CN115152617B - 一种高抗性淀粉含量、耐高低温籼稻品种的选育方法及其应用 - Google Patents

一种高抗性淀粉含量、耐高低温籼稻品种的选育方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于作物育种领域，涉及水稻育种，特别是指一种高抗性淀粉含量、耐高低温籼稻品种的选育方法及其应用。本发明采用筛选到的抗性淀粉含量高于5%的籼稻材料进行杂交，在F5至F9世代各世代逐代交替在高温、低温胁迫条件下进行结实率选择，选育抗性淀粉含量高于8%且耐高低温的籼稻品种，针对性强，是高抗性淀粉含量和耐高低温优异性状的有效聚合。培育的高抗性淀粉含量、耐高低温籼稻品种能满足我国糖尿病、肥胖患者等特殊群体对稻米的需求，同时能增加水稻产品的附加值，具有较大的应用价值。

Description

一种高抗性淀粉含量、耐高低温籼稻品种的选育方法及其 应用
技术领域
本发明属于作物育种领域，涉及水稻育种，特别是指一种高抗性淀粉含量、耐高低温籼稻品种的选育方法及其应用。
背景技术
随着生活水平的提高，我国糖尿病、肥胖患者人数越来越多，该部分人群对饮食有着特殊的要求，需食用高抗性淀粉含量的食品。抗性淀粉（RS）作为一种新型的膳食纤维，食用后不会被健康人体小肠所吸收，但却能够进入大肠，被大肠中的细菌发酵利用的一种具有酶抗性的淀粉。RS能够降低血脂含量、控制胰岛素水平、预防糖尿病的发生；具有较强的饱腹作用，能够有效的降低体重；且抗性淀粉能够被细胞菌群发酵，产生短链脂肪酸，可减少结肠癌的发病率。自古就有“药食同源、药食同用”的理论，可通过日常饮食调节生理机能和预防疾病。我国约60%的人口以大米为主食，但稻米中的抗性淀粉含量普遍较低，因此筛选高抗性淀粉含量水稻种质资源（材料），选育高抗性淀粉含量水稻新品种对满足特殊群体需求，增加水稻产品附加值，推动水稻产业结构性供给侧改革具有重要意义。
专利CN106900539A公开了一种高抗性淀粉和高锌聚合的粳稻选育方法，该方法以抗性淀粉含量为10％以上的籼稻品种为亲本I，以锌含量为30mg/kg以上的粳稻品种为亲本II；专利CN108967185A公开了一种优质抗稻瘟病强优势籼稻恢复系的选育方法，利用分子标记检测后代群体中单株的抗稻瘟病基因Pi2、Pi54、Pid3、Pita和Pib(亲本一含有的抗稻瘟病基因)，用稻谷手工脱壳器考察后代群体中单株的外观品质，以亲本二作对照，综合稻瘟病抗性鉴定结果、外观品质鉴定结果和农艺性状选择，选育出新的优质抗稻瘟病强优势恢复系；现有的研究中用于提高水稻抗性淀粉含量、选育优势水稻品种的方法多是针对粳稻的。目前籼稻品种的选育越来越优质化，直链淀粉含量有逐步下降的趋势，现有籼稻品种的抗性淀粉含量普遍偏低。水稻生长季节常常会受到各种不良气候的侵害，高低温是影响水稻产量和品质的关键环境因子，近年来异常气候频发，已严重影响水稻的安全生产。因此选育高抗性淀粉含量且耐高低温的籼稻品种是水稻育种的热点问题之一。
目前有关籼稻抗性淀粉含量筛选大多是采用分子标记法筛选，稻米抗性淀粉含量高效、稳定的测定方法和高抗性淀粉含量且抗逆性强的籼稻品种的选育方法还研究较少，本课题组长期致力于优势籼稻品种的选育，为了选育高抗性淀粉含量、耐高低温籼稻品种进行了长期的探索。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提出一种高抗性淀粉含量、耐高低温籼稻品种的选育方法及其应用。
本发明的技术方案是这样实现的：
