CN109689874A - 用于增加水稻中的抗性淀粉和膳食纤维的方法 - Google Patents

用于增加水稻中的抗性淀粉和膳食纤维的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了与适宜水稻品种胚乳中的膳食纤维和抗性淀粉水平增加相关的淀粉合成酶基因的突变。所述膳食纤维和抗性淀粉增加到使水稻谷物的水解指数值显著降低至35‑40％的程度。糖尿病人群对这些水稻品种的需求量很大，并且这些水稻品种提供许多其它健康方面的益处，诸如减少体重增加、心脏健康以及结肠健康。因这一策略并不涉及到使用基因操纵技术，故其可不受任何限制地直接用于水稻育种项目。

Description

用于增加水稻中的抗性淀粉和膳食纤维的方法
技术领域
本发明涉及膳食纤维和抗性淀粉表达增加的水稻植株。具体来说，本发明涉及一种与编码水稻的淀粉分支酶的基因突变相结合来化学诱导编码淀粉合成酶的基因发生突变的方法，通过改变支链淀粉结构导致直链淀粉含量、抗性淀粉以及膳食纤维增加，并且降低水解指数。
背景技术
谷粒，诸如水稻，是人类饮食中的基本食物组分，并且含有重要的营养成分，诸如膳食纤维和碳水化合物。膳食纤维的消耗对消化尤其重要，并且暗示适用于预防或治疗某些疾病，诸如糖尿病、肥胖症以及结肠癌。一般来说，膳食纤维被定义为对人类消化酶的消化作用具有抗性的植物材料残渣，包括非淀粉多糖、抗性淀粉、木质素以及诸如蜡、表皮素和木栓质的微量组分。由于富含膳食纤维的食物对健康具有潜在的好处，因此许多国家推荐增加消耗此类食物作为其膳食指南的一部分。
白米是世界一半以上人群的膳食主食。哈佛大学公共卫生学院的一项新研究表明，常吃白米的人患2型糖尿病的风险会显著升高。他们还发现，食用更多大米的人患糖尿病的几率是食用最少量大米的人的1.5倍以上。这项研究的更严重结果是，一个人每天每食用5.5盎司白米，风险就上升10％。“亚洲国家面临更高风险”，研究人员在研究中写道，此项研究公布在2015年3月发行的《英国医学杂志》上。
白米是一种高度精制的主食谷物，缺少几乎所有的纤维和矿物质。大部分的纤维和矿物质存在于米糠层中，而所述米糠层通过现代碾米和抛光机械被完全去除。因与未抛光或部分抛光的米粒相比，消费者更喜欢精磨的大米，因为其适口性更好，故在现代碾米中普遍采用高度抛光。在健康与适口性之间存在两难问题的情况下，全球食用大米的人群正在寻找一种能够积极解决所述问题的办法。
糖尿病是在发展中国家和发达国家中最常见的内分泌疾病。糖尿病是一种慢性疾病，当胰腺不能产生足够的胰岛素，或者当身体不能有效地利用其产生的胰岛素时，就会发生糖尿病。这导致血液中的葡萄糖浓度增加(高血糖症)。1型糖尿病，以前被称为胰岛素依赖型糖尿病或儿童期发病型糖尿病，其特点是缺乏胰岛素产生，而2型糖尿病，以前被称为非胰岛素依赖型糖尿病或成年发病型糖尿病，是由身体不能有效利用胰岛素而引起的。这是由于体重超标和缺乏运动所致。另一种类型的糖尿病，被称为妊娠期糖尿病，是首次被发现于孕期的高血糖症。
为糖尿病患者制定并实施适当的饮食计划是糖尿病临床管理策略中的重要方式。由于碳水化合物是食物的主要组成部分，也是葡萄糖释放的一个不可缺少的原因，因此目前的糖尿病饮食管理策略侧重于改变人体内的碳水化合物代谢，以实现使葡萄糖缓慢释放到血流中。此策略需要改变食品中的碳水化合物化学成分和组成，以使其在医学上可接受地用于管理糖尿病。
