JP7239136B2 - 難消化性澱粉高含有イネ変異体、米粉製造方法、難消化性澱粉製造方法、米ゲル製造方法、食品製造方法、及び難消化性澱粉高含有イネ変異体の作出方法 - Google Patents

Description

本発明は、特に難消化性澱粉（ＲＳ）の含有率が格段に高い難消化性澱粉高含有イネ変異体、米粉、難消化性澱粉、米ゲル、食品、食感改良剤、及び難消化性澱粉高含有イネ変異体の作出方法に関する。

澱粉は不溶性であり、植物に特有の貯蔵多糖である。また、地球上のほとんどの生物が炭水化物源として、澱粉を利用している。
化学物質としての澱粉は、グルコースのα１，４による直鎖及びα１，６グルコシド結合による枝分かれ構造を含むグルコースポリマーである。
また、澱粉は、主として直鎖からなるアミロースと枝分かれ構造をもつアミロペクチンの高分子の集合体でもある。

澱粉の生合成には、少なくとも４種類の酵素が関与していることが分かっている。この４種類の酵素は、基質供給酵素であるＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＡＧＰａｓｅ）、α１，４グルコシド結合を伸長するスターチシンターゼ（ＳＳ）、α１，６グルコシド結合からなる枝分かれ構造を形成する枝作り酵素（ＢＥ）、アミロペクチンの特徴であるクラスター構造を維持するためにＢＥが付加した不適切な位置の枝分かれ構造をトリミングする枝切り酵素（ＤＢＥ）である。このように、植物の澱粉生合成には少なくとも４種類の酵素が関与している。なお、澱粉生合成に関与する酵素は、他にもあると考えられている（非特許文献１参照）。

加えて、高等植物の場合、これらの酵素には多数のアイソザイムが存在し、澱粉生合成に関与している。アイソザイムは、同様の酵素反応を触媒するアミノ酸配列の異なる酵素群のことである。たとえば、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）には、１１種類ものＳＳ、３種類ものＢＥ、４種類ものＤＢＥが存在する。
近年、これらのアイソザイムは、組織特異性や、微妙な基質特異性によって、役割分担をしていることが分かってきた。アイソザイムの働きや役割を解明することは、アイソザイムの機能解明につながる。そして、アイソザイムの機能解明は、植物の澱粉生合成メカニズムの全体像の解明には欠かせない。
このため、従来から各アイソザイムの変異体が開発されてきた。特定のアイソザイムが欠失した変異体の表現型を調べることで、そのアイソザイムの働きや役割を知ることができる。

たとえば、各アイソザイムの機能を明確にするために、イネにおいて既に単離され、分析されている変異体には、ＳＳＩ（非特許文献２、特許文献１）、ＳＳＩＩａ（非特許文献３、特許文献２）、ＳＳＩＩＩａ（非特許文献４、特許文献３）、ＧＢＳＳＩ（非特許文献５、非特許文献１１）、ＢＥＩ（非特許文献６）、ＢＥＩＩｂ（非特許文献７）、ＩＳＡ１（非特許文献８）、ＰＵＬ（非特許文献９、特許文献４）、ＰＨＯ１（非特許文献１０）等がある。
これらの変異体のいくつかは、種子の胚乳に蓄積される澱粉の構造、物性が明らかになっている。具体的には、野生型とは異なることがあり、その構造の違いに伴い、澱粉粒の大きさや熱糊化温度、熱糊化粘度が異なる等の物性を示すことがある。これにより、各酵素の機能がある程度明らかになっている。

一方、澱粉には、αアミラーゼ等で容易に消化される成分の澱粉と、消化されにくい難消化性澱粉が存在する。難消化性澱粉（Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｒｃｈ、ＲＳ）は、消化液では分解されにくく、高分子のまま小腸を通過して大腸に到達する澱粉のことである。
難消化性澱粉は、比較的高分子のまま大腸に到達し、腸内細菌による発酵を通して短鎖脂肪酸を分泌し、大腸環境を整え、大腸癌予防、便秘予防効果があることが大麦（非特許文献１３）や小麦（非特許文献１４）で知られている。このため、難消化性澱粉を多く含む大麦グリッツ等は、オーストラリアで既に商品化されている。
加えて、難消化性澱粉は、小腸でグルコースにまで分解されにくいため、カロリーオフ効果がある。難消化性澱粉は、アミロース含量が高い澱粉に多く含まれることがある。このため、高アミローストウモロコシが、ダイエット素材として、利用されている。
以上のように、難消化性澱粉は、食物繊維と類似した機能性を示す食品として摂取することが推奨されている。

イネにおいては、通常の炊飯米にも難消化性澱粉は含まれるものの、その割合は、わずか１％前後であることが多い。
これについて、澱粉生合成に関与する酵素に変異を持つ上述の各イネ変異体においては、野生型より高アミロース性を示すイネ変異体系統は、野生型より有意に高い難消化性澱粉量を示した。一方、格段に高い難消化性澱粉量を示したのが、枝作り酵素ＢＥＩＩｂを欠損した変異体（以下、「ｂｅ２ｂ」と、記載する。）であった。ｂｅ２ｂでは、難消化性澱粉量が劇的に増加する。具体的には、アミロペクチンの長鎖の増加とアミロースの増加とにより、難消化性につながることが明らかになっている。（非特許文献１２）。

このため、難消化性澱粉を増加させるため、ＢＥＩＩｂの発現量を減らした遺伝子組換えイネ（非特許文献１５及び非特許文献１６）が開示されている。
しかしながら、非特許文献１５及び非特許文献１６に記載された米の難消化性澱粉の含有率を高める方式では、遺伝子組み換えの手法を用いているため、実用化が困難であった。

これについて、組換えの手法を用いないイネ（非特許文献２０、２１、特許文献５）のｂｅ２ｂ系統も作出されている。

特開２００３－０７９２６０号公報 特開２００５－２６９９２８号公報 特開２００６－０５１０２３号公報 特開２００７－０２０４７５号公報 特開２０１２－０１９７４２号公報 特開２００９－２５４２６５号公報

Ｙ． Ｎａｋａｍｕｒａ、Ｔｏｗａｒｄｓ ａ ｂｅｔｔｅｒ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ： ｒｉｃｅ ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ ａｓ ａ ｍｏｄｅｌ ｔｉｓｓｕｅ．、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、日本、Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２００２年、４３、ｐ．７１８－７２５ Ｎ． Ｆｕｊｉｔａ他、Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｉ ｕｓｉｎｇ ｍｕｔａｎｔｓ ｉｎ ｒｉｃｅ．、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、アメリカ合衆国、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ、２００６年、１４０、ｐ．１０７０－１０８４ Ｙ． Ｎａｋａｍｕｒａ他、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ ＩＩａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｓｔａｒｃｈ ｑｕａｌｉｔｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｊａｐｏｎｉｃａ ａｎｄ ｉｎｄｉｃａ ｒｉｃｅ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ． 、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、２００５年、５８、ｐ．２１３－２２７ Ｎ． Ｆｕｊｉｔａ他、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＳＩＩＩａ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ｒｉｃｅ （Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）； ｔｈｅ ｆｕｃｎｔｉｏｎ ｏｆ ＳＳＩＩＩａ ａｎｄ ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｂｙ ＳＳＩＩＩａ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ｔｈｅ ｒｉｃｅ ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ．、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、アメリカ合衆国、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ、２００７年４月、１４４、４、ｐ．２００９－２０２３ Ｙ． Ｓａｎｏ、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｗａｘｙ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｒｉｃｅ ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ．、Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ、１９８４年、６８、ｐ．４６７－４７３ Ｈ． Ｓａｔｏｈ他、Ｓｔａｒｃｈ－ｂｒａｎｃｈｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ Ｉ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ａｆｆｅｃｔｓ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｉｎ ｒｉｃｅ ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ．、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、アメリカ合衆国、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ、２００３年、１３３、ｐ．１１１１－１１２１ Ａ． Ｎｉｓｈｉ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｍｙｌｏｓｅ－ｅｘｔｅｎｄｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｉｃｅ ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ．、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、アメリカ合衆国、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ、２００１年、１２７、ｐ．４５９－４７２ Ｙ． Ｎａｋａｍｕｒａ他、Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｄｅｂｒａｎｃｈｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ α－ｐｏｌｙｇｌｕｃａｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ｅｎｄｏｓｐｅｒｍｓ ｏｆ ｓｕｇａｒｙ－１ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ｒｉｃｅ．、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、イギリス、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、１９９７年、１２、ｐ．１４３－１５３ Ｎ． Ｆｕｊｉｔａ他、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＵＬ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ｒｉｃｅ （Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．） ａｎｄ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＰＵＬ ｏｎ ｔｈｅ ｓｔａｒｃｈ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｉｃｅ ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ．、Ｊ Ｅｘｐ Ｂｏｔ．、イギリス、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２００９年３月、６０、３、ｐ．１００９－１０２３ Ｈ． Ｓａｔｏｈ他、Ｐｌａｓｔｉｄｉｃ α－ｇｌｕｃａｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｒａｍａｔｉｃａｌｌｙ ａｆｆｅｃｔｓ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｉｎ ｒｉｃｅ ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ．、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、アメリカ合衆国、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ、２００３年、２０、ｐ．１８３３－１８４９ Ｍ．Ｉｓｓｈｉｋｉ 他、Ａ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｌｌｅｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｒｉｃｅ ｗａｘｙ ｌｏｃｕｓ ｈａｓ ａ ＧＴ ｔｏ ＴＴ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ５' ｓｐｌｉｃｅ ｓｉｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｉｎｔｒｏｎ、Ｐｌａｎｔ Ｊ、１９９８年、１５、ｐ．１３３－１３８ Ｔｓｕｉｋｉ 他、Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｓｔａｒｃｈ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｌｅａｄ ｔｏ Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｒｃｈ ｏｆ Ｓｔｅａｍｅｄ Ｒｉｃｅ： Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｒｃｈ Ｒｉｃｅ Ｌｉｎｅｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｒｅａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１６年、６８、ｐ．８８－９２ Ｂｉｒｄ ＡＲ他、Ａ ｎｏｖｅｌ ｂａｒｌｅｙ ｃｕｌｔｉｖａｒ （Ｈｉｍａｌａｙａ ２９２） ｗｉｔｈ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ ＩＩａ ｒａｉｓｅｓ ｌａｒｇｅ ｂｏｗｅｌ ｓｔａｒｃｈ ａｎｄ ｓｈｏｒｔ－ｃｈａｉｎ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｒａｔｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、２００４年、１３４、ｐ．８３１－８３５ Ｒｅｇｉｎａ Ａ他、Ｈｉｇｈ－ａｍｙｌｏｓｅ ｗｈｅａｔ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｉｎｄｉｃｅｓ ｏｆ ｌａｒｇｅ－ｂｏｗｅｌ ｈｅａｌｔｈ ｉｎ ｒａｔｓ、Ｐｒｏｃｃｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００６年、１０３、ｐ．３５４６－３５５１ Ｂｕｔａｒｄｏ ＶＭ他、Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｂｒａｎｃｈｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ＩＩｂ ｉｎ ｒｉｃｅ ｂｙ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｍｉｃｒｏＲＮＡ－ ａｎｄ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＲＮＡ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙ、６２、ｐ．４９２７－４９４１ Ｚｈｕ Ｌ他、Ｈｉｇｈ－ａｍｙｌｏｓｅ ｒｉｃｅ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｉｎｄｉｃｅｓ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｈｅａｌｔｈ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒａｔｓ、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ、２０１２年、１０、ｐ．３５３－３６２ Ｗａｎｇ ＺＹ他、Ｔｈｅ ａｍｙｌｏｓｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｒｉｃｅ ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ ｉｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｗａｘｙ ｇｅｎｅ、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ、１９９５年、７（４）、ｐ．３１６－６２２ 西 愛子他、イネ枝作り酵素（ＢＥ）の二重変異の胚乳澱粉特性、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ、２００８年、Ｖｏｌ．５５、（３）、Ｓｕｐｐｌ．、ｐ．４３ 藤田 直子他、低カロリー機能性米の地域普及をめざして～調理法の開発と栽培簡易化～、秋田県立大学ウェブジャーナルＢ、２０１７年、４、ｐ．１５８－１６３ Ａｓａｉ Ｈ他、Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ ｉｎ ｂｏｔｈ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ （ＳＳ） ＩＩＩａ ａｎｄ ｂｒａｎｃｈｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ＩＩｂ ｌｅａｄ ｔｏ ａ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ａｍｙｌｏｓｅ ｉｎ ＳＳＩＩａ ｉｎａｃｔｉｖｅ ｊａｐｏｎｉｃａ ｒｉｃｅ ｓｅｅｄｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙ、２０１４年、６５、ｐ．５４９７－５５０７ Ｉｔｏｈ Ｙ他、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ ｓｔａｒｃｈ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ ｏｎ ｔｈｅｉｒ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｉｎ ｎｏｖｅｌ ｍｕｔａｎｔ ｒｉｃｅ ｌｉｎｅｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｔａｒｃｈ ａｎｄ ａｍｙｌｏｓｅ ｃｏｎｔｅｎｔ、Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１７年、２５８、ｐ．５２－６０． Ｗａｄａ Ｔ他、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｒｉｃｅ ｃｕｌｔｉｖａｒ， 'Ｃｈｉｋｕｓｈｉ－ｋｏｎａ ８５'， ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｓｔａｒｃｈ－ｂｒａｎｃｈｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ＩＩｂ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｕｔａｎｔ ｌｉｎｅ、Ｂｒｅｅｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１８年、Ｄｏｉ：１０．１２７０／ｊｓｂｂｓ．１７０６９

