GEBIET DER ERFINDUNG
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Die Erfindung betrifft das Strukturgen der membrangebundenen
Aldehyd-Dehydrogenase, die aus Mikroorganismen stammt, die
zu der Gattung Acetobacter gehören, und ein Plasmid, das
dasselbe enthält, und die Verwendung des genannten Plasmids.
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Die von den zur Gattung Acetobacter gehörigen Mikro-
Organismen produzierte membrangebundene
Aldehyd-Dehydrogenase ist ein Enzym, das mit Hilfe von Pyrrol-Chinolin
chinon als prosthetische Gruppe ein Aldehyd zu der
entsprechenden Säure oxidiert. Es ist ein Enzym von hohem
industriellen Wert, das bei der Essigsäuregärung an der
Oxidation von Ethanol zu Essigsäure beteiligt ist und zur
quantitativen Analyse verschiedener Aldehyde und zum
oxidativen Abbau von Aldehyden, die für den unangenehmen
Geruch von Nahrungsmittel verantwortlich sind, verwendet
wird.
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Die Erfindung bringt auch Vorteile auf dem Gebiet der
Essigsäuregärung, da die Essigsäurebakterien, die das
genannte Enzym in größeren Mengen in den Zellen produzieren,
höhere Geschwindigkeiten der Essigsäuregärung garantieren,
wodurch die Ausbeute an Essigsäure verbessert wird.
STAND DER TECHNIK UND DAMIT EINHERGEHENDE PROBLEME
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Die membrangebundene Aldehyd-Dehydrogenase wurde bisher
durch Anziehen eines Mikroorganismus produziert, der zu der
Gattung Acetobacter oder Gluconobacter gehört, und in Form
der so angezogenen unbehandelten mikrobiellen Zellen oder
als reines Produkt nach Extraktion aus den Zellen
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Dieses Enzym ist jedoch in den mikrobiellen Zellen in
kleinen Mengen enthalten und ist instabil, so daß es während
der Extraktions- und Reinigungsstufen zur Inaktivierung
neigt und nicht in ausreichend hoher Ausbeute isoliert
werden kann. Daher ist es schwierig, dieses Enzym in großen
Mengen zu erhalten. Es wäre möglich, Mutanten zu erzeugen,
die dieses Enzym in größeren Mengen enthalten, jedoch
existiert bisher kein Beleg für eine Mutante, die in der
Lage ist, dieses Enzym in den Zellen in ausreichend großer
Menge zu produzieren.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN -
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Fig. 1 ist eine Restriktionsenzym-Spaltungskarte für das
DNA-Fragment, das das Strukturgen für die membrangebundene
Aldehyd-Dehydrogenase enthält. Fig. 2 ist ein Diagramm, das
die Wirksamkeit einer Essigsäuregärung, die durch den
Elternstamm und durch die in Beispiel 3 beschriebene
Transformante verursacht wird, vergleicht. Fig. 3 zeigt die
Basensequenz des Strukturgens für die membrangebundene
Aldehyd-Dehydrogenase (obere Zeilen) und die
Aminosäuresequenz derselben (untere Zeilen).
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Die Abkürzungen für die Aminosäuresequenz besitzen die
nachstehend aufgeführten Bedeutungen.
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MET: Methionin
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Arg: Arginin
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- Asp: Asparaginsäure
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- Gln: Glutamin
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-Gly: Glycin
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Ile: Isoleucin
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Lys: Lysin
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Pro: Prolin
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Ala: Alanin
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Asn: Asparagin
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Cys: Cystein
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Glu:Glutaminsäure
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His: Histidin
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Leu Leucin
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Phe: Phenylalanin
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Ser: Serin
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Thr: Threonin
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Tyr: Tyrosin
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Trp: Tryptophan
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Val: Valin
MITTEL ZUR LÖSUNG DER PROBLEME
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Als Ergebnis intensiver Studien zur Lösung der obigen
Probleme durch DNA-Rekombinationstechniken ist es uns
gelungen, das membrangebundene, Aldehyd-Dehydrogenasegen aus
Acetobacter altoaceticrenes zu isolieren und es in ein
Plasmid einzubauen. Wir haben gefunden, daß die Verwendung
dieses Plasmids mit dem genannten darin eingebauten
Strukturgen den Gehalt des genannten Enzyms in den Zellen
erhöht, wodurch die Wirksamkeit der Essigsäuregärung
verbessert wird. Die Erfindung wurde auf der Basis dieser
Entdeckungen gemacht.
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Somit betrifft die Erfindung ein Plasmid, das das
Strukturgen für die membrangebundene Aldehyd-Dehydrogenase enthält,
die aus Mikroorganismen von Acetobacter altoacetigenes
stammt und eine Molekülgröße von etwa 3,6 Kb und die in Fig.