血糖指数(GI)是一种基于其对血糖水平的即时影响进行的碳水化合物排序。快速升高血糖含量的食物具有高的GI值。相反，缓慢升高血糖含量的食物具有低的GI值。因此，GI可以作为食物类产品淀粉消化的有效指标。世界卫生组织将GI定义为一份测试食物中50克可用碳水化合物部分的血糖反应曲线下的增量面积，表示为对同一受试者消耗的标准食物中相同量的碳水化合物的反应百分比。GI由1至100的范围组成，指示出某一特定食物中50克的碳水化合物以血糖的形式被吸收到血流中的速率。葡萄糖本身被用作主要的参照点，并被定为100。食物的GI值分为低等GI(<55)、中等(55-70)和高等(>70)(Miller等人,1992)。在消化过程中，快速分解的碳水化合物具有高GI。相反地，分解缓慢的碳水化合物则具有低GI。通过消耗低GI食物降低餐后血糖对健康受试者以及胰岛素抗性患者都具有积极的健康效果。
经过烹饪的大米因其含有较高比例的可消化淀粉(DS)以及较低比例的抗性淀粉(RS)而易被消化，因此大米就营养和医学方面而言并非最合适的食物。众所周知，与其它淀粉类食物相比，大米具有相对高的血糖反应。精米的高淀粉含量和低的非淀粉多糖含量意味着大米通常会产生高血糖反应，而且含有低水平的膳食纤维和抗性淀粉。Jenkins等人(1981)报道过白米的一个极高的GI值，为83。对更多水稻品种的许多其它研究也表明其具有高GI状态。
因此，要解决水稻GI高的问题，切实可行的解决方法是增加水稻植株中膳食纤维和抗性淀粉(RS)的含量。当将膳食纤维和RS纳入饮食中时可产生三种主要影响，即为稀释膳食代谢能；膨化效应；以及发酵成短链脂肪酸并且增加肽YY(PYY)和胰高血糖素样肽(GLP)-1在肠内的表达。与纤维具有类似生理作用的RS在大米为主的饮食中具有最为重要的作用。应了解，对水稻中的膳食纤维以及RS积累的遗传调控作用对于提高其营养品质而言具有最为重要的意义。鉴于越来越多采用西方饮食的东南亚国家中II型糖尿病和结肠直肠癌的发病率急剧增加，因此对于大米中膳食纤维和RS含量的研究具有非常重要的意义。
因此，就目前技术现状中存在的问题来看，需要生产出具有诸如高膳食纤维、抗性淀粉以及低血糖指数等特征的大米。
发明内容
就目前技术现状中存在的问题来看，需要利用在关键候选基因中诱发突变来改变支链淀粉结构并增加直链淀粉含量，从而提高水稻谷物中的抗性淀粉和膳食纤维。
本发明描述结合适宜水稻品种的淀粉分支酶在编码不同淀粉合成酶的基因中诱发突变的方法。这些突变与谷物淀粉生物合成中那些关键酶的下调有关。下调这些目标酶会增加水稻中抗性淀粉和膳食纤维的积累。膳食纤维和抗性淀粉的增加使水解指数降低到35％-40％的极低水平。
根据本发明的一个或多个实施方案，双重和三重水稻突变体在经历突变的适宜水稻品种的编码一种或多种淀粉合成酶的基因中具有突变以及在编码一种或多种淀粉分支酶的基因中具有突变。所述突变是利用甲烷磺酸乙酯(EMS)或N＝N＝亚硝基甲基脲(NMU)作为诱变剂，对适合的水稻品种的种子进行处理来进行的。因为诱变是随机事件，因此各种突变体都是通过诱变处理产生的，并且然后通过测序筛选具有潜在突变的突变体使突变体群体经历靶向诱导的局部损伤(TILLING)，从而获得增强的膳食纤维和抗性淀粉。然后在功能方面证实了这些突变在下调淀粉生物合成中的某些关键酶中的作用。下调这些目标酶会导致膳食纤维和抗性淀粉在水稻谷粒中的积累增加。
本发明可用于使任何水稻品种的膳食纤维总量提高10％以上以及使抗性淀粉含量提高8％以上。这些有利特征可降低水稻谷粒的血糖反应，因此适合糖尿病患者。此外，高膳食纤维提供了许多健康好处，诸如减轻体重，助于心脏健康以及结肠健康等。因此，这些突变的水稻品种也可以作为公众的一种健康的替代谷物主食。
