DE10352668A1

DE10352668A1 - Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Methylotrophen

Info

Publication number: DE10352668A1
Application number: DE10352668A
Authority: DE
Inventors: Yoshiya Kawasaki Gunji; Hisashi Kawasaki Yasueda
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2002-11-20
Filing date: 2003-11-11
Publication date: 2004-08-12
Also published as: CN1618970A; FR2847264A1; US20040146974A1; US7439038B2; JP2004166592A

Abstract

DNA, die eine Mutante des LysE-Proteins oder ein homologes Protein davon codiert, aus einem Coryneform-Bakterium, wobei die Mutante bei Einführung in ein Methanol-assimilierendes Bakterium eine Resistenz gegen ein L-Lysin-Analogon verleiht. Die für eine Mutante des LysE-Proteins oder ein homologes Protein hiervon codierende DNA wird in ein Methanol-assimilierendes Bakterium eingeführt, um die L-Lysin- und L-Arginin-Produktivität des Methanol-assimilierenden Bakteriums zu verbessern.

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein mikrobentechnisches Verfahren, das zur Herstellung von Aminosäuren geeignet ist, und insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin oder L-Arginin durch Fermentation. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen Mikroorganismus, der für das Herstellungsverfahren verwendbar ist.
Stand der Technik
L-Aminosäuren wie L-Lysin, L-Glutaminsäure, L-Threonin, L-Leucin, L-Isoleucin, L-Valin und L-Phenylalanin werden industriell durch Fermentation unter Verwendung von Mikroorganismen hergestellt, die zur Gattung Brevibacterium, Corynebacterium, Bacillus, Escherichia, Streptomyces, Pseudomonas, Arthrobacter, Serratia, Penicillium, Candida usw. gehören. Bakterienstämme, die aus der Natur isoliert werden, oder künstliche Mutanten dieser Bakterienstämme werden häufig verwendet, um die Produktivität dieser Mikroorganismen zu verbessern. Weiterhin sind verschiedene Verfahren zur Steigerung der L-Aminosäureproduktion von diesen Stämmen durch Erhöhung der Aktivität von L-Aminosäure-Biosyntheseenzymen unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken offenbart worden.
Die L-Aminosäureproduktion ist durch Züchten von Mikroorganismen wie den oben Erwähnten und den sich ergebenden Verbesserungen der Herstellungsverfahren beträchtlich erhöht worden. Um jedoch in der Zukunft auf weitere Steigerungen des Bedarfs zu reagieren, ist die Entwicklung von Verfahren, welche eine effizientere Herstellung von L-Aminosäuren bei niedrigeren Kosten bereitstellen, immer noch eindeutig notwendig, und stellt daher ein Bedürfnis in der Technik dar.
Methanol ist ein bekanntes Fermentations-Ausgangsmaterial, welches in großen Mengen bei geringen Kosten erhältlich ist. Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren durch Fermentation unter Verwendung von Methanol sind bekannt und beinhalten Verfahren unter Verwendung von Mikroorganismen, die zu der Gattung Achromobacter oder Pseudomonas (offengelegte japanische Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 45-25273), Protaminobacter (japanische Patentveröffentlichung (Kokoku) Nr. 49-125590), Protaminobacter oder Methanomonas (offengelegte japanische Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 50-25790), Mikrocyclus (offengelegte japanische Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 52-18886), Methylobacillus (offengelegte japanische Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 4-91793), Bacillus (offengelegte japanische Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 3-505284) usw. gehören. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren durch Züchten von Bakterien entwickelt, die zur Gattung Methylophilus und Methylobacillus gehören, wobei künstliche Mutagenese- und rekombinante DNA-Techniken verwendet werden (internationale Veröffentlichung WO00/61723; offengelegte japanische Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 2001-120269).
In den letzten Jahren wurden Proteine identifiziert, die eine Funktion des spezifischen Ausscheidens einer L-Aminosäure zur Außenseite einer Zelle oder eines Mikroorganismus aufweisen, sowie die Gene, welche diese Proteine codieren. Insbesondere haben Vrljic et al. ein Gen identifiziert, das an der Sekretion von L-Lysin aus einem Corynebacterium-Bakterium zur Außenseite einer Zelle beteiligt ist (Molecular Microbiology 22:815-826 (1996)). Dieses Gen wurde als lysE bezeichnet, und es wurde berichtet, dass die L-Lysinproduktionsfähigkeit von Corynebacterium-Bakterien verbessert werden konnte, indem die Expression dieses Gens in den Bakterien verstärkt wurde (internationale Veröffentlichung WO97/23597). Es ist weiterhin bekannt, dass die Herstellung verschiedener Arten von L-Aminosäuren durch Erhöhung der Expressionsmengen von Aminosäure-sekretierenden Proteinen in Escherichia coli verbessert werden kann (offengelegte japanische Patentveröffentlichung Nr. 2000-189180). Es wurde beispielsweise berichtet, dass die Herstellung von Cystin, Cystein usw. durch Verstärkung der Expression des ORF306-Gens in Escherichia coli verbessert werden kann (europäische Offenlegungsschrift Nr. 885962).
Es gibt jedoch bisher keine Berichte zur Verbesserung der L-Aminosäureproduktion durch Erhöhung ihrer Sekretion während der Fermentation von Methanol-assimilierenden Bakterien.
Weiterhin ist von keinem Aminosäure-Sekretionsgen berichtet worden, welches eine Sekretionsaktivität in Methanol-assimilierenden Bakterien aufweist.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur effizienten Herstellung von L-Lysin oder L-Arginin unter Verwendung von Methanol, welches im Überfluss und preisgünstig erhältlich ist, bereitzustellen.
Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, eine DNA bereitzustellen, die für eine Mutante des LysE-Proteins oder ein homologes Protein hiervon eines Coryneform-Bakteriums codiert, wobei die Mutante oder das homologe Protein davon bei Einführung in ein Methanol-assimilierendes Bakterium eine Resistenz gegenüber einem L-Lysin-Analogon verleiht.
Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, eine DNA wie oben angegeben bereitzustellen, wobei die Mutante ein Protein ist, das durch die folgenden (A) oder (B) definiert ist: (A) ein Protein, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist, wobei mindestens der Glycinrest an Position 56 durch eine andere Aminosäure ersetzt ist, oder (B) ein Protein, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist, wobei zumindest der Glycinrest an Position 56 durch eine andere Aminosäure ersetzt ist, und ein oder mehrere Aminosäurereste an anderen Positionen als dem 56. Rest substituiert, deletiert, insertiert oder addiert sind, und die Mutante bei Einführung in ein Methanol-assimilierendes Bakterium eine Resistenz gegen ein L-Lysin-Analogon verleiht.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, die oben angegebene DNA bereitzustellen, wobei die DNA aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus A) einer DNA mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1, wobei eine Mutation zum Austausch mindestens des 56. Glycinrests des codierten Proteins mit einem anderen Aminosäurerest führt, oder B) einer DNA, die mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 unter stringenten Bedingungen oder mit einer aus der Nukleotidsequenz hergestellten Sonde hybridisierbar ist, welche bei Einführung in ein Methanol-assimilierendes Bakterium eine Resistenz gegen ein L-Lysin-Analogon verleiht.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, die oben angegebene DNA bereitzustellen, wobei der andere Aminosäurerest ein Serinrest ist.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, die oben angegebene DNA bereitzustellen, wobei das L-Lysin-Analogon S-(2-Aminoethyl)cystein ist.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, die oben angegebene DNA bereitzustellen, wobei das Methanol-assimilierende Bakterium ein Bakterium ist, das zu der Gattung Methylophilus oder Methylobacillus gehört.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Bakterium bereitzustellen, das zu der Gattung Methylophilus oder Methylobacillus gehört, in welches die oben beschriebene DNA in einer exprimierbaren Form eingeführt ist, und welches eine Fähigkeit zur Produktion von L-Lysin oder L-Arginin aufweist.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin oder L-Arginin bereitzustellen, welches die Schritte umfasst: A) Kultivieren des oben beschriebenen Bakteriums in einem Medium, um L-Lysin oder L-Arginin in der Kultur anzuhäufen, und B) Gewinnen von L-Lysin oder L-Arginin aus der Kultur.
Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, das oben angegebene Verfahren bereitzustellen, bei dem das Medium Methanol als Hauptkohlenstoffquelle enthält.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die L-Aminosäureproduktivität von Methanol-assimilierenden Bakterien, insbesondere die Produktivität von L-Lysin und L-Arginin, verbessert werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt eine Karte eines Plasmids pRStac mit dem tac-Promoter und eines Plasmids pRSlysE, welches durch Insertieren des lysE-Gens in pRStac konstruiert wurde.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben ausgiebige Untersuchungen durchgeführt, um die oben angegebenen Gegenstände der vorliegenden Erfindung zu erreichen. Zunächst haben sie gefunden, dass wenn eine L-Aminosäure, insbesondere L-Lysin oder L-Arginin, unter Verwendung von Methanol-assimilierenden Bakterien hergestellt wird, insbesondere Bakterien, die zur Gattung Methylophilus und Methylobacillus gehören, der extrazelluläre Sekretionsprozess dieser L-Aminosäuren nicht erfolgreich war. Dann konnten die Erfinder erfolgreich Gene erhalten, welche eine Aktivität der Sekretion von Aminosäuren insbesondere in diesen Mikroorganismen zeigten, und fanden so, dass Aminosäuren effizient unter Verwendung der so erhaltenen Gene hergestellt werden konnten.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung führten das schon bekannte lysE-Gen des Corynebacterium Bakteriums in ein Methanol-assimilierendes Bakterium ein und untersuchten dessen Wirkung auf die Aminosäureproduktion. Es wurde gefunden, dass die Einführung des lysE-Gens in ein Methanol-assimilierendes Bakterium zu einer Mutation oder Deletion führte und lysE somit nicht funktionierte. Für die Sekretion verantwortliche Proteine müssen typischerweise zur Erfüllung ihrer Funktion in die Zellmembran einbezogen werden. Daher müssen die Protein- und Membranbedingungen, wie die Lipidzusammensetzung, füreinander geeignet sein. Es wurde gefolgert, dass es schwierig wäre, ein heterologes Membranprotein wie LysE so zu exprimieren, dass das Protein funktionieren kann, wobei diese Folgerung durch das zuvor erwähnte Ergebnis gestützt wurde.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben daher bei der Untersuchung des zuvor erwähnten L-Aminosäure-Sekretionsgens ein mutiertes Gen gefunden, das in einem Methanol-assimilierenden Bakterium funktionierte. Weiterhin fanden sie einen ausgeprägten Effekt bei Verwendung dieses mutierten Gens in der Aminosäureproduktion unter Verwendung von Methanol-assimilierenden Bakterien. Sie setzten die Forschungen weiter fort und erhielten erfolgreich eine Vielzahl mutierter Gene, welche in Methanol-assimilierenden Bakterien funktionieren.
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung ausführlich beschrieben.
DNA der vorliegenden Erfindung
Die DNA der vorliegenden Erfindung codiert eine Mutante des LysE-Proteins oder ein homologes Protein des LysE-Proteins, abgeleitet aus einem Coryneform-Bakterium, welches bei Einführung in ein Methanol-assimilierendes Bakterium die Funktion des LysE-Proteins zeigt.
Der hier verwendete Begriff „Funktion des LysE-Proteins" bedeutet mindestens eine der wie folgt definierten Funktionen (1 und/oder 2):

(1) Die Funktion, bei Expression in einem Methanol-assimilierenden Bakterium bei Einführung der zuvor erwähnten DNA, welche die Mutante codiert, eine Resistenz gegen ein L-Lysin-Analogon zu verleihen. Der Begriff, dem Bakterium „eine Resistenz gegen ein L-Lysin-Analogon" zu verleihen, bedeutet, so wie er hier verwendet wird, dass bei Einführung der zuvor erwähnten, die LysE-Mutante codierenden DNA in das zuvor erwähnte Methanol-assimilierende Bakterium, das Bakterium in der Lage ist, in Gegenwart einer höheren Konzentration von L-Lysin-Analoga zu wachsen im Vergleich mit Bakterien, welche die DNA nicht enthalten, beispielsweise Wild-Typ-Stämme der Methanol-assimilierenden Bakterien. Beispielsweise wird, wenn nach Kultivierung für einen bestimmten Zeitraum auf einem Agarmedium, das ein L-Lysin-Analogon bei einer bestimmten Konzentration enthält, ein transformierter Stamm des Methanol-assimilierenden Bakteriums, in den die oben erwähnte DNA eingeführt wurde, Kolonien bildet, jedoch ein nichttransformierter Stamm keine Kolonien bildet, dem erwähnten trans-formierten Stamm eine Resistenz gegen das L-Lysin-Analogon verliehen. Ein Beispiel des L-Lysin-Analogons ist S-(2-Amino-ethyl)cystein.
(2) Die Funktion der Verstärkung der extrazellulären Sekretion eines oder beider von L-Lysin oder L-Arginin, wenn die erwähnte Mutante in ein Methanol-assimilierendes Bakterium eingeführt wird. Der hier verwendete Ausdruck „Verstärkung der extrazellulären Sekretion eines oder beider von L-Lysin oder L-Arginin" bedeutet, dass wenn ein Methanol-assimilierendes Bakterium, das die DNA der vorliegenden Erfindung enthält, kultiviert wird, die Menge eines oder beider von L-Lysin oder L-Arginin, die in ein Medium sekretiert werden, im Vergleich zu einem Methanol-assimilierenden Bakterium, welches die DNA der vorliegenden Erfindung nicht enthält, erhöht ist. Die Verstärkung der extrazellulären Sekretion der L-Aminosäure wird durch eine erhöhte Konzentration der während der Kultivierung eines die DNA der vorliegenden Erfindung enthaltenden Methanol-assimilierenden Bakteriums, indem Medium akkumulierten Aminosäure, im Vergleich mit einem Methanol-assimilierenden Bakterium, das die DNA der vorliegenden Erfindung nicht enthält, beobachtet, was ein Ergebnis der Einführung der DNA ist. Weiterhin kann die Verstärkung der extrazellulären Sekreteion der L-Aminosäure auch beobachtet werden, wenn eine verminderte intrazelluläre L-Aminosäure-konzentration bei Einführung der DNA der vorliegenden Erfindung in ein Methanol-assimilierendes Bakterium beobachtet wird.

