JPH03219878A - 酢酸耐性遺伝子、それを含むプラスミド及び形質転換した酢酸菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、微生物の酢酸耐性に関与する遺伝子に関する
ものである。

本発明の酢酸耐性に関与する遺伝子を組入れたプラスミ
ドを用いて形質転換することにより、微生物の酢酸耐性
を向上させ、たとえば食酢製造における酢酸発酵を効率
化することができるので、酢酸発酵界に益するところ大
なるものがある。

〔従来技術および問題点〕

微生物の酢酸耐性を高める方法としては、自然界からの
スクリーニングや種々の変異方法を使用して変異株を取
得する方法などが、−船釣におこなわれてきた。しかし
、これらの方法で酢酸耐性を向上させた例としては、特
開昭６０−１８０５８１記載のアセトバクター・アルト
アセチゲネスと命名された新種の菌やエンザイム・マイ
クロブ・チクノル第９巻、第１１７頁（１９８７年）記
載のクロストリジウム・サーモアセチカムの変異株の例
などが知られているだけである。

これは、酢酸耐性の機構が解明されておらず、目的株の
選択が酢酸濃度の高い培地で生育してくる菌を選択する
方法しかなかったからである。

このため、目的株の取得は偶然性に期待するしかなく、
多大な労力が必要であり、より効率的でしかも効果的な
育種方法の出現が待たれていた。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、上記事情にかんがみ、計画的に酢酸耐性
を向上させるためには、酢酸耐性を担う遺伝子を用いて
組み換えＤＮＡ技術により、育種することが最も有効で
あると考え、鋭意検討をおこない、本発明を完成するに
至った。

すなわち本発明は、アセトバクター属の微生物に由来し
、分子サイズが約５．６キロベースであり、制限酵素地
図が第１図で示される酢酸耐性遺伝子又はこれを含むプ
ラスミド又は該プラスミドによって形質転換した酢酸菌
に関するものである。

本発明における酢酸耐性遺伝子源は、アセトバクター属
の微生物で酢酸耐性を示す菌株であれば、特に限定はな
い。たとえば、アセトバクター・アセチＮα１．０２３
（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２２８７）やアセトバクター・アセ
チＩＦ０３２８４などが挙げられる。

遺伝子分離は、種々の方法で分離可能であるが、たとえ
ばアセトバクター属の酢酸耐性が低下した変異株を用い
、導入した遺伝子により、低下した酢酸耐性が、向上す
ることを指標としておこなう方法が用いられる。酢酸耐
性の低下した変異株の取樽は、たとえばアグリカルチュ
ラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー第４６巻
、第３８１頁、１９８２年に記載の自然変異を利用する
方法やＮ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−二トロソグアニ
ジンを変異源として用いる方法などでおこなうことがで
きる。

酢酸耐性の低下した変異株を宿主として、酢酸耐性の低
下していない親株あるいは高濃度酢酸耐性株から抽出精
製した全ＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベク
ターと連結した後、アグリカルチュラル・アンド・バイ
オロジカル・ケミストリー第４９巻、第２０９１頁（１
９８５年）記載の方法で形質転換するか、ジャーナル・
オブ・バクテリオロジー、第１６５巻、第３３６頁（１
９８６年）記載のｐＲＫ　２０１３などの伝達性プラス
ミドを用いて接合伝達法により酢酸耐性の低下した変異
株を形質転換する。形質転換株のうち、宿主より酢酸耐
性が向上したものを選択することにより、該遺伝子をも
つ株を得ることができる。

全ＤＮＡの調製は、アグリカルチュラル・アンド・バイ
オロジカル・ケミストリー、第４９巻、第１０１１頁（
１９８５年）記載の方法など通常の方法にしたがえばよ
い。また使用するベクターとしては、アセトバクター属
で安定に保持されるものであれば特に限定はない。たと
えば、特開昭６０−９４８８に開示されているｐＴＡ　
５０１１、ｐＴＡ　５０１２や広宿主域ベクターρＲＫ
　２０１３、ＲＰ　４などが使用できる。

形質転換する酢酸菌は、アセトバクター属又はグルコノ
バクタ−属に属する微生物であればよく、特に限定はな
い。

また、酢酸菌の形質転換方法としては、たとえば、アグ
リカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリ
ー、第４９巻、第２０９１頁、第２４０７頁（１９８５
年）記載の方法などが使用できる。

