CN102550415A - 一种高抗性淀粉含量水稻的培育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高抗性淀粉含量水稻的培育方法，步骤包括：取直链淀粉含量20%～25%水稻品种的成熟胚为外植体，诱导愈伤组织，继代培养至成倍增殖期，暗条件预培养，进行农杆菌共培养转化，转移到筛选培养基进行3轮筛选，取抗性愈伤组织诱导分化成苗，对抗性植株进行标记基因组织化学染色和筛选基因分子检测，鉴定含目的基因ISA1插入序列的分化小苗，对入选的转基因植株进行抗性淀粉含量检测，选留抗性淀粉含量高于10%的转基因植株，继续种植评价抗性淀粉含量的表达稳定性，繁殖抗性淀粉含量稳定高于10%的优良株系，最终培育出高抗性淀粉含量水稻。本发明的高抗性淀粉水稻，可用于糖尿病专用产品的开发，对糖尿病人群实施饮食疗法具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种高抗性淀粉含量水稻的培育方法。
背景技术
据卫生部的统计，2010年我国糖尿病患者约9200万人，占我国总人口的9.3%，耐糖量低人群更是高达1.42亿人。
糖尿病等血液系统慢性疾病正在呈现出快速增长、向农村蔓延、低龄化的演变趋势，越来越严重地影响着人类社会的生存和发展（第一大生命杀手，严重影响生命质量，年医疗费用高达千亿元），而且目前尚无根治之法。
医学研究表明：除遗传因素外，糖尿病等血液系统慢性疾病主要起因于日常饮食起居等生活习惯，而高糖、高脂肪、高蛋白的饮食结构则是罪魁祸首，尤其是高糖这一“元凶”。稻米主食“高糖”的核心在于可消化淀粉的比例过高（导致贪食、肥胖和高血糖），而抗性淀粉的比例过低（目前一般籼稻米的抗性淀粉含量仅为1%，粳稻的含量仅有0.1%，而达到现代人健康需求的含量应为10%）。
因此，依照我国传统 “药食同源”、“寓药于食” 的理念，预防糖尿病等高危慢性病的发生，改进病患者生活质量的重要途径是改善一日三餐的大米营养构成，而培育满足人们健康需求的美味口感与功能性水稻品种则是这一途径的根本。高抗性淀粉含量专用水稻品种选育与开发是吃出健康的关键和核心。抗性淀粉的形成，不仅与水稻本身的直连淀粉含量有关，且与支链淀粉的链长结构密切相关。淀粉去分支酶基因ISA是调控淀粉合成的关键酶，可以优化支链淀粉链长的精细结构，实现显著提高抗性淀粉的含量。
正是在上述背景下，本发明提出一种高抗性淀粉含量水稻的培育方法，旨在选用中等直链淀粉含量籼稻为基础，通过淀粉去分支酶基因优化调控支链淀粉的链长结构，培育获得高抗性淀粉含量水稻，用于糖尿病专用产品的开发，这对糖尿病人群实施饮食疗法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高抗性淀粉含量水稻的培育方法，以获得高抗性淀粉含量水稻，用于糖尿病专用产品的开发，实施饮食疗法从源头预防和控制糖尿病。
本发明的高抗性淀粉含量水稻的培育方法，包括以下步骤：
1）取直链淀粉含量20%～25%水稻品种的成熟胚为外植体，接种至诱导培养基，在25±1℃、光强3000勒克司光条件下诱导形成愈伤组织；
2）将诱导形成2周的愈伤组织，转移至继代培养基，继代培养至愈伤组织进入成倍增殖期；
3）将成倍增殖的愈伤组织，在25±1℃避光的黑暗条件下进行受体愈伤组织的预培养2天；
4）将经过预培养的愈伤组织，在农杆菌悬浮液中浸泡10分钟，之后弃去菌液，用无菌滤纸吸干，接种于共培养基上，在25±1℃避光的黑暗条件下共培养2天；
5）将上述共培养愈伤组织，洗净、晾干后，转移到筛选培养基，在25±1℃避光的黑暗条件下培养6周，收集新长出的抗性愈伤组织，转移至新的筛选培养基上，再进行连续2轮继代筛选，每隔3周转继１次；
6）取3轮筛选后的抗性愈伤组织，转移至分化培养基，在25±1℃、光强3000勒克司光条件下诱导分化成苗，对抗性植株进行组织化学染色和分子检测，选留含目的基因插入序列的转基因植株，所说的目的基因插入序列是指目的基因淀粉分支酶基因ISA1、标记基因葡糖苷酸酶基因GUS和筛选基因抗潮霉素基因HPT的插入序列，目的基因淀粉分支酶基因ISA1片段长570bp；