In der vorliegenden Erfindung bedeutet Methanol-assimilierendes Bakterium, das heißt Methylotroph, ein Bakterium, welches unter Verwertung von Methanol als Hauptkohlenstoffquelle wachsen kann, und in welchem die Funktion des LysE-Proteins exprimiert wird, wenn die DNA der vorliegenden Erfindung eingeführt wurde. Spezifische Beispiele sind Methylophilus-Bakterien wie Methylophilus methylotrophus, und Methylobacillus-Bakterien wie Methylobacillus glycogenes und Methylobacillus flagellatum.
Beispiele für Methylophilus methylotrophus sind der AS1-Stamm (NCFMB10515) usw., sind jedoch nicht hierauf beschränkt. Der Methylophilus methylotrophus AS1-Stamm (NCIMB10515) ist erhältlich von der National Collections of Industrial and Marine Bacteria (Adresse: NCIMB Lts., Torry Research Station, 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom).
Beispiele für Methylobacillus glycogenes sind der T-11-Stamm (NCIMB 11375), ATCC 21276-Stamm, ATCC 21371-Stamm, ATR80-Stamm (beschrieben in Appl. Microbiol. Biotechnol., 42, S. 67-72 (1994)), A513-Stamm (beschrieben in in Appl. Microbiol. Biotechnol., 42, S. 67-72 (1994)) usw., sind jedoch nicht hierauf beschränkt. Der Methylobacillus glycogenes NCIMB 11375-Stamm ist erhältlich von der National Collections of Industrial and Marine Bacteria (Adresse: NCIMB Lts., Torry Research Station, 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom). Beispiele für Methylobacillus flagellatum sind der KT-Stamm (beschrieben in Arch. Microbiol., 149, S. 441-446 (1988)) usw., sind jedoch nicht hierauf beschränkt.
Eine Ausführungsform der DNA der vorliegenden Erfindung ist eine DNA, die für ein Protein codiert, welches die Amino säuresequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist, wobei zumindest der Glycinrest an Position 56 durch einen anderen Aminosäurerest ausgetauscht ist.
Weiterhin ist eine spezifischere Ausführungsform der DNA der vorliegenden Erfindung eine DNA, die für ein Protein codiert, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist und eine der folgenden Mutationen beinhaltet:

(i) Austausch des Glycinrests an Position 56 in SEQ ID NO: 2 durch einen anderen Aminosäurerest;
(ii) Austausch des Glycinrests an Position 56 in SEQ ID NO: 2 durch einen anderen Aminosäurerest und Austausch des Alaninrests an Position 55 in SEQ ID NO: 2 durch einen anderen Aminosäurerest;
(iii) Austausch des Glycinrests an Position 56 in SEQ ID NO: 2 durch einen anderen Aminosäurerest und Austausch des Asparaginsäurerests an Position 137 in SEQ ID NO: 2 durch einen anderen Aminosäurerest.