しかしながら、非特許文献１２に記載のｂｅ２ｂ系統を含むＢＥＩＩｂ欠損変異体の各系統では、炊飯米で測定した場合、難消化性澱粉含有率は、１５～２５％程度であった。これに加え、ｂｅ２ｂ系統は、種子が小さかったり、調理性が良くなかったりするため、実用性が低かった。実際に、難消化性澱粉を含むイネの具体的な販売は限定的であり、大量生産には至っていなかった。
より高い機能性を得るためには、できる限り難消化性澱粉を多く含む、大規模栽培可能な米品種が必要であった。このため、従来より難消化性澱粉を多く含有しつつ、大規模栽培可能で収量も高いような、実用性の高い非遺伝子組み換え体のイネ変異体が求められていた。

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、上述の課題を解消することを課題とする。

本発明の難消化性澱粉高含有イネ変異体は、ジャポニカ米由来のイネ枝作り酵素Ｉ型（ＢＥＩ）及びＩＩｂ型（ＢＥＩＩｂ）の遺伝子座が劣性ホモ（ｂｅ１／ｂｅ２ｂ）であり、遺伝的に固定されており、非遺伝子組み換え体であり、前記ＢＥＩ及び前記ＢＥＩＩｂは両者とも欠損しており、前記欠損は、前記ＢＥＩの遺伝子の第１０エキソンの最後の塩基がグアニンからアデニンへ変異し、前記ＢＥＩＩｂの遺伝子の第９イントロンの最後の塩基がグアニンからアデニンに変異していることであり、親系統である野生型の種子の胚乳澱粉と比較して、アミロペクチンの鎖長分布のうち、少なくともグルコース重合度（ＤＰ）６～１６が減少し、且つＤＰ１７以上が増加していることを特徴とする。
本発明の難消化性澱粉高含有イネ変異体は、精米後のイネ種子は、難消化性澱粉の含有率が、前記親系統であるＢＥＩＩｂ欠損変異体（ｂｅ２ｂ）よりも多いことを特徴とする。
本発明の難消化性澱粉高含有イネ変異体は、前記イネ種子を炊飯した場合、すり潰さない状態の炊飯米における前記難消化性澱粉の含有率が６０％以上、すり潰した状態の炊飯米における前記難消化性澱粉の含有率が２０％以上であり、前記イネ種子の玄米粉における前記難消化性澱粉の含有率が３２％以上であることを特徴とする。
本発明の難消化性澱粉高含有イネ変異体は、前記イネ種子の胚乳から製造される澱粉は、前記親系統であるＢＥＩＩｂ欠損変異体（ｂｅ２ｂ）のイネ種子の胚乳から製造される澱粉と比べて、アミロペクチンの鎖長分布のうち、ＤＰ１９以下が減少され、ＤＰ２０以上が増加されることを特徴とする。
本発明の難消化性澱粉高含有イネ変異体は、前記イネ種子の胚乳から製造される澱粉は、前記親系統であるＢＥＩＩｂ欠損変異体（ｂｅ２ｂ）のイネ種子の胚乳から製造される澱粉よりも、糊化ピーク温度が７℃以上高いことを特徴とする。
本発明の難消化性澱粉高含有イネ変異体は、前記イネ種子の胚乳から製造される澱粉は、算出されたアミロースの割合が５０％以上であることを特徴とする。
本発明の難消化性澱粉高含有イネ変異体は、前記イネ種子は、粉末化することで米粉、粥を攪拌することで米ゲルとしても利用可能であることを特徴とする。
本発明の米粉製造方法は、前記難消化性澱粉高含有イネ変異体の前記イネ種子の胚乳を粉末化して米粉を製造することを特徴とする。
本発明の難消化性澱粉製造方法は、前記難消化性澱粉高含有イネ変異体の前記イネ種子の炊飯米、及び／又は前記米粉製造方法により製造された米粉より難消化性澱粉を抽出することを特徴とする。
本発明の米ゲル製造方法は、前記難消化性澱粉高含有イネ変異体の前記イネ種子の粥を攪拌して米ゲルを製造することを特徴とする。
本発明の食品製造方法は、前記難消化性澱粉高含有イネ変異体の前記イネ種子、前記米粉、前記難消化性澱粉、及び前記米ゲルのいずれか又は任意の組み合わせを含んで製造されたことを特徴とする。
本発明の難消化性澱粉高含有イネ変異体の作出方法は、非遺伝子組み換えの方式により、ジャポニカ米由来のイネ枝作り酵素Ｉ型（ＢＥＩ）及びＩＩｂ型（ＢＥＩＩｂ）の二重劣性ホモ変異体を作出させ、遺伝的に固定させ、前記ＢＥＩ及び前記ＢＥＩＩｂの両者とも欠損しており、前記欠損として、前記ＢＥＩの遺伝子の第１０エキソンの最後の塩基がグアニンからアデニンへ変異し、前記ＢＥＩＩｂの遺伝子の第９イントロンの最後の塩基がグアニンからアデニンに変異している一塩基置換を分子マーカーとして、前記二重劣性ホモ変異体を特定し、前記二重劣性ホモ変異体は、親系統である野生型の種子の胚乳澱粉と比較して、アミロペクチンの鎖長分布のうち、少なくともグルコース重合度（ＤＰ）６～１６が減少し、且つＤＰ１７以上が増加していることを特徴とする。

本発明によれば、従来よりもイネ種子の難消化性澱粉含有率が高く、実用性が高いイネ変異体を提供することができる。

本発明の実施の形態に係るｂｅ１／ｂｅ２ｂ（＃１４０３）、それらの親変異体ｂｅ１（ＥＭ５５７）、ｂｅ２ｂ（ＥＭ１０）、及び野生型（台中６５号及び金南風）の完熟胚乳から抽出したタンパク質のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。 本発明の実施の形態に係るｂｅ１／ｂｅ２ｂ（＃１４０３）、それらの親変異体ｂｅ１（ＥＭ５５７）、ｂｅ２ｂ（ＥＭ１０）、及び野生型（台中６５号及び金南風）の分子マーカーを用いたＰＣＲ増幅後、制限酵素で切断したＤＮＡバンドパターンを示した図である。 本発明の実施の形態に係るｂｅ１／ｂｅ２ｂ（＃１４０３）、それらの親変異体ｂｅ１（ＥＭ５５７）、ｂｅ２ｂ（ＥＭ１０）、及び野生型（台中６５号及び金南風）の完熟玄米の形態及び平均玄米重量を示す図である。 本発明の実施の形態に係るｂｅ１／ｂｅ２ｂ（＃１４０３）、それらの親変異体ｂｅ１（ＥＭ５５７）、ｂｅ２ｂ（ＥＭ１０）、及び野生型（台中６５号及び金南風）の完熟胚乳のアミロペクチンの鎖長分布（Ｍｏｌａｒ％）示すグラフである。