附图说明
当结合附图理解时，实施方案的上述以及其它特征将由以下实施方案的详细描述中变得更加明确。附图中，相同的元件符号指的是相同的元件。
图1显示根据本发明的一个或多个实施方案，描绘在水稻突变系Lotus 1-4和野生型GFRL 78的种子中的支链淀粉链分布、直链淀粉含量、抗性淀粉含量、膳食纤维总量和水解指数的图表。
图2显示根据本发明的一个或多个实施方案的流程图。
图3显示根据本发明的一个或多个实施方案的Lotus 1突变体的色谱图。
图4显示根据本发明的一个或多个实施方案的Lotus 2突变体的色谱图。
图5显示根据本发明的一个或多个实施方案的Lotus 3突变体的色谱图。
图6显示根据本发明的一个或多个实施方案的Lotus 4突变体的色谱图。
图7显示根据本发明的一个或多个实施方案的野生型品种GFRL 78的色谱图。
图8显示根据本发明的一个或多个实施方案的Lotus 1突变体的支链淀粉链长度分布与野生型GFRL 78进行对比的图表。
图9显示根据本发明的一个或多个实施方案的Lotus 2突变体的支链淀粉链长度分布与野生型GFRL 78进行对比的图表。
图10显示根据本发明的一个或多个实施方案的Lotus 3突变体的支链淀粉链长度分布与野生型GFRL 78进行对比的图表。
图11显示根据本发明的一个或多个实施方案的Lotus 4突变体的支链淀粉链长度分布与野生型GFRL 78进行对比的图表。
图12显示根据本发明的一个或多个实施方案，描绘在突变体Lotus 1-4的关键候选基因中识别的突变的清单表格，所述突变导致水稻植株中的膳食纤维和抗性淀粉含量增加。
图13显示根据本发明的一个或多个实施方案，描绘在突变体Lotus 1-4的关键候选基因中识别的关于蛋白质的突变的清单列表。
图14显示根据本发明的一个或多个实施方案的具有突变的淀粉合成酶I的mRNA序列。
图15显示根据本发明的一个或多个实施方案的具有突变的淀粉合成酶I的蛋白质序列。
图16显示根据本发明的一个或多个实施方案的具有突变的淀粉合成酶I的DNA序列。
图17显示根据本发明的一个或多个实施方案的具有突变的淀粉合成酶IIIa的mRNA序列。
图18显示根据本发明的一个或多个实施方案的具有突变的淀粉合成酶IIIa的蛋白质序列。
图19显示根据本发明的一个或多个实施方案的具有突变的淀粉合成酶IIIa的DNA序列。
图20显示根据本发明的一个或多个实施方案的具有突变的淀粉分支酶I的mRNA序列。
图21显示根据本发明的一个或多个实施方案的具有突变的淀粉分支酶I的蛋白质序列。
图22显示根据本发明的一个或多个实施方案的具有突变的淀粉分支酶I的DNA序列。
图23显示根据本发明的一个或多个实施方案的具有突变的淀粉分支酶IIb的mRNA序列。
图24显示根据本发明的一个或多个实施方案的具有突变的淀粉分支酶IIb的蛋白质序列。
图25显示根据本发明的一个或多个实施方案的具有突变的淀粉分支酶IIb的DNA序列。
具体实施方式
现将对本发明的主题进行详细说明，其中的一个或多个实施例在附图中显示。每个实施例都是为了解释而非限制主题所提供的。对于本发明所属领域的技术人员来说，明显的各种变化和修改都被视为在本发明的精神、范畴和考虑范围以内。
为了更清楚和简洁地描述并指出本发明所要求保护的主题，对特定术语提供了下述定义，并用在下文的书面描述中。
术语“抗性淀粉”意思是不会被人类小肠中的酶分解的淀粉部分。根据上下文需要，抗性淀粉进入大肠，在那里进行部分或全部发酵。
