CN103789281B - 一种葡聚糖分支酶及其编码基因与应用 - Google Patents

一种葡聚糖分支酶及其编码基因与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种葡聚糖分支酶及其编码基因与应用。本发明公开的一种蛋白，为如下（1）或（2）所示：（1）SEQ？ID？No.2所示的蛋白；（2）将SEQ？ID？No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。本发明公开的葡聚糖分支酶RmGBE具有优良的酶学特性，在食品、饲料、造纸等行业中具有较大的应用潜力。

Description

一种葡聚糖分支酶及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及一种葡聚糖分支酶及其编码基因与应用。
背景技术
葡聚糖分支酶（1,4-α-glucanbranchingenzyme,branchingenzyme,α-1,4-glucan-6-glycosyltransferase;EC2.4.1.18），又称Q酶，隶属于GH13家族，是该家族酶中比较特殊的一类酶，能够同时作用于α-1,4和α-1,6-糖苷键，且是目前GH13家族中已知的唯一能够在葡萄糖多聚物间形成α-1,6-糖苷键的酶。葡聚糖分支酶能够切割α-葡聚糖分子内的α-1,4-糖苷键，同时将切下的寡糖以α-1,6-糖苷键的形式连接到葡聚糖上形成分支，是糖原和淀粉生化合成中的必须酶，对于淀粉及糖原的合成以及其最终的结构和功能特性具有重要的影响（ThiemannV,SaakeB,VollstedtA,etal.HeterologousexpressionandcharacterizationofanovelbranchingenzymefromthethermoalkaliphilicanaerobicbacteriumAnaerobrancagottschalkii.ApplMicrobiolBiotechnol2006,72:60–71）。葡聚糖分支酶特殊的催化功能使其在实际工业生产中具有巨大的应用潜力。
葡聚糖分支酶广泛分布于自然界中的高等动物、植物以及微生物中。目前国际上关于微生物和植物来源的葡聚糖分支酶研究的较为广泛，但关于真菌来源的葡聚糖分支酶研究较少，仅见Kawabata等对一个来源于粗糙脉孢菌（Neurosporacrassa）的葡聚糖分支酶进行了分离纯化和性质研究（KawabataY,ToedaK,TakahashiT,etal.PreparationofhighlybranchedstarchbyglycogenbranchingenzymefromNeurosporacrassaN2-44anditscharacterizationandapplication.JApplGlycosci2002,49:273–279），尚没有真菌来源的葡聚糖分支酶基因克隆以及表达等方面的研究报道。国内葡聚糖分支酶的研究多集中在植物来源（又称为淀粉分支酶)，且主要侧重于农学育种研究方面。其它来源分支酶的研究文献报道也较少，没有关于葡聚糖分支酶酶学性质方面的研究报道。
工业生产的淀粉原料中含有18-33%左右的直链淀粉成分（BuleonA,ColonnaP,PlanchotV,etal.Starchgranules:structureandbiosynthesis.InternationalJBiolMacromol1998,23:85–112），直链淀粉的特殊线性结构使其难以被降解，从而导致工业生产中淀粉原料的有效利用率降低。此外直链淀粉容易回生，使淀粉类产品老化速率加快，从而导致产品品质下降。葡聚糖分支酶由于具有独特的α-1,6-糖苷键催化能力，可以催化直链淀粉的分支反应以改变其抗性结构，因此在多种淀粉相关的工业生产中显示出较好的应用前景。
研究表明，葡聚糖分支酶作用于淀粉溶液时能够增加淀粉的溶解度和体系的稳定性，同时极大程度的降低淀粉溶液的老化速度（Eun-JooK,Soo-InR,Hyun-AhB.BiochemicalcharacterisationofaglycogenbranchingenzymefromStreptococcusmutans:Enzymaticmodificationofstarch.FoodChem2008,4:979–984；KawabataY,ToedaK,TakahashiT,etal.PreparationofhighlybranchedstarchbyglycogenbranchingenzymefromNeurosporacrassaN2-44anditscharacterizationandapplication.JApplGlycosci2002,49:273–279）。