（1）对收集的籼稻种质资源（材料）依据国家标准GB/T 15683-2008进行稻米直链淀粉含量测定，筛选直链淀粉含量高于20%的籼稻种质资源（材料）进行稻米抗性淀粉含量测定。
（2）优化后的稻米抗性淀粉含量测定方法为：
1）将待测样品粉碎，过100目筛，与抗性淀粉含量为39%的标样一起在密闭容器内平衡水分3天以上，测定样品水分含量；准确称取样品米粉100mg（±5mg）于15 ml离心管中，2次重复；
2）加入4 mL现配的Megazyme胰a-淀粉酶悬浮液（胰α-淀粉酶悬浮液包含终浓度30U/mL胰α-淀粉酶和终浓度3 U/mL淀粉葡萄糖苷酶原液，购自Megazyme公司）；旋紧试管，置于旋涡振荡器混匀，卧式放入水浴摇床，方向与摇床运动方向平行，于37℃±0 .5℃水温准确振荡16 h；振荡完毕后，取出样品，擦干离心管外部水分，加入4 ml无水乙醇涡旋混匀，1500g离心10min（不加盖），倒掉上清液，加入2.0 mL 50%乙醇溶液，重悬浮，旋涡振荡器振荡，再加入6.0 mL 50%乙醇溶液混匀，1500g离心10min，倒掉上清液。由于样品中的抗性淀粉含量均较低，不再重复上述重悬浮和离心的步骤；标样的抗性淀粉含量高，重复上述重悬浮和离心的步骤。倒掉上清液后离心管倒置10 min，用滤纸吸掉多余的液体。
3）将试管置于冰水中，放入磁力搅拌棒并加入2.0 mL浓度为2 mol/L氢氧化钾溶液，在冰水状态搅拌20 min后，边搅拌边向各个试管中按顺序加入8.0 mL乙酸钠缓冲液（pH=3.8）和0.1 mL的浓度为3300 U/mL淀粉葡萄糖苷酶原液，混匀。取出试管后，于50℃±0 .5℃水浴30 min，期间两次取出试管涡旋振荡后迅速放回水浴中。对于抗性淀粉含量≥10%的样品，用水将试管里的样品转移至100 ml容量瓶中加水定容置刻度线；对于含量＜10%的样品则直接进行离心；
4）吸取0.1 ml的离心上清液于玻璃试管中，加入3 ml GOPOD混合，50℃±0 .5℃水浴20 min后取出，放置5 min，进行测定，同时制备D-葡萄糖标准比色溶液、空白溶液与样品和标样进行吸光值的检测；其中GOPOD-氨基安替比林混合液pH为7.4，含有终浓度12 000U/L的葡萄糖氧化酶、终浓度650 U/L过氧化物酶、0.4 mmol/L 4-氨基安替比林0.4 mmol/L、0.05mol/L磷酸二氢钾、0.053mol/L氢氧化钠、1.5g/L对羟基苯甲酸和0.05g/L叠氮化钠；D-葡萄糖标准比色溶液包含0.1mL、1.0g/L的D-葡萄糖标准储备液和3.0mLGOPOD-氨基安替比林的混合液；空白溶液为0.1mL 100 mmol/L，pH4.5的乙酸钠缓冲液和3.0mLGOPOD-氨基安替比林的混合液；
5）计算测定样品和标样的抗性淀粉含量，标样的结果在39%±1.95%范围内时，说明本批次测定的结果可靠，超过上述范围则该批次样品重测。
6）抗性淀粉含量计算公式为：
或
；
⊿A：相对于空白试剂的吸光度值； F：从吸光度值到微g的转换，单位为微g，F=100（D-葡萄糖的微g数）/100μgD-葡萄糖在GOPOD反应中的吸光度； m：试样的质量，单位为毫g（mg）；w：样品的水分含量（为小数，不是百分数）。
