CN103298940B - 高直链淀粉的小麦 - Google Patents

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Abstract

提供一种小麦籽粒（普通小麦），包含一个胚、淀粉以及一种、两种或三种SBEIIa蛋白，所述胚包含一种SBEIIa-A基因的两个相同的等位基因、一种SBEIIa-B基因的两个相同的等位基因以及一种SBEIIa-D基因的两个相同的等位基因，其中该淀粉具有占该籽粒的可提取淀粉的比例至少50%（w/w）的一个直链淀粉含量，并且其中这些SBEIIa蛋白中的至少一种是在发育中的小麦胚乳中产生的并且具有淀粉分支酶活性。

Description

高直链淀粉的小麦
本申请要求于2010年11月4日提交的美国临时申请号61/410,288的优先权，该申请的内容通过引用结合在此。
技术领域
本说明书描述了获得多种具有高直链淀粉的六倍体小麦植株的方法以及这些植株、并且特别是来自这些植株的籽粒或淀粉在食物和非食物产品范围内的用途。
背景技术
本说明书中著者所参考的出版物的文献目录详情收录于说明书的结尾处。
本说明书中对任何现有技术的提及都不是并且不应视为对此现有技术形成任何国家中的一般常识的一部分的承认或任何形式的提议。
在过去的十年中，关于支持植物生命周期和植物生产的分子、遗传以及细胞事件已经知道了很多。一种尤其重要的植物产品是小麦籽粒。小麦籽粒是许多国家的一种主粮，并且它为整个世界人口提供了至少20％的食物千焦耳。淀粉是小麦籽粒的主要组分，并且用于大范围的食物和非食物产品中。淀粉的特性会变化并且它们在测定小麦淀粉对于一种具体的最终用途的适用性中起到关键作用。尽管有这么庞大的全球消耗量，并且尽管已经逐渐意识到淀粉功能对最终产品质量的重要性，但是对小麦中的遗传变异和它对淀粉的特性的确切影响的研究仍滞后于其他在商业上重要的植物作物。
面包小麦(普通小麦)是具有对基因组A、B以及D进行定义的三对部分同源染色体的一种六倍体。籽粒的胚乳包含了来自一个母细胞的2个单倍体组和来自一个父细胞的1个单倍体组。小麦籽粒的胚包含了来自该母系和父系细胞中的每一个的一个单倍体组。在研究和开发有用的小麦变异体中，六倍性已被视为一个重大的障碍。事实上，关于小麦的多个部分同源基因如何相互作用、它们的表达如何被调节、以及由多个部分同源基因制造的不同蛋白如何独立或协同地工作所知甚少。
谷物淀粉由两种葡萄糖聚合物，直链淀粉和支链淀粉组成。直链淀粉与支链淀粉的比率在以下方面似乎是一个主要决定因素：(i)小麦籽粒和小麦淀粉的健康益处和(ii)包含小麦淀粉的产品的最终质量。
直链淀粉是α-1，4连接的葡萄糖单元的一个基本上线性的聚合物，而支链淀粉高度地分支，具有连接线性链的α-1，6糖苷单元键。
高直链淀粉因它们的健康益处而受到特别关注。已特别地发现包含高直链淀粉的食物的抗性淀粉(一种膳食纤维形式)天然地更高。RS是在小肠中不被消化或吸收的淀粉或淀粉消化产物。已逐渐看出抗性淀粉在促进肠健康状况以及预防如结肠直肠癌、II型糖尿病、肥胖、心脏病以及骨质疏松症的疾病中具有重要作用。作为一种促进肠健康状况的手段，已经在用于食物中的如玉米和大麦的某些籽粒中开发高直链淀粉的淀粉。抗性淀粉的有益作用是由向大肠提供一种营养素而产生，在大肠中肠内微生物群落被给予一种能源，该能源经发酵以尤其形成短链脂肪酸。这些短链脂肪酸为结肠细胞提供营养素，增强某些营养素在大肠上的摄取并且促进结肠的生理活动。总体上，如果不向结肠提供抗性淀粉或其他膳食纤维，那么结肠在代谢上会变得相对不活跃。因此，高直链淀粉产品具有促使纤维消耗增加的潜力。消耗高直链淀粉的小麦籽粒或它们的产品(如淀粉)的一些潜在健康益处包括它在以下方面的作用：调节糖和胰岛素以及脂质的水平；促进肠健康状况；制造出促进饱腹感的热量值更低的食物；改善排便、粪便的水体积；促进益生菌的生长；以及增加粪便的胆酸排泄。
大部分经过加工的含淀粉的食物包含极少的RS。使用野生型小麦面粉和一种常规的配制与烘焙工艺制得的面包包含＜1％RS。比较起来，使用相同的烘焙工艺和储存条件但包含被改性的高直链淀粉的小麦的面包具有差不多高10倍的RS水平(参见国际公开号WO2006/069422)。作为人类膳食中RS的少数丰富来源之一的豆类包含通常＜5％的RS水平。因此，以成人通常所消耗的量(例如200g/d)计，高直链淀粉的小麦面包的消耗将轻易地提供至少5-12g的RS。因此，将高直链淀粉的小麦结合到食物产品中具有对多个发达国家(在这些发达国家中RS的平均每日摄取量据估算仅约5g)的膳食RS摄取量作出一个巨大贡献的潜力。
淀粉被广泛用于食品、造纸以及化学工业。淀粉的物理结构可以对用于食物或非食物或工业产品的淀粉的营养和操作性质具有一个重要的影响。某些特性可以被视为淀粉结构的一个指示，包括支链淀粉链长的分布、结晶度和结晶的类型、以及如糊化温度、粘度以及膨胀体积的性质。支链淀粉链长的变化可以是支链淀粉改变的结晶度、糊化或回生的一个指标。
虽然以化学方式或以其他方式改性的淀粉可以用于食物中，这些食物提供了通常不会通过未被改性的来源获得的功能，但这类加工具有使其他有价值的组分改变或带来因改性中涉及的工艺所引起的不希望的感受的一个倾向。因此，优选的是提供可以按未被改性的形式用于食物中的组分的来源。
淀粉起初在植物中的光合作用组织(如叶片)的叶绿体中以过渡淀粉的形式合成。这在随后的暗期过程中被调动，从而供应碳以输出到库器官和能量代谢或用于储存于如种子或块茎的器官中。淀粉的合成和长期储存发生于如胚乳的储存器官的淀粉体中，在这些淀粉体中淀粉是以直径高达100μm的半结晶颗粒形式沉积的。这些颗粒包含直链淀粉和支链淀粉两者，前者在天然淀粉颗粒中典型地为非晶相物质，而后者通过线性糖苷链的堆叠而成为半结晶。这些颗粒还包含了参与淀粉生物合成的一些蛋白。
胚乳中淀粉的合酶是在四个基本步骤中进行的。ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(ADGP)催化ADP-葡萄糖从葡萄糖-1-磷酸和ATP合成。接着，淀粉合酶促进ADP-葡萄糖转移到一个α-1，4连接的葡萄糖单元的末端。第三，淀粉分支酶(SBE)在α-聚葡聚糖中形成新的α-1，6键。接着，淀粉脱支酶(SDBE)通过尚未得到充分解答的一个机制去除一些分支键。
虽然清楚对于高等植物中的正常淀粉颗粒合成来说需要至少这四种活性，但在高等植物的胚乳中发现了参与这四种活性之一的酶的多种同工型。已基于突变分析或通过使用转基因方法的基因表达水平的修饰，提出了一些同工酶的特殊作用(亚伯(等人)，1996；乔布林(Jobling)等人，1999；施瓦尔(Schwall)等人，2000)。然而，每种活性的每一同工型对淀粉生物合成的确切贡献仍然未知，并且这些贡献似乎在物种之间明显地不同。
在谷物胚乳中，存在ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(ADGP)的两种同工型，一种形式在淀粉体内，并且一种形式在细胞质中。每种形式由两个亚基类型组成。玉米中的皱缩(sh2)和脆性(bt2)突变体分别代表了大亚基和小亚基的损伤。
一些努力已集中于淀粉合酶以研究对小麦中的直链淀粉/支链淀粉比率进行调制的策略(参见塞斯蒂利(Sestili)等人2010)。
在谷物胚乳中发现了四个种类的淀粉合酶(SS)，即，只位于淀粉颗粒内的一种同工型(颗粒结合型淀粉合酶(GBSS))、分配于颗粒与可溶性部分之间的两种形式(SSI和SSII)以及全部位于可溶性部分中的一个第四形式(SSIII)。已展示GBSS对于直链淀粉合成是必需的，并且已展示SSII和SSIII中的突变改变了支链淀粉结构。
完全缺乏SGP-1(SSIIa)蛋白的一个突变的小麦植株是通过使缺乏SGP-1(SSII)蛋白的A、B以及D基因组特定形式的多个株系杂交而产生的(山守(Yamamori)等人，2000)。对SSII无效型种子的检查展示了该突变引起支链淀粉结构的变化、淀粉颗粒变形、以及达到淀粉的约30％-37％的升高的相对直链淀粉含量(这是相对于野生型水平的约8％的增加)(山守等人，2000)。直链淀粉是通过比色测量、电流滴定(两者都是针对碘结合)以及一种伴刀豆球蛋白A法测量的。来自SSII无效型突变体的淀粉展现了与来自一种等效的非突变植株的淀粉相比一个降低的糊化温度。淀粉含量从野生型中的60％减少到SSII无效型籽粒中的低于50％。
在玉米中，dull1突变引起胚乳中的淀粉含量减少以及直链淀粉水平增加(其中变化的程度取决于遗传背景)、以及剩余支链淀粉中的分支程度增加。与该突变相对应的基因通过一种转座子标记策略使用转座子增变基因(Mu)得以鉴别和分离，并且展示出编码被称为淀粉合酶II(SSII)的酶。该酶现在被公认为谷物中SSIII家族的一名成员。突变的胚乳具有与dull1突变相关的水平减小的SBEIIa活性。尚不知道这些发现是否与其他谷物有关。
已鉴别出在籽粒淀粉中具有升高的比例的直链淀粉的大麦株系。这些株系包括高直链淀粉冰川(HighAmyloseGlacier；AC38)，它具有约45％的一个相对直链淀粉含量、以及大麦的SSIIa基因中以化学方式诱导的多个突变(这些突变使种仁淀粉中的直链淀粉水平升高到约65％-70％)(WO02/37955A1；莫雷尔(Morell)等人，2003)。该淀粉展示了降低的糊化温度。
已知植物中SBE的两个主要种类，SBEI和SBEII。SBEII在谷物中可以进一步分类为两个类型，SBEIIa和SBEIIb。在一些谷物中也报导了SBE的多个另外的形式，来自小麦的一种推定的149kDaSBEI和来自大麦的一种50/51kDaSBE。
序列比对揭露了在核苷酸和氨基酸两个水平上序列的高度相似性，并且允许归类到SBEI、SBEIIa以及SBEIIb种类中。SBEIIa和SBEIIb总体上展现彼此约80％的核苷酸序列一致性，尤其是在基因的中央区域中。
在玉米和稻米中，已展示出高直链淀粉表型是由SBEIIb基因(也称为直链淀粉扩充(ae)基因)的损伤引起(博耶(Boyer)和普赖斯(Preiss)，1981；水野(Mizuno)等人，1993；西(Nishi)等人，2001)。在这些SBEIIb突变体中，胚乳淀粉粒展示出一个异常的形态，直链淀粉含量显著升高，残留支链淀粉的分支频率减小，并且短链(＜DP17，尤其DP8-12)的比例更低。此外，淀粉的糊化温度增加。另外，存在被定义为介于直链淀粉与支链淀粉之间的“中间物”的一大批物质(博耶等人，1980，竹田(Takeda)等人1993b)。相比之下，由一个增变基因(Mu)插入元件引起并且因此缺乏SBEIIa蛋白表达的SBEIIa基因中的玉米植株突变体与野生型植株在胚乳淀粉的分支方面难以区分(布劳特(Blauth)等人，2001)，不过它们在叶片淀粉中发生变化。在玉米和稻米两项中，SBEIIa和SBEIIb基因在基因组中并不连锁。
SBEIIa、SBEIIb以及SBEI也可以根据它们在胚乳和其他组织中的在时间和空间两方面的表达模式来区分。SBEI从中期胚乳发育起表达于小麦和玉米中(莫雷尔等人，1997)。相比之下，SBEIIa和SBEIIb从胚乳发育的早期表达。在玉米中，SBEIIb是胚乳中的主要形式，而SBEIIa以高表达水平存在于叶片中(高(Gao)等人，1997)。在稻米中，在胚乳中发现了近似等量的SBEIIa和SBEIIb。然而，在表达的时间安排和组织方面存在差异。SBEIIa是在种子发育的早期表达，在开花后3天检测到，并且表达于叶片中，而SBEIIb在开花后3天不可检测到，并且在开花后7-10天在发育中的种子中最为丰富，并且不表达于叶片中。在小麦胚乳中，发现SBEI(莫雷尔等人，1997)只处于可溶性部分中，而在可溶性部分和淀粉颗粒相关部分两者中发现了SBEIIa和SBEIIb(拉赫曼(Rahman)等人，1995)。
知晓玉米的极高直链淀粉的品种已有一段时间。包含极高直链淀粉含量(＞90％)的低支链淀粉玉米是通过使SBEI活性明显减小以及SBEII活性的几乎完全失活来获得的(西德博特姆(Sidebottom)等人，1998)。
在马铃薯中，利用反义方法使块茎中的主要SBE(SBEB，相当于SBEI)下调引起了一些新颖的淀粉特性但并不改变直链淀粉含量(萨福德(Safford)等人，1998)。SBE的较不丰富形式(SBEA，类似于谷物中的SBEII)的反义抑制引起了直链淀粉含量适度增加到38％(乔布林等人，1999)。然而，与单独SBEII的下调相比，SBEII和SBEI两者的下调使相对直链淀粉含量增加大得多，达到60％-89％(施瓦尔等人，2000)。
国际公开号WO2005/001098和国际公开号WO2006/069422尤其描述了转基因六倍体小麦，该转基因六倍体小麦包含使胚乳中的SBEIIa和/或SBEIIb的表达减少的外源性双链RNA构建体。来自转基因株系的籽粒不携带SBEIIa和/或SBEIIb蛋白或蛋白水平减小。来自胚乳的SBEIIa蛋白的损失与增加超过50％的相对直链淀粉水平相关。SBEIIb蛋白水平的损失似乎并不实质上改变直链淀粉在籽粒淀粉中的比例。已提出但未经证实的是，实质上缺乏SBEIIa和SBEIIb蛋白的表达的SBEIIa和/或SBEIIb三无效突变体将引起直链淀粉水平的进一步升高。然而，尚不知晓或从现有技术尚不可预测的是，为提供占总淀粉比例至少50％的高直链淀粉水平将需要多少SBEIIa和/或SBEIIb的突变的等位基因。同样未知的是，三无效基因型的籽粒是否将能成活或者这些小麦植株是否将能繁育。
本领域中存在对改善的高直链淀粉的小麦植株和其制造方法的需求。
概述
贯穿本说明书，除非上下文另外需要，否则“包含(comprise)”一词或其变化形式(如“包含了”或“包含着”)应被理解为意指包括所陈述的要素或完整的事物、或者多个要素或多个完整的事物的群组，但不排除任何其他要素或完整的事物、或者多个要素或多个完整的事物的群组。
除非上下文另外清楚地指示，否则如在此所使用的单数形式“一个/种(a/an)”和“该”包括复数方面。因此，举例来说，提及“一个突变”包括单一突变以及两个或更多个突变；提及“一个植株”包括一个植株以及两个或更多个植株；等等。
除非另外明确地说明，否则本说明书中的每个实施例在进行必要的修改后适用于所有其他实施例。
基因和其他遗传物质(例如mRNA、构建体等)以斜体字表示，并且它们的蛋白质表达产物以非斜体形式表示。因此，举例来说，SBEIIa是SBEIIa的表达产物。
核苷酸和氨基酸序列利用一个序列识别号(SEQIDNO：)提及。多个SEQIDNO：在数字上与多个序列识别符<400>1(SEQIDNO：1)、<400>2(SEQIDNO：2)等相对应。在权利要求书之后提供了一个序列清单。
除非另外定义，否则在此使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。尽管与在此描述的那些类似或等效的任何方法和材料都可以用于实施或测试本发明，但描述了优选的方法和材料。
本发明提供了具有改性的淀粉特性的一系列小麦植株。
在一个实施例中，本发明提供了小麦籽粒(普通小麦)，该小麦籽粒包含一个胚乳和低水平或活性的总SBEII蛋白或SBEIIa蛋白，该低水平或活性是一种野生型小麦籽粒中的总SBEII或SBEIIa蛋白的水平或活性的2％到30％，并且其中该籽粒包含占该籽粒中的总淀粉的比例至少50％(w/w)、或至少60％(w/w)、或至少67％(w/w)的一个直链淀粉含量。