3 gezeigte Basensequenz besitzt, einen durch das genannte
Plasmid transformierten Mikroorganismus von Acetobacter oder
Gluconobacter und ein Essigsäuregärungsverfahren unter
Verwendung der genannten Transformante.
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Die erfindungsgemäße membrangebundene Aldehyd-Dehydrogenase
(im Folgenden als "ALDH" abgekürzt) ist ein Enzym (ein
Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 75 000), das die
in Fig. 3 gezeigte Aminosäuresequenz besitzt und die
Schlüsselsubstanz für die Aktivität darstellt, die von dem
neuen, in der japanischen Patentschrift Kokai Nr. 12279
(1988) beschriebenen Aldehyd-Dehydrogenase-Komplex gezeigt
wird. Sie ist aus dem Stamm Acetobacter altoacetigenes MH-24
(FERM BP-491) erhältlich. Ein DNA-Fragment, das das
Strukturgen für das genannte Enzym enthält, kann aus der
Gesamt-DNA isoliert werden, die von einem Mikroorganismus
von Acetobacter altoacetipenes gewonnen wird, der in der
Lage ist, das genannte Enzym zu produzieren. Die Gesamt-DNA
kann beispielsweise durch das in der japanischen
Patentschrift Kokai Nr. 9489 (1985) beschriebene Verfahren
hergestellt werden. Aus dieser Gesamt-DNA kann das
DNA-Fragment, das das ALDH-Strukturgen enthält, gemäß dem in
BEISPIEL 1 beschriebenen Verfahren isoliert werden, indem
der Antikörper gegen das genannte Enzym hergestellt wird und
indem über eine Antigen-Antikörper-Reaktion nach einem Klon
gesucht wird, der das betreffende Gen enthält.
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- Das genannte Enzym kann gemäß dem Verfahren hergestellt
werden, das in der japanischen Patentschrift Kokai Nr. 12279
(1988) beschrieben ist - durch Auftrennen des gereinigten
Aldehyd-Dehydrogenase-Komplexes in zwei Untereinheiten durch
Elektrophorese auf einem SDS-Polyacrylamidgel, Extrahieren
des Proteins, das ein Molekulargewicht von 75 000 aufweist,
aus dem Gel und Verwenden dieses Proteins als Antigen. Der
Antikörper gegen ALDH kann beispielsweise durch das in
"Methods in Enzymology", 73, 46 (1981), beschriebene
Verfahren erhalten werden. Die Immunisierung, die zweimal im
Abstand von etwa 2 Wochen wiederholt wird, erzeugt nach 1
bis 1,5 Monaten einen für ALDH spezifischen Antikörper. Der
so erzeugte Antikörper kann als Rohprodukt isoliert werden,
indem das immunisierte Serum einer Ammoniumsulfat-
Fraktionierung unterzogen wird, die anschließend noch durch
Ionenaustauschchromatographie gereinigt werden kann. Wird
der Antikörper zur Isolierung des betreffenden Gens
verwendet, kann das immunisierte Serum, das dasselbe enthält, nach
der richtigen verdünnung verwendet werden.
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Andererseits wird die Gesamt-DNA mit einem geeigneten
Restriktionsenzym gespalten, das resultierende Fragment wird
mit Hilfe von T4-DNA-Ligase mit einem
Expressionsvektorplasmid, das zuvor mit einem geeigneten Restriktionsenzym
geschnitten worden war, ligiert, und das ligierte Produkt
wird zur Transformation eines Escherichia-coli-Stammes
verwendet. Als Expressionsvektor kann ein Vektorplasmid
verwendet werden, das den Promotor und den Operator für das
β-Galactosidasegen trägt und die Genexpression ermöglicht,
die von Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (z.B. pUC18)
induziert wird.
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Sämtliche bekannten Verfahren können zur Transformation von
Escherichia coli verwendet werden, jedoch ist es
vorzuziehen, für den Einbau eines Gens ein hochwirksames
Verfahren heranzuziehen, beispielsweise das in "DNA Cloning",
Bd. 1, S. 109, IRL Press (1985), beschriebene Verfahren. Der
Stamm, der das betreffende Gen enthält, kann aus den so
erzeugten Transformanten beispielsweise gemäß dem Verfahren,
das in "Gene", 37, 267 (1985) beschrieben ist, herausgesucht
werden, was es ermöglicht, daß die Zelltrümmer der
Transformanten mit dem Antikörper reagieren und den Stamm
nachweisen, der die spezielle Reaktivität zeigt. Der so
ausgewählte Stamm enthält in einigen Fällen die gesamte
Länge des betreffenden Gens, jedoch in anderen Fällen nur
einen Teil des Gens.