根据上下文需要，术语“突变”意思是基因DNA序列的永久性遗传改变，其可改变由所述基因编码的蛋白质的氨基酸序列。
根据上下文需要，术语“血糖指数”意思是用来表示某种特定食物可以多快地升高血糖水平以及升到多高的一个数值范围。
根据上下文需要，术语“水解指数”意思是用来预测食品血糖指数的一种体外实验室方法。
本发明通过在两种主要的关键靶基因群中，即负责淀粉生物合成的淀粉合成酶和淀粉分支酶中组合表现突变，克服了现有技术中的缺陷。这些突变组合可以同时改变支链淀粉结构以及增加直链淀粉含量，从而增加水稻谷粒中的膳食纤维(DF)和抗性淀粉(RS)的含量。上述方法成功地使膳食纤维和抗性淀粉水平达到了使水解指数(HI)值显著降低至33％-40％的程度。
图1显示根据本发明的一个或多个实施方案，描绘在水稻突变系Lotus 1-4和野生型GFRL 78的种子中的支链淀粉链分布、直链淀粉含量、抗性淀粉含量、膳食纤维总量和水解指数的图表。使用简化的I2/KI法测量直链淀粉含量。使用美国官方农业化学家协会(AOAC)批准的方法2002.02，使用爱尔兰Megazyme国际公司的试剂盒进行抗性淀粉评估。
图2说明根据本发明的一个或多个实施方案的一个流程图，其中描绘一种在适合水稻品种的编码淀粉合成酶和淀粉分支酶的基因中诱导和筛选突变的方法。如图2所示，在步骤(201)中选取合适水稻品种的种子进行突变。在步骤(202)中，通过使合适水稻品种的种子暴露于如甲磺酸乙酯和/或N-N-亚硝基甲基脲的诱变剂来进行诱变。在步骤(203)中，通过所述突变法产生大量突变体。在步骤(204)中，通过测序靶向诱导的局部损伤(TILLING)(Tsai等人,2011)用于筛选具有增强膳食纤维和抗性淀粉的潜在突变的突变体。然后，通过生物信息学电脑模拟工具SIFT(Ng和Henikoff,2003)和Provean(Choi和Chan,2015)，在功能方面证实了这些突变在下调淀粉生物合成中的某些关键酶中的作用。下调这些目标酶会导致膳食纤维和抗性淀粉在水稻谷粒中的积累增加。在步骤(205)中，所选择的假定突变体通过生物化学方式进行表征以用于提高的膳食纤维和抗性淀粉的表达。
图3、图4、图5、图6和图7说明由荧光团辅助毛细管电泳(FACE)产生的色谱图。图中显示与野生型品种相比，链长较低的支链淀粉链(DP 6至12)的比例在所有突变体中占主导地位。野生型品种显示出中等(DP 13至18)和较长(DP>19)支链淀粉链的比例较高。链长的总体趋势与突变体所具备的突变明显有关。淀粉合成酶中发生突变的那些突变体显示出更倾向于短链支链淀粉，而分支酶中发生突变的趋势则相反，与淀粉合成酶中是否存在突变无关。由于仅分支酶发生突变的突变体并未被分离，因此与野生型相比，支链淀粉长度并无增加趋势。在突变体中，在两种淀粉合成酶SSI和SSIIIa中都具有突变的第四种突变体品种(Lotus 4)显示出短链的最高比例为42.34％，并且其所有的生物化学参数都是最理想的，高值分别为AC(29.3％)、RS(11.92％)及TDF(13.21％)，并且具有最低的HI为33.2。其次是第一种突变体品种(Lotus 1)，HI＝35.75％，其中具有一个淀粉合成酶突变(ssIIIa)和两个淀粉分支突变(sbeI和sbeIIb2)。无论所涉及的突变数量和基因数量如何，与野生型品种相比，所有突变体都显示出高的AC、RS、TDF以及减少的HI。
图8显示根据本发明一个或多个实施方案的Lotus 1突变体的支链淀粉的链长分布图。图中显示与野生型品种GFRL 78相比，Lotus 1突变体的支链淀粉链的聚合度。
