JP2002539822A - 分枝酵素活性を有するポリペプチド及びそれをコードする核酸 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、分枝酵素活性を有する単離したポリペプチド及び前記ポリペプチドをコードする単離した核酸に関する。本発明はまた、前記核酸配列を含んで成る核酸構築物、ベクター、及び宿主細胞、並びに前記ポリペプチドを生成し、そして使用するための方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明の分野 本発明は分枝酵素活性を有するポリペプチド及びそのポリペプチドをコードす
る単離した核酸配列に関する。本発明は前記核酸配列を含んで成る核酸構築物、
ベクター、及び宿主細胞並びに前記ポリペプチドを生成し、そして使用するため
の方法にも関する。

【０００２】 関連技術の説明 以降ＢＥと表す分枝酵素（ＥＣ２．４．１．１８）はグリコシル転移を触媒し
て、微生物、植物及び高等生物においてグリコーゲン及びアミロペクチンのα−
１，６−グリコシド結合（分枝点）を形成せしめる。グリコーゲン及びアミロペ
クチンは、微生物、植物及び高等生物におけるエネルギー保存に使用される、高
度に分枝化した澱粉材料である。ＢＥは異なる分子間で分枝を形成するだけでな
く（分子間転移）、複数の分枝化したグルカンの、同一の分子上の別の部位への
転移も触媒する（分子内転移）。

【０００３】 高度に分枝化した澱粉材料は、末修飾の澱粉と比較して高い溶解性、低粘度及
び劣化しにくいという様な独特の特性を持ち、これはＥＰＯ ６９０ １７０に
記載されている様に製紙業における表面のサイジング及びコーティングを含む接
着性組成物、ＵＳ ４ ４５４ １６１に記載の食品及び飲料添加物並びに抗デ
ンプン劣化剤における使用のために、それらを興味深いものにしている。

【０００４】 複数の異なる生物に由来する分枝酵素が単離され、そして開示されてきた：例
えば、ＵＳ ４ ４５４ １６１はバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のＢＥを記載し；Ｂｏｙｅｒ ａｎｄ Ｐｒｅｉ
ｓｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１６（１６），ｐｐ．３６９３−３
６９９，１９７７は、エスクリッチャ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）由来のＢＥを記載し；Ｚｅｖｅｒｈｕｉｚｅｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ａｃｔａ（８１），ｐｐ．６０８−６１１，１９６４は、アルスロバク
ター・グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）
由来のＢＥを記載し；Ｗａｌｋｅｒ ａｎｄ Ｂｕｉｌｄｅｒ，Ｅｕｒ．Ｊ．ｏ
ｆ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２０（１），ｐｐ１４−２１，１９７１は、ス
トレプトコッカス・ミチス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）由来の
ＢＥを記載し；Ｋｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．７８（１），ｐｐ
．９−１８，１９８９は、シアノバクテリウム・シネココッカス（Ｃｙａｎｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）種のＰＣＣ７９４２由来のＢ
Ｅを記載し；Ｒｕｍｂａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１７３（２１），ｐｐ．６７３２−６７４１，１９９
１は、ブチリビブリオ・フィブリソルベンス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｆｉ
ｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ）由来のＢＥを記載し；Ｋｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ｖｏｌ．３（４），ｐｐ．２２１−２３２，１９９２は、
バチルス・カルドリチカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ）由
来のＢＥを記載している。

【０００５】 上文で言及した引用の共通の特徴は、報告された至適温度のいずれも４５℃以
上ではないことである。わずかに２つの分枝酵素だけが、それより高い至適温度
を有すると開示された：Ｋｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇ
ｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｖｏｌ．２３０（１−２），ｐｐ．１３６−
１４４，１９９１（更にはＥＰ ０ ４１８ ９４５）：５３℃の至適温度を有
するバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｔｅａｒｏｔｈ
ｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）１５０３−４Ｒの分枝酵素；及びＴａｋａｔａ ｅｔ．
ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．６０（９），ｐｐ．３０９６−３１０４，１９９４：約
５０℃の至適温度を有するバチルス・ステアロサーモフィルスＴＲＢＥ１４の分
枝酵素。

【０００６】 高温で増大する反応速度が得られるため、高い至適温度を有する分枝酵素を使
用することは、産業上有利である。それによって、より高い能力が同量の酵素で
得られ、そしてより良い生産経済が達成される。更に、高温での処理の実施は、
感染の予防により有益である。

【０００７】 分枝酵素活性を有する改良ポリペプチド及びそのポリペプチドをコードする核
酸を提供することが本発明の目的である。

【０００８】 本発明の要約 本発明は、分枝酵素活性、及び少なくとも６０℃の至適温度を有する単離した
ポリペプチドに関する。

【０００９】 本発明は、前記ポリペプチドをコードする単離した核酸配列並びにその核酸配
列を含んで成る核酸構築物、ベクター、及び宿主細胞、並びに前記ポリペプチド
を生成し、そして使用するための方法にも関する。

【００１０】 本発明の詳細な説明 分枝酵素活性を有するポリペプチド 「分枝酵素活性」とは、グリコーゲン又はアミロペクチンの１，６−α−グリ
コシド結合の形成を触媒する１，４−α−グルカン分枝活性である（ＥＣ ２．
４．１．１８）。本発明の目的のために、分枝酵素活性は、本明細書の材料と方
法の項目の中の標題「分枝酵素活性」に記載されている、Ｔａｋａｔａ ｅｔ
ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ（１９９４），ｐ．３０９７に記載の方法（アッセイＡ）の改良版
に従い決定され得る。

【００１１】 第一の観点において、本発明は分枝酵素活性を有し、そして少なくとも６０℃
の至適温度を有する単離したポリペプチドに関し；好ましくは、その至適温度は
６０℃〜１２０℃の範囲にあり；更に好ましくは、その至適温度は６０℃〜１０
０℃の範囲にあり；より更に好ましくは、その至適温度は６０℃〜８０℃の範囲
にあり；最も好ましくは、その至適温度は６０℃〜７０℃の範囲にあり；そして
より最も好ましくは、その至適温度は６５℃である。

【００１２】 第一の態様において、本発明のポリペプチドはｐＨ６〜ｐＨ８の範囲で約７０
％の相対的活性を保持し；好ましくはｐＨ６〜ｐＨ７の範囲で約８０％の相対的
活性を保持し；更に好ましくは、至適ｐＨが約ｐＨ７である。

【００１３】 至適温度及びｐＨを決定するために使用する条件は、本明細書の材料を方法の
項目において「分枝酵素活性」の標題のもと記載されているものである。

【００１４】 第二の態様において、本発明のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸２〜６
２１（すなわち、成熟ポリペプチド）に対して、又はＥ．コリＤＳＭ１２６０７
に含まれるプラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅに含まれる核酸配列によってコードされる
アミノ酸配列に対して少なくとも約６５％、好ましくは少なくとも約７０％、更
に好ましくは少なくとも約８０％、より更に好ましくは少なくとも約９０％、最
も好ましくは少なくとも約９５％、より最も好ましくは少なくとも約９７％の相
同性の値を有する、分枝酵素活性を有するアミノ酸配列を有する（以降、「相同
ポリペプチド」と称する）。好ましい態様において、相同ポリペプチドは、配列
番号２のアミノ酸配列と、５つのアミノ酸、好ましくは４つのアミノ酸、更に好
ましくは３つのアミノ酸、より更に好ましくは２つのアミノ酸、最も好ましくは
１つのアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する。

【００１５】 本発明の目的のために、配列のアラインメント及び相同性スコアの計算は、タ
ンパク質及びＤＮＡ、その両方のアラインメントに有用な、完全なＳｍｉｔｈ−
Ｗａｔｅｒｍａｎアラインメントを用いて行われ得る。デフォルトスコアリング
マトリックス ＢＬＯＳＵＭ５０及び同一性マトリックスは、それぞれタンパク
質及びＤＮＡのアラインメントに使用される。ギャップの最初の残基についての
ペナルティーは、タンパク質で−１２、そしてＤＮＡで−１６であり、一方、ギ
ャップの追加の残基についてのペナルティーは、タンパク質で−２、そしてＤＮ
Ａで−４である。アラインメントは、ＦＡＳＴＡパッケージの第ｖ２０ｕ６版で
も行われ得る（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｄ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９
８８），「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ」，ＰＮＡＳ ８５：２４４４−２４４８、
及びＷ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９０）「Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔ
ｉｖｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ＦＡＳＴＰ ａ
ｎｄ ＦＡＳＴＡ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３：
６３−９８）。タンパク質配列の複数のアラインメントは、「Ｃｌｕｓｔａｌ
Ｗ」を用いて行われ得る（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．
Ｇ．ａｎｄ Ｇｉｂｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．（１９９４）ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ：ｉｍｐ
ｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖ
ｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇ
ｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ−ｓｐｅｃｉ
ｆｉｃ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ ａｎｄ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｔｒｉｘ
ｃｈｏｉｃｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：（１６
７３−４６８０）。ＤＮＡ配列の複数のアラインメントは、アミノ酸を、ＤＮＡ
配列に由来する相当するコドンと置き換える鋳型としてタンパク質のアラインメ
ントを用いて行われ得る。

【００１６】 好ましくは、本発明のポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列又はその対立
遺伝子変異体；あるいは分枝酵素活性を有するそのフラグメントを含んで成る。
更に好ましい態様において、本発明のポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列
を含んで成る。別の好ましい態様において、本発明のポリペプチドは、配列番号
２のアミノ酸配列又はその対立遺伝子変異体；あるいは分枝酵素活性を有するそ
のフラグメントから成る。別の好ましい態様において、本発明のポリペプチドは
、配列番号２のアミノ酸配列から成る。

【００１７】 配列番号２のフラグメントは、このアミノ酸配列のアミノ及び／又はカルボキ
シル末端から欠失した１又は複数のアミノ酸を有するポリペプチドである。

【００１８】 対立変異体とは、同一の染色体の座を占める遺伝子の２又はそれ以上の択一型
のいずれかを表す。対立変異は突然変異を介して自然に起こり、そして個体群に
おいて多型を生じ得る。遺伝子の突然変異はサイレント（コードされたポリペプ
チドにおける無変化）であることもあり、又は変化したアミノ酸配列を有するポ
リペプチドをコードすることもある。ポリペプチドの対立変異体は、対立変異体
の遺伝子によってコードされるポリペプチドである。

【００１９】 第三の態様において、本発明のポリペプチドは、非常に低いストリンジェント
な条件、好ましくは低いストリンジェントな条件、更に好ましくは中程度にスト
リンジェントな条件、更に好ましくは中程度−高度にストリンジェントな条件、
より更に好ましくは高度にストリンジェントな条件、最も好ましくは非常に高度
にストリンジェントな条件のもと、同一の条件下で（ｉ）配列番号１のヌクレオ
チド、（ｉｉ）配列番号１のヌクレオチドに含まれるｃＤＮＡ配列、（ｉｉｉ）
（ｉ）若しくは（ｉｉ）の亜配列、又は（ｉｖ）（ｉ），（ｉｉ）、若しくは（
ｉｉｉ）の相補鎖とハイブリダイズする核酸プローブとハイブリダイズする核酸
配列によってコードされる、分枝酵素活性を有する（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ
．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｈ，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅ
ｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
配列番号１の亜配列は少なくとも１００個のヌクレオチド又は好ましくは少なく
とも２００個のヌクレオチドであってもよい。更に前記亜配列は、分枝酵素活性
を有するポリペプチドフラグメントをコードすることがある。前記ポリペプチド
は更に、分枝酵素活性を有するポリペプチドの対立遺伝子変異体又はフラグメン
トであってもよい。

【００２０】 配列番号１の核酸配列又はその亜配列、及び配列番号２のアミノ酸配列又はそ
のフラグメントは、当業界で公知の方法に従い、異なる属又は種の菌株から分枝
酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを同定し、そしてクローン化
するための核酸プローブを設計するために使用されうる。特に、前記プローブは
、標準的なサザンブロッティング方法に従い、その中で相当する遺伝子を同定し
、そして単離するために、注目の属又は種のゲノム又はｃＤＮＡとのハイブリダ
イゼーションのために使用され得る。前記プローブは全配列よりもかなり短いこ
とがあるが、少なくとも１５、好ましくは少なくとも２５、及び更に好ましくは
少なくとも３５ヌクレオチドの長さであるべきである。更に長いプローブも使用
することができる。ＤＮＡ及びＲＮＡプローブ、その両方を使用することができ
る。前記プローブは、典型的に相当する遺伝子を検出するために標識される（例
えば、^３２Ｐ、^３Ｈ、^３５Ｓ、ビオチン、又はアビジンによる）。前記プローブ
は本発明に包含される。

【００２１】 従って、その様な他の生物から調製したゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリ
ーは、上述したプローブとハイブリダイズし、そして分枝酵素活性を有するポリ
ペプチドをコードするＤＮＡのためにスクリーニングされ得る。その様な他の生
物由来のゲノム又は他のＤＮＡは、アガロース又はポリアクリルアミドゲル電気
泳動、あるいは他の分離技術によって分離され得る。前記ライブラリー由来のＤ
ＮＡ又は分離したＤＮＡは、ニトロセルロース又は他の適当な担体材料上に移さ
れ、そして固定化され得る。配列番号１又はその亜配列と相同なクローン又はＤ
ＮＡを同定するために、前記担体材料はサザンブロットに使用される。本発明の
目的のためのハイブリダイゼーションは、前記核酸配列が、配列番号１に示した
核酸配列、その相補鎖、又はそれらの亜配列に、非常に低いないし非常に高度な
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを示唆する。前記核酸プロ
ーブがこれらの条件下でハイブリダイズする分子は、Ｘ線フィルムを用いて検出
される。

【００２２】 好ましい態様において、前記核酸プローブは、配列番号２のポリペプチドをコ
ードする核酸配列、又はその亜配列である。別の好ましい態様において、前記核
酸プローブは配列番号１である。別の好ましい態様において、前記核酸プローブ
は、エスケリッチャ・コリ ＤＳＭ１２６０７に含まれるプラスミドｐＴ７Ｂｌ
ｕｅに含まれる核酸配列であり（例１を参照のこと）、この中で、前記核酸配列
は分枝酵素活性を有するポリペプチドをコードする。

【００２３】 少なくとも１００ヌクレオチドの長さの長いプローブのための、非常に低いな
いし非常に高度なストリンジェントな条件は、５× ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ
、２００μｇ／ｍｌの剪断し、そして変性したサケ精子ＤＮＡ、並びに非常に低
い及び低いストリンジェント性のための２５％ホルムアミド、中程度及び中程度
−高度にストリンジェント性のための３５％ホルムアミド、又は高度及び非常に
高度なストリンジェント性のための５０％ホルムアミドのいずれかにおける、標
準的なサザンブロッティング法に従う４２℃でのプレハイブリダイゼーション及
びハイブリダイゼーションとして定義される。

【００２４】 少なくとも１００ヌクレオチドの長さのプローブのために、前記担体材料は、
最終的に２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、好ましくは少なくとも４５℃（
非常に低いストリンジェント性）、更に好ましくは少なくとも５０℃（低いスト
リンジェント性）、更に好ましくは少なくとも５５℃（中程度のストリンジェン
ト性）、更に好ましくは少なくとも６０℃（中程度−高度なストリンジェント性
）、より更に好ましくは６５℃（高度なストリンジェント性）、及び最も好まし
くは少なくとも７０℃（非常に高度なストリンジェント性）で、各１５分間、３
回洗浄される。

【００２５】 約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチドの長さの短いプローブのためのスト
リンジェントな条件は、Ｂｏｌｔｏｎ及びＭｃＣａｒｔｈｙ（１９６２，Ｐｒｏ
ｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ ４８：１３９０）に従う計算を用いて算出したＴ_ｍ
から５℃〜１０℃低い温度で、１ｍｌ当たり０．９Ｍ ＮａＣｌ、０．０９Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．６、６ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＮＰ−４０，１×
デンハルト溶液、１ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ 一塩基リン酸ナトリウ
ム、０．１ｍＭ ＡＴＰ、及び０．２ｍｇの酵母ＲＮＡにおいて、標準的なサザ
ンブロッティング法に従うプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーショ
ン、及びハイブリダイゼーション後の洗浄として定義される。

【００２６】 約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチドの長さの短いプローブのための前記
担体材料は、１回、６×ＳＣＣ＋０．１％ＳＤＳ中で１５分間、及び２回、６×
ＳＳＣを用いて算出したＴ_ｍより５℃〜１０℃低い温度で各１５分間洗浄される
。