在一个实施例中，本发明提供了包含一个胚和淀粉的小麦籽粒，其中该胚包含一种SBEIIa-A基因的两个相同的等位基因、一种SBEIIa-B基因的两个相同的等位基因以及一种SBEIIa-D基因的两个相同的等位基因，其中这些SBEIIa基因中的每一种产生比相应野生型基因更低的量的蛋白(w/w)或具有比相应野生型基因低的SBEIIa活性的蛋白，并且所述基因中的至少一种包含一个点突变，其中该淀粉包含直链淀粉使得该籽粒具有占该籽粒的可提取淀粉的比例至少50％(w/w)的一个直链淀粉含量。
在一个实施例中，本发明提供了小麦籽粒，该小麦籽粒包含一个胚、淀粉以及一种、两种或三种SBEIIa蛋白，所述胚包含一种SBEIIa-A基因的两个相同的等位基因、一种SBEIIa-B基因的两个相同的等位基因以及一种SBEIIa-D基因的两个相同的等位基因，其中该淀粉具有占该籽粒的可提取淀粉的比例至少50％(w/w)的一个直链淀粉含量，并且其中这些SBEIIa蛋白中的至少一种是在发育中的小麦胚乳中产生的并且具有淀粉分支酶活性。
在一些实施例中，SBEIIa蛋白的量和活性降低。因此，举例来说，本发明的一个籽粒可以包含降低的量的SBEIIa蛋白(w/w)，该SBEIIa蛋白具有降低的SBEIIa活性。
在不同的实施例中，该籽粒中的总SBEII或SBEIIa蛋白的水平或活性是野生型籽粒中的总SBEII或SBEIIa蛋白的水平或活性的不到2％或2％到15％、或3％到10％、或2％到20％或2％到25％。
在一些实施例中，该籽粒中的SBEIIa蛋白的量或活性是一种野生型小麦籽粒中的SBEIIa蛋白的量或活性的不到2％。
在另一个方面中，该籽粒是来自六倍体小麦。
在一个实施例中，该籽粒是来自六倍体小麦并且包含一个胚，其中该胚在选自下组的多种内源性SBEII基因的5到12个等位基因中的每一个中包含一个功能丢失突变，该组由以下各项组成：SBEIIa-A、SBEIIa-B、SBEIIa-D、SBEIIb-A、SBEIIb-B以及SBEIIb-D。在一个具体实施例中，包括4、5或6个SBEIIa等位基因的所述5到12个等位基因各自包含一个功能丢失突变。在另一个具体实施例中，当包含一个功能丢失突变的SBEIIa等位基因的数目仅为4时，那么包含一个功能丢失突变的SBEIIb等位基因的数目为6。在另一个实施例中，当包含一个功能丢失突变的SBEIIa等位基因的数目为6时，那么至少两个SBEIIb等位基因包含一个部分功能丢失突变。在另一个实施例中，该六倍体小麦胚不具有这些SBEIIb基因的无效等位基因，或具有这些SBEIIb基因的仅1个、仅2个、仅3个、仅4个、仅5个或6个无效等位基因。
在另一个实施例中，该六倍体小麦胚具有这些SBEIIa基因的仅2个、仅3个、仅4个或仅5个无效等位基因。
在一些实施例中，该六倍体小麦胚具有这些SBEIIa基因的6个无效等位基因。
在一些实施例中，该籽粒或胚仅具有1个无效SBEIIa基因。
在一些实施例中，该籽粒或胚仅具有2个无效SBEIIa基因。
在另一个实施例中，该六倍体小麦胚不具有这些SBEIIb基因的无效等位基因，或具有这些SBEIIb基因的仅1个、仅2个、仅3个、仅4个、仅5个或6个无效等位基因。
在又另一个实施例中，这些SBEIIa或SBEIIb基因的多个无效等位基因是在A基因组、B基因组、D基因组、A和B基因组、A和D基因组、A和D基因组、或所有三种该A、B以及D基因组上。
在又另一个实施例中，该六倍体小麦胚包含这些SBEIIa基因的0、1、2、3、4、5或6个部分功能丢失的等位基因。在一些情况下，该SBEIIa基因的部分功能丢失的等位基因是在A基因组、B基因组、D基因组、A和B基因组、A和D基因组、A和D基因组、或所有三种该A、B以及D基因组上。
另外，在一些实施例中，该六倍体小麦胚包含这些SBEIIb基因的0、1、2、3、4、5或6个部分功能丢失的等位基因。在一些情况下，该SBEIIb基因的部分功能丢失的等位基因是在A基因组、B基因组、D基因组、A和B基因组、A和D基因组、A和D基因组、或所有三种该A、B以及D基因组上。
在其他实施例中，这些SBEIIa或SBEIIb基因的部分功能丢失的等位基因是在A基因组、B基因组、D基因组、A和B基因组、A和D基因组、A和D基因组、或所有三种该A、B以及D基因组上。
在另一个实施例中，该六倍体小麦胚包含了各自包含一个无效或部分功能丢失突变的5个SBEIIa等位基因和呈野生型的1个SBEIIa等位基因。
在另一个实施例中，该籽粒是来自四倍体小麦。
在另一个实施例中，本发明提供了来自四倍体小麦的小麦籽粒，其中该籽粒包含一个胚乳和低水平或活性的总SBEII蛋白或SBEIIa蛋白，该低水平或活性是一种野生型小麦籽粒中的总SBEII或SBEIIa蛋白的水平或活性的2％到30％，并且其中该籽粒包含占该籽粒中的总淀粉的比例至少50％(w/w)、或至少60％(w/w)、或至少67％(w/w)的一个直链淀粉含量。
在一些实施例中，其中该胚在选自下组的多种内源性SBEII基因的5到8个等位基因中的每一个中包含一个功能丢失突变，该组由以下各项组成：SBEIIa-A、SBEIIa-B、SBEIIb-A以及SBEIIb-B，所述5到8个等位基因包括各自包含一个功能丢失突变的2、3或4个SBEIIa等位基因，并且其中当包含一个功能丢失突变的SBEIIa等位基因的数目仅为2时，那么包含一个功能丢失突变的SBEIIb等位基因的数目为4，并且当包含一个功能丢失突变的SBEIIa等位基因的数目为4时，那么至少一个、优选地至少两个这类等位基因包含一个部分功能丢失突变。
在一些实施例中，该胚具有这些SBEIIa基因的仅2个、或仅3个无效等位基因。
在一个具体实施例中，该四倍体小麦胚不具有这些SBEIIb基因的无效等位基因，或具有这些SBEIIb基因的仅1个、仅2个、仅3个或4个无效等位基因。
在一些实施例中，该一种SBEIIb蛋白是由该A基因组、该B基因组或D基因组编码，或者这两种SBEIIb蛋白是由该A和B基因组、A和D基因组、或B和D基因组编码。
在一些实施例中，该无效突变独立地选自下组，该组由以下各项组成：一个缺失突变、一个插入突变、一个剪接位点突变、一个翻译提前终止突变、以及一个移码突变。
在一些实施例中，这些SBEIIa或SBEIIb基因的这些无效等位基因是在该A基因组、B基因组、或该A和B基因组两者上。
在其他实施例中，该四倍体小麦胚包含这些SBEIIa基因的0、1、2、3或4、5、或6个部分功能丢失的等位基因。
在其他实施例中，该胚包含这些SBEIIb基因的0、1、2、3或4个部分功能丢失的等位基因。
在又另一个实施例中，这些SBEIIa或SBEIIb基因的这些部分功能丢失的等位基因是在该A基因组、B基因组、或该A和B基因组两者。
在一些实施例中，该胚对于在2或3种SBEIIa基因中的每一种和/或2或3种SBEIIb基因中的每一种中的多个突变的等位基因来说是纯合的。
在其他实施例中，该胚对于2或3种SBEIIa基因中的每一种和/或2或3种SBEIIb基因中的每一种来说是杂合的。
有用的是，在本发明的不同的实施例中，该籽粒包含SBEIIa和/或SBEIIb的无效等位基因和部分功能丢失的等位基因两者，其中这些无效等位基因中的每一个位于一个与这些部分功能丢失的等位基因中的每一个不同的基因组上。
在涉及这些无效等位基因的一些实施例中，每个无效突变独立地选自下组，该组由以下各项组成：一个缺失突变、一个插入突变、一个剪接位点突变、一个翻译提前终止突变、以及一个移码突变。在一个实施例中，这些无效突变中的一个或多个是非保守氨基酸取代突变，或者一个无效突变具有两个或更多个非保守氨基酸取代的组合。在此情况下，非保守氨基酸取代是如在此所定义。该籽粒可以包含在两种SBEIIa基因中的每一种中的每一个是无效突变的多个突变、和在一种第三SBEIIa基因中的一个氨基酸取代突变，其中这些无效突变中的每一个优选地是多个翻译提前终止突变或多个缺失突变、或一个翻译提前终止突变与一个缺失突变，并且该氨基酸取代突变是一个保守氨基酸取代或优选地是一个非保守氨基酸取代。
在一些广泛的实施例中，本发明的籽粒包含一个或多个无效突变或部分功能丢失突变，这些突变是多个氨基酸取代突变，它们独立地是多个非保守或保守氨基酸取代。
在一些实施例中，本发明的籽粒包含一个点突变，该点突变是一个氨基酸取代突变。
在本发明的一些实施例中，这些SBEIIa-A、SBEIIa-B或SBEIIa-D基因中的一种包含一个点突变，使得由所述基因编码的蛋白缺乏淀粉分支酶活性。
在一些实施例中，本发明的籽粒具有多个无效等位基因，这些无效等位基因是该B和D基因组中分别使该SBEIIa-B和SBEIIa-D基因的至少一部分缺失的缺失突变，并且其中该SBEIIa-A基因包含该点突变；或者具有多个无效等位基因，这些无效等位基因是该A和D基因组中分别使该SBEIIa-A和SBEIIa-D基因的至少一部分缺失的缺失突变，并且其中该SBEIIa-B基因包含该点突变；或具有多个无效等位基因，这些无效等位基因是该A和B基因组中分别使该SBEIIa-A和SBEIIa-B基因的至少一部分缺失的缺失突变，并且其中该SBEIIa-D基因包含该点突变。
在本发明的一些实施例中，该胚包含6个SBEIIb等位基因，这些SBEIIb等位基因中的至少一个具有一个功能丢失突变。
在本发明的一些实施例中，该胚不具有这些SBEIIb基因的无效等位基因，或具有这些SBEIIb基因的仅2个、仅4个或6个无效等位基因。
在一些实施例中，该籽粒包含一个无效突变，该无效突变为该A、B或D基因组中的一个缺失突变，该缺失突变使一种SBEIIa基因的至少一部分和一种SBEIIb基因的至少一部分缺失，优选地，该缺失突变使整个的该SBEIIa基因和/或该SBEIIb基因缺失。
在一些实施例中，本发明的籽粒包含一个无效突变，该无效突变是该B基因组中的一个缺失突变，该缺失突变使该SBEIIa-B基因的至少一部分和该SBEIIb-B基因的至少一部分缺失，优选地该缺失突变使整个的该SBEIIa-B基因和/或该SBEIIb-B基因缺失；或者包含一个无效突变，该无效突变是该D基因组中的一个缺失突变，该缺失突变使该SBEIIa-D基因的至少一部分和一种SBEIIb-D基因的至少一部分缺失，优选地该缺失突变使整个的该SBEIIa-D基因和/或该SBEIIb-D基因缺失；或者包含一个无效突变，该无效突变是该B基因组中的一个缺失突变，该缺失突变使该SBEIIa-A基因的至少一部分和该SBEIIb-A基因的至少一部分缺失，优选地该缺失突变使整个的该SBEIIa-A基因和/或该SBEIIb-A基因缺失。
在示意性实例中，提供了籽粒，其中包含一个部分功能丢失突变的这些等位基因各自表达一种SBEIIa或SBEIIb酶，该SBEIIa或SBEIIb酶的量和/或活性对应于相应的野生型等位基因的量或活性的2％到60％、或10％到50％。
在一些实施例中，该籽粒包含当在发育中的胚乳中表达时具有淀粉分支活性的至少一种SBEIIa蛋白，该蛋白是以一定的量存在或具有淀粉分支酶活性，该量或活性在一种野生型小麦籽粒中的相应蛋白的量或活性的2％到60％之间、或10％到50％之间、或2％到30％之间、或2％到15％之间、或3％到10％之间、或2％到20％之间或2％到25％之间。
在本发明的一些实施例中，该籽粒中的总SBEII蛋白的量或活性是一种野生型小麦籽粒中的总SBEII蛋白的量或活性的不到60％、优选地不到2％。
在本发明的一些实施例中，该籽粒中不存在SBEIIa蛋白活性。
确切地说，在一些实施例中，该籽粒是非转基因的，即，不包含任何转基因；或者在一个更具体实施例中不包含对使一种SBEIIa基因表达减少的一种RNA进行编码的一种外源性核酸，即，当该籽粒包含一种转基因时，该转基因编码除了会使一种SBEIIa基因表达减少的一种RNA以外的一种RNA。这些RNA包括会对赋予例如除草剂耐受性、疾病耐受性、增加营养素使用效率、或者干旱或其他逆境耐受性的蛋白进行编码的多种RNA。
在一些实施例中，该籽粒如通过蛋白印迹分析法所测定仅具有一种SBEIIa蛋白，并且其中该蛋白由该SBEIIa-A、SBEIIa-B以及SBEIIa-D基因中的一种编码，并且当与由相应的野生型基因编码的一种SBEIIa蛋白相比时，当在发育中的胚乳中产生时具有降低的淀粉分支酶活性。
在一些实施例中，如通过亲和力凝胶电泳在包含淀粉的凝胶上所测定，该SBEIIa蛋白相对于其相应的野生型SBEIIa蛋白具有一个改变的迁移率。
在一些实施例中，如通过蛋白印迹分析法所测定，该籽粒缺乏可检测的SBEIIa蛋白。
在一些实施例中，该胚包含当在发育中的胚乳中产生时具有淀粉分支酶活性的仅一种或仅两种SBEIIb蛋白、或者通过蛋白印迹分析法可检测到的仅一种或仅两种SBEIIb蛋白。
关于功能丢失突变，在一些实施例中，这些功能丢失突变中的至少一个、一个以上或所有是i)引入的突变；ii)通过用如一种化学剂、生物剂或辐射的一种诱变剂诱变而诱导于一个亲本小麦植株或种子中的；或iii)被引入的以便修饰该植株基因组。
在另一个示意性实施例中，该籽粒包含了对使一种SBEIIa基因、一种SBEIIb基因或这两者的表达减少的一种RNA进行编码的一种外源性核酸。
如在此所测定，在一些具体实施例中提供了籽粒，其中该籽粒具有相对于在标准条件下一种对照或野生型籽粒的发芽率约70％到约90％、或约90％到约100％的一个发芽率。这些标准条件优选地是如在此所定义。
在一个具体实施例中，该SBEII活性或SBEIIa活性是通过当籽粒在一个小麦植株中发育的时候分析该籽粒中的酶活性，或通过利用免疫或其他手段分析所收获的籽粒中的SBEII蛋白(如SBEIIa蛋白)的量而测定的。
在另一个方面中，本发明提供了籽粒，其中该籽粒的淀粉具有占总淀粉的比例至少50％(w/w)、或至少60％(w/w)、或至少67％(w/w)的直链淀粉，并且特征在于以下各项中的一项或多项：
(i)相对于野生型小麦淀粉颗粒或淀粉，包含2％到30％的量的SBEII或SBEIIa；
(ii)包含至少2％抗性淀粉；
(iii)包括一个低的相对血糖指数(GI)；
(iv)包括低的相对支链淀粉水平；
(v)变形的淀粉颗粒；
(vi)减小的颗粒双折射率；
(vii)减小的膨胀体积；
(viii)改变的链长分布和/或分支频率；
(ix)延迟的糊化终点的温度和更高的峰值温度；
(x)减小的粘度(峰值粘度、成糊温度等)；
(xi)增大的支链淀粉分子量；和/或
(xii)相对于一种野生型小麦淀粉颗粒或淀粉，改变的结晶度％A型或B型淀粉％。
在一些实施例中，该籽粒被包含在一个小麦植株中。
在其他实施例中，该籽粒是发育中的籽粒，或成熟的被收获的籽粒。优选地，籽粒的数量是至少1kg重量、或至少1吨重量。
方便的是，加工该籽粒以使该籽粒不再能够发芽，如粗磨的、破裂的、煮半熟的、轧制的、成珍珠状的、碾磨的或研磨的籽粒。
在另一个方面中，本发明提供了一种小麦植株，该小麦植株能够产生如在此所定义的籽粒，包括了包含一个胚乳和低水平或活性的总SBEII蛋白或SBEIIa蛋白的籽粒，该低水平或活性是一种野生型小麦籽粒中的总SBEII或SBEIIa蛋白的水平或活性的2％到30％，并且其中该籽粒包含占该籽粒中的总淀粉的比例至少50％(w/w)、或至少60％(w/w)、或至少67％(w/w)的一个直链淀粉含量。
在一个具体实施例中，该小麦植株是雄性和雌性都能育的。
在一个实施例中，该小麦植株是面包小麦，如普通小麦夏季亚种或硬粒小麦。在其他实施例中，该小麦植株的特性在于如在此所描述的该籽粒的一个或多个特征，优选地包括如在此所描述的SBEIIa和SBEIIb突变的数目和类型。提供了这些特征的所有组合。