得られた遺伝子の塩基配列の決定は、常法に従えばよく
、たとえばＭ１３ファージを用いたジデオキシ法で決定
すればよい。実施例に示したごとく。

酢酸耐性遺伝子は、塩基配列の結果から３種類の遺伝子
から構成されている。各遺伝子の塩基配列および塩基配
列にもとづいて決定されたアミノ酸配列を第５図、第６
図及び第７図に示した。これら３つの遺伝子単独では、
酢酸耐性を付与することができず、３つの遺伝子が同時
に発現し、機能することが必要である。

各遺伝子の発現には、通常宿主内で機能するプロモータ
ー活性をもつ遺伝子と各耐性遺伝子とを発現可能な形で
連結する必要がある。アセトバクター属やグルコノバク
タ−属の酢酸菌で酢酸耐性遺伝子を発現させるために用
いるプロモーターとしては、酢酸耐性遺伝子本来のプロ
モーターも使用できるし、酢酸菌由来の他のプロモータ
ー活性をもつ遺伝子や酢酸菌で発現可能な大腸菌のプロ
モーターも使用できる。

大腸菌プロモーターとしては、大腸菌プラスミドρＢＲ
３２２のアンピシリン耐性遺伝子や大腸菌プラスミドＰ
ＡＣＹＣ１７７のカナマイシン耐性遺伝子。

大腸菌プラスミドｐＡＣＹＣ１８４のクロラムフェニコ
ール耐性遺伝子、大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子
のプロモーターなどが使用できる。

プロモーター活性をもつ遺伝子は、各耐性遺伝子が宿主
に悪影響を及ぼさないように、適当量に発現量を制御す
るため、おのおのの遺伝子で使用するプロモーター活性
をもつ遺伝子をかえてもよい。過剰量に酢酸耐性遺伝子
が発現し、宿主の生育等に影響を及ぼす場合には、上記
のような適当なプロモーターを選択したり、ベクターを
選択し、コピー数を変化させ、発現量を制御する必要が
ある。後者の場合には、各遺伝子をそれぞれ別のベクタ
ーに組みこみ、ベクターのコピー数の違いを利用して、
発現量を制御することもできる。

また、酢Ｗ！菌内に＃Ｍ！酎性適性遺伝子む遺伝子断片
を保持させるためのベクターとしては、たとえば、特開
昭６０−９４８８に開示されているρＴＡ　５００１（
＾）、ρＴＡ　５００１（Ｂ）や酢酸菌に導入可能な広
宿主域ベクターＲＰ　４：：Ｍｕ、　ＲＰ　４、ｐＲＫ
　２０１３、Ｒ５Ｆ　１０１Ｏなどが利用できる。

なお、もともと酢酸耐性遺伝子の一部を有している宿主
に酢酸耐性を付与する場合には、保有していない遺伝子
のみを宿主に形質転換すればよい。

また、酢酸耐性遺伝子を３つとも有している宿主の場合
でも、特定の遺伝子の発現量が低く、酢酸耐性が低い場
合には、必要な遺伝子を導入し、発現量を高める必要が
ある。

〔実施例〕

アセトバクター・アセチＮｏ　１１０２３（ＦＥＲＢＰ
−２２８７）から、アグリカルチュラル・アンド・バイ
オロジカル・ケミストリー、第４６巻、第３８１頁（１
９８２年）記載の自然変異の方法により、酢酸耐性の低
下した変異株１０−８０を得た。親株の＆１０２３の酢
酸耐性が３％以上であるのに対し、ｔｏ−ｇｏの耐性は
１％以下であった。親株であるアセトバクター・アセチ
Ｎα１０２３の全ＤＮＡをアグリカルチュラル・アンド
・バイオロジカル・ケミストリー第４９巻、第１０１１
頁（１９８５年）の方法で調製した。全ＤＮＡを制限酵
素Ｅｃｏ　Ｒ：［で切断後、特開昭６０−９４８８に開
示されたベクターＰＴＡ　５０１１をＥｃｏ　ＲＩで切
断し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いて両者を連結した。

連結反応物をアグリカルチュラル・アンド・バイオロジ
カル・ケミストリー、第４９巻、第２０９１頁（１９８
５年）の方法にしたがって形質転換した。形質転換株は
、ベクター上のアンピシリン耐性遺伝子を指標とし、Ｙ
ＰＧ寒天培地（グルコース３％、酵母エキス０．５％、
ポリペプトン０．２％、寒天２％、ｐＨ６，５）にアン
ピシリン（５０μｇ／ｍＱ）を加えた培地で選択した。