【００２７】 第四の態様において、本発明は１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、及び／又
は挿入を含んで成る配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドのＢＥ活性
を有する変異体に関する。

【００２８】 変異体ポリペプチドのアミノ酸配列は、１又は複数のアミノ酸残基の挿入若し
くは欠失によって、及び／又は異なるアミノ酸残基による１又は複数のアミノ酸
残基の置換によって、配列番号２のアミノ酸配列又はその成熟ポリペプチドと異
なることがある。好ましくは、アミノ酸の変化は前記タンパク質の折りたたみ及
び／又は活性に有意に影響を与えない保存的なアミノ酸置換；典型的に１〜約３
０アミノ酸のわずかな欠失；わずかなアミノ又はカルボキシル末端の伸長、例え
ばアミノ末端のメチオニン残基；最大約２０〜２５残基の小さいリンカーペプチ
ド；あるいは正電価の変化又は別の機能により精製を容易にするわずかな伸長、
例えばポリヒスチジントラクト、抗原性エピトープ又は結合ドメインという、軽
微な性質のものである。

【００２９】 保存性置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン及びヒスチジン）、
酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン
及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン及びバリン）、
芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）及び小型ア
ミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニン及びメチオニン）の群内であ
る。一般的には比活性を変えないアミノ酸置換は当業界で既知であり、例えば、
Ｈ．ＮｅｕｒａｔｈとＲ．Ｌ．Ｈｉｌｌ（１９７９、「Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ
ｓ」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）により記載されている
。最も普通に発生する交換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌ
ｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌ
ａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒ
ｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ及びＡ
ｓｐ／Ｇｌｙならびにこれらの逆である。

【００３０】 第五の態様において、本発明のポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列を有
するポリペプチドに対して免疫化学的同一性又は部分的な免疫化学的同一性を有
する。免疫化学的特性は、公知のオクタロニー二重免疫拡散法による免疫学的交
差反応同定試験によって決定される。具体的には、免疫反応性の、又は配列番号
２のアミノ酸配列を有するポリペプチド若しくはその成熟ポリペプチドのエピト
ープに結合するポリクローナル抗体を含む抗血清は、Ｈａｒｂｏｅ ａｎｄ Ｉ
ｎｇｉｌｄ，Ｉｎ Ｎ．Ｈ．Ａｘｅｌｓｅｎ，Ｊ．Ｋｒｏｌｌ ａｎｄ Ｂ．Ｗ
ｅｅｋｓ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｑｕａｎｔａｔｉｖｅ
Ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅ
ｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９７３，Ｃｈａｐｔｅｒ ２３、
又はＪｏｈｎｓｔｏｎｅ ａｎｄ Ｔｈｏｒｐｅ，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ ｉｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９８２（更に具体的には２７〜３１ページ）に記
載されている方法に従いウサギ（又は他のげっ歯類）を免疫化することで調製さ
れる。免疫化学的同一性を有するポリペプチドは、同一の様式、例えば沈澱の全
体的な融合、同一な沈澱の形態、及び／又は同一な電気泳動の移動度で、特異的
な免疫化学的技術を用いて抗血清と反応するポリペプチドである。免疫化学的同
一性の更なる説明は、Ａｘｅｌｓｅｎ，Ｂｏｃｋ，ａｎｄ Ｋｒｏｌｌ，Ｉｎ
Ｎ．Ｈ．Ａｘｅｌｓｅｎ，Ｊ．Ｋｒｏｌｌ，ａｎｄ Ｂ．Ｗｅｅｋｓ，ｅｄｉｔ
ｏｒｓ，Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｅ
ｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９７３，Ｃｈａｐｔｅｒ １０に記載されている
。部分的な免疫化学的同一性を有するポリペプチドは、部分的に同一な様式、例
えば沈澱の部分的融合、部分的に同一な沈澱の形態、及び／又は部分的に同一な
電気泳動の移動度で、特異的な免疫化学的技術を用いて抗血清と反応するポリペ
プチドである。部分的な免疫化学的同一性の更なる説明は、Ｂｏｃｋ ａｎｄ
Ａｘｅｌｓｅｎ，Ｉｎ Ｎ．Ｈ．Ａｘｅｌｓｅｎ，Ｊ．Ｋｒｏｌｌ，ａｎｄ Ｂ
．Ｗｅｅｋｓ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｑｕａｎｔｉｔａｔ
ｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９７３，Ｃｈａｐｔｅｒ
１１に記載されている。

【００３１】 前記抗体は更に、モノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は
、例えばＥ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ，ｅｄｉｔｏｒｓ，１９８８
，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋの方法に従い調製され、そして使用されうる。

【００３２】 本発明のポリペプチドは、配列番号２のポリペプチドの少なくとも２０％、好
ましくは少なくとも４０％、更に好ましくは少なくとも６０％、より更に好まし
くは少なくとも８０％、より更に好ましくは少なくとも９０％、及び最も好まし
くは少なくとも１００％の分枝酵素活性を有する。

【００３３】 本発明のポリペプチドは、任意の属の微生物から得られる。本発明の目的のた
めに、「〜から得られる」という用語は、所定の供給源と関連して本明細書中で
用いる場合、核酸配列によりコードされるポリペプチドがその供給源により、又
は供給源からの核酸が挿入された細胞により生成されることを意味する。好まし
い態様において、ポリペプチドは細胞外に分泌される。

【００３４】 本発明のポリペプチドは、細菌ポリペプチドである。例えば、ポリペプチドは
、グラム陽性細菌ポリペプチド、例えばバチルス属ポリペプチド、例えばバチル
ス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチ
ルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａ
ｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチ
ルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・
コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・ラウツ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケミホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈ
ｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム、バチルス・ステアロサーモフ
ィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチル
ス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はバチルス・サーリ
ンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ポリペプチド
；あるいはストレプトミセスポリペプチド、例えばストレプトミセス・リビダン
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）又はストレプトミセス・ム
リヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｕｒｉｎｕｓ）ポリペプチド；あるいは
グラム陰性細菌ポリペプチド、例えばＥ．コリ又はシュードモナス種ポリペプチ
ドであり得る。

【００３５】 本発明のポリペプチドは、真菌ポリペプチド、更に好ましくは酵母ポリペプチ
ド、例えばカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅ
ｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ）又はヤローウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ポリペプチド；あるいは更
に好ましくは糸状真菌ポリペプチド、例えばアクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎ
ｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、オーレオバシジウム
属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、クリプトコックス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ）、フィリバシジウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（
Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ属（Ｍａ
ｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃ
ｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスチクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔ
ｉｘ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロミセス属（Ｐａｅ
ｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピロミセ
ス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾフィルム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）
、タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスクス属（Ｔｈｅｒｍ
ｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（
Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）又はトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）
ポリペプチドであり得る。

【００３６】 好ましい態様において、ポリペプチドは、サッカロミセス属・カースベルゲン
シス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロ
ミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、
サッカロミセス・ジアスタチクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａ
ｔｉｃｕｓ）、サッカロミセス・ドウグラシ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄ
ｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）又はサッカロミセス・オビホルミス（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）ポリペプチドである。

【００３７】 別の好ましい態様において、ポリペプチドは、アスペルギルス・クレツス（Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フェチズス（Ａｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニズランス（Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、フザリウム・バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕ
ｍ ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕ
ｍ ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クルックウェレンセ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ
ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ
ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒ
ａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍ
ｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓ
ｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｅｇｕｎｄｉ）、
フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザ
リウム・レテイキュラツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フ
ザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・ザムブ
チヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・ザルコクロ
ウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリ
キオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリ
ウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム
・トルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコ
セキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザ
リウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラ・イ
ンソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノサ（
Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ
ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏ
ｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐ
ｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・パープロゲヌム（ｐｕｒｐｕｒｏｇｅ
ｎｕｍ）、トリコデルマ・ハージアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉ
ａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギー（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎ
ｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏ
ｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒ
ｍａ ｒｅｅｓｅｉ）又はトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖ
ｉｒｉｄｅ）ポリペプチドである。

【００３８】 別の好ましい態様において、ポリペプチドはロドサームス・オバメンシス（Ｒ
ｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ）、又はロドサームス・マリヌス
（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ）のポリペプチドである。

【００３９】 更に好ましい態様において、ポリペプチドはロドサームス・オバメンシスのポ
リペプチドであり、そして最も好ましくは、エスケリッチャ・コリ ＤＳＭ１２
６０７に含まれるプラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅに含まれる配列（例１を参照のこと
）のコード領域のポリペプチド、例えば配列番号２のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドである。

【００４０】 前記の種に関しては、それらが知られている種名にかかわらず、本発明は完全
及び不完全状態、ならびにその他の分類学的等価物、例えば無性世代を含んで成
ると理解される。適切な等価物の同一性を、当業者は容易に理解する。例えば、
ロドサームス・オバメンシスの分類学的等価物は、Ｓａｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉ
ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４６（４） ｐｐ．１０９９−１１０４（１
９９６）によって定義されている。

【００４１】 これらの種の系統は、多数の培養コレクション、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓ
ａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌ
ｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）、Ｊａｐａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ（ＪＣＭ）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａ
ｕ Ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）及びＡｇｒｉｃｕ
ｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｐａｔｅｎｔ Ｃｕｌｔｕ
ｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＲＲＬ）において、一般に容易に入手可能である。

【００４２】 更にこのようなポリペプチドは、前記のプローブを用いて、自然（例えば土壌
、堆肥、水等）から単離された微生物を含めたその他の供給源から同定され、そ
して入手され得る。天然生息地から微生物を単離するための技法は、当業界で周
知である。次に、別の微生物のゲノム又はｃＤＮＡライブラリーを同様にスクリ
ーニングすることにより、核酸配列が得られる。ポリペプチドをコードする核酸
配列がプローブにより一旦検出されれば、当業者に既知の技法を用いて、配列を
単離又はクローン化し得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８
９（前記）を参照のこと）。

【００４３】 本明細書中で定義する場合、「単離された」ポリペプチドとは、本質的にその
他の非分枝酵素ポリペプチドを含まない、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定
した場合に、少なくとも約２０％純粋な、好ましくは少なくとも約４０％純粋な
、更に好ましくは約６０％純粋な、より更に好ましくは約８０％純粋な、最も好
ましくは約９０％純粋な、そして更には最も好ましくは約９５％純粋であるポリ
ペプチドである。

【００４４】 本発明の核酸配列によりコードされるポリペプチドは、もう一つのポリペプチ
ドが前記ポリペプチド又はそのフラングメントのＮ末端又はＣ末端で融合される
融合ポリペプチド又は開裂可能な融合ポリペプチドも含む。融合ポリペプチドは
、別のポリペプチドをコードする核酸配列（又はその一部）を本発明の核酸配列
（又はその一部）に融合することにより生成される。融合ポリペプチドを生成す
るための技法は当業界で既知であり、それらがフレーム内にあり、そして融合ポ
リペプチドの発現が同一プロモーター及びターミネーターの制御下にあるように
、ポリペプチドをコードするコード配列をライゲーションすることを含む。

【００４５】 核酸配列 本発明は、本発明のポリペプチドをコードする単離した核酸配列にも関する。
好ましい態様において、核酸配列は配列番号１に記載される。別の更に好ましい
態様において、核酸配列はＥ・コリ ＤＳＭ１２６０７に含まれるプラスミドｐ
Ｔ７Ｂｌｕｅに含まれる配列（例１を参照のこと）である。本発明は、遺伝暗号
の縮重の点で配列番号１とは異なる配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドをコードする核酸配列も含んで成る。本発明は、分枝酵素活性を有する配列
番号２のフラングメントをコードする配列番号１の亜配列にも関する。

【００４６】 配列番号１の亜配列は配列番号１に包含される核酸配列であるが、但し５’及
び／又は３’末端から１又は複数のヌクレオチドが欠失されている。

【００４７】 本発明は、配列番号１のポリペプチドをコードしている配列中に少なくとも１
つの変異を含んで成る変異体核酸配列にも関するが、この場合、変異体核酸配列
は配列番号２のアミノ酸から成るポリペプチドをコードする。

【００４８】 ポリペプチドをコードする核酸配列を単離又はクローン化するために用いられ
る技術は当業界で既知であり、その例としては、例えばゲノムＤＮＡからの単離
、ｃＤＮＡからの調製、又はそれらの組合せが挙げられる。このようなゲノムＤ
ＮＡからの本発明の核酸配列のクローン化は、例えば例１に示す様な周知のポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は共有の構造的特徴でクローン化したＤＮＡフラ
ングメントを検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニングを用いるこ
とにより実行され得る（例えば、Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０、「ＰＣ
Ｒ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。その他の
核酸増幅法、例えばリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、結合活性化転写（ＬＡＴ）及
び核酸配列を基にした増幅（ＮＡＳＢＡ）も用い得る。核酸配列は、ロドサーム
スの菌株、あるいは別の又は関連した生物からクローン化され、したがって、例
えば核酸配列のポリペプチドをコードしている領域の対立遺伝子的又は種変異体
であり得る。

【００４９】 「単離した核酸配列」という用語は、本明細書中で用いる場合は、その他の核
酸配列を本質的に含みない、例えばアガロース電気泳動により決定した場合に、
少なくとも約２０％純粋な、好ましくは少なくとも約４０％純粋な、更に好まし
くは少なくとも約６０％純粋な、より更に好ましくは少なくとも約８０％純粋な
、最も好ましくは少なくとも約９０％純粋である核酸配列を指す。例えば、単離
した核酸配列は、その天然の位置からそれが再生成される異なる部位に核酸配列
を配置し直すために遺伝子操作に用いられる標準的なクローン化法により得られ
る。クローン化法は、ポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成る所望の核
酸フラングメントの除去及び単離、そのフラングメントのベクター分子への挿入
、そして核酸配列の多数のコピー又はクローンが複製される宿主細胞中への組換
えベクターの組み込みを含み得る。核酸配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮ
Ａ、半合成、合成起源、又はそれらの任意の組合せのものであり得る。

【００５０】 本発明は、少なくとも約６５％、好ましくは約７０％、好ましくは約８０％、
更に好ましくは約９０％、より更に好ましくは約９５％、そして最も好ましくは
９７％の、活性ポリペプチドをコードする配列番号１の成熟ポリペプチドのコー
ド配列（すなわち、ヌクレオチド４〜１８６３）とある程度の相同性を有する核
酸配列にも関する。本発明の目的のために、２つの核酸配列間の相同性の程度は
、タンパク質及びＤＮＡ、その両方のアラインメントに有用な、完全なＳｍｉｔ
ｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアラインメントを用いて決定する。デフォルトスコアリン
グＢＬＯＳＵＭ５０及び同一性マトリックスは、それぞれタンパク質及びＤＮＡ
のアラインメントに使用される。ギャップの最初の残基についてのペナルティー
は、タンパク質で−１２、そしてＤＮＡで−１６であり、一方、ギャップの追加
の残基についてのペナルティーは、タンパク質で−２、そしてＤＮＡで−４であ
る。アラインメントはＦＡＳＴＡパッケージの第ｖ２０ｕ６版で行う（Ｗ．Ｒ．
Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｄ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９８８），Ｉｍｐｒｏｖｅ
ｄ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌ
ｙｓｉｓ，ＰＮＡＳ ８５：２４４４−２４４８，及びＷ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ
（１９９０）Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃ
ｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ＦＡＳＴＰ ａｎｄ ＦＡＳＴＡ，Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８３：６３−９８）。

【００５１】 本発明のポリペプチドをコードする核酸配列の修飾は、本ポリペプチドと実質
的に類似のポリペプチドの合成に必要である。本ポリペプチドと「実質的に類似
の」という用語は、非天然形態のポリペプチドを示す。これらのポリペプチドは
、何らかの工学処理方法で、その元の供給源から単離されたポリペプチドと異な
り、例えば、比活性、熱安定性、至適ｐＨなどで異なる変異体とは異なり得る。
変異体配列は、配列番号１の一部をコードするポリペプチドとして示される核酸
配列、例えばその亜配列を基礎にして、及び／又は核酸配列によりコードされる
ポリペプチドの別のアミノ酸配列を生じないが、しかし酵素の生成を意図された
宿主生物のコドン使用に対応するヌクレオチド置換の導入により、あるいは異な
るアミノ酸配列を生じ得るヌクレオチド置換の導入により構築され得る。ヌクレ
オチド置換の一般的記載に関しては、例えば、Ｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９
１、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎ」２：９５−１０７を参照のこと。

