DE69937036T3

DE69937036T3 - Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren

Info

Publication number: DE69937036T3
Application number: DE69937036.1T
Authority: DE
Inventors: Vitaliy Arkadyevich Livshits; Natalia Pavlovna Zakataeva; Vladimir Veniaminovich Aleshin; Alla Valentinovna Belareva; Irina Lyvovna Tokhmakova
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1998-12-23
Filing date: 1999-12-20
Publication date: 2014-10-16
Anticipated expiration: 2019-12-21
Also published as: ZA997819B; US9394346B2; SK184399A3; DK1013765T3; SK286619B6; EP1013765A1; SK288294B6; MXPA00000178A; ES2293707T5; AU774069B2; EP1013765B2; EP1013765B1; US20050239177A1; US20160289716A1; ID24025A; JP2000189177A; DK1013765T4; CA2291454A1; ES2293707T3; CN1260393A

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft die Biotechnologie und genauer gesagt ein Verfahren zum Herstellen einer Aminosäure, insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von L-Homoserin, L-Threonin, L-Valin oder L-Leucin unter Einsatz eines Bacteriums der Gattung Escherichia.
Hintergrund der Erfindung
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben bezüglich E. coli K-12 eine Mutante mit einer Mutation thrR, welche die Resistenz gegenüber hohen Konzentrationen von Threonin oder Homoserin in einem Minimalmedium betrifft, erhalten (Astaurova, O. B. et al., Appl. Bioch. And Microbiol., 21, 611–616 (1985)). Die Mutation erhöhte die Produktion von L-Threonin ( SU Patent Nr. 974817 ), Homoserin und Glutamat (Astaurova, O. B. et al., Appl. Bioch. And Microbiol., 27, 556–561, 1991) durch die jeweiligen Produktionsstämme von E. coli.
Außerdem haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung entdeckt, daß die thrR-Mutation bei 18 Minuten auf dem E. coli Chromosom liegt und daß die Mutation im ORF1 zwischen den Genen pexB und ompX auftritt. Die Einheit, die ein durch den ORF kodiertes Protein expremiert, ist als rhtA-Gen (rht: Resistenz gegen Homoserin und Threonin) bezeichnet worden. Das rhtA-Gen umfaßt eine 5'-nicht-kodierende Region, einschließlich eine SD Sequenz, ORF1 und einen Terminator. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben auch gefunden, daß ein Wildtyp rhtA-Gen an der Resistenz gegenüber Threonin und Homoserin beteiligt ist, wenn es in mehreren Kopien kloniert wird, und daß die rhtA23 Mutation eine Substitution von A nach G an der Position -1, bezogen auf das ATG Startcodon, ist (Abstracts des 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in Verbindung mit 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California, August 24–29, 1997, Abstract Nr. 457).
Es ist vorher gefunden worden, daß mindestens zwei unterschiedliche Gene, die Resistenz gegenüber Threonin und Homoserin verleihen, in einem Mehrkopienzustand in E. coli während des Klonierens des rhtA Gens vorhanden sind. Eines der Gene ist das rhtA-Gen, und das andere Gen ist als rhtB-Gen gefunden worden, welches Homoserinresistenz verleiht ( Russische Patentanmeldung Nr. 98118425 ).
Offenbarung der Erfindung
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Herstellen einer Aminosäure, insbesondere L-Homoserin, L-Threonin und verzweigte Aminosäuren, mit höherer Ausbeute zu produzieren.
Die Erfinder haben gefunden, daß eine Region bei 86 min auf dem E. coli Chromosom, wenn diese in einen Mehrkopienvektor kloniert wird, auf Zellen von E. coli eine L-Homoserin-Resistenz überträgt. Die Erfinder haben außerdem gefunden, daß in der stromaufwärtigen Region ein weiteres Gen, nämlich rhtC, existiert, welches an der Threonin-Resistenz beteiligt ist, und daß wenn diese Gene amplifiziert werden, die Aminosäureproduktivität von E. coli wie bei dem rhtA-Gen verbessert werden kann. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde die vorliegende Erfindung gemacht.
Somit wird folgendes offenbart:

(1) Ein Bacterium der Gattung Escherichia, worin die L-Threonin-Resistenz des Bacteriums dadurch erhöht ist, daß die Aktivität des in den folgenden Punkten (A) oder (B) definierten Proteins in einer Zelle des Bacteriums verstärkt ist: (A) ein Protein, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 4 umfaßt; oder (B) ein Protein, das die Aminosäuresequenz, einschließlich Deletion, Substitution, Insertion oder Addition einer oder mehrerer Aminosäure in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 4 aufweist und die Wirkung hat, ein das Protein enthaltende Bacterium L-Threonin-resistent zu machen;
(2) das Bacterium nach (1), wobei die L-Homoserin-Resistenz des Bacteriums durch Verstärken der Aktivität eines nachfolgend in (C) oder (D) definierten Proteins in den Zellen des Bakteriums erhöht ist: (C) ein Protein, welches die in SEQ ID Nr. 2 des Sequenzprotokolls gezeigte Aminosäuresequenz aufweist; oder (D) ein Protein, welches die Aminosäuresequenz, einschließlich Deletion, Substitution, Insertion oder Addition einer oder mehrerer Aminosäuren in der in SEQ ID Nr. 2 des Sequenzprotokolls gezeigten Aminosäuresequenz aufweist und die Wirkung hat, ein das Protein enthaltende Bakterium L-Homoserin-resistent zu machen;
(3) Das Bacterium nach (1) oder (2), wobei die Aktivität des (A) oder (B) definierten Proteins durch Transformation des Bacteriums mit DNA, die für das in (A) oder (B) definierte Protein kodiert, verstärkt ist;
(4) Das Bacterium nach (2), wobei die Aktivität des in (C) oder (D) definierten Proteins durch Transformation des Bacteriums mit DNA, die für das in (C) oder (D) definierte Protein kodiert, erhöht ist;
(5) Ein Verfahren zum Herstellen einer Aminosäure, welches die folgenden Stufen umfaßt: Kultivieren des Bacteriums, das in einem der vorstehenden Punkte (1) bis (4) definiert ist, welches die Fähigkeit hat, eine Aminosäure in einem Kulturmedium zu produzieren und die Aminosäure in dem Medium herzustellen und anzuhäufen, und das Gewinnen der Aminosäure aus dem Medium;
(6) das Verfahren nach (5) wobei die Aminosäure aus der aus L-Homoserin, L-Threonin und verzweigten Aminosäuren bestehenden Gruppe ausgewählt ist;
(7) das Verfahren nach (6), wobei die verzweigte Aminosäure L-Valin oder L-Leucin ist;
(8) eine DNA, die für ein nachfolgend in (A) oder (B) definiertes Protein kodiert: (A) ein Protein, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 4 umfaßt; oder (B) ein Protein, das die Aminosäuresequenz, einschließlich Deletion, Substitution, Insertion oder Addition einer oder mehrerer Aminosäure in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 4 aufweist und die Wirkung hat, ein das Protein enthaltende Bacterium L-Threonin-resistent zu machen;
(9) die DNA nach (8), die eine nachfolgend in (a) oder (b) definierte DNA ist: (a) eine DNA, welche die Nucleotidsequenz der Nucleotidnummern 187 bis 804 in der SEQ ID Nr. 3 enthält; (b) eine DNA, welche mit einer Nucleotidsequenz der Nucleotidnummern 187 bis 804 in der SEQ ID Nr. 3 unter einer stringenten Bedingung hybridisiert und für ein Protein mit der Wirkung kodiert, ein das Protein enthaltende Bakterium L-Threonin-resistent zu machen; und
(10) die DNA nach (8), wobei die stringente Bedingung eine Bedingung ist, bei der ein Waschvorgang bei 60°C bei einer Salzkonzentration, die 1 × SSC und 0,1% SDS entspricht, durchgeführt wird.