图9显示根据本发明一个或多个实施方案的Lotus 2突变体的支链淀粉的链长分布图。图中显示与野生型品种GFRL 78相比，Lotus 2突变体的支链淀粉链的聚合度。
图10显示根据本发明一个或多个实施方案的Lotus 3突变体的支链淀粉的链长分布图。图中显示与野生型品种GFRL 78相比，Lotus 3突变体的支链淀粉链的聚合度。
图11显示根据本发明一个或多个实施方案的Lotus 4突变体的支链淀粉的链长分布图。图中显示与野生型品种GFRL 78相比，Lotus 4突变体的支链淀粉链的聚合度。
图12显示根据本发明的一个或多个实施方案，描绘在突变体Lotus品种的关键候选基因中识别的突变的清单列表，所述突变可能会增加胚乳中的膳食纤维和抗性淀粉含量。表格显示出突变相对于DNA、RNA和蛋白质序列的位置。
图13显示出描绘在突变体Lotus品种的关键候选基因中识别出的突变的清单列表，涉及到蛋白质以及参考蛋白质序列、Provean评分、SIFT评分以及功能性预测。Provean评分小于-1.3是推断氨基酸变化在所述多肽位置不可容忍所设定的阈值，并且因此突变被推断为有害的。SIFT预测氨基酸取代是否影响蛋白质的功能。SIFT预测是基于通过PSI-BLAST收集到的来源于密切相关序列的序列比对中的氨基酸残基的保守程度。SIFT可用于自然发生的非同义多态性或实验室诱发的错义突变。SIFT是一种基于序列同源性的工具，它从耐受性的氨基酸取代中拣选出不耐受的，并预测蛋白质中的氨基酸取代是否会产生表型效应。SIFT评分在0至1的范围内。预测有害的氨基酸取代的评分为<＝0.05，而且若评分>0.05，则为耐受。
图14、图15、图16、图17、图18、图19、图20、图21、图22、图23、图24和图25显示淀粉合成酶I、淀粉合成酶IIIa、淀粉分支酶I和淀粉分支酶IIb的mRNA、蛋白质和DNA序列，其中序列中的单重、双重或三重突变被突出显示。
大致描述本发明后，可参考某些具体实施例来获得进一步的理解，本文中提供所述实施例仅用于说明目的而不是限制，除非另有说明。
实施例1：RS评估程序
使用Megazyme试剂盒来评估RS含量。所述试剂盒获自位于爱尔兰威克洛的布雷公司、布雷商业区、M/s Megazyme国际爱尔兰有限公司。用螺帽管取100±1毫克面粉样品一式两份并轻柔拍打以确保没有样品粘附在管壁上。每管加入4毫升含淀粉葡萄糖苷酶(AMG)(3U ml-1)的胰α-淀粉酶(3Ceralpha单位/mg，10mg/ml)。将管盖紧，使其完全分散在旋涡混合器上，并且水平连接在与运动方向对齐的震荡水浴中。将管在37℃下伴随连续震荡(200冲程/分钟)培育16小时。培育后，在使用旋涡混合器进行剧烈混合下，用4.0毫升乙醇(99％)对管进行处理。此后，将所述管以1,500x g(约3,000rpm)离心持续10分钟(未加盖)。将上清液小心倾析，并使球粒再悬浮在8ml的50％乙醇中。将管再次以1,500x g(约3,000rpm)离心持续10分钟。再次倾析上清液，并重复悬浮和离心步骤。倾析上清液，并将管倒置在吸水纸上以排出多余的液体。向每个管中加入一个磁力搅拌棒(5x15mm)，然后加入2ml的2M KOH溶液。通过在磁力搅拌器上的冰浴或水浴中搅拌约20分钟使颗粒再悬浮(并且RS溶解)。然后，向每个管中加入8ml的1.2M醋酸钠缓冲液(pH 3.8)。立即加入0.1ml的AMG(3300U ml-1)，将内容物在磁力搅拌器下充分混合，并将管放置在50℃的水浴中。