【００５２】 このような置換は分子の機能に決定的な領域の外側でなすことができ、そして
依然として活性なポリペプチドを生じる、ということは当業者には明らかである
。本発明の単離した核酸配列によりコードされるポリペプチドの活性に不可欠な
、したがって好ましくは置換を受けないアミノ酸残基は、当業界で既知の手法に
より、例えば部位指定突然変異誘発又はアラニン走査変異誘発により同定され得
る（例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓ、１９８９、「Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ」２４４：１０８１−１０８５参照）。後者の技法では、変異は、分子中のあ
らゆる正に荷電した残基に導入され、その結果生じる変異体分子が分枝酵素活性
に関して試験されて、分子の活性に重大であるアミノ酸残基を同定する。基質−
酵素相互作用の部位は、核磁気共鳴分析、結晶学又は光親和性標識のような技法
により決定されるような三次元構造の分析により決定され得る（例えば、ｄｅ
Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２５５：３０６−３１２
；Ｓｍｉｔｈｅｔ ａｌ．，１９９２、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」２２４：８９９−９０４；Ｗｌｏｄａｖｅｒ ｅｔ
ａｌ．，１９９２、「ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ」３０９：５９−６４を参照の
こと）。

【００５３】 本発明はまた、本明細書で定義したように、非常に低いストリンジェントな条
件、好ましくは低いストリンジェントな条件、更に好ましくは中程度にストリン
ジェントな条件、更に好ましくは中程度−高度にストリンジェントな条件、より
更に好ましくは高度にストリンジェントな条件、最も好ましくは非常に高度にス
トリンジェントな条件のもと、同一の条件下で配列番号１の核酸配列若しくはそ
の相補鎖；又はそれらの対立変異体及び亜配列（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ
．，１９８９（前記））とハイブリダイズする核酸プローブとハイブリダイズす
る、本発明のポリペプチドをコードする単離した核酸配列に関する。

【００５４】 本発明はまた、（ａ）非常に低い、低い、中程度、中程度−高度、高度、又は
非常に高度にストリンジェントな条件下で（ｉ）配列番号１のヌクレオチド、（
ｉｉ）配列番号１のヌクレオチドに含まれるｃＤＮＡ配列、（ｉｉｉ）（ｉ）若
しくは（ｉｉ）の亜配列、又は（ｉｖ）（ｉ），（ｉｉ）、若しくは（ｉｉｉ）
の相補鎖とハイブリダイズし；そして（ｂ）その核酸配列を単離することによっ
て生成する単離した核酸配列に関する。亜配列は、好ましくは少なくとも１００
ヌクレオチドの配列、例えば分枝酵素活性を有するポリペプチドフラグメントを
コードする配列である。

【００５５】 変異体核酸配列の生成方法 本発明は更に、配列番号１のポリペプチドのコード配列又はその亜配列に少な
くとも１つの変異を導入することを含んで成る変異体核酸配列の生成方法であっ
て、変異体核酸配列が配列番号２のアミノ酸又は分枝酵素活性を有するそのフラ
ングメントから成るポリペプチドをコードする方法に関する。

【００５６】 一方のヌクレオチドを他方のヌクレオチドに交換するための、変異の核酸配列
への導入は、当業界で既知の任意の方法を用いた部位指定突然変異誘発によりな
し遂げ得る。特に有用なのは、注目の挿入物を有する超コイル二本鎖ＤＮＡベク
ターと所望の変異を含む２つの合成プライマーとを用いる手法である。各々がベ
クターの反対鎖と相補的なオリゴヌクレオチドプライマーは、Ｐｆｕ ＤＮＡポ
リメラーゼによって温度周期進行中に伸張する。プライマーの組み込み時に、ス
タガーニックを含む変異化プラスミドが生成される。温度周期進行後、メチル化
及び半メチル化ＤＮＡに特異的なＤｐｎＩで生成物を処理して親ＤＮＡ鋳型を消
化し、そして変異含有合成ＤＮＡを選択する。当業界で既知のその他の手法も用
い得る。

【００５７】 核酸構築物 本発明は、調節（ｃｏｎｔｒｏｌｌ）配列と両立可能な条件下で適切な宿主細
胞でのコード配列の発現を指示する１又は複数の調節配列と作用可能に連結した
本発明の核酸配列を含んで成る核酸構築物にも関する。発現は、ポリペプチドの
生成に関与するあらゆる工程を含むと理解され、その例としては、転写、転写後
修飾、翻訳、翻訳後修飾及び分泌が挙げられるが、これらに限定されない。

【００５８】 「核酸構築物」は、天然遺伝子から単離される、あるいはそうでなければ天然
には存在しない方法で、結合され、並置される核酸のセグメントを含むよう修飾
された一本鎖又は二本鎖の核酸分子と本明細書中では定義される。核酸構築物と
いう用語は、核酸構築物が本発明のコード配列の発現に必要な調節配列をすべて
含む場合の発現カセットという用語と同義である。「コード配列」という用語は
、そのタンパク質生成物質のアミノ酸配列を直接特定する核酸配列と本明細書中
では定義される。コード配列の境界は、一般に、リボソーム結合部位により（原
核生物）、又はｍＲＮＡの５’末端のオープンリーディングフレームのすぐ上流
に位置するＡＴＧ開始コドンとｍＲＮＡの３’末端のオープンリーディングフレ
ームのすぐ下流に位置する転写ターミネーター配列とにより（真核生物）決定さ
れる。コード配列としては、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及び組換え核酸配列が挙げられる
が、これらに限定されない。

【００５９】 本発明のポリペプチドをコードする単離した核酸配列を種々の方法で操作して
、ポリペプチドの発現を提供し得る。それをベクターに挿入する前の核酸配列の
操作は、発現ベクターによっては望ましいか又は必要である。組換えＤＮＡ法を
用いて核酸配列を修飾する技法は、当業界では公知である。

【００６０】 「調節配列」という用語は、本発明のポリペプチドの発現に必要な又は有益な
すべての成分を含むと本明細書中では定義される。各々の調節配列は、ポリペプ
チドをコードする核酸配列に対して天然のものであるか又は外来のものであり得
る。このような調節配列としては、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチ
ド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列及び転写ターミネーターが挙げら
れるが、これらに限定されない。最低限度、調節配列は、プロモーターと、転写
及び翻訳停止シグナルを含む。調節配列は、調節配列とポリペプチドをコードす
る核酸配列のコード領域とのライゲーションを容易にする特異的制限部位を導入
する目的のためのリンカーを備え得る。「作用可能に連結される」という用語は
、調節配列が、ポリペプチドの発現を指示するように、ＤＮＡ配列のコード配列
に関連する位置に適切におかれる相対的配置と本明細書中では定義される。

【００６１】 前記調節配列は、核酸配列の発現のために宿主により認識される核酸配列であ
る適切なプロモーター配列であり得る。プロモーター配列は、ポリペプチドの発
現を仲介する転写調節配列を含む。プロモーターは、選択宿主細胞において転写
活性を示す任意の核酸配列、例えば変異体、切頭型及びハイブリッドプロモータ
ーであり得るし、宿主細胞に対して同種又は異種の細胞外又は細胞内ポリペプチ
ドをコードする遺伝子から得られる。

【００６２】 特に細菌宿主細胞における本発明の核酸構築物の転写を指示するのに適したプ
ロモーターの例は、Ｅ．コリのｌａｃオペロン、ストレプトミセス・コエリカラ
ー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）のアガラーゼ遺伝子（
ｄａｇＡ）、バチルス・ズブチリスのレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、バ
チルス・リヘニホルミスのα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バチルス・ステ
アロサーモフィラスのマルトース原性アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、バチルス
・アミロリケファシエンスのα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、バチルス・リ
ヘニホルミスのペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、バチルス・ズブチリスのｘ
ｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子及び原核生物β−ラクタマーゼ遺伝子（Ｖｉｌｌａ−
Ｋａｍａｒｏｆｆｅｔ ａｌ．，１９７８、「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ
ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ」
７５：３７２７−３７３１）から得られるプロモーター、並びにｔａｃプロモー
ター（ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３、「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏ
ｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ
ＳＡ」８０：２１−２５）である。さらなるプロモーターは、「Ｓｃｉｅｎｔｉ
ｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ」、１９８０、２４２：７４−９４中の“Ｕｓｅｆｕ
ｌｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ”
及びＳａｍｂｒｏｏｋｅｔ ａｌ．，１９８９（前記）に記載されている。

【００６３】 糸状真菌宿主細胞における本発明の核酸構築物の転写を指示するのに適したプ
ロモーターの例は、アスペルギルス・オリザエのＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコ
ール・ミエヘイのアスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガーの中
性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガーの酸安定性αアミラーゼ、アスペル
ギルス・ニガー又はアスペルギルス・アワモリのグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）
、リゾムコール・ミエヘイのリパーゼ、アスペルギルス・オリザエのアルカリ性
プロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエのトリオースホスフェートイソメラー
ゼ、アスペルギルス・ニズランスのアセトアミダーゼ及びフザリウム・オキシス
ポルムのトリプシン様プロテアーゼ（ＷＯ９６／００７８７）に関する遺伝子か
ら得られるプロモーター、ならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（アスペルギル
ス・ニガーの中性α−アミラーゼ及びアスペルギルス・オリザエのトリオースホ
スフェートイソメラーゼに関する遺伝子からのプロモーターのハイブリッド）、
そしてその変異体、切頭型及びハイブリッドプロモーターである。

【００６４】 酵母菌宿主では、有用なプロモーターは、サッカロミセス・セレビシエのエノ
ラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロミセス・セレビシエのガラクトキナーゼ（ＧＡ
Ｌ１）、サッカロミセス・セレビシエのアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセル
アルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、及びサ
ッカロミセス・セレビシエの３−ホスホグリセレートキナーゼに関する遺伝子か
ら得られる。酵母菌宿主細胞に対するその他の有用なプロモーターは、Ｒｏｍａ
ｎｏｓｅｔ ａｌ．，１９９２、「Ｙｅａｓｔ」８：４２３−４８８に記載され
ている。

【００６５】 調節配列は、転写を終結するよう宿主細胞に認識される配列である適切な転写
ターミネーター配列でもある。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードす
る核酸配列の３’末端に作用可能に連結される。選択される宿主細胞中で機能性
である任意のターミネーターは、本発明に用い得る。

【００６６】 糸状真菌宿主細胞に好ましいターミネーターは、アスペルギルス・オリザエの
ＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ、アスペルギ
ルス・ニズランスのアントラニル酸合成酵素、アスペルギルス・ニガーのαグル
コシダーゼ及びフザリウム・オキシスポルムのトリプシン様プロテアーゼに関す
る遺伝子から得られる。

【００６７】 酵母菌宿主細胞に好ましいターミネーターは、サッカロミセス・セレビシエの
エノラーゼ、サッカロミセス・セレビシエのチトクロームＣ（ＣＹＣ１）及びサ
ッカロミセス・セレビシエのグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲ
ナーゼに関する遺伝子から得られる。酵母菌宿主細胞に有用なその他のターミネ
ーターは、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２（前記）に記載されている
。

【００６８】 調節配列は、宿主細胞による翻訳に関して重要なｍＲＮＡの非翻訳領域である
適切なリーダー配列でもある。リーダー配列は、ペプチドをコードする核酸配列
の５’末端に作用可能に連結される。選択される宿主細胞中で機能性である任意
のリーダー配列は、本発明に用い得る。

【００６９】 糸状真菌宿主細胞に好ましいリーダーは、アスペルギルス・オリザエのＴＡＫ
Ａアミラーゼ及びアスペルギルス・ニズランスのトリオースホスフェートイソメ
ラーゼに関する遺伝子から得られる。

【００７０】 酵母菌宿主細胞にとって適当なリーダーは、サッカロミセス・セレビシエのエ
ノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロミセス・セレビシエの３−ホスフェートグリ
セレートキナーゼ、サッカロミセス・セレビシエのα因子及びサッカロミセス・
セレビシエのアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−ホスフェ
ートデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）に関する遺伝子から得られる。

【００７１】 調節配列は、核酸配列の３’末端に作用可能に連結される配列であって、転写
された場合に、ポリアデノシン残基を転写ｍＲＮＡに付加するためのシグナルと
して宿主細胞に認識されるポリアデニル化配列でもあり得る。選択された宿主細
胞中で機能性である任意のポリアデニル化配列は、本発明に用い得る。

【００７２】 糸状真菌宿主細胞に好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルス・オリザ
エのＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ、アスペ
ルギルス・ニズランスのアントラニル酸合成酵素、フザリウム・オキシスポルム
のトリプシン様プロテアーゼ及びアスペルギルス・ニガーのαグルコシダーゼに
関する遺伝子から得られる。

【００７３】 酵母菌宿主細胞に有用なポリアデニル化配列は、Ｇｕｏ及びＳｈｅｒｍａｎ、
１９９５、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」１５：
５９８３−５９９０に記載されている。

【００７４】 調節配列は、ポリペプチドのアミノ末端に結合されるアミノ酸配列をコードし
、細胞の分泌経路にコードされたペプチドを向けるシグナルペプチドのコード領
域でもある。核酸配列のコード配列の５’末端は、分泌ポリペプチドをコードす
るコード領域のセグメントと、翻訳リーディングフレームで天然に連結したシグ
ナルペプチドのコード領域を固有に含み得る。あるいは、コード配列の５’末端
は、コード配列に対して外来性であるシグナルペプチドのコード領域を含み得る
。外来性シグナルペプチドのコード領域は、コード配列がシグナルペプチドのコ
ード領域を天然に含まない場合に必要であり得る。あるいは、外来性シグナルペ
プチドのコード領域は、ポリペプチドの分泌を増強するために、天然シグナルペ
プチドのコード領域を単に置換し得る。しかしながら、発現ポリペプチドを選択
された宿主細胞の分泌経路に向ける任意のシグナルペプチドのコード領域は、本
発明に用い得る。

【００７５】 細菌宿主細胞に有効なシグナルペプチドのコード領域は、バチルス属のＮＣＩ
Ｂ１１８３７マルトース原性アミラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィルスの
αアミラーゼ、バチルス・リヘニホルミスのズブチリシン、バチルス・リヘニホ
ルミスのβラクタマーゼ、バチルス・ステアロサーモフィルスの中性プロテアー
ゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）及びバチルス・ズブチリスのｐｒｓＡに関
する遺伝子から得られるシグナルペプチドのコード領域である。さらなるシグナ
ルペプチドは、Ｓｉｍｏｎｅｎ及びＰａｌｖａ、１９９３、「Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ」５７：１０９−１３７に記載されている。

【００７６】 糸状真菌宿主細胞に有効なシグナルペプチドのコード領域は、アスペルギルス
・オリザエのＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーの中性アミラーゼ、
アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイのアスパ
ラギン酸プロテイナーゼ、フミコラ・インソレンスのセルラーゼ及びフミコラ・
ラヌギノサのリパーゼに関する遺伝子から得られるシグナルペプチドのコード領
域である。

【００７７】 酵母菌宿主細胞に有用なシグナルペプチドは、サッカロミセス・セレビシエの
α因子及びサッカロミセス・セレビシエのインベルターゼに関する遺伝子から得
られる。その他の有用なシグナルペプチドのコード領域は、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９２（前記）に記載されている。

【００７８】 調節配列は、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードする
プロペプチドのコード領域でもある。その結果生じるポリペプチドはプロ酵素又
はプロポリペプチド（又はいくつかの場合にはチモーゲン）として知られている
。プロポリペプチドは一般に不活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチ
ドの触媒的又は自己触媒的開裂により成熟活性ポリペプチドに変換され得る。プ
ロペプチドのコード領域は、バチルス・ズブチリスのアルカリ性プロテアーゼ（
ａｐｒＥ）、バチルス・ズブチリスの中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、サッカロ
ミセス・セレビシエのα因子、リゾムコール・ミエヘイのアスパラギン酸プロテ
イナーゼ及びミセリオフトラ・サーモフィラのラッカーゼ（ＷＯ９５／３３８３
６）に関する遺伝子から得られる。

【００７９】 シグナルペプチド及びプロペプチド領域がともにポリペプチドのアミノ末端に
存在する場合、プロペプチド領域はポリペプチドのアミノ末端の隣に位置し、シ
グナルペプチド領域はプロペプチド領域のアミノ末端の隣に位置する。