（3）根据稻米抗性淀粉含量测定的结果，筛选抗性淀粉含量高于5%的籼稻种质资源（材料）。根据杂交亲本的选择原则，选择抗性淀粉含量高于5%的籼稻种质资源（材料）为亲本杂交得到杂种F1；种植F1，选择真杂种混收得到 F2世代；种植F2世代，选性状Ⅰ：株型紧凑、生育期适宜、茎秆粗壮、抗倒性好、穗大粒多、熟色好、抗稻瘟病的单株混收得到F3世代；种植F3世代，选性状Ⅰ：株型紧凑、生育期适宜、茎秆粗壮、抗倒性好、穗大粒多、熟色好、抗稻瘟病的单株收种； F4世代种植多个株行，在优良株行中选性状Ⅱ：叶色、叶形、产量较优单株收种，测定各单株的抗性淀粉含量，留下抗性淀粉含量较高的单株；F5世代种植多个株行，在优良株行中选性状Ⅲ：叶色、叶形、产量较优及高温下结实率高的单株收种，测定各单株的抗性淀粉含量，留下抗性淀粉含量较高的单株；F6世代分株系种植，选性状Ⅳ：株系内整齐一致、株型紧凑、叶片清秀直立、穗大粒多及低温下结实率高的株系收种，测定各株系的抗性淀粉含量，留下抗性淀粉含量较高的株系；F7和F8世代分株系种植，株系农艺性状基本整齐，株系内重点筛选性状Ⅴ：茎秆粗壮、穗大粒多、落粒性适中及高温或低温下结实率高的单株混收种子，测定各株系的抗性淀粉含量，留下抗性淀粉含量高的株系；其中从F5至F9世代各世代逐代交替在高温、低温胁迫条件下进行结实率选择，高温条件为对孕穗期、抽穗期进行连续5天日平均气温在32℃以上或连续5天最高气温在37.5℃以上；低温条件为对孕穗期、抽穗期进行连续3天日平均气温在21℃以下或连续3天最低气温18℃以下；F9世代株系农艺性状已经整齐，重点选状Ⅵ：高温或低温下结实率高、株形好的单株混收种子得到F10世代种子，测定其抗性淀粉含量，如抗性淀粉含量高于8%，即为高抗性淀粉含量水稻品种。
本发明具有以下有益效果：
1、针对稻米抗性淀粉含量的测定方法，发明人进行了以下优化：①增加了样品和标样一起平衡水分和测定水分含量的步骤，以保证样品间水分含量的一致。②由于不同公司生产的胰α-淀粉酶对结果的影响较大，根据利用标样进行对比实验的结果，确定使用Megazyme的胰α-淀粉酶；③由于样品的抗性淀粉含量均较低，反复洗涤影响结果的重复性，减少了样品用50%乙醇溶液洗涤的次数；④为保证不同批次测定结果的可比性，增加了用标样测定结果来评价测定结果可靠性的步骤；⑤抗性淀粉含量计算公式中增加样品水分含量的影响，计算的是干样品中所含的抗性淀粉含量。优化后的稻米抗性淀粉含量测定方法具有重复性更好、准确度更高、结果更加可靠的优点，可有效解决原来方法结果重复性不好、不同批次测定结果差异大、样品水分含量不同对结果影响较大的问题。
2、本发明建立的高抗性淀粉含量、耐高低温籼稻品种的选育方法是在筛选高直链淀粉含量材料的基础上，再测定高直链淀粉含量材料的稻米抗性淀粉含量，减少了抗性淀粉含量的测定数量，由于抗性淀粉含量测定所需的成本和时间大大超过直链淀粉含量测定，因此本发明的方法可大大降低育种成本，提高育种效率。本发明采用筛选到的2个抗性淀粉含量高于5%的籼稻材料进行杂交，在F5至F9世代各世代逐代交替在高温、低温胁迫条件下进行结实率选择，选育抗性淀粉含量高于8%且耐高低温的籼稻品种，针对性强，是高抗性淀粉含量和耐高低温优异性状的有效聚合。培育的高抗性淀粉含量、耐高低温籼稻品种能满足我国糖尿病、肥胖患者等特殊群体对稻米的需求，同时能增加水稻产品的附加值，具有较大的应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为1589份水稻种质资源（材料）直链淀粉含量分布图。
图2为选育的高抗性含量、耐高低温籼稻品种植株照片。
图3为选育的高抗性含量、耐高低温籼稻品种粒型照片。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本申请采用的水稻种质资源，在国家水稻数据中心中均能查询到。