在另一个实施例中，本发明提供了全麦粉或面粉或另一种食物成分，如由如在此所定义的籽粒制造的精制淀粉，该籽粒包括了包含一个胚乳和低水平或活性的总SBEII蛋白或SBEIIa蛋白的籽粒，该低水平或活性是一种野生型小麦籽粒中的总SBEII或SBEIIa蛋白的水平或活性的2％到30％，并且其中该籽粒包含占该籽粒中的总淀粉的比例至少50％(w/w)、或至少60％(w/w)、或至少67％(w/w)的一个直链淀粉含量。该全麦粉、面粉或其他食物成分可以通过分级分离、漂白、热处理以使成分稳定、用酶处理或与其他食物成分(如来自一种野生型小麦的全麦粉或面粉)共混来精制。该面粉优选地是白面粉，具有如烘焙领域中已知的规格。在一个优选实施例中，该全麦粉、面粉或其他食物经过包装，准备作为一种食物成分销售，该包装可以包括关于其使用的配方说明。
本发明进一步涵盖由主题籽粒制造的小麦淀粉颗粒或小麦淀粉。在一些实施例中，这些淀粉颗粒或小麦淀粉包含占淀粉的比例至少50％(w/w)、或至少60％(w/w)、或至少67％(w/w)的直链淀粉，并且特性进一步在于以下各项特征中的一项或多项：
(i)相对于野生型小麦淀粉颗粒或淀粉，包含2％到30％的量的SBEII或SBEIIa；
(ii)包含至少2％抗性淀粉；
(iii)包括一个低的相对血糖指数(GI)；
(iv)包括低的相对支链淀粉水平；
(v)变形的淀粉颗粒；
(vi)减小的颗粒双折射率；
(vii)减小的膨胀体积；
(viii)改变的链长分布和/或分支频率；
(ix)延迟的糊化终点的温度和更高的峰值温度；
(x)减小的粘度(峰值粘度、成糊温度等)；
(xi)增大的支链淀粉分子量；和/或
(xii)相对于一种野生型小麦淀粉颗粒或淀粉，改变的结晶度％A型或B型淀粉％。
本发明进一步提供了一种食物成分，该食物成分包括如在此所定义的籽粒、全麦粉、面粉、淀粉颗粒、或淀粉，用于制造食物供非人类动物或优选地人类消耗。
在一些实施例中，该食物成分包括籽粒，其中该籽粒是粗磨的、破裂的、煮半熟的、轧制的、成珍珠状的、碾磨的或研磨的籽粒或这些的任何组合。
本发明还提供了食物或饮料产品，这些食物或饮料产品包括以干重计在至少10％水平的一种食物或饮料成分，其中该食物成分是或包括如在此所定义的籽粒、全麦粉、面粉、淀粉颗粒、或淀粉。优选地，该食物或饮料产品经包装准备销售。
在另一个实施例中，本发明提供了一种组合物或共混物，该组合物或共混物包括以重量计在至少10％水平的如在此所定义的籽粒、全麦粉、面粉、小麦淀粉颗粒或小麦淀粉、以及直链淀粉水平低于约50％(w/w)的小麦籽粒或由其获得的面粉、全麦粉、淀粉颗粒或淀粉。优选地，直链淀粉水平低于50％(w/w)的该小麦籽粒是野生型小麦籽粒。
提供了用于获得或鉴别或选择或制造一种小麦植株的方法，该小麦植株产生籽粒，该籽粒包含占该籽粒中总淀粉的比例至少50％(w/w)、或至少60％(w/w)、或至少67％(w/w)的一个直链淀粉含量。该小麦植株可以从多个候选植株的一个群体，如一个经诱变的群体或由一种杂交方法或一种回交/育种方法产生的植株的一个群体中加以鉴别或选择。
在一些实施例中，该方法包括：(i)使两个亲本小麦植株杂交，该两个亲本小麦植株各自在一种、两种或三种选自下组的SBEIIa或SBEIIb基因中的每一种中包含一个功能丢失突变，该组由以下各项组成：SBEIIa-A、SBEIIa-B、SBEIIa-D、SBEIIb-A、SBEIIb-B以及SBEIIb-D，或对包含所述功能丢失突变的一个亲本植株进行诱变；和(ii)通过分析来自这些植株或籽粒的DNA、RNA、蛋白、淀粉颗粒或淀粉来筛选由该杂交或诱变获得的多个植株或籽粒、或由其获得的多个子代植株或籽粒；以及(iii)选择一个能育植株，该能育植株在其籽粒中展现出在一种野生型籽粒中的SBEII或SBEIIa的水平或活性的2％到30％的该相应蛋白的水平或活性。可替代地，该方法包括以上步骤(ii)和(iii)，其中步骤(i)是任选的，如当选择或鉴别来自多个候选植株的一个群体的一个植株时。
在该方法的一些实施例中，步骤(ii)包括针对编码SBEII蛋白的6种内源性基因的包括4、5或6个SBEIIa等位基因的5到12个等位基因中的一个功能丢失突变来筛选第一、第二和/或后续代的多个子代植株或籽粒，并且其中当突变的SBEIIa等位基因的数目是4时，那么突变的SBEIIb等位基因的数目是6，并且当突变的SBEIIa等位基因的数目是6时，那么至少两个这类突变是部分突变。
在一些实施例中，所选择的能育小麦植株的籽粒的特性在于如在此所定义一个或多个特征。
本发明进一步提供了获得一种六倍体或四倍体小麦植株的方法，该植株产生籽粒，该籽粒包含占该籽粒中的总淀粉的比例至少50％(w/w)、或至少60％(w/w)或至少67％(w/w)的一个直链淀粉含量。在一些实施例中，该方法包括(i)将一种外源性核酸引入一种小麦细胞中，该外源性核酸编码使编码总SBEII蛋白或SBEIIa蛋白的一个或多个基因的表达减少的一种RNA；(ii)使包含了来自步骤(i)的细胞的外源性核酸的一种转基因小麦植株再生；以及(iii)对产生了具有一种野生型植株中的总SBEII或SBEIIa蛋白的水平或活性的2％到30％的籽粒的转基因小麦植株的第一、第二或后续代子代进行筛选和选择。优选地，该RNA分子是一种双链RNA分子或一种微RNA前体分子，它优选地由一种嵌合DNA表达，该嵌合DNA包含一个DNA区，该DNA区在转录时产生该RNA分子，可操作地连接于一种异源启动子，如一种胚乳特异性启动子。该嵌合DNA可以被引入到包含一个或多个SBEIIa或SBEIIb突变的一种小麦细胞中，使得该总SBEII活性通过一个或多个突变与一个或多个抑制性RNA分子的组合而在转基因植株中得以降低。
在一些实施例中，具有一种野生型植株中的总SBEII或SBEIIa蛋白的水平或活性的2％到30％的籽粒指示了该植株的至少3种SBEIIa基因或2种SBEIIa基因和3种SBEIIb基因包含一个功能丢失突变，并且因此该植株的籽粒包含占该籽粒中的总淀粉的比例超过50％(w/w)、或至少60％(w/w)、或至少67％(w/w)的直链淀粉。
在一些实施例中，至少低水平的SBEIIa蛋白的存在指示了该植株是能育的。
在另一个实施例中，本发明提供了一种筛选一种小麦植株或籽粒的方法，该方法包括针对六倍体小麦的A、B以及D基因组或四倍体小麦的A和B基因组中的每一个中的一种SBEIIa基因或SBEIIa和SBEIIb基因中的突变，使用一种或多种选自下组的引物筛选一种植株或籽粒，该组由以下各项组成：SEQIDNO：36到149。
在另一个实施例中，本发明提供了一种筛选一种小麦植株或籽粒的方法，该方法包括(i)测定出相对于一种野生型或对照植株或籽粒中的水平或活性的SBEIIa和/或SBEIIb的水平或活性，以及选择具有一种野生型植株中的总SBEII或SBEIIa蛋白的水平或活性的2％到30％的植株或籽粒。
在又另一个实施例中，本发明提供了一种制造一种食物或一种饮料的方法，包括(i)获得本发明的籽粒；(ii)加工该籽粒以制造一种食物或饮料成分；以及(iii)将来自(ii)的食物或饮料成分加入另一种食物或饮料成分中，由此制造该食物或饮料。
在另一个方面中，本发明提供了一种用于改善一名受试者的代谢健康状况、肠健康状况或心血管健康状况的一个或多个参数、或预防如糖尿病、肠疾病或心血管疾病的一种代谢疾病或降低该代谢疾病的严重度或发生率的方法，包括向该受试者提供如在此所定义的籽粒、食物或饮料。本发明还提供了籽粒、或由其获得的产品的用途，用于代谢疾病、肠疾病或心血管疾病的治疗或预防。
因此，本发明的类似方面提供了主题籽粒、食物或饮料，以用于改善一名受试者的代谢健康状况、肠健康状况或心血管健康状况的一个或多个参数、或预防如糖尿病、肠疾病或心血管疾病的一种代谢疾病或降低该代谢疾病的严重度或发生率。
因此，本发明的类似方面提供了主题籽粒、食物或饮料的用途，用于改善一名受试者的代谢健康状况、肠健康状况或心血管健康状况的一个或多个参数、或预防如糖尿病、肠疾病或心血管疾病的一种代谢疾病或降低该代谢疾病的严重度或发生率。
因此，在一些实施例中，本发明提供了如在此所定义的食物或饮料产品，以用于改善一名受试者的代谢健康状况、肠健康状况或心血管健康状况的一个或多个参数、或预防代谢、肠或心血管疾病或降低该疾病的严重度或发生率。
在另一个实施例中，本发明提供了一种制造籽粒的方法，包括以下步骤：i)获得能够产生如在此所定义的籽粒的一种小麦植株，该籽粒包含一个胚乳和低水平或活性的总SBEII蛋白或SBEIIa蛋白，该水平或活性是一种野生型小麦籽粒中的总SBEII或SBEIIa蛋白的水平或活性的2％到30％，并且其中该籽粒包含占该籽粒中的总淀粉的比例至少50％(w/w)、或至少60％(w/w)、或至少67％(w/w)的一个直链淀粉含量和；ii)从该植株中收获小麦籽粒；以及iii)任选地加工该籽粒。
在另一个实施例中，本发明提供了一种制造淀粉的方法，包括以下步骤：i)获得如在此所定义的小麦籽粒，该小麦籽粒包含包含一个胚乳和低水平或活性的总SBEII蛋白或SBEIIa蛋白，该水平或活性是一种野生型小麦籽粒中的总SBEII或SBEIIa蛋白的水平或活性的2％到30％，并且其中该籽粒包含占该籽粒中的总淀粉的比例至少50％(w/w)、或至少60％(w/w)、或至少67％(w/w)的一个直链淀粉含量；以及ii)从该籽粒中提取该淀粉，由此制造该淀粉。
本发明还提供了一种对小麦籽粒进行交易的方法，包括获得本发明的小麦籽粒，以及为了金钱收益对该获得的小麦籽粒进行交易。
在一些实施例中，获得该小麦籽粒包括了栽培或收获该小麦籽粒。
在一些实施例中，获得该小麦籽粒包括了收获该小麦籽粒。
在一些实施例中，获得该小麦籽粒进一步包括了储存该小麦籽粒。
在一些实施例中，获得该小麦籽粒进一步包括了将该小麦籽粒运输到一个不同的地点。
以上发明内容不是并且不应以任何方式看作是本发明的所有实施例的一个详尽叙述。
附图简要说明
图1是展示了SBEIIa蛋白比对的一个比对的一个图示(AAK26821.1是来自D基因组，CAR95900.1是来自B基因组并且CAA72154是来自A基因组)。该比对中的点指示了存在与最上面的序列中一致的氨基酸。
图2是展示了由来自小麦的A、B以及D基因组的外显子1到3编码的多个SBEIIb氨基酸序列的一个比对的一个图示。虚线指示了氨基酸存在于蛋白中，但序列未知，该比对中的点指示了存在与最上面的序列中一致的氨基酸。
图3是多个SBE11b氨基酸序列的一个比对的一个图示。
图4是展示了多个转基因突变株系(参见实例5)的直链淀粉含量的一个散点图的一个图形表示。
图5是展示了从多个SBEII转基因株系的行为获得的一个直链淀粉模型的一个数据图形表示。
图6是展示了从SBEII转基因株系的行为获得的一个直链淀粉模型的一个数据图形表示。
图7是展示了从小麦品种恰拉(Chara)获得的部分同源SBEIIa基因的外显子12到14区的多个DNA序列的一个比对的一个图示。针对恰拉B基因组片段的核苷酸序列展示全部，而针对部分同源A和D基因组片段的相应核苷酸仅展示存在多态性的部分。点指示了与恰拉B基因组片段一致的相应核苷酸。虚线指示了序列中不存在相应核苷酸。
图8是展示了从小麦品种顺科(Sunco)和塔斯曼(Tasman)获得的SBEIIa基因的内含子3区的多个DNA序列的一个比对的一个图示。针对塔斯曼D基因组片段的核苷酸序列展示全部，而针对部分同源片段的相应核苷酸仅展示存在多态性的部分。点指示了与塔斯曼D基因组片段一致的相应核苷酸。虚线指示了序列中不存在相应核苷酸。
图9是展示了从小麦品种中国春(ChineseSpring)获得的部分同源SBEIIa基因的外显子3区的多个DNA序列的一个比对的一个图示。针对中国春D基因组片段的核苷酸序列展示全部，而针对部分同源A和B基因组片段的相应核苷酸仅展示存在多态性的部分。点指示了与中国春D基因组片段一致的相应核苷酸。
图10是展示了来自六倍体小麦品种中国春的SBEIIa基因的外显子1区的一个DNA序列的一个图示。
图11是展示了跨越来自多个CS缺体-四体株系的SBEIIa基因的外显子12-14的区域的一个PCR扩增的一个图示。指定为BDD的株系对于A基因组是无效的，ADD对于B基因组是一个无效体并且AAB对于D基因组是一个无效体。
图12是展示了来自株系S28的多个发育中的胚乳中的SBEIIa蛋白表达的一个蛋白印迹的摄影图示。来自多个胚乳的多份蛋白提取物是通过如实例1中所描述的蛋白印迹分析法，使用多种SBEIIa特异性抗体来分析的。右手侧的最后一个泳道展示了从野生型胚乳(品种NB1)显现的多个条带。指出了由A、B以及D基因组编码的多种SBEIIa蛋白的位置。
图13是在1-D非变性PAGE中β-极限糊精不存在(m0)和存在(m)的情况下相互作用的SBEIIa的迁移率比率针对β-极限糊精的浓度(S)的一个作图。解离常数(Kd)是从方程式m0/m＝l+[S]/Kd获得的。
图14展示了从实例2中描述的多个转基因小麦株系获得的多份汇集的小麦淀粉样品中的直链淀粉含量与酶抗性淀粉的关系。
图15提供了针对小麦单一种子中的表观直链淀粉含量的NIRS预测值和生物化学参比值的散点图表示。
图16是展示了如由NIRS测定的在WM和WMC群体上的表观直链淀粉含量分布的一个图形表示。
图17(a)和(b)是展示了加入递增数量的多个小麦株系对吸水率(a)和揉面仪混合时间(b)的作用的数据图形表示。
图18(a)和(b)是示出了加入递增数量的高直链淀粉的小麦面粉对小规模面包块的抗性淀粉(a)和预测的GI(b)(HI％)的作用的数据图形表示。
附表简要说明
表1提供了从多种谷物表征的多种淀粉分支酶基因。
表2提供了一种氨基酸亚分类。
表3提供了多个示例性的氨基酸取代。
表4提供了用于小麦SBEIIa基因的多种基因组特异性引物。
表5提供了用于SBEIIa的多种基因组特异性引物的核苷酸序列。
表6提供了被设计用来使特定地来自小麦的A基因组的SBEIIa基因的多个部分扩增的多种引物。
表7提供了被设计用来使特定地来自小麦的B基因组的SBEIIa基因的多个部分扩增的多种引物。
表8提供了被设计用来使特定地来自小麦的D基因组的SBEIIa基因的多个部分扩增的多种引物。
表9提供了用于小麦SBEIIb基因的多种基因组特异性引物。
表10提供了用于SBEIIb的多种基因组特异性引物的核苷酸序列。
表11提供了如实例4中所描述的小麦的多个RNAi株系的总SBEII和SBEIIa以及SBEIIb表达和直链淀粉含量。
表12提供了在如实例5中所描述的多种突变体中测试的多种微卫星标志物的一个清单。
表13提供了如实例5中所描述的从HIB群体鉴别的多种突变体和微卫星定位数据。
表14提供了如实例5中所描述而鉴别出的SBEII的多种双无效突变体的一个说明。
表15提供了如实例5中所描述在双与单无效突变体之间进行的杂交的一个说明。
表16提供了如实例5中所描述的多种三无效突变体的籽粒淀粉中的直链淀粉含量的表格。
表17提供了对多种F2子代植株的能育性观察结果。
表18提供了针对所鉴别的双无效体的SBEII等位基因组成和直链淀粉比例数据。
表19提供了在单与双无效突变体之间的进一步杂交的详情。
表20提供了来自一个A2B2D2杂交的正常发芽中的籽粒的多种基因型的观察到的频率。括号中的数字指示了基于孟德尔分离的预期的频率。
表21提供了在单与双无效突变体之间的进一步杂交。
表22提供了在使用显性标志物的一个初始筛选中鉴别的SBEIIa基因中的多种推定的双和三无效突变体。
表23提供了来自多个转基因小麦株系的籽粒淀粉的淀粉表征。
表24提供了来自多个小麦转基因株系的淀粉部分的分子量分布。
表25提供了hp5′-SBEIIa转基因小麦淀粉的RVA参数。
表26提供了与对照NB1相比hp5′-SBEIIa转基因小麦淀粉的糊化峰的DSC参数。
表27提供了多种轧制和成薄片的籽粒产品中的RS含量。
表28提供了在高直链淀粉的小麦(HAW)的不同结合水平的多种食物产品中的抗性淀粉含量。
表29提供了实例18中所提及的多种基因组特异性引物。
详细描述