得られた約ｓ、ｏｏｏ株のアンピシリン耐性の形質転換
株について、ＹＰＧ寒天培地に種々の濃度の酢酸を加え
、レプリカ法で、酢酸耐性を調べた。宿主の１０８０の
酢酸耐性が１％であるのに対し、得られた形質転換株の
１株のみが３％の酢酸を含む培地で生育した。この株の
プラスミドをアグリカルチュラル・アンド・バイオロジ
カル・ケミストリー第４９巻、第２０８３頁（１９８５
年）の方法で調べたところ、ベクター以外に約７，５キ
ロベースの遺伝子断片を含んでいた。また、上記方法と
は、用いる制限酵素がＢｇｌ　ＩＩである以外は同じ方
法で１０−８０に酢酸耐性を付与するプラスミドを単離
した。約５，０００株から４株のプラスミドを単離した
が、いずれも、ベクター以外に約６．５キロベースの遺
伝子をもっており、常法により制限酵素地図を作成した
ところ、４株とも同一の遺伝子断片であることが分かっ
た。Ｅｃｏ　ＲＩを用いて単離した遺伝子の制限酵素地
図を第２図に、またＢｇｌ　ＩＩを用いて単離した遺伝
子の制限酵素地図を第３図に示す。第２図、第３図から
明らかなように、Ｅｃｏ　ＲＩで単離した遺伝子Ｂｇｌ
　ＩＩで単離した遺伝子は、共通部分を有していた。

（耐酸性に関与する遺伝子領域の決定）上記方法で単離
した遺伝子のどの領域に酢酸耐性に関与する遺伝子が存
在しているかを調べるために以下の大腸菌ベクター由来
のカナマイシン耐性遺伝子を用いた挿入失活実験をおこ
なった。

第２図に示すＥｃｏ　ＲＩ断片を大腸菌ベクターｐＵ（
。

１８のＥｃｏ　ＲＩ部位に常法によりクローン化した。

このキメラプラスミドをＣ１ａ　Ｉで切断した。ＰＵｃ
１８は、Ｃ１ａ　Ｉ　　で切断されないため、Ｅｃｏ　
ＲＩ断片上に１ケ所あるＣ１ａ　［部位で唯１ケ所切断
される。

一方、大腸菌ベクターρＡＣＹＣ１７７（ジャーナル・
オブ・バクテリオロジー、第１３４巻、第１１４１頁（
１９７８年）　ＡＴＣＣ３７０３１と、して寄託されて
いる。）をベクター上のカナマイシン耐性遺伝子を切断
しないように制限酵素Ｈａｅ　ＩＩで切断した。Ｃ１ａ
　Ｉで切断したキメラプラスミドおよび）Ｉａｅ　ｎで
切断したｐＡＣＹＣ１７７を常法にしたがいＴ４　ＤＮ
Ａポリメラーゼ処理し、切断末端を平滑化した。平滑化
した後、常法にしたがいＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて
両者を連結した。

連結物を常法にしたがい、大腸菌宿主Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｊ
Ｍ１０９に形質転換した。形質転換株は、ＬＢ培地（“
′ＡＭａｎｕａｌ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉ
ｎｅｅｒｉｎｇ”第２０１頁、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　
Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８０年）
にアンピシリン３０μｇ／ｍＱ及びカナマイシン３０μ
ｇ／ｍΩを含む寒天培地（寒天濃度１．５％）で選択し
た。得られた形質転換株のプラスミドをＢｉｒｎｂｏｉ
ｍとＤｏｌｙの方法（Ｎｕｃｌｅｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ
ｓ、、第７巻、第１５１３頁、１９７９年）にしたがい
胴入、分子サイズ及び制限酵素解析からｐｕｃ　１８、
Ｅｃｏ　ＲＩ断片およびｐＡＣＹＣ１７７のカナマイシ
ン耐性遺伝子を含む遺伝子断片の３者のキメラプラスミ
ドを得た。ここで得られたキメラプラスミドは、ρＵＣ
１８のＥｃｏ　ＲＩ部位に第２図で示される酢酸耐性遺
伝子部分が組みこまれ、さらに組みこまれた酢酸耐性遺
伝子部分のＣ１ａ　１部位にｐＡＣＹＣ１７７由来のカ
ナマイシン耐性遺伝子が組みこまれた構造となっている
。この組み換えプラスミドをアグリカルチュラル・アン
ド・バイオロジカル・ケミストリー、第４９巻、第２０
９１頁（１９８５年）記載の方法で、アセトバクター・
アセチＮα１０２３に形質転換した。形質転換株は、上
記ＹＰＧ寒天培地にカナマイシン１００μｇ／ｍＱの濃
度で加えた培地で選択した。形質転換に用いたベクター
は、大腸菌ベクターであり、大腸菌で複製するのに必要
な機能は有しているが、アセトバクター属では複製でき
ない。