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Wenn der Stamm nur einen Teil des betreffenden Gens enthält,
kann das Gesamtgen durch die
Southern-Blot-Hybridisierungstechnik erhalten werden, indem ein Teil des Gens als Sonde
verwendet wird und ein zu der Sonde homologes Fragment
isoliert wird.
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Um zur Produktion von ALDH herangezogen zu werden, muß das
so isolierte DNA-Fragment, das das ALDH-Strukturgen enthält,
mit einem Gen gekoppelt werden, das eine in Wirtszellen
funktionierende Promotoraktivität enthält. Als Promotor zur
Gewährleistung der Bildung von ALDH-Protein in einem Mikro-
Organismus von Acetobacter oder Gluconobacter kann,
abgesehen von dem für das ALDH-Gen natürlichen Promotor, ein
unterschiedliches Gen, das aus Essigsäurebakterien stammt
und eine Promotoraktivität besitzt, oder ein Promotor in
Escherichia coli verwendet werden, der zur Expression in
Essigsäurebakterien in der Lage ist. Als Beispiele für den
Promotor in Escherichia coli können erwähnt werden das
ampicillinresistente Gen in dem E.-coli-Plasmid pBR322, das
kanamycinresistente Gen in dem E.-coli-Plasmid pACYC177, das
chloramphenicolresistente Gen in dem E.-coli-Plasmid
pACYC1B4 und der Promotor für das β-Galactosidasegen in
E. coli. Wird ein Überschuß an ALDH produziert, so daß das
Wachstum der Wirtszellen nachteilig beeinflußt wird, muß ein
geeigneter Promotor zur Kontrolle des Genexpressionsgrades
ausgewählt werden. Es werden oft Fälle beobachtet, in denen
ein Protein mit einem Molekulargewicht, das sich von
demjenigen von ALDH unterscheidet, gebildet wird. Es handelt
sich dabei um ein Fusionsprotein, bestehend aus ALDH und
einem weiteren Typ von Protein, was kein Problem darstellt,
wenn die Enzymaktivität von ALDH normal exprimiert werden
kann.
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Als Vektor, um das DNA-Fragment, das das Strukturgen für
ALDH enthält, in Essigsäurebakterien beizubehalten, können
beispielsweise pTA5001(A) und pTA5001(B), beschrieben in der
japanischen Patentschrift, Kokai Nr. 9488/1985, sowie
Vektoren mit einem breiten Wirtsbereich, die in
Essigsäurebakterien eingeschleust werden können, wie RP4::mu, RP4,
pRK2013 und RSF1010, verwendet werden.
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Ein Plasmid, das das Strukturgen für ALDH enthält, kann
somit isoliert und in den Wirt eingeschleust werden, wobei
das ALDH-Protein in großen Mengen in den Zellen produziert
werden kann.
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Als Wirt zur Produktion von ALDH können Escherichia-coli
und Bacillus-subtilis-Stämme verwendet werden, für die DNA-
Rekombinationstechniken erstellt worden sind, jedoch ist es
vorzuziehen, Essigsäurebakterien zu verwenden, die von Natur
aus in der Lage sind, ALDH zu produzieren, wie die Stämme
Acetobacter und Gluconobacter.
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ALDH besitzt PQQ als prosthetische Gruppe, daher kann PQQ
dem Kulturmediurn zur Produktion von hochaktivem ALDH-Protein
zugesetzt werden. Jedoch ist es vorzuziehen, zu diesem Zweck
einen Wirt einzusetzen, der in der Lage ist, PQQ zu
produzieren. Wie beschrieben in Agricultural and Biological
Chemistry, 48, 561 (1984), ist die Fähigkeit zur
PQQ-Synthese bei Essigsäurebakterien hoch, jedoch bei Escherichia
coli und Bacilus subtilis recht gering. Außerdem sollte der
Kreislauf zwischen oxidiertem PQQ und reduziertem PQQ für
einen wirksamen Ablauf der Enzymreaktion glatt durchlaufen
werden, und die Verwendung eines Essigsäurebakteriums als
Wirt ist in dieser Hinsicht auch vorteilhaft, da die durch
die Reduktionsreaktion gebildeten Elektronen eine
Konjugation mit dem Elektronentransportsystem eingehen, so daß
ein wirksamer Kreislauf ermöglicht wird.
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ALDH ist bei dem Verfahren der Essigsäuregärung an der
Oxidation von Aldehyd zu Essigsäure beteiligt. Eine Zunahme
der ALDH-Menge in deri mikrobiellen Zellen würde darum die
Wirksamkeit des Gärungsprozesses verbessern. Wie in
BEISPIEL 3 gezeigt, verbessert die höhere ALDH-Aktivität,
die durch Verwendung einer Transformante des
Essigsäurebakteriums erreicht wird, tatsächlich die
Gärungswirksamkeit.