7）取入选的转基因植株，田间种植后收获种子，测定抗性淀粉含量，选留抗性淀粉含量高于10%的转基因植株；
8）继续种植步骤7）筛选的转基因株系，评价抗性淀粉含量的表达稳定性，繁殖抗性淀粉含量稳定高于10%的优良株系，为培育的高抗性淀粉含量水稻。
本发明中，所说的诱导培养基为N6基本培养基添加2,4-D1.5mg、蔗糖30g和琼脂粉6.8g，pH灭菌前5.8。
本发明中，所说的继代培养基为N6基本培养基添加2,4-D 1mg蔗糖30g和琼脂粉6.8g，pH灭菌前5.8。
本发明中，所说的共培养基为N6基本培养基添加2,4-D 0.5mg、乙酰丁香酮1mg、蔗糖30g和琼脂粉6.8g，pH灭菌前5.8。
本发明中，所说的筛选培养基为N6基本培养基添加2,4-D 0.5mg、潮霉素30mg、羧卞300 mg、蔗糖30g和琼脂粉6.8g，pH灭菌前5.8。
本发明中，所说的分化培养基为N6基本培养基添加6-BA1mg、NAA0.5mg、KT0.5mg、羧卞200mg、蔗糖30g和琼脂粉6.8g，pH灭菌前5.8。
上述的N6基本培养基为KNO3 2830mg、(NH4)2SO4 463mg、CaCl2·2H2O 166mg、MgSO4·7H2O 185mg、KH2P04 400mg、MnSO4·4H2O 4.4mg、ZnSO4·7H2O 1.5mg、FeSO4·7H2O 27.8mg、Na2-EDTA·2H2O 37.3mg、H3BO3 1.6mg、肌醇100mg、烟酸0.5mg、维生素B6 0.5mg、维生素B1 0.5mg和甘氨酸2mg。
本发明中，所说的农杆菌的菌株为EHA105，内含质粒pCAM1305，pCAM1305的T-DNA区域携带目的基因插入序列，包括目的基因淀粉分支酶基因ISA1、标记基因葡糖苷酸酶基因GUS和筛选基因抗潮霉素基因HPT。目的基因淀粉分支酶基因ISA1片段长570bp，与玉米启动子Ubi-1和nos终止子共同构成表达框架。菌株为EHA10方便购买或赠送获得，在一般植物遗传实验室均有保存，参见文献吴关庭等，中国农业科学，2005，38(12)：2395-2402。
上述的标记基因葡糖苷酸酶基因GUS的组织化学染色方法参见Rueb和Hensgens. Rice Genetics Newsletters, 1989, (6): 168-169，筛选基因抗潮霉素基因HPT的分子检测方法参见文献吴关庭等，中国农业科学，2005，38(12)：2395-2402。
本发明中，所说的抗性淀粉含量检测方法，参见文献杨朝柱等，中国水稻科学，2005，19(6): 516-520。
上述的稳定性是指入选水稻中抗性淀粉含量在不同年份间（2年以上）、季节间（2季以上）以及地点间（2个地点以上）的含量变化不显著。
本发明的高抗性淀粉含量水稻，具有以下优点：
本发明首先利用ISA转基因，优化调控直链淀粉含量20%~25%水稻的支链淀粉的链长结构，培育出高抗性淀粉含量水稻。高抗性淀粉含量水稻可用于糖尿病专用产品的开发，对糖尿病人群实施饮食疗法具有重要意义。
附图说明
图1是本发明所用的目的基因ISA插入序列的载体构建示意图。
具体实施方式
以下通过具体实例进一步说明本发明。
实施例1：
以取直链淀粉含量24.5%水稻品种“浙恢7954”的成熟胚为外植体，接种至诱导培养基，在25±1℃、光强3000勒克斯光条件下诱导形成愈伤组织；
取诱导形成2周的愈伤组织，转移至继代培养基，继代培养至愈伤组织进入成倍增殖期；
取成倍增殖的愈伤组织，在25±1℃、避光的黑暗条件下进行受体愈伤组织的预培养2天；
取经过预培养的愈伤组织（约300个培养皿，含1500块以上的愈伤组织），在农杆菌悬浮液中浸泡10分钟，之后弃去菌液，用无菌滤纸吸干，接种于共培养基上，在25±1℃、避光的黑暗条件下共培养2天；
取上述共培养愈伤组织，洗净、晾干后，转移到筛选培养基，在25±1℃、避光的黑暗条件下培养6周，收集新长出的抗性愈伤组织（约160块愈伤组织），转移至新的筛选培养基上，再进行连续2轮继代筛选，每隔3周转继１次；
取3轮筛选后的抗性愈伤组织（约40块愈伤组织），转移至分化培养基，在25±1℃、光强3000勒克斯光条件下诱导分化成苗69株，对抗性植株进行标记基因GUS组织化学染色和筛选基因HPT分子检测，选留含目的基因ISA1插入序列的转基因植株69株，目的基因插入序列的载体构建如图1所示。