本发明是部分基于在此描述的实验中进行的观察，即，在整个植株中完全缺乏SBEIIa活性的小麦植株在被设计用来制造它们的杂交中无法被回收，实际上，SBEIIa的完全缺乏被推断为对种子发育和/或能育性是致命的。这是令人惊讶的，因为先前的研究已展示出SBEIIa中的单无效突变体可以容易地在小麦中获得并且是能育的。此外，观察到为制造正常的能成活的种子而需要在小麦植株中保持的SBEIIa活性的最低水平为野生型水平的约2％。
还观察到对于组合多个突变的SBEIIa基因来说，尤其是为了获得以与野生型籽粒类似的比率发芽的在表型上正常的雄性和雌性能育植株和籽粒，在一种SBEIIa基因中包含至少一个点突变的突变的植株和籽粒比在多种SBEIIa基因中的每一种中具有多个缺失的植株和籽粒有利。此观察结果的一个可能的解释是多个缺失倾向于去除与SBEIIa基因邻接的重要的遗传元件。
还观察到，为了在籽粒淀粉中获得至少50％(w/w)的一个直链淀粉含量(在该水平抗性淀粉的量和相关的健康益处实质上增加)，籽粒中的总SBEII活性并且尤其SBEIIa活性需要被降低到低于野生型水平的30％。
此外，测定出，在六倍体小麦中，与在两种部分同源SBEIIa基因中具有无效突变的植株相比，降低来自三种部分同源SBEIIa基因中的每一种或来自至少两种部分同源SBEIIa基因和两种或三种部分同源SBEIIb基因的SBEII蛋白的水平和/或活性会引起小麦胚乳的淀粉中的直链淀粉的比例实质上非线性增加。六倍体小麦的籽粒中的直链淀粉含量与SBEII水平之间的此非线性关系以图解方式示出于图5和6中。
通过研究来自A、B以及D基因组的SBEIIa和/或SBEIIb等位基因的组合中的部分和完全功能丢失突变，已证实了多种SBEII基因在调制淀粉特性中的作用。确切地说，已研究和确定了获得具有极高水平直链淀粉的能育小麦植株所需的突变等位基因的数目和突变等位基因的组合。
包括小麦的高等植物的胚乳中的淀粉的合成是通过催化四个关键步骤的一套酶进行的。首先，ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(EC2.7.7.27)通过从G-1-P和ATP合成ADP-葡萄糖而使淀粉的单体前体活化。其次，通过淀粉合酶(EC2.4.1.24)将活化的葡糖基供体ADP-葡萄糖转移到先前存在的α(1-4)键的非还原末端。第三，淀粉分支酶通过使α(1-4)连接的葡聚糖的一个区域裂解继而将该裂解的链转移到一条受体链上，形成一个新的α(1-6)键而引入分支点。淀粉分支酶是可以将α(1-6)键引入α-聚葡聚糖中的唯一的酶，并且因此在支链淀粉的形成中起到必不可少的作用。第四，淀粉脱支酶(EC2.4.4.18)将一些分支键去除。
淀粉是植物，如谷物(包括小麦)中的主要储存碳水化合物。淀粉是在淀粉体中合成并以颗粒形式形成和储存在发育中的储存器官，如籽粒中；它在此被称为“储存淀粉”或“籽粒淀粉”。在谷物籽粒中，绝大多数的储存淀粉沉积于胚乳中。“淀粉”在此被定义为由通过α(1-4)和α(1-6)两种键的组合而聚合的吡喃葡萄糖单元组成的多糖。淀粉的多分散分子基于它们的聚合度(DP)和α(1-6)与α(1-4)键的比率被归类为属于两个称为直链淀粉和支链淀粉的组分部分。来自野生型谷物植株(包括来自小麦)的籽粒淀粉包含约20％-30％的直链淀粉和约70％-80％的支链淀粉。
“直链淀粉”在此被定义为包括α(1，4)连接的糖苷(吡喃葡萄糖)单元的基本上线性分子，有时被称为“真正的直链淀粉”；和直链淀粉样长链淀粉，它有时也被称为“中间物质”或“直链淀粉样支链淀粉”，它与真正的直链淀粉一起在一种碘量滴定分析中表现为碘结合物质(竹田等人，1993b；弗格森(Fergason)，1994)。典型地，真正的直链淀粉中的线性分子具有在500与5000之间的DP并且包含低于1％的α(1-6)键。近期的研究已展示了约0.1％的α(1-6)-糖苷分支位点可以存在于直链淀粉中，因此它被描述为“基本上线性”。相比之下，支链淀粉是一种大得多的分子，具有在5000到50,000范围内的DP并且包含4％-5％α(1-6)键。因此，支链淀粉分子更加高度地分支。直链淀粉具有一个螺旋构象，具有约104到约106道尔顿的分子量，而支链淀粉具有约107到约108道尔顿的分子量。这两个类型的淀粉可以通过本领域中熟知的方法容易地区分或分离。
如在此所定义的淀粉中的直链淀粉的比例是以重量/重量(w/w)计的，即，就在进行任何分级分离形成直链淀粉和支链淀粉部分之前的淀粉来说，直链淀粉的重量占从籽粒中可提取的总淀粉的重量的百分比。术语“淀粉中的直链淀粉的比例”和“直链淀粉含量”当在此在本发明的籽粒、面粉或其他产品的情形下使用时是基本上可互换的术语。直链淀粉含量可以通过本领域中已知的任何方法测定，包括大小排阻高效液相色谱法(HPLC)，例如在90％(w/v)DMSO中；伴刀豆球蛋白A法(爱尔兰的麦格酶国际公司(MegazymeInt，Ireland))；或优选地通过一种碘量滴定法，例如为如实例1中所描述。HPLC法可能涉及淀粉的脱支(贝蒂(Batey)和柯廷(Curtin)，1996)或不涉及脱支。应了解，如仅分析“真正的直链淀粉”的贝蒂和柯廷，1996的HPLC法的方法可能会低估如在此所定义的直链淀粉含量。如HPLC或凝胶渗透色谱法的方法取决于淀粉分成直链淀粉和支链淀粉部分的分级分离，而碘量滴定法取决于差异碘结合并且因此不需要分级分离。
由籽粒重量和直链淀粉含量，可以针对测试和对照株系计算出每颗籽粒沉积的直链淀粉的量并且进行比较。
淀粉最初是在一个植株的叶片和其他绿色组织中作为光合作用的一种产物合成并且累积。此淀粉在此被称为“过渡淀粉”等，因为与种子或块茎淀粉对比，此淀粉日间在光合组织的质体中累积并且至少夜间降解。在晚上，过渡淀粉被水解成糖，这些主要呈蔗糖形式的糖被从来源组织运输到库组织供植株的生长使用，作为用于代谢的一种能源或用于储存在组织中作为储存淀粉。
如在此所使用，“淀粉合酶”意指将ADP-葡萄糖转移到一个先前存在的α1-4键的非还原性末端的一种酶。在谷物胚乳中发现了四个种类的淀粉合酶，即，只位于淀粉颗粒内的一种同工型(颗粒结合型淀粉合酶(GBSS))、分配于颗粒与可溶性部分之间的两种形式(SSI，李(Li)等人，1999a；SSII，李等人，1999b)以及全部位于可溶性部分中的一个第四形式SSIII(曹(Cao)等人，2000；李等人，1999b；李等人，2000)。已展示GBSS对于直链淀粉合成是必需的(舒尔(Shure)等人，1983)，并且已展示SSII和SSIII中的突变会改变支链淀粉结构(高等人，1998；克雷格(Craig)等人，1998)。缺乏GBSS的谷物中的突变体还缺乏真正的直链淀粉，并且因此仅累积支链淀粉；这些突变体通常地被称为“蜡质”突变体。尚无界定针对SSI活性的作用的突变被描述。支链淀粉合成比直链淀粉合成更复杂，需要除GBSS以外的多种淀粉合酶、多种淀粉分支酶以及脱支酶的组合。
如在此所使用，“脱支酶”意指将由淀粉分支酶形成的支链淀粉的一些分支去除的一种酶。高等植物中存在两个类型的脱支酶，并且基于它们的底物特异性被定义为异淀粉酶型脱支酶和普鲁兰酶型脱支酶(迈尔斯(Myers)等人，2000)。玉米和稻米中的Sugary-1突变与两种脱支酶的缺乏相关(詹姆斯(James)等人，1995；库博(Kubo)等人，1999)，然而因果突变定位到与异淀粉酶型脱支酶基因相同的位置上。
表1中给出了来自于包括小麦的多种谷物的编码多种淀粉分支酶的多种基因的实例。如在此所使用，“淀粉分支酶”意指在葡萄糖残基的链之间引入α-1，6糖苷键的一种酶(EC2.4.1.18)。淀粉分支酶的三种形式表达于如稻米、玉米、大麦以及小麦的谷物，包括发育中的谷物胚乳中，即，淀粉分支酶I(SBEI)、淀粉分支酶IIa(SBEIIa)以及淀粉分支酶IIb(SBEIIb)(赫德曼(Hedman)和博耶，1982；博耶和普赖斯，1978；水野等人，1992，孙(Sun)等人，1997)。已针对稻米、大麦以及小麦表征了对于编码这些酶的基因的基因组和cDNA序列(表1)。序列比对揭露了在核苷酸和氨基酸两种水平上序列的高度相似性以及序列差异，并且允许归类到SBEI、SBEIIa以及SBEIIb种类中。来自任何一个物种的SBEIIa和SBEIIb总体上展示彼此约80％的氨基酸序列一致性，尤其是在基因的中央区域中。SBEIIa和SBEIIb也可以通过它们的表达模式区分，但这在不同的物种中不同。在玉米中，SBEIIb在胚乳中最高度地表达，而SBEIIa存在于植株的每一个组织中。在大麦中，SBEIIa和SBEIIb都以大约相等的量存在于胚乳中，而在小麦胚乳中，SBEIIa比SBEIIb高约4倍地表达。因此，这些谷类物种展示了在SBEIIa和SBEIIb表达方面的显著差异，并且在一个物种中得出的结论不能轻易地应用于另一个物种。在小麦中，SBEIIa与SBEIIb蛋白的大小不同(参见下文)，并且这是一种区分它们的便利的方式。特异性抗体也可以用于区分它们。
在玉米中，已展示出高直链淀粉表型由SBEIIb基因的损伤(也称为直链淀粉扩充(ae)基因)引起(博耶和普赖斯，1981；水野等人，1993；西等人，2001)。在这些SBEIIb突变体中，胚乳淀粉粒展示出一个异常的形态，直链淀粉含量显著升高，残留支链淀粉的分支频率减小，并且短链(＜DP17，尤其DP8-12)的比例更低。此外，淀粉的糊化温度增加。另外，存在被定义为介于直链淀粉与支链淀粉之间的“中间物”的一大批物质(博耶等人，1980；竹田等人，1993b)。相比之下，由一个增变基因(Mu)插入元件引起并且因此缺乏SBEIIa蛋白表达的SBEIIa基因中的玉米植株突变体与野生型植株在胚乳淀粉的分支方面难以区分(布劳特(Blauth)等人，2001)，不过它们在叶片淀粉中发生变化。类似地，缺乏SBEIIa活性的稻米植株展现出在胚乳中的支链淀粉链特征曲线方面无明显变化(中村(Nakamura)，2002)，而SBEIIb中的突变体展示了直链淀粉水平的一个适度增加，在籼稻背景中达到约35％，并且在一个粳稻背景中达到25％-30％(水野等人，1993；西等人，2001)。在玉米和稻米两项中，SBEIIa和SBEIIb基因在基因组中并不连锁。在大麦中，使胚乳中的SBEIIa和SBEIIb表达都降低的一种基因沉默构建体被用于产生高直链淀粉大麦籽粒(瑞加娜(Regina)等人，2010)。
在发育中的小麦胚乳中，只在可溶性部分(淀粉体基质)中发现SBEI(莫雷尔等人，1997)，而在胚乳中的可溶性和淀粉颗粒相关的两个部分中发现SBEIIa和SBEIIb(拉赫曼等人，1995)。在小麦中，表观基因重复事件已使每一个基因组中的SBEI基因的数目增加(拉赫曼等人，1999)。通过对来自A、B以及D基因组的SBEI基因的最高表达形式中的突变进行组合来消除大于97％的SBEI活性是对淀粉结构或功能性不具有可测量的影响的(瑞加娜等人，2004)。相比之下，通过小麦中的一个基因沉默构建体减少SBEIIa表达引起了高直链淀粉水平(＞70％)，而减少SBEIIb表达而非SBEIIa的一个相应构建体具有最小作用(瑞加娜等人，2006)。
淀粉分支酶(SBE)活性可以通过酶分析，例如通过磷酸化酶刺激分析来测量(博耶和普赖斯，1978)。此分析测量了SBE对葡萄糖-1-磷酸通过磷酸化酶A结合到甲醇不溶性聚合物(α-D-葡聚糖)中的刺激。SBE活性可以通过碘染色分析来测量，该碘染色分析测量了由葡聚糖聚合物的分支产生的葡聚糖-多碘络合物的吸光度的减小。SBE活性也可以通过分支键分析加以分析，该分支键分析测量了在异淀粉酶消化之后还原末端从作为底物的减少的直链淀粉的产生(竹田等人，1993a)。优选地，该活性在不存在SBEI活性的情况下测量。SBE的同工型展示了不同的底物特异性，例如SBEI在分支直链淀粉中展现更高活性，而SBEIIa和SBEIIb在一种支链淀粉底物的情况下展示更高的分支率。这些同工型还可以基于所转移的葡聚糖链的长度加以区分。SBE蛋白还可以通过使用特异性抗体(如在此描述的那些)进行测量。在籽粒发育过程中在发育中的胚乳中可以测量SBEII活性。可替代地，在仍然存在蛋白的成熟籽粒中测量SBEII水平，并且可以通过免疫方法分析。
在一些实施例中，SBEII或SBEIIa的水平或活性可以通过如利用Northern或RT-PCR分析法评估转录物水平来评估。在一个优选方法中，籽粒或发育中的胚乳中的SBEIIa蛋白的量通过以下方式测量：通过电泳对籽粒/胚乳的提取物中的蛋白进行分离，接着利用蛋白印迹法将这些蛋白转移到一张膜上，随后使用特异性抗体定量检测该膜上的蛋白(“蛋白印迹分析法”)。此方法例示于实例11中。
如在此所展示，发育中的六倍体小麦胚乳从A、B以及D基因组中的每一种表达SBEIIa和SBEIIb。四倍体小麦从A和B基因组中的每一种表达SBEIIa和SBEIIb。如在此所使用，“从A基因组表达的SBEIIa”或“SBEIIa-A”意指氨基酸序列阐述于SEQIDNO：1中或与阐述于SEQIDNO：1中的氨基酸序列至少99％一致或包含这类序列的一种淀粉分支酶。SEQIDNO：1的氨基酸序列(基因库登录号CAA72154)对应于从小麦的A基因组表达的一种SBEIIa，它在此用作针对野生型SBEIIa-A的参考序列。SEQIDNO：1的蛋白长为823个氨基酸。此酶的活性变异体存在于小麦中，例如栽培品种夏安中，参见与SEQIDNO.199.88％(822/823)一致的登录号AF286319。这类变异体包括于“SBEIIa-A”中，只要它们具有关于SEQIDNO：1的基本上野生型淀粉分支酶活性。
如在此所使用，“从B基因组表达的SBEIIa”或“SBEIIa-B”意指氨基酸序列阐述于SEQIDNO：2中或与阐述于SEQIDNO：2中的氨基酸序列至少99％一致或包含这类序列的一种淀粉分支酶。SEQIDNO：2的氨基酸序列(基因库登录号CAR95900)对应于从小麦品种中国春(ChineseSpring)的B基因组表达的SBEIIa，它在此用作针对野生型SBEIIa-B的参考序列。SEQIDNO：2的蛋白长为823个氨基酸。此酶的活性变异体可以存在于小麦中并且包括于SBEIIa-B中，只要它们具有关于SEQIDNO：2的基本上野生型淀粉分支酶活性。SEQIDNO：2与SEQIDNO：198.42％(811/824)一致。图1中的多个氨基酸序列的比对展示了可以用于区分这些蛋白或将变异体归类为SBEIIa-A或SBEIIa-B的多个氨基酸差异。
如在此所使用，“从D基因组表达的SBEIIa”或“SBEIIa-D”意指氨基酸序列阐述于SEQIDNO：3中或与阐述于SEQIDNO：3中的氨基酸序列至少98％一致或包含这类序列的一种淀粉分支酶。SEQIDNO：3的氨基酸序列(基因库登录号AAK26821)对应于从粗山羊草(六倍体小麦的D基因组的一个可能的祖代)的D基因组表达的SBEIIa，它在此用作针对野生型SBEIIa-D的参考序列。SEQIDNO：3的蛋白长为819个氨基酸。此酶的活性变异体可以存在于小麦中并且包括于SBEIIa-D中，只要它们具有关于SEQIDNO：3的基本上野生型淀粉分支酶活性。SEQIDNO：3与SEQIDNO：197.57％(803/823)一致并且与SEQIDNO：297.81％(805/823)一致。图1中的多个氨基酸序列的比对展示了可以用于区分这些蛋白或将变异体归类为SBEIIa-A、SBEIIa-B或SBEIIa-D的多个氨基酸差异。
当在此情形下例如通过Blastn比较这些氨基酸序列以测定一致性百分比时，应对全长序列进行比较，并且一个序列中的空位被算作是氨基酸差异。
