ES2293707T5

ES2293707T5 - Método para producir L aminoácidos

Info

Publication number: ES2293707T5
Application number: ES99125406.1T
Authority: ES
Inventors: Vitaliy Arkadyevich Livshits; Natalia Pavlovna Zakataeva; Vladimir Veniaminovich Aleshin; Alla Valentinovna Belareva; Irina Lyvovna Tokhmakova
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1998-12-23
Filing date: 1999-12-20
Publication date: 2014-10-23
Anticipated expiration: 2019-12-20
Also published as: RU2148642C1; ZA997819B; EP1013765A1; DK1013765T3; DE69937036T3; CN1260393A; DE69937036T2; US20160289716A1; SK288294B6; AU774069B2; EP1013765B1; SK286619B6; AU6543599A; KR20000048340A; MXPA00000178A; ID24025A; US20050239177A1; DK1013765T4; EP1013765B2; DE69937036D1

Description

Método para producir L-aminoácidos.

Campo técnico

La presente invención se refiere a la biotecnología, y más particularmente a un método para producir un aminoácido, especialmente a un método para producir L-homoserina, L-treonina, L-valina o L-leucina usando una bacteria que pertenece al género Escherichia.

Antecedentes de la técnica

Se ha obtenido, con respecto a K-12 de E. coli, un mutante que tiene la mutación thrR que está involucrado en la resistencia a concentraciones elevadas de treonina u homoserina en un medio mínimo (Astaurova, O.B. et al., Appl. Bioch. And Microbiol., 21, 611-616 (1985)). La mutación mejoró la producción de L-treonina (patente SU nº 974817), de homoserina y de glutamato (Astaurova, O.B. et al., Appl. Bioch. And Microbiol., 27, 556-561, 1991) mediante las cepas productoras de E. coli respectivas.

Además, se ha revelado que la mutación thrR existe a 18 min en el cromosoma de E. coli, y que la mutación surge en ORF1 entre los genes pexB y ompX. La unidad que expresa una proteína codificada por el ORF se ha designado como gen rhtA (rht: resistencia a homoserina y treonina). El gen rhtA incluye una región no codificante en 5’ que incluye la secuencia de SD, el ORF1 y un terminador. También, se ha encontrado que un gen rhtA de tipo natural participa en la resistencia a treonina y a homoserina si se clona en un estado de múltiples copias, y que la mutación rhtA23 es una sustitución de A por G en la posición –1 con respecto al codón de partida de ATG (ABSTRACTS of 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology junto con 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California, 24-29 de agosto de 1997, resumen nº 457).

Se ha encontrado previamente que existen en E. coli, durante la clonación del gen rhtA, al menos dos genes diferentes que proporcionan resistencia a treonina y a homoserina en un estado de múltiples copias. Uno de los genes es el gen rhtA, y se encontró que el otro gen era el gen rthB que confiere resistencia a homoserina (solicitud de patente rusa nº 98118425).

Descripción de la invención

Un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un método para producir un aminoácido, especialmente L-homoserina, L-treonina y aminoácidos de cadena ramificada, con un mayor rendimiento.

Se ha encontrado que una región a 86 min sobre el cromosoma de E. coli, cuando se clona mediante un vector de múltiples copias, imparte resistencia a L-homoserina a células de E. coli. Se ha encontrado además que existe en la región en dirección 5’ otro gen, rhtC, que implica resistencia a treonina, y que cuando se amplifican estos genes la productividad de aminoácidos de E. coli se puede mejorar como el gen rthA. En base a estos hallazgos, se ha completado la presente invención.

De este modo, es divulgado lo expuesto a continuación:

(1): una bacteria que pertenece al género de Escherichia, en la que la resistencia a L-treonina de la bacteria está potenciada potenciando una actividad de proteína como se define en los siguientes apartados (A) o (B) en una célula de la bacteria:

(A): una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 4; o

(B): una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que incluye la supresión, sustitución, inserción o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 4, y que tiene una actividad que hace que la bacteria tenga la proteína resistente a L-treonina;

(2): la bacteria según (1), en la que la resistencia a L-homoserina de la bacteria está potenciada potenciando una actividad de proteína como se define en los siguientes apartados (C) o (D) en una célula de la bacteria:

(C): una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 2; o

(D): una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que incluye la supresión, sustitución, inserción o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 2, y que tiene una actividad que hace que una bacteria tenga la proteína resistente a L-homoserina;

(3): la bacteria según (1) o (2), en la que la actividad de proteína como se define en los apartados (A) o (B) está

potenciada mediante la transformación de la bacteria con ADN que codifica la proteína como se define en los apartados (A) o (B);

(4): la bacteria según (2), en la que la actividad de proteína como se define en los apartados (C) o (D) está potenciada mediante la transformación de la bacteria con ADN que codifica la proteína como se define en los apartados (C) o (D);

(5): un método para producir un aminoácido, que comprende las etapas siguientes:

cultivar la bacteria como se define en uno cualquiera de los apartados (1) a (4), que tiene la capacidad de producir un aminoácido, en un medio de cultivo, para producir y acumular el aminoácido en el medio, y recuperar el aminoácido del medio;

(6): el método según (5), en el que el aminoácido se selecciona del grupo que consiste en L-homoserina, L-treonina y aminoácidos de cadena ramificada;

(7): el método según (6), en el que el aminoácido de cadena ramificada es L-valina o L-leucina;

(8): un ADN que codifica una proteína definida en los siguientes apartados (A) o (B):

(A): una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 4;

(B): una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 4, que incluye la sustitución, supresión, inserción, adición o inversión de uno o varios aminoácidos, y que tiene una actividad para hacer que la bacteria tenga la proteína resistente a L-treonina;

(9): el ADN de (8) que es un ADN definido en los siguientes apartados (a) o (b):

(a): un ADN que comprende la secuencia nucleotídica de números de nucleótidos 187 a 804 en SEC ID nº: 3;

(b): un ADN que se puede hibridar con una secuencia nucleotídica de números de nucleótidos 187 a 804 en SEC ID nº: 3, o una sonda preparada a partir de la secuencia nucleotídica en una condición restrictiva, y que codifica una proteína que tiene la actividad de hacer que una bacteria tenga la proteína resistente a L-treonina; y

(10): el ADN de (9), en el que la condición restrictiva es una condición en la que el lavado se realiza a 60ºC, y a una concentración salina que corresponde a 1 x SSC y 0,1% de SDS.