このため、得られたカナマイシン耐性の形質転換株は、
アセトバクター属の宿主の染色体ないしはプラスミドＤ
ＮＡ上の相同部位と組み換えをおこし、宿主染色体また
はプラスミドにカナマイシン耐性遺伝子が組みこまれて
いる。この場合、カナマイシン耐性遺伝子の組みこまれ
ている部位が、酢酸耐性に関与しているならば、カナマ
イシン耐性遺伝子の挿入により、酢酸耐性遺伝子が不活
性化される。このため、得られるカナマイシン耐性の形
質転換株は、カナマイシン耐性の獲得と同様に酢酸耐性
が低下する。第２図に示される遺伝子のＣ１ａ　１部位
にカナマイシン耐性遺伝子を挿入したプラスミドを用い
て得られたカナマイシン耐性の形質転換株の酢酸耐性を
上記したＹＰＧ寒天培地に種々の濃度の酢酸を加えて調
べたところ、Ｎα１０２３株の耐性が３％以上であった
のに対し、形質転換株では１％以下に顕著に低下してい
た。このことから、Ｃ１ａ　１部位が、酢酸耐性に関与
する遺伝子内にあることが分かった。同様の手法にて、
第２図、第３図の各遺伝子上の制限酵素切断部位にカナ
マイシン耐性遺伝子を組みこんだ組み換えプラスミドを
作成し、Ｎｎ１．０２３に上記と同様にして形質転換し
た。（第４図にカナマイシン耐性遺伝子の挿入位置を示
した。）得られたカナマイシン耐性の形質転換株の酢酸
耐性を調べたところ、第１表に示すごとくなった。

第１表 これらの結果から、第１図に制限酵素地図を示す遺伝子
部位が、酢酸耐性に関与する遺伝子領域であると決定し
た。第１図に示す遺伝子は、第４図のＰｓｔ　Ｉで切断
される約７．６キロベースの遺伝子断片に含まれる形で
ρＵＣ１８をベクターとしてＥ、ｃｏｌｉ　ＪＭ　１０
９に形質転換され、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＡＲ−１の株名で、
ＦＥＲＮ　Ｐ−１０５１２として微工研に寄託されてい
る。

（酢酸菌耐性遺伝子を含む遺伝子断片の酢酸菌宿主への
形質転換） 上記実施例で単離した第４図に制限酵素地図を示す遺伝
子断片をＰｓｔ　Ｉで切断して得られる約７．６キロベ
ースの遺伝子断片を大腸菌ベクターｐｕｃ　１８に組込
んだ組み換えプラスミドをＥ、ｃｏｌｉ　ＡＲ−１から
常法により単離した。

次に、アセトバクター・アセチ・サブスピーシズ・キシ
リナムＩＦ０３２８８の有するプラスミドのうち、分子
サイズが約２．１キロベースのプラスミドを常法により
単尊し、制限酵素Ａｃｅ　Ｉで切断した後、Ｔ４　ｔ）
ＮＡポリメラーゼで切断末端を平滑化した。

一方、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＡＲ−１から単離したｐＵＣ１８
のＰｓｔ　Ｉ部位に第４図に示される遺伝子断片をＰｓ
ｔ　Ｉで切断して得られる約７．６キロベースの遺伝子
断片を組みこんだ組換えプラスミドを制限酵素Ｓａｌ　
Ｉで切断し、同じ＜Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで切断末端
を平滑化した。