WIRKUNGEN, DIE DURCH DIE ERFINDUNG ERZIELT WERDEN
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Die Erfindung ermöglicht eine leichte Herstellung von ALDH,
einem Enzym, das aufgrund der geringen Erzeugung durch
Mikroorganismen schwierig zu reinigen war, wodurch ihre
Verwendung als Enzym zur quantitativen Analyse und zur
Desodorierung ausgeweitet wird. Ferner kann die Wirksamkeit
der Essigsäuregärung durch Verwendung eines
Essigsäurebakteriurns mit einem höheren ALDH-Gehalt verbessert werden.
BEISPIEL 1
Herstellung des Anti-ALDH-Antikörpers
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Der Stamm Acetobacter altoacetigenes MH-24 (FERM BP-491)
wurde unter Schütteln bei 30 ºC in einem Medium kultiviert,
das 3 % Glucose, 4 % (Volumen) Ethanol, 6 % (Volumen)
Essigsäure, 0,5 % Hefeextrakt (Daigo Eiyo-kagaku Co.) und
0,2 % Polypepton (Daigo Eiyo-kagaku Co.) enthielt. Die
angezogenen Zellen wurden durch Zentrifugationstrennung
gesammelt. 4 mg ALDH-Komplex wurden aus den Zellen durch das
übliche Verfahren isoliert, das in der japanischen
Patentschrift, Kokai Nr. 12279/1988, beschrieben ist. Dieser
Komplex wurde zur Trennung in ein Protein mit einem
Molekulargewicht von etwa 75 000 und in ein weiteres Protein
mit einem Molekulargewicht von etwa 20 000 einer
Elektrophorese auf SDS-Polyacrylamidgel unterzogen. Das vorgehende
Protein wurde aus dem Gel eluiert und als
ALDH-Standardprodukt isoliert.
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Die so erhaltende ALDH (0,1 mg) wurde zusammen mit
komplettem Freudschen Adjuvans einem Kaninchen subkutan
injiziert. Dieselbe Menge wurde erneut etwa 2 Wochen später
injiziert. 1 Monat nach der ersten Injektion wurde aus dem
Ohr eine Blutprobe entnommen und das Serum von der Probe
durch Zentrifugieren abgetrennt. Die Fällungsreaktion wurde
beobachtet, als das Serum auf die Reaktivität von ALDH
getestet wurde. Außer mit ALDH wurde mit Proteinen praktisch
keine Aktivität beobachtet, wenn die Zelltrümmer von
Acetobacter altoacetigenes einer Elektrophorese auf
SDS-Polyacrylamidgel unterzogen und durch Western-Blot-
Technik auf ihre Spezifität getestet wurden, was die Bildung
des Anti-ALDH-Antikörpers mit hoher Spezifität andeutete.
Isolierung eines Teils des Strukturgens für ALDH
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Aus den Zellen des Stammes Acetobacter altoacetigenes MH-24,
die auf dieselbe Weise wie vorstehend angezogen wurden,
wurde die Gesamt-DNA durch das in der japanischen
Patentschrift Kokai Nr. 9489/1985 beschriebene bekannte
Verfahren hergestellt. Sie wurde mit dem Restriktionsenzym
PstI (Takara Shuzo Co., Ltd.) gespalten, und die so
gebildeten DNA-Fragmente wurden mit Hilfe von T4-DNA-Ligase
(Takara Shuzo Co., Ltd.) mit dem E.-coli-Vektor pUCl8
(Takara Shuzo Co., Ltd.), der zuvor mit PstI gespalten und
mit alkalischer Phosphatase mikrobiellen Ursprungs (Takara
Shuzo Co., Ltd.) dephosphoryliert worden war, ligiert. Das
Reaktionsgemisch wurde zur Transformation des E.-coli-
Stammes JM 109 dürch das Verfahren von Hanahan ["DNA
doning", Bd. 1, S. 109, IRL Press (1985)] verwendet. Die
Transformanten wurden durch Kultur auf LB-Agarmedium
aussortiert, das 30 µg/ml Ampicillin enthielt ("A Manual for
Genetic Engineering", S. 201, Cold Spring Harbor Laboratory,
1980). Die Rekombinationshäufigkeit betrug etwa 60 %. Die so
erhaltenen Transformanten (etwa 5 000 Stämme) wurden auf die
Reaktivität mit dem Anti-ALDH-Antikörper gemäß dem Verfahren
von Wang et al. [Gene, 37, 267 (1985)], wie nachstehend
beschrieben, getestet. Die auf dem LB-Medium angezogenen
Transformanten wurden auf ein Nitrocellulosefilter
übertragen und bei 37 ºC 3 bis 5 Stunden lang inkubiert. Die
angezogenen Kolonien auf dem Filter wurden mit einer
wäßrigen 10 mM IPTG-Lösung
(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) befeuchtet, um den lac-Promotor von pUC18 zu
induzieren, so daß die Wirtszellen (E. coli) zur Produktion
des Fusionsproteins in großen Mengen veranlaßt wurden. Der
Einbau von IPTG wurde bei 37 ºC 3 bis 5 Stunden lang
durchgeführt, und das Filter wurde 10 Minuten lang Chloroform-
Dampf ausgesetzt, um die Kolonien vorzubehandeln, und
anschließend über Nacht in Puffer A (50 mM Tris-HCl, 150 mM
NaCl, pH 7,5), der außerdem 5 mM MgCl&sub2;, 5 µg/ml Dnase,
0,1 mg/ml Lysozym und 0,5 % BSA zur vollständigen Lyse der
Kolonien enthielt, eingetaucht, um das Nitrocellulosefilter
zur Absorption der mikrobiellen Proteine zu veranlassen, und
um gleichzeitig eine Blockierüng auszulösen. Das Filter
wurde dreimal mit Puffer A gewaschen und bei Raumtemperatur
5 Stunden lang in eine Verdünnung von 1:1000 von Anti-ALDH-
Antikörper, vorstehend hergestellt, in Puffer A eingetaucht.