【００８０】 宿主細胞の増殖に関してポリペプチドの発現の制御（ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）
を可能にする制御配列を付加するのも望ましい。制御系の例は、制御化合物の存
在を含めた、化学的又は物理的刺激に対して切り換えられる遺伝子の発現を引き
起こすものである。原核生物系における制御系としては、ｌａｃ、ｔａｃ及びｔ
ｒｐオペレーター系が挙げられる。酵母菌では、ＡＤＨ２系又はＧＡＬ１系が用
いられる。糸状真菌では、ＴＡＫＡαアミラーゼプロモーター、アスペルギルス
・ニガーのグルコアミラーゼプロモーター及びアスペルギルス・オリザエのグル
コアミラーゼプロモーターが制御配列として用いられる。制御配列のその他の例
は、遺伝子増幅を可能にするものである。真核生物系では、これらの例としては
、メトトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、及
び重金属を用いて増幅されるメタロチオネイン遺伝子が挙げられる。これらの場
合、ポリペプチドをコードする核酸配列は、制御配列と作用可能に連結される。

【００８１】 発現ベクター 本発明は更に、本発明の核酸配列、プロモーター、ならびに転写及び翻訳停止
シグナルを含んで成る組換え発現ベクターに関する。前記の種々の核酸及び調節
配列は、一緒に連結されて、このような部位でのポリペプチドをコードする核酸
の挿入又は置換を可能にするために１又は複数の便利な制限部位を含みうる組換
え発現ベクターを生成し得る。あるいは、本発明の核酸配列は、発現のための適
切なベクター中に核酸配列又はその配列を含んで成る核酸構築物を挿入すること
により発現され得る。発現ベクターを作製する場合、コード配列が発現のための
適切な調節配列と作用可能に連結されるように、コード配列はベクター内に位置
する。

【００８２】 組換え発現ベクターは、都合良く組換えＤＮＡ法にかけられ得る、そして核酸
配列の発現をもたらし得る任意のベクター（例えばプラスミド又はウイルス）で
あり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞との
ベクターの適合性によっている。ベクターは、直鎖状又は閉環状プラスミドであ
り得る。

【００８３】 ベクターは、自律的複製ベクター、即ち染色体外存在物として存在するベクタ
ーであり、その複製は染色体複製とは無関係で、例えば、プラスミド、染色体外
要素、ミニ染色体又は人工染色体がその例である。ベクターは、自己複製を保証
するための任意の手段を含み得る。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入され
た場合、そのゲノムに組込みされて、それが組込みされた染色体と一緒に複製さ
れ得る。更に、宿主細胞のゲノム中に導入される全ＤＮＡ、又はトランスポゾン
を一緒に含む単一ベクター又はプラスミド、あるいは２又はそれ以上のベクター
又はプラスミドが用いられる。

【００８４】 本発明のベクターは、好ましくは、形質変換した細胞の選択を容易にする１又
は複数の選択マーカーを含む。選択マーカーは、その生成物が殺生物剤又はウイ
ルス耐性、重金属に対する耐性、栄養素要求株に対する原栄養性等を提供する生
成物の遺伝子である。細菌選択マーカーの例は、バチルス・ズブチリス又はバチ
ルス・リヘニホルミスからのｄａｌ遺伝子、あるいは抗生物質耐性、例えばアン
ピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリン耐性を付
与するマーカーである。酵母菌宿主細胞に適したマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ
３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰＩ及びＵＲＡ３である。糸状真菌宿
主細胞に用いるための選択マーカーとしては、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、
ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノ
スリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｙｇＢ（ヒグロマイシンホスホトラ
ンスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５
’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、
ｔｒｐＣ（アントラニル酸合成酵素）、ならびにその等価物が挙げられるが、こ
れらに限定されない。アスペルギルス細胞に用いるのに好ましいのは、アスペル
ギルス・ニズランス又はアスペルギルス・オリザエのａｍｄＳ及びｐｙｒＧ遺伝
子、ならびにストレプトミセス・ヒグロスコピクスのｂａｒ遺伝子である。

【００８５】 本発明のベクターは、好ましくは、宿主細胞ゲノムへのベクターの安定な組込
み、又はゲノムと無関係の細胞中でのベクターの自律性複製を可能にする要素を
含む。

【００８６】 宿主細胞ゲノムへの組込みのために、ベクターは、相同的又は非相同的組換え
により、ペプチドをコードする核酸配列、又はベクターのゲノムへの安定な組込
みのためのベクターのその他の任意の要素に依存し得る。あるいは、ベクターは
、宿主細胞のゲノムへの、相同的組換えによる組込みを指示するための付加的核
酸配列を含み得る。付加的核酸配列は、染色体中の正確な位置でベクターを宿主
細胞ゲノムの中へ組込ませ得る。正確な位置での組込みの見込みを増大するため
に、組込み性要素は、好ましくは、十分な数の核酸、例えば１００〜１，５００
塩基対、好ましくは４００〜１，５００塩基対、そして最も好ましくは８００〜
１，５００塩基対を含むべきであり、これは対応する標的配列と高度に相同性で
、相同的組換えの可能性を増強する。組込み要素は、宿主細胞のゲノム中の標的
配列と相同の任意の配列であり得る。更に、組込み要素は、非コード又はコード
核酸配列であり得る。他方、ベクターは、非相同的組換えにより、宿主細胞のゲ
ノムに組込まれ得る。

【００８７】 自律的複製のために、ベクターは、問題の宿主細胞中でベクターを自律的に複
製させ得る複製起点を更に包含し得る。細菌の複製起点の例は、Ｅ．コリ中での
複製を可能にするプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７及び
ｐＡＣＹＣ１８４、バチルス菌中での複製を可能にするｐＵＢ１１０、ｐＥ１９
４、ｐＴＡ１０６０及びｐＡＭβ１の複製起点である。酵母菌宿主細胞で用いる
ための複製起点の例は、２μの複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥ
Ｎ３の組合せ、ならびにＡＲＳ４とＣＥＮ６の組合せである。複製起点は、宿主
細胞中でその機能を温度感受性にする突然変異を有するものである（例えば、Ｅ
ｈｒｌｉｃｈ）１９７８、「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉ
ｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ」７５：１４３３を
参照のこと）。

【００８８】 本発明の核酸配列の１つより多いコピーを宿主細胞に挿入して、遺伝子生成物
の生成が増大され得る。核酸配列のコピー数の増大は、配列の少なくとも１つの
付加的コピーを宿主細胞ゲノムに組込むことにより、又は核酸配列を有する増幅
性選択マーカー遺伝子を含入することにより得られるが、この場合、選択マーカ
ー遺伝子の増幅コピーを含む細胞と、それによる核酸配列の付加的コピーが、適
切な選択可能な作用物質の存在下で細胞を培養することにより選択され得る。

【００８９】 本発明の組換え発現ベクターを構築するために前記の要素をライゲーションす
るために用いられる手法は、当業者には周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ｅｔ ａｌ．，１９８９（前記）を参照のこと）。

【００９０】 宿主細胞 本発明は更に、本発明の核酸配列を含んで成り、ポリペプチドの組換え体生成
に有益に用いられる組換え宿主細胞に関する。本発明の核酸配列を含んで成るベ
クターは、ベクターが、前記のように染色体組込み物として、又は自己複製染色
体外ベクターとして保持されるように、宿主細胞中に導入される。「宿主細胞」
という用語は、複製中に生じた変異のために親細胞と同一でない親細胞の任意の
子孫を含む。宿主細胞の選択は、ポリペプチドをコードする遺伝子及びその供給
源に大いに依存している。

【００９１】 宿主細胞は、単細胞微生物、例えば原核生物、又は非単細胞性微生物、例えば
真核生物であり得る。

【００９２】 有用な単細胞性細胞は、細菌細胞、例えばグラム陽性細菌で、その例としては
、バチルス属細胞、例えばバチルス・アルカロフィルス、バチルス・アミロリケ
ファシエンス、バチルス・ブレビス、バチルス・サーキュランス、バチルス・ク
ラウシ、バチルス・コアギュランス、バチルス・ラウツス、バチルス・レンツス
、バチルス・リヘニホルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・ステアロサ
ーモフィルス、バチルス・ズブチリス又はバチルス・スリンギエンシス；あるい
はストレプトミセス菌細胞、例えばストレプトミセス・リビダンス又はストレプ
トミセス・ムリヌス；あるいはグラム陰性細菌、例えばＥ．コリ及びシュードモ
ナス種が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい態様において、細菌宿
主細胞は、バチルス・レンツス、バチルス・リヘニホルミス、バチルス・ステア
ロサーモフィルス、又はバチルス・ズブチリス細胞である。別の好ましい態様に
おいて、バチルス菌細胞は、親アルカリ性バチルス菌である。

【００９３】 細菌宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、コンピテント細胞（例えば、Ｙ
ｏｕｎｇ ａｎｄ Ｓｐｉｚｉｚｉｎ、１９６１、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」８１：８２３−８２９又はＤｕｂｎａｕ ａｎｄ Ｄ
ａｖｉｄｏｆｆ−Ａｂｅｌｓｏｎ、１９７１、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」５６：２０９−２２１を参照のこと）を用いた
プロトプラスト形質変換（例えば、Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ、１９７９
、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」１６８：１１１
−１１５を参照のこと）、エレクトロポレーション（例えば、Ｓｈｉｇｅｋａｗ
ａ ａｎｄ Ｄｏｗｅｒ、１９８８、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」６：７４
２−７５１を参照のこと）又は接合（例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｔｈｏ
ｒｎｅ、１９８７、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」１６
９：５７７１−５２７８を参照のこと）により実行され得る。

【００９４】 宿主細胞は、真核生物、例えば哺乳類、昆虫、植物又は真菌細胞であり得る。

【００９５】 好ましい態様において、宿主細胞は真菌細胞である。「真菌」とは、本明細書
中で用いる場合には、子嚢菌門、担子菌門、ツボカビ門及び接合菌門（Ｈａｗｋ
ｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，「Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ ａｎｄ Ｂｉｓｂｙ’ｓ
Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｔｈｅ Ｆｕｎｇｉ」８版１９９５，ＣＡＢ
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒ
ｉｄｇｅ，ＵＫによる定義）、ならびに卵菌門（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ ｅｔ
ａｌ．，１９９５（前記）ｐ１７１に引用）、そしてすべての糸状胞子真菌（Ｈ
ａｗｋｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９５（前記））を含む。

【００９６】 更に好ましい態様において、真菌宿主細胞は酵母菌細胞である。「酵母菌」と
は、本明細書中で用いる場合には、子嚢胞子形成酵母菌（エンドミケス目）、担
子菌形成酵母菌、及び不完全真菌（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）に属する酵母
菌が含まれる。酵母菌の分類は将来、変わり得るため、本発明の目的のためには
、酵母菌は、Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｙｅａｓ
ｔ（Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｆ．Ａ．，Ｐａｓｓｍｏｒｅ，Ｓ．Ｍ．及びＤａｖｅｎｐ
ｏｒｔ，Ｒ．Ｒ．編「Ｓｏｃ．Ａｐｐ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕ
ｍ Ｓｅｒｉｅｓ」Ｎｏ．９，１９８０）に記載されたように定義する。

【００９７】 より更に好ましい態様において、酵母菌宿主細胞はカンジダ属、ハンセヌラ属
、クルイベロミセス属、ピキア属、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属又
はヤローウィア属の細胞である。

【００９８】 最も好ましい態様において、酵母菌宿主細胞はサッカロミセス・カールスベル
ゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サ
ッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・ジアスタチクス（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロミセス・ドウグラシ（Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロミセス・クルイベリ
、サッカロミセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｎｏｒｂｅｎ
ｓｉｓ）又はサッカロミセス・オビホルミス細胞である。別の最も好ましい態様
において、酵母菌宿主細胞は、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏ
ｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）細胞である。別の最も好ましい態様において、酵母
菌宿主細胞はヤローウイア・リポリチカ細胞である。

【００９９】 別の更に好ましい態様において、真菌宿主細胞は糸状真菌細胞である。「糸状
真菌」は、真菌門及び卵菌門のすべての糸状形態を含む（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ
ｅｔ ａｌ．，１９９５（前記）により定義）。糸状真菌は、キチン、セルロ
ース、グルカン、キトサン、マンナン及びその他の複合多糖で構成される菌糸体
壁を特徴とする。植物性成長は菌糸伸張により、そして炭素異化作用は無条件に
好気性である。これに対比して、酵母菌、例えばサッカロミセス・セレビシエに
よる植物性成長は、単細胞性葉状体の出芽によるもので、炭素異化は発酵であり
得る。

【０１００】 より更に好ましい態様において、糸状真菌宿主細胞は、例えばアクレモニウム
属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属、フザリウム属、フミコラ属、
ムコール属、ミセリオフトラ属、ニューロスポラ属、ペニシリウム属、チエラビ
ア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属又はトリコデルマ属の細胞で
あるが、これらに限定されない。

【０１０１】 最も好ましい態様において、糸状真菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ
、アスペルギルス・フェチズス、アスペルギルス・ジャポニクス、アスペルギル
ス・ニズランス、アスペルギルス・ニガー又はアスペルギルス・オリザエ細胞で
ある。別の最も好ましい態様において、糸状真菌宿主細胞は、フザリウム・バク
トリジオイデス、フザリウム・セレアリス、フザリウム・クルックウェレンセ、
フザリウム・クルモルム、フザリウム・グラミネアルム、フザリウム・グラミヌ
ム、フザリウム・ヘテロスポルム、フザリウム・ネグンジ、フザリウム・オキシ
スポルム、フザリウム・レティキラツム、フザリウム・ロゼウム、フザリウム・
ザムブチヌム、フザリウム・ザルコロウム、フザリウム・スポロトリキオイデス
、フザリウム・スルフレウム、フザリウム・トルロスム、フザリウム・トリコセ
キオイデス又はフザリウム・ベネナツム細胞である。より最も好ましい態様にお
いて、糸状菌親細胞はフザリウム・ベネナツム（Ｎｉｅｒｅｎｂｅｒｇの新種）
の細胞である。別の最も好ましい態様において、糸状真菌親細胞は、フミコラ・
インソレンス、フミコラ・ラヌギノサ、ムコール・ミエヘイ、ミセリオフトラ・
サーモフィラ、ニューロスポラ・クラッサ、ペニシリウム・パープロゲヌム、シ
ーラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トリ
コデルマ・ハージアヌム、トリコデルマ・コニンギー、トリコデルマ・ロンギブ
ラキアツム、トリコデルマ・リーセイ又はトリコデルマ・ビリデ細胞である。

【０１０２】 真菌細胞は、それ自体既知の方法での、プロトプラスト形成、プロトプラスト
の形質変換、及び細胞壁の再生を含んで成る方法により形質変換され得る。アス
ペルギルス宿主細胞の形質変換に適した手法は、欧州特許第２３８０２３号、及
びＹｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４、 「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ
ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ ＳｃｉｅｎｃｅＵＳＡ」
８１：１４７０−１４７４に記載されている。フザリウム種の形質変換に適し
た方法は、Ｍａｌａｒｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９、「Ｇｅｎｅ」７８：
１４７−１５６及びＷＯ９６／００７８７に記載されている。酵母菌は、Ｂｅｃ
ｋｅｒ ａｎｄ Ｇｕａｒｅｎｔｅ，Ｉｎ Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．ａｎｄ
Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．編「Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ」Ｖｏｌｕｍｅ １９４，ｐｐ １８２−１８７，Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｉｔｏｅｔ ａｌ．，１９８
３、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」１５３：１６３；及
びＨｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９７８、「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ
ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ
」７５：１９２０に記載された方法を用いて形質変換し得る。

【０１０３】 生成の方法 本発明はまた、本発明のポリペプチドを生成する方法であって、（ａ）菌株を
、前記ポリペプチドを生成することができるその野生型で培養し；そして（ｂ）
そのポリペプチドを回収することを含んで成る方法に関する。好ましくは、前記
菌株はロドサームス属のものであり、そして更に好ましくはロドサームス・オバ
メンシスである。

【０１０４】 本発明はまた、本発明のポリペプチドを生成する方法であって、（ａ）前記ポ
リペプチドの生成を助成する条件下で宿主細胞を培養し、（ｂ）前記ポリペプチ
ドを回収することを含んで成る方法に関する。

【０１０５】 本発明はまた、本発明のポリペプチドを生成する方法であって、（ａ）宿主細
胞をポリペプチドの生成を助成する条件下で培養し、ここで、宿主細胞は配列番
号１のポリペプチドのコード領域において少なくとも１つの変異を有する変異体
核酸配列を含んで成り、ここで、変異体核酸配列は配列番号２のアミノ酸から成
るポリペプチドをコードする、及び（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含
んで成る方法に関する。