Das DNA-Fragment, das für das vorstehend in (A) oder in (B) definierte Protein kodiert, kann als ”rhtC-Gen” bezeichnet werden, ein Protein, das von dem rhtC-Gen kodiert wird, kann als ”RhtC-Protein” bezeichnet werden, die DNA, die für das vorstehend in (C) oder in (D) definierte Protein kodiert, kann als ”rhtB-Gen” bezeichnet werden, ein Protein, das von dem rhtB-Gen kodiert wird, kann als ”RhtB-Protein” bezeichnet werden. Die Aktivität des rhtC Proteins, das an der Resistenz gegenüber L-Threonin eines Bacteriums beteiligt ist (d. h. eine Aktivität, mit der ein RhtC-Protein enthaltendes Bacterium L-Threonin-resistent gemacht wird), kann als ”Rt-Aktivität” bezeichnet werden, und eine Aktivität des RhtB-Proteins, das an der Resistenz gegen L-Homoserin eines Bacteriums beteiligt ist (d. h. eine Aktivität, mit der ein das RhtB-Protein enthaltendes Bacterium L-Homoserin-resistent gemacht wird), kann als ”Rh-Aktivität” bezeichnet werde. Ein strukturelles Gen; welches das RhtC-Protein oder das RhtB-Protein in dem rhtC-Gen oder dem rhtB-Gen kodiert, kann als ”rhtC-Strukturgen” oder ”rhtB-Strukturgen” bezeichnet werden. Der Ausdruck ”Erhöhen der Rt-Aktivität oder der Rh-Aktivität” bedeutet, daß auf ein Bacterium die Resistenz gegen Threonin oder Homoserin übertragen wird oder die Resistenz verstärkt wird, indem die Anzahl der Moleküle des RhtC Proteins oder RhtB-Proteins erhöht wird, was zu einer Erhöhung der spezifischen Aktivität dieser Proteine führt, oder indem die negative Regulation der Expression oder der Aktivität dieser Proteine oder dergleichen desensibilisiert wird. Der Ausdruck ”DNA, die für ein Protein kodiert” bedeutet eine DNA, in der ein Strang für das Protein kodiert, wenn die DNA doppelsträngig ist. Die L-Threonin-Resistenz bedeutet die Eigenschaft, daß ein Bacterium auf einem Minimalmedium, welches L-Threonin in einer Konzentration enthält, bei der ein Wildtypstamm nicht wachsen kann, üblicherweise > 30 mg/ml, wächst. Die L-Homoserin-Resistenz bedeutet die Eigenschaft, daß ein Bacterium auf einem Minimalmedium, welches L-Homoserin in einer Konzentration enthält, bei der ein Wildtypstamm nicht wächst, üblicherweise > 5 mg/ml. Die Fähigkeit zur Produktion einer Aminosäure bedeutet die Eigenschaft, das ein Bacterium die Aminosäure in einem Medium in einer größeren Menge als ein Wildtypstamm davon produziert und anhäuft.
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden eingehend beschrieben.

(1) DNA, die für ein Protein kodiert, das in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird

Das erste für die vorliegende Erfindung eingesetzte DNA-Fragment (rhtC-Gen) kodiert für ein Protein mit der Rt-Aktivität und einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 4. Insbesondere kann die DNA beispielsweise eine DNA sein, die eine Nucleotidsequenz der Nucleotidnummern 187 bis 104 der Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 3 umfaßt.
Das zweite DNA-Fragment, das für die vorliegende Erfindung eingesetzt wird, ist das rhtB-Gen, das für ein Protein mit der Rh-Aktivität und einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 kodiert. Insbesondere ist ein Beispiel dieser DNA eine DNA, die eine Nucleotidsequenz der Nucleotidnummern 557 bis 1171 einer Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 enthält.
Das rhtB-Gen mit der Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 entspricht einem Teil des Sequenzkomplements zu der Sequenz mit der GenBank Eintragungsnummer M87049 und umfaßt f138 (Nucleotidnummern 61959–61543 von M87049), welches ein bekannter, jedoch hinsichtlich der Funktion unbekannter ORF (offener Leserahmen) ist, der bei 86 auf einem E. coli Chromosom vorhanden ist, und umfaßt außerdem die 5'- und 3'-flankierenden Bereiche davon. f138, welches nur 160 Nucleotide in dem 5'-flankierenden Bereich enthält, konnte keine Resistenz gegen Homoserin übertragen. Zwischen den Nucleotiden 62160 und 61959 von M87049 (stromaufwärts des ORF f138) ist kein Terminationskodon vorhanden. Überdies ist vor einem der ATG Codons dieser Sequenz eine Ribosomenbindungsstelle (62171–62166 in M87049). Somit ist die kodierende Region 201 bp länger. Der größere ORF (Nucleotidnummern 62160 bis 61546 von M87049) wird als rhtB-Gen bezeichnet.
Das rhtB-Gen kann beispielsweise durch Infizieren des Mucts lysogenen Stammes von E. coli unter Verwendung eines Lysats, eines lysogenen Stammes von E. coli, wie K12 oder W3110, nach dem Verfahren erhalten werden, bei dem mini-Mu d5005 Phagemid eingesetzt wird (Groisman, E. A., et al., J. Bacteriol., 168, 357–364 (1986)), und dann werden die Phagemid DNAs aus den Kolonien, die auf einem Minimalmedium wachsen, das Kanamycin (40 μg/ml) und L-Homoserin (10 mg/ml) enthält, isoliert. Wie in den nachstehend beschriebenen Beispielen veranschaulicht wird, wurde das rhtB-Gen bei 86 Minuten auf dem Chromosom von E. coli kartiert. Deshalb kann das DNA-Fragment, welches das rhtB-Gen enthält, aus dem Chromosom von E. coli durch Koloniehybridisierung oder PCR (Polymerasekettenreaktion, vergl. White, T. J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)) unter Verwendung von einem oder mehreren Oligonucleotiden, die eine Sequenz haben, welche der Region in der Nähe des Bereichs bei 86 Minuten auf dem E. coli Chromosom entspricht, erhalten werden.
Alternativ dazu kann das Oligonucleotid gemäß der Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 entworfen werden. Durch Verwendung von Oligonucleotiden mit Nucleotidsequenzen, die einer stromaufwärtigen Region von der Nucleotidnummer 557 und einer stromabwärtigen Region von der Nucleotidnummer 1171 in der SEQ ID NO: 1 entspricht, als Primer für die PCR kann die gesamte kodierende Region amplifiziert werden.
Die Synthese der Oligonucleotide kann mit einem üblichen Verfahren, wie dem Phosphoamidit-Verfahren (vergl. Tetrahedron Letters, 22, 1859 (1981)) unter Einsatz eines käuflich erwerbbaren DNA-Synthetisiergeräts (beispielsweise DNA-Synthesizer Model 380B, hergestellt von Applied Biosystems) durchgeführt werden. Außerdem kann die PCR unter Verwendung eines käuflich erwerbbaren PCR-Geräts (beispielsweise DNA Thermal Cycler Model PJ2000, hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) unter Verwendung von Taq DNA Polymerase (von Takara Shuzo Co., Ltd.) nach dem vom Hersteller angegebenen Verfahren durchgeführt werden.
Das rhtC-Gen wurde in dem DNA-Fragment, welches das rhtB-Gen enthält, zufällig erhalten, als das rhtB-Gen wie nachstehend in den Ausführungsformen beschrieben kloniert wurde. Das rhtC-Gen entspricht einer wie nachstehend beschriebenen berichtigten Sequenz von O128 (Nucleotidnummern 60860–61480 der GenBank Zugangsnummer M87049), welche ein bekannter, jedoch bezüglich der Funktion unbekannter ORF ist. Das rhtC-Gen kann durch PCR oder Hybridisierung unter Einsatz von Oligonucleotiden erhalten werden, die gemäß der Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 3 entworfen wurden. Unter Verwendung von Oligonucleotiden mit einer Nucleotidsequenz, die einer stromaufwärtigen Region von Nucleotidnummer 187 und einer stromabwärtigen Region von Nucleotidnummer 804 in der SEQ ID NO: 3 entspricht, als Primer für die PCR kann die gesamte kodierende Region amplifiziert werden.
In der vorliegenden Erfindung kann die für das erfindungsgemäße RhtB-Protein kodierende DNA für ein RhtB-Protein, einschließlich eine Deletion, Substitution, Insertion oder Addition einer oder mehrerer Aminosäuren an einer oder mehreren Positionen kodieren, mit der Maßgabe, daß die Rh-Aktivität des so kodierten RhtB Proteins nicht beeinträchtigt wird. Ebenso kann die für das RhtC-Protein kodierende erfindungsgemäße DNA für ein RhtC-Protein, einschließlich Deletion, Substitution, Insertion oder Addition einer oder mehrerer Aminosäuren an einer oder mehrerer Aminosäuren an einer oder mehreren Positionen kodieren, mit der Maßgabe, daß die Rt-Aktivität des so kodierten RhtC-Proteins nicht beeinträchtigt ist.
Die DNA, die für im wesentlichen dasselbe Protein wie das RhtB-Protein oder das RhtC-Protein, wie vorstehend beschrieben kodiert, kann beispielsweise durch Modifizieren der Nucleotidsequenz durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten werden, so daß ein oder mehrere Aminosäurereste an einer bestimmten Stelle einer Deletion, Substitution, Insertion oder Addition unterliegen. Die wie vorstehend beschrieben modifizierte DNA kann durch herkömmlich bekannte Mutationsbehandlung erhalten werden. Die Mutationsbehandlung umfaßt ein Verfahren zur Behandlung einer DNA, die für das RhtB-Protein oder das RhtC-Protein in vitro kodiert, beispielsweise. mit Hydroxylamin, und ein Verfahren zur Behandlung eines Mikroorganismus, beispielsweise, eines Bakteriums der Gattung Escherichia, das eine für das RhtB-Protein kodierende DNA enthält, mit UV-Strahlen oder einem Mutagenisierungsmittel, wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) und salpetriger Säure, die üblicherweise für Mutationsbehandlungen verwendet werden.
Die DNA, die für im wesentlichen dasselbe Protein wie das RhtB-Protein oder das RhtC-Protein kodiert, kann durch Expremieren einer DNA, die wie vorstehend beschrieben einer in vitro-Mutationsbehandlung unterworfen worden ist, in Mehrkopienform in einer geeigneten Zelle, Untersuchen der Resistenz gegenüber Homoserin oder Threonin und Selektieren der DNA, welche die Resistenz erhöht, erhalten werden.
Es ist allgemein bekannt, daß eine Aminosäuresequenz eines Proteins und eine dafür kodierende Nucleotidsequenz sich zwischen einzelnen Arten, Stämmen, Mutanten oder Varianten leicht unterscheiden können.
Deshalb kann die DNA, die für im wesentlichen dasselbe Protein wie das RhtC-Protein kodiert, durch Isolieren einer DNA erhalten werden, die mit einer DNA, die beispielsweise eine Nucleotidsequenz der Nucleotidnummern 187 bis 804 der Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 3 aufweist, oder mit einer davon unter stringenten Bedingungen erhaltenen Sonde hybridisiert und für ein Protein mit der Rt-Aktivität aus einem Bacterium der Gattung Escherichia, das einer Mutationsbehandlung unterworfen worden ist, oder einer spontanen Mutante oder Variante eines Bacteriums der Gattung Escherichia kodiert.
Die DNA, die für im wesentlichen dasselbe Protein wie das RhtB-Protein kodiert, kann auch durch Isolieren einer DNA erhalten werden, die mit DNA, die beispielsweise eine Nucleotidsequenz der Nucleotidnummern 557 bis 1171 der Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 aufweist, oder mit einer Sonde, die unter stringenten Bedingungen davon erhalten kann, hybridisiert und für ein Protein mit der Rh-Aktivität aus einem Bacterium der Gattung Escherichia, das einer Mutationsbehandlung unterworfen worden ist, oder einer spontanen Mutante oder Variante eines Bacteriums der Gattung Escherichia kodiert.
Der hier verwendete Ausdruck ”stringente Bedingungen” bezieht sich auf Bedingungen, unter denen DNAs bei einer Salzkonzentration miteinander hybridisieren, die einer üblichen Bedingung beim Waschen in der Southern-Hybridisierung entspricht, d. h. 60°c, 1 × SSC, 0,1% SDS, vorzugsweise 0,1 × SSC, 0,1% SDS.

(2) In dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetztes Bacterium der Gattung Escherichia