如在此所使用，一种“SBEIIa蛋白”包括具有减小的或无淀粉分支酶活性的蛋白变异体、以及具有基本上野生型酶活性的蛋白。还应理解的是，SBEIIa蛋白可以存在于籽粒、尤其如通常在商业上收获的休眠籽粒中，但因籽粒中的生理条件而呈一种非活性状态。这类蛋白包括于如在此所使用的“SBEIIa蛋白”中。SBEIIa蛋白在仅部分的籽粒发育过程中、尤其当储存淀粉典型地沉积时在发育中的胚乳中可以具有酶促活性，但在其他情况下呈非活性状态。这类SBEIIa蛋白可以使用免疫方法，如蛋白印迹分析法容易地进行检测和定量。如在此所使用的一种“SBEIIb蛋白”具有一个类似的含义。
如在此所使用，“从A基因组表达的SBEIIb”或“SBEIIb-A”意指氨基酸序列阐述于SEQIDNO：4中或与阐述于SEQIDNO：4中的氨基酸序列至少98％一致或包含这类序列的一种淀粉分支酶。SEQIDNO：4的氨基酸序列对应于从小麦的A基因组表达的SBEIIb的氨基末端序列，它在此用作针对野生型SBEIIb-A的参考序列。
如在此所使用，“从B基因组表达的SBEIIb”或“SBEIIb-B”意指包含了阐述于SEQIDNO：5中的氨基酸序列或与阐述于SEQIDNO：5中的氨基酸序列至少98％一致或包含这类序列的一种淀粉分支酶。在此用作针对野生型SBEIIb-B的参考序列的氨基酸序列SEQIDNO：5是由小麦中的SBEIIb-B基因的外显子2-3编码的一个部分氨基酸序列。一种变异的SBEIIb-B序列是由从栽培品种中国春分离的登录号AK335378的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
如在此所使用，“从D基因组表达的SBEIIb”或“SBEIIb-D”意指氨基酸序列阐述于SEQIDNO：6中或与阐述于SEQIDNO：6中的氨基酸序列至少98％一致或包含这类序列的一种淀粉分支酶。SEQIDNO：6的氨基酸序列(基因库登录号AAW80631)对应于从粗山羊草(六倍体小麦的D基因组的一个可能的祖代)的D基因组表达的SBEIIb，并且在此用作针对野生型SBEIIa-D的参考序列。此酶的活性变异体存在于小麦中并且包括于SBEIIb-D中，只要它们具有关于SEQIDNO：6的基本上野生型淀粉分支酶活性。举例来说，美国专利申请公开号20050074891的SEQIDNO：4(从第一个蛋氨酸开始)展示了与本申请中的SEQIDNO：699.5％一致的一种SBEIIb-D蛋白的氨基酸序列。图2中的多个氨基酸序列的比对展示了可以用于区分这些SBEIIb蛋白或将变异体归类为SBEIIb-A、SBEIIb-B或SBEIIb-D的多个氨基酸差异。
因此，如在此所使用的“野生型”在提及SBEIIa-A时意指氨基酸序列阐述于SEQIDNO：1中的一种淀粉分支酶；如在此所使用的“野生型”在提及SBEIIa-B时意指氨基酸序列阐述于SEQIDNO：2中的一种淀粉分支酶；如在此所使用的“野生型”在提及SBEIIa-D时意指氨基酸序列阐述于SEQIDNO：3中的一种淀粉分支酶；如在此所使用的“野生型”在提及SBEIIb-A时意指氨基酸序列阐述于SEQIDNO：4中的一种淀粉分支酶；如在此所使用的“野生型”在提及SBEIIb-B时意指氨基酸序列阐述于SEQIDNO：5中的一种淀粉分支酶；并且，如在此所使用的“野生型”在提及SBEIIb-D时意指氨基酸序列阐述于SEQIDNO：6中的一种淀粉分支酶。
如在此所使用，术语“小麦SBEIIa基因”和“小麦SBEIIb基因”分别指代在小麦中编码功能性SBEIIa或SBEIIb酶的基因，包括存在于其他小麦品种中的同源基因，以及编码具有减少的活性或不可检测的活性的酶的基因的突变形式。这些基因包括(但不限于)已克隆的小麦SBEII基因，包括表1中所列出的基因组和cDNA序列。如在此所使用的基因包涵了完全不编码任何蛋白的多种突变形式，在该情况下这些突变形式代表了这些基因的无效等位基因。
一种“内源性SBEII基因”指代在小麦基因组中处于其天然位置中的一种SBEII基因，包括野生型和突变形式。相比之下，术语“分离的SBEII基因”和“外源性SBEII基因”指代并不处于其天然位置中的一种SBEII基因，例如已被克隆、合成、包含于一种载体中或呈一种细胞中的一种转基因形式，优选地作为一种转基因小麦植株中的转基因。在此情形下，SBEII基因可以是如下描述的任何特定形式。
如在此所使用，“小麦的A基因组上的SBEIIa基因”或“SBEIIa-A基因”意指编码如在此所定义的SBEIIa-A或来源于编码SBEIIa-A的一种聚核苷酸的任何聚核苷酸，包括天然存在的聚核苷酸、序列变异体或合成聚核苷酸，包括编码具有基本上野生型活性的一种SBEIIa-A的“一种或多种野生型SBEIIa-A基因”、和不编码具有基本上野生型活性的一种SBEIIa-A但可识别地来源于一种野生型SBEIIa-A基因的“一种或多种突变的SBEIIa-A基因”。一种SBEII基因的一个突变形式的核苷酸序列与一套野生型SBEII基因的比较被用于测定它来源于哪些SBEII基因并且因此将其归类。举例来说，如果一种突变的SBEII基因的核苷酸序列比任何其他SBEII基因更密切地与一种野生型SBEIIa-A基因相关，即，具有一个更高程度的序列一致性，那么它被视为一种突变的SBEIIa-A基因。一种突变的SBEIIa-A基因编码具有降低的淀粉分支酶活性的一种SBE(部分突变体)、或缺乏SBE活性的一种蛋白或完全不编码蛋白(无效突变基因)。对应于一种SBEIIa-A基因的一种cDNA的一个示例性的核苷酸序列在基因库登录号Y11282中给出。SBEIIa-A基因的多个部分的序列也在此给出，如图7、8、9以及10和SEQIDNO13、14以及15中所提及。
如在此所使用，术语“从B基因组表达的SBEIIa”或“SBEIIa-B”、“从D基因组表达的SBEIIa”或“SBEIIa-D”、“从A基因组表达的SBEIIb”或“SBEIIb-A”、“从B基因组表达的SBEIIb”或“SBEIIb-B”以及“从D基因组表达的SBEIIb”或“SBEIIb-D”具有与前一段落中用于SBEIIa-A的那个术语相对应的意义。
示意性的部分SBEIIb-A、SBEIIb-B以及SBEIIb-D蛋白序列提供于图2中。示意性的SBEIIb-A氨基酸序列阐述于SEQIDNO：1和SEQIDNO：4(由外显子1-3编码的氨基末端序列)中。示意性的SBEIIb-B氨基酸序列阐述于SEQIDNO：2和SEQIDNO：5中。示意性的SBEIIb-D氨基酸序列阐述于SEQIDNO：3和SEQIDNO：6以及SEQIDNO：9中。
如以上所定义的SBEII基因包括：任何调节序列，这些调节序列是转录区的5′或3′(包括启动子区)，调节相关转录区的表达；和转录区内的内含子。
应理解的是，来自不同小麦品种的SBEIIa和SBEIIb基因的序列中存在天然变异。这些同源基因容易由熟练的业内人士基于序列一致性识别。同源SBEIIa基因或蛋白之间的序列一致性的程度被认为是至少90％，对于SBEIIb基因或蛋白来说是类似的。小麦SBEIIa基因在序列上与小麦SBEIIb基因约80％一致。所编码的蛋白在序列上也是约80％一致。
一个等位基因是在单一基因座处的一种基因的一种变化形式。一个二倍体生物体具有两套染色体。每一种染色体具有每一种基因的一个拷贝(一个等位基因)。如果两个等位基因是相同的，那么该生物体就该基因来说是纯合的，如果这些等位基因是不同的，那么该生物体就该基因来说是杂合的。在一个基因座处的多个等位基因之间的相互作用总体上被描述为显性或隐性的。一个功能丢失突变是引起籽粒中的SBEII、SBEIIa或SBEIIb酶的可检测的水平或活性无或降低的一个等位基因中的一个突变。该突变可以意指例如没有或更少RNA从包含该突变的基因转录或所制造的蛋白无或具有降低的活性。不编码或不能够引起制造任何活性酶的等位基因是无效等位基因。一个等位基因中的一个功能丢失突变(它包括一个部分功能丢失突变)意指该等位基因中引起籽粒中的SBEII、SBEIIa或SBEIIb酶的水平或活性降低的一个突变。等位基因中的突变可能意指例如更少的具有野生型或降低的活性的蛋白被翻译、或者野生型或降低的水平的转录之后是具有降低的酶活性的一种酶的翻译。“降低的”量或水平的蛋白意指相对于由相应野生型等位基因产生的量或水平降低。“降低的”活性意指相对于相应野生型SBEII、SBEIIa或SBEIIb酶降低。胚中的不同等位基因可以具有相同或一个不同的突变，并且不同的等位基因可以使用本领域中已知的方法加以组合。在一些实施例中，SBEIIa蛋白或SBEIIb蛋白的量因为分别存在SBEIIa基因或SBEIIb基因的更少转录或翻译而降低。在一些实施例中，尽管籽粒中存在野生型数目的SBEIIa蛋白分子或SBEIIb蛋白分子，但SBEIIa蛋白或SBEIIb蛋白以重量计的量仍降低，因为所制造的这些蛋白中的一些与野生型SBEIIa蛋白或SBEIIb蛋白相比更短，例如，突变的SBEIIa蛋白或SBEIIb蛋白因一个翻译提前终止信号而被截短。
表1中列出了已从多种谷物中克隆的多种代表性的淀粉生物合成基因。
如在此所使用，“一种SBEIIa-A基因的两个相同的等位基因”意指该SBEIIa-A基因的两个等位基因彼此相同；“一种SBEIIa-B基因的两个相同的等位基因”意指该SBEIIa-B基因的两个等位基因彼此相同；“一种SBEIIa-D基因的两个相同的等位基因”意指该SBEIIa-D基因的两个等位基因彼此相同；“一种SBEIIb-A基因的两个相同的等位基因”意指该SBEIIb-A基因的两个等位基因彼此相同；“一种SBEIIb-B基因的两个相同的等位基因”意指该SBEIIb-B基因的两个等位基因彼此相同；并且“一种SBEIIb-D基因的两个相同的等位基因”意指该SBEIIb-D基因的两个等位基因彼此相同。
本发明的小麦植株可以在诱变之后产生并且鉴别。这可以提供一种小麦植株，它是非转基因的，这在一些市场中是所希望的，或者它不含使一种SBEIIa基因表达减少的任何外源性核酸分子。突变的小麦植株可以是例如通过对核酸进行定点诱变而合成的，或者是通过诱变处理而诱导的，或者可以是天然存在的，即，从一个天然来源分离的，这些突变的小麦植株在单一SBEII基因中具有一个突变，该突变可以与其他SBEII突变通过杂交并且选择而组合，从而产生本发明的小麦植株。总体上，一种祖代植物细胞、组织、种子或植株可以经受诱变以产生单个或多个突变，如核苷酸取代、缺失、添加和/或密码子修饰。本发明的优选的小麦植株和籽粒包含至少一个引入的SBEII突变，更优选地两个或更多个引入的SBEII突变，并且可能不包含来自一个天然来源的突变，即，该植株中的所有突变的SBEIIa和SBEIIb等位基因都是通过合成手段或通过诱变处理而获得的。
诱变可以通过本领域中熟知的化学或辐射手段，例如EMS或叠氮化钠(兹瓦尔(Zwar)和钱德勒(Chandler)，1995)处理种子、或γ辐射来实现。化学诱变倾向于促进核苷酸取代而不是缺失。已知重离子束(HIB)辐射是用于突变育种以制造新的植株栽培品种的一项有效技术，参见例如林(Hayashi)等人，2007和风间(Kazama)等人，2008。离子束辐射关于决定DNA损伤的量和DNA缺失的规模的生物效应具有两个物理因子，剂量(gy)和LET(线性能量转移，keV/μm)，并且这些因子可以根据诱变的所希望的程度加以调整。HIB产生许多突变体，它们中的多个都包含可以针对如实例中所示的特定SBEII基因中的突变加以筛选的缺失。经鉴别的突变体可以与作为轮回亲本的非突变的小麦植株回交，以便去除并且因此减少经诱变的基因组中的不连锁突变的作用，参见实例9。
适用于制造定点突变体的生物剂包括多种酶，这些定点突变体包括刺激内源性修复机制的DNA中的双链断裂。这些酶包括核酸内切酶、锌指核酸酶、转座酶以及位点特异性重组酶。这些锌指核酸酶(ZFN)例如促进一个基因组内的定点裂解，允许内源性或其他末端连接的修复机制引入多个缺失或多个插入来修复空位。锌指核酸酶技术评述于乐普罗沃斯特(LeProvost)等人，2009中，也参见杜莱(Durai)等人，2005和刘(Liu)等人，2010。
突变体的分离可以通过对经诱变的植株或种子进行筛选来实现。举例来说，一个经诱变的小麦群体可以直接针对SBEIIa和/或SBEIIb基因型筛选或者通过针对由SBEII基因中的突变产生的一个表型筛选来间接筛选。直接针对基因型的筛选优选地包括针对SBEII基因中突变的存在进行分析，这可以在PCR分析中通过当一些基因缺失时不存在如所预料的特异性SBEIIa或SBEIIb标志物、或如Tilling中基于异源双链的分析观察到。针对表型的筛选可以包括通过ELISA或亲和色谱法针对一种或多种SBEIIa或SBEIIb蛋白的量的损失或降低、或籽粒淀粉中直链淀粉含量的增加进行筛选。在六倍体小麦中，筛选优选地在已缺乏SBEII活性中的一种或两种的一个基因型中，例如三个基因组中的两个上的SBEIIa或SBEIIb基因中已突变的一种小麦植株中进行，以便探寻进一步缺乏功能活性的一个突变体。在四倍体小麦中，筛选优选地在A或B基因组上已缺乏一种SBEII活性的一个基因型中进行，并且鉴别在来自第二个基因组的SBEII中减少的一个突变体。亲和色谱法可以如实例11中展示般进行。经诱变的种子的大型群体(成千或上万的种子)可以针对高直链淀粉表型使用近红外光谱法(NIR)筛选，如实例10中所展示。使用NIR，可获得关于高直链淀粉候选物富集的一个子群。通过这些手段，容易实现高通量筛选，并且允许以每数百个种子约一个的频率分离突变体。
本发明的植株和种子可以使用据称为TILLING(基因组中靶向诱导的局部损害)的方法制造，因为小麦植株或籽粒中的一种或多种突变可以通过此方法产生。在一个第一步骤中，通过用一种化学或辐射诱变剂处理多个种子或花粉而在植株的一个群体中诱导如新颖单碱基对改变的引入的突变，并且然后使植株发展到突变将稳定遗传的一代，典型地是可以鉴别出纯合体的一个M2代。提取DNA，并且储存来自该群体的所有成员的种子，从而建立可以随时间推移反复地获取的一个资源。针对一项TILLING分析，设计多种PCR引物以特异性扩增所关注的单一基因靶。接着，这些经染料标记的引物可以用于从多个个体的汇集的DNA扩增PCR产物。使这些PCR产物变性并且再退火，从而允许形成错配的碱基对。错配或异源双链代表了天然存在的单核苷酸多态性(SNP)(即，来自该群体的数个植株很可能携带相同的多态性)和诱导的SNP(即，仅极少的个别植株有可能展示该突变)两项。在异源双链形成之后，识别并且裂解错配的DNA的一种核酸内切酶(如CelI)的使用是在一个TILLING群体内发现多种新颖SNP的关键。
使用此方法，可以筛选成千上万个的植株，从而鉴别在基因组的任何基因或特定区中具有一个单碱基改变以及多个小型插入或缺失(1-30bp)的任何个体。所分析的基因组片段在大小上可以在从0.3到1.6kb的范围内的任一处。在每次分析96个泳道的情况下以8倍汇集并且扩增1.4kb片段，此组合允许每单次分析筛选多达一百万个基因组DNA碱基对，使得TILLING成为一项高通量技术。TILLING进一步描述于斯莱德(Slade)和克瑙夫(Knauf)，2005以及亨尼科夫(Henikoff)等人，2004中。
除允许突变的有效检测以外，高通量TILLING技术对于天然多态性的检测也是理想的。因此，通过对一个已知的序列构建异源双链而询问一个未知的同源DNA揭露了多态性位点的数目和位置。核苷酸改变以及小型插入和缺失都可被鉴别，包括至少一些重复数目多态性。这已被称为Ecotilling(措麦(Comai)等人，2004)。可以对包含排成列阵的生态型DNA的板，而非来自经诱变的植株的DNA池进行筛选。因为检测是在凝胶上以接近碱基对的分辨率进行的，并且背景模式在整个泳道是均一的，所以可以将大小相同的条带匹配，因此在单一步骤中发现多个突变并且对它们进行基因分型。以此方式，突变的基因的测序是简单而有效的。