实施例
一种高抗性淀粉含量、耐高低温籼稻品种的选育方法，通过以下方法实施：
对收集的1589份水稻种质资源（材料）依据国家标准GB/T 15683-2008进行稻米直链淀粉含量测定，供试材料直链淀粉含量分布主要集中在8%～15%之间，总计1370份，占总数的86.22%；分布于0～10%有323份；10%～20%有1201份；20%～26%有65份，筛选到直链淀粉含量高于20%的水稻种质资源（材料）65份（见图1）；对这65份水稻种质资源（材料）采用优化后的稻米抗性淀粉含量测定方法测定抗性淀粉含量，其中抗性淀粉含量高于5%的和低于2%的各有5份，抗性淀粉含量在2%～5%之间的有55份；其中Z1682、Z804、Z793、Z965、Z307 5个材料的抗性淀粉含量高于5%，分别为5.05%、5.39%、5.32%、5.74%、7.05%（见表1）。
表1 65份水稻种质资源（材料）的抗性淀粉含量
（2）优化后的稻米抗性淀粉含量测定方法为：
1）将待测样品粉碎，过100目筛，与抗性淀粉含量为39%的标样一起在密闭容器内平衡水分3天以上，测定样品水分含量；准确称取样品米粉100mg（±5mg）于15 ml离心管中，2次重复；
2）加入4 mL现配的Megazyme胰a-淀粉酶悬浮液（胰α-淀粉酶悬浮液包含终浓度30U/mL胰α-淀粉酶和终浓度3 U/mL淀粉葡萄糖苷酶原液，购自Megazyme公司）；旋紧试管，置于旋涡振荡器混匀，卧式放入水浴摇床，方向与摇床运动方向平行，于37℃±0 .5℃水温准确振荡16 h；振荡完毕后，取出样品，擦干离心管外部水分，加入4 ml无水乙醇涡旋混匀，1500g离心10min（不加盖），倒掉上清液，加入2.0 mL 50%乙醇溶液，重悬浮，旋涡振荡器振荡，再加入6.0 mL 50%乙醇溶液混匀，1500g离心10min，倒掉上清液。由于样品中的抗性淀粉含量均较低，不再重复上述重悬浮和离心的步骤；标样的抗性淀粉含量高，重复上述重悬浮和离心的步骤。倒掉上清液后离心管倒置10 min，用滤纸吸掉多余的液体。
3）将试管置于冰水中，放入磁力搅拌棒并加入2.0 mL浓度为2 mol/L氢氧化钾溶液，在冰水状态搅拌20 min后，边搅拌边向各个试管中按顺序加入8.0 mL乙酸钠缓冲液（pH=3.8）和0.1 mL的浓度为3300 U/mL淀粉葡萄糖苷酶原液，混匀。取出试管后，于50℃±0 .5℃水浴30 min，期间两次取出试管涡旋振荡后迅速放回水浴中。对于抗性淀粉含量≥10%的样品，用水将试管里的样品转移至100 ml容量瓶中加水定容置刻度线；对于含量＜10%的样品则直接进行离心；
4）吸取0.1 ml的离心上清液于玻璃试管中，加入3 ml GOPOD混合，50℃±0 .5℃水浴20 min后取出，放置5 min，进行测定，同时制备D-葡萄糖标准比色溶液、空白溶液与样品和标样进行吸光值的检测；其中GOPOD-氨基安替比林混合液pH为7.4，含有终浓度12 000U/L的葡萄糖氧化酶、终浓度650 U/L过氧化物酶、0.4 mmol/L 4-氨基安替比林0.4 mmol/L、0.05mol/L磷酸二氢钾、0.053mol/L氢氧化钠、1.5g/L对羟基苯甲酸和0.05g/L叠氮化钠；D-葡萄糖标准比色溶液包含0.1mL1.0g/L的D-葡萄糖标准储备液和3.0mLGOPOD-氨基安替比林的混合液；空白溶液为0.1mL 100 mmol/L，pH4.5的乙酸钠缓冲液和3.0mLGOPOD-氨基安替比林的混合液；