Spezifische Beispiele des Austauschs an der 56. Position sind der Austausch des Glycinrests durch einen Serinrest, sind jedoch nicht hierauf beschränkt. Spezifische Beispiele des Austauschs an der 55. Position sind der Austausch des Alaninrests durch einen Threoninrest, sind jedoch nicht hierauf beschränkt. Spezifische Beispiele des Austauschs an der 137. Position sind der Austausch des Asparaginsäurerests durch einen Glycinrest, sind jedoch nicht hierauf beschränkt.
Spezifischere Ausführungsformen der DNA der vorliegenden Erfindung, die Proteine mit den erwähnten Austauschen codiert, sind DNA, die als lysE562, lysE564 und lysE565 bezeichnet werden und hier in den Beispielen beschrieben sind. Dieses sind Mutanten von Genen, die aus Brevibacterium lactofermentum als Homologe des für Corynebacterium-Bakterien berichteten lysE-Gens isoliert wurden. Die DNA der vorliegenden Erfindung wird daher auch als „mutiertes lysE" bezeichnet, und das durch die DNA der vorliegenden Erfindung codierte Protein der Einfachheit halber als „mutiertes LysE".
Als für das LysE-Protein von Coryneform-Bakterien codierende DNA ist die Nukleotidsequenz vom Wildtyp-lysE von Brevibacterium lactofermentum in SEQ ID NO: 1 gezeigt, und die Aminosäuresequenz des codierten Proteins ist in SEQ ID NO: 2 gezeigt.
Es wurde gefunden, dass das Glycin an der 56. Position vom Aminoterminus in der Aminosäuresequenz des durch lysE564 codierten Proteins zu Serin verändert war, verglichen mit der durch das Wildtyp-lysE codierten Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2. Es wurde gefunden, dass das Glycin an der 56. Position vom Aminoterminus in der durch lysE564 codierten Aminosäuresequenz des Proteins in Serin und Asparagin an der 137. Position in Glycin umgewandelt wurde, verglichen mit der durch Wildtyp-lysE codierten Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2. Es wurde weiterhin gefunden, dass das Glycin an der 56. Position vom Aminoterminus in der Aminosäuresequenz des durch lysE565 codierten Proteins in Serin umgewandelt wurde und das Alanin an der 55. Position in Threonin umgewandelt wurde, verglichen mit der durch Wildtyp-lysE codierten Aminosäuresequenz. Es wurde gefunden, dass der gemeinsame Mutationspunkt der Austausch von Glycin mit Serin an der 56. Position war. Es wurde ermittelt, dass die Veränderung an dieser Position wichtig war, insbesondere zur Herstellung eines Sekretionsträgers, welcher eine Aktivität der Sekretion von L-Lysin in einem Methylotroph aufweist.
Die DNA der vorliegenden Erfindung kann eine Aminosäuresequenz codieren, einschließlich einer Substitution, Deletion, Insertion oder Addition eines oder mehrerer Aminosäurereste an anderen Positionen als der 55., 56. und 137. Position, solange die codierte Mutante lysE eine der erwähnten Mutationen aufweist und die Funktion des lysE-Proteins in einem Methanol-assimilierenden Bakterium ausübt. Der hier verwendete Begriff „mehrere" variiert in Abhängigkeit der Positionen der Aminosäurereste in der dreidimensionalen Struktur des Proteins und der Aminosäuretypen. Er bedeutet jedoch bevorzugt 2 bis 10 Aminosäurereste, bevorzugter 2 bis 5 und am bevorzugtesten 2 bis 3.
Eine DNA, die für ein Protein codiert, das im Wesentlichen identisch zu der erwähnten Mutante LysE ist, kann durch Modifizieren der Nukleotidsequenz des mutierten lysE erhalten werden. Beispielsweise kann eine ortsgerichtete Mutagenese eingesetzt werden, so dass eine Substitution, Deletion, Insertion oder Addition eines Aminosäurerests oder von Aminosäureresten an einem bestimmten Ort auftritt. Weiterhin kann eine wie oben beschrieben modifizierte DNA auch durch herkömmlicherweise bekannte Mutationsbehandlungen erhalten werden. Beispiele solcher Mutationsbehandlungen sind ein Verfahren der Behandlung der DNA vor der Mutationsbehandlung in vitro mit Hydroxylamin oder Ähnlichem, ein Verfahren der Behandlung eines Mikroorganismus, beispielsweise eines Escherichia-Bakteriums, der DNA enthält, vor der Mutationsbehandlung mit Ultraviolettstrahlen-Bestrahlung oder mit einem Mutagenesemittel, das in einer üblichen Mutationsbehandlung verwendet wird, wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) oder salpetrige Säure usw. Diese Verfahren sind in Sambrook, J., Fritsch, E.F., und Maniatis, T., „Molecular Cloning A Labratory Manual, 2. Ausgabe", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) usw. beschrieben.
Eine DNA, die für ein Protein codiert, das im Wesentlichen zu dem mutierten LysE identisch ist, kann durch Expression einer DNA, die eine der oben erwähnten Mutationen enthält, in einem Methanol-assimilierenden Bakterium und Untersuchen der Aktivität des Expressionsprodukts, erhalten werden.
In der vorliegenden Erfindung sind die Positionen der Aminosäurereste nicht notwendigerweise absolute Positionen in jedem LysE-Protein, sondern Positionen in Relation zu den Positionen in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2. Wenn beispielsweise ein Aminosäurerest an der N-Terminusseite der 56. Position in der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 deletiert ist, wird der zuvor erwähnte 56. Aminosäurerest der 55. Aminosäurerest vom N-Terminus. In diesem Fall ist dies der „56." Aminosäurerest, da der 55. Aminosäurerest vom N-Terminus ein Aminosäurerest ist, welcher dem 56. Aminosäurerest in SEQ ID NO: 2 entspricht.
Die das LysE-Protein eines Coryneform-Bakteriums oder dessen homologe Proteine codierende DNA, d.h. das lysE-Gen oder dessen homologes Gen, können von irgendeinem Mikroorganismus erhalten werden, solange der Mikroorganismus Varianten von Genen aufweist, die die L-Lysin-Sekretionsaktivität in einem Methanol-assimilierenden Bakterium exprimieren können. Insbesondere sind Beispiele solcher Mikroorganismen Coryneform-Bakterien, wie Corynebacterium glutamicum und Brevibacterium lactofermentum, Escherichia-Bakterien wie Escherichia coli, Pseudomonas-Bakterien wie Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium-Bakterien wie Mycobacterium tuberculosis usw., sind jedoch nicht hierauf beschränkt.
Beispiele des zu lysE homologen Gens beinhalten eine für ein Protein codierende DNA, welche mit einer Sonde mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 oder einem Teil hiervon unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist, und ein Protein codiert, welches die Funktion des LysE-Proteins in einem Methanol-assimilierenden Bakterium als Ergebnis der zuvor erwähnten Aminosäuresubstitution aufweist. Die zuvor erwähnten „stringenten Bedingungen" sind ein Zustand, in dem ein sogenanntes spezifisches Hybrid gebildet wird und ein nicht-spezifisches Hybrid nicht gebildet wird. Es ist schwierig, diese Bedingungen durch einen numerischen Wert auszudrücken. Die stringenten Bedingungen beinhalten jedoch beispielsweise eine Bedingung, bei der DNA mit hoher Homologie, beispielsweise DNA mit einer Homologie von 80 % oder mehr, bevorzugt 90% oder mehr, bevorzugter 95% oder mehr, miteinander hybridisieren, wohingegen DNA mit einer niedrigeren Homologie als oben nicht miteinander hybridisieren. Alternativ werden die stringenten Bedingungen beispielhaft durch Bedingungen angegeben, bei denen DNA miteinander bei einer Salzkonzentration bei üblichen Waschbedingungen bei der Southern-Hybridisierung hybridisieren, d.h. 1 × SSC, 0,1 SDS, bevorzugt 0,1 × SSC, 0,1 % STS, bei 60°C.
Eine Teilsequenz der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 kann ebenfalls als Sonde verwendet werden. Sonden können durch PCR unter Verwendung von Oligonukleotiden, basierend auf der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1, als Primer und eines DNA-Fragments, welche die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 als Templat enthält, hergestellt werden. Wenn ein DNA-Fragment von ungefähr 300 bp als Sonde verwendet wird, können die Waschbedingungen der Hybridisierung beispielsweise 2 × SSC, 0,1 % SDS bei 50°C sein.
Um die Expression des mutierten lysE-Gens in einem Methanol-assimilierenden Bakterium wie Methylophilus-Bakterien oder Methylobacillus-Bakterien zu verstärken, kann das das mutierte lysE-Gen enthaltende Genfragment an einen Vektor ligiert werden, der in einem Methanol-assimilierenden Bakterium funktioniert, bevorzugt einen Vektor mit hoher Kopienzahl, um eine rekombinante DNA herzustellen, und verwendet werden, um einen Wirt, wie beispielsweise ein Methanol-assimilierendes Bakterium, zu transformieren. Alternativ kann die lysE-Genmutante in ein Transposon einbezogen werden und in das Chromosom eingeführt werden. Weiterhin kann ein Promoter, der eine potente Transkription in einem Methanol-assimilierenden Bakterium induziert, stromaufwärts der lysE-Genmutante ligiert werden.
Die Referenz WO97/23597 offenbart lysE und zeigt nur das lysE-Gen des Coryneform-Bakteriums, das in ein Coryneform-Bakterium eingeführt wurde. Weiterhin wird nur L-Lysin als sekretierte Aminosäure erwähnt, und es wird ein neues Proteinsekretionssystem offenbart, einschließlich LysE mit einer Struktur, die sechs Transmembranhelices enthält. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung bestätigten jedoch, dass aus Coryneform-Bakterien stammendes LysE in Methanol-assimilierenden Bakterien überhaupt nicht funktionierte.
Weiterhin ist der erhaltene Faktor ein neuer L-Lysinsekretionsträger bzw. -Carrier, der eine Substitutionsmutation einer Aminosäure an einem bestimmten Ort beinhaltet, wobei ein solcher Faktor anhand der bisherigen lysE betreffenden Patentbeschreibungen nicht abgeleitet werden kann.
Methanol-assimilierendes Bakterium der vorliegenden Erfindung
Das Methanol-assimilierende Bakterium der vorliegenden Erfindung ist ein Methanol-assimilierendes Bakterium, in welches die zuvor erwähnte DNA der vorliegenden Erfindung in exprimierbarer Form eingeführt wurde, und welches eine L-Lysin- oder L-Arginin-Produktionsfähigkeit aufweist. Das Methanol-assimilierende Bakterium der vorliegenden Erfindung kann erhalten werden, indem die DNA der vorliegenden Erfindung in ein Methanol-assimilierendes Bakterium mit L-Lysin- oder L-Arginin-Produktionsfähigkeit eingeführt wird. Das Methanol-assimilierende Bakterium der vorliegenden Erfindung kann weiterhin erhalten werden, indem einem Methanol-assimilierenden Bakterium, in welches die DNA der vorliegenden Erfindung eingeführt wurde, eine L-Lysin oder L-Arginin-Produktionsfähigkeit verliehen wird. Weiterhin kann das Methanol-assimilierende Bakterium der vorliegenden Erfindung ein Bakterium sein, dem durch Einführen der DNA der vorliegenden Erfindung in exprimierbarer Form die L-Lysin- oder L-Arginin-Produktionsfähigkeit verliehen wurde.
Beispiele des Methanol-assimilierenden Bakteriums sind die erwähnten Methylophilus-Bakterien oder Methylobacillus-Bakterien, sind jedoch nicht hierauf eingeschränkt.
Ein Methanol-assimilierendes Bakterium mit L-Lysin- oder L-Arginin-Produktionsfähigkeit kann erhalten werden, indem einem Wildtyp-Stamm eines Methanol-assimilierenden Bakteriums eine L-Lysin- oder L-Arginin-Produktionsfähigkeit verliehen wird. Um die L-Lysin- oder L-Arginin-Produktionsfähigkeit zu verleihen, können Verfahren eingesetzt werden, die üblicherweise zum Züchten von Coryneform-Bakterien, Escherichia-Bakterien usw, verwendet werden. Beispielsweise beinhalten solche Verfahren den Erwerb bzw. die Beschaffung auxotropher Mutantenstämme, Analogon-resistenter Stäämme oder von Stämmen mit mutierter Stoffwechselregulierung, die Bildung rekombinanter Stämme, in welchen ein L-Lysin- oder L-Arginin-Biosynthesesystemenzym verstärkt ist (siehe „Amino Acid Fermentation", the Japan Scientific Societies Press [Gakkai Shuppan Center], 1. Auflage, veröffentlicht am 30. Mai 1986, S. 77 bis 100) usw., sind jedoch nicht hierauf beschränkt. Die Eigenschaften der Auxotrophie, Analogon-Resistenz, Mutation der Stoffwechselregulierung usw. können einzeln verliehen werden, oder zwei oder mehrere können in Kombination beim Züchten von L-Lysin- oder L-Argininerzeugenden Bakterien verliehen werden. Das Biosynthesesystemenzym kann einzeln verstärkt werden, oder zwei oder mehrere hiervon können in Kombination verstärkt werden. Weiterhin kann das Versehen mit Eigenschaften, einschließlich Auxotrophie, Analogon-Resistenz, Mutation der Stoffwechselregulierung usw. mit der Verstärkung des Biosynthesesystemenzyms kombiniert werden.
Zum Beispiel können L-Lysin-erzeugende Bakterien so gezüchtet werden, dass sie auxotroph für L-Homoserin oder L-Threonin und L-Methionin sind (japanische Patentveröffentlichungen Nrn. 48-28078 und 56-6499) oder auxotroph für Inositol oder Essigsäure sind (offengelegtes japanisches Patent Nrn. 55-9784 und 56-8692), oder resistent gegen Oxalysin, Lysin-hydroxamat, S-(2-Aminoethyl)-cystein, γ-Methyllysin, α-Chlorcaprolactam, DL-α-Amino-ε-caprolactam, α-Amino-lauryllactam, einem Asparaginsäure-Analogon, einem Sulfa-Arzneimittel, einem Chinoid oder N-Lauroylleucin sind.
L-Arginin-erzeugende Bakterien können so gezüchtet werden, dass sie resistent gegen ein bestimmtes Mittel sind, beispielsweise ein Sulfa-Arzneimittel, 2-Thiazolalanin; α-Amino-β-hydroxyvaleriansäure oder ähnliche; auxotroph für L-Histidin, L-Prolin, L-Threonin, L-Isoleucin, L-Methionin oder L-Tryptophan zusätzlich zur Resistenz gegen 2-Thiazolalanin (japanische Patentoffenlegung Nr. 54-44096); resistent gegen Ketomalonsäure, Fluormalonsäure oder Monofluoressigsäure (japanische Patentoffenlegung Nr. 57-18989); resistent gegen Argininol (japanische Patentoffenlegung Nr. 62-24075); resistent gegen X-Guanidin (X bezeichnet ein Derivat einer Fettsäure oder eine aliphatische Kette, japanische Patentoffenlegung Nr. 2-186995); resistent gegen 5-Azauracil, 6-Azaurazil, 2-Thiouracil, 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Azacytosin, 6-Azacytosin usw.; resistent gegen Rrginin-hydroxamat und 2-Thiouracil; resistent gegen Argininhydroxamat und 6-Azauracil (siehe japanische Patentoffenlegung Nr. 57-150381); resistent gegen ein Histidin-Analogon oder Tryptophan-Analogon (siehe japanische Patentoffenlegung Nr. 52-114092); auxotroph für mindestens eines von Methionin, Histidin, Threonin, Prolin, Isoleucin, Lysin, Adenin, Guanin und Uracil (oder einem Uracil-Vorläufer) (siehe japanische Patentoffenlegung Nr. 52-99289); resistent gegen Arginin-hydroxamat (siehe japanische Patentveröffentlichung Nr. 51-6754); auxotroph für Succinsäure oder resistent gegen ein Nukleinsäurebasenanalogon (siehe japanische Patentoffenlegung Nr. 58-9692); nicht in der Lage, Arginin zu metabolisieren und resistent gegen einen Arginin-Antagonisten und Canavanin und auxotroph für Lysin (siehe japanische Patentoffenlegung Nr. 52-8729); resistent gegen Arginin, Argininhydroxamat, Homoarginin, D-Arginin und Canavanin oder resistent gegen Argininhydroxamat und 6-Azauracil (siehe japanische Patentoffenlegung Nr. 53-143288); resistent gegen Canavanin (siehe japanische Patentoffenlegung Nr. 53-3586) usw.
Im Folgenden werden Verfahren zum Verleihen oder Verbessern einer L-Aminosäure-Produktionsfähigkeit durch Verstärken eines L-Aminosäure-Biosyntheseenzymgens beispielhaft beschrieben.
Eine L-Lysin-Produktionsfähigkeit kann beispielsweise verliehen werden, indem die Aktivitäten von Dihydrodipicolinat-synthase und Aspartokinase verstärkt werden. Die Aktivitäten von Dihydrodipicolinatsynthase und Aspartokinase in einem Methanol-assimilierenden Bakterium können verstärkt werden, indem der Methanol-assimilierende Bakterienwirt mit einer rekombinanten DNA transformiert wird, welche durch Ligieren eines die Dihydrodipicolinatsynthase codierenden Genfragments und eines Aspartokinase codierenden Genfragments mit einem Vektor, der in dem Methanol-assimilierenden Bakterium funktioniert, vorzugsweise einem Vektor mit hoher Kopienzahl, ligiert wird. Die Aktivitäten von Dihydrodipicolinatsynthase und Aspartokinase sind als Ergebnis der Erhöhung der Kopienzahl der die Enzyme in dem transformierten Stamm codierenden Gene erhöht. Im Folgenden werden Dihydrodipicolinatsynthase, Aspartokinase und Aspartokinase III auch als DDPS, AK und AKIII bezeichnet.
Jeder Mikroorganismus kann die Gene bereitstellen, welche DDPS und AK codieren, solange der gewählte Mikroorganismus Gene beinhaltet, die eine DDPS-Aktivität und AK-Aktivität in einem Methanol-assimilierenden Bakterium exprimieren können. Solche Mikroorganismen können Wildtyp-Stämme oder davon abgeleitete Mutantenstämme sein. Insbesondere sind Beispiele solcher Mikroorganismen der E. coli (Escherichia coli) K-12-Stamm, der Methylophilus methylotrophus AS1-Stamm (NCIMB 10515) und der Methylobacillus glycogenes T-11-Stamm (NCIMB 11375) usw., sind jedoch nicht hierauf beschränkt. Diese Gene können durch PCR unter Verwendung von Primern erhalten werden, die auf Basis der bekannten Nukleotidsequenzen von DDPS (dapA, Richaud, F. et al., J. Bacteriol., 297 (1986)) und AKIII (lysC, Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G.N. und Patte, J.C., J. Biol. Chem, 261, 1052 (1986)) synthetisiert werden, wobei chromosomale DNA eines Mikroorganismus wie E. coli K-12 als Templat verwendet wird. Spezifische Beispiele sind dapA und lysC, die von E. coli stammen bzw. abgeleitet sind, wie hier erklärt wird.
Bevorzugt unterliegen die in der vorliegenden Erfindung verwendeten DDPS und AK keiner Rückkopplungsinhibierung durch L-Lysin. Es ist bekannt, dass aus E. coli abgeleitete Wildtyp-DDPS einer Rückkopplungshemmung durch L-Lysin unterliegt (siehe US-Patente 5,661,012 und 6,040,160), und dass die von E. coli abgeleitete Wildtyp-AKIII einer Suppression unter Rückkopplungshemmung durch L-Lysin unterliegt. Daher codieren dapA und lysC bevorzugt DDPS und AKIII, die jeweils eine Mutation enthalten, welche die Rückkopplungshemmung durch L-Lysin bei Einführung in ein Methanol-assimilierendes Bakterium ausschaltet. Im Folgenden wird die DDPS, welche eine Mutation enthält, die die Rückkopplungshemmung durch L-Lysin ausschaltet, auch als „mutierte DDPS" bezeichnet, und eine DNA, welche die mutierte DDPS codiert, kann auch als „mutierte dapA" oder „dapA*" bezeichnet werden. Die von E. coli abgeleitete AKIII, welche eine Mutation enthält, die die Rückkopplungshemmung durch L-Lysin ausschaltet, kann auch als „mutierte AKIII" bezeichnet werden, und die DNA, welche die mutierte AKIII codiert, kann auch als „mutiertes lysC" bezeichnet werden.
Es ist in der vorliegenden Erfindung jedoch nicht immer notwendig, dass DDPS und AK mutiert werden. Beispielsweise ist bekannt, dass die von Corynebacterium-Bakterien stammende DDPS keiner Rückkopplungshemmung durch L-Lysin unterliegt (siehe koreanische Patentveröffentlichung Nr. 92-8382, US-Patente 5,661,012 und 6,040,160).
Eine aus E. coli stammende Nukleotidsequenz von Wildtyp-dapA ist beispielhaft in SEQ ID NO: 3 gezeigt, und die durch diese Nukleotidsequenz codierte Aminosäuresequenz der Wildtyp-DDPS ist beispielhaft in SEQ ID NO: 4 gezeigt.
Die DNA, welche die mutierte DDPS codiert, die keiner Rückkopplungshemmung durch L-Lysin unterliegt, kann eine DNA sein, die DDPS mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 codiert, einschließlich des Austausch des Histidinrests an Position 118 von SEQ ID NO: 4 durch einen Tyrosinrest. Weiterhin kann die DNA, welche die Mutante AKIII codiert, die keiner Rückkopplungshemmung durch L-Lysin unterliegt, eine DNA sein, die AKIII mit der Aminosäuresequenz einschließlich des Austauschs von Threonin an Position 352 durch einen Isoleucinrest codiert (hinsichtlich der AKIII-Sequenz siehe US-Patente 5,661,012 und 6,040,160).
Das zum Genklonieren verwendete Plasmid kann irgendein Plasmid sein, solange es sich in Mikroorganismen wie Escherichia-Bakterien replizieren kann. Insbesondere sind Beispiele solcher Bakterien pBR322, pTWV228, pMW119, pUC19 usw.
Vektoren, die in Methylophilus-Bakterien funktionieren, beinhalten beispielsweise ein Plasmid, das sich autonom in Methylophilus-Bakterien replizieren kann. Insbesondere sind Beispiele RSF1010, welches ein Wirtsvektor mit breitem Spektrum ist, sowie Derivate hiervon, pAYC32 (Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D. Plasmid, 16, 161-167 (1986)), pMFY42 (Gene, 44, 53 (1990)), pRP301, pTB70 (Nature, 287, 396, (1980)) usw.
Weiterhin beinhalten Beispiele für Vektoren, die in Methylobacillus-Bakterien funktionieren, beispielsweise ein Plasmid, das sich autonom in Methylobacillus-Bakterien replizieren kann. Spezielle Beispiele sind RSF1010, welches ein Vektor mit breitem Wirtsspektrum ist, sowie Derivate hiervon wie pMFY42 (Gene, 44, 53 (1990)).
Um eine rekombinante DNA über Ligation von dapA und lysC an einen Vektor, der in einem Methanol-assimilierenden Bakterium funktioniert, herzustellen, wird der Vektor mit einem für die Enden eines DNA-Fragments, welches dapA und lysC enthält, geeigneten Restriktionsenzym verdaut. Die Ligation wird üblicherweise unter Verwendung einer Ligase wie T4-DNA-Ligase durchgeführt. Die Gene dapA und lysC können in verschiedene Vektoren oder den gleichen Vektor einbezogen werden.
Ein Plasmid mit breitem Wirtsbereich RSFD80 ist bekannt (WO95/16042) und kann in der vorliegenden Erfindung als das Plasmid mit einem mutierten dapA, das für eine mutierte DDPS codiert und einem mutierten lysC, das für eine mutierte AKIII codiert, verwendet werden. Ein mit diesem Plasmid transformierter E. coli JM109-Stamm wurde als AJ12396 bezeichnet und beim National Institute of Bioscience of Advanced Industrial Science and Technology am 28. Oktober 1993 hinterlegt, wobei eine Zugangsnummer FERM P-13936 erhalten wurde. Dann wurde dieser einer internationalen Hinterlegung unter den Vorschriften des Budapester Vertrags am 1. November 1994 überführt, wobei eine Zugangsnummer FERM BP-4859 erhalten wurde. RSFC80 kann aus dem AJ12396-Stamm durch ein bekanntes Verfahren erhalten werden.
RSFD80 enthält ein mutiertes dapA, wobei die Nukleotidsequenz von Wildtyp-dapA, die in SEQ ID NO: 3 gezeigt ist, an der Position 597 von C in T geändert wurde. Der Histidinrest an Position 118 der Wildtyp DDPS von SEQ ID NO: 4, die durch die Wildtyp-dapA von SEQ ID NO: 3 codiert wird, wird als Ergebnis der obigen Nukleotidänderung in einen Tyrosinrest umgewandelt. Weiterhin enthält RSFD80 ein mutiertes lysC, in dem die Nukleotidsequenz des lysC an der Position 1638 von C zu T verändert wurde. Diese Mutation führt zu der mutierten AKIII, das Threonin an Position 352 ist jedoch zu einem Isoleucin verändert.
Jedes Verfahren kann verwendet werden, um die wie oben hergestellte rekombinante DNR in ein Methylophilus-Bakterium oder Methylobacillus-Bakterium einzuführen, solange eine ausreichende Transformationseffizienz gewährleistet wird. Beispielsweise kann die Elektroporation verwendet werden (Canadian Journal of Microbiology, 42, 197 (1997)).
Die Verstärkung der Expression eines gewünschten Gens kann erreicht werden, indem eine hohe Kopienzahl des Gens auf der chromosomalen DNA eines Methylophilus-Bakteriums eingeführt wird. Vielfache Kopien von dapA und lysC können in die chromosomale DNA eines Methylophilus-Bakteriums durch homologe Rekombination eingeführt werden. Dies kann durchgeführt werden, indem auf eine Sequenz abgezielt wird, die auf chromosomaler DNR in vielfacher Kopienzahl vorliegt. Eine repetitive DNA oder ein invertierter Repeat, der am Ende eines transponiblen Elements vorliegt, kann als Sequenz verwendet werden, die in vielfacher Kopienzahl auf chromosomaler DNA vorliegt. Alternativ können vielfache Kopien des gewünschten Gens in die chromosomale DNA eingeführt werden, indem diese in ein Transposon einbezogen werden und dieses transferiert wird, wie in der japanischen Patentoffenlegung Nr. 2-109985 offenbart ist. Bei beiden Verfahren wird die Aktivität der gewünschten Gene als Ergebnis der erhöhten Kopienzahl der gewünschten Gene in Transformantenstämmen verstärkt.
Neben den obigen Genamplifizierungsverfahren kann die Expression des gewünschten Gens verstärkt werden, indem eine Expressionskontrollsequenz, wie Promoter von dapA und lysC, durch stärkere ausgetauscht werden (siehe japanische Patentoffenlegung Nr. 1-215280). Beispiele starker Promoter beinhalten den lac-Promoter, trp-Promoter, trc-Promoter, tac-Promoter, PR-Promoter und den PL Promoter von Lambdaphagen, den tet-Promoter, amyE-Promoter, spac-Promoter usw. Die Verwendung dieser Promoter verstärkt die Expression des gewünschten Gens, womit die Aktivität des gewünschten Genprodukts verstärkt wird. Solche Genexpressionsverstärkungsverfahren können mit den oben beschriebenen Genamplifizierungsverfahren (Erhöhung der Kopienzahl des gewünschten Gens) kombiniert werden.
Die Herstellung einer rekombinanten DNA kann erreicht werden, indem ein Genfragment und ein Vektor ligiert werden, nachdem der Vektor einmal mit einem Restriktionsenzym verdaut wurde, entsprechend dem Terminus des Genfragments. Die Ligation wird üblicherweise durch eine Ligase wie T4-DNA-Ligase durchgeführt. Die dem Fachmann bekannten gewöhnlichen Verfahren können als Verdauungsverfahren verwendet werden und beinhalten die Ligation von DNA, Herstellung chromosomaler DNA, PCR, Herstellung von Plasmid-DNA, Transformation, Konstruktion von Oligonukleotiden, die als Primer verwendet werden, usw. Solche Methoden sind in Sambrook, J., Fritsch, E.F., und Maniatis, T., „Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2. Ausgabe", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) usw. beschrieben.
Zusätzlich zur Verbesserung der DDPS- und AK-Genexpression oder -Aktivität können auch andere Enzyme, die an der L-Lysin-Biosynthese beteiligt sind, verstärkt werden. Solche Enzyme beinhalten Enzyme des Diaminopimelatwegs, wie Dihydrodipicolinatreduktase, Diaminopimelatdecarboxylase, Diaminopimelatdehydrogenase (siehe WO96/40934 hinsichtlich sämtlicher voranstehender Enzyme), Phosphoenolpyruvatcarboxylase (japanische Patentoffenlegung Nr. 60-87788), Aspartataminotransferase (japanische Patentveröffentlichung Nr. 6-102028), Diaminopimelatepimerase und Asparaginsäure-Semialdehyddehydrogenase, Enzyme des Aminoadipatwegs, wie Homoaconitathydratase usw.
Aspartokinase, Asparaginsäure-Semialdehyddehydrogenase, Dihydrodipicolinatsynthase, Dihydrodipicolinatreductase und Diaminopimelatdecarboxylase, abgeleitet von Methylophilus methylotrophus, sind in WO 00/61723 beschrieben.
Weiterhin können die Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung eine verminderte Aktivität eines Enzyms aufweisen, welches eine Reaktion der Bildung einer anderen Verbindung als L-Lysin durch Abzweigung vom Biosyntheseweg für L-Lysin katalysiert, oder ihnen kann ein solches Enzym fehlen. Illustrative Beispiele des Enzyms, welches eine Reaktion der Bildung einer anderen Verbindung als L-Lysin durch Abzweigung vom Biosyntheseweg für L-Lysin katalysiert, sind Homoserindehydrogenase (siehe WO95/23864).
Die zuvor erwähnten Verfahren zur Erhöhung der Aktivitäten von an der L-Lysin-Biosynthese beteiligten Enzymen können ähnlich für L-Arginin verwendet werden.
Die Fähigkeit zur Produktion von L-Arginin kann verbessert werden, indem die Acetylornithindeacetylaseaktivität, die N-Acetylglutaminsäure-g-semialdehyddehydrogenaseaktivität, N-Acetylglutamokinaseaktivität und Argininosuccinaseaktivität verstärkt werden (siehe japanische Patentveröffentlichung Nr. 5-23750).
Die Fähigkeit zur Produktion von L-Arginin kann weiterhin verbessert werden, indem die Aktivität von Glutamatdehydrogenase ( EP 1 057 893 A1 ), Argininosuccinatsynthase ( EP 0 999 267 A1 ), Carbamoylphosphatsynthetase ( EP 1 026 247 A1 ) oder N-Acetylglutamatsynthase (siehe japanische Patentoffenlegung Nr. 57-5693) verstärkt werden, oder indem das Gen, welches einen Argininrepressor codiert (argR), zerstört wird.
Herstellung von L-Lysin oder L-Arginin
L-Lysin oder L-Arginin können hergestellt werden, indem ein Methanol-assimilierendes Bakterium wie Methylophilus-Bakterien oder Methylobacillus-Bakterien, welche eine L-Lysin- oder L-Arginin Produktionsfähigkeit aufweisen, kultiviert werden. L-Lysin oder L-Arginin können wie oben beschrieben bei der Herstellung und Akkumulation aus dem Medium gewonnen werden. L-Lysin oder L-Arginin können dann aus der Kultur gewonnen werden.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Mikroorganismus kann durch ein Verfahren kultiviert werden, das typischerweise bei der Kultivierung von Methanol-assimilierenden Mikroorganismen verwendet wird. Entweder kann ein natürliches Medium oder ein synthetisches Medium als Medium in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, solange es eine Kohlenstoffquelle enthält, eine Stickstoffquelle, anorganische Ionen und andere organische Bestandteile in Spurenmengen, wenn erforderlich.
Wenn Methanol als Hauptkohlenstoffquelle verwendet wird, können L-Lysin oder L-Arginin bei geringen Kosten hergestellt werden. Bei Verwendung als Hauptkohlenstoffquelle wird Methanol einem Medium in einer Konzentration von 0,001 bis 30% zugegeben. Als Stickstoffquelle werden Ammoniumsulfat usw. dem Medium zugegeben. Zusätzlich hierzu können in Spurenmengen Bestandteile wie Kaliumphosphat, Natriumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisensulfat und Mangansulfat in geringen Mengen zugegeben werden.
Die Kultivierung wird üblicherweise unter aeroben Bedingungen durch Schütteln oder Rühren unter Belüftung durchgeführt, wobei der pH bei 5 bis 9 gehalten wird, und die Temperatur bei 20 bis 45°C gehalten wird, und ist typischerweise nach 24 bis 120 Stunden beendet.
L-Lysin oder L-Arginin können üblicherweise durch eine Kombination eines Ionenaustauschharzverfahrens, Fällungsverfahrens und anderen bekannten Verfahren gewonnen werden.
Beispiele
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung ausführlicher mit Bezug auf die bevorzugten Ausführungsformen beschrieben, die nur beispielhaft angegeben sind.
Wenn nicht anders angegeben, wurden Reagenzien verwendet, die von Wako Pure Chemical Industries oder von Nakarai Tesque hergestellt wurden. Die Zusammensetzungen der in den Beispielen verwendeten Medien sind unten gezeigt. Bei allen Medien wurde der pH mit NaOH, KOH oder HCl eingestellt. LB-Medium:

Bacto trypton (Difco) 10 g/l

Hefeextrakt (Difco) 5g/l

NaCl 10 g/l pH 7,0
Eine Dampfsterilisation wurde bei 120°C für 20 Minuten durchgeführt. LB-Agarmedium: LB-Medium

Bactoagar 15 g/l

Eine Dampfsterilisation wurde bei 120°C für 20 Minuten durchgeführt. SEII-Medium:

K₂HPO₄	1,9 g/l
NaH₂PO₄	1,5 g/l
MgSO₄·7H₂O	0,2 g/l
(NH₄)₂SO₄	5 g/l
CuSO₄·5H₂O	5 μg/l
MnSO₄·5H₂O	25 μg/l
ZnSO₄·7H₂O	23 μg/l
CaCl₂·2H₂O	72 mg/l
FaCl₃·6H₂O	9,7 mg/l
CaCO₃(Kanto Kagaku)	30 g/l
Methanol	2% (v/v)
ph 7,0

Die Bestandteile ausgenommen Methanol wurden einer Dampfsterilisation bei 121°C für 15 Minuten unterzogen, und Methanol wurde zugegeben, nachdem das Medium ausreichend abgekühlt war. SEII-Agarmedium:

K₂HPO₄	1,9 g/l
NaH₂PO₄	1,56 g/l
MgSO₄·7H₂O	0,2 g/l
(NH₄)₂SO₄	5 g/l
CuSO₄·5H₂O	5 μg/l
MnSO₄·5H₂O	25 μg/l
ZnSO₄·7H₂O	23 μg/l
CaCl₂·2H₂O	72 mg/l
FaCl₃·6H₂O	9,7 mg/l
Methanol	0,5% (v/v)
ph 7,0
Bactoagar (Difco)	15 g/l

