢酸発酵
   せしめることを特徴とする酢酸発酵法。 ５、アセトバクター属の微生物に由来し、第３図の塩基
   配列で示される細胞膜結合型アルデヒド脱水素酵素の構
   造遺伝子。 ６、アセトバクター属の微生物に由来し、第３図のアミ
   ノ酸配列で示される細胞膜結合型アルデヒド脱水素酵素
   の構造遺伝子。