＜実施の形態＞
以下で図面を参照して、本発明の実施の形態について説明する。
上述したように、従来から、難消化性澱粉の含有量が多い種子を取得可能で、実用的なイネ変異体が求められていた。
本発明者らは、難消化性澱粉の取得について実用的なイネの変異体を探索するため、鋭意実験を行い、イネの澱粉の代謝系を網羅的に研究して、有益な表現型をもつ新規変異体を探索した。この際、本発明者らは、ＢＥＩ及びＩＩｂ型の二重劣性ホモ変異体（二重変異体。以下、「ｂｅ１／ｂｅ２ｂ」と記載する。）に着目した。このｂｅ１／ｂｅ２ｂについては、従来、試験的に作出されたものの性質がよく調べられないまま失われており、難消化性澱粉量について、まったく知られていなかったためである。
このため、本発明者らは、ｂｅ１／ｂｅ２ｂを新たに作出し、性質について鋭意、実験を行って調べた。すると、作出されたｂｅ１／ｂｅ２ｂのイネ種子は、難消化性澱粉含有率が非常に高く、実用性が高い難消化性澱粉高含有イネ変異体であることを見いだし、本発明を完成させるに至った。

より具体的に説明すると、本発明の実施の形態に係るｂｅ１／ｂｅ２ｂは、ジャポニカ米由来のイネ枝作り酵素Ｉ型（ＢＥＩ）及びＩＩｂ型（ＢＥＩＩｂ）の遺伝子座が劣性ホモであり、遺伝的に固定されており、非遺伝子組み換え体であることを特徴とする。
この本実施形態のｂｅ１／ｂｅ２ｂは、両親変異体（ｂｅ１、ｂｅ２ｂ）及び野生型（ＷＴ）と比べて、以下のような性質を得ることができる。

本発明の実施の形態に係るｂｅ１／ｂｅ２ｂのイネ種子からは、特に通常のイネの澱粉とは異なった性質と形状をもつ特性の澱粉を得られる。これらの特性の中で、特にユニークであるのは、見かけのアミロース含量と難消化性澱粉含有率である。
具体的に、本実施形態のｂｅ１／ｂｅ２ｂの変異体米（イネ種子）は、難消化性澱粉含有率が、親系統であるｂｅ２ｂよりも高くなる。これは、従来の非組換えイネ（非特許文献２０、２１、２２、特許文献５、６）の中でも類をみないほどである。

つまり、本発明の実施の形態に係るｂｅ１／ｂｅ２ｂのイネ種子は、炊飯した場合、従来のイネ変異体より遙かに多い難消化性澱粉が含まれる。
より具体的には、本実施形態のｂｅ１／ｂｅ２ｂにおける精米後のイネ種子を炊飯した場合、すり潰さない状態の炊飯米における難消化性澱粉の含有率が６０％以上、すり潰した状態の炊飯米における難消化性澱粉の含有率が２０％以上であり、イネ種子の玄米粉における難消化性澱粉の含有率が３２％以上となる。
ここで、炊飯米の難消化性澱粉含有率は、調理や測定方法によって大きく異なる。たとえば、ｂｅ１／ｂｅ２ｂは、すり潰さない炊飯米は７６．２％であるが、すり潰した場合、２８．４％となる。また、玄米粉の難消化性澱粉含有率も３５．１％となり、いずれも親系統のｂｅ２ｂより格段に高い値を示す。

他の特徴として、本発明の実施の形態に係るイネ種子の胚乳から製造される澱粉は、ＢＥＩＩｂの活性低下に起因する親系統イネ（ｂｅ２ｂ）を用いて製造される澱粉と比べて、アミロペクチンの鎖長分布のうち、ＤＰ１９以下が減少され、ＤＰ２０以上が増加されることを特徴とする。
すなわち、後述する実施例の図４に示すように、本実施形態のｂｅ１／ｂｅ２ｂのイネ種子の胚乳から製造される澱粉は、アミロペクチンの鎖長分布のうち、ＤＰ１９以下が減少し、ＤＰ２０以上が増加する。これは、アミロペクチンの長鎖量が、通常米に比べて格段に高いｂｅ２ｂの澱粉と比べても多い。

さらに、本発明の実施の形態に係るｂｅ１／ｂｅ２ｂのイネ種子の胚乳から製造される澱粉は、アミロースの割合が５０％以上となる。
加えて、本発明の実施の形態に係るｂｅ１／ｂｅ２ｂのイネ種子の胚乳から製造される澱粉は、ｂｅ２ｂを用いて製造される澱粉よりも、糊化ピーク温度が７℃以上高くなる。
つまり、本発明の実施の形態に係るイネ種子、イネ種子から製造される米粉、及び澱粉は、親系統のｂｅ２ｂよりアミロペクチンの長鎖量が増加していることで、ｂｅ２ｂとは違った物性を示し、具体的には糊化ピーク温度が高くなる。

ここで、本実施形態のｂｅ１／ｂｅ２ｂのイネ種子、イネ種子から製造される精米、米粉、及び澱粉は、高アミロース含量及びアミロペクチンの長鎖が多いことに起因する老化性の高さから、老化性が有利に働く調理法において、調理性を高めることができる。
具体的には、本実施形態のイネ種子、イネ種子から製造される精米、米粉、及び澱粉は、老化性が有利に働く調理法である、麺や米菓に適している。さらに具体的には、本実施形態のイネ種子、米粉、及び澱粉は、ピラフ若しくはリゾット、米菓、グラノーラ等の食品に好適に用いることができる。これにより、従来とは、味わい、口触り、食感、風味等が異なる特徴ある食品を製造することができる。すなわち、「食感改良剤」として用いることが可能である。また、これらを用いた各種健康食品やダイエット食品、難消化性澱粉を精製したサプリメント等に利用可能である。

さらに、本発明の実施の形態に係るｂｅ１／ｂｅ２ｂのイネ種子は、粉末化することで米粉、粥を攪拌することで米ゲルとしても利用可能であることを特徴とする。
具体的には、本実施形態のｂｅ１／ｂｅ２ｂのイネ種子は、粉砕機等で粉砕して、米粉として提供可能である。すなわち、ｂｅ１／ｂｅ２ｂのイネ種子の胚乳を粉末化することで米粉を製造できる。
また、ｂｅ１／ｂｅ２ｂのイネ種子の粥を攪拌することで米ゲルとして使用することができる。
本発明の実施の形態に係るｂｅ１／ｂｅ２ｂのイネ種子を粉砕した粉砕物である米粉又は米ゲルは、パンや麺等に混合させて利用することができる。
この際、本実施形態の米粉、米ゲルについても、従来の１００％米粉で作ったパンや麺等の食感を改良する「食感改良剤」として用いることも可能である。この「食感改良剤」として用いられる際の配合割合や配合順序や配合方法等は、加工法や製造法等や保存法等に対応して、任意に設定可能である。

また、本実施形態のｂｅ１／ｂｅ２ｂのイネ種子自体も、玄米のまま又は精米してダイエット米として提供することが可能である。この際、このダイエット米を、モチ米や通常米とブレンドすることで、高い老化性を緩和し、難消化性澱粉量を維持した状態で、良食味な炊飯米として食用に供することができる。
また、本実施形態の変異体米から抽出した澱粉自体を、難消化性澱粉が多く含まれる澱粉として使用することも可能である。

より具体的には、本発明の実施の形態に係る食品は、ｂｅ１／ｂｅ２ｂのイネ種子、米粉、難消化性澱粉、及び米ゲルのいずれか又は任意の組み合わせを含んで製造されたことを特徴とする。
すなわち、このような本実施形態のｂｅ１／ｂｅ２ｂのイネ種子、この粉末、米ゲル等を用いた食品は、麺、パン、ピラフ、かゆ、米菓等の米由来のダイエット素材として用いることが可能である。また、これらの食品は、習慣的に摂取することにより、低カロリー性を備え、大腸環境を整えるため糖尿病、大腸癌、便秘の予防等の効果が期待される。さらに、米粉１００％の食品が開発されれば、小麦粉由来のグルテンを持たない、グルテンフリー食品として、小麦アレルギーの患者に有効な食品として提供できる。

さらに、本発明の実施の形態に係る難消化性澱粉は、ｂｅ１／ｂｅ２ｂのイネ種子の炊飯米、及び／又は米粉より抽出されることを特徴とする。
本実施形態のｂｅ１／ｂｅ２ｂは、炊飯米にしても多くの難消化性澱粉を含んでいる。このため、この炊飯米を溶解、酵素処理等することで、容易に難消化性澱粉を分離することが可能となる。さらに、本実施形態のｂｅ１／ｂｅ２ｂは、従来の系統に比べると、すり潰した状態でも多くの難消化性澱粉を含んでいる。このため、米粉から難消化性澱粉を抽出しても、実用的に多くの量を取得可能である。
この本実施形態のｂｅ１／ｂｅ２ｂの米粉や澱粉は、アミロースの含量が高いことにより、工業的な用途にて使用可能である。これは、生分解性プラスチックなど、成形が必要な場合は、老化性が高い方が有利であるためである。たとえば、アミロースは温水に溶けるため、フィルム状に成形して、生分解性フィルム、医療用材料、縫合糸のような用途に用いることができる。また、体内で吸収分解される性質を用いて、再生医療の「足場」用の部材として用いることが可能である。
さらに、グラスファイバー作成時の資材、工業用糊、建築材料の配合剤、植物栽培用の資材等、様々な工業用途に利用可能である。