El fragmento de ADN que codifica la proteína como se define en los apartados (A) o (B) anteriores se puede denominar como “gen rhtC”; una proteína codificada por el gen rhtC se puede denominar como la “proteína RhtC”; el ADN que codifica la proteína como se define en los apartados (C) o (D) anteriores se puede denominar como “gen rhtB”; una proteína codificada por el gen rhtB se puede denominar como “proteína RhtB”. Una actividad de la proteína RhtC que participa en la resistencia a L-treonina de una bacteria (es decir, una actividad que hace que la bacteria tenga la proteína RhtC resistente a L-treonina) se puede denominar como “actividad Rt”; y una actividad de la proteína RhtB que participa en la resistencia a L-homoserina de una bacteria (es decir, una actividad que hace que una bacteria tenga la proteína RhtB resistente a L-homoserina) se puede denominar como “actividad Rh”. Un gen estructural que codifica la proteína RhtC o la proteína RhtB en el gen rhtC o rhtB se puede denominar como “gen estructural de rhtC” o “gen estructural de rhtB”. La expresión “potenciar la actividad de Rt o la actividad de Rh” significa impartir resistencia a treonina o a homoserina a una bacteria, o potenciar la resistencia por medio del aumento del número de moléculas de la proteína RhtC o de la proteína RhtB aumentando una actividad específica de estas proteínas, o desensibilizando la regulación negativa frente a la expresión o la actividad de estas proteínas o similar. La expresión “ADN que codifica una proteína” significa un ADN que tiene una cadena que codifica la proteína cuando el ADN es bicatenario. La expresión resistencia a L-treonina significa que una bacteria crece en un medio mínimo que contiene L-treonina a una concentración a la que su cepa de tipo natural no crece, habitualmente > 30 mg/ml. La expresión resistencia a L-homoserina significa que una bacteria crece en un medio mínimo que contiene L-homoserina a una concentración a la que su cepa de tipo natural no crece, habitualmente a > 5 mg/ml. La capacidad para producir un aminoácido significa que una bacteria produce y acumula el aminoácido en un medio en una cantidad mayor que su cepa de tipo natural.

La presente invención se explicará con mayor detalle a continuación.

<1> ADN utilizado para codificar una proteína utilizada en el método de la presente invención.

El primer fragmento de ADN usado para la presente invención (gen rhtC) codifica una proteína que tiene la actividad de Rt y que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 4. Específicamente, el ADN se puede ejemplificar

mediante un ADN que comprende una secuencia nucleotídica de números de nucleótidos 187 a 804 de una secuencia nucleotídica de SEC ID nº: 3.

El segundo fragmento de ADN usado para la presente invención (gen rhtB) codifica una proteína que tiene la actividad de Rh y que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 2. Específicamente, el ADN se puede ejemplificar mediante un ADN que comprende una secuencia nucleotídica de números de nucleótidos 557 a 1171 de una secuencia nucleotídica de SEC ID nº: 1.

El gen rhtB que tiene la secuencia nucleotídica de SEC ID nº: 1 corresponde a una parte de la secuencia complementaria a la secuencia de número de acceso de GenBank M87049, e incluye f138 (números de nucleótidos 61959-61543 de M87049) que es un ORF (marco de lectura abierta) conocido pero de función desconocida, presente en 86 min sobre el cromosoma de E. coli, y sus regiones de flanqueo en 5’ y en 3’. El f138, que sólo tenía 160 nucleótidos en la región de flanqueo en 5’, no pudo impartir resistencia a homoserina. No había ningún codón de terminación entre los nucleótidos 62160 y 61959 de M87049 (en dirección 5’ del f138 del ORF). Además, uno de los codones de ATG de esta secuencia está precedido por un sitio de unión a ribosoma (62171-62166 en M87049). Por tanto, la región codificante tiene 201 pb más, y es más larga. El ORF más grande (números de nucleótidos 62160 a 61546 de M87049) se denomina como gen rhtB.

El gen rhtB se puede obtener, por ejemplo, infectando la cepa lisogénica Mucts de E. coli usando un lisado de una cepa lisogénica de E. coli, tal como K12 o W3110, según el método en el que se usa un fagémido mini-Mu d5005 (Groisman, E.A., et al., J. Bacteriol., 168, 357-364 (1986)), y asilando los ADN de los fagémidos a partir de colonias que crecen en un medio mínimo que contiene canamicina (40 µg/ml) y L-homoserina (10 mg/ml). Como se ilustra en el Ejemplo descrito más abajo, el gen rhtB se cartografió en 86 min sobre el cromosoma de E. coli. Por lo tanto, el fragmento de ADN que incluye el gen rhtB se puede obtener a partir del cromosoma de E. coli mediante hibridación de colonias o mediante PCR (reacción en cadena de polimerasa; refiérase a White, T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)) usando un oligonucleótido u oligonucleótidos que tienen una secuencia que corresponde a la región próxima a la porción de 86 min sobre el cromosoma de E. coli.

Como alternativa, el oligonucleótido se puede diseñar según la secuencia nucleotídica de SEC ID nº: 1. Toda la región codificante se puede amplificar usando, como cebadores para PCR, oligonucleótidos que tienen secuencias nucleotídicas que corresponden a una región en dirección 5’ desde el número de nucleótido 557, y a una región en dirección 3’ desde el número de nucleótido 1171 en SEC ID nº: 1.

La síntesis de los oligonucleótidos se puede realizar mediante un método normal tal como el método de fosforamidito (véase Tetrahedron Letters, 22, 1859 (1981)) usando un sintetizador de ADN comercialmente disponible (por ejemplo, el modelo 380B de sintetizador de ADN producido por Applied Biosystems). Además, la PCR se puede realizar usando un aparato de PCR comercialmente disponible (por ejemplo, el modelo PJ2000 de ciclador térmico de ADN producido por Takara Shuzo Co., Ltd.), usando Taq ADN polimerasa (suministrado por Takara Shuzo Co., Ltd.) según un método designado por el proveedor.

El gen rhtC se obtuvo en el fragmento de ADN que incluye el gen rhtB por casualidad cuando rhtB se clonó como se describe más abajo en las realizaciones. El gen rhtC corresponde a una secuencia corregida, como se describe más abajo, de 0128 (números de nucleótidos 60860-61480 del número de acceso de GenBank M87049) que es un ORF conocido pero de función desconocida. El gen rhtC se puede obtener mediante PCR o mediante hibridación usando oligonucleótidos diseñados según la secuencia nucleotídica de SEC ID nº: 3. Toda la región codificante se puede amplificar usando, como cebadores para la PCR, oligonucleótidos que tienen la secuencia nucleotídica que corresponde a una región en dirección 5’ desde el número de nucleótido 187, y a una región en dirección 3’ desde el número de nucleótido 804, en SEC ID nº: 3.

