CN102816778A

CN102816778A - 一种水稻淀粉分支酶sbe3基因的突变基因及其用途

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Publication number: CN102816778A
Application number: CN2012102666499A
Authority: CN
Inventors: 朴钟泽; 杨瑞芳; 张建明; 白建江; 楼素芬
Original assignee: Shanghai Haoyang Agricultural Science & Technology Development Co ltd; Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Haoyang Agricultural Science & Technology Development Co ltd; Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2012-07-30
Filing date: 2012-07-30
Publication date: 2012-12-12
Anticipated expiration: 2032-07-30
Also published as: CN102816778B

Abstract

本发明提供一种水稻淀粉分支酶SBE3基因的突变基因，所述突变基因在对应于水稻淀粉分支酶SBE3基因第16个外显子的第105位处具有T→C的碱基突变。本发明还提供一种筛选高抗性淀粉含量的水稻品种的方法。本发明提供的突变基因的碱基突变可以作为分子标记，有效地检测高抗性淀粉含量品种降糖稻1号及其衍生品种（系），从而大大提高高抗性淀粉含量水稻新品种的选择效率，获得高抗性淀粉含量水稻品种。

Description

一种水稻淀粉分支酶SBE3基因的突变基因及其用途

技术领域

本发明属于分子遗传学领域。具体而言，本发明涉及水稻高抗性淀粉含量主效基因的突变筛选及所述突变的应用。

背景技术

欧洲抗性淀粉协会（EURESTA）的定义，抗性淀粉（Resistant Starch，简称RS）是指在健康个体的小肠中不能被吸收的淀粉或淀粉降解产物。抗性淀粉具有降低血糖、降低血脂及有利于肠道健康等多种重要的生理功能。已有研究表明，RS不能在小肠消化吸收和提供葡萄糖，而在大肠中可以被肠道生理性细菌发酵，产生短链脂肪酸（shortchain fatty acid，简称SCFA）和气体。RS的发现及研究进展，被联合国粮农组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）认为是近年来碳水化合物与健康关系的研究中一项最重要的成果。RS有着重要的生理功能，它能够降低餐后血糖和胰岛素应答，提高机体对胰岛素的敏感性，预防便秘和结肠癌的发生，降低血清中胆固醇和甘油三酯含量，降低和控制体重，促进矿物质吸收。与低抗性淀粉饮食者相比，高抗性淀粉饮食者具有较少的胰岛素反应，这对糖尿病患者控制餐后血糖值有很大影响。尤其对于非胰岛素依赖型病人，摄食高抗性淀粉食物，可延缓餐后血糖上升，有效控制糖尿病病情。然而，日常食用的稻米中抗性淀粉含量很低，米饭及其制品主要在胃和小肠中被淀粉酶以酶解的方式消化，最终产物为葡萄糖。因此，稻米被认为是高血糖指数（Glycemic index，GI）的食物。热米饭抗性淀粉含量低于1%，冷米饭抗性淀粉含量也仅为1%-2.1%。

鉴于上述情况，近几年来，抗性淀粉引起了国内外水稻育种专家的极大关注。目前市场上的抗性淀粉均是利用高直链淀粉生产的。已有一些报道通过提高作物直链淀粉含量来提高RS含量，例如：Bird等获得一个SSIIa基因突变的大麦突变体，该突变体产生的直链淀粉比例增加，RS含量显著提高；Regina等利用RNAi技术获得了直链淀粉含量高达70%的小麦突变体，其RS含量也明显提高；Wei等通过RNAi技术降低水稻淀粉分支酶的表达，获得了直链淀粉和抗性淀粉含量比野生型水稻品种“特青”明显提高的转基因品种；浙江大学的科研人员利用航天诱变和理化诱变技术，培育了高RS水稻新品种“浙辐201”，并与相关企业合作进行了产业化开发，产品命名为“宜糖”米。