Das in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Bacterium der Gattung Escherichia ist ein Bacterium der Gattung Escherichia, worin die Rt-Aktivität erhöht ist. Bevorzugte Ausführungsformen des Bacteriums sind ein Bacterium, worin die Rh-Aktivität weiter erhöht ist. Ein Bacterium der Gattung Escherichia ist beispielsweise Escherichia coli. Die Rt-Aktivität kann beispielsweise durch Erhöhen der Kopienzahl des rhtC-Strukturgens in einer Zelle oder durch Transformation eines Bacteriums der Gattung Escherichia mit einer rekombinanten DNA, worin ein DNA-Fragment, welches das rhtC-Strukturgen enthält, das für das RhtC-Protein kodiert, mit einer Promotor-Sequenz ligiert ist, die in einem Bacterium der Gattung Escherichia effizient funktioniert, erhöht werden. Die Rt-Aktivität kann ebenfalls durch Substitution der Promotor-Sequenz des rhtC-Gens auf einem Chromosom durch eine Promotor-Sequenz erhöht werden, die in einem Bacterium der Gattung Escherichia effizient funktioniert.
Daneben kann die Rh-Aktivität beispielsweise durch Erhöhen der Kopienzahl des rhtB-Strukturgens in einer Zelle oder durch Transformation eines Bacteriums der Gattung Escherichia mit einer rekombinanten DNA erhöht werden, worin ein DNA-Fragment, welches das für das RhtB-Protein kodierende rhtB-Strukturgen enthalten ist, mit einer Promotor-Sequenz ligiert ist, die in einem Bacterium der Gattung Escherichia effizient funktioniert. Die Rh-Aktivität kann auch durch Substitution der Promotor-Sequenz des rhtB-Gens auf einem Chromosom durch eine Promotor-Sequenz erhöht werden, die in einem Bacterium der Gattung Escherichia effizient funktioniert.
Die Amplifikation der Kopienzahl des rhtC-Strukturgens oder des rhtB-Strukturgens in einer Zelle kann durch Einführen eines Mehrkopienvektors, der das rhtC-Strukturgen oder das rhtB-Strukturgen trägt, in eine Zelle eines Bacteriums der Gattung Escherichia durchgeführt werden. Genauer gesagt kann die Kopienzahl durch Einführen eines Plasmids, eines Phagen oder eines Transposons (Berg, D. E. und Berg, C. M., Bio/Tecnol., 1, 417 (1983)), welches das rhtC-Strukturgen oder das rhtB-Strukturgen trägt in eine Zelle eines Bacteriums der Gattung Escherichia erhöht werden.
Der Mehrkopienvektor ist beispielsweise ein Plasmidvektor, wie pBR322, pMW118, pUC19 oder dergleichen, und Phagenvektoren, wie λ1059, λBF101, M13mp9 oder dergleichen. Das Transposon ist beispielsweise Mu, Tn10, Tn5 oder dergleichen.
Die Einführung einer DNA in ein Bacterium der Gattung Escherichia kann beispielsweise durch ein Verfahren von D. A. M. Morrison (Methods in Enzymology, 68,326 (1979)) oder ein Verfahren, bei dem eine Empfängerzelle mit Calciumchlorid zur Erhöhung der Permeabilität von DNA behandelt wird (Mandel, M. und Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159, (1970)) oder dergleichen durchgeführt werden.
Wenn die Rt-Aktivität oder die Rt-Aktivität und die Rh-Aktivität in einem Aminosäure-produzierenden Bacterium der Gattung Escherichia wie vorstehend beschrieben erhöht werden, kann die produzierte Menge der Aminosäure erhöht werden. Als Bacterium der Gattung Escherichia, worin die Rt-Aktivität oder die Rt-Aktivität und die Rh-Aktivität erhöht sein sollen, werden Stämme eingesetzt, welche die gewünschten Aminosäuren produzieren können. Daneben kann die Fähigkeit zur Produktion einer Aminosäure auf ein Bacterium, worin die Rt-Aktivität oder die Rt-Aktivität und die Rh-Aktivität erhöht sind, übertragen werden.
Auf der Grundlage der Amplifikation des rhtC-DNA-Fragments wurden neue Stämme E. coli MG442/pRhtc, der Homoserin produziert, E. coli MG442/pVIC40, pRhtc, der Threonin produziert, E. coli NZ10/pRhtBC und E. coli NZ10/pRhtB, pRhtC, welche Homoserin, Valin und Leucin produzieren, erhalten, wobei diese Stämme die Aminosäuren in einer höheren Menge als solche, die kein amplifiziertes rhtC-DNA-Fragment enthalten, anhäufen.
Die neuen Stämme wurden (gemäß einer internationalen Hinterlegung nach dem Budapester Abkommen) bei der All-Russian Collection for Industrial Microorganisms (VKPM) hinterlegt. Der Stamm E. coli MG442/pRhtc wurde mit der Hinterlegungsnummer VKPM B-7700 hinterlegt. Der Stamm E. coli MG442/pVIC40, pRhtC wurde mit der Hinterlegungsnummer VKPM B-7680 hinterlegt, der Stamm E. coli NZ10/pRhtB, pRhtC wurde mit der Hinterlegungsnummer VKPM B-7681 hinterlegt, und der Stamm E. coli NZ10/pRhtBC wurde mit der Hinterlegungsnummer VKPM B-7682 hinterlegt.
Der Stamm E. coli MG442/pRhtC (VKPM B-7700) zeigt die folgenden kulturmorphologischen und biochemischen Eigenschaften.
Cytomorphologie
Gram-negative, schwach bewegliche Stäbchen mit runden Enden, 1,5 bis 2 μm Größe in Längsrichtung.
Kulturelle Eigenschaften
Rindfleischextraktagar:
Nach 24 Stunden Wachstum bei 37°C wurden runde weißliche, halbtransparente Kolonien mit einem Durchmesser von 1,0 bis 3 mm produziert, die eine glatte Oberfläche, regelmäßige oder leicht gewellte Ränder, eine leicht erhabene Mitte, eine homogene Struktur, pastöse Konsistenz und leichte Emulgierbarkeit aufweisen.
Luria-Agar:
Nach 24-stündigem Wachstum bei 37°C entwickeln sich weißliche, halbdurchscheinende Kolonien mit einem Durchmesser von 1,5 bis 2,5 mm mit einer glatten Oberfläche, homogenen Struktur, pastösen Konsistenz und leichter Emulgierbarkeit.
Minimalagar dotiertes Medium M9:
Nach 40- bis 48-stündigem Wachstum bei 37°C bilden sich Kolonien mit einem Durchmesser von 0,5 bis 1,5 mm, die gräulich weiß, halbtransparent, leicht konvex und mit einer schimmernden Oberfläche sind.
Wachstum in Rindfleischextraktbrühe:
Nach 24-stündigem Wachstum bei 37°C zeigt sich eine starke gleichförmige Trübung mit charakteristischem Geruch.
Physiologische und biochemische Merkmale
Wächst nach Einstichimpfung in einen Rindfleischextraktagar:
Zeigt gutes Wachstum über die angeimpfte Fläche. Die Mikroorganismen stellen sich als fakultativ anaerob heraus. Verflüssigt Gelatine nicht. Zeigt gutes Wachstum auf Milch, begleitet von Milchverklumpung. Produziert kein Indol. Temperaturbedingungen: Wächst auf Rindfleischextraktbrühe bei 20 bis 42°C, wobei die optimale Temperatur zwischen 33 und 37°C liegt. Der pH-Wert des Kulturmediums: Wächst auf flüssigen Medien mit einem pH-Wert von 6 bis 8, wobei der optimale Wert bei 7,2 liegt. Kohlenstoffquellen: Zeigt gutes Wachstum auf Glucose, Fructose, Lactose, Mannose, Galactose, Xylose, Glycerin, Mannitol, wobei eine Säure und Gas hergestellt werden. Stickstoffquellen: Assimiliert Stickstoff in der Form von Ammoniumsalzen und Salzen salpetriger Säure sowie von einigen organischen Verbindungen. Resistent gegen Ampicillin.
L-Isoleucin wird als Wachstumsfaktor verwendet. Der Stamm kann jedoch ohne Isoleucin langsam wachsen. Plasmidgehalt: Die Zellen enthalten das Mehrkopieren Hybridplasmid pRhtC, das die Resistenz gegen Ampicillin (100 mg/l) sicherstellt und welches das rhtC-Gen trägt, dasfür die erhöhte Resistenz gegen Threonin (50 mg/ml) verantwortlich ist.
Der Stamm E. coli MG 442/pVIC40, pRhtc (VKPM B-7680) hat dieselben kulturmorphologischen und biochemischen Eigenschaften wie der Stamm VKPM B-7700, mit Ausnahme der Zugabe von pRhtC, er enthält ein Mehrkopienhybridplasmid pVIC40, welches die Resistenz gegen Streptomycin (100 mg/l) sicherstellt und welches die Gene des Threoninoperons enthält.
Der Stamm E. coli NZ10/pRhtB, pRhtC (VKPM B-7681) hat dieselben kulturmorphologischen und biochemischen Eigenschaften wie der Stamm VKPM B-7700, mit der Ausnahme, daß L-Threonin (0,1 bis 5 mg/ml) als Wachstumsfaktor anstelle von L-Isoleucin verwendet wird. Daneben enthält er das Mehrkopienhybridplasmid pRhtB, welches die Resistenz gegen Kanamycin (50 mg/l) sicherstellt und welches das rhtB-Gen trägt, welches Resistenz gegen Homoserin verleiht (10 mg/ml).
Der Stamm E. coli NZ10/pRhtBC (VKPM B-7682) hat dieselben kulturmorphologischen und biochemischen Eigenschaften wie der Stamm VKPM B-7681, mit der Ausnahme, daß er das Mehrkopienhybridplasmid pRhtBC enthält, welches die Resistenz gegen Ampicillin (100 mg/l) sicherstellt und welches sowohl das rhtB-Gen als auch das rhtC-Gen trägt, das Resistenz gegen Homoserin (10 mg/ml) und L-Threonin (50 mg/ml) verleiht.