En la presente invención, el ADN que codifica la proteína RhtB de la presente invención puede codificar la proteína RhtB que incluye la supresión, sustitución, inserción, o adición de uno o varios aminoácidos en una o más posiciones, con la condición de que no se deteriore la actividad de Rh de la proteína RhtB codificada por él. De forma similar, el ADN que codifica la proteína RhtC de la presente invención puede codificar la proteína RhtC que incluye la supresión, sustitución, inserción o adición de uno o varios aminoácidos en una o más posiciones, con la condición de que no se deteriore la actividad de Rt de la proteína codificada por él.

El ADN, que codifica la sustancialmente misma proteína que la proteína RhtB o la proteína RhtC como se describe anteriormente, se puede obtener, por ejemplo, modificando la secuencia nucleotídica, por ejemplo por medio del método de mutagénesis dirigida al sitio, de forma que uno o más restos de aminoácidos en un sitio específico implican la supresión, sustitución, inserción o adición. El ADN modificado como se describe anteriormente se puede obtener mediante el tratamiento de mutación conocido convencionalmente. El tratamiento de mutación incluye un método para tratar un ADN que codifica la proteína RhtB o la proteína RhtC in vitro, por ejemplo con hidroxilamina, y un método para tratar un microorganismo, por ejemplo una bacteria, que pertenece al género de Escherichia que produce un ADN que codifica la proteína RhtB, con radiación ultravioleta o con un agente mutante tal como N-metilN’-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) y ácido nitroso usados habitualmente en el tratamiento de mutación.

El ADN, que codifica sustancialmente la misma proteína que la proteína RhtB o la proteína RhtC, se puede obtener expresando un ADN sometido a un tratamiento de mutación in vitro como se describe anteriormente en múltiple copia en una célula apropiada, investigando la resistencia a homoserina o a treonina, y seleccionando el ADN que aumenta la resistencia.

Generalmente se sabe que una secuencia de aminoácidos de una proteína, y una secuencia nucleotídica que la codifica, puede ser ligeramente diferente entre especies, cepas, mutantes o variantes.

Por lo tanto, el ADN, que codifica sustancialmente la misma proteína que la proteína RhtC, se puede obtener aislando un ADN que se hibrida con ADN que tiene, por ejemplo, una secuencia nucleotídica de los números de nucleótidos 187 a 804 de la secuencia nucleotídica de SEC ID nº: 3, o una sonda que se puede obtener a partir de ella en condiciones restrictivas, y que codifica una proteína que tiene la actividad de Rt, a partir de una bacteria que pertenece al género Escherichia que se somete a tratamiento de mutación, o un mutante espontáneo o una variante de una bacteria que pertenece al género Escherichia.

También, el ADN, que codifica sustancialmente la misma proteína que la proteína RhtB, se puede obtener aislando un ADN que se hibrida con ADN que tiene, por ejemplo, una secuencia nucleotídica de los números de nucleótidos 557 a 1171 de la secuencia nucleotídica de SEC ID nº: 1, o una sonda que se puede tener a partir de ella en condiciones restrictivas, y que codifica una proteína que tiene la actividad de Rh, a partir de la bacteria que pertenece al género Escherichia que se somete a tratamiento de mutación, o un mutante espontáneo o una variante de una bacteria que pertenece al género Escherichia.

La expresión “condiciones restrictivas”, usada en la presente memoria, es una condición en la que los ADN se hibridan entre sí a una concentración salina que corresponde a una condición normal de lavado en hibridación Southern, es decir, 60ºC, 1 x SSC, 0,1% de SDS, preferiblemente 0,1 x SSC, 0,1% de SDS.

<2> Bacteria que pertenece al género Escherichia utilizada en el método de la presente invención

La bacteria que pertenece al género Escherichia utilizada en el método de la presente invención es una bacteria que pertenece al género Escherichia cuya actividad de Rt está potenciada. Una forma de realización preferida de la bacteria es una bacteria que tiene potenciada además la actividad de Rh. Una bacteria que pertenece al género Escherichia se ejemplifica por Escherichia coli. La actividad de Rt se puede potenciar, por ejemplo, mediante amplificación del número de copias del gen estructural rhtC en una célula, o mediante transformación de una bacteria que pertenece al género Escherichia con un ADN recombinante en el que se liga un fragmento de ADN, que incluye el gen estructural rhtC que codifica la proteína RhtC, con una secuencia promotora que funciona eficazmente en una bacteria que pertenece al género Escherichia. La actividad de Rt también se puede potenciar mediante la sustitución de la secuencia promotora del gen rhtC en un cromosoma por una secuencia promotora que funciona eficazmente en una bacteria que pertenece al género Escherichia.

Además, la actividad de Rh se puede potenciar, por ejemplo, mediante amplificación del número de copias del gen estructural rhtB en una célula, o mediante transformación de una bacteria que pertenece al género Escherichia con ADN recombinante, en la que un fragmento de ADN que incluye el gen estructural rhtB que codifica la proteína RhtB se liga con una secuencia promotora que funciona eficazmente en una bacteria que pertenece al género Escherichia. La actividad de Rh también se puede potenciar mediante sustitución de la secuencia promotora del gen rhtB en un cromosoma por una secuencia promotora que funciona eficazmente en una bacteria que pertenece al género Escherichia.

La amplificación del número de copias del gen estructural rhtC o del gen estructural rhtB en una célula se puede realizar mediante la introducción de un vector de múltiples copias que porta el gen estructural rhtC o el gen estructural rhtB en una célula de una bacteria que pertenece al género Escherichia. Específicamente, el número de copias se puede incrementar mediante la introducción de un plásmido, un fago o un transposón (Berg, D.E. y Berg,

C.M. Bio/Tecnol., 1, 417 (1983)) que porta el gen estructural rhtC o el gen estructural rhtB en una célula de una bacteria que pertenece al género Escherichia.

El vector de múltiples copias se ejemplifica mediante vectores plasmídicos tales como pBR322, pMV118, pUC19 o similares, y los vectores fágicos tales como λ1059, λBF101, M13mp19 o similares. El transposón se ejemplifica por Mu, Tn10, Tn5 o similares.