接着，通过使突变体与所希望的遗传背景的一个植株杂交，并且进行适合次数的回交以删去最初所不希望的亲本背景，可以将多个经鉴别的突变引入所希望的遗传背景中。
在本申请的上下文中，一个“诱导的突变”或“引入的突变”是一个人为诱导的遗传变异，它可以是基于化学品、辐射或生物学的诱变的结果，例如转座子或T-DNA插入。优选的突变是使基因完全失活的无效突变，如无义突变、移码突变、缺失、插入突变或剪接位点变异体。其他优选的突变是保留一些SBEII活性，但低于该酶的野生型水平的部分突变。核苷酸插入型衍生物包括5′和3′末端融合以及单个或多个核苷酸的序列内插入。插入型核苷酸序列变异体是在利用锌指核酸酶(ZFN)或其他同源重组方法是可能的一个预定位点处、或通过随机插入以及对所得产物的适当筛选而将一个或多个核苷酸引入核苷酸序列中的一个位点中的变异体。缺失型变异体的特征在于从序列中去除一个或多个核苷酸。优选地，相对于野生型基因，一个突变基因仅具有一个核苷酸序列的单一插入或缺失。缺失可以是大范围的，足以包括一个或多个外显子或内含子、外显子与内含子两项、一个内含子-外显子边界、启动子的一部分、翻译起始位点、或甚至整个基因。基于A、B或D基因组上的SBEIIa和SBEIIb基因两种基因的密切的遗传连锁，缺失可以延伸远到足以包括这两种基因的至少一部分或全部。一个基因的蛋白编码区的外显子内的插入或缺失使一定数目的核苷酸插入或缺失，该数目并非三的整倍数，由此在翻译过程中引起阅读框的一个改变，这几乎总是使包含这类插入或缺失的突变基因的活性消除。
取代型核苷酸变异体是序列中的至少一个核苷酸已被去除并且在它的位置中插入了一个不同的核苷酸的变异体。相对于野生型基因，一个突变基因中受取代影响的核苷酸的优选数目是最大十个核苷酸，更优选地最大是9、8、7、6、5、4、3、或2个，或最优选地是仅一个核苷酸。这些取代可以“沉默的”，因为该取代不改变由密码子界定的氨基酸。这些核苷酸取代可以例如通过降低mRNA稳定性或当接近一个外显子-内含子剪接边界时改变剪接效率而使翻译效率降低，并且由此降低SBEII表达水平。预期那些未改变一种SBEIIa或SBEIIb基因的翻译效率的沉默取代不会改变基因的活性，并且因此在此被视为非突变的，即，这些基因是活性变异体，并且不包涵于“突变等位基因”中。可替代地，一个或多个核苷酸取代可以改变所编码的氨基酸序列，并且由此改变所编码的酶的活性，尤其是当保守的氨基酸被另一个截然不同的氨基酸取代(即，一个非保守取代)时。典型的保守取代是根据表3进行的取代。
如在此所使用的术语“突变”不包括那些不影响基因活性的沉默的核苷酸取代，并且因此仅包括那些影响基因活性的基因序列中的改变。术语“多态性”是指包括这类沉默的核苷酸取代的核苷酸序列中的任何改变。筛选方法可能涉及首先在多态性变异体的一个群组内针对多态性并且其次针对突变加以筛选。
如本领域中所理解，如面包小麦的六倍体小麦包含通常被指定为A、B以及D基因组的三个基因组，而如硬粒小麦的四倍体小麦包含通常被指定为A和B基因组的两个基因组。如本领域中所熟知，每个基因组包含7对染色体，这些染色体可以通过细胞学方法在减数分裂过程中观察到并且由此鉴别。
如在此所使用的术语“一个或多个植株”和“一个或多个小麦植株”作为一个名词总体上指代完整植株，但是当“植株”或“小麦”作为一个形容词使用时，这些术语指代一个植株或一个小麦植株中存在、从其获得、来源于其或与其相关的任何物质，如例如植物器官(例如叶、茎、根、花)、单一细胞(例如花粉)、种子、植物细胞(包括例如组织培养的细胞)、由该植株制造的产品(如“小麦面粉”、“小麦籽粒”、“小麦淀粉”、“小麦淀粉颗粒”等)。已萌发了根和芽的小植株和发芽的种子也包括在“植株”的含义内。如在此所使用的术语“多个植物部分”指代从一个完整植株、优选地一个小麦植株中获得的一个或多个植物组织或器官。这些植物部分包括营养结构(例如叶、茎)、根、花器官/结构、种子(包括胚、胚乳、以及种皮)、植物组织(例如维管组织、基本组织等)、细胞以及其子代。如在此所使用的术语“植物细胞”指代从一个植株获得或一个植株中的一个细胞(该植株优选为一个小麦植株)，并且包括来源于植株的原生质体或其他细胞、产生配子的细胞、以及再生成完整植株的细胞。植物细胞可以是培养的细胞。“植物组织”意指一个植株中或从一个植株获得的分化的组织(“外植体”)或来源于不成熟或成熟的胚、种子、根、芽、果实、花粉、以及培养的植物细胞的聚集体的不同的形式(如愈伤组织)的未分化的组织。如小麦种子的种子中或来自这些种子的植物组织是种皮、胚乳、盾片、糊粉层以及胚。
如在此所使用的谷物意指单子叶植物禾本科(Poaceae)或黍草科(Graminae)的植株或籽粒，这些植株或籽粒针对它们种子的可食用组分进行栽培，并且包括小麦、大麦、玉米、燕麦、黑麦、稻米、高粱、黑小麦、小米、荞麦。优选地，谷物植株或籽粒是小麦或大麦植株或籽粒，更优选地是小麦植株或籽粒。在另一个优选实施例中，谷物植株不是稻米或玉米或这两种。
如在此所使用，术语“小麦”指代小麦属的任何物种，包括它们的祖代、以及通过与其他物种的杂交而产生的它们的子代。小麦包括具有AABBDD的基因组构造、包含42个染色体的“六倍体小麦”、以及具有AABB的基因组构造、包含28个染色体的“四倍体小麦”。六倍体小麦包括普通小麦、斯卑尔脱小麦、马卡小麦、密穗小麦、印度圆粒小麦、瓦维洛夫小麦、以及它们的种间杂交株。四倍体小麦包括硬粒小麦(也称为硬粒小麦或圆锥小麦硬粒亚种)、野生二粒小麦、栽培二粒小麦、波兰小麦、以及它们的种间杂交株。另外，术语“小麦”包括六倍体或四倍体小麦属的可能的祖代，如针对A基因组的乌拉尔图小麦、栽培一粒小麦或野生一粒小麦、针对B基因组的拟斯卑尔脱山羊草、以及针对D基因组的节节麦(也称为粗山羊草(Aegilopssquarrosa或Aegilopstauschii))。供本发明中使用的一个小麦栽培品种可能属于(但不限于)以上列出的物种中的任一项。还包涵了通过常规技术在与一个非小麦物种(如黑麦(ryeSecalecereale))的一个有性杂交中使用小麦属作为一个亲本而产生的植株，包括(但不限于)黑小麦。优选地，小麦植株适用于籽粒的商业生产，如六倍体小麦或硬粒小麦的商业品种，它们具有本领域普通技术人员已知的适合的农艺特征。更优选地，小麦是普通小麦夏季亚种或圆锥小麦硬粒亚种，并且最优选地，小麦是普通小麦，在此也称为“面包小麦”。
如在此所使用，术语“大麦”指代大麦属的任何物种，包括它们的祖代、以及通过与其他物种的杂交而产生的它们的子代。优选的是，植株属于商业上栽培的一个大麦物种，如大麦或适于籽粒商业生产的一个品系或栽培品种或品种。
本发明的小麦植株除了用于食物或动物饲料以外还可以具有许多用途，例如用于研究或育种。在种子繁殖型作物(如小麦)中，植株可以自交以产生对于所希望的基因来说是纯合的一种植株，或者可以对单倍体组织(如发育中的生殖细胞)进行诱导以使染色体组加倍，从而产生一个纯合的植株。本发明的近交小麦植株由此产生了包含突变SBEII等位基因的组合的可以是纯合的种子。这些种子可以生长，从而产生将具有所选的表型(如其淀粉中直链淀粉含量高)的植株。
本发明的小麦植株可以与包含一个更为所希望的遗传背景的植株杂交，并且因此本发明包括将低SBEII性状转移到其他遗传背景。在最初的杂交之后，可以进行适合次数的回交，从而去除一个更不希望的背景。SBEII等位基因特异性的基于PCR的标志物(如在此描述的那些)可以用于筛选或鉴别那些具有所希望的等位基因的组合的子代植株或籽粒，由此在育种计划中追踪这些等位基因的存在。所希望的遗传背景可以包含基因的一个适合的组合，这些基因提供商业产率和其他特性(如农艺性能或非生物逆境抗性)。遗传背景还可以包含其他改变的淀粉生物合成或修饰基因，例如来自其他小麦株系的基因。遗传背景可以包含一个或多个转基因，如赋予对一种除草剂(如草甘膦)的耐受性的一种基因。
小麦植株的所希望的遗传背景将包括农艺产率和其他特性的考虑因素。这些特性可以包括对具有一个冬季或春季类型、农艺性能、疾病抗性和非生物逆境抗性是否是希望的。为了澳大利亚人使用，可能会想使本发明的小麦植株的改变的淀粉性状杂交到如巴克斯特(Baxter)、肯尼迪(Kennedy)、简兹(Janz)、弗瑞姆(Frame)、罗赛乐(Rosella)、凯多克斯(Cadoux)、钻石鸟(Diamondbird)或其他常见生长的品种的小麦栽培品种中。其他品种将适于其他生长区。优选的是，本发明的小麦植株提供相对于至少一些生长区中的相应野生型品种的产率至少80％的一个籽粒产率，更优选地至少85％或至少90％，并且甚至更优选地相对于具有几乎相同的遗传背景、在相同条件下生长的一个野生型品种至少95％。最优选地，本发明的小麦植株的籽粒产率至少与具有几乎相同的遗传背景、在相同条件下生长的野生型小麦植株一样大的产率。该产率可以在经控制的田间试验中、或在温室中模拟的田间试验中、优选地在田间容易地测量。
标志物辅助的选择是针对在与一个轮回亲本在一项经典的育种计划中回交时获得的多个杂合植株进行选择的一种广获认可的方法。每一回交代中的植株的群体对于在一个回交群体中通常以一个1∶1比率存在的所关注的一种或多种基因来说将是杂合的，并且分子标志物可以用于区分该基因的两个等位基因。通过从例如幼芽提取DNA并且针对基因渗入的所希望的性状用一个特异性标志物测试，进行用于进一步回交的植株的早期选择，同时将能量和资源集中在更少的植株上。
如使小麦植株杂交、使小麦植株自体受精或标志物辅助的选择的程序是标准程序并且是本领域中熟知的。将等位基因从四倍体小麦(如硬粒小麦)转移到一个六倍体中、或其他形式的杂交是更困难的但也是本领域中已知的。
为了鉴别所希望的表型特征，典型地将包含突变的SBEIIa和SBEIIb等位基因或其他所希望的基因的组合的小麦植株与对照植株比较。当评估与酶活性相关的一个表型特性(如籽粒淀粉中的直链淀粉含量)时，使待测试的植株和对照植株在生长箱、温室、开顶箱和/或田间条件下生长。一种具体表型性状的鉴别和与对照的比较是基于常规的统计分析和评分。植株的株系之间的统计学差异可以通过对植株的株系之间表达酶的每一组织类型内的该酶活性进行比较来加以评估。表达和活性是与生长、发育以及出产参数相比的，这些参数包括植株部分形态、颜色、数目、大小、尺寸、干重和湿重、成熟、地上与地下的生物质比率、以及生长到衰老的不同阶段的时间安排、速率以及持续时间，包括营养生长、结果、开花、以及可溶性碳水化合物含量(包括蔗糖、葡萄糖、果糖以及淀粉水平以及内源性淀粉水平)。优选地，当在相同条件下生长时，本发明的小麦植株与野生型植株在这些参数中的一项或多项方面相差不到50％、更优选地不到40％、不到30％、不到20％、不到15％、不到10％、不到5％、不到2％或不到1％。
如在此所使用，术语“连锁”指代一个标志物基因座与一个第二基因座在一条染色体上足够接近，使得它们将例如非随机地在超过50％的减数分裂中共同遗传。此定义包括了该标志物基因座与第二基因座形成同一基因的一部分的情形。此外，此定义包括了该标志物基因座包含会引起所关注的性状的一个多态性(换句话说，该标志物基因座直接“连锁”到该表型)的情形。如在此所使用的术语“遗传连锁”是更狭隘的，仅关于以下情形使用：一个标志物基因座与一个第二基因座在一条染色体上足够接近，使得它们将在超过50％的减数分裂中共同遗传。由此，每代在基因座之间观察到的重组百分比(厘摩(cM))将低于50。在本发明的具体实施例中，遗传连锁的基因座可以在一条染色体上相隔45、35、25、15、10、5、4、3、2、或1或更少cM。优选地，这些标志物相隔不到5cM或2cM，并且最优选地相隔约0cM。如在此实例5中所描述，SBEIIa和SBEIIb基因在每一个小麦基因组的染色体2的长臂上遗传连锁，相隔约0.5cM，这对应于物理距离中的约100-200kb。
如在此所使用，“其他遗传标志物”可以是连锁到本发明的小麦植株中的一个所希望的性状的任何分子。这类标志物为本领域普通技术人员所熟知，并且包括了连锁到基因决定性状的分子标志物，这些基因决定性状如疾病抗性、产率、植株形态、籽粒质量、其他休眠性状，如籽粒颜色、种子中的赤霉酸含量、植株高度、面粉颜色等。这些基因的实例是茎锈病抗性基因Sr2或Sr38、条锈病抗性基因Yr10或Yr17、线虫抗性基因(如Cre1和Cre3)、决定生面团强度的麦谷蛋白基因座处的等位基因(如Ax、Bx、Dx、Ay、By以及Dy等位基因)、决定半矮生长习性并且因此决定倒伏抗性的Rht基因(伊格尔(Eagles)等人，2001；兰格里奇(Langridge)等人，2001；夏普(Sharp)等人，2001)。
本发明的小麦植株、小麦植株部分以及来自其的产品优选地对于抑制SBEIIa表达的基因来说是非转基因的，即，它们不包含对使内源性SBEIIa基因表达减少的一种RNA分子进行编码的一种转基因，不过在这一实施例中，它们可能包含其他转基因，例如除草剂耐受性基因。更优选地，小麦植株、籽粒以及来自其的产品是非转基因的，即，它们不包含任何转基因，这在一些市场中是优选的。这些产品在此也被描述为“非转化的”产品。这些非转基因植株和籽粒包含如在此所描述的多个突变的SBEII等位基因，如在诱变之后产生的那些。
如在此所使用的“转基因植株”和“转基因小麦植株”是指包含了在相同物种、品种或栽培品种的一个野生型植株中未发现的一个基因构建体(“转基因”)的一个植株。即，转基因植株(转化的植株)包含了在转化之前它们所不包含的遗传物质。如在此所提及的“转基因”具有生物技术领域中的普通含义，并且指代已通过重组DNA或RNA技术产生或改变并且已引入植物细胞中的一个基因序列。转基因可以包括从以下获得或来源于以下的基因序列：一种植物细胞、或另一种植物细胞、或一种非植物来源、或一种合成序列。典型地，转基因已通过人类操作，如例如通过转化来引入植物中，但可以使用如本领域普通技术人员认可的任何方法。遗传物质典型地稳定地整合到植物的基因组中。所引入的遗传物质可以包含相同物种中天然存在但呈一个重排的次序或一个不同的元件排列形式的序列，例如一个反义序列。包含这类序列的植株在此被包括在“转基因植株”中。如在此所定义的转基因植株包括一个最初转化和再生的植株(T0植株)的所有子代，该植株已使用重组技术以遗传方式修饰，其中该子代包含该转基因。这类子代可以通过原代转基因植株的自体受精或通过使这类植株与相同物种的另一个植株杂交来获得。在一个实施例中，转基因植株对于每一个已经引入的基因(转基因)来说是纯合的，以便它们的子代对于所希望的表型不会分离。转基因植株部分包括了包含该转基因的所述植株的所有部分和细胞，如例如种子、培养的组织、愈伤组织和原生质体。一个“非转基因植株”、优选地一个非转基因小麦植株是尚未通过利用重组DNA技术引入遗传物质来以遗传方式修饰的植株。
如在此所使用，术语“相应非转基因植株”指代相对于该转基因植株，大多数特性相同或类似、优选地等基因或近等基因的，但不具有所关注的转基因的一个植株。优选地，相应非转基因植株与所关注的转基因植株的祖代属于相同的栽培品种或品种，或者是缺乏经常称为一个“分离子”的构建体的一个同属植物株系，或者是经一个“空载体”构建体转化的相同栽培品种或品种的一个植株，并且可以是一个非转基因植株。如在此所使用的“野生型”指代尚未根据本发明进行修饰的一个细胞、组织或植株。野生型细胞、组织或植株为本领域中已知的并且可以用作对照，从而与如在此所描述进行修饰的细胞、组织或植株比较一种外源性核酸的表达水平或性状修饰的程度和性质。如在此所使用，“野生型小麦籽粒”意指一个相应的未进行诱变的非转基因的小麦籽粒。如在此所使用的具体野生型小麦籽粒包括(但不限于)阳光州(Sunstate)和凯多克斯。