両者をＴ４　ＤＮＡリガーゼにより連結し、組み換え体
を得た後、アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカ
ル・ケミストリー第４９巻、第２４８５頁（１９８５年
）に開示された方法により、アセトバクター・アセチ・
サブスピーシズ・キシリナムＩＦ０３２８８に形質転換
した。形質転換株はアンピシリン３００μｇ／ｍＩｌを
含むＹＰＧ寒天培地（グルコース３％、酵母エキス０．
５％、ポリペプトン０．２％、寒天２％、ｐＨ６，５）
で選択した。選択培地に生育したアンピシリン耐性株の
プラスミドをアグリカルチュラル・アンド・バイオロジ
カル・ケミストリー、第４９巻、第２０８３頁（１９８
５年）の方法に準じて調べた。形質転換株は元株と比較
し、導入したプラスミドと同一サイズの約１２．４キロ
ベースのプラスミドを余分に保有しており、また、制限
酵素解析により、ｐｔＪｃ１８および第４図に示される
遺伝子断片をＰｓｔ　Ｉで切断して得られる約７．６キ
ロベースの遺伝子断片およびアセトバクター・アセチ・
サブスピーシズ・キシリナムＩＦ０３２８８の保有する
約２．１キロベースの大きさのプラスミドの３者のキメ
ラプラスミドであることを確認した。

上記で得られた形質転換株の酢酸耐性を元株と比較した
。ＹＰＧ液体培地（上記のＹＰＧ寒天培地から寒天を除
いた組成の培地）に種々の濃度の酢酸を加えて、　３０
℃で４日間振どう培養し、生育の有無について調へた。

元株では酢酸濃度１．５％（％＋／ｖ）までしか生育が
見られなかったが、形質転換株では、酢酸濃度２．５％
（ｉｉ／ｖ）の培地でも生育が見られ、酢酸耐性遺伝子
を含むプラスミドで形質転換することにより、酢酸菌の
酢酸耐性を向上させることができた。

（酢酸耐性遺伝子の塩基配列の決定） 実施例で得た大腸菌形質転換株Ｅ、ｃｏｌｉ　ＡＲ−１
の保有するプラスミドを常法によって精製し、得られた
精製ＤＮＡをＰｓｔ　Ｉで切断して得られる約７．６キ
ロベースの遺伝子断片についてＭ１３ファージを用いた
ジデオキシ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ、第１０巻、第２０頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒ
ｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８３年）によって
その塩基配列を決定した。

決定した塩基配列をもとに翻訳可能領域を検索した。カ
ナマイシン耐性遺伝子を用いた挿入失活実験により、カ
ナマイシン耐性遺伝子の挿入により酢酸耐性の低下した
制限酵素サイト（第４図の３．４．５）が領域内にある
ような翻訳可能領域を検索したところ、第５図、第６図
、第７図に示すようなＡＴＧ翻訳開始コドンから翻訳さ
れるそれぞれ１３０８塩基、４６２塩基、１２２４塩基
からなるアミノ酸残基４３６．１５４．４０８（分子量
４８１２０．１７５１０．４４４９０）をコードする領
域が見呂された。（第５図、第６図、第７図の塩基配列
から決定されたアミノ酸配列を第５図、第６図、第７図
の塩基配列の下段しこ示した。）第５図、第６図、第７
図の塩基配列で示されるポリペプチドが酢酸耐性の発現
に関与していることは、以下のようにして確認した。

第５図に塩基配列を示した遺伝子（以下ａａｒ　Ａと命
名）内にあるＨｉｎｃ　ＩＩサイト（塩基数６５５）で
切断し、アミノ末端側とカルボキシ末端側を含む断片を
それぞれ調製し、翻訳フレームが合うように大腸菌発現
ベクターｐｔｌｃ　１８またはｐｕｃ　１９のβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子のアミノ末端部分にあるポリリンカ
一部分の制限酵素サイトにＴ４　ＤＮＡリガーゼを用い
連結し、大腸菌宿主Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭ　１０９に常法
により形質転換した。得られた組換えプラスミドを保有
する形質転換株をアンピシリン３０μｇ７ｍ（１、β−
イソプロピルガラクトチオグルコサイド（ＩＰＴＧ）　
１ｍＭを含むＬＢ液体培地で３７℃、１８時間培養し、
得られた菌体を０．０１Ｍリン酸バッファー（ＰＨ７，
０）で洗浄後、超音波破砕をおこない、得られた菌体破
砕液を常法によりドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動に供し、クマシーブリリアントブ
ルーで蛋白染色した。ＩＰＴＧによりｌａｃプロモータ
ーを誘導した場合、カルボキシ末端側を含む断片をβ−
ガラクトシダーゼ遺伝子の下流側に連結した組換えプラ
スミドでは、分子置駒２８．０００の蛋白が著量合成さ
れたが、アミノ末端側を含む断片をβ−ガラクトシダー
ゼ遺伝子の下流に第５図とは逆向きに連結した組換えプ
ラスミドでは、特異的な蛋白の合成は見られなかった。