La introducción de un ADN en una bacteria que pertenece al género Escherichia se puede realizar, por ejemplo, mediante el método de D.A.M. Morrison (Methods in Enzymology, 68, 326 (1979)), o mediante un método en el que se trata una célula bacteriana receptora con cloruro de calcio para aumentar la permeabilidad del ADN (Mandel, M. y Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159, (1970)), y similares.

Si la actividad de Rt, o la actividad de Rt y la actividad de Rh se potencian en una bacteria que produzca aminoácidos y que pertenezca al género Escherichia como se describe anteriormente, la cantidad del aminoácido producida puede aumentar. Puesto que se potencia la bacteria que pertenece al género Escherichia que posee la

actividad de Rt, o la actividad de Rt y la actividad de Rh, se usan cepas que tengan la capacidad para producir los aminoácidos deseados. Además, la capacidad para producir un aminoácido se puede impartir a una bacteria en la que esté potenciada la actividad de Rt, o la actividad de Rt y la actividad de Rh.

Basándose en la amplificación del fragmento de ADN de rhtC, se obtuvieron las nuevas cepas MG442/pRhtC de E. coli que produce homoserina; la MG442/pVIC40, pRhtC de E. coli que produce treonina; NZ10/pRhtBC de E. coli y NZ10/pRhtC, pRhtC de E. coli que producen homoserina, valina y leucina; las cuales acumulan los aminoácidos en una cantidad mayor que aquellas que no contienen el fragmento de ADN de rhtC amplificado.

Las nuevas cepas se han depositado (según el depósito internacional basado en el Tratado de Budapest) en la All-Rusian Collection for Industrial Microorganisms (VKPM). La cepa MG442/pRhtC de E. coli se ha depositado con el número de acceso de VKPM B-7700; la cepa MG442/pVIC40, pRhtC de E. coli se ha depositado con el número de acceso de VKPM B-7680; la cepa NZ10/pRhtB, pRhtC de E. coli se ha depositado con el número de acceso de VKPM B-7681, y la cepa NZ10/pRhtBC de E. coli se ha depositado con el número de acceso de VKPM B-7682.

La cepa MG442/pRhtC de E. coli (VKPM B-7700) muestra las siguientes características morfológicas y bioquímicas de cultivo. Citomorfología Bacilos Gram negativos débilmente móviles que tienen extremos redondeados. Tamaño longitudinal, 1,5 a 2 µm. Características de cultivos

Agar de extracto de carne de vacuno: Después de 24 horas de crecimiento a 37ºC, produce colonias semitransparentes blanquecinas redondas de 1,0 a 3 mm de diámetro, con una superficie lisa, bordes regulares o ligeramente ondulados, con el centro ligeramente elevado, con estructura homogénea, con una consistencia parecida a una pasta, fácilmente emulsionables.

Agar de Luria:

Después de un crecimiento durante 24 horas a 37ºC, desarrolla colonias semitranslúcidas blanquecinas de 1,5 a

2,5 mm de diámetro que tienen una superficie lisa, estructura homogénea, consistencia parecida a una pasta, fácilmente emulsionables. Medio M9 dopado con agar mínimo: Después de 40 a 48 horas de crecimiento a 37ºC, forma colonias de 0,5 a 1,5 mm de diámetro, que tienen un

color blanco grisáceo, semitransparentes, y ligeramente convexas, con una superficie lustrosa. Crecimiento en un caldo de extracto de carne de vacuno: Después de un crecimiento durante 24 horas a 37ºC, muestra una fuerte turbidez uniforme, y tienen un olor

característico. Características fisiológicas y bioquímicas

Crecimientos con la inoculación violenta en un agar de extracto de carne de vacuno:

Muestra buen crecimiento en todo el área inoculada. El microorganismo demuestra ser un anaerobio facultativo.

No licúa gelatina. Tiene un buen crecimiento en la leche, acompañado de coagulación de la leche. No produce indol. Condiciones de temperatura: crece en caldo de extracto de carne de vacuno a 20-42ºC, estando la temperatura

óptima entre 33 y 37ºC.

Valor de pH del medio de cultivo: crece en medio líquido que tiene el valor de pH de 6 a 8, siendo un valor óptimo 7,2. Fuentes de carbono: muestra buen crecimiento sobre glucosa, fructosa, lactosa, manosa, galactosa, xilosa,

glicerina, manitol, para producir un ácido y gas.

Fuentes de nitrógeno: asimila nitrógeno en forma de amonio, sales de ácido nítrico, así como a partir de algunos compuestos orgánicos.

5 Resistente a ampicilina.

Se usa L-isoleucina como un factor de crecimiento. Sin embargo, la cepa puede crecer lentamente sin isoleucina.

Contenido de plásmidos: las células contienen pRhtC plasmídico híbrido de múltiples copias que asegura 10 resistencia a ampicilina (100 mg/l) y que porta el gen rhtC responsable del aumento de la resistencia a treonina (50 mg/ml).

La cepa MG442/pVIC40, pRhtC de E. coli (VKPM B-7680) tiene las mismas características morfológicas de cultivo y bioquímicas que la cepa de VKPM B-7700, excepto que, además de pRhtC, contiene un plásmido híbrido de 15 múltiples copias pVIC40 que asegura resistencia a estreptomicina (100 mg/l) y que porta los genes del operón de treonina.

La cepa NZ10/pRhtB, pRhtC de E. coli (VKPM B-7681) tiene las mismas características morfológicas de cultivo y bioquímicas que la cepa de VKPM B-7700, excepto que se usó L-treonina (0,1-5 mg/ml) como un factor de 20 crecimiento en lugar de L-isoleucina. Además, contiene un plásmido híbrido de múltiples copias pRhtB que asegura resistencia a canamicina (50 mg/l) y que porta el gen rhtB que confiere resistencia a homoserina (10 mg/ml).

La cepa NZ10/pRhtBC de E. coli (VKPM B-7682) tiene las mismas características morfológicas de cultivo y bioquímicas que la cepa de VKPM B-7681, excepto que contiene un plásmido híbrido de múltiples copias pRhtBC 25 que asegura resistencia a ampicilina (100 mg/l) y que porta tanto los genes rhtB como rhtC que confieren resistencia a L-homoserina (10 mg/ml) y L-treonina (50 mg/ml).