目前，对于RS功能产品的绝大多数研究仍集中于采用物理加工的方法提高RS含量，关于遗传改良方面的报道尚不多见。常规育种技术是目前稻米品质改良的主要手段，其方法也比较简单，即将待改良亲本与高抗性淀粉含量亲本杂交，在杂交后代或回交后代中再进一步选育目标品系，但在选育抗性淀粉含量高的水稻中往往需要精确测定。由于抗性淀粉的测定不但费时、成本高，而且容易受到环境的影响，加之测定方法的复杂性，稻米抗性淀粉含量的改良一直比较困难。

此外，目前鲜见与抗性淀粉含量紧密连锁的分子标记开发和利用的报道。仅在2008年，牟方贵等报道在杂交组合II-32B/RS111中，位于第8染色体的RM72和RM547与抗性淀粉存在一定的连锁关系，而在宜香B/RS111的F₂中，和Wx基因连锁的RM217和RM225与抗性淀粉存在一定的连锁关系。2009年王琳等利用BSA法在小麦中找到一个与高抗性淀粉含量密切相关的SSR标记Xbarc59。

分子标记辅助选择可以大大减少育种的工作量，育种效率也会明显提高。开发与稻米抗性淀粉含量相关基因紧密连锁的分子标记或功能标记，利用开发的分子标记对育种材料进行早代选择，加快育种进程，改良稻米营养品质有着重要的意义。

发明内容

针对上述技术问题，本发明人发现了一种水稻高抗性淀粉含量主效基因（命名为sbe3-rs）的分子标记。通过检测该分子标记，能够准确预测高抗性淀粉含量水稻植株，从而加快高抗性淀粉含量水稻品种的选择进度，提高育种选择效率。

因此，本发明的一个目的是提供一种水稻淀粉分支酶SBE3基因的突变基因，所述突变基因在对应于水稻淀粉分支酶SBE3基因第16个外显子的第105位处具有T→C的碱基突变。

优选地，所述突变基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。此核苷酸序列与水稻淀粉分支酶SBE3基因相比，在对应于其第16个外显子的第105位处具有T→C的碱基突变。

另一方面，本发明还提供一种DNA核酸序列，所述DNA核酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示（本文中命名为“PCR-SpeI”）。SEQID NO. 2所示的核苷酸序列为571bp的片段，其与水稻淀粉分支酶SBE3基因相比，涵盖了水稻淀粉分支酶SBE3基因第16个外显子及其上下游的部分非编码区，并且此DNA核酸序列中在对应于水稻淀粉分支酶SBE3基因第16个外显子第105位处具有碱基C，从而原本与其上下游碱基构成的限制性内切酶SpeI的酶切位点ACTAGT被突变成ACCAGT，由此丧失了限制性内切酶SpeI的酶切位点。

研究表明，包含本发明提供的上述突变基因或DNA核酸序列的水稻品种，其抗性淀粉含量显著高于对应的基因或DNA核酸序列中不包含该碱基点突变的水稻品种。因此，在又一方面，本发明提供上述突变基因或DNA核酸序列在筛选高抗性淀粉含量的水稻品种中的用途。

再一方面，本发明提供一种筛选高抗性淀粉含量的水稻品种的方法，所述方法包括以下步骤：

以扩增包含水稻淀粉分支酶SBE3基因第16个外显子第105位的核酸序列为目标设计引物，然后采用该引物并以待筛选水稻的基因组DNA为模板进行PCR扩增，鉴定在得到的扩增产物中在对应于水稻淀粉分支酶SBE3基因第16个外显子第105位处是否具有T→C的碱基突变。

具体而言，所述方法包括以下步骤：

1）提取待筛选水稻的基因组DNA；

2）以该基因组DNA为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO. 3和SEQID NO. 4所示的引物进行PCR扩增：

PCR-SpeI F: ATGTGATGTGCTGGATTTGG SEQ ID NO.3

PCR-SpeI R: TGTGGTTTTCATACCGTTCTTA SEQ ID NO. 4；以及

3）鉴定在得到的扩增产物中在对应于水稻淀粉分支酶SBE3基因第16个外显子第105位处是否具有T→C的碱基突变。

优选地，所述步骤3）中采用以下方式进行鉴定：

A. 对获得的扩增产物进行测序。PCR扩增可得到571bp的片段，可以对其进行片段全长测序，从而确定在该核苷酸片段中在对应于水稻淀粉分支酶SBE3基因第16个外显子第105位处是否具有T→C的碱基突变，具有此碱基突变的植株为高抗性淀粉含量的品种。