このことから、第５図の翻訳可能領域が存在することが
確認された。第６図および第７図に塩基配列を示した遺
伝子（それぞれａａｒＢ、ａａｒＣと命名）について、
ａａｒ　Ｂについては、ａａｒ　Ｂの上流にあるＮｄｅ
　Ｉサイトで、ａａｒ　Ｃについては、　ａａｒＣ内に
あるＥｃｏ　ＲＩサイト（塩基数８２５）でａａｒＡと
同様に融合蛋白として発現させられたことから（Ｎｄｅ
　Ｉサイトでは分子量１７，０００の蛋白が、またＥｃ
ｏ　ＲＩサイトでは分子量１５，０００の蛋白が生産さ
れた。）、各々の翻訳可能領域が存在することを確認し
た。各遺伝子の翻訳開始位置は、酢酸菌と同じダラム陰
性菌である大腸菌のＳＤ配列との類似性をもとに決定し
た。

（ａａｒＡ遺伝子の機能） 第５図に塩基配列を示したａａｒ　Ａ遺伝子の機能を明
らかにするため、既知遺伝子とのホモロジー検索をおこ
なった。アミノ酸配列をもとにして比較したところ大腸
菌、シュードモナス、リケッチアのクエン酸合成酵素と
５０％以上のホモロジーが見出された。ａａｒ　Ａ遺伝
子がクエン酸合成酵素の遺伝子であるかは以下のように
して確認した。

ａａｒＡ遺伝子を含む約２．９キロベースのＨｉｎｄｍ
　−ＢｇｌＩＩ断片（第４図のカナマイシン耐性遺伝子
の挿入位置４のＨｉｎｄ　ｍサイトから挿入位置６のＢ
ｇｌ■サイトの間の断片）を大腸菌ベクターρＵＣ１９
にＴ４ＤＮＡ　リガーゼを用い、連結し、常法により組
換えプラスミドを得た。このプラスミドを大腸菌のクエ
ン酸合成酵素欠損株［Ｅ、ｃｏｌｉ　ＭＥ　８３３０　
（国立遺伝学研究所に保存されている。）に常法により
形質転換し、形質転換株を得た。元株と形質転換株のク
エン酸合成酵素活性をＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ。

第１３巻、第３頁（１９６９）の方法にしたがって測定
したところ、元株の比活性が０．０１ユニット／ｍｇ蛋
白以下であったのに対し、形質転換株では、４．５ユニ
ット／ｍｇ蛋白であり、顕者な活性の発現がみられた。

また、先の実施例で得られた。第４図でカナマイシン耐
性遺伝子の挿入位置の５にカナマイシン耐性遺伝子が挿
入されａａｒ　Ａ遺伝子が欠損していると推定されるカ
ナマイシン耐性の形質転換株のクエン酸合成酵素活性を
上記の方法に準じて測定したところ、親株の比活性が０
．３９ユニツト／旺蛋白であるのに対し、形質転換株で
は０．０１ユ一ソト／ｍｇ蛋白以下の比活性しかなく、
クエン酸合成酵素が欠失していることが確認できた。次
に、上記の第４図で制限酵素地図を示した断片の内、ａ
ａｒ　Ａ遺伝子を含むＨｉｎｄ　ｍ　−Ｂｇｌ　Ｕ断片
が組みこまれたｐｕｃ　１９をＥｃｏ　ＲＩで切断し、
Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、一方、アセトバ
クター・アセチ・サブスピーシズ・キシリナムＩＦ０３
２８８の有するプラスミドのうち、分子サイズが約２．
１キロベースのプラスミドを常法により単離し、制限酵
素Ａｃｅ　Ｉで切断した後、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼ
で切断末端を平滑化したプラスミドＤＮＡをＴ４　ＤＮ
Ａリガーゼを用い連結し、組換えプラスミドを作成した
。