【０１０６】 本発明の生成方法において、細胞は、当業界で既知の方法を用いて、そのポリ
ペプチドの生成に適切な栄養培地中で培養される。例えば、細胞は、ポリペプチ
ドを発現及び／又は単離させるのに適切な培地及び条件下で実施される、振とう
フラスコ培養、実験室又は工業的発酵器における小規模又は大規模発酵（連続、
バッチ、フュド バッチ又は固体状態発酵を含む）により培養し得る。培養は当
業界で既知の手順を用いて、炭素源及び窒素源、並びに無機塩を含む適切な栄養
培地で行なわれる。適切な培地は、商業的な供給者から入手するか、公表された
組成（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎカタログ中に）にしたがって調製し得る。ポリペプチドが栄養培地中に分
泌されるなら、ペプチドを培地から直接回収することができる。ポリペプチドが
分泌されないなら、細胞溶解物から回収することができる。

【０１０７】 ポリペプチドは、そのポリペプチドに特異的である、当業界で既知の方法を用
いて検出し得る。これらの検出方法は、特異的抗体の使用、酵素生成物の形成又
は酵素基質の消失を含み得る。例えば、本明細書に記載したポリペプチドの活性
を測定するのに酵素アッセイを用い得る。

【０１０８】 生じたポリペプチドは当業界で既知の方法で回収し得る。例えば、ポリペプチ
ドは、栄養培地から、遠心、ろ過、抽出、スプレー乾燥、蒸発又は沈澱を含むが
、これらに限定されない慣用の手順により回収し得る。

【０１０９】 本発明のポリペプチドは、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィ
ニティ、疎水性、等電点電気泳動及びサイズ排除）、電気泳動手順（例えば、予
備等電点電気泳動）、差溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈澱）、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ又は抽出（例えば、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」Ｊ．
−Ｃ．Ｊａｎｓｅｎ ａｎｄ Ｌａｒｓ Ｒｙｄｅｎ編、ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓ
ｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９を参照のこと）を含むが、これらに限定
されない、当業界で既知の種々の手順により精製し得る。

【０１１０】 植物 本発明はまた、回収可能な量でポリペプチドを発現し、かつ、生成するように
、本発明の分枝酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列で形質変換
された、遺伝子組換え植物、植物の部分又は植物細胞にも関する。ポリペプチド
は植物又は植物の部分から回収し得る。代りに、組み換えポリペプチドを含む植
物又は植物部分はそれ自体食品又は飼料の品質を改良するため、例えば、栄養価
値、味のよさ及びレオロジー特性を改良するため又は栄養とならない因子を破壊
するために用い得る。

【０１１１】 遺伝子組換え植物は双子葉植物又は単子葉植物であり得る。単子葉植物はイネ
科植物、例えば、牧草（イチゴツナギ、イネ科イチゴツナギ属）、飼料イネ科植
物、例えば、フェスチュカ（ｆｅｓｔｕｃａ）、ロリウム（ｌｏｌｉｕｍ）、温
和なイネ科植物、例えば、アグロスチス（Ａｇｒｏｓｔｉｓ）並びに穀物、例え
ば、ムギ、オートムギ、ライムギ、オオムギ、コメ、モロコシ及びメイズ（トウ
モロコシ）である。

【０１１２】 双子葉植物の例は、タバコ、まめ科植物、例えば、ルピナス、ジャガイモ、砂
糖大根、えんどう、マメ、ダイズ及びアブラナ科の植物（アブラナ科）、例えば
、カリフラワー、ナタネ及び密接に関連するモデル生物アラビドプシス・サリア
ナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）である。

【０１１３】 植物の部分の例は茎、カルス、葉、根、果実、種子及び塊茎である。また、特
種な植物組織、例えば、葉緑体、アポプラスト（ａｐｏｐｌａｓｔ）、ミトコン
ドリア、液胞、ペルオキシソーム及び細胞質は植物の部分と考えられる。更に組
織の起原が何であれ、あらゆる植物細胞は植物の部分と考えられる。

【０１１４】 また、上記植物の子孫、植物部分及び植物細胞は本発明の範囲内に包含される
。

【０１１５】 本発明のポリペプチドを発現する遺伝子組換え植物又は植物細胞は当業界で既
知の方法にしたがって構築される。簡単に言うと、本発明のポリペプチドをコー
ドする１又は複数の発現構築物を植物宿主ゲノムに組み込み、得られた変性植物
又は植物細胞を遺伝子組換え植物又は植物細胞に伝播することにより、植物又は
植物細胞を構築する。

【０１１６】 便利には、発現構築物は、選択された植物又は植物の部分中で核酸配列の発現
に必要な適当な制御配列に作用可能に連結した、本発明のポリペプチドをコード
する核酸配列を含む核酸構築物である。更に、発現構築物は、発現構築物が組み
込まれた宿主細胞及び問題の植物への構築物の導入に必要なＤＮＡ配列（後者は
用いられるＤＮＡ導入方法に依存する）を同定するのに有用な選択マーカーを含
むことができる。

【０１１７】 制御配列、例えば、プロモーター配列及びターミネーター配列並びに任意にシ
グナル配列又はトランジット配列の選択は、例えば、ポリペプチドをいつ、どこ
で、どのように発現させることを望むかに基づいて決定される。例えば、本発明
のポリペプチドをコードする遺伝子の発現は構成的もしくは誘導的でもよく、又
は発達上、段階もしくは組織特異的でよく、そして、遺伝子産物は特定の組織又
は植物の部分、例えば、種子又は葉を標的とすることができる。制御配列は、例
えば、Ｔａｇｕｅ ｅｔ ａｌ．，１９８８，「Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏ
ｇｙ」８６： ５０６に記載されている。

【０１１８】 構成的発現のために、３５Ｓ−ＣａＭＶプロモーターを用い得る（Ｆｒａｎｃ
ｋ ｅｔａｌ．，「Ｃｅｌｌ」２１：２８５−２９４、１９８０年）。器官特異
的プロモーターは、例えば、貯蔵シンク組織、例えば、種子、ジャガイモ塊茎及
び果実（Ｅｄｗａｒｄｓ及びＣｏｒｕｚｚｉ，１９９０，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅ
ｎｅｔ．２４：２７５−３０３）又は代謝シンク組織、例えば、分裂組織（Ｉｔ
ｏｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４： ８６３−
８７８）からのプロモーター、種子特異的プロモーター、例えば、コメからのグ
ルテリン、プロラミン、グロブリン又はアルブミンプロモーター（Ｗｕ ｅｔ
ａｌ．，１９９８，Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ３
９：８８５−８８９）、レグミンＢ４からのＶｉｃｉａ ｆａｂａプロモーター
及びＶｒｃｉａ ｆａｂａからの未知の種子タンパク質遺伝子（Ｃｏｎｒａｄｅ
ｔ ａｌ．，「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＰｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ」１５
２：７０８−７１１、１９９８年）、種子油体タンパク質からのプロモーター（
Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，「Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏ
ｇｙ」３９：９３５−９４１、１９９８年）、ブラッシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓ
ｉｃａ ｎａｐｕｓ）からの貯蔵タンパク質ｎａｐＡプロモーター又は当業界で
既知のあらゆる他の種子特異的プロモーター、例えば、ＷＯ９１／１４７７２号
記載のものであり得る。更に、プロモーターは葉特異的プロモーター、例えば、
コメ又はトマトからのｒｂｃｓプロモーター（Ｋｙｏｚｕｋａ ｅｔ ａｌ．，
「Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ」１０２：９９１−１０００、１９９３年
）、クロレラウィルス アデニンメチルトランスフェラーゼ遺伝子プロモーター
（Ｍｉｔｒａ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，１９９４，「Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」２６：８５−９３）又はコメからのａｌｄＰ遺伝子
プロモーター（Ｋａｇａｙａ ｅｔ ａｌ．，１９９５，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」２４８：６６８−６７４）又は
傷誘導性プロモーター、例えば、ジャガイモｐｉｎ２プロモーター（Ｘｕ ｅｔ
ａｌ．，１９９３，「Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」２
２：５７３−５８８）であり得る。

【０１１９】 プロモーターエンハンサー因子も植物中の酵素の高い発現を達成するのに用い
得る。例えば、プロモーターエンハンサー因子は、プロモーターと本発明のポリ
ペプチドをコードするヌクレオチド配列との間に位置するイントロンであっても
よい。例えば、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，１９９３（上記）は、コメアクチン１遺伝
子の第１イントロンを、発現を増強するのに用いることを開示している。

【０１２０】 選択マーカー遺伝子及び発現構築物のあらゆる他の部分は当業界で利用し得る
ものから選択し得る。

【０１２１】 核酸構築物は、アグロバクテリウムを介する形質変換、ウィルスを介する形質
変換、マイクロインジェクション、粒子衝撃（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、微粒
子銃形質変換及びエレクトロポレーションを含んで成る、当業界で既知の慣用の
技術にしたがって、植物ゲノムに組み込まれる（Ｇａｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，
１９９０，「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２４４： １２９３、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，１９９
０， 「Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」８： ５３５、Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ
ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ」３３８：２７４）。

【０１２２】 現在、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを介する遺伝子導入は遺伝子組
換え双子葉植物を発生させるための一般に好まれる方法である（概説のために、
Ｈｏｏｙｋａｓ ａｎｄ Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ，１９９２，「Ｐｌａｎｔ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」１９：１５−３８を参照のこと）。そ
れは単子葉植物を形質変換するのにも使用され得るが、これらの植物を形質変換
するために、他の形質転換法が一般に好ましい。現在、遺伝子組換え単子葉植物
を生じさせるために一般的に好まれる方法は胚芽のカルス又は発育中の胚芽の粒
子衝撃（形質変換するＤＮＡで被覆された超小型の金又はタングステン粒子）で
ある（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，１９９２，「Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ」２： ２
７５−２８１、Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ，１９９４，「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉ
ｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」５： １５８−１６２、Ｖａｓｉｌ ｅｔ
ａｌ．，１９９２，「Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」１０：６６７−６７４
）。単子葉植物のための他の方法は、Ｏｍｉｒｕｌｌｅｈ ｅｔ ａｌ．，１９
９３，「Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」２１：４１５−４
２８に記載された、プロトプラスト形質変換に基づく。

【０１２３】 形質変換後、発現構築物を組み込んだ形質変換体は、当業界で公知の方法にし
たがって、選択され、そして植物全体へと再生される。

【０１２４】 本発明はまた、（ａ）ポリペプチドの生成を助成する条件下で、本発明の分枝
酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成る遺伝子組換え
植物又は植物細胞を培養し；そして（ｂ）そのポリペプチドを回収することを含
んで成る、本発明のポリペプチドを生成する方法にも関する。

【０１２５】 組成物 なお、さらなる観点においては、本発明は本発明のポリペプチドを含んで成る
組成物に関する。好ましくは、前記組成物は本発明のポリペプチドが濃縮されて
いる。本文脈においては、用語「濃縮された」は組成物の分枝酵素活性が、例え
ば、１．１の濃縮率で増加したことを示す。

【０１２６】 前記組成物は主要酵素成分、例えば、単成分組成物として本発明のポリペプチ
ドを含んでよい。あるいは、前記組成物は、複数の酵素活性、例えば、アミノペ
プチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラ
ーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルト
ランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシ
ダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−
グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパー
ゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナー
ゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質
分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ又はキシラナーゼを含ん
で成ることもある。

【０１２７】 前記ポリペプチド組成物は、当業界で既知の方法にしたがって製造することが
でき、液体又は乾燥組成物の形でよい。例えば、ポリペプチド組成物は顆粒状物
又は微顆粒状物の形でよい。組成物に包含されるポリペプチドは当業界で既知の
方法にしたがって安定化し得る。

【０１２８】 本発明のポリペプチド組成物の好ましい使用の例を下記に示す。本発明のポリ
ペプチド組成物の投与量及び組成物を用いる他の条件は当業界で既知の方法に基
づいて決定し得る。

【０１２９】 洗剤組成物 本発明の分枝酵素は洗剤組成物に加えられてもよく、そしてその結果、その成
分となり得る。

【０１３０】 本発明の洗剤組成物は、汚れた織物の前処理に適した洗濯用添加剤組成物及び
リンスを加えた織物柔軟剤組成物を含む、手洗い又は洗濯機洗剤組成物として調
製され、あるいは通常の塗装面の洗浄作業における使用のための洗剤組成物とし
て調製され、あるいは手洗い又は機械の食器洗い作業のために調製され得る。

【０１３１】 具体的な観点において、本発明は、本発明の分枝酵素を含んで成る洗剤添加物
を提供する。前記洗剤添加物及び洗剤組成物は、１又は複数の他の酵素、例えば
プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラ
ーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナ
ーゼ、オキシダーゼ、例えばラッカーゼ、及び／又はペルオキシダーゼを含んで
成ることもある。

【０１３２】 通常、選択した酵素の特性は選択した洗剤との適合性があるべきであり（すな
わち、他の酵素的かつ非酵素的成分との適合性がある至適ｐＨなど）、そして前
記酵素は有効量で存在すべきである。

【０１３３】プロテアーゼ ： 適当なプロテアーゼは、動物、植物又は微生物起源のものを含む。微生物起源
が好ましい。化学的に修飾され、又はタンパク質工学的に処理した変異体が含ま
れる。前記プロテアーゼはセリンプロテアーゼ又はメタロプロテアーゼ、好まし
くはアルカリ性の微生物プロテアーゼ又はトリプシン様プロテアーゼであっても
よい。アルカリ性プロテアーゼの例にはズブチリシンであり、これは特にバチル
ス属に由来するものであり、例えばズブチリシンＮｏｖｏ、ズブチリシンＣａｒ
ｌｓｂｅｒｇ、ズブチリシン３０９、ズブチリシン１４７及びズブチリシン１６
８（ＷＯ８９／０６２７９に記載）である。トリプシン様プロテアーゼの例は、
ＷＯ８９／０６２７０及びＷＯ９４／２５５８３に記載のトリプシン（例えばブ
タ及びウシ起源のもの）及びフザリウム属のプロテアーゼである。

【０１３４】 有用なプロテアーゼの例は、ＷＯ９２／１９７２９，ＷＯ９８／２０１１５，
ＷＯ９８／２０１１６、及びＷＯ９８／３４９４６に記載の変異体であり、特に
１又は複数の以下の位置：２７，３６，５７，７６，８７，９７，１０１，１０
４，１２０，１２３，１６７，１７０，１９４，２０６，２１８，２２２，２２
４，２３５及び２７４において置換を有する変異体である。

【０１３５】 好ましい市販のプロテアーゼ酵素は、Ａｌｃａｌａｓｅ（商標）、Ｓａｖｉｎ
ａｓｅ（商標）、Ｐｒｉｍａｓｅ（商標）、Ｄｕｒａｌａｓｅ（商標）、Ｅｓｐ
ｅｒａｓｅ（商標）、及びＫａｎｎａｓｅ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ
Ａ／Ｓ）、Ｍａｘａｔａｓｅ（商標）、Ｍａｘａｃａｌ（商標）、Ｍａｘａｐ
ｅｍ（商標）、Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ（商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（商標）、Ｐｕ
ｒａｆｅｃｔ ＯｘＰ（商標）、ＦＮ２（商標）、及びＦＮ３（商標）（Ｇｅｎ
ｅｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）を含む。

【０１３６】リパーゼ ： 適当なリパーゼは細菌又は菌起源のものを含む。化学的に修飾され、又はタン
パク質工学的に処理された変異体が含まれる。有用なリパーゼの例は、フミコラ
（異名サーモミセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ））属由来、例えばＥＰ ２５８
０６８及びＥＰ ３０５ ２１６に記載のＨ．ラヌギノサ（Ｔ．ラヌギノサス
（ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ））由来又はＷＯ９６／１３５８０に記載のＨ．イン
ソレンス由来のリパーゼ、シュードモナス属のリパーゼ、例えばＰ．アルカリジ
ェネス（ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）若しくはＰ．シュードアルカリジェネス（ｐ
ｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）（ＥＰ ２１８ ２７２）、Ｐ．セパシア
（ｃｅｐａｃｉａ）（ＥＰ ３３１ ３７６）、Ｐ．スタットゼリ（ｓｔｕｔｚ
ｅｒｉ）（ＧＢ １，３７２，０３４）、Ｐ．フルオレセンス（ｆｌｕｏｒｅｓ
ｃｅｎｓ）、シュードモナスＳＰ．菌株ＳＤ７Ｏ５（ＷＯ９５／０６７２０及び
ＷＯ９６／２７００２）、Ｐ．ウィスコンシネンシス（ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎ
ｓｉｓ）（ＷＯ９６／１２０１２）由来のもの；バチルスのリパーゼ、例えばＢ
．ズブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Ｄａｒｔｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１１３１：２５３−３
６０，１９９３）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（ＪＰ６４／７４４９９２）若
しくはＢ．プミルス（ｐｕｍｉｌｕｓ）（ＷＯ９１／１６４２２）由来のものを
含む。