<3> Método para producir un aminoácido

30 Un aminoácido se puede producir eficazmente cultivando la bacteria en la que está potenciada la actividad de Rt, o la actividad de Rt y la actividad de Rh, amplificando un número de copias del gen rhtC, o del gen rhtC y del gen rhtB como se describe anteriormente, y que tiene la capacidad para producir el aminoácido, en un medio de cultivo, produciendo y acumulando el aminoácido en el medio, y recuperando el aminoácido del medio. El aminoácido se ejemplifica preferiblemente por L-homoserina, L-treonina y aminoácidos de cadena ramificada. Los aminoácidos de

35 cadena ramificada se pueden ejemplificar por L-valina, L-leucina y L-isoleucina, y preferiblemente se pueden ejemplificar por L-valina, L-leucina.

En el método de la presente invención, el cultivo de la bacteria que pertenece al género Escherichia, la recogida y la purificación de los aminoácidos a partir del medio líquido se pueden realizar de manera similar a aquellos del método 40 convencional para producir un aminoácido mediante fermentación usando una bacteria. El medio usado en el cultivo puede ser un medio sintético o un medio natural, en tanto que el medio incluya una fuente de carbono y de nitrógeno y minerales, y, si es necesario, nutrientes que la bacteria usada requiere para el crecimiento, en una cantidad apropiada. La fuente de carbono puede incluir diversos hidratos de carbono tales como glucosa y sacarosa, y diversos ácidos orgánicos. Dependiendo de la capacidad de asimilación de la bacteria usada, se puede usar un

45 alcohol, incluyendo etanol y glicerina. Como fuente de nitrógeno, se usan amoníaco, diversas sales de amonio tales como sulfato de amonio, otros compuestos nitrogenados tales como aminas, una fuente de nitrógeno natural tal como peptona, hidrolizado de haba de soja y un microbio fermentador digerido. Como minerales, se usan fosfato monopotásico, sulfato de magnesio, cloruro de sodio, sulfato ferroso, sulfato de manganeso, carbonato de calcio.

50 El cultivo es preferiblemente un cultivo en una condición aerobia tal como una agitación, y un cultivo con aireación y agitación. La temperatura del cultivo habitualmente es 20 a 40ºC, preferiblemente 30 a 38ºC. El pH del cultivo está habitualmente entre 5 y 9, preferiblemente entre 6,5 y 7,2. El pH del cultivo se puede ajustar con amoníaco, carbonato de calcio, diversos ácidos, diversas bases, y tampones. Habitualmente, un cultivo de 1 a 3 días conduce a la acumulación del aminoácido diana en el medio.

55 La recuperación del aminoácido se puede realizar eliminando los sólidos tales como células del medio, mediante centrifugación o mediante filtración con membrana tras el cultivo, y recogiendo y purificando después el aminoácido diana mediante intercambio iónico, concentración y métodos de fraccionamiento cristalino, y similares.

60 Breve explicación de los dibujos

La Fig. 1 muestra la clonación e identificación de los genes rhtB y rhtC, la Fig. 2 muestra la estructura del plásmido pRhtB que posee el gen rhtB, la Fig. 3 muestra la estructura del plásmido pRhtC que posee el gen rhtC,y

65 la Fig. 4 muestra la estructura del plásmido pRhtBC que posee el gen rhtB y el gen rhtC.

Mejor modo de poner en práctica la invención

La presente invención se explicará de forma más detallada a continuación con referencia a los ejemplos. En los ejemplos, un aminoácido tiene la configuración L, excepto que se señale de otro modo.

Ejemplo 1: obtención de los fragmentos de ADN de rhtB y rhtC

Etapa 1. Clonación de genes que implican resistencia a homoserina y a treonina en un fagémido mini-Mu

Los genes que implican resistencia a homoserina y a treonina se clonaron in vivo usando el fagémido mini-Mu d5005 (Groisman, E.A., et al., J. Bacteriol., 168, 357-364 (1986)). Como donante, se usó el lisógeno MuCts62 de la cepa MG442 (Guayatiner et al., Genetika (en ruso), 14, 947-956 (1978)). Se usaron lisados recientemente preparados para infectar un derivado lisogénico Mucts de una cepa de VKPM B-513 (Hfr K10 metB). Las células se cultivaron en placas en medio mínimo de glucosa M9 con metionina (50 µg/ml), canamicina (40 µg/ml) y homoserina (10 µg/ml). Se escogieron y se aislaron colonias que aparecieron después de 48 h. El ADN plasmídico se aisló y se usó para transformar la cepa de VKPM B-513 mediante técnicas estándar. Los transformantes se seleccionaron en placas de agar con caldo L, con canamicina, según lo anterior. El ADN plasmídico se aisló de aquellas que fueron resistentes a homoserina, y se analizó mediante cartografía de restricción de la estructura de los fragmentos insertados. Parece que se habían clonado del donante dos tipos de insertos que pertenecen a regiones cromosómicas diferentes. De este modo, existen en E. coli al menos dos genes diferentes que en múltiples copias imparten resistencia a homoserina. Uno de los dos tipos de insertos es el gen rhtA que ya se dio a conocer (ABSTRACT of 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology junto con 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California, 24-29 de agosto de 1997). Entre el otro de los dos tipos de insertos, sólo un fragmento de MluI-MluI de 0,8 kb imparte resistencia a homoserina (Fig. 1).

Etapa 2: identificación del gen rhtB y del gen rhtC

El fragmento de inserto se secuenció mediante el método de terminación de cadena con didesoxi, de Sanger. Ambas cadenas de ADN se secuenciaron en su totalidad, y todas las uniones se solaparon. La secuenciación mostró que el fragmento del inserto incluyó f138 (números de nucleótidos 61543 a 61959 de número de acceso GenBank M87049), que es un ORF (marco de lectura abierta) conocido pero de función desconocida, presente en 86 min del cromosoma de E. coli y alrededor de 350 pb de una región en dirección 5’ del mismo (región en dirección 3’ en la secuencia de M87049). El f138, que sólo tuvo 160 nucleótidos en la región de flanqueo en 5’, no pudo impartir la resistencia a homoserina. No hay ningún codón de terminación en dirección 5’ del f138 de ORF entre los nucleótidos 62160 y 61950 de M87049. Además, en la secuencia está presente un ATG tras una secuencia que se predice como un sitio de unión a ribosoma. El ORF más grande (números de nucleótidos 62160 a 61546) se denomina como gen rhtB. La proteína RhtB, deducida a partir del gen, tiene una región que es altamente hidrófoba y contiene posibles segmentos transmembránicos.