ここで、これらの米粉、難消化性澱粉、米ゲル、及び食品は、上述の難消化性澱粉の特性、含まれたＤＮＡ等により、直接特定することが可能である。

本発明の実施の形態に係る難消化性澱粉高含有イネ変異体の作出方法は、非遺伝子組み換えの方式により、ジャポニカ米由来のイネ枝作り酵素Ｉ型（ＢＥＩ）及びＩＩｂ型（ＢＥＩＩｂ）の二重劣性ホモ変異体を作出させ、遺伝的に固定させることを特徴とする。このように、非遺伝子組み換えの方式により、ジャポニカ米由来ＢＥＩＩｂの欠損に加えてＢＥＩを欠損させ、遺伝的に固定させることで、両親変異体及び野生型と比べると、難消化性澱粉含有率を著しく高めるｂｅ１／ｂｅ２ｂを作出することができる。
より具体的には、本発明の実施の形態に係るイネ変異体の作出方法は、ＢＥＩの遺伝子の第１０エキソンの最後の塩基がグアニンからアデニンへ変異し、ＢＥＩＩｂの遺伝子の第９イントロンの最後の塩基がグアニンからアデニンに変異している一塩基置換を分子マーカーとして、二重劣性ホモ変異体を特定する。
これらの二重変異の結果、本実施形態のイネ変異体は、野生型に比べて、ＢＥＩ及びＢＥＩＩｂの活性が低下する。
具体的な作出による形質変化は、ウエスタンブロッティングでそれぞれのバンドが欠損していること、又は、分子マーカーを使ったＰＣＲ増幅及び制限酵素切断されたＤＮＡのアガロースゲル電気泳動パターンから二重変異体であることを確認することが可能である。

以上のように構成することで、以下のような効果を得ることができる。
上述したように、トウモロコシ、大麦等には、難消化性澱粉量の高い系統が存在した。しかしながら、これらの植物の澱粉の生合成の機構は、イネとは大分、異なっていることが明らかとなっており、これをイネに適用できるかどうかは不明であった。

また、従来から、アミロース含量が高い澱粉には、難消化性澱粉が多いと推測されていた。しかしながら、どのような構造、あるいは澱粉が難消化性を示すのかは、詳細については、不明であった。
一方で、枝作り酵素ＢＥＩＩｂを欠損させ、アミロペクチンの長鎖が相対的に多くなった変異体（ｂｅ２ｂ系統）は、アミロペクチンの長鎖量が通常米と変わらず、高アミロース性を示す系統より、難消化性澱粉量が格段に多かった（非特許文献１２）。これにより、難消化性澱粉は、アミロース含量よりもむしろアミロペクチンの長鎖量に由来することが明らかになってきていた。

しかしながら、この非特許文献１２のｂｅ２ｂ系統は、炊飯米で測定した場合、難消化性澱粉含有率は、１５～２５％程度であった。
ここで、難消化性澱粉の摂取カロリーは、通常の澱粉の半分の２カロリーとして計算される。このため、難消化性澱粉含有率が１５～２５％程度であるｂｅ２ｂの炊飯米は、通常品種の炊飯米を食べた時に比べて、わずか７．５～１２．５％しかカロリーオフにならなかった。また、これらの数値は、炊飯米をすり潰さずに測定した値であるものの、実際に食べるときは咀嚼するため、難消化性澱粉含有の量はさらに低下する。さらに、難消化性澱粉含有率が高い米は、炊飯米として食する場合、食味がすぐれず、１００％で食べることはかなり困難であるため、通常米とブレンドした状態で食べることになる。さらに、米粉として利用する場合は、消化液への露出が多くなるので消化されやすくなり、炊飯米として食べる時よりも難消化性澱粉量が更に低下する場合があることも分かってきた。
以上のことを考慮すると、実際に摂取した際により高い機能性を期待するためには、できる限り難消化性澱粉を多く含む、大規模栽培可能な米品種が必要となる。これに関して、従来のｂｅ２ｂのような難消化性澱粉を含むイネ変異体は、実用性が低かった。
このため、難消化性澱粉の含有率が高く、収量も高く、実用性を高めた非遺伝子組み換え体のイネ変異体が求められていた。

これに対して、本発明の実施の形態に係る難消化性澱粉高含有イネ変異体は、類い希な難消化性澱粉含有率をもつイネ変異体である。
より具体的には、後述の実施例の表３や図３に示されるように、本実施形態の炊飯米の難消化性澱粉含有率は、従来のｂｅ２ｂの一例であるＥＭ１０に比べて、約２倍程度高い値を示し、少なくとも２０％の難消化性澱粉含有率となる。

さらに、本発明の実施の形態に係る難消化性澱粉高含有イネ変異体のイネ種子、米粉、精製澱粉、及び／又は米ゲルは、これらを利用する飲食品及び工業製品に用いることができる。
具体的には、本実施形態のｂｅ１／ｂｅ２ｂのイネ種子は、難消化性澱粉含有率が格段に高いため、食品に少量でも用いるだけで低カロリー化が可能であり、ダイエット食品を製造する際、低コスト化につながる。より具体的には、難消化性澱粉は、上述したように、通常の炭水化物が４ｋｃａｌ／１ｇに対して、２ｋｃａｌ／ｇであるため、本実施形態の変異体米を食品に含有させることで、確実に摂取カロリーを少なくすることができる。
また、本実施形態のｂｅ１／ｂｅ２ｂのイネ種子を米粉、精製澱粉、及び／又は米ゲルとして添加して食品を製造した場合、その食品中の難消化性澱粉含有率も調理方法により変化するものの、機能性を高めることができる。ブレンドする際も従来のイネよりも添加量を抑えることができる。

また、本実施形態の食感改良剤は、これを既存のパンや麺等の食品に加えることで、例えば、これらの食品の粘度を低下させ、より「食べ応え」があり風味を引き立てるようにすることができる。これにより、食品の製造者の望む食感が得られるように添加することが可能となる。加えて、食品の加工や保存する際にも、製造者の望む効果を付加可能となる。
さらに、本実施形態の食感改良剤は、加工デンプンのように化学的に修飾され、食品添加物しての表示が義務付けられているような添加物ではない。つまり、本実施形態の食感改良剤は、食品添加物ではなく、天然素材由来の添加剤として用いることが可能である。この上で、腸内フローラに良い影響を与えて、健康を増進させる効果が期待できる。

また、従来のｂｅ２ｂの一例であるＥＭ１０は、種子が小さいため、精米上の困難があり、又、相対的に収量が低いため、実用的に使用できなかった。
これに対して、本発明の実施の形態に係るイネ変異体のイネ種子は、ＥＭ１０よりも難消化性澱粉含有率が多くなり、更に、種子が大きくなるため、実用性がさらに高くなる。

なお、本実施形態のｂｅ１／ｂｅ２ｂについて、さらに種子重量を高めるため、品種改良を行い、その系統（株）を用いることも可能である。
たとえば、本発明者らは、後述の実施例で示すｂｅ１／ｂｅ２ｂのクローン（系統、株）である＃１４０３について、超多収米である秋田６３号を戻し交配することによる品種改良も行ってみたところ、種子の巨大化が確認できた。すなわち、これら戻し交配した系統を、本発明の他の実施形態のイネ変異体として用いることが可能である。
また、上述の難消化性澱粉高含有イネ変異体の作出方法により、新たにｂｅ１／ｂｅ２ｂの株を作出して、更に性質のよいものを選抜することも考えられる。
このようにして、種子が大きい株が得られれば、精米する上で大きなメリットとなる。また、種子が大きくなることから収量が高くなり、この生産性の高さが経済性にも貢献する。すなわち、難消化性澱粉を取得したり食品を製造したりする際に低コスト化につながる。このため、実際に食品等を製造する際、又は、炊飯米として提供する際の実用性を高めることができる。

以下で、図を参照しながら本発明の実施例について説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら制限されるものではない。

〔実験方法と材料〕
（ｂｅ１／ｂｅ２ｂ二重変異体米の単離）
ＢＥＩＩｂ欠損変異体米（ＥＭ１０）にＢＥＩ変異体（ＥＭ５５７）を交配することで、ｂｅ１／ｂｅ２ｂ二重変異体米を作出し、その性質を調べた。

以下で、ｂｅ１／ｂｅ２ｂ二重変異体米の作出法について説明する。本発明者らは、ＢＥＩＩｂ欠損変異体米（ＥＭ１０）にＢＥＩ変異体（ＥＭ５５７）を交配し、交配当代のＦ１種子を次年度に播種し、Ｆ２種子を得た。この中には、ｂｅ１／ｂｅ２ｂの二重変異体米は約２５％含まれていると推定された。
白濁種子の胚と反対側の胚乳１／４を使って、タンパク質を抽出し、ＢＥＩ抗体及びＢＥＩＩｂ抗体でウエスタンブロッティングを行い、ＢＥＩ及びＢＥＩＩｂが欠損している種子の胚側の残りの３／４を滅菌し、寒天培地に移植した。
これらの幼植物の葉身からＰＣＲ法によって、ＢＥＩ及びＢＥＩＩｂ遺伝子が欠損している個体を選抜し、栽培を続け、Ｆ３種子を取得し、＃１４０３と名付けた。この＃１４０３において、ウエスタンブロッティングにより、両タンパク質が欠損していることを確認した。

ウエスタンブロッティングのためのＳＤＳ－ＰＡＧＥ手法について述べる。電気泳動槽にアクリルアミドゲルをセットして泳動バッファ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭ ｇｌｙｃｉｎｅ、０．１％ ＳＤＳ）を注ぎ、ゲルのウェルに分子量マーカー（Ｃａｔ＃１６１－０３７３、Ｂｉｏ Ｒａｄ社製）を５μＬ、調製したサンプルを１０μＬずつアプライして、室温で電気泳動を行った。ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）フロントダイが濃縮ゲルを通過するまではゲル１枚あたり１０ｍＡの定常電流を流し、分離ゲルに到達した後ゲル１枚あたり２０ｍＡの電流を流して電気泳動を行い、ＢＰＢフロントダイがゲルの下から１ｃｍ程度になるまで電流を流し停止した。

ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってゲル上に分離されたタンパク質を転写するためのメンブレン（ＰＶＤＦ膜、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製、ＩＰＶＨ００１０）１枚と、ろ紙６枚をゲルと同じ程度の大きさに切り、メンブレンは１００％ ｍｅｔｈａｎｏｌに２０秒浸してから、ｔｒａｎｓｆｅｒ ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭ ｇｌｙｃｉｎｅ、２０％ ｍｅｔｈａｎｏｌ、０．１％ ＳＤＳ）に浸した。ろ紙はそのまま、ｔｒａｎｓｆｅｒ ｂｕｆｆｅｒが湿るぐらい浸した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行ったゲルをｔｒａｎｓｆｅｒ ｂｕｆｆｅｒの入ったプラスチックケースに移して１５分間浸とうした。ブロッティング用電極の陽極側にｔｒａｎｓｆｅｒ ｂｕｆｆｅｒに浸したろ紙３枚を泡が入らないように重ね、その上にメンブレンを泡が入らないように重ね、次にゲルを泡が入らないように重ね、更にろ紙３枚を泡が入らないように重ねた。上部電極板（陰極）をセットし、メンブレン１枚当たり８０ｍＡの電流で１時間流した。１時間後、通電を止めてメンブレンをプラスチック容器に移し、ブロッキング液（４％スキムミルク／ＴＢＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、５００ｍＭ ＮａＣｌ））１５ｍＬを入れ、３０分間浸とうした（ブロッキング）。３０分後、１次抗体（本実験では４％スキムミルク／ＴＢＳで抗ＢＥＩ血清（非特許文献６）を１５００倍希釈したもの、抗ＢＥＩＩｂ血清（非特許文献７）を３０００倍希釈したものを添加して４℃で一晩ゆっくり浸とうさせた。

翌日、メンブレンを約５０ｍＬの蒸留水で３回すすぎ、約５０ｍＬのＴＢＳＴ２（５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、１％ Ｔｗｅｅｎ２０）で１回、洗浄した。その後、４％スキムミルク／ＴＢＳ１０ｍＬと共に、抗ウサギヤギ血清パーオキシダーゼ（Ｂｉｏ Ｒａｄ社製）を５０００倍希釈した２次抗体を添加して約２時間ゆっくり浸とうさせた。その後、メンブレンを約５０ｍＬの蒸留水で３回すすぎ、約５０ｍＬのＴＢＳＴ２で１回洗い、ＴＢＳで１回洗った後、新しいＴＢＳに浸し、検出に用いた。
ウエスタンブロッティングを行ったメンブレンにＥＣＬ溶液（Ｐｉｅｒｅｃｅ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｒｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を１ｍＬかけることで発色させ、Ｆｕｊｉ ＬＡＳ４０００（富士フイルム株式会社製）で発色したバンドを写真に撮り、その画像データを、ソフトウェア（ＭｕｌｔｉＧａｕｇｅ）を用いて、検出したバンドの明るさやコントラストを編集した。写真撮影後、メンブレンを蒸留水で十分に洗浄した後乾燥させ保存した。

次にＰＣＲ選抜のための幼植物からのＤＮＡ抽出方法について述べる。培地からセルトレイに移植した幼植物の葉身２ｃｍ程度をマルチビーズショッカー用のチューブに移し、液体窒素に入れ凍らせてマルチビーズショッカーで粉砕した（ＳＰＥＥＤ ＭＥＴＥＲ：２０００ｒｐｍ、ＯＮ ＴＩＭＥ：５秒、ＯＦＦ ＴＩＭＥ：０秒、ＣＹＣＬＥ：１回）。４００μＬのＤＮＡ抽出ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ）を加えてボルテックスし、１５，０００ｒｐｍ、２０℃で５分間、遠心分離した。上清３００μＬを新しい１．５ｍＬチューブに移し、３００μＬのイソプロピルアルコールを加えよく混合し、１５分間静置した。その後、上述のものと同じ条件で遠心分離し、チューブの底に半透明な沈殿があるか確認した後、７０％エタノール１ｍＬを加えて攪拌し、遠心分離後、上清を除去した。残った沈殿を減圧乾燥し、氷上で２５μＬのＴＥ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ－２Ｎａ）を加え懸濁した。その後、実験に用いるまで－３０℃で冷凍保存した。

ジャポニカ米のＢＥＩ遺伝子（ＯｓＢＥＩ遺伝子、非特許文献６）は、１４個のエキソンと１３個のイントロンから構成されており、ＢＥＩ欠損変異体であるＥＭ５５７は、第１０エキソンの最後の塩基がグアニンからアデニンへ変異している。また、ジャポニカ米のＢＥＩ遺伝子（ＯｓＢＥＩＩｂ遺伝子、非特許文献７）は２２個のエキソンと２１個のイントロンから構成されており、ＢＥＩＩｂ欠損変異体であるＥＭ１０は、第９イントロンの最後の塩基がグアニンからアデニンに変異している。これらの一塩基置換を利用して、分子マーカーを開発した。

ＥＭ５５７の変異を検出するために、ＢＥＩ－ｄＣＡＰＳ－Ｆ（５'ＴＣＴＣＴＧＣＡＧＴＣＡＡＧＣＴＣＴＧＣＡＡＴＴＴＧＴＣ３'）とＢＥＩ－ＳｃａＩ－Ｒ（５'ＧＧＧＣＣＣＡＴＡＣＴＡＡＡＴＴＡＣＡＡＴＴＧＣＣＡＧＴＡＣ３'） プライマーとゲノミックＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物をＳｃａＩで制限酵素処理した。具体的には、Ｑｕｉｃｋ Ｔａｑ ＨＳ ｄｙｅ ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ製） ５μＬ，４μＭ プライマー 各０．５μＬずつ，ＤＮＡ １μＬ，蒸留水３μＬを混合し、９４℃ ２分×１サイクル、（９４℃ ２０秒、５０℃ ２０秒、６８℃ ２０秒）×３８サイクル）でＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物３μＬ，１０×制限酵素Ｂｕｆｆｅｒ １μＬ，ＳｃａＩ ０．２μＬ，蒸留水５．８μＬを混合し、３７℃で３０分以上反応させたのち、２μＬのＬｏａｄｉｎｇ ｄｙｅ（３６％グリセロール，０．０５％ ＢＰＢ，０．０３５％ キシレンサイアノール，３０ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加し、１×ＴＢＥ，１５％アクリルアミドゲルで泳動した。泳動後、エチジウムブロマイドでゲルを染色し、ＵＶトランスイルミネーターで検出すると、ＢＥＩに上記ＥＭ５５７の変異がある場合は、１７３ｂｐと３０ｂｐのバンドが２本、変異がない場合は２０３ｂｐの単一バンドが得られた。

同様に、ＥＭ１０の変異を検出するために、ＥＭ１０－ＮｌａＩＶ－Ｆ（５'ＧＡＣＴＡＴＧＣＡＧＧＡＧＡＡＧＴＡＣＡＴＡＴＴＣＡＡＧＣ３'）とＢＥＩ－ＮｌａＩＶ－Ｒ２（５'ＣＴＧＴＧＡＡＣＡＡＣＡＴＣＣＡＴＧＡＧＣＡＣ３'）プライマーとゲノミックＤＮＡを用いてＰＣＲを行った（Ｑｕｉｃｋ Ｔａｑ ＨＳ ｄｙｅ ｍｉｘ（ＴＡＫＡＲＡ製）５μＬ，４μＭ プライマー各０．５μＬずつ，ＤＮＡ １μＬ，蒸留水３μＬを混合し、９４℃２分×１サイクル、（９４℃ ３０秒、５０℃ ４５秒、６８℃１２０秒）×３５サイクル）。ＰＣＲ産物３μＬ，１０×制限酵素Ｂｕｆｆｅｒ １μＬ， ＮｌａＩＶ ０．２μＬ，蒸留水５．８μＬを混合し、３７℃で３０分以上反応させたのち、２μＬのＬｏａｄｉｎｇ ｄｙｅ（３６％グリセロール，０．０５％ＢＰＢ，０．０３５％キシレンサイアノール，３０ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加し、１×ＴＡＥ，０．８％アガロースゲルで泳動した。エチジウムブロマイドでゲルを染色すると、ＢＥＩＩｂに上記ＥＭ１０の変異がある場合は、１０２６ｂｐの単一バンドが、変異が無い場合は５７７ｂｐと４４７ｂｐの２本のバンドが得られた。
以上のように、得られるバンドの分子量の違いで、ＢＥＩ及びＢＥＩＩｂの欠損を確認した確実な材料を使って分析することが可能となる。

（澱粉の精製方法）
澱粉の精製は、冷アルカリ浸せき法（Ｙａｍａｍｏｔｏ他、Ｄｅｎｐｕｎ Ｋａｇａｋｕ ２８：２４１－２４４（１９８１））を用いた。
１０ｇの玄米を８０％まで精米し、０．１％のＮａＯＨを２００ｍＬ加えて一晩４℃で放置した。翌日、上清を捨て、乳鉢ですりつぶし、１５０μｍのメッシュに通して、３，０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。
沈殿に０．１％のＮａＯＨを６００ｍＬ加えて氷中で３時間振とうし、一晩４℃で放置した。
翌日、上清を捨て、蒸留水でけん濁し、１Ｎの酢酸で中和した。さらに、蒸留水で５回洗浄し、乾燥させ、乳鉢で粉体にした。

