CN107177694B - 一种与水稻高抗性淀粉含量基因sbe3-rs紧密连锁的分子标记、引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与水稻高抗性淀粉含量基因sbe3‑rs紧密连锁的分子标记、扩增该分子标记的引物对以及检测水稻高抗性淀粉含量基因sbe3‑rs的方法。所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示或SEQ ID NO：2所示。本发明分子标记位于高抗性淀粉突变体基因sbe3‑rs的内部，与水稻高抗性淀粉含量基因sbe3‑rs紧密连锁，与非基因内部标记相比，本发明分子标记不会出现分离，可以更有效地提高育种效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说涉及一种与水稻高抗性淀粉含量基因sbe3-rs紧密连锁的分子标记、引物及其应用。
背景技术
淀粉是人类食物和能量的主要来源，其进入人体后，绝大部分在小肠中酶解后被消化吸收，小部分可逃避酶解进入小肠，在大肠中被微生物发酵利用后，最终排出体外，前者为可消化吸收淀粉(digestible starch，DS)，后者为抗性淀粉(resistant starch，RS)。RS具有降血糖、降血脂、促进肠道健康及促进矿物质的消化和吸收等重要生理功能。高RS饮食者与低RS饮食者相比，具有较少的胰岛素反应，这对糖尿病患者控制餐后血糖值有很大益处，尤其对于非胰岛素依赖性病人，通过摄食高RS食物，可延缓或抑制餐后血糖上升，有效改善糖尿病人的病情。
基于表型选择的常规育种方法存在选择效率低和育种周期长等缺点，迫切需要注入现代分子技术手段，辅之于高效率地基因型定向选择，才能快速高效地培育出优异水稻新品种。随着分子生物学和基因组学的迅速发展，分子标记技术的应用更加广泛。基于PCR的分子标记如微卫星或SSR(simple sequence repeat)等具有多态率高、相对稳定、检测方法简便快速及易于操作等特点而被广泛的应用。由于分子标记辅助选择不易受环境因素影响和性状显隐性干扰等，可以从分子水平定向选择目标性状基因，同时还有可能打破不利基因之间的连锁而高效率地聚合多个优良基因于一体。通常所说的分子标记既包括目标基因的连锁标记也包括目标基因自身功能标记。分子标记辅助多基因聚合育种技术已经成为水稻、玉米等作物育种研究的一种发展趋势，运用该技术能否有效地将优质、多抗和高产等基因聚合到少数骨干品种中，关键在于能否获得与目标性状基因或主效QTL紧密连锁的实用分子标记。
中国专利201210266649.9定位了控制水稻RS含量的主效基因sbe-rs，该突变基因在对应于水稻淀粉分支酶SBE3基因第16外显子的第105位出具有T→C的碱基突变，并且针对该位点开发了一个CAPS功能分子标记，为通过分子标记辅助选择技术活转基因手段培育高RS含量的高产水稻新品种提供理论和技术指导。
但是，由于CAPS分子标记设计到先PCR反应后用限制性内切酶Spel酶切步骤，所以使用起来存在步骤繁琐，费用昂贵等一系列弊端，因此，建立一种新的基于PCR技术的基因分型方法来快速、准确地鉴定水稻高抗性淀粉突变体基因sbe3-rs基因型已成为目前抗性淀粉育种应用中亟待解决的技术难题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种与水稻高抗性淀粉含量基因sbe3-rs紧密连锁的分子标记、扩增该分子标记的引物对以及检测水稻高抗性淀粉含量基因sbe3-rs的方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种与水稻高抗性淀粉含量基因sbe3-rs紧密连锁的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示或SEQID NO：2所示。
一种扩增上述分子标记的引物对，包括引物1和引物2，所述引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
一种检测水稻高抗性淀粉含量基因sbe3-rs的方法，包括如下步骤：
(1)PCR扩增：以从待测水稻中提取的基因组DNA作为DNA扩增模板，以SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列组成为扩增引物对进行PCR扩增；
(2)扩增产物的鉴定：若所得PCR扩增产物为241bp碱基片段，则待测水稻为高抗性淀粉品种，若所得PCR扩增产物为246bp碱基片段，则待测水稻为不含高抗性淀粉含量基因sbe3-rs品种。
进一步地，步骤(2)中，所述241bp碱基片段为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述246bp碱基片段为SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
进一步地，步骤(1)中，从待测水稻中提取的基因组DNA的提取方法为碱煮法，具体步骤为：取1/10的水稻籽粒胚乳，加入40ml的0.2Mol/L的氢氧化钠水溶液，在100℃条件下水浴3分钟，再加入60ml的0.17Mol/L的tris-HCL，在100℃条件下水浴1分钟。