葡聚糖分支酶的这种抗老化特性使其能够应用于焙烤食品的生产加工过程中，不仅起到延长食品货架期的目的，同时还能够提高产品的品质，如增大面包的比容等（OkadaS,KitahataS,YoshikawaS,etal.Processfortheproductionofbranchingenzyme,andamethodforimprovingthequalitiesoffoodproductstherewith:USpatentapplication4454161；SpendlerT,JoergensenOB.Useofabranchingenzymeinbaking:PatentapplicationWO97/41736）。另外葡聚糖分支酶能够应用于造纸工业中，在纸张的成型包衣流程中添加葡聚糖分支酶能够降解该流程中的淀粉溶液，减少其中老化淀粉的生成量，从而有助于提高纸张的均匀度和光滑度（NicholsSE.Glucan-containingcompositionsandpaper:USPatentapplication6465203）。葡聚糖分支酶还能够作用于直链或支链淀粉，通过环化作用产生有特殊功效的环状葡聚糖（TakataH,TakahaT,OkadaS.Cyclizationreactioncatalyzedbybranchingenzyme.JBacteriol1996,6:1600–1606；TakataH,TakahaT,OkadaS,etal.StructureofthecyclicglucanproducedfromamylopectinbyBacillusstearothermophilusbranchingenzyme.CarbohydrRes1996,295:91–101）。
随着社会的快速发展，能源的需求量日渐增加，然而化石能源的储量却在逐渐枯竭，因此人们对于可再生新能源的渴求非常强烈。淀粉作为植物光合作用的产物，广泛分布于各种农作物中，是一种储量极其丰富的天然可再生生物质资源，且具有价格低廉、容易获取、污染小、可再生、易处理和可生物降解等优点，已被广泛应用于多种工业生产中。淀粉资源充分、高效利用的关键是要有酶学特性优良的水解酶系发挥作用，葡聚糖分支酶是淀粉酶系中的一种，因此开发一些新型、高效和具有特殊新功能特性的葡聚糖分支酶具有重要的研究意义和实际应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种葡聚糖分支酶及其编码基因与应用。
本发明提供的一种蛋白，为如下（1）或（2）所示：
（1）SEQIDNo.2所示的蛋白；
（2）将SEQIDNo.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。
上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。
上述编码基因中，所述编码基因为如下中至少一种：
1）SEQIDNo.1中自5’末端起第28位至第2124位核苷酸所示的DNA分子；
2）SEQIDNo.1所示的DNA分子；
3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且所述蛋白质的DNA分子；
4）与1）或2）或3）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述蛋白质的DNA分子。
含有上述任一所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
一种制备葡聚糖分支酶的方法也属于本发明的保护范围，该方法是将所述的重组菌进行诱导表达得到。
所述重组菌是将SEQIDNo.1中自5’末端起第28位至第2124位核苷酸所示的DNA分子插入pET-28a（+）的多克隆位点得到的。
上述蛋白在制备具有葡聚糖分支酶作用的产品中的应用也属于本发明的保护范围；
所述蛋白在pH5.5-9.5，40℃以下具有葡聚糖分支酶活力，最适pH为7.5，最适温度为25℃。
上述蛋白在增加食品比容和/或延缓食品老化中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述食品为面食；
所述面食具体为面包。
上述蛋白在水解葡聚糖类多糖中的应用也属于本发明的保护范围；
所述多糖具体为直链淀粉。
本发明提供的一种来源于米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)CAU432的葡聚糖分支酶RmGBE纯酶的比酶活力为11.8Umg-1，该酶的最适反应pH值为7.5，在较宽的pH范围内保持稳定。最适反应温度为25℃，在10-30℃保持较高的酶活力，具有良好的低温适应性。并且本发明的葡聚糖分支酶的底物专一性较强，在面包中添加该酶能够显著提高面包的比容并延缓面包的老化。本发明提供的葡聚糖分支酶RmGBE具有优良的酶学特性使其在食品、饲料、造纸等行业中具有较大的应用潜力。