(3) Verfahren zum Herstellen einer Aminosäure

Eine Aminosäure kann durch Kultivieren des Bacteriums, worin die Rt-Aktivität oder die Rt-Aktivität und die Rh-Aktivität durch Amplifizieren der Kopienzahl des rhtC-Gens oder des rhtC-Gens und des rhtB-Gens wie vorstehend beschrieben erhöht ist und welches die Fähigkeit hat, die Aminosäure zu produzieren, in einem Kulturmedium, durch Produzieren und Anhäufen der Aminosäure in dem Medium und durch Gewinnen der Aminosäure aus dem Medium effizient hergestellt werden. Die Aminosäure ist beispielsweise vorzugsweise L-Homoserin, L-Threonin oder eine verzweigte Aminosäure. Die verzweigten Aminosäuren sind beispielsweise L-Valin, L-Leucin und L-Isoleucin und vorzugsweise L-Valin und L-Leucin.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Kultivierung des Bacteriums der Gattung Escherichia, das Gewinnen und Reinigen der Aminosäuren aus dem flüssigen Medium auf ähnliche Weise wie in herkömmlichen Verfahren zur Produktion einer Aminosäure durch Fermentation unter Verwendung eines Bacteriums durchgeführt werden. Ein in der Kultivierung eingesetztes Medium kann entweder eine synthetisches oder natürliches Medium sein, solange das Medium eine Kohlenstoffquelle und eine Stickstoffquelle und Mineralien sowie bei Bedarf Nährstoffe enthält, die das eingesetzte Bakterium für das Wachstum braucht. Die Kohlenstoffquelle kann verschiedene Kohlenhydrate, wie Glycose und Saccharose und verschieden organische Säuren umfassen. In Abhängigkeit von der assimilatorischen Fähigkeit des eingesetzten Bacteriums kann ein Alkohol, einschließlich Ethanol und Glycerin, eingesetzt werden. Als Stickstoffquelle werden Ammoniak, verschiedene Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, andere Stickstoffverbindungen, wie Amine, eine natürliche Stickstoffquelle, wie Pepton, Sojabohnenhydrolysat und verdaute fermentative Microben, eingesetzt. Als Mineralien werden Monokaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisen(II)-sulfat, Mangansulfat, Calciumcarbonat eingesetzt.
Die Kultivierung ist vorzugsweise eine Kultivierung unter aeroben Bedingungen, beispielsweise eine Kultivierung unter Schütteln oder unter Belüften und Rühren. Die Kulturtemperatur ist üblicherweise 20 bis 40°C, vorzugsweise 30 bis 38°C. Der pH-Wert der Kultur ist üblicherweise zwischen 5 und 9, vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,2. Der pH-Wert der Kultur kann mit Ammoniak, Calciumcarbonat, verschiedenen Säuren, verschiedenen Basen und Puffern eingestellt werden. Üblicherweise führt eine Kultivierung über 1 bis 3 Tage zu der Anhäufung der gewünschten Aminosäure in dem Medium.
Die Gewinnung der Aminosäure kann durch Entfernen von Feststoffen, beispielsweise Zellen, aus dem Medium durch Zentrifugation oder Membranfiltration nach der Kultivierung und durch anschließendes Gewinnen und Reinigen der gewünschten Aminosäure durch Ionenaustauschverfahren, Konzentrationsverfahren und Kristallfraktionierungsverfahren und dergleichen durchgeführt werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Klonierung und Identifizierung der rhtB- und rhtC-Gene,
2 zeigt die Struktur des Plasmids pRhtB, welches das rhtB-Gen trägt,
3 zeigt die Struktur des Plasmids pRhtC, welches das rhtC-Gen trägt und
4 zeigt die Struktur des Plasmids pRhtBC, welches das rhtB-Gen und das rhtC-Gen trägt.
Beste Ausführungsform der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die Beispiele im Folgenden genauer beschrieben. In den Beispielen weist die L-Aminosäure die L-Konfiguration auf, wenn nichts anderes angegeben ist.
Beispiel 1: Erhalten des rhtB- und des rhtC-DNA-Fragments
Stufe 1. Klonen der Gene, die an der Resistenz gegen Homoserin und Threonin beteiligt sind, in das Mini-Mu-Phagemid
Die Gene, die an der Resistenz gegen Homoserin und Threonin beteiligt sind, wurden unter Verwendung des Mini-Mu-Phagemids d5005 in vivo kloniert (Groisman, E. A., et al., J. Bacteriol., 168, 357–364 (1986). Das MuCts62-Lysogen des Stammes MG442 (Guayatiner et al., Genetika (auf Russisch), 14, 947–956, (1978)) wurde als Donor eingesetzt. Frisch hergestellte Lysate wurden eingesetzt, um ein Mucts-lysogenes Derivat des Stammes VKPM B-513 (Hfr K10 metB) zu infizieren. Die Zellen wurden auf M9-Glucoseminimalmedium mit Methionin (50 μg/ml), Kanamycin (40 μg/ml) und Homoserin (10 μg/ml) plaziert. Kolonien, die nach 48 Stunden auftraten, wurden ausgewählt und isoliert. Die Plasmid-DNA wurde isoliert und eingesetzt, um dem Stamm VKPM B-513 durch Standardverfahren zu transformieren. Die Transformanten wurden auf L-Brüheagarplatten mit Kanamycin wie vorstehend beschrieben selektiert. Plasmid-DNA wurde aus denjenigen isoliert, die gegen Homoserin resistent waren, und sie wurden durch Restriktionskartierung der Struktur der eingefügten Fragmente analysiert. Es zeigte sich, daß zwei Arten von Insertionen, die zu unterschiedlichen Chromosomenbereichen gehören, von dem Donor kloniert worden waren. Somit existieren mindestens zwei unterschiedliche Gene in E. coli, die in Mehrkopien-Form Resistenz gegen Homoserin verleihen. Einer der zwei Typen von Insertionen ist das rhtA-Gen, welches bereits berichtet worden ist (ABSTRACT des 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology zusammen mit dem 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California, August 24–29, 1997). Unter dem anderen der zwei Insertionstypen verleiht nur ein MluI-MluI-Fragment von 0,8 kb Resistenz gegen Homoserin (1).
Stufe 2: Identifizierung des rhtB-Gens und des rhtC-Gens
Das Insertionsfragment wurde mit Hilfe des Dideoxykettenterminationsverfahrens von Sanger sequenziert. Beide DNA-Stränge wurden in ihrer Gesamtheit sequenziert, und alle Schnittstellen wurden überlappt. Die Sequenzierung zeigte, daß das Insertionsfragment f138 (Nukleotidnummern 61543 bis 61959 mit der GenBank Hinterlegungsnummer M87049) enthielt, welches ein bekannter, jedoch hinsichtlich der Funktion unbekannter ORF (offener Leserahmen) ist, der sich bei 86 Min. auf dem E. coli-Chromosom und etwa 350 bp stromaufwärts davon (stromabwärtige Region in der Sequenz M87049) befindet. f138, welches nur 160 Nucleotide in der 5'-flankierenden Region hat, konnte Resistenz gegen Homoserin nicht verleihen. Stromaufwärts des ORF f138 zwischen den Nucleotiden 62160 und 61950 von M87049 ist kein Terminationscodon vorhanden. Außerdem ist ein ATG nach der Sequenz vorhanden, die als Ribosomenbindungsstelle vorausgesagt ist. Der größere ORF (Nucleotidnummern 62160 bis 61546) wird als rhtB-Gen bezeichnet. Das von dem Gen abgeleitete RhtB-Protein hat eine Region, die hoch hydro-phob ist und mögliche Transmembransegmente enthält.
Wie vorstehend beschrieben wurde, verleiht das Plasmid, welches dieses Gen enthält, den Zellen nur die Resistenz gegen hohe Konzentrationen von Homoserin. Da das ursprüngliche SacII-SacII-DNA-Fragment den zweiten nicht-identifizierten ORF, 0128, enthält, wurde das Gen subkloniert und auch seine Fähigkeit zur Verleihung von Resistenz gegen Homoserin und Threonin untersucht. Es zeigte sich, daß das Plasmid, welches o128 (ClaI-Eco47III-Fragment) enthielt, Resistenz gegen 50 mg/ml Threonin verlieh (1). Das subklonierte Fragment wurde sequenziert, und es wurde gefunden, daß es das zusätzliche Nucleotid (G) in der Position zwischen den Nucleotiden 61213 und 61214 von M87049 enthält. Die Nucleotidzugabe zu der Sequenz schaltete eine Leserahmenverschiebung aus und vergrößerte den ORF in der 5'-flankierenden Region bis zu dem Nucleotid 60860. Dieses neue Gen wurde als rhtC bezeichnet. Beide Gene rhtB und rhtC wurden als homolog zu dem Transporter identifiziert, der an dem Lysinexport von Coryne-bacterium glutamicum beteiligt ist.
Beispiel 2: Wirkung der Amplifizierung der rhtB- und rhtC-Gene auf die Homoserinproduktion.