进一步地，步骤(1)中，PCR扩增的反应体系为：含Mg2+的10X Buffer 2μl，10mM的dNTP 0.4μl，5μM的如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列和5μM的如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列各2μl，从待测水稻中提取的基因组DNA 1μl，5U/μl的taq酶0.5μl，其余为超纯水，反应体积为20μl，滴加一滴矿物油覆盖；PCR扩增的反应程序为：94℃5min；94℃60s、53.5℃60s，72℃60s，35个循环；72℃10min。
本发明还提供上述分子标记、引物对以及检测水稻高抗性淀粉含量基因sbe3-rs的方法在水稻育种中的应用。
本发明的有益效果体现在：
本发明分子标记位于高抗性淀粉突变体基因sbe3-rs的内部，与水稻高抗性淀粉含量基因sbe3-rs紧密连锁，与非基因内部标记相比，本发明分子标记不会出现分离，可以更有效地提高育种效率。
本发明引物对可以很好地扩增经过简单处理所得到的从待测水稻中提取的基因组，克服了现有技术中与该基因紧密连锁的其他分子标记无法扩增经过简单处理所得到的从待测水稻中提取的基因组的问题，获得本发明检测水稻高抗性淀粉含量基因sbe3-rs的方法，该本发明方法能够对播种前的水稻种粒进行快速基因鉴定筛选，然后有选择性地播种，减少用工用地，缩短育种周期，进一步提高育种效率。
本发明检测水稻高抗性淀粉含量基因sbe3-rs的方法克服了常规育种中因表型选择而导致育种效率低等问题，同时可取代专利201210266649.9中使用酶切的方案，可以利用本发明引物对对水稻高抗性淀粉突变体基因sbe3-rs进行早期世代选择而缩短育种周期，从而较快地筛选出高抗性淀粉突变体基因sbe3-rs的水稻材料。本发明可应用于水稻育种，以提高育种效率。
附图说明
图1是SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列组成的引物对扩增高抗性淀粉突变体基因sbe3-rs和不含高抗性淀粉突变体基因sbe3-rs品种后，扩增产物碱基片段对比图。
图2是SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列组成的引物对扩增高抗性淀粉突变体基因sbe3-rs品种降糖稻1号和不含高抗性淀粉突变体基因sbe3-rs品种FD1710以及两者杂交种的电泳图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均由常规生化试剂公司购买得到。
实施例1
高抗性淀粉突变体基因sbe3-rs性状鉴定专用引物对SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的获得
1.1双亲基因组扩增
用于创建水稻重组自交系(recombinant inbred line，RIL)群体的双亲分别是降糖稻1号4和安徽丰大种业股份有限公司选育的FD1710。FD1710为母本，不含高抗性淀粉突变体基因sbe3-rs；降糖稻1号为父本，含高抗性淀粉突变体基因sbe3-rs。
采用CTAB法提取双亲叶片的基因组DNA，以NCBI上公布的sbe3-rs序列(网址)设计引物对，由SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列组成，委托北京梓熙生物公司合成后，进行PCR扩增实验。PCR扩增的反应体系为：10X Buffer2μl(含Mg2 +)，dNTP 0.4μl(10mM)，SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列各2μl(5μM)，基因组DNA 1μl(40ng/μl)，taq酶0.5μl(5υ/μl)，其余为超纯水，反应体积为20μl，滴加一滴矿物油覆盖；PCR扩增的反应程序为:94℃5min；94℃60s，53.5℃60s，72℃60s，35个循环；72℃10min。
PCR扩增产物送去测序，测序公司为北京梓熙生物公司，测序结果在NCBI网站的在线比对结果见图1。图中虚线区域表示5bp的缺失，其中query是降糖稻1号，含高抗性淀粉突变体基因sbe3-rs的序列；sbjct是FD1710，不含高抗性淀粉突变体基因sbe3-rs的序列。
1.2引物合成和验证
根据图1的测序比对结果，在跨越两个序列有5bp插入缺失差异区域设计引物，上游引物为SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，下游引物为SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。委托北京梓熙生物公司合成。上游引物和下游引物(将该引物对命名为QK1)位于基因sbe3-rs内部区域。