附图说明
图1为葡聚糖分支酶RmGBE的纯化电泳图。
图2为葡聚糖分支酶RmGBE的最适pH（A）及pH稳定性（B）。
图3为葡聚糖分支酶RmGBE的最适温度（A）及温度稳定性（B）。
图4为葡聚糖分支酶RmGBE对面包比容的影响。
图5为葡聚糖分支酶RmGBE对面包硬度的影响。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
碘液(工作液)的配制：将0.125mL储备液（0.26g碘和2.6g碘化钾溶于10mL蒸馏水）与0.5mL1mol/LHCl溶液混合，用蒸馏水定容至65mL。
下述实施例中葡聚糖分支酶酶活力的定义及测定方法如下：
葡聚糖分支酶酶活力的测定参照Takada等（TakataH,TakahaT,KurikiT,etal.PropertiesandactivecenterofthethermostablebranchingenzymefromBacillusstearothermophilus.ApplEnvironMicrobiol1994,60:3096–3104）的方法并稍作改动，具体方法为：将直链淀粉（购自Sigma）溶解于50mmol/L磷酸盐缓冲液（pH7.5），制备浓度为0.1g/100ml的底物溶液。将50μL适当稀释的待测酶液与等体积的底物溶液混合，在25℃水浴中反应20min。再加入400μL碘液(工作液)终止反应，随即加入800μL0.4mmol/LHCl，在660nm下检测吸光值。
葡聚糖分支酶酶活力单位（U）定义：在以上条件下，每分钟底物与碘液的混合物吸光度值降低1%所需要的葡聚糖分支酶的酶量。
米黑根毛霉（Rhizomucormiehei）CAU432在文献“Tang,etal.,2012.Purificationandcharacterizationofanovelbeta-1,3-1,4-glucanase(lichenase)fromthermophilicRhizomucormieheiwithhighspecificactivityanditsgenesequence.JAgrFoodChem60,2354-2361.”中公开过，公众可从中国农业大学获得。
SMARTRACEcDNAAmplificationKit购自美国Clontech公司，产品目录号为634914。
琼脂糖Ni-IDA亲和柱购自美国GE公司，产品目录号为17-0575-01。
实施例1、葡聚糖分支酶基因的获得
一、葡聚糖分支酶基因基因组保守区片断PCR扩增
以米黑根毛霉（Rhizomucormiehei）CAU432的基因组DNA为模板，用简并引物GBEDF和GBEDR，使用ExTaqDNA聚合酶进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
PCR反应条件：94℃5min；94℃30s，60℃～55℃（每个循环降低0.5℃）30s，72℃1min，共10个循环；94℃30s，55℃30s，72℃1min，20个循环；72℃，10min。
PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，显示在460bp左右有一条特异条带，将此条带回收并连接pMD18-T载体、热激法转化E.coliDH5α和菌落PCR鉴定重组子后测序。测序结果经NCBIBLAST搜索比对，结果表明该条带的核苷酸序列与葡聚糖分支酶有较高同源性。
简并引物如下：
GBEDF（正向）：5’-GACGGCTTCCGATTCGAYGGNGTNAC-3’
GBEDR（反向）：5’-TCGCCGACCAGGGCYTGRTCRTG-3’
其中：Y=C/T，N=A/T/C/G，R=A/G。
二、葡聚糖分支酶基因全长cDNA扩增
（一）根据步骤一克隆得到的DNA片段，分别设计5'RACE和3'RACE引物，如表1所示。
表1引物序列
GBE5'GSP 5’-TGATCATGCGATTCACAGTACG-3’
GBE5'NGSP 5’-GCGATTCACAGTACGCGATAGCTT-3’
GBE3'GSP 5’-GCTTTACAAGCATCATGGTATTGGC-3’
GBE3'NGSP 5’-GGTATTGGCTATGGCTTTTCAGG-3’
（二）提取米黑根毛霉CAU432的mRNA并纯化，按照SMARTRACE方法（SMARTRACEcDNAAmplificationKit），以纯化的mRNA为模板，反转录合成第一链cDNA，分别命名为5'RACE-ReadycDNA和3'RACE-ReadycDNA。