Nach fünfmaligem Waschen des Filters mit Puffer A wurde
folgendermaßen geprüft, ob die Antigen-Antikörper-Reaktion
stattgefunden hatte oder nicht. Das Filter wurde bei
Raumtemperatur 1 Stunde lang mit einer Verdünnung von 1:2000
von Peroxidase-markiertem Antikaninchen-IgG-Antikörper (Bio-
Rad Laboratories) als zweitem Antikörper reagieren gelassen,
es wurde dreimal mit Puffer A gewaschen und in eine Lösung
eingetaucht, die Wasserstoffperoxid und 4-Chlor-1-naphthol
als Farbentwickler enthielt. Als Ergebnis ergab sich, daß
zwei der ampicillinresistenten Transformanten (etwa
5 000 Stämme) mit dem Antikörper reagiert haben. Die
Extraktion der Plasmide aus diesen zwei Stämmen durch
alkalische Lysetechnik [Nucleic Acids Res., 7, 1513 (1979)]
und die Analyse der extrahierten Plasmide durch Spaltung mit
Restriktionsenzymen ergaben, daß beide Stämme ein
DNA-Fragment von etwa 2,0 Kb an der PstI-Schnittstelle des Vektors
pUC18 enthalten. Getrennt davon wurde die Transformante über
Nacht bei 37 ºC in LB-Medium angezogen, das 30 µg/ml
Ampicillin und 10 mM IPTG enthielt, die angezogenen Zellen
wurden durch Ultraschall aufgebrochen, die so erhaltenen
Zelltrümmer einer Elektrophorese auf SDS-Polyacrylamidgel
unterzogen, und das Molekulargewicht des Proteins, das mit
dern Anti-ALDH-Antikörper reagiert, wurde durch Western-Blot
Technik [Anal. Biochem. 112, 195 (1981)] bestimmt. Als
Ergebnis wurde gefunden, daß ein Protein mit einem
Molekulargewicht von etwa 40 000 mit dem Antikörper
reagierte. Da das Molekulargewicht von ALDH 75 000 beträgt,
zeigt dies, daß das vorstehend isolierte Gen ein Gen ist,
das für etwa die Hälfte des ALDH-Proteins kodiert.