数种方法中的任一种都可以用于测定一个转化的植株中的一种转基因的存在。举例来说，聚合酶链反应(PCR)可以用于对该转化的植株所独有的序列进行扩增，并且通过凝胶电泳或其他方法检测所扩增的产物。可以使用常规方法从这些植株中提取DNA出，并且使用将对转化和非转化的植株进行区分的引物进行PCR反应。确认一个阳性转化体的一种替代方法是利用本领域中熟知的Southern印迹杂交进行。经转化的小麦植株还可以通过例如由存在一种可选择的标志物基因所赋予的它们的表型，或者通过检测或定量由该转基因编码的一种酶的表达的免疫分析，或者由该转基因赋予的任何其他表型，从非转化的或野生型小麦植株中鉴别出来(即，区分开来)。
本发明的这些小麦植株对于籽粒来说可以是生长的或收获的，除其他用途之外，主要用作供人类消耗的食物或用作动物饲料、或用于发酵或工业原料生产，如乙醇生产。可替代地，这些小麦植株可以直接作为饲料使用。本发明的植株优选地适用于食物生产并且尤其适用于商业食物生产。这类食物生产可以包括从籽粒制造面粉、生面团、粗粒小麦粉或可以成为商业食物生产中的一种成分的其他产品。
如在此所使用，术语“籽粒”总体上指代一个植株的成熟的被收获的种子，但根据上下文也可以指代在吸涨或发芽之后的籽粒。成熟的谷物籽粒，如小麦通常具有低于约18％-20％的水分含量。如在此所使用，术语“种子”包括了收获的种子，但也包括在开花后的植株中的发育中的种子和在收获之前的植株中所包含的成熟种子。
如在此所使用，“发芽”指代在吸涨之后根尖从种皮萌出。“发芽率”指代一个群体中在吸涨之后的一段时间(例如7或10天)内已发芽的种子的百分比。发芽率可以使用本领域中已知的技术加以计算。举例来说，可以在数天内每天对种子的一个群体进行评估以测定随时间推移发芽的百分比。就本发明的籽粒来说，如在此所使用的术语“实质上相同的发芽率”意指籽粒的发芽率是相应野生型籽粒的发芽率的至少90％。
使用标准方法，例如舒尔曼(Schulman)和凯米欧维尔塔(Kammiovirta)，1991的方法容易从小麦籽粒中分离出淀粉。在工业规模上，可以使用湿式或干式碾磨。淀粉颗粒的尺寸在存在从更小的B颗粒中分离出更大的A颗粒的淀粉加工工业中是很重要的。
商业生长的野生型小麦在籽粒中具有通常在55％-65％范围内的淀粉含量，有点取决于所生长的栽培品种。比较起来，当植株在相同条件下生长时，本发明的种子或籽粒具有相对于野生型籽粒的淀粉含量至少90％，并且优选地相对于野生型籽粒的淀粉含量至少93％、至少95％或至少98％的淀粉含量。在另外的实施例中，籽粒的淀粉含量占籽粒重量(w/w)百分比至少约25％、至少约35％、至少约45％、或至少约55％到约65％。其他所希望的特性包括碾磨籽粒的能力、尤其是籽粒硬度。可以使一个小麦植株具有更高价值的另一个方面是淀粉从籽粒提取的程度，更高提取率会更有用。籽粒形状也是可以影响一种植株的商业适用性的另一个特征，因此颗粒形状可以对籽粒可以被碾磨的容易性或其他具有影响。
在另一个方面中，本发明提供了从如上所描述的植株的籽粒获得的淀粉颗粒或淀粉，这些淀粉颗粒或淀粉具有一个增加的直链淀粉比例和一个降低的支链淀粉比例。精制淀粉可以通过一种碾磨工艺，例如一种湿碾工艺从籽粒获得，该工艺涉及将淀粉从蛋白、油类和纤维中分离出来。碾磨工艺的初始产物是淀粉颗粒的混合物或组合物，并且本发明因此包涵这些颗粒。来自小麦的淀粉颗粒除其他蛋白之外还包含淀粉颗粒结合型蛋白(包括GBSS、SBEIIa以及SBEIIb)，并且因此这些蛋白的存在将小麦淀粉颗粒与其他谷物的淀粉颗粒区分开来。来自淀粉颗粒的淀粉可以通过在利用热和/或化学处理使淀粉颗粒瓦解和分散之后移除这些蛋白来纯化。如在此例示，当借助光学显微术观察时，尤其对于直链淀粉含量占籽粒的总淀粉的百分比至少50％的小麦籽粒来说，来自本发明的小麦籽粒的淀粉颗粒典型地在形状和表面形态方面变形。在一个实施例中，从籽粒获得的至少50％、优选地至少60％或至少70％的淀粉颗粒展示变形的形状或表面形态。这些淀粉颗粒在借助偏振光观察时还展示了一个双折射率的损失。
本发明的籽粒的淀粉、淀粉颗粒的淀粉、以及精制淀粉的特性可能进一步在于以下性质中的一项或多项：
(i)占总淀粉的比例至少50％(w/w)、或至少60％(w/w)、或至少67％(w/w)的直链淀粉；
(ii)改变的膨胀体积；
(iii)改变的链长分布和/或分支频率；
(iv)改变的糊化温度；
(v)改变的粘度(峰值粘度、成糊温度等)；
(vi)改变的支链淀粉和/或直链淀粉的分子质量；
(vii)改变的结晶度％
(viii)包含至少2％抗性淀粉；和/或
(ix)包括一个低的相对血糖指数(GI)。
淀粉的特性还可以在于它与野生型淀粉相比在加热的过量水中的膨胀体积。膨胀体积典型地通过将一份淀粉或面粉与过量水混合并且加热到高温(典型地大于90℃)来测量。接着，通过离心来收集样品，并且将膨胀体积表示为沉降的物质的质量除以样品的干重。当所希望的是提高一种食物配制品、尤其是一种水化的食物配制品的淀粉含量时，一个低膨胀特性是有用的。
一种改变的支链淀粉结构的一个量度是淀粉的链长分布或聚合度。链长分布可以通过在异淀粉酶脱支之后使用荧光团辅助的碳水化合物电泳(FACE)来测定。本发明的淀粉的支链淀粉可以具有在5到60范围内的一个链长分布，该链长分布比来自野生型植株的在脱支后的淀粉的分布更大。具有更长链长的淀粉也将在分支频率方面具有一个相称的减小。因此，淀粉还可以在仍然存在的支链淀粉中具有一个更长的支链淀粉的链长分布。籽粒的支链淀粉的特性可以在于如在支链淀粉的异淀粉酶脱支之后所测量，相对于野生型籽粒的支链淀粉包含一个减少的比例的4-12dp链长部分。
在本发明的另一个方面中，小麦淀粉可以具有一个改变的糊化温度，该糊化温度可以通过差示扫描量热法(DSC)容易地测量。糊化是在过量水中淀粉颗粒内的分子序态在热驱使下崩溃(瓦解)，并且伴随着和不可逆地发生在如颗粒膨胀、微晶熔融、双折射率损失、粘度发展以及淀粉溶液化的性质方面的改变。与来自野生型植株的淀粉相比，糊化温度可能升高或降低，取决于剩余支链淀粉的链长。来自玉米的直链淀粉扩充(ae)突变体的高直链淀粉展示了一个比普通玉米更高的糊化温度(不破(Fuwa)，1999；克鲁格(Krueger)等人，1987)。另一方面，当与来自对照植株的淀粉相比时，来自缺乏淀粉合酶IIa活性的大麦sex6突变体的淀粉具有更低的糊化温度，并且关于糊化峰的焓减小(莫雷尔等人，2003)。
如通过DSC测量，与从一个相似的但未改变的籽粒中提取的淀粉相比，糊化温度、尤其是第一个峰的起始的温度或关于第一个峰的顶点的温度可以升高至少3℃、优选地至少5℃或更优选地至少7℃。淀粉可以包含一个升高的水平的抗性淀粉，具有由特定物理特性指示的一个改变的结构，这些物理特性包括由以下各项组成的群组中的一项或多项：消化酶的物理难接近性(这可能是由于具有改变的淀粉颗粒形态)、可测量的淀粉相关的脂质的存在、改变的结晶度、以及改变的支链淀粉链长分布。直链淀粉的高比例也有助于抗性淀粉的水平。
与从小麦分离的普通淀粉相比，本发明的小麦的淀粉结构的不同之处还可以在于结晶程度减小。一种淀粉的结晶度减小也被认为会引起感官性质增强并且有助于一个更爽滑的口感。因此，淀粉可以另外展现由一种或多种支链淀粉合成酶的活性水平降低引起的结晶度减小。结晶度典型地通过X射线晶体学研究。
在一些实施例中，本发明淀粉提供了改变的消化性质，如增加的抗性淀粉(包括在1％到20％、2％到18％、3％到18％或5％到15％之间的抗性淀粉)和一个降低的血糖指数(GI)。
本发明还提供了从该籽粒制造的面粉、粗粉或其他产品。这些产品可能未被加工或例如通过分级分离或漂白进行加工。
本发明还提供了来自例示的小麦植株的籽粒的淀粉，该淀粉包含增加的量的膳食纤维，优选地与一个升高的水平的抗性淀粉组合。此增加至少部分地也是直链淀粉的高相对水平的一个结果。
如在此所使用的术语“膳食纤维”包括了在健康人类的小肠中未被吸收，而是进入大肠的碳水化合物和碳水化合物消化产物。这包括了抗性淀粉和其他可溶性和不溶性碳水化合物聚合物。预期包括至少部分在大肠中由固有微生物群落可发酵的碳水化合物的部分。本发明的淀粉包含相对较高水平的膳食纤维，更具体地说是直链淀粉。本发明的籽粒的膳食纤维含量至少部分地由该籽粒的淀粉中的增加的直链淀粉含量、以及、或与占总淀粉的百分比增加的抗性淀粉含量组合产生。“抗性淀粉”在此被定义为在健康人类的小肠中未被吸收但进入大肠的淀粉和淀粉消化产物的总和。根据上下文，这是按照籽粒的总淀粉的百分比、或食物中的总淀粉含量的百分比定义的。因此，抗性淀粉排除了在小肠中消化和吸收的产物。抗性淀粉包括物理难接近的淀粉(RS1形式)、抗性天然淀粉颗粒(RS2)、回生淀粉(RS3)、以及化学改性的淀粉(RS4)。本发明的淀粉的改变的淀粉结构以及尤其高的直链淀粉水平引起当在食物中进行消耗时抗性淀粉的一个增加。该淀粉可以呈一种RS1形式，有点难以消化。如由V-复合物结晶度测量的淀粉-脂质结合也可能有助于抗性淀粉的水平。
虽然本发明可能尤其适用于人类的治疗或预防，但应理解的是，本发明也适用于非人类受试者，包括(但不限于)农用动物，如牛、绵羊、猪等；家养动物，如犬或猫；实验动物，如兔或啮齿动物，如小鼠、大鼠、仓鼠；或可以用于体育的动物，如马。该方法可能尤其适用于非反刍类哺乳动物或如单胃哺乳动物的动物。本发明还可以适用于其他农用动物，例如家禽，包括例如鸡、鹅、鸭、火鸡、或鹌鹑、或鱼。
治疗受试者、尤其人类的方法可以包括以下步骤：以一个或多个剂量，以一定的量并且持续一段时间，向受试者投与如在此所定义的改变的小麦籽粒、面粉、淀粉或一种食物或饮料产品，由此改善一项或多项肠健康状况或代谢指标的水平。该指标可能相对于未改变的小麦淀粉或小麦或其产品改变，如在如pH值、SCFA水平升高、餐后葡萄糖波动的一些指标的情况下，该改变在数小时的一段时间内，或者如在粪便体积增加或排便改善的情况下，它可能耗费数天，或者如在测量丁酸盐增强的普通结肠细胞的增殖的情况下，可能是约为数周或数个月的更长时间。可能所希望的是改变的淀粉或小麦或小麦产品的投与是终生的。然而，假定改变的淀粉可以相对容易地投与，那么可期待所治疗的个体具有良好的顺应性。
取决于所治疗或预防的病状，剂量可以改变，但对于人类预计为每天至少1g本发明的小麦籽粒或淀粉，更优选地每天至少2g，优选地每天至少10g或至少20g。每天大于约100克的投与可能需要相当大体积的递送并且降低了顺应性。最优选地，剂量针对一个人是在每天5g与60g小麦籽粒或淀粉之间，或针对成人在每天5g与100g之间。
血糖指数(GI)涉及包含淀粉的食物的消化率，并且是对血糖浓度的漂移的一种测试食物的作用与白面包或葡萄糖的作用的一个比较。血糖指数是所关注的食物对餐后血清葡萄糖浓度的可能的作用以及对用于血糖动态平衡的胰岛素的需求的一个量度。由本发明的食物提供的一个重要特性是一个降低的血糖指数。与低直链淀粉的小麦相比，血清葡萄糖水平在人类志愿者摄取高直链淀粉的小麦产品之后30分钟更低(戈达德(Goddard)等人，1984)。此外，食物可以具有一个低水平的最终消化，并且因此是相对低卡路里的。一种低卡路里产品可以基于包含由碾磨的小麦籽粒制造的面粉。这类食物可以具有饱腹、增强肠健康状况、降低餐后血清葡萄糖和脂质浓度以及提供一种低卡路里食物产品的作用。
改善的肠健康状况的指标可以包括(但不必限于)：
i)肠内含物的pH值减小，
ii)肠内含物中的总SCFA浓度或总SCFA量增加，
iii)肠内含物中的一种或多种SCFA的浓度或量增加，
iv)粪便体积增加，
v)肠或粪便的总水体积增加，并且不腹泻，
vi)排便改善，
vii)一个或多个益生细菌物种的数目或活性增加，
viii)粪便胆酸排泄增加，
ix)腐化产物的尿水平降低，
x)腐化产物的粪便水平降低，
xi)正常结肠细胞的增殖增加，
xii)肠发炎的个体的肠中炎症减少，
xiii)尿毒症患者的尿素、肌酸酐以及磷酸盐中的任一种的粪便或大肠水平降低，以及
xiv)以上的任何组合。
改善的代谢健康状况的指标可以包括(但不必限于)：
i)餐后葡萄糖波动的稳定化，
ii)血糖反应改善(降低)，
iii)餐前血浆胰岛素浓度降低，
iv)血脂特征曲线改善，
v)血浆LDL胆固醇降低，
vi)尿毒症患者的尿素、肌酸酐以及磷酸盐中的一种或多种的血浆水平降低，
vii)血糖代谢异常反应的改善，或
viii)以上的任何组合。
应理解的是，本发明的一个益处在于它提供了具有特定营养益处的产品，如面包，并且此外它这样做不需要对小麦籽粒的淀粉或其他组分进行收获后改性。然而，可能所希望的是对籽粒的淀粉或其他组分进行改性，并且本发明包涵这类改性的组分。改性方法已众所周知，并且包括利用常规方法的淀粉或其他组分的提取以及对淀粉的改性以增加抗性形式。淀粉可以通过用热和/或水分处理、以物理方式(例如球磨)、以酶促方式(使用例如α-或β-淀粉酶、普鲁兰酶等)、化学水解(使用液体或气体试剂的湿式或干式)、氧化、用双官能试剂(例如三偏磷酸钠、磷酰氯)交联、或羧甲基化作用来改性。
本发明的小麦淀粉对于发酵来说将是一种适合的底物，该发酵是针对乙醇(生物燃料)或包含乙醇的饮料、以及用于其他发酵产品(如食物、保健食品(不溶性或可溶性纤维)、酶以及工业材料)的小麦籽粒或小麦淀粉。用于使用植物来源的淀粉的发酵的方法与用于不同发酵产品的既定工艺为本领域普通技术人员所熟知(参见例如沃格尔(Vogel)等人，1996和其中引用的参考文献)。在一个实施例中，淀粉碳水化合物可以通过将本发明的小麦植株部分(如籽粒)捣碎、或通过从植物组织扩散到水或另一种适合的溶剂中来提取。本发明的小麦组织或淀粉可以在一种分批、连续或固定化细胞工艺中直接用作用于发酵或生物转化的一种底物。
术语“多肽”与“蛋白”在此总体上可互换使用。如在此所使用的术语“蛋白”和“多肽”还包括如在此所描述的本发明的多肽的变异体、突变体、修饰和/或衍生物。如在此所使用，“实质上纯化的多肽”指代已从与其在其天然状态下结合的脂质、核酸、其他肽以及其他分子中分离出来的一种多肽。优选地，实质上纯化的多肽至少60％不含、更优选至少75％不含、并且更优选地至少90％不含与其天然结合的其他组分。“重组多肽”意指使用重组技术，即，通过一种重组聚核苷酸在一种细胞、优选地一种植物细胞并且更优选地一种小麦细胞中的表达而制得的一种多肽。在一个实施例中，该多肽具有淀粉分支酶活性、尤其SBEII活性，并且与在此描述的一种SBEII至少90％一致。
如在此所使用，一种“生物学活性”片段是维持全长多肽的一个界定的活性的本发明的一种多肽的一个部分。在一个尤其优选实施例中，生物学活性片段具有淀粉分支酶活性。生物学活性片段可以是任何大小，只要它们维持所界定的活性即可，但优选地长为至少700或800个氨基酸残基。
一种多肽相对于另一种多肽的一致性％可以通过GAP(尼德曼(Needleman)和温施(Wunsch)，1970)分析法(GCG程序)测定，其中一个空位产生罚分＝5，并且一个空位延长罚分＝0.3。查询序列长为至少50个氨基酸，并且GAP分析法在至少50个氨基酸的一个区域上比对这两个序列。更优选地，查询序列长为至少100个氨基酸，并且GAP分析法在至少100个氨基酸的一个区域上比对这两个序列。甚至更优选地，查询序列长为至少250个氨基酸，并且GAP分析法在至少250个氨基酸的一个区域上比对这两个序列。最优选地，两个SBEII多肽在它们全长氨基酸序列上进行比对。
关于一个所定义的多肽，应了解高于以上提供的那些一致性％数值的一致性％数值将包涵优选实施例。因此，当可适用时，根据最低一致性％数值，优选的是该多肽包含与相关指定的SEQIDNO至少75％、更优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、更优选地至少93％、更优选地至少94％、更优选地至少95％、更优选地至少96％、更优选地至少97％、更优选地至少98％、更优选地至少99％、更优选地至少99.1％、更优选地至少99.2％、更优选地至少99.3％、更优选地至少99.4％、更优选地至少99.5％、更优选地至少99.6％、更优选地至少99.7％、更优选地至少99.8％、并且甚至更优选至少99.9％一致的一个氨基酸序列。