Como se describe a continuación, el plásmido que contiene este gen confirió a las células sólo la resistencia a concentraciones elevadas de homoserina. Puesto que el fragmento de ADN de SacII-SacII inicial contenía el segundo ORF no identificado, 0128, el gen se subclonó y se ensayó para determinar su capacidad para conferir resistencia a homoserina y a treonina. Se demostró que el plásmido que contienen o128 (fragmento de ClaI-Eco47III) confirió resistencia a 50 mg/ml de treonina (Fig. 1). El fragmento subclonado se secuenció y se encontró que contenía un nucleótido (G) adicional en la posición entre los nucleótidos 61213 y 61214 de M87049. La adición del nucleótido a la secuencia eliminó un desplazamiento del marco y agrandó el ORF en la región de flanqueo en 5’ hasta el nucleótido 60860. Este nuevo gen se denominó como rhtC. Se encontró que ambos genes, rhtB y rhtC, eran homólogos al transportador implicado en la exportación de lisina de Corynebacterium glutamicum.

Ejemplo 2: efecto de la amplificación de los genes rhtB y rhtC sobre la producción de homoserina

<1> Construcción de la cepa NZ10/pAL4, pRhtB de E. coli productora de L-homoserina, y producción de homoserina

El gen rhtB se insertó en un plásmido pUK21 (Vieira, J. y Messing, J., Gene, 100, 189-194 (1991)), para obtener pRhtB (Fig. 2).

La cepa NZ10 de E. coli se transformó mediante un plásmido pAL4 que fue un vector pBR322 en el que se insertó el gen trhA que codifica aspartoquinasa-homoserina deshidrogenasa I, para obtener las cepas NZ10/pAL4. La cepa NZ10 es un mutante thrB -invertido de leuB+ obtenido a partir de la cepa C600 (thrB, leuB) de E. coli (Appleyard R.K., Genetics, 39, 440-452, 1954).

La cepa NZ10/pAL4 se transformó con pUK21 o pRhtB para obtener las cepas NZ10/pAL4, pUK21 y NZ10/pAL4, pRhtB.

Los transformantes así obtenidos se cultivaron cada uno a 37ºC durante 18 horas en un caldo de nutriente con 50 mg/l de canamicina y 100 mg/l de ampicilina, y 0,3 ml del cultivo obtenido se inocularon en 3 ml de un medio de

fermentación que tiene la siguiente composición y que contiene 50 mg/l de canamicina y 100 mg/ml de ampicilina, en un tubo de ensayo de 20 x 200 mm, y se cultivaron a 37ºC durante 48 horas con un agitador giratorio. Tras el cultivo, se determinó la cantidad acumulada de homoserina en el medio y la absorbancia a 560 nm del medio mediante

métodos conocidos.

[Composición del medio de fermentación (g/l)]

Glucosa: 80

(NH4)2SO4: 22

K2HPO4: 2

NaCl: 0,8

MgSO4·7H2O: 0,8

FeSO4·7H2O: 0,02

MnSO4·5H2O: 0,02

Hidrocloruro de tiamina: 0,2

Extracto de levadura: 1,0

CaCO3: 30

(El CaCO3 se esterilizó separadamente)

Los resultados se muestran en la Tabla 1. Como se muestra en la Tabla 1, la cepa NZ10/pAL4, pRhtB acumuló homoserina en una cantidad mayor que la cepa NZ10/pAL4, pUK21, en la que el gen rhtB no estaba potenciado.

Tabla 1

Cepa: OD560 Cantidad acumulada de homoserina (g/l)

NZ10/pAL4, pUK21: 14,3 3,3

NZ10/pAL4, pRhtB: 15,6 6,4

<2> Construcción de la cepa MG442/pRhtC de E. coli productora de homoserina, y producción de homoserina

El gen rhtC se insertó en el vector pUC21 (Vieira, J. y Messing, J., Gene, 100, 189-194 (1991)), para obtener pRhtC (Fig. 3).

La cepa MG442 de E. coli conocida, que puede producir treonina en una cantidad no menor que 3 g/l (Gusyatiner, et al., 1978, Genetika (en ruso), 14:947-956), se transformó introduciendo pUC21 o pRhtC para obtener las cepas MG442/pUC21 y MG442/pRhtC.

Los transformantes así obtenidos se cultivaron cada uno a 37ºC durante 18 horas en un caldo nutriente con 100 mg/ml de ampicilina, y se inocularon 0,3 ml del cultivo obtenido en 3 ml de un medio de fermentación descrito anteriormente y que contiene 100 mg/ml de ampicilina, en un tubo de ensayo de 20 x 200 mm, y se cultivaron a 37ºC durante 48 horas con un agitador giratorio. Tras el cultivo, se determinó, mediante métodos conocidos, la cantidad acumulada de homoserina en el medio, y la absorbancia a 560 nm del medio. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2

Cepa: OD560 Cantidad acumulada de homoserina (g/l)

MG442/pUC21: 9,7 <0,1

MG442/pRhtC: 15,2 9,5

Ejemplo 3: efecto de la amplificación de los genes rhtB y rhtC sobre la producción de treonina

<1> Construcción de la cepa VG442/pVIC40, pRhtB (VKPM B-7660) de E. coli productora de treonina, y producción de treonina

La cepa MG442 se transformó introduciendo un plásmido conocido pVIC40 (patente U.S. nº 5.175.107 (1992)) mediante un método de transformación habitual. Los transformantes se seleccionaron en placas de agar con LB que contienen 0,1 mg/ml de estreptomicina. De este modo se obtuvo una nueva cepa MG442/pVIC40.

La cepa MG442/pVIC40 se transformó con pUK21 o pRhtB para obtener la cepa MG442/pVIC40, pUK21 y MG442/pVIC40, pRhtB.

Los transformantes así obtenidos se cultivaron cada uno a 37ºC durante 18 horas en un caldo nutriente con 50 mg/l de canamicina y 100 mg/l de estreptomicina, y se inocularon 0,3 ml del cultivo obtenido en 3 ml de un medio de fermentación descrito en el Ejemplo 2 y que contiene 50 mg/l de canamicina y 100 mg/l de estreptomicina, en un

tubo de ensayo de 20 x 200 mm, y se cultivaron a 37ºC durante 68 horas con un agitador giratorio. Tras el cultivo, se determinó, mediante métodos conocidos, la cantidad acumulada de treonina en el medio, y la absorbancia a 560 nm del medio.