（澱粉の枝切り及びゲル濾過）
精製した澱粉５ｍｇに蒸留水０．２５ｍＬを加えて混合し、２ＮのＮａＯＨを０．２５ｍＬ加えて、３７℃で２時間糊化させた。
これに蒸留水３．６５ｍＬを加え、５ＮのＨＣｌを９０μＬ加えて中和させた。次に、１００ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）を１．５ｍＬ加え、Ｐ．ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａイソアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６８、林原生物化学研究所製）を１２．５μＬ（約８７５ｕｎｉｔ）加え、３７℃で２４時間揺らしながら反応させた。
そして、エタノールを５ｍＬ加え、ロータリーエバポレーターで乾固させた。これに蒸留水を０．４ｍＬ及び２ＮのＮａＯＨを０．４ｍＬ加えて、４℃で３０分間糊化させ、５μｍのフィルターで濾過した後、ろ液をゲル濾過カラムにアプライした。

使用したカラムは、ＴＳＫｇｅｌ ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ５５Ｓ（３００×２０ｍｍ）１本にＴＳＫｇｅｌ ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ５０Ｓ（３００×２０ｍｍ）３本（両カラムとも、ＴＯＳＯＨ社製）を直列に接続したものであり、溶離液は０．２％のＮａＣｌ／０．０５ＮのＮａＯＨを用いた。試験管１本あたり３ｍＬずつ分取し、６８本に分画し、各フラクションの澱粉ヨウ素複合体のλｍａｘを求めた。糖量は、カラムに接続したＲＩディテクター（ＲＩ８０２０、ＴＯＳＯＨ社製）で検出した。

（鎖長分布解析）
鎖長分布解析において、試料は、完熟種子１粒から外内穎及び胚を取り除き、ペンチで胚乳を粉砕した後、エッペンドルフチューブ内でプラスチック製ホモジナイザー（グライナー社製）を用いてさらに磨砕した粉末を用いた。
各々に５ｍＬのメタノールを加え、１０分間煮沸した。次に、２、５００ｘｇで１０分間遠心分離し、上清を除去し、９０％のメタノールを５ｍＬ加え２度洗浄した。
さらに、沈殿に５Ｎの水酸化ナトリウムを１５μＬ加え、５分間煮沸して澱粉を糊化させた。
その糊化液を氷酢酸９．６μＬで中和した後、蒸留水を１０８９μＬ、０．６Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ４．４）を１００μＬ、２％のアジ化ナトリウムを１５μＬ、Ｐ．ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａイソアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６８、林原生物化学研究所製）を２μＬ（約２１０ｕｎｉｔ）加え、スターラーバーで撹拌しながら３７℃で８時間以上反応した。
次に、イソアミラーゼを２μＬ追加して８時間以上反応した後、常温で１０，０００ｘｇで遠心分離し、上清を脱イオンカラム（ＡＧ５０１－Ｘ８（Ｄ）、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）で濾過した。
試料中の糖含量５～１０ｎｍｏｌ相当の還元末端をもつα－グルカン鎖を遠心濃縮機で乾燥させ、１－アミノピレン－３，６，８－三硫酸塩（ＡＰＴＳ）溶液（２．５％のＡＰＴＳ、１５％の酢酸）を２μＬ、シアン化ホウ素ナトリウム溶液（１Ｍのシアン化ホウ素ナトリウム、１００％のテトラヒドロフラン）を２μＬ添加し、５５℃で９０分間反応させた。
分析時には１２．５倍に蒸留水で希釈して用いた。鎖長分布解析は、キャピラリー電気泳動装置（Ｐ／ＡＣＥ ＭＤＱ、ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製）を用いて行った。
グルコース重合度（ＤＰ）３以上の各ピーク面積を数値化し、ＤＰ６０までのピーク面積の合計を１００％としたときの各ＤＰの割合（Ｍｏｌｅ％）を算出した。

（示差走査熱量測定器ＤＳＣ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ）による糊化温度の測定）
１０５℃で２時間乾燥させた澱粉、約３ｍｇに蒸留水９μＬを加えて混合し、昇温速度３℃／分で５℃から１００℃までの温度変化させたときの示差走査熱量をＤＳＣ６１００（セイコーインスツル株式会社製）で測定した。
その後、同機種のアプリケーションソフトを用いて、糊化開始温度、糊化ピーク温度、糊化終了温度、及び糊化熱量を算出した。

（難消化性澱粉含有率の測定）
まず、すり潰さない炊飯米の難消化性澱粉含有率の測定における炊飯方法について述べる。１５ｍＬフタ付き遠沈管に約１００ｍｇの精米（５～８粒）を秤量し、パスツールピペットを用いて遠沈管内でサンプルを２回水洗した。遠沈管内の水分が精米重量の１．５倍±０．３ｍｇの水量になるように蒸留水を加えた。すなわち、遠沈管内の全重量が精米の２．５倍になるようにした。遠沈管側面に付いた水を遠心分離機にかけて落とした。５合炊き炊飯器の炊飯釜に約２５０ｍＬの水道水を入れ、マイクロチューブスタンドとガラスシャーレ（直径１２ｃｍ）を置き、その上にサンプルの入った１５ｍＬ遠沈管をななめに置いて５合炊き炊飯器で炊飯した。
次に、すり潰さない炊飯米の難消化性澱粉含有率の測定における炊飯方法について述べる。１５ｍＬフタ付き遠沈管に約１ｇの精米を秤量し、上記と同様の方法で、加水量１．５倍になるように加水し、炊飯した。炊飯した精米を乳鉢ですり潰し、２５０ｍｇ秤量して難消化性澱粉含有率の定量に用いた。
玄米粉の難消化性澱粉含有率の測定の際は、玄米をペンチと乳鉢で粉砕し、それらを約１００ｍｇ測り取り、以下の方法で難消化性澱粉含有率の測定を行った。

難消化性澱粉含有率は、ＲＳ ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（メガザイム社製。以下、「ＲＳ測定キット」という。）により測定した。
ＲＳ測定キットの測定用のパンクレアチンα－アミラーゼ（１０ｍｇ／ｍＬ）＋アミログルコシターゼ（３Ｕ／ｍＬ）は以下の通り作成した。５０ｍＬ遠沈管に０．１Ｍマレート・ナトリウム・バッファー（ｐＨ ６．０）５０ｍＬと、ＲＳ測定キットに付属のブタ膵臓α－アミラーゼ０．５ｇを溶かし、氷上で５分間振とう機で撹拌した。３００Ｕ（ｕｎｉｔ）／ｍＬに希釈したアミログルコシターゼ（ＡＭＧ）溶液０．５ｍＬを加え撹拌し３，０００ｒｐｍ、２５℃、１０分遠心分離し、上清を新しい５０ｍＬ遠沈管に移した。この試薬は必要分等倍に変化させ、その都度作成した。

このように準備したパンクレアチンα－アミラーゼ（１０ｍｇ／ｍＬ）＋ＡＭＧ（３Ｕ／ｍＬ）４ｍＬを各炊飯米に加え、恒温振とう機（ＭＨ－１０，ＴＡＩＴＥＣ社製）を用いて１６４ｒｐｍ、３７℃で１６時間、激しく振とうさせた。１００％エタノール４ｍＬを加えて撹拌し、３，０００ｒｐｍ、２５℃、１０分間で遠心分離し、５０ｍＬ遠沈管に、すばやく上清を回収した。沈殿物に５０％エタノールを２ｍＬ入れて撹拌した後、再度５０％エタノールを８ｍＬ加え、全体量を１０ｍＬにし、撹拌した。３，０００ｒｐｍ、２５℃、１０分間で遠心分離して、上記の５０ｍＬ遠沈管にすばやく上清を移した。この作業をもう一度行い、沈殿（この中に含まれる難消化性澱粉をｒｓとする）と上清（この中に含まれる可溶化した澱粉量をｎｏｎ－ｒｓとする）を分離した。なお、この一連の操作の際に用いた遠心分離機は（Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ－３０Ｒ、ＢＥＣＫＭＡＮ社製）であり、スイングローター（ＳＸ４４００）のバケットを用いた。

沈殿に残っている上清をピペットでできるだけ取り除き、１５ｍＬ遠沈管に入っているｒｓをプラスチックペッスルで潰しながら、２ｍＬの２Ｍ ＫＯＨを加えた。スターラーバーを入れ、氷中で２０分撹拌した。１．２Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ３．８）を８ｍＬ、ＡＭＧ（３３００Ｕ／ｍＬ）を０．１ｍＬ加えて、ｒｓをグルコースまで分解させた。５分に１回ボルテックスで撹拌しながら、５０℃で３０分加熱し、４，５００ｒｐｍ、２５℃、１０分間で遠心分離した。
グルコースまで分解されたｒｓは遠沈管の目盛１１ｍＬ、ｎｏｎ－ｒｓは目盛３０ｍＬまで、蒸留水でメスアップした。ｒｓは難消化性澱粉が高いサンプル（難消化性澱粉が１５％を超えるもの）及び、ｎｏｎ－ｒｓは０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．５）で１０倍希釈した。各溶解液及び希釈液１０μＬとグルコース測定試薬（ＧＯＰＯＤ溶液）１５０μＬとをそれぞれ２ホールずつ９６穴のマイクロプレートの各穴にアプライした。また、別の穴に、検量線作成のためのグルコース溶液標準液（ｍｇ／ｍＬ）、その上から、０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．５）、グルコース測定試薬（ＧＯＰＯＤ溶液）をアプライした。マイクロプレートシートでふたをし、ハイブリオーブン（ＴＡＩＴＥＣ ＨＢ－８０）で５０℃、２０分間反応させた。反応後、マイクロプレートリーダーを用いて、５１０ｎｍの吸光度を測定した。
グルコース溶液の測定値から検量線を引き、各サンプルのグルコース濃度（μｇ／μＬ）を求め、１００ｍｇ精米中のｒｓ及びｎｏｎ－ｒｓ量を算出した。難消化性澱粉含有率を示す難消化性澱粉含有率（％）は以下の式（１）により算出した。