替代地或额外地，所述步骤3）中采用以下方式进行鉴定：

B. 采用限制性内切酶SpeI对获得的扩增产物进行酶切鉴定。对于PCR扩增得到的571bp片段，如果在其对应于水稻淀粉分支酶SBE3基因第16个外显子第105位处具有T→C的碱基突变，则此点突变造成了该位置处的限制性内切酶SpeI的酶切位点丧失（由于ACTAGT被突变成ACCAGT）。采用SpeI酶切，低抗性淀粉含量植株PCR产物的酶切结果有375bp和196bp两条谱带；高抗性淀粉含量植株PCR产物不能被酶切，只有571bp一条谱带；杂合基因型的有3条谱带。

还一方面，本发明提供一种用于筛选高抗性淀粉含量的水稻品种的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：能够扩增包含水稻淀粉分支酶SBE3基因第16个外显子第105位的核酸序列的PCR引物；

优选地，所述试剂盒还包括Taq DNA聚合酶、PCR缓冲体系和dNTP。

优选地，在本发明提供的试剂盒中，所述PCR引物为核苷酸序列如SEQID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示的引物；并且优选地，所述试剂盒还包括限制性内切酶SpeI。

另一方面，本发明提供根据本发明的水稻淀粉分支酶SBE3基因的突变基因（优选核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的突变基因）编码的蛋白，其中所述突变基因在对应于水稻淀粉分支酶SBE3基因第16个外显子的第105位处具有T→C的碱基突变；

优选地，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 7所示。

并且本发明还提供由根据本发明的DNA核酸序列（SEQ ID NO. 2）编码的氨基酸序列。

由此，本发明还提供上述蛋白或氨基酸序列在筛选高抗性淀粉含量的水稻品种中的用途。

又一方面，本发明提供另一种筛选高抗性淀粉含量的水稻品种的方法，所述方法包括以下步骤：

获得待筛选水稻的水稻淀粉分支酶SBE3的氨基酸序列或其部分序列，然后鉴定该氨基酸序列中对应于水稻淀粉分支酶SBE3第599位处是否具有亮氨酸→脯氨酸的氨基酸突变。

本发明人通过大量实验证明，在不同水稻品种中，如在水稻淀粉分支酶SBE3基因第16个外显子第105位处具有T→C的碱基突变，其抗性淀粉含量高。因此，采用人工合成的引物序列扩增基因组DNA，然后通过对PCR产物酶切电泳得到多态性，由此检测此碱基点突变形成的分子标记，可以有效地检测高抗性淀粉含量品种降糖稻及其衍生品种（系）中是否含有该主效基因位点，从而大大提高高抗性淀粉含量水稻新品种的选择效率，获得高抗性淀粉含量水稻品种。

此外，采用本发明提供的鉴别水稻抗性淀粉含量的分子标记方法，步骤简单快捷、稳定性可靠。实验证明，其鉴别结果与表型测定结果准确一致、重复性好，特别适用于抗性淀粉分子标记辅助育种，可以省去复杂的抗性淀粉含量测定过程，节省育种成本，提高选择效率，加速育种进程。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为覆盖sbe3-rs的连锁遗传图，其中示出了物理图谱及交换重组情况分析。

图2为对亲本植株进行扩增得到的扩增产物SpeI酶切结果，其中M为分子量标准品DL2000，泳道1和2分别为亲本密阳23的扩增产物经SpeI酶切前后的电泳结果，泳道3和4分别为亲本降糖稻1号的扩增产物经SpeI酶切前后的电泳结果。

图3为F₂代单株的突变检测结果电泳图谱，其中P1为降糖稻1号，P2为密阳23，其余为178个F₂代单株。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