【０１３７】 他の例は、リパーゼ変異体、例えばＷＯ９２／０５２４９，ＷＯ９４／０１５
４１，ＥＰ ４０７ ２２５，ＥＰ ２６０ １０５，ＷＯ９５／３５３８１，
ＷＯ９６／００２９２，ＷＯ９５／３０７４４，ＷＯ９４／２５５７８，ＷＯ９
５／１４７８３，ＷＯ９５／２２６１５，ＷＯ９７／０４０７９及びＷＯ９７／
０７２０２に記載のものを含む。

【０１３８】 好ましい市販のリパーゼ酵素はＬｉｐｏｌａｓｅ（商標）及びＬｉｐｏｌａｓ
ｅ Ｕｌｔｒａ（商標）及びＬｉｐｏｍａｘ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓ
ｋ Ａ／Ｓ）を含む。

【０１３９】アミラーゼ ： 適当なアミラーゼ（α及び／又はβ）は、細菌又は菌起源のものを含む。化学
的に修飾され、又はタンパク質工学的に処理された変異体が含まれる。アミラー
ゼは、例えばバチルス属から得たα−アミラーゼ、例えばＢ．リケミホルミスの
特別な菌株のアミラーゼを含み、これはＧＢ １，２９６，８３９で更に詳細に
説明されている。

【０１４０】 有用なアミラーゼの例は、ＷＯ９４／０２５９７，ＷＯ９４／１８３１４，Ｗ
Ｏ９６／２３８７３、及びＷＯ９７／４３４２４に記載の変異体であり、特に１
又は複数の以下の位置：１５，２３，１０５，１０６，１２４，１２８，１３３
，１５４，１５６，１８１，１８８，１９０，１９７，２０２，２０８，２０９
，２４３，２６４，３０４，３０５，３９１，４０８、及び４４４において置換
を有する変異体である。

【０１４１】 市販のアミラーゼには、Ｄｕｒａｍｙｌ（商標）、Ｔｅｒｍａｍｙｌ（商標）
、Ｆｕｎｇａｍｙｌ（商標）及びＢＡＮ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ
Ａ／Ｓ）、Ｒａｐｉｄａｓｅ（商標）及びＰｕｒａｓｔａｒ（商標）（Ｇｅｎｅ
ｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）がある。

【０１４２】セルラーゼ ： 適当なセルラーゼは、細菌又は菌起源のものを含む。化学的に修飾され、又は
タンパク質工学的に処理された変異体が含まれる。適当なセルラーゼは、バチル
ス、シュードモナス、フミコラ、フザリウム、チエラビア、アクレモニウム属由
来のセルラーゼ、例えばＵＳ ４，４３５，３０７，ＵＳ ５，６４８，２６３
，ＵＳ ５，６９１，１７８，ＵＳ ５，７７６，７５７及びＷＯ８９／０９２
５９に開示されている、フミコラ・インソレンス、マイセリオフトラ・サーモフ
ィラ及びフサリウム・オキシスポルムから生成される菌のセルラーゼを含む。

【０１４３】 特に適当なセルラーゼは、色の保護の利点を有するアルカリ性又は中性セルラ
ーゼである。その様なセルラーゼの例は、ＥＰ ０ ４９５ ２５７，ＥＰ ０
５３１ ３７２，ＷＯ９６／１１２６２，ＷＯ９６／２９３９７，ＷＯ９８／
０８９４０に記載のセルラーゼである。他の例はセルラーゼ変異体、例えばＷＯ
９４／０７９９８，ＥＰ ０ ５３１ ３１５，ＵＳ ５，４５７，０４６，Ｕ
Ｓ ５，６８６，５９３，ＵＳ ５，７６３，２５４，ＷＯ９５／２４４７１，
ＷＯ９８／１２３０７及びＰＣＴ／ＤＫ９８／００２９９に記載されているもの
である。

【０１４４】 市販のセルラーゼは、Ｃｅｌｌｕｚｙｍｅ（商標）、及びＣａｒｅｚｙｍｅ（
商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ）、Ｃｌａｚｉｎａｓｅ（商標）、
及びＰｕｒａｄａｘ ＨＡ（商標）（Ｇｅｎｅｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ
ａｌＩｎｃ．）、並びにＫＡＣ−５００（Ｂ）（商標）（Ｋａｏ Ｃｏｒｐｏｒ
ａｔｉｏｎ）を含む。

【０１４５】ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ ： 適当なペルオキシダーゼ／オキシダーゼは、植物、細菌又は菌起源のものを含
む。化学的に修飾され、又はタンパク質工学的に処理された変異体が含まれる。
有用なペルオキシダーゼの例は、コプリヌス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）属由来、例え
ばＣ．シネレウス（Ｃｉｎｅｒｅｕｓ）由来のペルオキシダーゼ、並びにＷＯ９
３／２４６１８，ＷＯ９５／１０６０２、及びＷＯ９８／１５２５７に記載のそ
れらの変異体を含む。

【０１４６】 市販のペルオキシダーゼは、Ｇｕａｒｄｚｙｍｅ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒ
ｄｉｓｋ Ａ／Ｓ）を含む。

【０１４７】 洗剤酵素は、１又は複数の酵素を含む別々の添加物を加えることによって、あ
るいはこれらの酵素の全てを含んで成る複合型の添加物を加えることによって洗
剤組成物に含めることもできる。本発明の洗剤添加物、すなわち別々の添加物又
は複合型の添加物は、例えば顆粒、液体、スラリー等として調製され得る。好ま
しい洗剤添加物の形態は顆粒、特に無粉塵顆粒、液体、特に安定化液体、又はス
ラリーである。

【０１４８】 無粉塵顆粒は、例えばＵＳ ４，１０６，９９１及び４，６６１，４５２に開
示されている様に製造することができ、そして任意に当業者に既知の方法によっ
てコーティングされることもある。ロウ性コーティング材料の例は、１０００〜
２００００の平均分子量を有するポリエチレンオキシド生成物（ポリエチレング
リコール、ＰＥＧ）；１６〜５０のエチレンオキシド単位を有する、エトキシル
化したノニルフェノール；アルコールが１２〜２０の炭素原子を含み、そして１
５〜８０のエチレンオキシド単位が存在する、エトキシル化した脂肪アルコール
；脂肪アルコール：脂肪酸；並びに脂肪酸のモノ−及びジ−及びトリグリセリド
である。流動床技術による適当な模形成コーティング材料の例は、英国特許第１
４８３５９１号において与えられている。液体酵素調製物は、例えば確立された
方法に従い、多価アルコール、例えばプロピレングリコール、糖又は糖アルコー
ル、乳酸又はホウ酸を加えることによって安定することができる。他の酵素安定
化剤は当業界で公知である。保護された酵素を、欧州特許第２３８，２１６号に
開示された方法に従い調製することができる。

【０１４９】 本発明の洗剤組成物は都合の良い形態、例えば粉末、顆粒、ペースト又は液体
として存在することができる。液体洗剤は最大７０％の水及び０〜３０％の有機
溶媒を典型的に含む、水性であるか、又は非水性のものであってもよい。

【０１５０】 前記洗剤組成物は、半極性及び／又は陰イオン性及び／又は陽イオン性及び／
又は両性であってもよい、１又は複数の界面活性剤を含んで成る。

【０１５１】 前記組成物に含まれる場合、前記洗剤は通常、約１％〜約４０％の直鎖状アル
キルベンゼンスルホン酸塩、アルファオレフィンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩
（脂肪酸アルコール硫酸塩）、アルコールエトキシ硫酸塩、第２級アルカンスル
ホン酸塩、アルファスルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル又はアルケニルコハ
ク酸、又はセッケンを含むであろう。

【０１５２】 前記組成物に含まれる場合、前記洗剤は通常、約０．２％〜約４０％の非イオ
ン性界面活性剤、例えばアルコールエトキシラート、ノニルフェノールエトキシ
ラート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシ
ル化した脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒド
ロキシアルキル脂肪酸アミド又はグルコサミンのＮ−アシルＮ−アルキル誘導体
（ｇｌｕｃａｍｉｄｅ）を含むだろう。

【０１５３】 前記洗剤は、０〜６５％の洗浄性ビルダー又は錯化剤、例えばゼオライト、二
リン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、ニトリロ三酢酸、
エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸、アルキル
又はアルケニルコハク酸、可溶性ケイ酸塩又は層状ケイ酸塩（例えばＨｏｅｃｈ
ｓｔ社のＳＫＳ−６）を含むことがある。

【０１５４】 前記洗剤は１又は複数のポリマーを含んで成ることがある。例は、カルボキシ
メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリビニ
ルアルコール、ポリビニルピリジン−Ｎ−オキシド、ポリビニルイミダゾール、
ポリカルボキシラート、例えばポリアクリラート、マレイン酸／アクリル酸コポ
リマー、及びラウリルメタクリル酸／アクリル酸コポリマーである。

【０１５５】 前記洗剤は漂白系を含むことがあり、これはＨ_２Ｏ_２源、例えば過ホウ酸又は
過炭酸を含んで成ることもでき、これは過酸を形成する漂白活性剤、例えばテト
ラアセチルエチレンジアミン又はノナノイルオキシベンゼンスルホン酸塩と組み
合わされることもある。あるいは、前記漂白系は、例えばアミド、イミド、又は
スルホン型の過酸化物を含んで成ることもある。

【０１５６】 本発明の洗剤組成物の酵素は、常用の安定化剤を用いて安定化することができ
、例えばプロピレングリコール若しくはグリセロールなどの多価アルコール、糖
又は糖アルコール、乳酸、ホウ酸、又は例えば芳香族ホウ酸エステルなどのホウ
酸誘導体、例えば４−ホルミルフェニルボロン酸であり、そして前記組成物を例
えばＷＯ９２／１９７０９及びＷＯ９２／１９７０８に記載されている様に調製
することができる。

【０１５７】 前記洗剤はまた、他の常用の洗剤成分、例えば粘土を含む繊維調節剤、泡増幅
剤、石けん水抑制剤、防食剤、汚れの懸濁剤、抗−汚れ再沈着剤、染料、殺菌剤
、光増白剤、屈水性誘発物質、変色阻害剤、又は香料などを含むことができる。

【０１５８】 現時点で、洗剤組成物において、いずれかの酵素、特に本発明の分枝酵素は、
洗浄液１Ｌ当たり０．０１〜１００ｍｇの酵素タンパク質、好ましくは洗浄液１
Ｌ当たり０．０５〜５ｍｇの酵素タンパク質、特に洗浄液１Ｌ当たり０．１〜１
ｍｇの酵素タンパク質に相当する量で加えられ得ると考えられている。

【０１５９】 本発明の分枝酵素は、引用によって本明細書に組み入れられる、ＷＯ９７／０
７２０２に開示されている洗剤調製物に追加として組み入れられ得る。

【０１６０】 使用 本発明はまた、分枝酵素活性を有するポリペプチドを用いる方法を述べる。例
えば、本発明のポリペプチドは、デンプン又はデンプン含有材料の修飾のために
使用され、その結果その様な材料の特性が向上し得る。

【０１６１】 分枝酵素で修飾され得る材料の例は全ての型（ジャガイモ、トウモロコシ、コ
ムギ）の天然デンプン（未修飾型）、ロウ性デンプン、高アミロースデンプン、
アミロース、アミロペクチン、デキストリンを含む化学的に修飾されたデンプン
変換型デンプン、架橋型デンプン（ジスターチホスフェート）、デンプンエーテ
ル及びデンプンエステル（酢酸デンプン、ヒドロキシアルキル化デンプン、オク
テニルコハク酸デンプン）を含む。

【０１６２】 本発明の分枝酵素は、上述した様なデンプン様材料の修飾にとって有用であり
、その結果、修飾された材料は、その意図される目的のために、例えばＵＳ ４
４５４ １６１に記載の様な食品生成物、例えば食品及び飲料組成物、食品添
加物組成物、医薬製剤、サイジング剤、接着剤等の製造において一層適したもの
となる。通常、分枝酵素で修飾した材料は、未修飾のデンプンと比較して高い溶
解性、低い粘度及び老化しにくい傾向を有する。これらの特性は、デンプン様材
料から調製した食品生成物の特性、特にその様な生成物の保存安定性を改良する
ために使用され得る。食品生成物の例は、パン、デザート、ケーキ、スナック菓
子、ヌードル及びパスタ、ベビーフード、スポーツ飲料、冷凍又は冷蔵加工食品
及びペットフードである。酵素的修飾は、食品生成物への添加前にデンプン様材
料上で別々に、又は料理の前若しくは直後に酵素を食品材料に加え、食品を直接
修飾することによって、そのいずれかで行われ得る。

【０１６３】 紙の表面のサイジング及びコーティングのために使用するデンプン溶液の高い
溶解性、低い粘性及び良好な安定性は、ＥＰ ０ ６９０ １７０に示した様な
これらの利用に、分枝酵素修飾型デンプンを関連づけるのに非常に重要である。

【０１６４】 本発明は以下の例によって更に説明されるが、これは本発明の範囲を限定する
ものとして解釈されるべきではない。

【０１６５】 例１ 材料と方法 ロドサームス・オバメンシス（ＪＣＭ ９７８５）は、理化学研究所微生物系
統保存施設（日本国埼玉県和光市（３５１−０１９８））から入手した。

【０１６６】 分子クローニング技術は、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，
ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。

【０１６７】 以下の市販のプラスミド／ベクターを使用した： ｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、オランダ） ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、アメリカ） ｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−ＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、オランダ）

【０１６８】 以下の菌株は、形質転換及びタンパク質の発現に使用した： ＴＯＰ１０ Ｅ．コリ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、オランダ） Ｅ．コリ ＤＨ１２Ｓ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ、アメリカ）

【０１６９】 ＳＢ増殖培地（ＤＩＦＣＯ ♯ ０１２３−１７−３）は、トリプトン／ペプ
トン、３２ｇ／Ｌ；酵母抽出物、２０ｇ／Ｌ；ＮａＣｌ、５ｇ／Ｌ；５Ｎ Ｎａ
ＯＨ、１ｍｌ／Ｌから構成されている。

【０１７０】 緩衝液及び基質として使用した化学薬品は、少なくとも試薬等級の市販の製品
であった。

【０１７１】 分枝酵素活性 分枝酵素活性は、Ｔａｋａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅ
ｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４），ｐ．３０
９７（ａｓｓａｙ Ａ）に記載されている方法の改良版に従い決定した：５０μ
ｌの酵素溶液を５０μｌの基質溶液で混合し、そして試験温度で３０分間インキ
ュベートする。基質溶液は、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液に溶解した０．１％のＩ
ＩＩ型アミロースである。反応は、２ｍｌのヨウ素試薬の添加によって決定する
。ヨウ素試薬は、０．５ｍｌの１Ｎ ＨＣｌと混合した０．５ｍｌの保存液（０
．２６ｇのＩ_２及び２．６ｇのＫＩ／１０ｍｌの水）から毎日作り、そして１３
０ｍｌに希釈する。混合物は、色を安定化するために室温で１５分間インキュベ
ートする。活性は、試験する試料と、細胞抽出物を水で置換したコントロールと
の間のＡ_６６０の差異として測定する。１ユニットの分枝酵素活性は、６０℃、
ｐＨ７．０で１分当たり１％ずつアミロースーヨウ素複合体のＡ_６６０を低下さ
せ得る酵素量として定義される。

【０１７２】 Ｒ．オバメンシスｇｌｇＢプローブの調製 プライマーａ）（配列番号３）及びｂ）（配列番号４）を設計し（報告されて
いる細菌のｇｌｇＢ配列のアラインメントに基づく）、調製し、ロドサームス・
オバメンシス由来のゲノムＤＮＡとのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において
使用した。