Los resultados se muestran en la Tabla 3. Como se muestra en la Tabla 3, la cepa MG442/pVIC40, pRhtB acumuló treonina en una cantidad mayor que la cepa MG442/pVIC40, pUK21, en la que el gen rhtB no estaba potenciado.

Tabla 3

Cepa: OD560 Cantidad acumulada de treonina (g/l)

MG442/pVIC40, pUK21: 16,3 12,9

MG442/pVIC40, pRhtB: 15,2 16,3

<2> Construcción de la cepa VG442/pVIC40, pRhtC (VKPM B-7680) de E. coli productora de treonina, y producción de treonina

La cepa MG442/pVIC40 se transformó con pRhtC y pUC21. De este modo se obtuvieron los transformantes

15 MG442/pVIC40, pRhtC y MG442/pVIC40, pUC21. De la misma manera como se describe anteriormente, se cultivó cada uno de MG442/pVIC40, pUC21 y MG442/pVIC40, pRhtC a 37ºC durante 18 horas en un caldo nutriente con 100 mg/ml de ampicilina y 100 mg/l de estreptomicina, y se inocularon 0,3 ml del cultivo obtenido en 3 ml de un medio de fermentación descrito anteriormente y que contiene 100 mg/l de ampicilina y 100 mg/l de estreptomicina, en un tubo de ensayo de 20 x 200 mm, y se cultivaron a 37ºC durante 46 horas con un agitador giratorio. Tras el

20 cultivo, se determinaron, mediante métodos conocidos, la cantidad acumulada de treonina en el medio, y la absorbancia a 560 nm del medio.

Los resultados se muestran en la Tabla 4. Como se muestra en la Tabla 4, la cepa MG442/pVIC40, pRhtC acumuló treonina en una cantidad mayor que la cepa MG442/pVIC40, pUC21, en la que el gen rhtC no estaba potenciado. 25 Tabla 4

Cepa: OD560 Cantidad acumulada de treonina (g/l)

MG442/pVIC40, pUC21: 17,4 4,9

MG442/pVIC40, pRhtC: 15,1 10,2

Ejemplo 4: efecto concertado del gen rhtB y del gen rhtC sobre la producción de aminoácidos

30 El fragmento de ADN de SacII-SacII, que contiene tanto el gen rhtB como el gen rhtC, se insertó en el pUC21. De este modo se obtuvo el plásmido pRhtBC que contiene el gen rhtB y el gen rhtC (Fig. 4).

Después, la cepa NZ10 se transformó con pUC21, pRhtB, pRhtC o pRhtBC, y de este modo se obtuvieron los 35 transformantes NZ10/pUC21 (VKPM B-7685), NZ10/pRhtB (VKPM B-7683), NZ10/pRhtC (VKPM B-7684), NZ10/pRhtB, pRhtC (VKPM B-7681) y NZ10/pRhtBC (VKPM B-7682).

Los transformantes obtenidos anteriormente se cultivaron de la misma manera como se describe antes, y se determinaron las cantidades acumuladas de diversos aminoácidos en el medio y la absorbancia a 540 nm del medio, 40 mediante métodos conocidos.

Los resultados se muestran en la Tabla 5. Se concluye a partir de la Tabla 5 que existe un efecto concertado del pRhtB y del pRhtC sobre la producción de homoserina, valina y leucina. Estos resultados indican que los productos de los genes rhtB y rhtC pueden interactuar en las células.

45 Tabla 5

Cepa: OD560 Homoserina (g/l) Valina (g/l) Leucina (g/l)

NZ10/pUC21: 18,7 0,6 0,22 0,16

NZ10/pRhtB: 19,6 2,3 0,21 0,14

NZ10/pRhtC: 20,1 0,7 0,2 0,15

NZ10/pRhtBC: 21,8 4,2 0,34 0,44

NZ10/pRhtB, pRhtC: 19,2 4,4 0,35 0,45

Ejemplo 5: efecto del gen rhtB y del gen rhtC sobre la resistencia a aminoácidos

Como se describe anteriormente, los plásmidos que contienen el rhtB y rhtC tienen un efecto positivo sobre la acumulación de algunos aminoácidos en caldo de cultivo por cepas diferentes. Se demostró que el patrón de aminoácido acumulado dependía del genotipo de la cepa. La homología de los productos de los genes rhtB y rhtC

con el transportador de lisina LysE de Corynebacterium glutamicum (Vrljic, M., Sahm, H. y Eggeling, L. (1996) Mol. Microbiol. 22, 815-826) indica la función de análogos para esas proteínas.

Por lo tanto, se ensayó el efecto de los plásmidos pRhtB y pRhtC sobre la susceptibilidad de la cepa N99, que es un

5 mutante resistente a estreptomicina (StrR) de la cepa conocida W3350 (VKPM B-1557), a algunos aminoácidos y análogos de aminoácidos. Se diluyeron cultivos de caldo de toda la noche (109 cfu/ml) de las cepas N99/pUC21, N99pUK21, N99/pRhtB y N99/pRhtC en medio mínimo M9 1:100, y se hicieron crecer durante 5 h en el mismo medio. Después, los cultivos de fase log así obtenidos se diluyeron, y se aplicaron alrededor de 104 células viables a placas de ensayo bien secas con agar M9 (2%) que contienen incrementos del doble de aminoácidos o análogos.

10 De este modo, se examinó la concentración inhibidora mínima (MIC) de estos compuestos.

Los resultados se muestran en la Tabla 6. Se concluye a partir de la Tabla 6 que múltiples copias de rhtB confieren, además de resistencia a homoserina, resistencia a ácido α-amino-β-hidroxivalérico (AHBA) y a S-(2-aminoetil)L-cisteína (AEC), y 4-aza-DL-leucina; y que múltiples copias del gen rhtC, además de la resistencia a treonina,

15 aumentaron la resistencia a valina, histidina y AHVA. Este resultado indica que cada uno de los transportadores que se presuponen, RhtB y RhtC, tienen especificidad por varios sustratos (aminoácidos), o pueden mostrar efectos no específicos como resultado de la amplificación.