在涡流混合器上通过间歇性混合将管培育30分钟。然后将其直接在1,500x g下离心10分钟。每个管中的最终体积约为10.3(±0.05)ml。从每管转移0.1ml的上清液等分试样(一式两份)到玻璃试管中，加入3.0ml的GOPOD试剂，并使用旋涡混合器使其充分混合。通过将0.1ml的0.1M醋酸钠缓冲液(pH 4.5)与3.0ml的GOPOD试剂混合来制备一份空白试剂。通过将0.1ml葡萄糖(1mg ml-1)与3.0ml GOPOD试剂混合来制备葡萄糖标准物。将样品、空白物和标准物在50℃下培育20分钟。对空白试剂在510nm处测量吸光度。使用Megazyme公司的Mega-Calc计算样品的RS含量。
实施例2：支链淀粉链的聚合度
根据Lumdubwong和Seib(2000)描述的方法，从所有突变体和野生型中分离出纯淀粉。如Morell、Samuel和O’Shea(1998)所述，通过荧光团辅助毛细管电泳法(FACE)分析分离淀粉的支链淀粉链长度分布。使用异淀粉酶(10U)使分离的淀粉脱支(37℃下持续2h)，并用1-氨基芘-3,6,8-三磺酸(APTS)标记。使用装配有488nm激光模块的P/ACE系统5010(美国加利福尼亚州贝克曼库尔特公司)进行FACE。使用具有预燃窗的N-CHO(PVA)毛细管(美国加利福尼亚州贝克曼库尔特公司)(50米m ID以及47cm总长度)来分离脱支样品。使用麦芽糖作为内标。分离在10℃下进行30分钟。基于麦芽糖的迁移时间，将聚合度(DP)分配为峰值。
尽管前文发明内容和具体实施方式中已提出至少一个示例性的实施方案，但应了解存在多种变化形式。还应了解，示例性的实施方案仅为示例，而并不打算以任何方式限制其范畴、适用性或布局。相反，前文发明内容和具体实施方式将为本领域技术人员提供一个用于实施示例性实施方案的便利指南，应了解，在不偏离随附权利要求所述的范畴及其同等法律效应的前提下，可对示例性实施方案中所述元素的功能和配置进行各种更改。

Claims (9)

1.一种水稻植株，所述水稻植株包含包括SSI、SS IIIa、SBE I和SBE IIb中两个、三个或四个基因的组合中的一种或多种突变；其中所述水稻植株产生发芽的种子，并且另外其中所述水稻植株的谷物与野生型水稻植株的谷物相比，抗性淀粉或膳食纤维的总量水平增加。
2.如权利要求1所述的水稻植株，所述水稻植株与野生型水稻植株的淀粉颗粒相比，还包含水平降低的酶淀粉合成酶I和/或淀粉合成酶IIIa，以及由于编码所述植株的这些酶的两个、三个或四个基因的组合中的突变，导致淀粉颗粒中的淀粉分支酶I和/或淀粉分支酶IIb的水平降低。
3.如权利要求1所述的水稻植株，其中与所述野生型水稻植株的谷物相比，所述谷物的淀粉具有26％以上的增强直链淀粉含量。
4.如权利要求1所述的水稻植株，其中与所述野生型水稻植株的谷物相比，所述谷物中的淀粉具有6％以上的增强抗性淀粉含量。
5.如权利要求1所述的水稻植株，所述水稻植株为籼稻型的亚洲水稻。
6.一种来自如权利要求1所述的水稻植株的水稻谷物。
7.一种包含如权利要求1所述的水稻谷物的团体的面粉。
8.一种包含如权利要求1所述的水稻谷物的团体的食品或饮料产品。
9.一种通过植物育种或分子育种或其任何生物技术途径从如权利要求1所述的水稻植株以任何方式获取的水稻种子、花粉粒、植物部分或后代。
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