抗性淀粉含量测定应用Megazyme公司提供的抗性淀粉含量测定试剂盒（Megazyme, Co. Wicklow, Ireland）对抗性淀粉含量测定，略有改进。具体步骤为：

准确称取100mg米粉样品，小心放入带螺旋盖的塑料试管中，依次加入α-胰淀粉酶反应液和淀粉葡萄糖苷酶（AGM），37℃震荡孵育16小时，非抗性淀粉被溶解，水解成D-葡萄糖；孵育结束后加入99%乙醇终止反应；离心上述溶液，弃上清，底部残留絮状团即为样品中的抗性淀粉，再用50%乙醇洗涤沉淀；倒置离心管，沉淀干燥后用2M KOH溶解沉淀，并加入AGM，置于60℃水浴中孵育1小时，最后用D-葡萄糖用葡糖氧化酶/过氧化物酶试剂（GOPOD）试剂测定葡萄糖含量，并计算抗性淀粉含量（以重量百分比计，简称RS (%)）。

实施例1

（一）降糖稻1号/密阳23 F₂群体构建及表型鉴定

2008年夏季，在上海农科院综合试验基地以高抗性淀粉含量材料降糖稻1号为母本与籼稻品系密阳23为父本杂交获得F₁代种子。母本以人工剪颖去雄的方法进行处理。2008年冬季在海南基地种植杂种F₁代获得F₂代种子，2009年夏季在上海农科院种植F₂代。每个F₂代单株采集叶片抽提DNA用于基因型分析，自交种子单株收获用于抗性淀粉含量测定。用F2代对控制抗性淀粉含量的基因进行初步定位，在2号染色体上发现分子标记RM13366和RM6611区间内存在一个与抗性淀粉含量相关的QTL，能解释抗性淀粉含量变异的60.4%，挑选此区段杂合单株，自交后代群体进一步对目的基因精细定位。根据初定位结果，选择目的区段杂合单株连续自交构建F3:4群体，用于目的性状的精细定位。

（二）降糖稻1号/密阳23 F₂群体的分子标记分析

（1）用CTAB法提取亲本及F₂代群体个单株的基因组DNA

水稻小量DNA提取法，主要参考McCouch等（1988）的报道，方法简述如下：

1) 剪取一小片叶片4-5 cm，加入700μL 1.5 × CTAB（含1.5%CTAB，75 mM Tris-HCl，15mM EDTA，1.05 M NaCl），充分研磨；

2) 将匀浆转入1.5 ml的离心管，56℃水浴20 min后冷却至室温；

3) 加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），摇匀；

4) 最高速度（13200 rpm）离心10 min；

5) 将上清液转入新的离心管，并加入两倍体积的预冷的100%酒精，静止20 min后离心收集DNA；

6) 去上清，风干DNA，加50-100 μL双蒸水溶解，于紫外分光光度计中检测。稀释DNA，制备一套DNA工作溶液，其浓度为50-100ng/μL左右，4℃冰箱保存备用。

（2）根据gramene网站公布的SSR分子标记（http://www.gramene.org/markers/），按照较均匀5cM的遗传距离选择一定数目的分子标记进行合成。用所获标记对两亲本进行多态性筛选，在亲本间有多态性的SSR标记用于后续分析。

（3）利用F₂代分离群体的基因型资料，根据连锁交换规律，利用软件Joinmap3.0构建水稻抗性淀粉含量性状的遗传连锁图谱并获得各个分子标记的遗传距离。最后根据F₂代群体各个单株的分子标记基因型资料和相应的抗性淀粉含量表型值，利用MapQTL 6.0软件符合区间作图法，对目标染色体进行QTL位点基因扫描。