【０１７３】 配列番号３、ＰＣＲプライマーａ）（上流）： ５′−ＧＡＧＣＡＣＣＣＣＹＴＣＧＡＣＧＧＣＡＧＴＴＧＧ−３′

【０１７４】 配列番号４、ＰＣＲプレイマーｂ）（下流）： ５′−ＣＡＴＣＣＡＩＣＣＷＡＫＲＴＴＣＣＡ−３′

【０１７５】 Ｉ＝イノシン Ｋ＝Ｇ又はＴ Ｒ＝Ａ又はＧ Ｗ＝Ａ又はＴ Ｙ＝Ｃ又はＴ

【０１７６】 反応成分を混合し〔１×緩衝液（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｊａ
ｐａｎ）中、ゲノムＤＮＡ、０．１ｎｇ／μｌ；ｄＮＴＰ各０．１２５ｍＭ；Ｍ
ｇ^２＋、２．５ｍＭ；プライマー、各２ｐＭ；Ｔａｑポリメラーゼ０．０２５Ｕ
／μｌ〕、そして以下の条件下でのＰＣＲに適用した：

【表１】

【０１７７】 ＰＣＲ反応混合物をアガロースゲル上で分離し、そして増幅したＰＣＲフラグ
メントの予想されるサイズをＥ．コリｇｌｇＢの配列データから計算し、約５５
０ｂｐとした。これらのフラグメントをＱＩＡｑｕｉｃｋ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｊａ
ｐａｎ）でゲル精製し、そして次に、Ｔａｋａｒａライゲーションキットバージ
ョン２（Ｔａｋａｒａ，Ｊａｐａｎ）を用いてｐＴ７Ｂｌｕｅベクターにライゲ
ーションした。ライゲーション混合物をフェノール／クロロホルムで精製し、そ
して次にエレクトロポレーションによってＥ．コリＤＨ１２Ｓを形質転換した。
得られた形質転換体由来のプラスミド（ｐＭＳｒａ８）を制限酵素で調べ、ロド
サームス・オバメンシスｇｌｇＢのインサートのサイズを確認した。

【０１７８】 Ｒ．オバメンシスｇｌｇＢ遺伝子のクローニング Ｒ．オバメンシスｇｌｇＢプローブとして、ｐＭＳｒａ８の挿入フラグメント
を用いて、サザンハイブリダイゼーションをＲ．オバメンシス由来のゲノムＤＮ
Ａ上で行い、サブクローンを生成するのに便利な制限酵素を選択した。３．５ｋ
ｂのハイブリダイズしたＢａｍＨＩフラグメントをｇｌｇＢのサブクローンのた
めに選択した。その結果、Ｒ．オバメンシスのゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩで消化
し、そしてサイズごとに分画したＤＮＡをアガロースゲルから切り出し、そして
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）にクローン化した。ＢａｍＨＩのサブライ
ブラリーは、ライゲーションしたクローンがＥ．コリＤＨ１２Ｓ細胞を形質転換
することによって行われた。コロニーの拾い上げは、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ^＋膜（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｊａｐａｎ）を用いて
、ＢａｍＨＩのサブライブラリーの形質転換体上で行い、そして次にＤＩＧ標識
したＲ．オバメンシスｇｌｇＢプローブにハイブリダイズした。ポジティブコロ
ニーを突き、そしてインサートをＰＣＲで調べた。選択したコロニー由来のプラ
スミドを調製し、そして配列決定することによって３．５ｋｂのＢａｍＨＩフラ
グメントがｇｌｇＢ（ｐＭＳｒａ１０）の５′末端を失っていることが明らかに
なった。従って、Ｋｐｎｌ及びＳａｌＩで２回消化したＲ．オバメンシスのゲノ
ムＤＮＡから作製した別のサブライブラリーを、Ｒ．オバメンシスｇｌｇＢプロ
ーブでスクリーニングし、Ｒ．オバメンシスｇｌｇＢ（ｐＭＳｒａ２９）の５′
末端を回収した。構造ｇｌｇＢの全配列は、ｐＭＳｒａ１０及びｐＭＳｒａ２９
から入手し、そして全ｇｌｇＢ遺伝子の増幅のためのＰＣＲプライマー（配列番
号５及び配列番号６）をこの配列から設計した。

【０１７９】 発現ベクターの構築 それぞれＢｓｐＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素部位を含むプライマーｃ）
（配列番号５）及びｄ）（配列番号６）を用いて、全ｇｌｇＢ遺伝子をロドサー
ムス・オバメンシスのゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した（ＰＣＲ反応の間の変異
を避けるために、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ＭａｎｎｈｅｉｍのＥｘｐａｎｄ Ｈ
ｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙを使用した）。ＢｓｐＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにする
ＰＣＲ増幅したフラグメントの切り出しは、ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化
したｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−ＨｉｓＡへの一方向のクローニングを可能にした。生じ
たベクターｐＭＳｒａ３３は、ＴＯＰ１０ Ｅ．コリにおける形質転換及びアラ
ビノースによる誘導後にＲ．オバメンシスの分枝酵素を生成した。

【０１８０】 配列番号５、プライマーｃ）；ロドサームス・オバメンシスｇｌｇＢ遺伝子の
増幅のためのプライマー（上流）。下線を引いたヌクレオチドが、ＢｓｐＨＩ部
位を導入する ５′−ＴＴＣＣＴＣＡＴＧＡＧＣＴＧＧＣＴＣＡＣＧＧＡＡＧＡＡＧＡＣＡ−３
′

【０１８１】 配列番号６、プライマーｄ）；ロドサームス・オバメンシスｇｌｇＢ遺伝子の増
幅のためのＰＣＲプライマー（下流）。下線を引いたヌクレオチドがＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位を導入する： ５′−ＧＴＴＴＡＡＡＧＣＴＴＴＴＣＡＧＧＡＣＧＧＣＴＡＣＣ−３′

【０１８２】 生物学的寄託ＤＳＭ １２６０７ 完全なロドサームス・オバメンシスｇｌｇＢ遺伝子を有するプラスミドｐＴ７
Ｂｌｕｅ（配列番号１）も、Ｅ．コリ ＤＨ１２Ｓを形質転換させ、これはＤＳ
Ｍ １２６０７としてＤＳＭＺに寄託された（生物学的材料の寄託に記載）。

【０１８３】 タンパク質の発現 Ｒ．オバメンシスの分枝酵素は、ｐＭＳｒａ３３で形質転換したＴＯＰ１０ Ｅ．コリの菌株において異種的に発現した。前記Ｅ．コリの細胞は、１００μｇ
／ｍｌのアンピシリンを有するＳＢ培地で、２８℃で一晩インキュベートした。
０．０００２％のアラビノースを発現の誘導のために加えた。細胞は遠心によっ
て遠心沈澱し、そして２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で再懸濁した。
緩衝液の量は、増殖培地の１／２０に相当する。次に、細胞を超音波処理し、そ
して細片を遠心によって除去した。

【０１８４】 Ｅ．コリからの内因性アミロース分解活性の除去 Ｅ．コリの抽出物から全ての内因性アミロース分解酵素活性を除去することに
よって、発現した分枝酵素活性を検出するために、ヨウ素法（Ｔａｋａｔａ ｅ
ｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４），ｐ．３０９７）を使用することが可能になる。
従って、ｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−ＨｉｓＡベクターを有し、そしてｇｌｇＢのインサ
ートを持たない（ネガティブコントロール）宿主Ｅ．コリの菌株から、内因性の
アミロース分解活性を除くために熱処理が使用できるかどうかを試験した。結果
は、６０℃／２０分の処理が、Ｔａｋａｔａ等によって記述されたアミロースー
ヨウ素アッセイで測定されるバックグラウンドのアミロース分解活性を熱で消滅
させるのに十分であり、この中で活性は検出されなかったことを示した。

【０１８５】 Ｒ．オバメンシスの分枝酵素変異体Ｙ３９７Ｃ＋Ｌ４１９Ｐの部分精製 発現したＲ．オバメンシスの分枝酵素の配列決定は、配列番号２の成熟アミノ
酸配列と比較して、２つの変化がＰＣＲ反応の間に導入されたことを明らかにし
た： ａ）Ｔｙｒ３９７はＣｙｓ３９７へと変化した。 ｂ）Ｌｅｕ４１９はＰｒｏ４１９へと変化した。 この分枝酵素変異体は、以降「Ｙ３９７Ｃ＋Ｌ４１９Ｐ」と表す。

【０１８６】 Ｅ．コリで発現した、置換Ｙ３９７Ｃ＋Ｌ４１９Ｐを有するＲ．オバメンシス
の分枝酵素はイオン交換及びハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー
によって部分的に精製した。熱処理した細胞抽出物を透析し、そしてＳｕｐｅｒ
−Ｑ Ｔｏｙｏｐｅａｌ（２２ｍｍ×２００ｍｍ、ＴＯＳＯＨ）にかけ、続いて
０〜０．６Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）の直線
勾配で溶出した。分枝酵素活性を有する画分を回収し、そしてＭａｃｒｏ−ｐｒ
ｅｐ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｔｙｐｅ Ｉ（１４ｍ
ｍ×１００ｍｍ、ＢｉｏＲａｄ）にかけ、続いて５〜４００ｍＭリン酸ナトリウ
ム（ｐＨ６．５）の勾配で溶出した。活性を示す画分を回収した。それは、クー
マシーブリリアントブルー染色によるＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、わずかなバンドと
一緒に、１つの主要なバンドを示した。

【０１８７】 分枝結合の形成 α−１，６−分枝結合の形成は、分枝結合アッセイの改良版（ＢＬ ａｓｓａ
ｙ，Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ，２４０ ２５３−２６０（１９９３））によって確認した。 使用した基質は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に溶解した０．
５％のＩＩＩ型アミロース（Ｓｉｇｍａ）である。基質（９０μｌ）及び酵素溶
液（１０μｌ）を混合し、そして６０℃で３０分間インキュベートし、続いて反
応を４分間の煮沸によって停止させた。１０μｌの１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．１
）の添加後、５μｌのイソアミラーゼ（１ｍｇ／ｍｌ、Ｈａｙａｓｈｉｂａｒａ
Ｃｏ．Ｌｔｄ．）又は５μｌの脱イオン水のいずれかを反応混合物に加えた。
それを４５℃で４５分間インキュベートした。続いて、反応液を４６０μｌの氷
冷エタノールに加え、そして氷上で１０分間保持した、沈澱した糖を１２，００
０ｒｐｍで５分間の遠心によって回収し、そして一旦真空で乾燥させ、続いて８
μｌの１Ｎ ＮａＯＨ及び２９２μｌの脱イオン水中で再び溶解した。溶液の還
元力は、改良型の３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法（Ｌｕｃｈｓｉｎｇ
ｅｒ ａｎｄ Ｃｏｒｎｅｓｋｙ，１９６２）を用いて測定した。ＤＮＳ溶液は
、最初に１０ｍｌの２Ｎ ＮａＯＨに０．０５ｇの３，５−ジニトロサリチル酸
を溶解し、続いて３ｇのロッシェル塩を溶液に加え、そして最後に全量を脱イオ
ン水で１５ｍｌに調整することで調製した。試料溶液（０．２〜０．３ｍｌ）を
０．４ｍｌのＤＮＳ溶液と混合し、そして５分間煮沸した。流水による冷却の後
、１．８ｍｌの水を反応混合物に加え、そして５２５ｎｍでの吸光度を測定した
。還元末端の量は、グルコース量に等しいとして推定した。部分的に精製したＹ
３９７Ｃ＋Ｌ４１９Ｐの試料は、分枝結合の形成の測定のために使用した。表５
に示す様に、還元末端はイソアミラーゼ処理によって生成し、示したα−１，６
分枝結合はＹ３９７Ｃ＋Ｌ４１９Ｐによって形成した。

【表２】

【０１８８】 例２分枝酵素変異体Ｙ３９７Ｃ＋Ｌ４１９Ｐについての温度及びｐＨの効果 至適温度及びｐＨを、分枝酵素変異体Ｙ３９７Ｃ＋Ｌ４１９Ｐについて評価し
た（例１に記載）。

【０１８９】 分枝酵素活性測定に使用したアッセイは、材料と方法に記載した様に行った。
Ｒ．オバメンシスの分枝酵素を発現しているＥ．コリ由来の内因性アミロース分
解活性を避けるために、細胞抽出物は６０℃で少なくとも２０分間、あらかじめ
加熱し、そして細片は遠心によって除去した。続いて、あらかじめ加熱した細胞
抽出物をアッセイにかけ、そして分枝酵素活性について解析した。

【０１９０】 至適ｐＨアッセイにおいて、異なる緩衝液を使用して基質溶液を調製した： ｐＨ＜４ ０．１Ｍ クエン酸ナトリウム ４＜ｐＨ＜６ ０．１Ｍ 酢酸ナトリウム ６＜ｐＨ＜１０ ０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ＞１０ ０．１Ｍ グリシルグリシン

【０１９１】 酵素（Ｙ３９７Ｃ＋Ｌ４１９Ｐ）を、指示温度で３０分間、ｐＨ７．０でイン
キュベートした。分枝酵素活性は上述の様に測定した。実験は少なくとも三回一
組で行った；平均値及び標準偏差を以下の表２及び表３に示す。

【０１９２】 データは、Ｙ３９７Ｃ＋Ｌ４１９Ｐの至適温度が約６５℃であることを示して
いる。

【表３】

【表４】

【０１９３】 ｐＨの活性実験は６０℃で行い、そして酵素を３０分間インキュベートした。
実験は少なくとも三回一組で行い；平均値及び標準偏差は以下の表４に示す。デ
ータは、Ｙ３９７Ｃ＋Ｌ４１９Ｐが約ｐＨ５〜約ｐＨ８の広範な至適ｐＨを有す
ることを示している。

【表５】

【０１９４】 例３ 分枝酵素変異体Ｙ３９７Ｃ＋Ｌ４１９Ｐによるシクロデキストリンの調製 コメアミロペクチン（Ｍｏｔｙｌ Ｂ，Ｓｈｉｍａｄａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，
Ｊａｐａｎ）を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７）中の、置換Ｙ３９７Ｃ＋Ｌ
４１９Ｐを有するＲ．オバメンシスの分枝酵素（例１に記載）（４００ユニット
／ｇ デンプン）で、５０℃で１８時間処理した。１５，０００ｒｐｍでの１０
分間の遠心による細片の除去後、２倍量のエタノールを溶液に加え、そして沈澱
したデキストリンを回収し、そして乾燥させた。約６７ｇのデキストリンを、１
００ｇのコメアミロペクチンから得た。分子内分枝結合が酵素処理によって起き
たならば、グルコアミラーゼに耐性があるシクロデキストリンが得られるはずで
ある。１ｇの上述したデキストリンを、１５００ユニットのグルコアミラーゼ（
リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ種、Ｗａｋｏ ＰｕｒｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｊａ
ｐａｎ））で、ｐＨ４．１、４０℃で１８時間処理し、そして生じたデキストリ
ンをエタノールによって回収した。約２００ｍｇのデキストリンを得た。酸α−
アミラーゼの存在下での処理によって、デキストリンは得られなかった。グルコ
アミラーゼ耐性デキストリンは、グルコアミラーゼ単独（０．９ユニット／ｇデ
キストリン）又はグルコアミラーゼとイソアミラーゼの組合わせ（それぞれ０．
９ユニット及び２９ユニット／ｇデキストリン）を用いて、ｐＨ４．５、４０℃
で１６時間再び処理した。その結果、９０％のデキストリンがグルコアミラーゼ
単独で回収され、一方、わずかに１０％のデキストリンが、イソアミラーゼの存
在下での処理後に残った。これは、環状デキストリンがＹ３９７Ｃ＋Ｌ４１９Ｐ
によって触媒される分子内α−１，６−分枝結合によって形成したことを示した
。

【０１９５】 例４アスペルギルスにおけるＲ．オバメンシスの発現 宿主生物 アスペルギルス・オリザエＢＥＣｈ２は、デンマーク特許出願ＰＡ １９９９
０１７２６に記載されている。これは、ＩＦＯ４１７７の変異体である、Ｊａ
Ｌ２２８の変異体（ＷＯ９８／１２３０００に記載）である。