難消化性澱粉含有率（％）＝ｒｓ（ｍｇ）／［ｒｓ（ｍｇ）＋ｎｏｎ－ｒｓ（ｍｇ）］……式（１）

〔結果〕
まず、図１を参照して、ｂｅ１／ｂｅ２ｂ（＃１４０３）及びそれらの親変異体（ＥＭ５５７及びＥＭ１０）と野生型（台中６５号と金南風）の完熟胚乳から抽出したタンパク質のウエスタンブロッティングの結果について説明する。
なお、ＥＭ５５７及びＥＭ１０は、胚の突然変異源であるＭＮＵ（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｎ－ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ、メタンニトロソウレア）処理を用いて選抜した。ＭＮＵ処理は、文献（非特許文献６及びＹａｎｏ，Ｍ．， Ｏｋｕｎｏ， Ｋ．， Ｋａｗａｋａｍｉ， Ｊ．， Ｓａｔｏｈ， Ｈ． ａｎｄ Ｏｍｕｒａ， Ｔ． （１９８５） Ｈｉｇｈ ａｍｙｌｏｓｅ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ｒｉｃｅ， Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ． Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ ６９： ２５３－２５７．）に記載された方法に従って行った。
また、ＥＭ５５７の親系統は台中６５号、ＥＭ１０の親系統は金南風である。

具体的には、本実施例のイネ変異体は、ｂｅ１／ｂｅ２ｂ（＃１４０３）及びそれらの親変異体（ＥＭ５５７及びＥＭ１０）と野生型（台中６５号と金南風）である。選抜により得られたＦ３種子が、望みの遺伝子型をホモに持つかを確認するため、ウエスタンブロッティングでＢＥＩ及びＢＥＩＩｂのタンパク質バンドを検出した。

図１（ａ）の写真は、＃１４０３のＦ３種子及び親変異体及び野生型の種子各１粒から、ウレア緩衝液（８Ｍ Ｕｒｅａ，１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ，ｐＨ６．８，４％ＳＤＳ， ５％ ２－メルカプトエタノール）を用いて抽出したタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、ＢＥＩ抗体で検出を行ったウエスタンブロッティングの検出結果を示す。図１（ｂ）の写真は、ＢＥＩＩｂ抗体で検出した結果を示す。各レーンは、左から、＃１４０３の異なる種子（６粒）、ｂｅ１（ＥＭ５５７）、ｂｅ２ｂ（ＥＭ１０）、金南風及び台中６５号の種子１粒から抽出したタンパク質を示す。
＃１４０３のタンパク質を抽出したウエスタンブロッティングにおいては、いずれの種子でもＢＥＩ及びＢＥＩＩｂバンドが欠損していた。

次に、図２において、ＢＥＩ及びＢＥＩＩｂの欠損を確認するための分子マーカーを用いたＰＣＲ増幅後の制限酵素せん断したＤＮＡバンドパターンを示す。ＢＥＩ遺伝子が欠損しているときは、１７３ｂｐと３０ｂｐのバンドが、正常な場合は、２０３ｂｐのバンドが検出される。同様に、ＢＥＩＩｂ遺伝子が欠損しているときは、１０２６ｂｐのバンドが、正常な場合は、５７７ｂｐと４４７ｂｐの２本のバンドが検出される。＃１４０３の異なる６個体由来のＤＮＡでは、ＢＥＩにおいては、１７３ｂｐと３０ｂｐの２本のバンド、ＢＥＩＩｂ遺伝子においては、１０２６ｂｐのバンドが得られたことから、ＢＥＩ及びＢＥＩＩｂ遺伝子が欠損していることが証明された。

次に、図３を参照して、ｂｅ１／ｂｅ２ｂ二重変異体米及び、それらの親変異体（ＥＭ５５７及びＥＭ１０）と野生型（台中６５号と金南風）の各クローンの完熟玄米の形態について説明する。
各クローンにおいて、左図は完熟玄米の下から光を当てて撮影した写真、右図は完熟玄米の上から光を当てて撮影した写真である。ｂｅ１親変異体の種子は、野生型とほとんど変化が無かったが、ｂｅ２ｂのクローンであるＥＭ１０の種子は白濁し、野生型（日本晴）より小さかった。
これに対して、ｂｅ１／ｂｅ２ｂのクローンである＃１４０３の種子は、ｂｅ２ｂのＥＭ１０と同様、玄米全体が白く濁る「白濁」の形態を示した。これに加え、＃１４０３の種子の大きさは、ＥＭ１０と比べて大きかった。

また、図３は、ｂｅ１／ｂｅ２ｂ（＃１４０３）、それらの親変異体（ＥＭ５５７及びＥＭ１０）、及び野生型（台中６５号及び金南風）の玄米１粒重（ｍｇ）を測定したデータも示している。図３において、測定のｎ＝５０であり、玄米重量（ｍｇ）は平均±標準誤差、相対値は日本晴を１００としたときの値を、それぞれ示す。
このように、ｂｅ２ｂのクローンであるＥＭ１０は、野生型の５６．９％の種子重量であった。
また、ｂｅ１／ｂｅ２ｂのクローンである＃１４０３の玄米重量は野生型（金南風）の６２．６％と、親系統のＥＭ１０より有意に大きく、玄米重量のさらなる減少は見られなかった。

次に、図４を参照して、アミロペクチンの鎖長分布について説明する。
図４は、ｂｅ１／ｂｅ２ｂ（＃１４０３）、それらの親変異体（ＥＭ５５７及びＥＭ１０）、及び野生型（台中６５号及び金南風）の完熟胚乳のアミロペクチンの鎖長分布を示すグラフである。図４において、横軸は、ＤＰ（ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）は、グルコースの重合度を示す値である。縦軸は、Ｍｏｌａｒ（％）を示す。
ＢＥＩＩｂの単一変異体のクローンであるＥＭ１０は、ＤＰ≦１４の短鎖が野生型と比べて激減し、その代わりＤＰ≧１５の長鎖が増加していた。
また、ｂｅ１／ｂｅ２ｂのクローン＃１４０３は、ＥＭ１０のパターンに類似してＤＰ６～１４の短鎖の減少が大きいのが特徴であった。しかしながら、ＤＰ１０～１９の減少の程度はＥＭ１０より増加しており、ＤＰ２０以上の長鎖は、ＥＭ１０より増加していた。
以上のように、＃１４０３のアミロペクチンの鎖長分布パターンは、ＥＭ１０を野生型と比較した場合よりも、短鎖が減少し長鎖が増加する、より長鎖が多くなる特徴を示した。

次に、下記の表１を参照して、ゲル濾過法による澱粉構造解析について説明する。

表１において、測定のｎ＝３、エラーバーは標準誤差を示す。
澱粉を枝切りしたもののゲル濾過パターンは、３つのピークにわかれ、最も速く検出されるピーク（Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｉ）が見かけのアミロース、２番目に検出されるピーク（Ｆｒａｃｔｉｏｎ ＩＩ）がクラスターを連結するＢ２鎖より長いアミロペクチンの長鎖、３番目に検出されるピーク（Ｆｒａｃｔｉｏｎ ＩＩＩ）がアミロペクチンのクラスター内の短鎖である。表１は、それぞれｂｅ１／ｂｅ２ｂ（＃１４０３）、それらの親変異体（ＥＭ５５７及びＥＭ１０）、及び野生型（台中６５号及び金南風）のゲル濾過パターンから数値化したＦｒ．Ｉ～ＩＩＩの各フラクションの割合とＦｒ． ＩＩＩのＩＩに対する割合を示す。

ｂｅ１は、枝切りした澱粉のゲル濾過の結果、見かけのアミロース含量が野生型と同等であった。ｂｅ２ｂは、見かけのアミロース含量が野生型に比べて約１．５倍高い（非特許文献１９）。本実施例の実験結果においても、金南風の見かけのアミロース含量は２０．６％であるのに対し、ｂｅ２ｂのクローンＥＭ１０は２６．５％と約１．３倍の値を示した。
これに対して、ｂｅ１／ｂｅ２ｂのアミロース含量は５１．７％と、ｂｅ２ｂのクローンＥＭ１０よりも更に約２．０倍高かった。また、ｂｅ２ｂでは、短鎖の割合であるＩＩＩ／ＩＩ値が１．０と非常に小さいことから、アミロペクチンの長鎖の割合が非常に大きかった。ｂｅ１／ｂｅ２ｂは、この値が０．５であり、さらにアミロペクチンの長鎖の割合が高かった。

以上のことから、ｂｅ１／ｂｅ２ｂは、ｂｅ２ｂよりアミロペクチンの長鎖の割合が高いうえ、アミロース含量がｂｅ２ｂより格段に高い値を示す、ということが明らかとなった。
これにより、アミロペクチンの長鎖とアミロース含量が高い澱粉においては難消化性澱粉の割合が多い傾向があり、ｂｅ１／ｂｅ２ｂにおいても、澱粉の難消化性澱粉は非常に高くなることが分かる。このため、ダイエット素材を中心とした食品加工分野や添加剤及び工業資材として特徴的な製品を製造できると考えられる。

次に、下記の表２を参照して、ｂｅ１／ｂｅ２ｂの澱粉の糊化温度について説明する。

表２は、ｂｅ１／ｂｅ２ｂ（＃１４０３）、それらの親変異体（ＥＭ５５７及びＥＭ１０）、及び野生型（台中６５号及び金南風）の胚乳澱粉の糊化温度及び糊化熱量を示す表である。
具体的には、ｂｅ１／ｂｅ２ｂ（＃１４０３）、それらの親変異体（ＥＭ５５７及びＥＭ１０）、及び野生型（台中６５号及び金南風）の各澱粉糊試料の糊化開始温度、糊化ピーク温度、糊化終了温度、糊化熱量を示差走査熱量分析器（ＤＳＣ）で測定した結果を示す。
ＥＭ１０の糊化ピーク温度は金南風より約１６℃高かった。＃１４０３は、ＥＭ１０よりさらに７．５℃高く、測定した澱粉の中では最も高い糊化温度を示した。一方、＃１４０３の糊化熱量は、測定した澱粉の中で最も低い値を示した。上記の糊化の際に得られる吸熱反応は、アミロペクチンに由来しており、アミロース含量が極端に高い＃１４０３は、アミロペクチンが少ないため、糊化熱量も低かったものと考えられる。