5）计算测定样品和标样的抗性淀粉含量，标样的结果在39%±1.95%范围内时，说明本批次测定的结果可靠，超过上述范围则该批次样品重测。
6）抗性淀粉含量计算公式为：
⊿A：相对于空白试剂的吸光度值； F：从吸光度值到微g的转换，单位为微g，F=100（D-葡萄糖的微g数）/100μgD-葡萄糖在GOPOD反应中的吸光度； m：试样的质量，单位为毫g（mg）；w：样品的水分含量（为小数，不是百分数）。
（3）本发明提供的优化后的稻米抗性淀粉含量测定方法进行了以下几个方面的优化：
1）考虑了样品间水分含量不一致对结果的影响，增加了样品和标样一起平衡水分和测定水分含量的步骤；
2）由于不同公司生产的胰α-淀粉酶对结果的影响较大，根据利用标样在不同时间进行对比实验的结果，确定使用Megazyme的胰α-淀粉酶（见表2）；
表2 不同公司生产的胰α-淀粉酶对样品抗性淀粉含量的影响
3）由于样品的抗性淀粉含量均较低，反复洗涤影响结果的重复性，减少了样品用50%乙醇溶液洗涤的次数（见表3，4）；
表3 50%乙醇溶液洗涤1次的抗性淀粉含量测定结果
表4 50%乙醇溶液洗涤2次的抗性淀粉含量测定结果
4）为保证不同批次测定结果的可比性，增加了用标样测定结果来评价测定结果可靠性的步骤；
5）抗性淀粉含量计算公式中增加样品水分含量的影响，计算的是干样品中所含的抗性淀粉含量。
（4）根据杂交亲本的选择原则，选择抗性淀粉含量为7.05%的水稻材料Z307（里占/炳1B//R0861）为母本，抗性淀粉含量为5.39%的水稻材料Z804（里占/059B//绍恢093-1）为父本进行杂交得到杂种F1，收种37粒；种植F1，选择真杂种28株混收得到 F2世代；种植F2世代3000株，选株型紧凑、生育期适宜、茎秆粗壮、抗倒性好、穗大粒多、落色好、抗稻瘟病的单株混收得到F3世代；种植F3世代3000株，选株型紧凑、生育期适宜、茎秆粗壮、抗倒性好、穗大粒多、熟色好、抗稻瘟病的单株收种； F4世代种植3176个株行，在优良株行中选叶色、叶形、产量较优的2254个单株收种，测定各单株的抗性淀粉含量，留下抗性淀粉含量较高的789个单株；F5世代种植789个株行，在优良株行中选叶色、叶形、产量较优及高温下结实率高的531个单株收种，测定各单株的抗性淀粉含量，留下抗性淀粉含量较高的117个单株；F6世代种植117个株系，选株系内基本整齐一致、株型紧凑、叶片清秀直立、穗大粒多及低温下结实率高的66个株系收种，测定各株系的抗性淀粉含量，留下抗性淀粉含量较高的37个株系；F7世代种植37个株系，选株系农艺性状基本整齐，株系内重点筛选茎秆粗壮、穗大粒多、落粒性适中及高温下结实率高的单株混收种子，选25个株系收种，测定各株系的抗性淀粉含量，留下抗性淀粉含量高的株系13个；F8世代种植13个株系，选株系农艺性状基本整齐，株系内重点筛选茎秆粗壮、穗大粒多、落粒性适中及低温下结实率高的单株混收种子，选8个株系收种，测定各株系的抗性淀粉含量，连续两年抗性淀粉含量最高的株系当选；F9世代种植F8代中连续两年抗性淀粉含量最高的株系，此时株系农艺性状已经整齐，重点选高温下结实率高、株形好的单株混收种子得到F10世代种子，筛选到抗性淀粉含量高于8%的即为高抗性淀粉含量水稻品种。其中的F5至F9世代各世代逐代交替在高温、低温胁迫条件下进行结实率选择，高温条件为对孕穗期、抽穗期进行连续5天日平均气温在32℃以上或连续5天最高气温在37.5℃以上；低温条件为对孕穗期、抽穗期进行连续3天日平均气温在21℃以下或连续3天最低气温18℃以下。