Isolierung des DNA-Fragments, das die Gesamtlänge des
Strukturgens für ALDH enthält
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Ein DNA-Fragment, das die Gesamtlänge des Strukturgens für
ALDH enthält, wurde, wie nachstehend beschrieben, durch
Southern-Hybridisierungstechnik [J. Mol. Biol. 98, 503
(1975)] isoliert, wobei als Sonde das vorstehend erhaltene
Gen (etwa 2,0 Kb groß) verwendet wurde, das einen Teil des
Strukturgens enthielt. Die Gesamt-DNA von Acetobacter
altoacetigenes MH-24 wurde, wie vorstehend angegeben,
hergestellt und einem Teilabbau durch Verwendung des
Restriktionsenzyms BamHI unter solchen Bedingungen
unterzogen, daß die Größe der resultierenden Fragmente
hauptsächlich 20 bis 30 Kb beträgt. Die so gebildeten Fragmente
wurden mit Hilfe von T4-DNA-Ligase mit dem
E.-coli-Cosmidvektor pHC79 [Gene 11, 291 (1980)], der zuvor mit BamHI
gespalten worden war, ligiert, und das ligierte Produkt
wurde unter Verwendung des In-vitro-Packungskits
(Promegabiotechn. Co.) einem Packen unterzogen. Getrennt
davon wurde der E.-coli-Stamm HB101 (Wirt) über Nacht bei
30 ºC in LB-Hedium angezogen, das 0,2 % Haltose enthielt,
und die angezogenen Zellen wurden durch Zentrifugieren
gesammelt und in LB-Medium suspendiert, das 10 mM MgCl&sub2;
enthielt. Zu dieser Suspension wurden 0,5 ml des gepackten,
vorstehend erhaltenen Produkts hinzugegeben, das Gemisch
wurde sanft gerührt und bei Raumtemperatur 20 Minuten
stehengelassen. 4 ml LB-Medium wurden sodann hinzugegeben,
und das Schütteln der Kultur wurde bei 37 ºC 1 Stunde lang
fortgesetzt. Die so erhaltene Kulturlösung wurde auf
LB-Agarmedium ausplattiert, das 30 p,g/ml Ampicillin
enthielt, und über Nacht bei 37 ºC inkubiert. Etwa 1 000 Stämme
der entwickelten Transformanten wurden auf das Vorliegen
eines Plasmids, das zur Hybridisierung mit einer Sonde durch
die Southern-Blot-Hybridisierungstechnik in der Lage war,
getestet. Es erwies sich, daß drei Stämme der getesteten
Transformanten DNA enthielten, die zur Hybridisierung mit
der Sonde in der Lage war, und eine von ihnen wurde zur
Klonierung eines DNA-Fragments verwendet, das die gesamte
Länge des Strukturgens für ALDH enthielt. Auf der Grundlage
der Tatsache (bewiesen durch Southern-Blot-Hybridisierung),
daß die Sonden-DNA in einem durch EcoRI gespaltenen Fragment
von etwa 10 Kb enthalten war, wurde dieses Fragment zuerst
als pUC18-Vektor isoliert. Dieses Fragment wurde sodann
unter Verwendung von AvaI einem Teilabbau unterzogen. Es
wurde ein Fragment isoliert, daß die Gesamtlänge des ALDH-
Strukturgens enthielt. Es besitzt ein Molekulargewicht von
etwa 3,6 Kb und die in Fig. 1 gezeigte
Restriktionsenzymkarte. Dieses Genfragment wurde an der
EcoRI-AvaI-Schnittstelle in einer solchen Richtung zu dem E.-coli-Vektor pUC18
gespleißt, daß die Kontrolle durch den lac-Promotor
funktioniert, und der so erzeugte Transformant wurden unter
dern Namen E. coli AL25 (FERM BP-2288 (FERM P-9911)) bei FRI
hinterlegt. Diese Transformante wurde über Nacht bei 37 ºC
in LB-Medium angezogen, das 30 µg/ml Ampicillin und 10 mM
IPTG enthielt, und die angezogenen Zellen wurden durch
Western-Blot-Technik analysiert. Das Ergebnis war, daß ein
spezifisch mit einem Anti-ALDH-Antikörper reaktives Protein
mit einem Molekulargewicht von etwa 79 000 in merklicher
Menge P4oduziert wurde. In Abwesenheit von IPTG wurde kein
solches Protein produziert, was anzeigte, daß das
ALDH-Protein unter der Kontrolle des lac-Promotors in dieser
Transformante produziert wurde. Das größere Molekulargewicht
des produzierten Proteins im Vergleich zu demjenigen der
ursprünglichen ALDH ist wahrscheinlich darauf
zurückzuführen, daß es in Form eines Fusionsproteins mit einem
unterschiedlichen Protein, das von dem Gen uyimittelbar
hinter dem lac-Promotor stammt, produziert wurde. Die
ALDH-Enzymaktivität der E.-coli-Transformante wurde durch
das Verfahren gemessen, das für Essigsäurebakterien
angewendet wird [Agricultural and Biological Chemistry, 4,
503 (1980)]. Es wurde jedoch keine Aktivität nachgewiesen.