次に、表３を参照して、ｂｅ１／ｂｅ２ｂの澱粉の難消化性澱粉含有率について説明する。

表３は、ｂｅ１／ｂｅ２ｂ（＃１４０３）、それらの親変異体（ＥＭ５５７及びＥＭ１０）、及び野生型（台中６５号及び金南風）に加え、比較対象として高難消化性澱粉米系統である３系統（高ＲＳ米系統Ａ～Ｃ）の精米の炊飯米及び玄米粉の難消化性澱粉量を示す表である。表３において、数値は平均±標準誤差（Ｎ＝３）を示す。
具体的には、ｂｅ１／ｂｅ２ｂ（＃１４０３）、それらの親変異体（ＥＭ５５７及びＥＭ１０）、及び野生型（台中６５号及び金南風）に加え、高ＲＳ米系統Ａ～Ｃの精米を１．５倍の加水量で炊飯し、すり潰していない炊飯米の難消化性澱粉含有率、乳鉢ですり潰した炊飯米及び加熱していない玄米粉をＲＳ測定キットで測定した結果を示す。

ここで、高ＲＳ米系統Ａは、ＢＥＩＩｂ活性が低下し、スターチシンターゼＩＩＩａ活性も低下した難消化性澱粉含有率が高い株である＃４０１９（特許文献５）を用いた。＃４０１９は、超多収米である秋田６３号と戻し交配を行うことで、種子重が元の１．５倍に増大したものである（非特許文献１９）。
高ＲＳ米系統Ｂは、ＥＭ１０を親系統として、アミロース含量が０％のモチ米の変異体と交配により作成した二重変異体である（特許文献６）。このモチ米と交配した二重変異体は、アミロースを含まないにもかかわらず、ＥＭ１０のアミロペクチンの平均鎖長が極端に長いという性質に由来する難消化性澱粉を備えている。なお、高ＲＳ米系統Ｂは、品種改良がおこなわれていないため、種子は非常に小さく、収量が上がらないため、実用性が非常に低い。
高ＲＳ米系統Ｃは、ＢＥＩＩｂ活性が低下したｂｅ２ｂの株の一例であるＥＭ１２９を多収品種と戻し交配して品種登録申請された、ちくし粉８５号である（非特許文献２２）。この高ＲＳ米系統Ｃは、血糖値上昇抑制作用が示され、ＥＭ１０と比べると多収である。

結果として、高ＲＳ米系統Ａの系統のすり潰さない炊飯米の難消化性澱粉含有率は１５．８％、すり潰した炊飯米の難消化性澱粉含有率は８．０％、玄米粉の難消化性澱粉含有率は４．７％といずれも親系統のＥＭ１０より低い値を示した。
高ＲＳ米系統Ｂは、アミロースが含まれず、玄米粉の難消化性澱粉含有率は３０．２％と高いにもかかわらずすり潰した炊飯米では、ＥＭ１０と比べると、難消化性澱粉含有率が比較的少なかった。
高ＲＳ米系統Ｃの難消化性澱粉含有率は、玄米粉では、１１．２％とＥＭ１０と同等の値を示すものの、炊飯米の難消化性澱粉含有率はＥＭ１０よりはるかに低くなっていた。

ここで、すり潰さない炊飯米の難消化性澱粉含有率は、精米度合いによってその数値が左右される。すなわち、種子が小さく、しわが寄ったＥＭ１０、＃１４０３、高ＲＳ系統Ｂは、精米した際、果皮が多く残っているので、それ以外の系統より難消化性澱粉含有率が高い値が出る傾向にある。一方、すり潰した炊飯米は、果皮が残っていたとしてもすり潰すことで胚乳の内部が露出するため、精米度合いには左右されにくい。すり潰さない炊飯米において、＃１４０３の難消化性澱粉含有率は７６．２％と、いずれの系統よりも格段に高い値を示した。

すり潰した炊飯米の難消化性澱粉含有率は、すり潰さない炊飯米よりいずれの系統でも低い値を示したが、＃１４０３は２８．４％と、ＥＭ１０や他の高ＲＳ米系統の中でも格段に高い値を示した。玄米粉については、高ＲＳ米系統Ｂでは、３０．２％と高い値を示したが、＃１４０３のＲＳは、これよりも高い３５．１％であった。
以上のように、炊飯米、玄米粉のいずれでも、＃１４０３のＲＳは、従来の高ＲＳ米の中でも格段に高い値を示すことが明らかになった。

なお、上記実施の形態の構成及び動作は例であって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更して実行することができることは言うまでもない。

本発明は、ジャポニカ米由来のイネ枝作り酵素Ｉ型（ＢＥＩ）及びＩＩｂ型（ＢＥＩＩｂ）の活性が低下したイネ二重変異体のイネ変異体のイネ種子は、イネでは類い希な難消化性澱粉含量となるため、産業上利用可能である。

Claims (12)

1. ジャポニカ米由来のイネ枝作り酵素Ｉ型（ＢＥＩ）及びＩＩｂ型（ＢＥＩＩｂ）の遺伝子座が劣性ホモであり、遺伝的に固定されており、非遺伝子組み換え体であり、
   前記ＢＥＩ及び前記ＢＥＩＩｂは両者とも欠損しており、前記欠損は、前記ＢＥＩの遺伝子の第１０エキソンの最後の塩基がグアニンからアデニンへ変異し、前記ＢＥＩＩｂの遺伝子の第９イントロンの最後の塩基がグアニンからアデニンに変異していることであり、
   親系統である野生型の種子の胚乳澱粉と比較して、アミロペクチンの鎖長分布のうち、少なくともグルコース重合度（ＤＰ）６～１６が減少し、且つＤＰ１７以上が増加している
   ことを特徴とする難消化性澱粉高含有イネ変異体。
2. 精米後のイネ種子は、難消化性澱粉の含有率が、前記親系統であるＢＥＩＩｂ欠損変異体よりも多い
   ことを特徴とする請求項１に記載の難消化性澱粉高含有イネ変異体。
3. 前記イネ種子を炊飯した場合、
   すり潰さない状態の炊飯米における前記難消化性澱粉の含有率が６０％以上、すり潰した状態の炊飯米における前記難消化性澱粉の含有率が２０％以上であり、
   前記イネ種子の玄米粉における前記難消化性澱粉の含有率が３２％以上である
   ことを特徴とする請求項２に記載の難消化性澱粉高含有イネ変異体。
4. 前記イネ種子の胚乳から製造される澱粉は、前記親系統であるＢＥＩＩｂ欠損変異体のイネ種子の胚乳から製造される澱粉と比べて、アミロペクチンの鎖長分布のうち、ＤＰ１９以下が減少され、ＤＰ２０以上が増加される
   ことを特徴とする請求項２又は３に記載の難消化性澱粉高含有イネ変異体。
5. 前記イネ種子の胚乳から製造される澱粉は、
   前記親系統であるＢＥＩＩｂ欠損変異体のイネ種子の胚乳から製造される澱粉よりも、糊化ピーク温度が７℃以上高い
   ことを特徴とする請求項２乃至４のいずれか１項に記載の難消化性澱粉高含有イネ変異体。
6. 前記イネ種子の胚乳から製造される澱粉は、算出されたアミロースの割合が５０％以上である
   ことを特徴とする請求項２乃至５のいずれか１項に記載の難消化性澱粉高含有イネ変異体。
7. 前記イネ種子は、粉末化することで米粉、粥を攪拌することで米ゲルとしても利用可能である
   ことを特徴とする請求項２乃至６のいずれか１項に記載の難消化性澱粉高含有イネ変異体。
8. 請求項２乃至６のいずれか１項に記載の難消化性澱粉高含有イネ変異体の前記イネ種子の胚乳を粉末化して米粉を製造する
   ことを特徴とする米粉製造方法。
9. 請求項２乃至７のいずれか１項に記載の難消化性澱粉高含有イネ変異体の前記イネ種子の炊飯米、及び／又は請求項８に記載の米粉製造方法により製造された米粉より難消化性澱粉を抽出する
   ことを特徴とする難消化性澱粉製造方法。
10. 請求項２乃至７のいずれか１項に記載の難消化性澱粉高含有イネ変異体の前記イネ種子の粥を攪拌して米ゲルを製造する
    ことを特徴とする米ゲル製造方法。
11. 請求項２乃至７のいずれか１項に記載の難消化性澱粉高含有イネ変異体の前記イネ種子、請求項８に記載の米粉製造方法により製造された米粉、請求項９に記載の難消化性澱粉製造方法により製造された難消化性澱粉、及び請求項１０に記載の米ゲル製造方法により製造された米ゲルのいずれか又は任意の組み合わせを含んで製造する
    ことを特徴とする食品製造方法。
12. 非遺伝子組み換えの方式により、ジャポニカ米由来のイネ枝作り酵素Ｉ型（ＢＥＩ）及びＩＩｂ型（ＢＥＩＩｂ）の二重劣性ホモ変異体を作出させ、遺伝的に固定させ、
    前記ＢＥＩ及び前記ＢＥＩＩｂの両者とも欠損しており、前記欠損として、前記ＢＥＩの遺伝子の第１０エキソンの最後の塩基がグアニンからアデニンへ変異し、前記ＢＥＩＩｂの遺伝子の第９イントロンの最後の塩基がグアニンからアデニンに変異している一塩基置換を分子マーカーとして、前記二重劣性ホモ変異体を特定し、
    前記二重劣性ホモ変異体は、親系統である野生型の種子の胚乳澱粉と比較して、アミロペクチンの鎖長分布のうち、少なくともグルコース重合度（ＤＰ）６～１６が減少し、且つＤＰ１７以上が増加している
    ことを特徴とする難消化性澱粉高含有イネ変異体の作出方法。

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