Andere Bestandteile als Methanol wurden einer Dampfsterilisation bei 121°C für 15 Minuten unterzogen, und Methanol wurde zugegeben, nachdem das Medium ausreichend abgekühlt war.
Beispiel 1
Konstruktion einer Mutanten-lysE-Genbibliothek
Zunächst wurde das lysE-Gen, ein homologes Gen des für Corynebacterium-Bakterien bekannten, die Sekretion von L-Lysin verstärkenden Gens, aus. einem Brevibacterium-Bakterium kloniert, und die Expression des Gens wurde in einem Methylophilus-Bakterium versucht.
(1) Konstruktion von pRSlysE
Um lysE in ein Methylophilus-Bakterium einzuführen, wurde ein bekanntes Plasmid pRS (siehe internationale Patentveröffentlichung in Japanisch (Kohyo) Nr. 3-501682) verwendet, um ein Plasmid pRSlysE zur Expression von lysE zu konstruieren. pRS ist ein Plasmid, welches das Vektorsegment des pVIC40-Plasmids enthält (internationale Patentveröffentlichung WO90/04636, internationale Patent-veröffentlichung in Japanisch Nr. 3-501682) und wird aus pVIC40 erhalten, indem ein DNA-Bereich deletiert wird, der das in dem Plasmid enthaltene Threoninoperon codiert. Das Plasmid pVIC40 stammt aus einem Plasmid eines Vektors mit einem breiten Wirtsspektrum pAYC32 (Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D., Plasmid, 1986, 16, 161-167), welches ein Derivat von RSF1010 ist.
Insbesondere wurde pRS wie folgt konstruiert. Das pVIC40-Plasmid wurde mit EcoRI verdaut und mit einer Phenol/ Chloroform-Lösung versetzt und vermischt, um die Reaktion zu beenden. Nachdem das Reaktionsgemisch zentrifugiert wurde, wurde die obere Schicht gesammelt, und DNA wurde durch Ethanolfällung gewonnen und auf einem 0,8% Agarosegel aufgetrennt. Ein DNA-Fragment von ungefähr 8 Kilobasenpaaren (im Folgenden „kbp"), welches die Vektorseite enthielt, wurde unter Verwendung von EASY TRAP Ver. 2 (DNA collection kit, Takara Shuzo) gewonnen. Das wie oben beschrieben hergestellte Vektorbereiehfragment des pVIC40-Plasmids wurde unter Verwendung des DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo) selbstligiert. Diese Ligationsreaktionslösung wurde verwendet, um Escherichia coli (E. coli JM109 kompetente Zellen, Takara Shuzo) zu transformieren. Die Zellen wurden auf das LB-Agarmedium, welches 20 mg/l Streptomycin enthielt, aufgebracht und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die auf dem Agarmedium erscheinenden Kolonien wurden jeweils in das LB-Flüssigmedium, welches 20 mg/l Streptomycin enthielt, geimpft und 8 Stunden unter Schütteln bei 37°C kultiviert. Plasmid-DNA wurde aus jeder Kulturlösung durch das alkalische SDS- Verfahren extrahiert, und die Struktur jedes Plasmids wurde durch Verdauung mit Restriktionsenzymen bestätigt, wobei pRS erhalten wurde.
Dann wurde ein den tac-Promoter aufweisendes Plasmid pRStac gemäß dem in 1 gezeigten Schema aus pRS konstruiert. Das pRStac-Plasmid wurde wie folgt konstruiert. Der pRS-Vektor wurde mit Restriktionsenzymen EcoRI und PstI verdaut und einer Phenol/Chloroform-Lösung zugegeben und vermischt, um die Reaktion zu beenden. Nachdem das Reaktionsgemisch zentrifugiert wurde, wurde die obere Schicht gesammelt, und DNA wurde durch Ethanolfällung gewonnen und auf einem 0,8 Agarosegel getrennt. Ein DNA-Fragment von 8 Kilobasenpaaren (im Folgenden als „kbp" abgekürzt) wurde unter Verwendung von EASY TRAP Ver. 2 (DNA collection kit, Takara Shuzo) gewonnen. Andererseits wurde der tac-Promoterbereich durch PCR amplifiziert, wobei das pKK223-3-Plasmid (Expressionsvektor, Pharmacia) als Templat sowie die in SEQ ID NO: 7 und 8 gezeigten Primer verwendet wurden (ein Zyklus, bestehend aus Denaturierung bei 94°C für 20 Sekunden, Anneal bei 55°C für 30 Sekunden und Verlängerungsreaktion bei 72°C für 60 Sekunden, wurde für 30 Zyklen wiederholt). Pyrobest DNA-Polymerase (Takara Shuzo) wurde für die PCR verwendet. Das den amplifizierten tac-Promoter enthaltende DNA-Fragment wurde unter Verwendung von PCR prep (Promega) gereinigt und anschließend an den Restriktionsenzymstellen, die zuvor in dem Primern konstruiert wurden, d.h. an den EcoRI- und EcoT22I-Stellen, verdaut. Dann wurde das Reaktionsgemisch einer Phenol/Chloroform-Lösung zugegeben und vermischt, um die Reaktion zu beenden. Nachdem das Reaktionsgemisch zentrifugiert wurde, wurde die obere Schicht gesammelt, und DNA wurden durch Ethanolfällung gewonnen und auf einem 0,8 Agarosegel getrennt. Ein DNA-Fragment von ungefähr 0,15 kbp wurde unter Verwendung von EASY TRAP Ver. 2 gewonnen.
Die Verdauungsprodukte des pRS-Vektors und des tac-Promoterbereichfragments, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, wurden unter Verwendung des DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo) ligiert. Diese Ligationsreaktionslösung wurde verwendet, um Escherichia coli (E. coli JM109 kompetente Zellen, Takara Shuzo) zu transformieren. Die Zellen wurden auf ein LB-Agarmedium, welches 20 mg/l Streptomycin enthielt, plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die auf dem Agarmedium erscheinenden Kolonien wurden jeweils in ein LB-Flüssigmedium geimpft, welches 20 mg/l Streptomycin enthielt, und 8 Stunden unter Schütteln bei 37°C kultiviert. Plasmid-DNA wurde aus jeder Kulturlösung durch das Alkali-SDS-Verfahren extrahiert, und die Struktur jedes Plasmids wurde durch Verdauung mit Restriktionsenzymen bestätigt, wobei pRStac erhalten wurde. Ein Plasmid, bei dem die Transkriptionsrichtungen des Streptomycinresistenzgens auf dem pRS-Vektor und des tac-Promoters zueinander identisch waren, wurde als pRStac ausgewählt.
Das wie oben beschrieben erhaltene pRStac wurde mit Sse8387I (Takara Shuzo) und SapI (New England Biolabs) verdaut, einer Phenol/Chloroform-Lösung zugegeben und vermischt, um die Reaktion zu beenden. Nachdem das Reaktionsgemisch zentrifugiert wurde, wurde die obere Schicht entnommen, und DNA wurden durch Ethanolfällung gewonnen und auf einem 0,8 Agarosegel getrennt, wobei ein DNA-Fragment von ungefähr 9,0 kbp erhalten wurde.
Das lysE-Genfragment wurde ebenfalls mittels PCR unter Verwendung eines Chromosoms, das aus dem Brevibacterium lactofermentum 2256-Stamm (ATCC13869) extrahiert wurde, als Templat, und den in SEQ ID NO: 9 und 10 gezeigten Primern amplifiziert (Denaturierung bei 94°C für 20 Sekunden, Anneal bei 55°C für 30 Sekunden und Verlängerungsreaktion bei 72°C für 90 Sekunden). Pyrobest DNA-Polymerase (Takara Shuzo) wurde für die PCR verwendet. Dabei wurden, um eine Expression des lysE-Gens in einem Methylophilus-Bakterium möglich zu machen, die Primer so konstruiert, dass Nukleotide, die sich 9-15 bp vom Translationsinitiierungscodon des lysE-Gens befanden, durch eine Sequenz ausgetauscht wurden, von der bekannt ist, dass sie in einem Methylophilus-Bakterium funktioniert (Wyborn, N.R., Mills, J., Williamis, S.G. und Jones, C.W., Euro. J. Biochem., 240, 314-322 (1996)). Das erhaltene Fragment wurde unter Verwendung von PCR prep (Promega) gereinigt und dann mit Sse8387I und SapI verdaut. Das Reaktionsgemisch wurde zu einer Phenol/Chloroform-Lösung gegeben und vermischt, um die Reaktion zu beenden. Nachdem das Reaktionsgemisch zentrifugiert wurde, wurde die obere Schicht gesammelt, und DNA wurde durch Ethanolfällung gewonnen und weiter aus einem 0,8 % Agarosegel gewonnen.
Die Verdauungsprodukte des pRStac-Vektors und das wie oben beschrieben hergestellte lysE-Genbereichfragment wurden unter Verwendung des DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo) ligiert. Diese Ligationsreaktionslösung wurde verwendet, um Escherichia coli (E. coli JM109 kompetente Zellen, Takara Shuzo) zu transformieren. Die Zellen wurden auf ein LB-Agarmedium plattiert, das 20 mg/l Streptomycin enthielt, und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die auf dem Agarmedium erscheinenden Kolonien wurden jeweils in ein LB-Flüssig medium, welches 20 mg/l Streptomycin enthielt, geimpft und unter Schütteln 8 Stunden bei 37°C kultiviert. Plasmid-DNA wurde aus jeder Kulturlösung durch das Alkali-SDS-Verfahren extrahiert, und die Struktur jedes Plasmids wurde durch Verdauung mit Restriktionsenzymen und Bestimmung der Nukleotidsequenz bestätigt, wobei pRSlysE erhalten wurde (1). In pRSlysE war das lysE-Gen so positioniert, dass dessen Transkriptionsrichtung die gleiche sein sollte, wie die des tac-Promoters.
(2) Einführung von pRSlysE in ein Methylophilus-Bakterium
Das wie oben beschrieben erhaltene pRSlysE wurde durch Elektroporation (Canadian Journal of Microbiology, 43, 197 (1997)) in den Methylophilus methylotrophus AS1-Stamm (NCIMB10515) eingeführt. Weiterhin wurde pRS auch als Kontrolle auf die gleiche Weise wie für pRSlysE in den AS1-Stramm eingeführt. Als Ergebnis wurden mehrere Tausend Kolonien pro 1 μg DNA bei Verwendung von pRS als Kontrolle erhalten, wohingegen nur einige Kolonien mit pRSlysE erhalten wurden.
Wenn Plasmide aus transformierten Stämmen extrahiert wurden, von denen angenommen wurde, dass in diese pRSlysE eingeführt war, und deren Nukleotidsequenzen untersucht wurden, war bei allen untersuchten Plasmiden eine spontane Mutation in einem lysE-codierenden Bereich eingeführt, und in einigen Fällen war eine Nonsense-Mutation bzw. Nichtsinn-Mutation als Mutation eingeführt, wodurch ein eine Aminosäure codierendes Codon durch ein Stoppcodon ausgetauscht war, was die Translation terminierte. Weiterhin wurde in dem anderen Plasmid die Deletion des lysE-Gens beobachtet. Es wurde angenommen, dass die von solchen Plasmiden getragene lysE-Funktion verloren ging.
Wie oben beschrieben, war die die Einführungshäufigkeit für pRSlysE, welches die volle Länge des lysE-Gens trug, in Methylophilus methylotrophus extrem gering, und nur Plasmide mit einem lysE-mutierten Gen, welches eine Mutation enthielt, die die Funktion ausschaltete, konnten eingeführt werden. Unter Berücksichtigung dieser Tatsachen in Kombination wurde angenommen, dass die Einführung des lysE-Gens in Methylophilus methylotrophus ein letaler Effekt war. Dies weist darauf hin, dass das lysE-Gen nicht universell für die Sekretion von L-Lysin in heterogenen Bakterien wirkt.
Der Methylophilus methylotrophus AS1-Stamm, der das mit einer Mutation eingeführte pRSlysE enthält, wurde auf eine SEII-Platte aufgebracht, welche 50 mg/l Streptomycin enthielt und über Nacht bei 37°C kultiviert. Dann wurden die Zellen von ungefähr 10 cm² der Mediumoberfläche abgekratzt, in das SEII-Hersteilungsmedium (20 ml), das 50 mg/l Streptomycin enthielt, eingeimpft, und bei 37°C für 34 Stunden unter Schütteln kultiviert. Nach Beendigung der Kultivierung wurden die Zellen durch Zentrifugation entfernt und die L-Lysin-Konzentration im Kulturüberstand wurde unter Verwendung eines Aminosäureanalysators bestimmt (Nihon Bunko, Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatographie). Als Ergebnis wurde im Wesentlichen kein Stamm erhalten, in welchem die Sekretion von L-Lysin verstärkt war, trotz Einführung des mutierten lysE-Gens.
Wie oben beschrieben ist, führt die Einführung des von Corynebacterium-Bakterien stammenden schon bekannten lysE- Gens in Methanol-assimilierende Bakterien zu einem letalen Effekt. In den Stämmen, bei denen ein lysE-Gen nur in geringer Zahl eingeführt war, unterlag das eingeführte lysE-Gen einer Mutation oder Defizienz, und lysE funktionierte nicht. Da für die Sekretion von Aminosäuren verantwortliche Proteine nur funktionieren, wenn sie in eine Zellmembran einbezogen werden, müssen die Protein- und Membranbedingungen, wie beispielsweise die Lipidzusammensetzung, gegenseitig geeignet sein. Es wurde daher als schwierig angesehen, ein von einem heterologen Organismus stammendes Membranprotein so zu exprimieren, dass dessen Funktion beibehalten wird. Demgemäß wurde angenommen, dass wenn ein Einführungsverfahren für eine künstliche Mutation verwendet würde, durch welches mehr Mutationen positiv eingeführt werden können als natürliche Mutationen, aus solchen Mutanten ein mutiertes lysE mit L-Lysin-Sekretionsfähigkeit erfolgreich erhalten werden könnte. Auf Grundlage dieses Konzepts wurde eine lysE-Mutantenbibliothek konstruiert, indem ein wie hier beschriebenes Mutationseinführungsverfahren unter Verwendung von Hydroxylamin verwendet wurde.
Weiterhin haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung überlegt, dass wenn ein mutiertes lysE-Gen, welches eine L-Lysin-Sekretionsaktivität in einem Methanol-assimilierenden Bakterium aufweist, in ein Methanol-assimilierendes Bakterium eingeführt wird, der Resistenzgrad gegen AEC (S-(2-Aminoethyl)cystein), einer analogen Verbindung von L-Lysin, erhöht sein könnte. Auf Grundlage dieses Konzepts wurde ein hier beschriebenes Screening-System entwickelt. Zunächst wird die Konstruktion der lysE-Mutantenbibliothek ausführlich beschrieben.
(3) Mutationsbehandlung des pRSlysE-Plasmids
Der E. coli JM109-Stamm, welcher das Wildtyp-lysE tragende pRSlysE-Plasmid (erhältlich von Takara Shuzo) enthält, wurde in das LB-Flüssigmedium eingeimpft, welches 20 mg/l Streptomycin enthielt, und 8 Stunden unter Schütteln bei 37°C kultiviert. Jede Plasmid-DNA wurde aus jeder Kulturlösung durch das alkalische SDS-Verfahren extrahiert.