利用新合成的引物扩增降糖稻1号和FD1710，以及两者的杂交种。采用碱煮法从待测水稻中提取基因组DNA，具体步骤为：取1/10的水稻籽粒胚乳，加入40ml的0.2Mol/L的氢氧化钠水溶液，在100℃条件下水浴3分钟，再加入60ml的0.17Mol/L的tris-HCL，在100℃条件下水浴1分钟，即提取得到待测水稻的基因组DNA，4℃冰箱冷却备用。
PCR扩增的反应体系为：10X Buffer 2μl(含Mg2+)，dNTP 0.4μl(10mM)，上游引物和下游引物各2μl(5μM)，从待测水稻中提取的基因组DNA1μl，taq酶0.5μl(5U/μl)，反应体积为20μl，滴加一滴矿物油覆盖；PCR扩增的反应程序为：94℃5min；94℃60s，53.5℃60s，72℃60s，35个循环；72℃10min。
PCR扩增产物用6％聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，快速银染法染色并观察拍照，见图2，图中降糖稻1号、FD1710和杂交种每个材料各3个重复，M大小为250bp。对PCR扩增产物进行测序，从扩增产物的电泳图可以清晰地看出，降糖稻1号有一条电泳带，经测序所述电泳带对应的扩增产物为241bp碱基片段，为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；FD1710有一条电泳带，经测序所述电泳带对应的扩增产物为246bp碱基片段，为SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；杂交品种有二条电泳带，经测序所述电泳带对应的扩增产物为241bp和246bp碱基片段，为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和序列表SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
实施例2
QK1的扩增产物与水稻高抗性淀粉含量性状的相关性验证
以含高抗性淀粉突变体基因sbe3-rs的降糖稻1号和不含抗性淀粉突变体基因sbe3-rs的FD1710做亲本，两者杂交后的285个F2代材料为试验对象。采用碱煮法从待测水稻中提取基因组DNA，具体步骤同与实施例1。以QK1进行PCR扩增实验。PCR扩增的反应体系为：10X Buffer 2μl(含Mg2+)，dNTP 0.4μl(10mM)，SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列和SEQ IDNO：4所示的核苷酸序列各2μl(5μΜ)，待测水稻提取的基因组DNA 1μl，taq酶0.5μl(5U/μl)，反应体积为20μl，滴加一滴矿物油覆盖；PCR扩增的反应程序为：94℃5min；94℃60s，53.5℃60s，72℃60s，35个循环；72℃10min。
PCR扩增产物用6％聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，快速银染法染色并观察拍照记录,其中纯合的241bp的80株，纯合246bp的64株，杂合带型的171株。
RS含量测定：应用RS含量测定试剂盒(Megazyme，Co.Wicklow,Ireland)进行测定，方法略有改进。具体步骤为：准确称取100mg米粉样品，小心放入带螺旋盖的塑料管中，依次加入a-胰淀粉酶反应液和淀粉葡萄糖苷酶(AGM)，37℃震荡孵育16h，非RS被溶解，水解成D-葡萄糖；孵育结束后加入99％乙醇终止反应；离心上述溶液，弃上清，底部残留絮状图即为样品中的RS，再用50％乙醇洗涤沉淀；倒置离心管，沉淀干燥后用2mol/L氢氧化钠溶解沉淀，并加入AGM，置于60℃水浴中孵育1h，最后用D-葡萄糖用葡糖氧化酶/过氧化物酶试剂测定葡萄糖含量，并计算RS含量。其中单株RS含量大于3％的归位高RS含量单株，RS含量低于3％归位低RS含量。
分析如下：如下表1所示，供试水稻样本中存在纯合241bp的80株，70株RS含量高，10株低；而不带有246bp片段的64个材料中60RS株含量低，4株高；杂合的171株，152株RS含量低，19株高；两者的一致性达到90.5％。因此，可以得出结论，SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列组成的引物对是与水稻高抗性淀粉含量性状相关位点相紧密连锁的分子标记，可用于水稻分子辅助育种。
表1 PCR扩增产物鉴定结果与试剂盒检测试验对照
应当理解本文所述的例子和实施方式仅为了说明，并不用于限制本发明，本领域技术人员可根据它做出各种修改或变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
序列表
<110>安徽丰大种业股份有限公司
<120>一种与水稻高抗性淀粉含量基因sbe3-rs紧密连锁的分子标记、引物及其应用
<160>6
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>241
<212>DNA
<213>水稻（Zea mays L.）
<220>
<221>gene
<222>（1）..（241）
<223>
<400>1