BEISPIEL 2
Transformation eines Essigsäurebakteriums mit dem DNA-
Fragment, das das Strukturgen für ALDH enthält
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Däs in BEISPIEL 1 isolierte DNA-Fragment, das das
ALDH-Strukturgen, wie in Fig. 1 gezeigt, enthielt, wurde an
seiner Avai-Schnittstelle in einer solchen Richtung zu pUC18
gespleißt, daß eine Syhthese des ALDH-Proteins ermöglicht
wurde. Das resultierende rekombinante Plasmid wurde mit dem
Restriktionsenzym SalI geschnitten, und die geschnittenen
Enden wurden mit Hilfe der T4-DNA-Polymerase mit glatten
Enden versehen. Getrennt davon wurde ein Plasmid mit einer
Molekülgröße von etwa 2,1 Kb aus Acetobacter aceti,
Subspezies xylinum IFO 3288, isoliert und mit dem
Restriktionsenzym AccI geschnitten, und die geschnittenen
Enden wurden mit Hilfe von T4-DNA-Polymerase mit glatten
Enden versehen. Die beiden Typen der vorstehend erhaltenen
geschnittenen DNA-Fragmente wurden unter Verwendung von
T4-DNA-Ligase miteinander ligiert, und die resultierende
rekombinante DNA wurde verwendet, um durch das in
Agricultural and Biological Chemistry, 49, 2091 (1985),
beschriebene Verfahren einen mutierten Stamm 10-812 mit
geringerer ALDH-Aktivität, der durch das in Agricultural and
Biological Chemistry 49, 2185 (1985) beschriebene Verfahren
von Acetobacter aceti Nr. 1023 (FERM BP-2287 (FERM P-7122))
stammt, zu transformieren. Die so erhaltenen Transformanten
wurden auf YPG-Agarmedium (3 % Glucose, 0,5 % Hefeextrakt,
0,2 % Polypepton und 2 % Agar, pH 6,5), das außerdem
50 µg/ml Ampicillin enthielt, inkubiert, und die in dem
ampicillinresistenten Stamm auf diesem Medium gezüchteten
Plasmide wurden durch das in Agricultural and Biological
Chemistry 49, 2083 (1985), beschriebene Verfahren geprüft.
Es wurde gefunden, daß die Molekülgröße des eingeschleusten
Plasmids etwa 8,3 Kb betrug. Die Analyse durch die Wirkung
der Restriktionsenzyme ergab, daß dieses Plasmid ein
chimäres Plasmid ist, das aus drei Fragmenten
zusammengesetzt
ist: PUC18, dem Genfragment, das in Fig. 1 gezeigt
ist, und einem Plasmid von etwa 2,1 kb von der Acetobacter
aceti-Subspezies xylinum (IF03288).
Eigenschaften der Acetobacter-Transformante
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Die Transformante von Acetobacter aceti, die vgrstehend
erhalten worden war, wurde durch das Western-Blot-Verfahren
auf die gebildete Menge an ALDH-Protein getestet. Sie wurde
unter Schütteln in flüssigem YPG-Mediurn (YPG-Agarmedium, aus
dem der Agar entfernt worden war), das 3o µg/ml Ampicillin
enthielt, bei 30 ºC 36 Stunden lang angezogen, und die
angezogenen Zellen wurden gesammelt und in McIlvaine-Puffer
(pH 6,0) suspendiert und mittels einer French-Presse
aufgebrochen. Nach Entfernung der nicht aufgebrochenen
mikrobiellen Zellen durch Zentrifugieren (5 000 upm, 10 Minuten)
wurde der Überstand einer Elektrophorese auf
SDS-Polyacrylamidgel unterzpgen, und die Bildung der Proteine, die
spezifisch mit dem Anti-ALDH-Antikörper reagieren, wurde
durch Western-Blot-Technik geprüft. Es wurde gezeigt, daß
ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 79 000 aktiv
mit dem Antikörper reagiert hatte. Andererseits hatte sich
kein solches Protein in dem Elternstamm gebildet. Die ALDH-
Enzymaktivität der Transformante wurde durch das in
BEISPIEL 1 beschriebene Verfahren gemessen. Ihre spezifische
Aktivität betrug 0,43, im Gegensatz zu 0,15 des
Elternstammes - eine etwa dreifache Zunahme der Aktivität. Das im
Vergleich zu ursprünglicher ALDH größere Molekulargewicht
dieses Proteins, das mit dem Anti-ALDH-Antikörper reaktiv
ist, beruht wahrscheinlich darauf, daß es, wie im Falle von
E. coli, was in BEISPIEL 1 beschrieben ist, in Form eines
Fusionsproteins produziert wurde. Dies stellt kein
praktisches Problem dar, da das produzierte Protein sogar
mit dem größeren Molekulargewicht eine normale Enzym
aktivität zeigt. Wie aus dem Vorgenannten hervorgeht, kann
der intrazelluläre ALDH-Gehalt von Essigsäurebakterien durch
Transformation mit einer rekombinanten DNA, die das
Strukturgen für ALDH enthält, vergrößert werden.