Anschließend wurde durch ein in vitro Mutationsverfahren unter Verwendung von Hydroxylamin eine Mutation in das hergestellte pRSlysE eingeführt. Das heißt, es wurde eine Lösung, enthaltend 250 mM Kaliumphosphatpuffer, der auf pH 6,0 eingestellt war, 400 mM einer Hydroxylaminlösung, die auf einen pH 6,0 eingestellt war, jeweils als Endkonzentration, und 2 μg des pRSlysE-Plasmids sowie 200 μl zubereitetes Wasser hergestellt und bei 75°C für 2 Stunden oder 3 Stunden inkubiert. Anschließend wurde das pRSlysE-Plasmid aus dieser Lösung unter Verwendung von EASY TRAP Ver. 2 (DNA collection kit, Takara Shuzo) gewonnen. Mit Hydroxylamin für 2 Stunden umgesetzte Plasmide und mit Hydroxylamin für 3 Stunden umgesetzte Plasmide wurden vermischt, um ein Aggregat von pRSlysE-Plasmiden zu erhalten, in welche Mutationen mit verschiedenen Graden eingeführt waren.
Die Anhäufung der wie oben beschrieben erhaltenen mutierten pRSlysE-Plasmide, von denen angenommen wurde, dass Mutationen an verschiedenen Positionen eingeführt waren, wurden amplifiziert und Escherichia coli (E. coli JM109 kompetente Zellen, Takara Shuzo) wurden mit diesem Plasmidaggregat transformiert, auf das LB-Agarmedium aufgebracht, welches 20 mg/l Streptomycin enthielt, und über Nacht bei 37°C inkubiert, um eine Bibliothek in Escherichia coli zu konstruieren. Alle Kolonien, die auf dem Agarmedium erschienen, wurden abgekratzt, in das LB-Flüssigmedium, welches 20 mg/l Streptomycin enthielt, eingeimpft, und unter Schütteln 8 Stunden bei 37°C kultiviert. Plasmid-DNA wurde aus jeder Kulturlösung durch das alkalische SDS-Verfahren extrahiert und als Mutanten-pRSlysE-Plasmidbibliothek verwendet.
Einführung eines mutierten pRSlysE-Plasmids in ein Methylophilus-Bakterium und L-Aminosäureherstellung
(1) Screenen nach funktionellem lysE aus der lysE-Bibliothek, in das eine künstliche Mutation eingeführt war
Die wie oben beschrieben erhaltene pRSlysE-Plasmidmutantenbibliothek wurde in den Methylophilus methylotrophus AS1-Stamm (NCIMB10515) durch Elektroporation (Canadian Journal of Microbiology, 23, 197 (1997)) eingeführt. Als Kontrolle wurde Wildtyp-pRSlysE in den AS1-Stamm eingeführt. Als ein Ergebnis wurde bei Verwendung von pRSlysE als Kontrolle das vorherige Untersuchungsergebnis reproduziert, und nur wenige Kolonien wurden pro 1 μg DNA erhalten. Andererseits konnten mit der pRSlysE-Plasmidmutantenbibliothek einige Hundert bis einige Tausend Kolonien erhalten werden. Die bisherigen Untersuchungen haben gezeigt, dass in fast allen der mehreren Kolonien, die bei Einführung des Wildtyp-pRSlysE auftraten, lysE seine Funktion aufgrund der Einführung einer natürlichen Mutation verlor. Das heißt, die Einführungshäufigkeit von pRSlysE, welches die volle Länge des lysE-Gens enthielt, in Methylophilus methylotrophus war extrem niedrig, und nur Plasmide mit einem mutierten lysE-Gen, das eine Mutation enthielt, welche die Funktion ausschaltete, konnten eingeführt werden. Unter Berücksichtigung dieser Tatsachen insgesamt wurde angenommen, dass die Einführung des lysE-Gens in Methylophilus methylotrophus zu einer letalen Wirkung führen würde. Da andererseits viel mehr Kolonien als oben auftraten, wenn die pRSlysE-Plasmidmutantenbibliothek eingeführt wurde, wurde eine Mutationseinführung durch Hydroxylaminbehandlung bei hoher Effizienz erreicht.
Wie oben beschrieben ist, konnte die lysE-Mutantenbibliothek als eine pRSlysE-Plasmidmutantenbibliothek erhalten werden. Dann wurde ein Screening-System zur Gewinnung von funktionierendem lysE entwickelt, welches eine Aktivität der extrazellulären Sekretion von L-Lysin aufweist.
Der wie oben beschrieben erhaltene, die pRSlysE-Plasmidmutantenbibliothek enthaltende Methylophilus methylotrophus AS1-Stamm wurde geeignet verdünnt, so dass mehrere hundert Kolonien pro Platte auftreten sollten, auf das SEII-Agarmedium, welches 50 mg/l Streptomycin und 3 g/l L-Threonin enthielt, aufgebracht, und 48 Stunden bei 37°C inkubiert. Die auftretenden Kolonien wurden auf dem SEII-Agarmedium, das 3 g/l L-Threonin und 0, 5, 7 oder 10 g/l AEC enthielt, repliziert. Wenn die Kolonien auf einer Platte repliziert wurden, die AEC nicht enthielt, waren die Kolonienzahlen, die auf der ursprünglichen Platte und der replizierten Platte nach der Replikation auftraten, gleich. Wenn die Kolonien jedoch auf, der AEC enthaltenden Platte repliziert wurden, waren die auf der replizierten Platte auftretenden Kolonienzahlen merklich vermindert im Vergleich zu denen der ursprünglichen Platte. Die auf der replizierten Platte gebildeten Kolonien, die AEC bei der jeweiligen Konzentration enthielten, wurden auf ein neues SEII-Agarmedium übertragen, das AEC enthielt, und kultiviert, und der Erwerb der AEC-Resistenz wurde auf Grundlage der Beobachtung bestätigt, dass eine einzelne Kolonie auf dem gleichen Medium gebildet werden konnte. Aus solchen Stämmen wurden hundert Stämme zufällig selektiert und einem weiteren Screenen unterzogen.
(2) L-Aminosäureproduktion durch einen Stamm, in den ein mutiertes pRSlysE-Plasmid eingeführt war
Von den Methylophilus methylotrophus AS1-Stämmen, die ein mutiertes pRSlysE enthielten, das vermutlich mit einer Mutation eingeführt wurde und eine REC-Resistenz gegenüber einem Wirt verlieh, wurden hundert Stämme auf eine SEII-Platte aufgebracht, die 50 mg/l Streptomycin enthielt, und über Nacht bei 37°C kultiviert. Dann wurden die Zellen auf ungefähr 10 cm2 der Mediumoberfläche abgekratzt, in ein SEII-Produktionsmedium (20 ml) eingeimpft, welches 50 mg/l Streptomycin enthielt und unter Schütteln 48 Stunden bei 37°C kultiviert. Nach Beendigung der Kultivierung wurden die Zellen durch Zentrifugation entfernt, und die in dem Kulturüberstand enthaltenen L-Aminosäuren wurden durch Dünnschichtchromatographie isoliert und mittels eines Verfahrens unter Verwendung einer Detektion mit Ninhydrin grob quantifiziert. Als Ergebnis wurde gefunden, dass L-Lysin und L-Arginin extrazellulär in verschiedenen Konzentrationen sekretiert wurden. Diese hundert Stämme wurden grob in fünf Gruppen, basierend auf ihren Mustern, klassifiziert.
Ein typischer Stamm wurde aus jeder dieser fünf Gruppen selektiert, und die in diesen Stämmen enthaltenen Plasmide wurden als pRSlysE561, pRSlysE562, pRSlysE563, pRSlysE564 und pRSlysE565 bezeichnet. Diese Plasmide wurden gereinigt, und die Nukleotidsequenzen ihrer lysE-Regionen wurden analysiert. Als Ergebnis wurde gefunden, dass pRSlysE562 und pRSlysE563 sowie pRSlysE561 und pRSlysE564 vollständig identische Sequenzen aufwiesen. Daher wurden pRSlysE562, pRSlysE564 und pRSlysE565 im Folgenden untersucht:
Die Nukleotidsequenzen der für das lysE-Protein codierenden Bereiche in pRSlysE562, pRSlysE564 und pRSlysE565 wurden analysiert. Als Ergebnis wurde gefunden, dass lysE564 eine Substitution an der 166. Position von A (Adenin) für G (Guanin) in der DNA-Sequenz des in SEQ ID NO: 1 gezeigten Wildtyp-lysE enthielt. Als Ergebnis war Ser (Serin) für Gly (Glycin) an der 56. Position in der Aminosäuresequenz des in SEQ ID NO: 2 gezeigten Wildtyp-lysE substituiert. Es wurde weiterhin gefunden, dass lysE562 Substitionen von A (Adenin) für G (Guanin) an der 166. Position und A (Adenin) für G (Guanin) an der 410. Position in der DNA-Sequenz des in SEQ ID NO: 1 gezeigten Wildtyp-lysE beinhaltete. Als Ergebnis war Ser (Serin) für Gly (Glycin) an der 56. Position substituiert, und Gly (Glycin) war für Asp (Asparaginsäure) an der 137. Position in der Aminosäuresequenz des in SEQ ID NO: 2 gezeigten Wildtyp-lysE substituiert. Es wurde weiterhin gefunden, dass lysE565 Substitutionen von A (Adenin) für G (Guanin) an der 166. Position und von A (Adenin) für G (Guanin) an der 163. Position in der in SEQ ID NO: 1 gezeigten DNA-Sequenz des Wildtyp-lysE beinhaltete. Als Ergebnis war Ser (Serin) für Gly (Glycin) an der 56. Position substituiert, und Thr (Threonin) war an der 55. Position in der Aminosäuresequenz des in SEQ ID NO: 2 gezeigten Wildtyp-lysE für Ala (Alanin) substituiert. Wenn pRSlysE562, pRSlysE564 und pRSlysE565 wieder in die AS1-Stämme eingeführt wurden, konnten diese Plasmide mit ungefähr der gleichen Häufigkeit wie pRS eingeführt werden. Die Stämme mit eingeführten Plasmiden wurde durch das gleiche Verfahren wie oben beschrieben kultiviert, und die Konzentrationen von L-Lysin und L-Arginin in den Kulturüberständen wurden unter Verwendung eines Aminosäureanalysators (Nihon Bunko, Hochleistungsflüssigchromatographie) quantifiziert. Die Messergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Aus den obigen Ergebnissen wurde ermittelt, dass pRSlysE562, pRSlysE564 und pRSlysE565 eine beträchtliche Erhöhung der Sekretion von L-Lysin und L-Arginin bewirkten. Weiterhin wurde die Aktivität der Erhöhung der Sekretion von L-Lysin und L-Arginin beibehalten, selbst wenn pRSlysE562, pRSlysE564 und pRSlysE565 wieder in die RS1-Stämme eingeführt wurden. So wurde gezeigt, dass die Mutation des Stamms mit erworbener AEC-Resistenz nicht in den Wirt eingeführt wurde, sondern in das Plasmid.
Die in pRSlysE562, pRSlysE564 und pRSlysE565 gemeinsam eingeführte Mutation war die Substitution von Ser (Serin) für Gly (Glycin) an der 56. Position in der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Aminosäuresequenz des Wildtyp-lysE. Der mit pRSlysE564 transformierte E. coli JM109-Stamm, der nur diese gemeinsame Mutation aufwies, wurde als AJ110086 bezeichnet. Dieser Stamm wurde beim International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology am 26. September 2002 als eine internationale, Hinterlegung unter den Vorschriften des Budapester Vertrags hinterlegt und erhielt die Zugangsnummer FERM BP-8196.
Die lysE562- und lysE565-Gene können aus lysE564 leicht durch dem Fachmann bekannte Verfahren erhalten werden. Insbesondere kann das lysE562-Gen erhalten werden, indem ein Fragment des aus pRSlysE564 erhaltenen, für lysE564 codierenden Bereichs beispielsweise in pSELECTTM-1, einen Vektor zur ortsgerichteten Mutationseinführung, der von Promega hergestellt wird, einbezogen wird, und eine ortsgerichtete Mutation unter Verwendung von Altered Sites^TM, einem von Promega hergestellten Kit zur Einführung einer ortsgerich-teten Mutation, eingeführt wird, um G (Guanin) für A (Adenin) an der 410. Position in SEQ ID NO: 1 zu substituieren. In dem obigen Verfahren kann beispielsweise das synthetische Oligonukleotid von SEQ ID NO: 5 als Primer verwendet werden. Das 20. Nukleotid in SEQ ID NO: 5 unterliegt einer Nukleotidsubstitution in dem Wildtyp-lysE-Gen. Ähnlich kann das lysE565-Gen erhalten werden, indem A (Adenin) für G (Guanin) an der 166. Position in SEQ ID NO: 1 substituiert wird. Zur Einführung der Mutation kann beispielsweise das synthetische Oligonukleotid von SEQ ID NO: 6 verwendet werden. Die 16. und 19. Nukleotide in SEQ ID NO: 6 unterliegen einer Nukleotidsubstitution in dem Wildtyp-lysE-Gen.
Beispiel 2: Einführung eines L-Lysin-Biosyntheseenzymgens und der Gene lysE562, lysE564 oder lysE565 in Methylophilus methylotrophus.
Da ermittelt wurde, dass die extrazelluläre Sekretion von L-Lysin durch Einführung der lysE562-, lysE564- oder lys565-Gene verstärkt war, wurde die L-Lysinbiosynthese in einem Stamm, in den das lysE562-, lysE564- oder lysE565-Gen eingeführt war, verstärkt, um eine weitere Verbesserung der Produktivität zu versuchen.
(1) Konstruktion eines Plasmids pRSdapA mit dem dapA*-Gen
Ein Plasmid mit einem Dihydrodipicolinatsynthase codierenden Gen, welches keiner Rückkopplungshemmung durch L-Lysin unterlag (dapA*), wurde als L-Lysin-Biosynthesesystemenzymgen hergestellt.
Das in Beispiel 1 hergestellte pRStac wurde mit Sse8387I und XbaI verdaut und zu einer Phenol/Chloroform-Lösung zugesetzt und vermischt, um die Reaktion zu beenden. Nachdem das Reaktionsgemisch zentrifugiert wurde, wurde die obere Schicht gesammelt und DNA wurden durch Ethanolfällung gesammelt und auf einem 0,8% Agarosegel getrennt, wobei ein DNA-Fragment von ungefähr 9 kbp gewonnen wurde.
Das dapA*-Genfragment wurde mittels PCR unter Verwendung des bekannten Plasmids RSFD80 (siehe WO90/16042), welches das Gen als Templat und die in SEQ ID NO: 11 und 12 gezeigten Primer enthielt, amplifiziert (Denaturierung bei 94°C für 20 Sekunden, Anneal bei 55°C für 30 Sekunden und Verlängerungsreaktion bei 72°C für 60 Sekunden). Pyrobest DNA-Polymerase (Takara Shuzo) wurde zur PCR verwendet. Das erhaltene dapA*-Fragment wurde unter Verwendung von PCR prep (Promega) gereinigt und dann mit den Restriktionsenzymen Sse8387I und XbaI verdaut. Das Reaktionsgemisch wurde zu einer Phenol/ Chloroform-Lösung gegeben und vermischt, um die Reaktion zu beenden. Nachdem das Reaktionsgemisch zentrifugiert wurde, wurde die obere Schicht gesammelt und DNA wurde durch Ethanolfällung gewonnen und auf einem 0,8 % Agarosegel getrennt, wobei ein DNA-Fragment von ungefähr 0,1 kbp gewonnen wurde.
Die wie oben beschrieben hergestellten Verdauungsprodukte des pRStac-Vektors und das dapA*-Genbereichfragment wurden unter Verwendung des DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo) ligiert. Diese Ligationsreaktionslösung wurde zur Transformation von Escherichia coli (E. coli JM109 kompetente Zellen, Takara Shuzo) verwendet. Die Zellen wurden auf ein LB-Agarmedium plattiert, das 20 mg/l Streptomycin enthielt, und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die auf dem Agarmedium erscheinenden Kolonien wurden jeweils in ein LB-Flüssigmedium geimpft, das 20 mg/l Streptomycin enthielt, und unter Schütteln 8 Stunden bei 37°C kultiviert. Plasmid-DNA wurde jeder Kulturlösung durch das alkalische SDS-Verfahren entzogen, und die Struktur jedes Plasmids wurde durch Verdauung mit Restriktionsenzymen und Bestimmung der Nukleotidsequenz bestätigt, wobei ein pRSdapA-Plasmid erhalten wurde. In dem pRSdapA-Plasmid war das dapA*-Gen so positioniert, dass dessen Transkriptionsrichtung die gleiche sein sollte wie die des tac-Promoters.