F9世代的稻米抗性淀粉含量为9.63% ，F10世代的稻米抗性淀粉含量为10.04% 。定向培育包括以下步骤：从F5世代起各世代逐代交替在高温、低温的条件下胁迫选择。在育种过程中，F5、F7代待选的株系，在长沙进行分期播种开展耐高温胁迫选择，即4月10日播种，每隔7天播一期，共播6期，开展孕穗期、抽穗期耐高温胁迫选择，耐高温条件为连续5天日平均气温在32℃以上或连续5天最高气温在37.5℃以上。在育种过程中，F6、F8代待选的株系，在海南进行分期播种开展耐低温胁迫选择，即11月10日开始播种，每隔7天播一期，共播6期，开展孕穗期、抽穗期耐低温胁迫选择，耐低温胁迫选择条件为连续3天日平均气温在21℃以下或连续3天最低气温平均18℃以下。上述可通过实验设备调节室内的试验环境进行耐高低温胁迫选择。
本实施例中，定向培育的高抗性淀粉含量、耐高低温籼稻品种，株高98cm左右，株型紧散适中，茎秆粗壮，分蘖力强，一般单株有效穗9～11个，穗长23cm左右，平均每穗颖花数220个左右，谷粒长9.6mm，长宽比3.7，谷粒饱满，千粒重25g（见图2，3）；在浏阳市大围山稻瘟病鉴定：稻瘟病综合指数 3.8 级，穗瘟损失率最高级5级；白叶枯病抗性5级，纹枯病轻；耐高低温能力较强。
应用例
2016年夏季用以抗性淀粉含量为7.05%的水稻材料（里占/炳1B//R0861）为母本（选育过程见表5），抗性淀粉含量为5.39%的水稻材料（里占/059B//绍恢093-1）为父本（选育过程见表6）进行杂交，经孕穗期、抽穗期耐高低温胁迫选择，抗稻瘟病鉴定和抗性淀粉含量测定，通过5年10代的定向培育，于2021年育成高抗性含量、耐高低温籼稻品种。选育过程如表7所示。
表5抗性淀粉含量为7.05%的水稻材料的选育过程
表6 抗性淀粉含量为5.39%的水稻材料的选育过程
表7高抗性含量、耐高低温籼稻品种的选育过程
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种高抗性淀粉含量、耐高低温籼稻品种的选育方法，其特征在于，步骤如下：
（1）筛选直链淀粉含量高于20%的籼稻种质资源，进行稻米抗性淀粉含量的测定；
（2）筛选经步骤（1）测定后抗性淀粉含量高于5%的籼稻种质资源；
（3）以步骤（2）的抗性淀粉含量高于5%的籼稻种质资源为亲本，经杂交获得杂种F1；
（4）种植杂种F1选择真杂种混收得到F2世代，种植F2世代单株混收性状Ⅰ的F3世代，种植F3世代单株收种性状Ⅰ的F4世代，多株行种植F4世代选择优良株行单株收种性状Ⅱ的F5世代，多株行种植F5世代选择优良株行单株收种性状Ⅲ的F6世代，分株系种植F6世代选性状Ⅳ的株系进行单株混收种子作为F7世代，分株系种植F7世代选性状Ⅴ的株系进行单株混收种子作为F8世代，分株系种植F8世代选性状Ⅴ的株系进行单株混收种子作为F9世代，种植F9世代选性状Ⅵ的株系进行单株混收种子作为F10世代，筛选抗性淀粉含量高于8%的即为高抗性淀粉含量水稻品种；
所述步骤（1）中稻米抗性淀粉含量的测定方法，步骤为：
a. 将待测稻米粉碎、过筛得样品米粉，与抗性淀粉含量为39%的标样一同置于密闭容器内平衡水分3-7天，测定样品米粉的水分含量；
b. 称取步骤a中样品米粉100mg±5mg于15 ml离心管中，加入4 mL现配的胰α-淀粉酶悬浮液，经振荡混匀后37℃±0.5℃水浴准确振荡16 h，然后加入4 mL无水乙醇涡旋混匀，离心后倒掉上清液，再加入2.0 mL 50%乙醇溶液，重悬浮，旋涡振荡，再加入6.0 mL 50%乙醇溶液混匀，离心后倒掉上清液，倒置离心管去除试管内的液体；