actggatgtg ttggttgctg aactgcaaaa taatttatgt tgctttctat caggtggtct 60
tggactcaga tgctggactc tttggtggat ttggcaggat ccatcacact gcagagcact 120
tcactgccgt aagtcttgct cagatgaaat tgcgtaccgt atattgtgtg ctctttatta 180
acctctgttg tgctcattcc ttgcaggatt gttcacatga caacaggccc tactcgttct c 241
<210>2
<211>274
<212>DNA
<213>水稻（Zea mays L.）
<220>
<221>gene
<222>（1）..（246）
<223>
<400>2
actggatgtg ttggttgctg aactgcaaaa taatttatgt tgctttctat caggtggtct 60
tggactcaga tgctggactc tttggtggat ttggcaggat ccatcacact gcagagagca 120
ccacttcact gccgtaagtc ttgctcagat gaaattgcgt accgtatatt gtgtgctctt 180
tattaacctc tgttgtgctc attccttgca ggattgttca catgacaaca ggccctactc 240
gttctc 246
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>primer_bind
<222>（1）..（20）
<223>
<400>3
actggatgtg ttggttgctg 20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>primer_bind
<222>（1）..（20）
<234>
<400>4
gagaacgagt agggcctgtt 20
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>primer_bind
<222>（1）..（20）
<223>
<400>5
tagtcctagg tctggatcct 20
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>primer_bind
<222>（1）..（20）
<234>
<400>6
cagaagtgca gaactatgta 20
Claims (5)
1.一种与水稻高抗性淀粉含量基因sbe3-rs紧密连锁的插入缺失分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。
2.如权利要求1所述的分子标记在筛选含有高抗性淀粉含量基因sbe3-rs的水稻中的应用。
3.一种检测水稻高抗性淀粉含量基因sbe3-rs的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）PCR扩增：以从待测水稻中提取的基因组DNA作为DNA扩增模板，以SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列组成为扩增引物对进行PCR扩增；
（2）扩增产物的鉴定：若所得PCR扩增产物为241bp碱基片段，则待测水稻为高抗性淀粉品种，若所得PCR扩增产物为246bp碱基片段，则待测水稻为不含高抗性淀粉含量基因sbe3-rs品种，所述241bp碱基片段为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述246bp碱基片段为SEQID NO：2所示的核苷酸序列。
4.如权利要求3所述的检测水稻高抗性淀粉含量基因sbe3-rs的方法，其特征在于，步骤（1）中，从待测水稻中提取的基因组DNA的提取方法为碱煮法，具体步骤为：取1/10的水稻籽粒胚乳，加入40ml的0.2mol /L的氢氧化钠水溶液，在100℃条件下水浴3分钟，再加入60ml的0.17mol /L的tris-HCl ，在100℃条件下水浴1分钟。
5.如权利要求3或4所述的检测水稻高抗性淀粉含量基因sbe3-rs的方法，其特征在于，步骤（1）中，PCR扩增的反应体系为：含Mg2+的10×Buffer 2μl，10mM的dNTP 0.4μl，5μM的如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列和5μM的如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列各2μl，从待测水稻中提取的基因组DNA 1μl，5U/μl的taq酶0.5μl，其余为超纯水，反应体积为20μl，滴加一滴矿物油覆盖；PCR扩增的反应程序为：94℃5min；94℃60s、 53.5℃60s，72℃60s， 35个循环；72℃10min。
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