(1) Konstruktion des L-Homoserin-produzierenden Stammes E. coli NZ10/pAl4, pRhtB und Homoserinproduktion.

Das rhtB-Gen wurde in ein Plasmid pUK21 eingefügt (Vieira, J. And Messing, J., Gene, 100, 189–194 (1991)), wobei pRhtB erhalten wurde (2).
Der Stamm NZ10 von E. coli wurde mit einem Plasmid pAL4 transformiert, welches ein pBR322-Vektor ist, in den das thrA-Gen für Aspartokinase-Homoserindehydrogenase I eingeführt war, wobei der Stamm NZ10/pAL4 erhalten wurde. Der Stamm NZ10 ist eine leuB⁺-Revertante der Mutante thrB^–, die von dem E. coli-Stamm C6000 erhalten wird (thrB, leuB) (Appleyard R. K., Genetics, 39, 440–452, 1954).
Der Stamm NZ10/pAL4 wurde mit pUK21 oder pRhtB transformiert, wobei die Stämme NZ10/pAL4, pUK21 und NZ10/pAL4, pRhtB erhalten wurden.
Die so erhaltenen Transformanten wurden jeweils bei 37°C während 18 Stunden in einer Nährstoffbrühe mit 50 mg/l Kanamycin und 100 mg/l Ampicilin kultiviert, und 0,3 ml der erhaltenen Kultur wurde in 3 ml eines Fermentationsmediums, welches die folgende Zusammensetzung aufwies und 50 mg/l Kanamycin und 100 mg/l Ampicilin enthielt, ein einem 20 × 200 mm Teströhrchen eingeimpft und bei 37°C während 48 Stunden mit einem Rotationsschüttler kultiviert. Nach der Kultivierung wurden die angehäufte Menge des Homoserins in dem Medium und die Absorption bei 560 nm des Mediums durch bekannte Verfahren bestimmt. Zusammensetzung des Fermentationsmediums (g/L)

Glucose 80

(NH₄)₂SO₄ 22

K₂HOP₄ 2

NaCl 0,8

MgSO₄·7H₂O 0,8

FeSO₄·7H₂O 0,02

MnSO₄·5H₂O 0,02

Thiaminhydrochlorid 0,2

Hefeextrakt 1,0

CaCO₃ 30

(CaCO₃ wurde getrennt sterilisiert)
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 zeigt, daß der Stamm NZ10/pAL4, pRhtB Homoserin in einer größeren Menge anhäufte als der Stamm NZ10/pAL4, pUK21, worin das rhtB-Gen nicht verstärkt war. Tabelle 1

Stamm OD₅₆₀ Angehäufte Menge des Homoserins (g/L)

NZ10/pAL4, pUK21 14,3 3,3

NZ10/pAL4, pRhtB 15,6 6,4

(2) Konstruktion des Homoserin-produzierenden Stammes E. coli MG442/pRhtC und Homoserinproduktion

Das rhtC-Gen wurde in den Vektor pUC21 eingeführt (Vieira, J. And Messing, J., Gene, 100, 189–194 (1991)), wobei das Plasmid pRhtC erhalten wurde (3).
Der bekannte E. coli-Stamm MG442, der Threonin in einer Menge von nicht weniger als 3 g/L produzieren kann (Gusyatiner, et al., 1978, Genetika (auf Russisch), 14: 947–956) wurde durch Einführen von pUC21 oder pRhtC transformiert, wobei die Stämme MG442/pUC21 und MG442/pRhtC erhalten wurden.
Die so erhaltenen Transformanten wurden jeweils 18 Stunden bei 37°C in einer Nährstoffbrühe mit 100 mg/ml Ampicilin kultiviert, und 0,3 ml der erhaltenen Kultur wurden in 3 ml des vorstehend beschriebenen Fermentationsmediums, das 100 mg/ml Ampicilin enthielt, in einem 20 × 200 mm-Teströhrchen eingeimpft und 48 Stunden bei 37°C mit einem Rotationsschüttler kultiviert. Nach der Kultivierung wurden die angehäufte Menge des Homoserins in dem Medium und die Absorption bei 560 nm des Mediums durch bekannte Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2

Stamm OD₅₆₀ Angehäufte Menge des Homoserins (g/L)

MG442/pUC21 9,7 < 0,1

MG442/pRhtC 15,2 9,5
Beispiel 3: Die Wirkung der Amplifizierung der rhtB- und rhtC-Gene auf die Threoninproduktion

(1) Konstruktion des Threonin-produzierenden Stammes E. coli VG442/pVIC40, pRhtB (VKPM B-7660) und Threoinproduktion