c. 向经步骤b处理后的试管内加入2.0 mL氢氧化钾溶液，在冰水状态搅拌20 min后，边搅拌边向各个试管中按顺序加入8.0 mL pH=3.8乙酸钠缓冲液和0.1 mL的淀粉葡萄糖苷酶原液，混匀，取出试管后，于50℃±0.5℃水浴30 min；对于抗性淀粉含量≥10%的样品，用水将试管里的样品转移至100 ml容量瓶中加水定容置刻度线；对于抗性淀粉含量＜10%的样品则直接进行离心；
d. 抗性淀粉含量＜10%的样品离心后取上清液，与3ml GOPOD-氨基安替比林混合液混合，50℃±0.5℃水浴20 min后取出，放置5 min，进行测定，同时制备D-葡萄糖标准比色溶液、空白溶液与样品米粉和标样进行吸光值的检测；
e. 计算测定样品米粉和标样的抗性淀粉含量，标样的结果在39%±1.95%范围内时，说明本批次测定的结果可靠，超过上述范围则该批次样品重测；
所述步骤e中抗性淀粉含量的计算公式为：
或
；
式中：⊿A：相对于空白试剂的吸光度值；F：从吸光度值到μg的转换，单位为μg，F=100（D-葡萄糖的μg数）/100μgD-葡萄糖在GOPOD反应中的吸光度；m：试样的质量，单位为mg；w：样品的水分含量；
所述步骤（4）中性状Ⅰ指株型紧凑、生育期适宜、茎秆粗壮、抗倒性好、穗大粒多、熟色好及抗稻瘟病；性状Ⅱ指叶色、叶形、产量较优及抗性淀粉含量高；性状Ⅲ指叶色、叶形、产量较优、高温下结实率高及抗性淀粉含量高；性状Ⅳ指株系内整齐一致、株型紧凑、叶片清秀直立、穗大粒多、低温下结实率高及抗性淀粉含量高；性状Ⅴ指茎秆粗壮、穗大粒多、落粒性适中及高温、低温下结实率高及抗性淀粉含量高；性状Ⅵ指高温或低温下结实率高、株形好及抗性淀粉含量高于8%；
所述F5世代至F9世代各世代逐代交替在高温胁迫条件、低温胁迫条件下进行结实率选择；
所述高温胁迫条件为对孕穗期、抽穗期进行连续5天日平均气温在32℃以上或连续5天最高气温在37.5℃以上；
所述低温条件为对孕穗期、抽穗期进行连续3天日平均气温在21℃以下或连续3天最低气温18℃以下。
2.根据权利要求1所述的高抗性淀粉含量、耐高低温籼稻品种的选育方法，其特征在于，所述步骤b中胰α-淀粉酶悬浮液pH值为6.0，包含终浓度30 U/mL胰α-淀粉酶和终浓度3U/mL淀粉葡萄糖苷酶原液，购自Megazyme公司。
3.根据权利要求2所述的高抗性淀粉含量、耐高低温籼稻品种的选育方法，其特征在于，所述步骤c中氢氧化钾溶液的浓度为2 mol/L，淀粉葡萄糖苷酶原液的浓度为3300 U/mL；步骤d中GOPOD-氨基安替比林混合液pH为7.4，其中含有终浓度12 000 U/L的葡萄糖氧化酶、终浓度650 U/L过氧化物酶、0.4 mmol/L 4-氨基安替比林0.4 mmol/L、0.05mol/L磷酸二氢钾、0.053mol/L氢氧化钠、1.5g/L对羟基苯甲酸和0.05g/L叠氮化钠；D-葡萄糖标准比色溶液包含0.1mL1.0g/L的D-葡萄糖标准储备液和3.0mLGOPOD-氨基安替比林的混合液；空白溶液为0.1mL 100 mmol/L，pH4.5的乙酸钠缓冲液和3.0mLGOPOD-氨基安替比林的混合液。
4.权利要求1或2或3所述的选育方法在选育高抗性淀粉含量、耐高低温籼稻品种中的应用。
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