(2) Konstruktion eines Plasmids mit dem dapA*-Gen und einem der Gene lysE562, lysE564 oder lysE565
Um die Wirkung der Kombination eines von lysE562, lysE564 oder lysE565 mit dapA* zu bewerten, wurden die Plasmide pRSlysE562, pRSlysE564 und pRSlysE565 durch Insertion des dapA*-Gens konstruiert. Die in Beispiel 1 hergestellten pRSlysE562, lysE564 und lysE565 wurden mit einem Restriktionsenzym SapI verdaut und unter Verwendung des DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) mit einem glatten Ende versehen. Weiterhin wurde ein pRSdapA-Plasmid mit den Restriktionsenzymen EcoRI und SapI verdaut, und ein Fragment von ungefähr 1 kbp mit dem tac-Promoter und dem dapA*-Bereich wurde auf einem 0,8 Agarosegel getrennt und unter Verwendung von EASY TRAP Ver. 2 gewonnen (Takara Shuzo). Dieses Fragment wurde wie oben beschrieben mit einem glatten Ende versehen und an jedes der Verdauungsprodukte der zuvor erwähnten pRSlysE562, lysE564 und lysE565 unter Verwendung des DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo) ligiert.
Escherichia coli (E. coli JM 109 kompetente Zellen, Takara Shuzo) wurde mit jeder der erwähnten Ligationsreaktionslösungen transformiert, auf das LB-Agarmedium aufgebracht, das 20 mg/l Streptomycin enthielt, und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die auf dem Agarmedium erscheinenden Kolonien wurden in das LB-Flüssigmedium geimpft, welches 20 mg/l Streptomycin enthielt, und 8 Stunden unter Schütteln bei 37°C kultiviert. Die Plasmid-DNA wurde aus jeder Kulturlösung durch das alkalische SDS-Verfahren extrahiert, und die Struktur hiervon wurde durch Verdauung mit Restriktionsenzymen und Bestimmung der Nukleotidsequenz bestätigt, wobei pRSlysE562dapA-, pRSlysE564dapA- und pRSlysE565dapA-Plasmide erhalten wurden. In diesen Plasmiden waren die Gene so positioniert, dass die Transkriptionsrichtungen von lysE562, lysE564 und lysE565 zu der von dapA* entgegengesetzt sein sollten.
Wenn die durch das oben erwähnte Verfahren erhaltenen pRSlysE562dapA-, pRSlysE564dapA- und pRSlysE565dapA-Plasmide jeweils in den Methylophilus methylotrophus AS1-Stamm (NCIMB10515) durch Elektroporation eingeführt wurden, wurden transformierte Stämme mit pRSlysE562dapA und pRSlysE564dapA erhalten, wohingegen kein transformierter Stamm mit pRSlysE565dapA erhalten wurde. Dies kann auf der verminderten Stabilität des Plasmids in dem A51-Stamm beruhen.
(3) Herstellung von L-Lysin durch Methylophilus-Bakterien, die lysE562 oder lysE564 und dapA* enthalten
Die wie oben beschrieben erhaltenen AS1-Stämme, in die pRSlysE562dapA oder pRSlysE564dapA eingeführt waren, oder pRSlysEdapA als Kontrolle, wurden jeweils auf eine SEII-Platte aufgebracht, die 20 mg/l Streptomycin enthielt, und über Nacht bei 37°C kultiviert, und die Zellen auf 0,3 cm² der Mediumoberflächen wurden abgekratzt, in das SEII-Produktionsmedium (20 ml), das 20 mg/l Streptomycin enthielt, eingeimpft, und 34 Stunden unter Schütteln bei 37°C kultiviert. Nach Beendigung der Kultur wurden die Zellen durch Zentrifugation entfernt und die in dem Kulturüberstand enthaltene L-Lysinkonzentration wurde unter Verwendung eines Aminosäureanalysators (Nihon Bunko, Hochleistungsflüssigchromatographie) quantifiziert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Die Stämme, in die pRSlysE562dapA oder pRSlysE564dapA eingeführt waren, zeigten eine verbesserte L-Lysinakkumulierung. Die L-Lysinakkumulierung in den Medien war merklich verbessert im Vergleich mit denen, in die nur pRSlysE562 oder pRSlysE564 eingeführt waren. Es ist daher ersichtlich, dass die Geschwindigkeits- bzw. Mengenbegrenzung der Sekretion ausgeschaltet war, und der dapA*-Gen verstärkende Effekt synergistisch auftrat.
Tabelle 2
Beispiel 3 : Einführung des lysE564-Gens in Methylobacillus glycogenes und L-Aminosäuresäureproduktion
(1) Herstellung von pRS-lysE564-Tc
Es wurde entschieden, zu bestätigen, ob lysE562, lysE564 und lysE565, welche mutiertes lysE enthielten, in Methylobacillus-Bakterien funktionierten. Zu diesem Zweck wurde lysE564 ausgewählt, und pRSLysE564, ein Plasmid zur Expression von lysE564, wurde modifiziert. Das pRSlysE564-Plasmid trägt ein Streptomycin-Resistenzgen. Da Methylobacillus glycogenes ursprünglich jedoch nicht resistent gegen Streptomycin ist, kann das pRSlysE-Plasmid nicht gescreent werden. Daher wurde ein modifiziertes Plasmid konstruiert, indem ein Tetracyclinresistenzgen in das pRSlysE-Plasmid inser-tiert wurde, das in Methylobacillus glycogenes verwendet werden konnte.
Zunächst wurde pRS-lysE564-Tc, welches das Tetracyclinresistenzgen trug, aus pRSlysE564 konstruiert. Das pRSlysE564-Plasmid wurde mit einem Restriktionsenzym EcoRI verdaut und zu einer Phenol/Chloroform-Lösung gegeben und vermischt, um die Reaktion zu beenden. Das Reaktionsgemisch wurde zentrifugiert, und die obere Schicht wurde gewonnen. DNA wurde durch Ethanolfällung gewonnen, und die verdauten Enden hiervor wurden unter Verwendung des DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) mit einem glatten Ende versehen. DNA-Fragmente wurden auf einem 0,8% Agarosegel getrennt, und ein DNA-Fragment mit ungefähr 9 Kilobasenpaaren (im Folgenden als „kbp" abgekürzt) wurde unter Verwendung von EASY TRAP Ver. 2 (DNA collection kit, Takara Shuzo) gewonnen.
Weiterhin wurde der Tetracyclinresistenzgenbereich durch PCR unter Verwendung des pRK310-Plasmids (Pansegrau et al. J. Mol. Biol. 239, 623-663 (1994)) als Templat und den in SEQ ID NO: 13 und 14 gezeigten Primern amplifiziert (ein Zyklus, bestehend aus einer Denaturierung bei 94°C für 20 Sekunden, einem Anneal bei 55°C für 30 Sekunden und einer Verlängerungsreaktion bei 72°C für 60 Sekunden, wurde für 30 Zyklen wiederholt). Pyrobest DNA-Polymerase (Takara Shuzo) wurde für die PCR verwendet. Das amplifizierte DNA-Fragment, das den Tetracyclinresistenzgenbereich enthielt, wurde unter Verwendung von PCR prep (Promega) gereinigt, und anschließend wurde DNA durch Ethanolfällung gewonnen und unter Verwendung des Takara BKL Kit (Blunting Kination Ligation Kit, Takara Shuzo) mit einem glatten Ende versehen und phosphoryliert, zu einer Phenol/Chloroform-Lösung gegeben und vermischt, um die Reaktion zu beenden. Nachdem das Reaktionsgemisch zentrifugiert war, wurde die obere Schicht gesammelt, und DNA wurde durch Ethanolfällung gewonnen und auf einem 0,8 Agarosegel getrennt. Ein DNA-Fragment von 1,5 kpb wurde unter Verwendung von EASY TRAP Ver. 2 gewonnen.
Das Tetracyclinresistenzgen kann auch durch ein dem obigen Verfahren ähnliches PCR-Verfahren erhalten werden, indem ein anderes Plasmid, beispielsweise das pRK2-Plasmid, anstelle von pRK310 als Templat verwendet wird.
Das wie oben beschrieben hergestellte pRSlysE564-Vektorfragment und das den Tetracyclinresistenzgenbereich enthaltende DNA-Fragment wurden unter Verwendung des DNA Ligation Kit Ver. 2 (Takara Shuzo) ligiert. Escherichia coli (E. Coli JM109 kompetente Zellen, Takara Shuzo) wurden mit dieser Ligationsreaktionslösung transformiert, auf das LB-Agarmedium gebracht, welches 20 mg/l Streptomycin und 15 mg/l Tetracyclin enthielt, und über Nacht bei 37°C kultiviert. Die auf dem Agarmedium erscheinenden Kolonien wurden in das LB-Flüssigmedium, das 20 mg/l Streptomycin und 15 mg/l Tetracyclin enthielt, eingeimpft und 8 Stunden unter Schütteln bei 37°C kultiviert. Plasmid-DNA wurde aus jeder Kulturlösung durch das alkalische SDS-Verfahren extrahiert, und die Struktur jedes Plasmids wurde durch Verdauung mit Restriktionsenzymen bestätigt, wobei pRS-lysE564-Tc erhalten wurde.
(2) Einführung von pRS-lysE564-Tc in ein Methylobacillus-Bakterium und L-Aminosäureproduktion
Wie oben beschrieben erhaltenes pRS-lysE564-Tc wurde in den Methylobacillus glycogenes NCIMB11375-Stamm durch Elektroporation (Canadian Journal of Microbiology, 43, 197 (1997)) eingeführt. Als Kontrolle wurde pRK310 ähnlich in den Methylobacillus glycogenes NCIMB11375-Stamm eingeführt. Als Ergebnis wurden pRS-lys564-Tc enthaltende Kolonien mit fast der gleichen Häufigkeit erhalten wie mit der Kontrolle pRK310 erhalten wurden.
pRSlysET wurde konstruiert, indem ein Tetracyclinresistenzgenbereich auf die gleiche Weise wie für pRS-lysE564-Tc in das pRSlysE-Plasmid insertiert wurde, welches das Wildtyp-lysE enthielt, und es wurde versucht, dieses in den Methylobacillus glycogenes-Stamm auf die gleiche Weise einzuführen. Es wurde jedoch kein Stamm mit einer Einführung erhalten. Dies ist das gleiche Phänomen, das in dem Methylobacillus methylotrophus AS1-Stamm beobachtet wurde, und es wurde vermutet, dass Wildtyp-lysE auch in Methylobacillus-Bakterien nicht normal funktionierte.
Der pRS-lysE564-Tc enthaltende Stamm Methylobacillus glycogenes NCIMB11375 wurde auf eine SEII-Platte aufgebracht, die 10 mg/l Tetracyclin enthielt, und über Nacht bei 30°C kultiviert. Dann wurden die Zellen auf ungefähr 10 cm² der Mediumoberfläche abgekratzt und in das SEII-Produktionsmedium (20 ml) eingeimpft, das 10 mg/l Tetracyclin enthielt, und unter Schütteln 60 Stunden bei 30°C kultiviert. Nach Beendigung der Kultur wurden die Zellen durch Zentrifugation entfernt, und die Konzentration von in dem Kulturüberstand enthaltenem L-Lysin wurde unter Verwendung eines Aminosäureanalysators (Nihon Bunko, Hochleistungsflüssigchromatographie) quantifiziert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
(3) Konstruktion von pRS-lysE564-dapA-Tc
Es wurde gefunden, dass L-Lysin in einem Medium akkumuliert wurde, indem das lysE564-Gen in den Stamm Methylobacillus glycogenes eingeführt wurde. Es wurde vermutet, dass dies an der Verstärkung der L-Lysin-Sekretion lag.
Demgemäß wurde die Wirkung der Verbesserung der Expression eines L-Lysin-Biosynthesegens und des lysE564-Gens in Kombination in Methylobacillus glycogenes auf die gleiche Weise untersucht wie in Beispiel 2.
Es wurde ein Plasmid konstruiert, indem das Tetracyclinresistenzgen durch das gleiche Verfahren wie in Beispiel 3, (1) in das in Beispiel 2, (2) hergestellte pRSlysE564dapA-Plasmid eingeführt wurde. Das erhaltene Plasmid wurde als pRS-lysE564-dapA-Tc bezeichnet.
(4) Einführung des Plasmids pRS-lysE564-dapA-Tc in Methylobacillus glycogenes und L-Aminosäureproduktion
Das wie oben beschrieben erhaltene pRS-lysE564-dapA-Tc wurde in den Stamm Methylobacillus glycogenes NCIMB11375 durch Elektroporation eingeführt. Die L-Aminosäurekonzentrationen in den Kulturlösungsüberständen wurden für den erhaltenen transformierten Stamm untersucht (im Folgenden auch als „NCIMB11375/pRS-lysE564-dapA-Tc" bezeichnet), den zuvor erwähnten Methylobacillus glycogenes-Stamm, in den pRSlysE564-Tc eingeführt war (im Folgenden auch als „NCIMB11375/ pRS-lysE564-Tc" bezeichnet), und für den Methylobacillus glycogenes-Stamm, in den das pRK310-Plasmid eingeführt war, als Kontrolle (im Folgenden auch als „NCIMB11375/pRK310" bezeichnet).
Jeder transformierte Stamm wurde für 2 Tage bei 30°C auf einer SEII-Platte kultiviert, die 10 mg/l Tetracyclin enthielt. Dann wurden die Zellen auf 10 cm² der Mediumoberfläche abgekratzt, und in das SEII-Produktionsmedium (20 ml) geimpft, welches 10 mg/l Tetracyclin enthielt, und unter Schütteln 60 Stunden bei 30°C kultiviert. Nach Beendigung der Kultur wurden die Zellen von einem Teil der Kulturlösung durch Zentrifugation entfernt, und die Konzentrationen der in dem Kulturüberstand enthaltenen L-Aminosäuren wurden unter Verwendung eines Aminosäureanalysators quantifiziert.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Eine merkliche Menge an L-Lysin wurde in dem Medium akkumuliert, das den Stamm enthielt, in den NCIMB11375/pRS-lysE564-dapA-Tc eingeführt war. Die L-Lysin-Akkumulierung in dem Medium, das den Stamm enthielt, in den NCIMB11375/pRS-lysE564-dapA-Tc eingeführt war, war verbessert im Vergleich mit dem Fall, in dem nur pRSlysE564T eingeführt war. Es wurde vermutet, dass die Geschwindigkeitsbegrenzung bzw. Mengenbegrenzung für die Sekretion aufgrund der Einführung des lysE564-Gens ausgeschaltet war, und der verstärkende Effekt des dapA*-Gens synergistisch auftrat.
Tabelle 4
Obwohl die Erfindung ausführlich mit Bezug auf die bevorzugten Ausführungsformen hiervon beschrieben wurde, ist dem Fachmann klar, dass verschiedene Änderungen vorgenommen werden können und Äquivalente eingesetzt werden können, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen. Jedes der zuvor erwähnten Dokumente wird hier in seiner Gesamtheit durch Bezugnahme aufgenommen, einschließlich ausländischen Prioritätsdokuments JP 2002-336315 .
Erläuterung des Sequenzprotokolls:
SEQ ID NO: 1: Wildtyp-lysE-Nukleotidsequenz
SEQ ID NO: 2: Wildtyp-LysE-Aminosäuresequenz
SEQ ID NO: 3: Wildtyp-dapA-Nukleotidsequenz
SEQ ID NO: 4: Wildtyp-DDPS-Aminosäuresequenz
SEQ ID NO: 5 und 6: Primer für die lysE562 ortsgerichtete Mutation
SEQ ID NO: 7 und 8: Primer für die tac-Promoter-Amplifikation
SEQ ID NO: 9 und 10: Primer zum Klonieren von lysE
SEQ ID NO: 11 und 12: Primer zum Klonieren von dapA*
SEQ ID NO: 13 und 14: Primer zur Amplifikation des Tetracyclinresistenzgenbereichs SEQUENZPROTOKOLL