Der Stamm MG442 wurde durch Einführen eines bekannten Plasmids pVIC40 ( U. S. Patent Nr. 5,175,107 (1992)) mit einem üblichen Transformationsverfahren transformiert. Transformanten wurden auf LB-Agarplatten, die 0,1 mg/ml Streptomycin enthielten, ausgewählt. Auf diese Weise wurde der neue Stamm MG442/pVIC40 erhalten.
Der Stamm MG442/pVIC40 wurde mit pUK21 oder pRhtB transformiert, wobei der Stamm MG442/pVIC40, pUK21 und MG442/pVIC40, pRhtB erhalten wurden.
Die so erhaltenen Transformanten wurden jeweils 18 Stunden bei 37°C in einer Nährstoffbrühe mit 50 mg/l Kanamycin und 100 mg/l Streptomycin kultiviert, und 0,3 ml der erhaltenen Kultur wurden in 3 ml eines in Beispiel 2 beschriebenen Fermentationsmediums, das 50 mg/l Kanamycin und 100 mg/l Streptomycin enthielt, in einem 20 × 200 mm-Teströhrchen eingeimpft und 68 Stunden bei 37°C mit einem Rotationsschüttler kultiviert. Nach der Kultivierung wurden die angehäufte Menge des Threonins in dem Medium und die Absorption bei 560 nm des Mediums durch bekannte Verfahren bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 zeigt, daß der Stamm MG442/pViC40, pRhtB Threonin in einer größeren Menge anhäufte als der Stamm Mg442/pVIC40, pUK21, worin das rthB-Gen nicht vermehrt war. Tabelle 3

Stamm OD₅₆₀ Angehäufte Menge des Threonins (g/L)

MG442/pVIC40, pUK21 16,3 12,9

MG442/pVIC40, pRhtB 15,2 16,3

(2) Konstruktion des Threonin-produzierenden Stammes E. coli VG442/pVIC40, pRhtC (VKPM B-7680) und Threoninproduktion

Der Stamm MG442/pVIC40 wurde mit pRhtC und pUC21 transformiert. Auf diese Weise wurden die Transformanten MG442/pVIC40, pRHtC und MG442/pVIC40, pUC21 erhalten. Auf dieselbe Weise wie vorstehend beschrieben wurden MG442/pVIC40, pUC21 und MG442/pVIC40, pRhtC jeweils 18 Stunden bei 37°C in einer Nährstoffbrühe mit 100 mg/l Ampicilin und 100 mg/l Streptomycin kultiviert, und 0,3 ml der erhaltenen Kultur wurden in 3 ml des vorstehend beschriebenen Fermentationsmediums, das 100 mg/l Ampicilin und 100 mg/l Streptomycin enthielt, in einem 20 × 200 mm Teströhrchen eingeimpft und 46 Stunden bei 37°C mit einem Rotationsschüttler kultiviert. Nach der Kultivierung wurden die angehäufte Menge des Threonins in dem Medium und die Absorption des Mediums bei 560 nm durch bekannte Verfahren bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4 zeigt, daß der Stamm MG442/pVIC40, pRhtC Threonin in einer größeren Menge anhäufte als der Stamm MG442/pVIC40, pUC21, worin das rhtC-Gen nicht vermehrt war. Tabelle 4

Stamm OD₅₆₀ Angehäufte Menge des Threonins (g/L)

MG442/pVIC40, pUK21 17,4 4,9

MG442/pVIC40, pRhtB 15,1 10,2
Beispiel 4: Konzertierte Wirkung des rhtB-Gens und des rhtC-Gens auf die Aminosäureproduktion.
Das SacII-SacII-DNA-Fragment, das sowohl das rhtB-Gen als auch das rhtC-Gen enthielt, wurde in pUC21 eingeführt. Auf diese Weise wurde das Plasmid pRhtBC erhalten, welches das rhtB-Gen und das rhtC-Gen enthält (4).
Dann wurde der Stamm NZ10 mit pUC21, pRhtB, pRhtC oder pRhtBC transformiert, und die Transformanten NZ10/pUC21 (VKPM B-7685), NZ10/pRhtB (VKPM B-7683), NZ10/pRhtC, (VKPM B-7684), NZ10/pRhtB, pRhtC (VKPM B-7681) und NZ10/pRhtBC (VKPM B-7682) wurden somit erhalten.
Die vorstehend beschriebenen Transformanten wurden auf dieselbe Weise wie vorstehend beschrieben kultiviert, und die angehäuften Mengen der verschiedenen Aminosäuren in dem Medium sowie die Absorption des Mediums bei 540 nm wurden durch bekannte Verfahren bestimmt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5 zeigt, daß die konzertierte Wirkung von pRhtB und pRhtC auf die Produktion von Homoserin, Valin und Leucin gegeben ist. Diese Ergebnisse zeigen, daß die rhtB- und rhtC-Genprodukte in Zellen wechselwirken können. Tabelle 5

Stamm	0D₅₆₀	Homoserin (g/L)	Valin (g/L)	Leucin (g/L)
NZ10/pUC21	18,7	0,6	0,22	0,16
NZ10/pRhtB	19,6	2,3	0,21	0,14
NZ10/pRhtC	20,1	0,7	0,2	0,15
NZ10/pRhtBC	21,8	4,2	0,34	0,44
NZ10/pRhtB, pRhtC	19,2	4,4	0,35	0,45

Beispiel 5: Wirkung des rhtB-Gens und des rhtC-Gens auf die Resistenz gegen Aminosäuren
Wie vorstehend beschrieben wurde, haben die Plasmide, die rhtB und rhtC enthalten, eine positive Wirkung auf die Anhäufung einiger Aminosäuren in der Kulturbrühe durch verschiedene Bakterienstämme. Es zeigte sich, daß das Muster der angehäuften Aminosäure von dem Genotyp des Stammes abhing. Die Homologie der rhtB- und der rhtC-Genprodukte mit dem Lysintransporter LysE von Coryne-bacterium glutamicum (Vrljic, M., Sahm, H. und Eggeling, L. (1996) Mol. Microbiol. 22, 815–826) zeigt die analogen Funktionen für diese Proteine.
Deshalb wurde die Wirkung der Plasmide pRhtB und pRhtC auf die Empfindlichkeit des Stammes N99, der eine Streptomycin-resistente (Str^R)-Mutante des bekannten Stammes W3350 (VKPM B-1557) ist, gegenüber einigen Aminosäuren und Aminosäureanaloga untersucht. Übernacht-Kulturbrühen (10⁹ cfu/ml) der Stämme N99/pUC21, N99pUK21, N99/pRhtB und N99/pRhtC wurden in M9-Minimalmedium 1:100 verdünnt und 5 Stunden in demselben Medium gezüchtet. Dann wurden die so erhaltenen Kulturen der logarythmischen Phase verdünnt, und es wurden etwa 10⁴ lebende Zellen auf gut getrocknete Versuchsplatten mit M9-Agar (2%), welche immer die doppelte Menge der Aminosäuren oder Analoga enthielten, aufgetragen. Auf diese Weise wurde die minimale inhibitorische Konzentration (MIC) dieser Verbindungen untersucht.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6 zeigt, daß multiple Kopien von rhtB neben Homoserin eine erhöhte Resistenz gegen α-Amino-β-hydroxyvaleriansäure (AHVA) und S-(2-Aminoethyl)-L-cystein (AEC) und 4-Aza-DL-Leucin verliehen; und multiple Kopien des rhtC-Gens erhöhten neben Threonin auch die Resistenz gegen Valin, Histidin und AHVA. Diese Ergebnisse deuten an, daß jeder der vermuteten Transporter RhtB und RhtC gegenüber mehreren Substraten (Aminosäuren) Spezifitäten aufweisen, oder aufgrund der Amplifikation nicht spezifische Wirkungen zeigen. Tabelle 6