（三）分别以5'RACE-ReadycDNA、3'RACE-ReadycDNA为模板，对应的GSP、NGSP基因特异性引物，分别进行如下两轮嵌套PCR反应。
5'RACE：
第一轮的模板为5'RACE-ReadycDNA，引物为GBE5'GSP和UPM（UPM为SMARTRACEcDNAAmplificationKit试剂盒自带引物）；
第二轮的模板为第一轮PCR产物（稀释50倍），引物为GBE5'NGSP和NUP（NUP为SMARTRACEcDNAAmplificationKit试剂盒自带引物）；
3'RACE：
第一轮的模板为3'RACE-ReadycDNA，引物为GBE3'GSP和UPM（UPM为SMARTRACEcDNAAmplificationKit试剂盒自带引物）；
第二轮的模板为第一轮PCR产物（稀释50倍），引物为GBE3'NGSP和NUP（NUP为SMARTRACEcDNAAmplificationKit试剂盒自带引物）。
通过5'RACE获得1462bp的PCR扩增产物，3'RACE获得1107bp的PCR扩增产物。分别回收5'RACE和3'RACE的PCR扩增产物并连接pMD18-T载体，热激转化E.coliDH5α，菌落PCR鉴定重组子后分别测序。将5'RACE产物和3'RACE产物序列拼接后，获得2232bp的全长cDNA序列（SEQIDNo.1所示），其中包含2097bp的完整开放阅读框（ORF）（SEQIDNo.1中自5’末端起第28位至第2124位核苷酸所示），编码698个氨基酸构成的蛋白（SEQIDNo.2所示），将该蛋白命名为RmGBE。
实施例2、重组葡聚糖分支酶的制备
一、构建重组菌
（一）设计并合成如下引物
RmGBEF：5’-ATTCCGGAATTCATGCTTACCGACGACTTTG-3’
（下划线所示序列为EcoRⅠ酶切识别位点）
RmGBER：5’-ATTCCGCTCGAGCTAATCTGCTTTTCCCAATACA-3’
（下划线所示序列为XhoⅠ酶切识别位点）
（二）提取米黑根毛霉CAU432的mRNA并反转录为cDNA，以该cDNA为模板，以RmGBEF和RmGBER为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min30s，共30个循环；72℃总延伸10min。
（三）EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切PCR扩增产物，得到基因片段；EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切pET-28a（+）载体，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为pET-RmGBE。将重组质粒pET-RmGBE转化E.coliBL21（DE3），在含卡那霉素（50μg/mL）的LB平板上筛选阳性转化子并测序验证。测序结果表明，PCR扩增产物的核苷酸序列如SEQIDNo.1中自5’末端起第28位至第2124位核苷酸所示，与预期一致。
二、重组葡聚糖分支酶（RmGBE）的表达
将步骤一验证正确的阳性转化子于1L含卡那霉素（50μg/mL）的TB培养基中扩大培养。37℃振荡培养至OD600达到3.0时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，30℃诱导培养过夜，离心收集菌体。将菌体按照体积比1:10的比例重悬于缓冲液A（50mmol/LTris-HClpH8.0，500mmol/LNaCl，20mmol/L咪唑）中超声破碎，离心收集上清液即为葡聚糖分支酶（RmGBE）的粗酶液。
三、重组葡聚糖分支酶的纯化
基于pET-28a(+)质粒中有编码His-Tag标签蛋白的序列，所以使用琼脂糖Ni-IDA亲和柱纯化重组葡聚糖分支酶（RmGBE）。
具体步骤如下：
用缓冲液A冲洗Ni-IDA柱（1cm×5cm）5-10个柱体积；将上述步骤二中葡聚糖分支酶（RmGBE）的粗酶液以0.5mL/min流速上样；用缓冲液A冲洗15个柱体积，再用缓冲液B（50mmol/LTris-HClpH8.0,500mmol/LNaCl,50mmol/L咪唑）以1mL/min流速洗涤至洗脱液OD280﹤0.05，洗去杂蛋白；最后用缓冲液C（50mmol/LTris-HClpH8.0,500mmol/LNaCl,200mmol/L咪唑）洗脱并收集目的蛋白，得到纯化产物。
经SDS-PAGE（LaemmliUK.CleavageofstructuralproteinsduringassemblyofheadofbacteriophageT4.Nature,1970,227:680–685）检测蛋白纯度。结果如图1所示。
图1中，M为低分子量标准蛋白质；1为粗酶液；2为纯化产物。