BEISPIEL 3
Essigsäuregärung unter Verwendung einer Acetobacter-
Transformante
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Die Acetobacter-aceti-Subspezies xylinum IFO3288 wurde durch
Einschleusen eines chimären Plasmids, zusammengesetzt aus
drei Komponenten (aus dem DNA-Fragment, das das ALDH-
Strukturgen enthält, das in BEISPIEL 2 erhalten worden war,
dern E.-coli-Plasmid PUC1l8 und dem Essigsäurebaktenum-
Plasmid) durch das in Agricultural and Biological Chemistry
49, 2091 (1985), beschriebene Verfahren transformiert. Die
gewünschte Transformante wurde durch Anzucht auf YPG-
Agarmedi" um, das 500 µg/ml Ampicillin enthielt, aussortiert,
und die Plasmide in dem ampicillinresistenten Stamm, der auf
diesem selektiven Medium angezogen worden war, wurden durch
dasselbe Verfahren wie in BEISPIEL 2 analysiert. Es
bestätigte sich, daß die Transformante das chimäre Plasmid
einer Größe von etwa 8,3 Kb enthält. Die Transformante, die
dieses chimäre Plasmid enthält, wurde mit dem Elternstamm
verglichen, der selbiges für das Vermögen einer
Essigsäuregärung nicht enthält. Fig. 2 zeigt den Verlauf der Gärung,
die in einem 5-1-Miniaturbehälter durchgeführt wurde.
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Das in BEISPIEL 2 verwendete YPG-Agarmedium, das außerdem
geeignete Mengen Ethanol und Essigsäure enthielt, wurde als
Gärungsmedium eingesetzt, mit dem der Behälter in einer
Menge von 3,1 beschickt wurde. Die Gärung wurde unter
Schütteln (500 upm) bei 30 ºC und Belüften (0,2 vvm)
durchgeführt. Tabelle 1 zeigt die Daten der relativen
Wachstumsgeschwindigkeit der mikrobiellen Zellen, die
Geschwindigkeit der Essigsäurebildung für eine
Volumeneinheit und die endgültige Essigsäurekonzentration. Wie aus
der Tabelle ersehen werden kann, verhält sich die
Transformante unter allen drei Kriterien weitaus besser als
der Elternstamm. Ein Test auf kdntinuierliche Gärung mit
einer Säurekonzentration von 4 % zeigte, daß ein
Gleichgewichtszustand bei einer Zufuhrgeschwindigkeit von 150 ml/h
beim Elternstamm erreicht war, während mit der Transformante
eine kontinuierliche Gärung bis zu einer
Zufuhrgeschwindigkeit von 250 ml/h durchgeführt werden konnte.
Tabelle 1
Elternstamm
Transformante
relative Wachstumsgeschwindigkeit
Säurebildungsgeschwindigkeit
Säure-Endkonzentration
(1): bei 3 % Säurekonzentration
(2): bei 2 % Säurekonzentration
BEISPIEL 4
Bestimmung der Basen- und Aminosäuresequenzen des
Strukturgens für die membrangebundene Aldehyd-Dehydrogenase
-
Die Transformante E. coli AL25, die in BEISPIEL 1 erhalten
worden war, wurde durch das alkalische Lyseverfahren
behandelt, und das so extrahierte Plasmid wurde mit EcoRI
gespalten, wobei ein DNA-Fragment von etwa 3,6 Kb isoliert
wird, das eine wie in Fig. 1 gezeigte
Restriktionsenzymspaltungskarte besaß. Seine Basensequenz wurde durch das
Didesoxyverfahren unter Verwendung des M13-Phagen ("Methods
in Enzymology", 10, 20, 1983, Academic Press, New York)
bestimmt. Aus dieser Basensequenz wurde eine
Translationsregion
gefunden, die mit dem Startkodon ATG beginnt und aus
2 349 Basen besteht, die für 773 Aminosäuren
(Gesamtmolekulargewicht: 84 135) kodieren, wie in Fig. 3 gezeigt.
Die aus der vorstehenden Basensequenz bestimmte
Aminosäuresequenz ist in den unteren Zeilen in Fig. 3 gezeigt. Die
Identität des durch die Basensequenz in Fig. 3 gezeigten
Polypeptids mit der erfindungsgemäßen membrangebundenen
Aldehyd-Dehydrogenase wurde durch die Tatsache bestätigt,
daß die 10-Aminosäuresequenzen auf der Seite des
Aminoterminus (Asn-Gln-Ile-Phe-Pro-Leu-Asp-Arg-Ser-Leu), bestimmt
durch Edman-Abbau von gereinigter ALDH, vollständig mit der
Aminosäuresequenz von der 45. Säure auf der Seite des
Aminoterminus übereinstimmt, die in Fig. 3 gezeigt ist. Die
Aminosäuresequenz bis zu der 44. Säure, die in der durch den
Edman-Abbau bestimmten Sequenz gefunden wurde, wird als
Region betrachtet, die an der Sekretion der
membrangebundenen Aldehyd-Dehydrogenase beteiligt ist.