Substrat	MIC (μg/ml)
Substrat	N99/pUC21	N99/pRhtB	N99/pRhtC
L-Homoserin	1000	20000	1000
L-Threonin	30000	40000	80000
L-Valin	0,5	0,5	2,0
L-Histidin	5000	5000	40000
AHVA	100	2000	15000
AEC	5	20	5
4-Aza-DL-Leucin	50	100	50
O-Methyl-L-threonin	20	20	20

*: Dieselben Daten wurden für N99/pUK21 erhalten. SEQUENZLISTE

Claims

Verfahren zum Herstellen der Aminosäure L-Homoserin oder L-Threonin, welches die folgenden Stufen umfasst: Kultivieren eines Bakteriums, das die Aminosäure produzieren kann, in einem Kulturmedium unter Herstellung und Anhäufung der Aminosäure in dem Medium und Gewinnen der Aminosäure aus dem Medium, wobei das Bakterium zur Gattung Escherichia gehört, worin die L-Threonin-Resistenz des Bakteriums durch Verstärken der Aktivität eines Proteins, das nachfolgend in (A) oder (B) definiert ist, in den Zellen des Bakteriums erhöht ist: (A) ein Bakterium, welches die in SEQ ID Nr. 4 des Sequenzprotokolls gezeigte Aminosäuresequenz aufweist; oder (B) ein Protein, welches die Aminosäuresequenz, einschließlich Deletion, Substitution, Insertion oder Addition einer oder mehrerer Aminosäuren in der in SEQ ID Nr. 4 des Sequenzprotokolls gezeigten Aminosäuresequenz aufweist und die Wirkung hat, ein das Protein enthaltende Bakterium L-Threonin-resistent zu machen, wobei das Protein von einer DNA, die nachfolgend in (A) oder (B) definiert ist, kodiert wird: (a) eine DNA, welche die Nucleotidsequenz der Nucleotidnummern 187 bis 804 in der SEQ ID Nr. 3 enthält; (b) eine DNA, welche mit einer Nucleotidsequenz der Nucleotidnummern 187 bis 804 in der SEQ ID Nr. 3 unter einer stringenten Bedingung hybridisiert und für ein Protein mit der Wirkung kodiert, ein das Protein enthaltende Bakterium L-Threonin-resistent zu machen, wobei die stringente Bedingung eine Bedingung ist, bei der das Waschen bei 60°C bei einer Salzkonzentration, die 1 × SSC und 0,1% SDS entspricht, durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die L-Homoserin-Resistenz des Bakteriums außerdem durch Verstärken der Aktivität eines nachfolgend in (C) oder (D) definierten Proteins in den Zellen des Bakteriums erhöht ist: (C) ein Protein, welches die in SEQ ID Nr. 2 des Sequenzprotokolls gezeigte Aminosäuresequenz aufweist; oder (D) ein Protein, welches die Aminosäuresequenz, einschließlich Deletion, Substitution, Insertion oder Addition einer oder mehrerer Aminosäuren in der in SEQ ID Nr. 2 des Sequenzprotokolls gezeigten Aminosäuresequenz aufweist und die Wirkung hat, ein das Protein enthaltende Bakterium L-Homoserin-resistent zu machen.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das in (C) oder (D) definierte Protein von einer DNA kodiert wird, die nachfolgend in (c) oder (d) definiert ist: (c) eine DNA, welche die Nucleotidsequenz der Nucleotidnummern 557 bis 1171 in der SEQ ID Nr. 1 enthält; (d) eine DNA, welche mit einer Nucleotidsequenz der Nucleotidnummern 557 1171 in SEQ ID Nr. 1 unter einer stringenten Bedingung hybridisiert und, für ein Protein mit der Wirkung kodiert, ein das Protein enthaltende Bakterium L-Homoserin-resistent zu machen, wobei die stringente Bedingung eine Bedingung ist, bei der das Waschen bei 60°C und einer Salzkonzentration, die 1 × SSC und 0,1% SDS entspricht, durchgeführt wird.
Verfahren zum Herstellen einer Aminosäure, welches die folgenden Stufen umfasst: Kultivieren eines Bakteriums, das die Aminosäure produzieren kann, in einem Kulturmedium unter Herstellung und Anhäufung der Aminosäure in dem Medium und Gewinnen der Aminosäure aus dem Medium, wobei das Bakterium zur Gattung Escherichia gehört, worin die L-Threonin-Resistenz des Bakteriums durch Verstärken der Aktivität eines Proteins, das nachfolgend in (A) oder (B) definiert ist, in den Zellen des Bakteriums erhöht ist: (A) ein Bakterium, welches die in SEQ ID Nr. 4 des Sequenzprotokolls gezeigte Aminosäuresequenz aufweist; oder (B) ein Protein, welches die Aminosäuresequenz, einschließlich Deletion, Substitution, Insertion oder Addition einer oder mehrerer Aminosäuren in der in SEQ ID Nr. 4 des Sequenzprotokolls gezeigten Aminosäuresequenz aufweist und die Wirkung hat, ein das Protein enthaltende Bakterium L-Threonin-resistent zu machen, wobei das Protein von einer DNA, die nachfolgend in (A) oder (B) definiert ist, kodiert wird: (a) eine DNA, welche die Nucleotidsequenz der Nucleotidnummern 187 bis 804 in der SEQ ID Nr. 3 enthält; (b) eine DNA, welche mit einer Nucleotidsequenz der Nucleotidnummern 187 bis 804 in der SEQ ID Nr. 3 unter einer stringenten Bedingung hybridisiert und für ein Protein mit der Wirkung kodiert, ein das Protein enthaltende Bakterium L-Threonin-resistent zu machen, wobei die stringente Bedingung eine Bedingung ist, bei der das Waschen bei 60°C bei einer Salzkonzentration, die 1 × SSC und 0,1% SDS entspricht, durchgeführt wird und wobei die L-Homoserin-Resistenz des Bakteriums außerdem durch Verstärken der Aktivität eines nachfolgend in (C) oder (D) definierten Proteins in den Zellen des Bakteriums erhöht ist: (C) ein Protein, welches die in SEQ ID Nr. 2 des Sequenzprotokolls gezeigte Aminosäuresequenz aufweist; oder (D) ein Protein, welches die Aminosäuresequenz, einschließlich Deletion, Substitution, Insertion oder Addition einer oder mehrerer Aminosäuren in der in SEQ ID Nr. 2 des Sequenzprotokolls gezeigten Aminosäuresequenz aufweist und die Wirkung hat, ein das Protein enthaltende Bakterium L-Homoserin-resistent zu machen.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Aminosäure eine verzweigte Aminosäure ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die verzweigte Aminosäure L-Valin oder L-Leucin ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das in (C) oder (D) definierte Protein von einer DNA kodiert wird, die nachfolgend in (c) oder (d) definiert ist: (c) eine DNA, welche die Nucleotidsequenz der Nucleotidnummern 557 bis 1171 in der SEQ ID Nr. 1 enthält; (d) eine DNA, welche mit einer Nucleotidsequenz der Nucleotidnummern 557 1171 in SEQ ID Nr. 1 unter einer stringenten Bedingung hybridisiert und für ein Protein mit der Wirkung kodiert, ein das Protein enthaltende Bakterium L-Homoserin-resistent zu machen, wobei die stringente Bedingung eine Bedingung ist, bei der das Waschen bei 60°C und einer Salzkonzentration, die 1 × SSC und 0,1% SDS entspricht, durchgeführt wird.