Tabla 6 20

Sustrato: MIC (µg/ml)

N99/pUC21 ^*: N99/pRhtB N99/pRhtC

L-homoserina: 1000 20000 1000

L-treonina: 30000 4000 80000

L-valina: 0,5 0,5 2,0

L-histidina: 5000 5000 40000

AHVA: 100 2000 15000

AEC: 5 20 5

4-aza-DL-leucina: 50 100 50

O-metil-L-treonina: 20 20 20

*: Se obtuvieron los mismos datos con N99/pUK21

Listado de secuencias

<110> Ajinomoto Co., Inc. 25

<120>

<130> EPA-53286

<140> 99125406.1 30 <141>

<150> RU-98123511

<151> 35 <160> 4

<170> Patentln Ver. 2.0

<210> 1 40 <211> 1231

<212> ADN

<213> Escherichia coli

<220> 45 <221> CDS

<222> (557)..(1171)

<400> 1

<210> 2 5 <211> 205

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 2 10

<210> 3

<211> 840 5 <212> ADN

<213> Escherichia coli

<220>

<221> CDS 10 <222> (187)..(804)

<400> 3

<210> 4

<211> 206

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 4

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para producir el aminoácido L-homoserina o L-treonina, que comprende las etapas siguientes:

5 cultivar una bacteria, que presenta la capacidad para producir el aminoácido, en un medio de cultivo, para producir y acumular el aminoácido en el medio, y

recuperar el aminoácido a partir del medio, perteneciendo dicha bacteria al género Escherichia, en el que la resistencia a L-treonina de dicha bacteria está potenciada potenciando la actividad de una proteína como se define en los apartados (A) o (B) siguientes en las células de dicha bacteria:

(A) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada en SEC ID nº: 4 en el listado de secuencias; o

15 (B) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que incluye una supresión, sustitución, inserción

o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos representada en SEC ID nº: 4 en el listado de secuencias, y que presenta la actividad de hacer que una bacteria presente la proteína resistente a L-treonina,

en el que la proteína está codificada por un ADN que se define en los apartados (a) o (b) siguientes:

(a)

un ADN que comprende la secuencia nucleotídica de números de nucleótidos 187 a 804 en SEC ID nº: 3;

(b)

un ADN que se hibrida con una secuencia nucleotídica de números de nucleótidos 187 a 804 en SEC ID nº:

25 3 en una condición restrictiva, y que codifica una proteína que presenta la actividad de hacer que una bacteria presente la proteína resistente a L-treonina, en el que la condición restrictiva es una condición en la que el lavado se realiza a 60ºC y a una concentración salina que corresponde a 1 x SSC y 0,1% de SDS.
2. Método según la reivindicación 1, en el que la resistencia a L-homoserina de dicha bacteria está potenciada además potenciando la actividad de una proteína como se define en los apartados (C) o (D) siguientes en las células de dicha bacteria:

(C) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada en SEC ID nº: 2 en el listado de

secuencias; o 35

(D) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que incluye una supresión, sustitución, inserción

o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos representada en SEC ID nº: 2 en el listado de secuencias, y que presenta la actividad de hacer que una bacteria presente la proteína resistente a L-homoserina.
3. Método según la reivindicación 2, en el que la proteína como se define en (C) o (D) está codificada por un ADN que se define en los puntos (c) o (d) siguientes:

(c) un ADN que comprende la secuencia nucleotídica de números de nucleótidos 557 a 1171 en SEC ID nº: 1; 45

(d) un ADN que se hibrida con una secuencia nucleotídica de números de nucleótidos 557 a 1171 en SEC ID nº: 1 en una condición restrictiva, y que codifica una proteína que presenta la actividad de hacer que una bacteria presente la proteína resistente a L-homoserina, en el que la condición restrictiva es una condición en la que el lavado se realiza a 60ºC y a una concentración salina que corresponde a 1 x SSC y 0,1% de SDS.
4. Método para producir un aminoácido, que comprende las etapas siguientes:

cultivar una bacteria, que presenta la capacidad para producir el aminoácido, en un medio de cultivo, para 55 producir y acumular el aminoácido en el medio, y

recuperar el aminoácido a partir del medio, perteneciendo dicha bacteria al género Escherichia, en el que la resistencia a L-treonina de dicha bacteria está potenciada potenciando la actividad de una proteína como se define en los apartados (A) o (B) siguientes en las células de dicha bacteria:

(A)

una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada en SEC ID nº: 4 en el listado de secuencias; o

(B)

una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que incluye una supresión, sustitución, inserción

65 o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos representada en SEC ID nº: 4 en el listado de secuencias, y que presenta la actividad de hacer que una bacteria presente la proteína resistente

a L-treonina,

en el que la proteína está codificada por un ADN que se define en los apartados (a) o (b) siguientes:

5 (a) un ADN que comprende la secuencia nucleotídica de números de nucleótidos 187 a 804 en SEC ID nº: 3;

(b) un ADN que se hibrida con una secuencia nucleotídica de números de nucleótidos 187 a 804 en SEC ID nº: 3 en una condición restrictiva, y que codifica una proteína que presenta la actividad de hacer que una bacteria presente la proteína resistente a L-treonina, en el que la condición restrictiva es una condición en la

10 que el lavado se realiza a 60ºC y a una concentración salina que corresponde a 1 x SSC y 0,1% de SDS, y

en el que la resistencia a L-homoserina de dicha bacteria está potenciada además potenciando la actividad de una proteína como se define en los apartados (C) o (D) siguientes en las células de dicha bacteria:

15 (C) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada en SEC ID nº: 2 en el listado de secuencias; o

(D) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que incluye una supresión, sustitución, inserción

o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos representada en SEC ID nº: 2 en el

20 listado de secuencias, y que presenta la actividad de hacer que una bacteria presente la proteína resistente a L-homoserina.
5. Método según la reivindicación 4, en el que dicho aminoácido es un aminoácido de cadena ramificada.

25 6. Método según la reivindicación 5, en el que dicho aminoácido de cadena ramificada es L-valina o L-leucina.
7. Método según la reivindicación 4, en el que la proteína como se define en (C) o (D) está codificada por un ADN que se define en los apartados (c) o (d) siguientes:

30 (c) un ADN que comprende la secuencia nucleotídica de números de nucleótidos 557 a 1171 en SEC ID nº: 1;

(d) un ADN que se hibrida con una secuencia nucleotídica de números de nucleótidos 557 a 1171 en SEC ID nº: 1 en una condición restrictiva, y que codifica una proteína que presenta la actividad de hacer que una bacteria presente la proteína resistente a L-homoserina, en el que la condición restrictiva es una condición

35 en la que el lavado se realiza a 60ºC y a una concentración salina que corresponde a 1 x SSC y 0,1% de SDS.