この組換えプラスミドは、ａａｒ　Ａ遺伝子を含むＨｉ
ｎｄｌｌＩ−ＢｇｌＩＩ断片と大腸菌ベクターｐｕｃ　
１９とアセトバクターのプラスミドとの３者のキメラプ
ラスミドである。このキメラプラスミドをアグリカルチ
ュラル・アン　ド・バイオロジカル・ケミストリー第４
９巻、第２４８５頁（１９８５年）に開示された方法に
より、アセトバクター・アセチ・サブスピーシズ・キシ
リナムＩＦ０３２８８に形質転換した。形質転換株はア
ンピシリン３００　／！ｇ／　ｍＱを含むＹＰＧ寒天培
地（グルコース３％、酵母エキス０．５％、ポリペプト
ン０．２％、寒天２％、ｐ）１６．５）で選択した。選
択培地に生育したアンピシリン耐性株のプラスミドをア
グリカルチュラル・アンド・バイオロジカル。

ケミストリー、第４９巻、第２０８３頁（１９８５年）
の方法に準じて調べ制限酵素解析により、ｐ（、ｌＣＩ
’ｌｌおよび第４図に示される遺伝子断片をＨｉｎｄ　
■とＢｇｌ　ＩＩで切断して得られる約２．９キロベー
スの遺伝子断片およびアセトバクター・アセチ・サブス
ピーシズ・キシリナムＩＦ０３２８８の保有する約２．
１キロベースの大きさのプラスミドの３者のキメラプラ
スミドを保有していることを確認した。

上記で得られたアンピシリン耐性の形質転換株のクエン
酸合成酵素の活性を、上記と同様な方法で測定したとこ
ろ、４．５ユニット／ｍｇ蛋白であり、ａａｒ　Ａ遺伝
子を有するプラスミドの導入により、活性が回復しただ
けでなく、コピー数にもとづく遺伝子増幅効果により、
親株の１０倍以上にまで活性が上昇した。

〔発明の効果〕

本発明を用いれば、従来、偶然性によってしか得ること
のできなかった酢酸耐性の向上した菌株を容易に取得す
ることができるだけでなく、酢酸耐性の向上した酢酸菌
を用いることにより、酢酸発酵の効率化が可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、酢酸耐性遺伝子の制限酵素地図で、第２図は
、Ｅｃｏ　ＲＩを用いて単離した酢酸耐性遺伝子の制限
酵素地図で、第３図は、Ｂｇｌ　ＩＩを用いて単離した
酢酸耐性遺伝子の制限酵素地図で、第４図は、カナマイ
シン耐性遺伝子の挿入位置を示す。 第５図、第６図及び第７図は、連続させて酢酸耐性遺伝
子の塩基配列及びアミノ酸配列を示す。第５図は単独で
クエン酸合成酵素遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列を
示す。 アミノ酸配列における略記号の意味は次のとおりである
。 Ｍｅｔメチオニン　　　　ＡｌａアラニンＡｒｇアルギ
ニン　　　　ＡｓｎアスパラギンＡｓｐアスパラギン酸
　　Ｃｙｓシスティングルタミン グリシン イソロイシン リシン プロリン スレオニン チロシン ｌｕ ｉｓ ｅｕ ｈｅ ｅｒ ｒｐ ａｌ グルタミン酸 ヒスチジン ロイシン フェニルアラニン セリン トリプトファン バリン 第　　１ 図 Ｎ；　ＨｉｎｃｌＩ、　Ｖ；ＥｃｏＲＶ、　ｓ、　Ｓｍ
ａｌ。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アセトバクター属の微生物に由来し、分子サイズが
   約５．６キロベースであり、制限酵素地図が第１図で示
   される酢酸耐性遺伝子。 ２、アセトバクター属の微生物に由来し、分子サイズが
   約５．６キロベースであり、制限酵素地図が第１図で示
   される酢酸耐性遺伝子を含むプラスミド。 ３、アセトバクター属の微生物に由来し、分子サイズが
   約５．６キロベースであり、制限酵素地図が第１図で示
   される酢酸耐性遺伝子を含むプラスミドによって形質転
   換した酢酸菌。 ４、アセトバクター属の微生物に由来し、第５図、第６
   図及び第７図の塩基配列で示される酢酸耐性遺伝子。 ５、アセトバクター属の微生物に由来し、第５図、第６
   図及び第７図のアミノ酸配列で示される酢酸耐性遺伝子
   。 ６、アセトバクター属の微生物に由来し、第５図のアミ
   ノ酸配列で示されるクエン酸合成酵素遺伝子。