【０１９６】 Ａ．オリザエの形質転換 アスペルギルス・オリザエの菌株ＢＥＣｈ２を１００ｍｌのＹＰＧ培地に接種
し、そして８０ｒｐｍで撹拌しながら３２℃で１６時間インキュベートした。生
育した菌糸を濾過によって回収し、０．６Ｍ ＫＣｌで洗浄し、そしてＧｌｕｃ
ａｎｅｘ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋより入手可）を３０μｌ／ｍｌの
濃度で含む３０ｍｌの０．６Ｍ ＫＣｌ中で再懸濁した。混合物は、プロトプラ
ストが形成するまで、６０ｒｐｍで撹拌しながら３２℃でインキュベートした。
残った菌糸を除去するための濾過後、プロトプラストを遠心によって回収し、そ
してＳＴＣ緩衝液で２回洗浄した。プロトプラストはヘマタイトメーター（ｈｅ
ｍａｔｉｔｏｍｅｔｅｒ）で計数し、そしてＳＴＣ：ＳＴＰＣ：ＤＭＳＯの溶液
（８：２：０．１）中で１．２×１０^７プロトプラスト／ｍｌの最終濃度に再懸
濁した。約４μｇのＤＮＡを１００μｌのプロトプラストに加え、穏やかに混合
し、そして氷上で３０分間インキュベートした。１μｌのＳＴＰＣ緩衝液を混合
物に加え、そして３７℃で更に３０分間インキュベートした。５０℃であらかじ
め暖めた１０ｍｌのＣｏｖｅのトップアガロースの添加後、反応混合物をＣＯＶ
Ｅのアガープレートに注いだ。プレートは、３２℃で５日間又は形質転換体が出
現するまでインキュベートした。

【０１９７】 培地及び緩衝溶液 ＣＯＶＥ：１Ｌ当たり、３４２．３ｇのスクロース、２０ｍｌのＣＯＶＥ塩溶液
、１０ｍＭのアセトアミド、１５ｍＭのＣｓＣｌ_２、３０ｇのアガーノーブル（
Ｄｉｆｃｏ）。 ＣＯＶＥ塩溶液：１Ｌ当たり、２６ｇのＫＣｌ、２６ｇのＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ
、７６ｇのＫＨ_２ＰＯ_４、５０ｍｌのＣｏｖｅ微量金属。 Ｃｏｖｅ微量金属：１Ｌ当たり、０．０４ｇのＮａＢ_４Ｏ_７−１０Ｈ_２Ｏ、０．
４ｇのＣｕＳＯ_４−５Ｈ_２Ｏ、１．２ｇのＦｅＳＯ_４−７Ｈ_２Ｏ、０．７ｇのＭ
ｎＳＯ_４−Ｈ_２Ｏ、０．７ｇのＮａ_２ＭｏＯ_２−２Ｈ_２Ｏ、０．７ｇのＺｎＳＯ
_４−７Ｈ_２Ｏ。 ＡＭＧ微量金属：１Ｌ当たり、１４．３ｇのＺｎＳＯ_４−７Ｈ_２Ｏ、２．５ｇの
ＣｕＳＯ_４−５Ｈ_２Ｏ、０．５ｇのＮｉＣｌ_２、１３．８ｇのＦｅＳＯ_４、８．
５ｇのＭｎＳＯ_４、３．０ｇのクエン酸。 ＹＰＧ：１Ｌ当たり、４ｇの酵母抽出物、１ｇのＫＨ_２ＰＯ_４、０．５ｇのＭｇ
ＳＯ_４−７Ｈ_２Ｏ、５ｇのグルコース、ｐＨ６．０。 ＳＴＣ：０．８Ｍソルビトール、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、２５ｍＭ Ｃａ
Ｃｌ_２。 ＳＴＰＣ：４０％ ＰＥＧ４０００／ＳＴＣ緩衝液。 Ｃｏｖｅトップアガロース：１Ｌ当たり、３４２．３ｇのスクロース、２０ｍｌ
のＣＯＶＥ塩溶液、１０ｍＭのアセトアミド、１０ｇの低融点アガロース。 ＭＳ−９：１Ｌ当たり３０ｇのダイズ粉末、２０ｇのグリセロール、ｐＨ６．０
。ＭＤＵ−２Ｂｐ：１Ｌ当たり、４５ｇのマルトース−１Ｈ_２Ｏ、７ｇの酵母抽
出物、１２ｇのＫＨ_２ＰＯ_４、１ｇのＭｇＳＯ_４−７Ｈ_２Ｏ、２ｇのＫ_２ＳＯ_４
、５ｇの尿素、１ｇのＮａＣｌ、０．５ｍｌのＡＭＧ微量金属溶液ｐＨ５．０。

【０１９８】 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティング ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動は、市販のゲルＰＡＧＥＬ ＡＥ６０００
ＮＰＵ−７．５Ｌ（７．５Ｔ％）を、装置ＡＥ−６４００（Ａｔｔｏ，Ｊａｐ
ａｎ）と一緒に用い、提供されたプロトコールに従い行った。ゲルにおいて分離
したタンパク質は、ＡＥ−６６７７ Ｈｏｒｉｚｏｎ ｂｌｏｔ（Ａｔｔｏ，Ｊ
ａｐａｎ）を用いて、Ｃｌｅａｒ Ｂｌｏｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ−Ｐ ＡＥ−６
６５５（Ａｔｔｏ，Ｊａｐａｎ）にトランスファーした。タンパク質の検出は、
Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｌｏｔ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて行った
。

【０１９９】アスペルギルスのためのＲ．オバメンシスｇｌｇＢの発現プラスミドの構築 Ｒ．オバメンシスｇｌｇＢ遺伝子は、各末端に制限酵素部位ＢｇＩＩＩ及びＸ
ｈｏＩを導入するために、プライマーセットａ）及びｂ）、又はａ）及びｃ）を
用いて、Ｒ．オバメンシスのゲノムＤＮＡから増幅した。プライマーｃ）は、Ｃ
末端のｇｌｇＢにおいてＧｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを含んで成るｃ−ｍｙｃエピトープの配列を与え
る。

【０２００】 反応成分、すなわち４０ｎｇのＲ．オバメンシスの染色体ＤＮＡ、Ｅｘｐａｎ
ｄ（商標）Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ）の３００ｐｍｏｌの各プライマー、０．２ｍＭのｄＮＴＰ及び２．６
ユニットのＤＮＡポリメラーゼを、提供されている緩衝液中で混合し、そして以
下の条件下でＰＣＲにかけた。

【表６】

【０２０１】 増幅した１．９ｋｂのフラグメントをＱＩＡ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、そしてＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩでの消化後
、それをＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで消化したｐＣａＨｊ４８３にライゲーション
した。プラスミドｐＣａＨｊ４８３は、アスペルギルス・ニガーの中性アミラー
ゼプロモーター、アスペルギルス・ニジュランスのＴＰＩリーダー配列、アスペ
ルギルス・ニガーのグルコアミラーゼターミネーター及びマーカーとしてアスペ
ルギルス・ニジュランスのａｍｄＳ遺伝子を有する。プライマーセットａ）及び
ｂ）で得られたプラスミドはｐＩＨ２８と命名され、そしてプライマーセットａ
）及びｃ）で得られたものをｐＩＨ２９と表した。

【０２０２】 Ａ．オリザエにおけるＲ．オバメンシスｇｌｇＢの発現 発現プラスミド、ｐＩＨ２８及びｐＩＨ２９をＮｏｔＩで消化し、そして生じ
たＲ．オバメンシスｇｌｇＢの発現カセットを含む６ｋｂのフラグメントをＱＩ
Ａ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて精製した。Ａ．オリザエＢ
ＥＣｈ２は各フラグメントで形質転換され、そして選択のポジティブな形質転換
体を単離した。形質転換体は５００ｍｌの振とうフラスコ中の１００ｍｌのＭＳ
−９に接種し、そして３２℃で１日間培養し、そして３ｍｌの各培養物を振とう
フラスコ中の１００ｍｌのＭＤＵ−２Ｂｐに移し、３２℃で２〜３日間培養した
。増殖した細胞は３５００ｒｐｍで１５分間の遠心によって採集した。約０．１
ｇの回収した細胞を、１００μｌの２倍濃度の試料添加緩衝液（１００ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２００ｍＭのジチオスレイトール、４％ ＳＤ
Ｓ、０．２％のブロモフェノールブルー及び２０％グリセロール）中で懸濁し、
そして５分間煮沸した。１４０００ｒｐｍで５分間の遠心後、１０μｌの上清を
ポリアクリルアミドゲルに載せ、そしてランニング緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ
、０．１％ ＳＤＳ、１９２ｍＭグリシン）中での、ゲル当たり２０ｍＡの電気
泳動にかけた。そのゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色した。ポジティ
ブな形質転換体は、Ｒ．オバメンシスｇｌｇＢの予想されるサイズ、７２ｋＤａ
のタンパク質のバンドを示した。ｃ−ｍｙｃタグを有する形質転換体の抽出物を
載せたゲルは、一次抗体として抗ｍｙｃ抗体（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び二次
抗体として抗マウスＩｇＧ（ｓｉｇｍａ）を用いてウェスタンブロッティングに
かけた。ポジティブなシグナルは、７２ｋＤａに相当する位置で得られた。

【０２０３】 例５Ｒ．オバメンシスの分枝酵素アッセイ並びに温度及びｐＨの効果 宿主菌株由来の内因性アミラーゼ活性を不活性化するために、細胞抽出物を６
８℃で３０分加熱した。活性は上述の様に測定した。

【０２０４】 ｐＨの活性プロファイルは６５℃で測定し、そして温度の活性プロファイルは
ｐＨ７で得た。実験は二回一組又は三回一組のいずれかで行い、そして平均及び
標準偏差を以下に示す。

【０２０５】 温度安定性は、次の様にｃ−ｍｙｃタグ無しの、Ｒ．オバメンシスの分枝酵素
上で測定した；３０〜５０ユニット／ｍｌ（ｐＨ７）を含む酵素溶液を異なる温
度で３０分間インキュベートし、そして続いて残りの分枝酵素活性を測定した。

【０２０６】 データは、Ｒ．オバメンシスの分枝酵素の至適ｐＨ及び温度がそれぞれ約ｐＨ
７及び６５℃であることを示唆している。ｃ−ｍｙｃタグの存在は、ｐＨ及び温
度のプロファイルに影響を与えなかった。

【表７】

【表８】

【表９】

【０２０７】 生物学的材料の寄託 プラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅ内に挿入されたロドサームス・オバメンシス由来の
分枝酵素遺伝子（例１を参照のこと）を含むＥ．コリのクローンは、ブダペスト
条約の名のもと、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏ
ｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ
）（Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ，Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃ
ｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に寄託され、そして次の寄託番号が与えられた： 寄託 寄託番号 寄託日 ＮＭＯ４９４４３ ＤＳＭ１２６０７ １９９８年１２月２３日

【０２０８】 前記菌株は、米国特許法施行規則第１．１４条及び米国特許法第１２２条のも
とでそれらを名付けるために、特許商標庁長官によって決定されるものにとって
、この特許出願の審査の間、前記培養物の入手が可能であることを保証する条件
のもとで寄託された。前記寄託は、寄託した菌株の実質的に純粋な培養物を表す
。前記寄託は、従属する出願の対応物、又はその孫が提出されている国の外国特
許法によって必要とされる場合に入手可能である。しかし、寄託の入手可能性が
、政府の指令によって付与される特許権の減損における従属発明を実施する許可
を構成しないと理解すべきである。

【０２０９】 本明細書に記載され、そして請求された発明が、本明細書で開示した具体的な
態様によって範囲を限定されないのは、これらの態様が本発明の複数の観点の例
示として意図されているためである。いずれかの等しい態様が、本発明の範囲内
であることが意図されている。実際、本明細書に示し、そして記載したものに加
えて、本発明の様々な変更が前述の説明から当業者に明らかとなるだろう。その
様な変更は更に、特許請求の範囲に含まれることも意図されている。抵触する場
合、定義を含む本開示が調節するだろう。

【０２１０】 様々な引用を本明細書に列記しており、これらの開示は引用によってそれら全
体が組み入れられる。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 9/10 5/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:01） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 分枝酵素活性及び少なくとも６０℃の至適温度を有する単離
   したポリペプチド。
2. 【請求項２】 前記至適温度が６０℃〜１２０℃の範囲にある、請求項１に
   記載のポリペプチド。
3. 【請求項３】 前記至適温度が６０℃〜８０℃の範囲にある、請求項２に記
   載のポリペプチド。
4. 【請求項４】 前記至適温度が約６５℃である、請求項３に記載のポリペプ
   チド。
5. 【請求項５】 細菌起源の、請求項１に記載のポリペプチド。
6. 【請求項６】 ロドサームス（Ｒｈｏｄｏ ｔｈｅｒｍｕｓ）属、特にＲ．
   オバメンシス（ｏｂａｍｅｎｓｉｓ）及びＲ．マリヌス（ｍａｒｉｎｕｓ）の種
   の細胞に由来する、請求項５に記載のポリペプチド。
7. 【請求項７】 分枝酵素活性を有するポリペプチドであって： ａ）配列番号２の成熟アミノ酸配列と少なくとも６５％の相同性を有するアミ
   ノ酸配列を有するポリペプチド； ｂ）Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ）ＤＨ１２Ｓ，ＤＳＭ１２６０７に含まれるプラスミ
   ドｐＴ７Ｂｌｕｅに含まれる核酸配列によってコードされる、成熟分枝酵素のア
   ミノ酸配列と少なくとも６５％の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプ
   チド；及び ｃ）（ｉ）前記成熟酵素に相当する配列番号１の核酸配列のヌクレオチド、（
   ｉｉ）配列番号１のｃＤＮＡ配列、（ｉｉｉ）少なくとも１００ヌクレオチドの
   （ｉ）若しくは（ｉｉ）の亜配列、又は（ｉｖ）（ｉ），（ｉｉ）、若しくは（
   ｉｉｉ）の相補鎖と、低ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配
   列によってコードされるポリペプチド、 から成る群から選択されるポリペプチド。
8. 【請求項８】 配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有
   するアミノ酸配列を有する、請求項７に記載のポリペプチド。
9. 【請求項９】 配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％の相同性を有
   するアミノ酸配列を有する、請求項８に記載のポリペプチド。
10. 【請求項１０】 配列番号２のアミノ酸配列を含んで成るか又はこれから成
    る、あるいは配列番号２のアミノ酸配列のフラグメントから成る、請求項７に記
    載のポリペプチド。
11. 【請求項１１】 配列番号２のアミノ酸配列又は置換Ｙ３９７Ｃ＋Ｌ４１９
    Ｐを有するその変異体から成る、請求項１０に記載のポリペプチド。
12. 【請求項１２】 Ｅ．コリ ＤＨ１２Ｓ，ＤＳＭ１２６０７に含まれるプラ
    スミドｐＴ７Ｂｌｕｅに含まれる核酸配列によってコードされる、請求項７に記
    載のポリペプチド。
13. 【請求項１３】 請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチドをコ
    ードする、核酸配列を含んで成る単離した核酸配列。
14. 【請求項１４】 分枝酵素活性を有するポリペプチドをコードする単離した
    核酸配列であって： ａ）配列番号１の核酸配列をコードする分枝酵素と少なくとも６５％の相同性
    を有する核酸配列； ｂ）Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ）ＤＨ１２Ｓ，ＤＳＭ１２６０７に含まれるプラスミ
    ドｐＴ７Ｂｌｕｅに含まれる核酸配列をコードする分枝酵素と少なくとも６５％
    の相同性を有する核酸配列；及び ｃ）（ｉ）配列番号１の核酸配列、（ｉｉ）配列番号１のｃＤＮＡ配列、（ｉ
    ｉｉ）少なくとも１００ヌクレオチドの（ｉ）若しくは（ｉｉ）の亜配列、又は
    （ｉｖ）（ｉ），（ｉｉ）、若しくは（ｉｉｉ）の相補鎖と、低ストリンジェン
    トな条件下でハイブリダイズする核酸配列、 から成る群から選択される核酸配列。
15. 【請求項１５】 適当な発現宿主において前記ポリペプの生成を指示する１
    又は複数の調節配列と作用可能に連結している、請求項１３又は１４に記載の核
    酸配列を含んで成る核酸構築物。
16. 【請求項１６】 請求項１５に記載の核酸構築物を含んで成る組換え発現ベ
    クター。
17. 【請求項１７】 請求項１６に記載の核酸構築物を含んで成る組換え宿主細
    胞。
18. 【請求項１８】 請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチドを生
    成する方法であって、（ａ）前記ポリペプチドの生成に適した条件下で請求項７
    に記載の宿主細胞を培養し；そして（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含
    んで成る方法。
19. 【請求項１９】 デンプン様材料を修飾するための、請求項１〜１２のいず
    れか１項に記載の、又は請求項１５に記載の核酸配列によってコードされるポリ
    ペプチドの使用。
20. 【請求項２０】 請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチド及び
    界面活性剤を含んで成る洗剤組成物。