图1表明，葡聚糖分支酶（RmGBE）的粗酶液经Ni-IDA亲和柱纯化后得到单一蛋白带（即为葡聚糖分支酶（RmGBE）），分子量大小为78.2kDa。
以pET-28a（+）按照上述方法转化E.coliBL21（DE3），并进行步骤二和步骤三没有目的条带产生。
四、测定步骤三得到的琼脂糖Ni-IDA亲和柱纯化产物（即葡聚糖分支酶（RmGBE））以及相对应的粗酶液的总蛋白量、葡聚糖分支酶的总酶活力以及比酶活力；以粗酶液的量为100%，计算RmGBE的回收率；以粗酶液的纯化倍数为1，计算RmGBE的纯化倍数，结果如表2所示。
其中蛋白含量测定参照Lowry等（LowryOH,RosebroughNJ,FarrAL,etal.Proteinmeasurementwiththefolinphenolreagent.JBiolChem1951,193:265–275）的方法，以牛血清白蛋白作为标准蛋白。
表2重组葡聚糖分支酶（RmGBE）纯化表
实施例3、重组葡聚糖分支酶（RmGBE）的性质
一、RmGBE的最适pH测定：将葡聚糖分支酶（RmGBE）酶液和直链淀粉（购自Sigma）分别溶于如下不同pH值的5种缓冲液体系中：柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液（pH3.0-6.0）、MES（2-(N-吗啉代)乙磺酸）缓冲液（pH5.5-6.5）、磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液（pH6.0-8.0）、Tris-HCl缓冲液（pH7.0-9.0）、甘氨酸/氢氧化钠缓冲液（pH8.6-10.6），然后在25℃条件下测定葡聚糖分支酶的酶活力，以酶活力最高点作为100%，计算得到各pH下的相对酶活力。结果如图2A所示。
二、RmGBE的pH稳定性测定：用上述5种不同pH值的缓冲液分别稀释葡聚糖分支酶（RmGBE）酶液，将稀释好的酶液在25℃水浴中分别处理30min，迅速将样品置于冰水中冷却30min，然后测定残余酶活力，以未经处理的葡聚糖分支酶（RmGBE）酶液作为对照，得到对照酶活力，计算残余酶活力占对照酶活力的百分比，得到相对酶活力。结果如图2B所示。
图2中，带有“◆”的曲线为RmGBE在柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液中的相对酶活；带有“■”的曲线为RmGBE在MES缓冲液中的相对酶活；带有“●”的曲线为RmGBE在磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液中的相对酶活；带有“▲”的曲线为RmGBE在Tris-HCl缓冲液中的相对酶活；带有“×”的曲线为RmGBE在甘氨酸/氢氧化钠缓冲液中的相对酶活。
图2A表明，重组葡聚糖分支酶RmGBE的最适pH为7.5。
图2B表明，重组葡聚糖分支酶RmGBE在pH5.5-9.5范围内处理30min后酶活力仍保持在80%以上，具有较宽的pH稳定范围。
三、RmGBE的最适反应温度的测定：将葡聚糖分支酶RmGBE用50mmol/LpH7.5的磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液中适当稀释，然后分别在5-60℃下测定葡聚糖分支酶的酶活力，以酶活力最高点作为100%，计算在各温度下的相对酶活力，结果如图3A所示。
四、RmGBE的温度稳定性测定：将葡聚糖分支酶RmGBE用50mmol/LpH7.5的磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液中适当稀释，分别在不同的温度下处理30min，迅速将样品置于冰水浴中冷却30min，然后测定残余酶活力，以未经处理的葡聚糖分支酶RmGBE作为对照，得到对照酶活力，计算残余酶活力占对照酶活力的百分比，得到相对酶活力，结果如图3B所示。
图3A表明，重组葡聚糖分支酶RmGBE的最适温度为25℃。
图3B表明，重组葡聚糖分支酶RmGBE在40℃以下保持相对稳定，相对酶活力仍能保持80%以上。与目前报道的大多数葡聚糖分支酶的温度性质不同，葡聚糖分支酶RmGBE表现出了良好的低温适应性，在10-30℃温度范围内都能保持较高的酶活力。
五、重组葡聚糖分支酶RmGBE的底物特异性研究
直链淀粉内部几乎全部由线性的α-1,4-糖苷键连接，而其他淀粉（玉米淀粉、马铃薯淀粉和可溶性淀粉等）中存在着不同含量的α-1,6-糖苷键。α-1,6-糖苷键构成了淀粉的分支结构，其中直链淀粉分支度最低。分支度的不同使得这些淀粉具有了不同的结构和理化性质。