（三）利用分子标记筛选降糖稻1号/密阳23 F₄自交群体精细定位sbe3-rs基因。

在初步定位的基础上，进一步利用扩大作图群体和标记加密分析对高抗性淀粉含量相关基因进行精细定位，采用的精细定位群体是656株F₄群体，所用的SSR标记系从禾本科数据库中（http://www.gramene.org）获得。根据QTL定位结果，本发明把控制水稻抗性淀粉含量主效基因定位到物理距离约为573kb（图1）。结合生物信息学工具分析候选区段序列，从http://rice.plantbiology.msu.edu/网站上搜索573Kb长的定位区段（从Indel2到InDel6）DNA序列总计找到86个已知和未知基因。这86个基因中只有一个淀粉分支酶基因SBE3与淀粉合成相关。该基因基因组序列全长11,380bp（SEQ ID NO. 5），含有22个外显子，CDS全长2478bp（SEQ ID NO. 8），编码825个氨基酸（SEQ ID NO. 6）。我们设计了9对引物扩增突变体降糖稻1号和野生型的SBE3基因组DNA，覆盖全部的外显子，测序比对分析发现，位于突变体降糖稻1号SBE3基因组DNA第16个外显子区具有一个碱基突变（T→C），该点突变同时造成SpeI酶切位点的丧失。

采用：

PCR-SpeI F: ATGTGATGTGCTGGATTTGG SEQ ID NO.3

PCR-SpeI R: TGTGGTTTTCATACCGTTCTTA SEQ ID NO. 4

作为引物PCR扩增亲本密阳23和亲本降糖稻1号，得到571bp片段，本文中命名为“PCR-SpeI”。

将PCR产物在37℃下经SpeI酶切5小时后，酶切产物经过1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。图2所示电泳结果表明，低抗性淀粉含量植株即亲本密阳23的酶切产物（泳道2）有375bp和196bp两条谱带，高抗性淀粉含量植株即亲本降糖稻1号的PCR产物不能被酶切，只有571bp一条谱带（泳道4）。从而找到了与抗性淀粉含量性状共分离的分子标记，即位于第16个外显子区的碱基突变（T→C）。

实施例2 分子标记的验证

1 材料和方法

1.1 材料

降糖稻1号/密阳23杂交F₂代178个单株。

PCR扩增引物：

PCR-SpeI F: ATGTGATGTGCTGGATTTGG SEQ ID NO.3

PCR-SpeI R: TGTGGTTTTCATACCGTTCTTA SEQ ID NO. 4

1.2 方法

用引物扩增F₂群体样本DNA。反应体系中包括2 μl 10×PCR buffer （100 mM Tris-HCl pH 8.0, 15 mM MgCl2, 500 mMKCl, 1% TritonX-100）， 0.2 mM dNTPs，0.2 μM上游和下游引物，50-100 ng样本DNA和0.625 U Taq酶。

反应程序为：94℃预变性5min，循环（94℃ 30s，56℃ 30s， 72℃ 1 min）35次，最后72℃延伸10min。PCR产物经SpeI（TaKaRa）酶切，酶切反应体系20μl，包括：17.5μlPCR产物，2 μl 10×M buffer，0.5μl SpeI。37 ℃酶切5小时，酶切产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析检测多态性。亲本密阳23带型2条（375bp和196bp），亲本降糖稻1号不能被酶切，带型只有一条571bp。杂合型单株有三条带型，571bp，375bp和196bp。后代与亲本密阳23基因型一致的标记为A，与亲本降糖稻1号基因型一致的标记为B，杂合型的标记为H。

2 结果

利用F₂代群体的178个单株对突变进行验证，限制性内切酶SpeI对特异扩增片段进行酶切，其电泳检测结果见图3。结果表明，分离群体单株出现3种带型，即分别与亲本密阳23、降糖稻1号和杂合型一致。带型均与抗性淀粉含量测定结果相对应。178个F₂群体中，有70个单株基因型与亲本密阳23一致，其抗性淀粉含量以重量百分比计为0.25%-0.73%，17个单株的基因型与降糖稻1号亲本基因型一致，其抗性淀粉含量为4.56%-12.73%，91株基因型为杂合型，其抗性淀粉含量为0.35%-2.19%。F₂代单株基因型及表现型即抗性淀粉含量测定值（RS (%)）结果见下表1。

由此说明，本发明提供的分子标记筛选方法能够准确筛选出高抗性淀粉含量单株和纯合单株。

表1.

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。