Claims

DNA, die ein mutiertes LysE-Protein eines Coryneform-Bakteriums oder ein homologen Proteins davon codiert, wobei die Mutante oder das homologe Protein davon bei Einführung in ein Methanol-assimilierendes Bakterium eine Resistenz gegen ein L-Lysin-Analogon verleiht.
DNA nach Anspruch 1, wobei die Mutante ein Protein ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus A) einem Protein, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist, wobei zumindest der Glycinrest an Position 56 durch einen anderen Aminosäurerest ausgetauscht ist, und B) einem Protein, welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist, wobei zumindest der Glycinrest an Position 56 durch einen anderen Aminosäurerest ausgetaucht ist, und ein oder mehrere Aminosäurereste an anderen Positionen als dem 56. Rest substituiert, deletiert, insertiert oder addiert sind, und die Mutante bei Einführung in ein Methanol-assimilierendes Bakterium eine Resistenz gegen ein L-Lysin-Analogon verleiht.
DNA nach Anspruch 2, wobei die DNA aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: A) einer DNA, welche die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Nukleotidsequenz aufweist, wobei eine Mutation zum Austausch zumindest des 56. Glycinrests des codierten Proteins durch einen anderen Aminosäurerest führt; B) einer DNA, die mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 unter stringenten Bedingungen oder mit einer Sonde, die aus der Nukleotidsequenz hergestellt wird, hybridisierbar ist, und die DNA oder die Sonde bei Einführung der DNA oder der Sonde in ein Methanol-assimilierendes Bakterium ein Protein codiert, welches eine Resistenz gegen ein L-Lysin-Analogon verleiht.
DNA nach Anspruch 2, wobei der andere Aminosäurerest ein Serinrest ist.
DNA nach Anspruch 1, wobei das L-Lysin-Analogon S-(2-Aminoethyl)cystein ist.
DNA nach Anspruch 1, wobei das Methanol-assimilierende Bakterium ein Bakterium ist, das zur Gattung Methylophilus oder Methylobacillus gehört.
Bakterium, das zur Gattung Methylophilus oder Methylobacillus gehört, in welches die DNA von Anspruch 1 in einer exprimierbaren Form eingeführt ist, und welches die Fähigkeit zur Produktion von L-Lysin oder L-Arginin aufweist.
Verfahren zur Herstellung von L-Lysin oder L-Arginin, umfassend die Schritte: A) Kultivieren des Bakteriums von Anspruch 7 in einem Medium, um L-Lysin oder L-Arginin in der Kultur zu produzieren und zu akkumulieren, und B) Gewinnen von L-Lysin oder L-Arginin aus der Kultur.
Verfahren zur Herstellung von L-Lysin oder L-Arginin nach Anspruch 8, wobei das Medium Methanol als Hauptkohlenstoffquelle enthält.