分别以直链淀粉、支链淀粉、可溶性淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉和糯米淀粉为底物测定重组葡聚糖分支酶RmGBE的底物特异性，将各底物溶解在50mmol/LpH7.5的磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液中配制成浓度0.1g/100ml，25℃水浴中反应20min，其余步骤与葡聚糖分支酶酶活力的测定方法相同，以直链淀粉为底物时的比酶活力为100%，计算得到其他底物条件下的相对酶活力，结果如表3所示。
表3表明，以直链淀粉为底物时，葡聚糖分支酶RmGBE表现出相对较高的酶活力（10.7U/mg），在以马铃薯淀粉和玉米淀粉为底物时该酶的酶活力明显降低，对可溶性淀粉和支链淀粉只有较低的水解能力，另外该酶不能水解普鲁兰多糖、环状糊精等其他多糖底物。
结果表明，RmGBE对于直链淀粉类的由α-1,4-糖苷键连接的低分支度的葡聚糖（多糖）类底物具有较强的水解能力，对分支度较高的底物水解能力较弱，这种专一性使该酶在食品、造纸等工业生产中具有较高应用潜力。
表3重组葡聚糖分支酶RmGBE的底物特异性
底物 比酶活力（U/mg） 相对酶活力（%）
直链淀粉 10.7±0.2 100
支链淀粉 1.2±0.2 11
玉米淀粉 3.6±0.1 33
马铃薯淀粉 3.3±0.1 31
可溶性淀粉 1.1±0.1 10
实施例4、重组葡聚糖分支酶（RmGBE）在面包加工中的应用
一、面包的制作
面包的制作方法如下：500g面粉中（以面粉质量为100%计）加入占面粉质量58%的水、2%的酵母、5%的糖、3%的脱脂奶粉，混匀后中速和面2min，后加入占面粉质量1%的盐，中速和面2min，高速2min，加入占面粉质量3%的黄油中速2min，最后高速3min，静置5min，按70g每个分割成型后室温发酵15min，38℃，80%相对湿度条件下发酵90min，最后在烤箱中焙烤20min（面火180℃，底火200℃），室温（25℃）下冷却。
二、重组葡聚糖分支酶（RmGBE）对面包品质的影响
加酶组为将重组葡聚糖分支酶（RmGBE）的酶液分别按照0、0.25、0.5、1、2.0ppm（mg/kg面粉）（比酶活力11.8U/mg）的添加量与水混匀后加入到面粉中，与不加酶组（对照组）一起按上述面包制作的方法进行操作，待面包焙烤完成后室温下冷却2h后测定面包的比容及质构参数，另外用自封袋密封，室温下贮存不同时间后测定面包的老化程度。
三、面包品质及老化程度的测定
（一）比容的测定：使用分析天平测定各组面包的重量，采用菜籽置换法测定面包的比容（mL/g），结果如图4所示。
图4A表明，与对照组相比，加重组葡聚糖分支酶（RmGBE）后面包的比容有了显著的增长，比容随加酶量的升高先增大后减小，在1.0ppm（比酶活力11.8U/mg）的加酶量时比容最高增长了36%。图4B从外观上反应了各组面包的比容变化，与图4A的结果一致。
（二）老化程度的测定：用质构仪测定各面包在室温（25℃）下贮存不同时间的硬度及咀嚼性的变化来反应面包的老化程度。将各面包样品分别密封贮存24h、48h、72h、96h后，取面包的中间部分切成20mm薄片，采用直径为35mm的探头挤压面包片（压缩40%的厚度），测定面包应力指标。
图5表明，在4天的储藏过程中，对照组和加酶组面包的硬度均发生了增长，但加酶组面包老化指标的增长程度显著低于对照组。第四天时，加酶组面包的硬度与对照组相比降低了38%，表明在面包中添加葡聚糖分支酶RmGBE能够延缓面包自身的老化过程，起到抗老化的作用。

Claims (13)

1.一种蛋白，为如SEQIDNo.2所示的蛋白。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下1)或2)：
1)SEQIDNo.1中自5’末端起第28位至第2124位核苷酸所示的DNA分子；
2)SEQIDNo.1所示的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体。
5.含有权利要求2或3所述编码基因的表达盒。
6.含有权利要求2或3所述编码基因的转基因细胞系。
7.含有权利要求2或3所述编码基因的重组菌。
8.一种制备葡聚糖分支酶的方法，该方法是将权利要求7所述的重组菌进行诱导表达得到。
9.权利要求1所述的蛋白在制备具有葡聚糖分支酶作用的产品中的应用。
10.权利要求1所述的蛋白在增加食品比容和/或延缓食品老化中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：所述食品为面食。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于：所述面食为面包。
13.权利要求1所述的蛋白在水解葡聚糖类多糖中的应用；
所述多糖为直链淀粉。
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