取入选的转基因植株，田间种植后收获种子，进行抗性淀粉含量检测，选留抗性淀粉含量高于10%的转基因植株16株；继续种植转基因株系；
2008-2010连续3年，分别在浙江杭州（春季）、浙江富阳（夏季）、海南陵水（冬季）三地三季评价抗性淀粉含量的表达稳定性，繁殖抗性淀粉含量稳定高于10%的优良株系，最终培育高抗性淀粉含量水稻5个，T-RS-1、T-RS-2、T-RS-3、T-RS-4、T-RS-5，其抗性淀粉含量分别为10.5%、11.2%、12.7%、14.1%、19.5%，而原中等直链淀粉含量水稻品种“浙恢7954”的抗性淀粉含量分别为0.9%。
Claims (7)
1. 一种高抗性淀粉含量水稻的培育方法，包括以下步骤：
1）取直链淀粉含量20%～25%水稻品种的成熟胚为外植体，接种至诱导培养基，在25±1℃、光强3000勒克司光条件下诱导形成愈伤组织；
2）将诱导形成2周的愈伤组织，转移至继代培养基，继代培养至愈伤组织进入成倍增殖期；
3）将成倍增殖的愈伤组织，在25±1℃避光的黑暗条件下进行受体愈伤组织的预培养2天；
4）将经过预培养的愈伤组织，在农杆菌悬浮液中浸泡10分钟，之后弃去菌液，用无菌滤纸吸干，接种于共培养基上，在25±1℃避光的黑暗条件下共培养2天；
5）将上述共培养愈伤组织，洗净、晾干后，转移到筛选培养基，在25±1℃避光的黑暗条件下培养6周，收集新长出的抗性愈伤组织，转移至新的筛选培养基上，再进行连续2轮继代筛选，每隔3周转继１次；
6）取3轮筛选后的抗性愈伤组织，转移至分化培养基，在25±1℃、光强3000勒克司光条件下诱导分化成苗，对抗性植株进行组织化学染色和分子检测，选留含目的基因插入序列的转基因植株，所说的目的基因插入序列是指目的基因淀粉分支酶基因ISA1、标记基因葡糖苷酸酶基因GUS和筛选基因抗潮霉素基因HPT的插入序列，目的基因淀粉分支酶基因ISA1片段长570bp；
7）取入选的转基因植株，田间种植后收获种子，测定抗性淀粉含量，选留抗性淀粉含量高于10%的转基因植株；
8）继续种植步骤7）筛选的转基因株系，评价抗性淀粉含量的表达稳定性，繁殖抗性淀粉含量稳定高于10%的优良株系，为培育的高抗性淀粉含量水稻。
2. 根据权利要求1所述的高抗性淀粉含量水稻的培育方法，其特征在于所说的诱导培养基为N6基本培养基添加2,4-D1.5mg、蔗糖30g和琼脂粉6.8g，pH灭菌前5.8。
3. 根据权利要求1所述的高抗性淀粉含量水稻的培育方法，其特征在于所说的继代培养基为N6基本培养基添加2,4-D 1mg、蔗糖30g和琼脂粉6.8g，pH灭菌前5.8。
4. 根据权利要求1所述的高抗性淀粉含量水稻的培育方法，其特征在于所说的共培养基为N6基本培养基添加2,4-D 0.5mg、乙酰丁香酮1mg、蔗糖30g、和琼脂粉6.8g，pH灭菌前5.8。
5. 根据权利要求1所述的高抗性淀粉含量水稻的培育方法，其特征在于所说的筛选培养基为N6基本培养基添加2,4-D 0.5mg、潮霉素30mg、羧卞300 mg、蔗糖30g和琼脂粉6.8g，pH灭菌前5.8。
6. 根据权利要求1所述的高抗性淀粉含量水稻的培育方法，其特征在于所说的分化培养基为N6基本培养基添加6-BA1mg、NAA0.5mg、KT0.5mg、羧卞200mg、蔗糖30g和琼脂粉6.8g，pH灭菌前5.8。
7. 根据权利要求2-6所述的高抗性淀粉含量水稻的培育方法，其特征在于所说的N6基本培养基为KNO3 2830mg、(NH4)2SO4 463mg、CaCl2·2H2O 166mg、MgSO4·7H2O 185mg、KH2P04 400mg、MnSO4·4H2O 4.4mg、ZnSO4·7H2O 1.5mg、FeSO4·7H2O 27.8mg、Na2-EDTA·2H2O 37.3mg、H3BO3 1.6mg、肌醇100mg、烟酸0.5mg、维生素B6 0.5mg、维生素B1 0.5mg和甘氨酸2mg。
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