本发明的多肽的氨基酸序列突变体可以通过将适当核苷酸改变引入本发明的一个核酸中或通过体内诱变(如利用化学或辐射处理)来制备。这类突变体包括例如氨基酸序列内的残基的缺失、插入或取代。本发明的聚核苷酸可以经受如由原山(Harayama)，1998描述的DNA改组技术或其他体外方法，从而制造出编码多肽变异体的改变的聚核苷酸。这些DNA改组技术可以使用与本发明的那些基因序列有关的基因序列，如来自除小麦以外的植物物种的SBE基因。从突变/改变的DNA获得的产品可以使用在此描述的技术容易地筛选，从而确定它们是否具有例如SBE活性。
氨基酸序列缺失总体上在约1到15个残基，更优选地约1到10个残基并且典型地约1到5个连续残基范围内。
取代突变使多肽分子中的至少一个氨基酸残基被去除并且在其位置中插入一个不同的残基。对于取代诱变来说最关注的位点包括被鉴别为一个或多个活性位点的位点。所关注的其他位点是从不同品系或物种获得的具体残基在其中一致(即，保守氨基酸)的那些位点。这些位置对于生物活性可能是重要的。这些氨基酸，尤其是处于至少三个其他一致保守的氨基酸的一个连续序列中的那些氨基酸优选地以一种相对保守的方式被取代，以便保留如SBEII活性的功能。这些保守取代展示于表1中的“示例性取代”的标题下。“非保守氨基酸取代”在此被定义为除表3中列出的那些(示例性保守取代)以外的取代。预期一种SBEII中的非保守取代会降低酶的活性，并且许多将对应于由一种“部分功能丢失突变的SBEII基因”编码的一种SBEII。
同样包括在本发明的范围内的是在例如通过磷酸化进行合成的过程之中或之后被有区别地修饰的本发明的多肽，如已针对小麦的淀粉体中的SBEI、SBEIIa以及SBEIIb所展示(泰特洛(Tetlow)等人，2004)。这些修饰可以用于例如通过在淀粉合成过程中调节淀粉体中的蛋白复合物的形成来调节酶的活性(泰特洛等人，2008)，或者用于提高本发明的多肽的稳定性和/或生物活性，或充当用于结合另一种分子的一个配体。
在一些实施例中，本发明涉及基因活性、尤其是SBEII基因活性的修饰、突变基因的组合、以及嵌合基因的构建和使用。如在此所使用，术语“基因”包括了包括一个蛋白编码区或在一个细胞中转录但不翻译的任何脱氧核糖核苷酸序列，以及相关的非编码和调节区。这些相关的区域典型地位于5′和3′两个末端上与编码区邻接，在任一侧上达约2kb的一个距离。在这一点上，基因包括多种控制信号，如与一个给定的基因天然相关的启动子、增强子、转录终止和/或聚腺苷酸化信号；或异源控制信号，在该情况下，该基因被称为一个“嵌合基因”。位于蛋白编码区的5′并且存在于mRNA上的序列被称为5′非翻译序列。位于蛋白编码区的3′或下游并且存在于mRNA上的序列被称为3′非翻译序列。术语“基因”包涵一个基因的cDNA和基因组两种形式。术语“基因”包括编码在此描述的本发明的蛋白的合成或融合分子。基因通常以双链DNA形式存在于小麦基因组中。可以将一个嵌合基因引入一个适当载体中以用于一个细胞中的染色体外维持或用于整合到宿主基因组中。如在此所提及的基因或基因型呈斜体形式(例如SBEIIa)，而蛋白、酶或表型以非斜体形式(SBEIIa)提及。
包含编码区的一个基因的一个基因组形式或克隆可以间杂有多个称为“内含子”或“介入区”或“介入序列”的非编码序列。如在此所使用的一个“内含子”是一个基因的一个区段，它作为一个初级RNA转录物的一部分被转录，但并不存在于成熟mRNA分子中。内含子会被从核或初级转录物中去除或“剪除”；因此信使RNA(mRNA)中不存在内含子。内含子可以包含调节元件，如增强子。如在此所使用的“外显子”指代与存在于成熟mRNA或在RNA分子未被翻译的情况下的成熟RNA分子中的RNA序列相对应的DNA区。一个mRNA在翻译过程中起作用，从而指定一个新生多肽中的多个氨基酸的序列或次序。
本发明涉及不同的聚核苷酸。如在此所使用，一种“聚核苷酸”或“核酸”或“核酸分子”意指核苷酸的一种聚合物，它可以是DNA或RNA或其组合，例如DNA与RNA的一个异源双链，并且包括例如mRNA、cRNA、cDNA、tRNA、siRNA、shRNA、hpRNA、以及单或双链DNA。它可以是细胞、基因组或合成(例如在一台自动化合成仪上制得)来源的DNA或RNA，并且可以与碳水化合物、脂质、蛋白或其他物质组合，用荧光或其他基团标记，或附着于一种固体支撑物以表现出在此所定义的一个特定活性。优选地，聚核苷酸当存在于一种细胞中时仅仅是DNA或仅仅是RNA，并且当存在于一种小麦细胞中时一些碱基可以被甲基化或以其他方式修饰。聚合物可以是单链、基本上双链或部分双链的。一种部分双链RNA分子的一个实例是一种发夹RNA(hpRNA)、短发夹RNA(shRNA)或自身互补RNA，它包含了通过一种核苷酸序列与其互补序列之间的碱基配对而形成的一种双链茎干以及以共价方式连接该核苷酸序列与其互补序列的一种环序列。如在此所使用的碱基配对指代核苷酸之间的标准碱基配对，包括一种RNA分子中的G:U碱基对。“互补”意指两种聚核苷酸能够沿着它们长度的一部分或者沿着一种或两种的全长形成碱基配对。
“分离的”意指实质上或基本上不含在其天然状态中通常伴随其的组分的物质。如在此所使用，一种“分离的聚核苷酸”或“分离的核酸分子”意指一种聚核苷酸，它至少部分地从它在它的天然状态中所结合或连接的相同类型的聚核苷酸序列中分离出来、优选地实质上或基本上不含该聚核苷酸序列。举例来说，一种“分离的聚核苷酸”包括已从在一个天然存在状态中与它侧接的多个序列中纯化或分离出来的一种聚核苷酸，例如一种DNA片段，该DNA片段已从通常邻接于该片段的多个序列去除。优选地，分离的聚核苷酸也至少90％不含如蛋白、碳水化合物、脂质等的其他组分。如在此所使用的术语“重组聚核苷酸”涉及通过将核酸操作成自然界中未通常发现的一种形式而体外形成的一种聚核苷酸。举例来说，重组聚核苷酸可以呈一种表达载体的形式。总体上，这些表达载体包含可操作地连接于有待在细胞中转录的核苷酸序列的转录和翻译调节核酸。
本发明涉及寡核苷酸的使用，它们可以用作“探针”或“引物”。如在此所使用，“寡核苷酸”是至多长为50个核苷酸的聚核苷酸。它们可以是RNA、DNA、或任一种的组合或衍生物。寡核苷酸典型地是10到30个核苷酸的相对短的单链分子，通常长为15-25个核苷酸，典型地包含10-30个或15-25个核苷酸，这些核苷酸与一种SBEIIa或SBEIIb基因或对应于一种SBEIIa或SBEIIb基因的cDNA的一部分一致或互补。当在一种扩增反应中用作一种探针或一种引物时，这类寡核苷酸的最小的大小是用于在该寡核苷酸与一种靶核酸分子上的一种互补序列之间形成一种稳定杂交体所需的大小。优选地，这些寡核苷酸长为至少15个核苷酸、更优选地至少18个核苷酸、更优选地至少19个核苷酸、更优选地至少20个核苷酸、甚至更优选地至少25个核苷酸。用作一种探针的聚核苷酸典型地与一种可检测的标记(如一种放射性同位素、一种酶、生物素、一种荧光分子或一种化学发光分子)结合。本发明的寡核苷酸和探针适用于对与所关注的一种性状(例如改性淀粉)相关的一种SBEIIa、SBEIIb或其他基因的一个等位基因进行检测的方法。这类方法采用了核酸杂交，并且在许多情况下包括利用一种适合的聚合酶的寡核苷酸引物延伸，例如像在PCR中用于对野生型或突变等位基因进行检测或鉴别。优选的寡核苷酸和探针与来自小麦的一种SBEIIa或SBEIIb基因序列(包括在此所披露的任何序列，例如SEQIDNO：36到149)杂交。优选的寡核苷酸对是跨越一个或多个内含子、或一个内含子的一部分的那些寡核苷酸对，并且因此可以用于在一种PCR反应中对一种内含子序列进行扩增。在此的实例中提供了许多实例。
术语“聚核苷酸变异体”和“变异体”等是指展示出与一种参考聚核苷酸序列的实质上序列一致性，并且能够以与该参考序列类似的方式、或以与参考序列相同的活性起作用的聚核苷酸。这些术语还包涵了通过至少一个核苷酸的添加、缺失或取代而与一种参考聚核苷酸不同、或当与天然存在的分子相比时具有一个或多个突变的聚核苷酸。因此，术语“聚核苷酸变异体”和“变异体”包括一个或多个核苷酸已被添加或缺失、或用不同的核苷酸置换的聚核苷酸。在这一点上，本领域中充分理解的是，可以对一种参考聚核苷酸作出包括突变、添加、缺失以及取代在内的某些改变，由此所改变的聚核苷酸保留该参考聚核苷酸的生物功能或活性。因此，这些术语包涵了对展现酶促或其他调节活性的多肽进行编码的聚核苷酸、或能够充当选择性探针或其他杂交剂的聚核苷酸。术语“聚核苷酸变异体”和“变异体”还包括天然存在的等位基因变异体。突变体可以是天然存在的(也就是说，从一种天然来源中分离)或合成的(例如通过对核酸执行定点诱变)。优选地，编码具有酶活性的一种多肽的本发明的一种聚核苷酸变异体长为大于400、更优选地大于500、更优选地大于600、更优选地大于700、更优选地大于800、更优选地大于900、并且甚至更优选大于1,000个核苷酸，至多为该基因的全长。
本发明的一种寡核苷酸的一种变异体包括能够在接近在此定义的特定寡核苷酸分子的位置的一个位置处与例如小麦基因组杂交的大小变化的分子。举例来说，变异体可以包含额外的核苷酸(如1、2、3、4、或更多个)，或更少的核苷酸，只要它们仍然与靶区域杂交即可。此外，可以取代几个核苷酸而不影响寡核苷酸与靶区域杂交的能力。另外，可以容易地设计出接近于(例如(但不限于)在50个核苷酸内)在此定义的特定寡核苷酸杂交的植株基因组区域杂交的变异体。
在聚核苷酸或多肽的情形下，“对应于”或“与……相对应”意指一种聚核苷酸(a)具有与一种参考聚核苷酸序列的全部或一部分实质上一致或互补的一种核苷酸序列或(b)编码与一种肽或蛋白中的一种氨基酸序列一致的一种氨基酸序列。这一短语在其范围内还包括一种肽或多肽具有与一种参考肽或蛋白中的一种氨基酸序列实质上一致的一种氨基酸序列。用于描述两种或更多种聚核苷酸或多肽之间的序列关系的术语包括“参考序列”、“比较窗口”、“序列一致性”、“序列一致性百分比”、“实质上一致性”以及“一致”，并且相对于一个界定的最小数目的核苷酸或氨基酸残基或优选地在全长内定义。术语“序列一致性”与“一致性”在此可互换使用以指代在一个比较窗口内，在核苷酸与核苷酸的基础上或在氨基酸与氨基酸的基础上序列一致的程度。因此，一个“序列一致性百分比”是通过以下方式计算的：在该比较窗口内比较两个经最佳对齐的序列，测定在这两个序列中出现一致的核酸碱基(例如A、T、C、G、U)或一致的氨基酸残基(例如Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys以及Met)的位置的数目，从而得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以该比较窗口中的位置的总数目(即，窗口大小))，并且将该结果乘以100，得到序列一致性百分比。
一种聚核苷酸的一致性％可以通过GAP(尼德曼和温施，1970)分析法(GCG程序)测定，其中一个空位产生罚分＝5，并且一个空位延长罚分＝0.3。除非另有说明，否则查询序列长为至少45个核苷酸，并且GAP分析法在至少45个核苷酸的一个区域上比对这两个序列。优选地，查询序列长为至少150个核苷酸，并且GAP分析法在至少150个核苷酸的一个区域上比对这两个序列。更优选地，查询序列长为至少300个核苷酸，并且GAP分析法在每一情况下在至少300个核苷酸、或至少400、500或600个核苷酸的一个区域上比对这两个序列。还可以参考如例如由阿特休尔(Altschul)等人，1997所披露的BLAST程序家族。序列分析的一个详细的论述可以见于奥苏伯尔(Ausubel)等人，1994-1998，第15章的第19.3单元。
当核苷酸或氨基酸序列具有至少约95％、特别地至少约98％、更特别地至少约98.5％、十分特别地约99％、尤其约99.5％、更尤其约100％的序列一致性、十分尤其地是一致时，这些序列被指示为“基本上相似”。很明显，当RNA序列被描述为与DNA序列基本上相似、或具有一定程度的序列一致性时，DNA序列中的胸腺嘧啶(T)被视为相当于RNA序列中的尿嘧啶(U)。
关于这些所定义的聚核苷酸，应了解高于以上提供的那些一致性％数值的一致性％数值将包涵优选实施例。因此，当可适用时，根据最低一致性％数值，优选的是该聚核苷酸包含与相关指定的SEQIDNO至少75％、更优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、更优选地至少93％、更优选地至少94％、更优选地至少95％、更优选地至少96％、更优选地至少97％、更优选地至少98％、更优选地至少99％、更优选地至少99.1％、更优选地至少99.2％、更优选地至少99.3％、更优选地至少99.4％、更优选地至少99.5％、更优选地至少99.6％、更优选地至少99.7％、更优选地至少99.8％、并且甚至更优选地至少99.9％一致的一个聚核苷酸序列。
在一些实施例中，本发明涉及杂交条件的严格度以界定两个聚核苷酸的互补程度。如在此所使用的“严格度”是指在杂交过程中的温度和离子强度条件、以及存在或不存在某些有机溶剂。严格度越高，一个靶核苷酸序列与经标记的聚核苷酸序列之间的互补程度将越高。“严格条件”是指使仅具有一个高频率的互补碱基的核苷酸序列杂交的温度和离子条件。如在此所使用，术语“在低严格度、中等严格度、高严格度、或极高严格度条件下杂交”描述了用于杂交和洗涤的条件。针对执行杂交反应的指导可以见于通过引用结合在此的分子生物学实验指南(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，纽约的约翰威利父子出版公司(JohnWileyandSons，N.Y.)(1989)，6.3.1-6.3.6。在此所提及的特定杂交条件如下：1)低严格度杂交条件为在约45℃下，在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，随后在50℃-55℃下，在0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤两次；2)中等严格度杂交条件为在约45℃下，在6×SSC中，随后在60℃下，在0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次；3)高严格度杂交条件为在约45℃下，在6×SSC中，随后在65℃下，在0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次；以及4)极高严格度杂交条件为在65℃下，0.5M磷酸钠、7％SDS，随后在65℃下在0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次。
如在此所使用，一种“嵌合基因”或“基因构建体”是指在其天然位置中并非一种天然基因的任何基因，即，它已被人为操作过，包括整合于小麦基因组中的一种嵌合基因或基因构建体。典型地，一种嵌合基因或基因构建体包含在自然界中未共同发现的调节和转录或蛋白编码序列。因此，一种嵌合基因或基因构建体可以包含从不同来源获得的调节序列和编码序列、或从相同来源获得的但以与自然界中发现的方式不同的一种方式排列的调节序列和编码序列。术语“内源性”在此用于指代在一种未被修饰的植株中在与处于研究中的植株(优选地一种小麦植株)相同的发育阶段通常产生的一种物质，如淀粉或一种SBEIIa或SBEIIb。一种“内源性基因”是指在一种生物体的基因组中处于其天然位置中的一种天然基因，优选地是一种小麦植株中的一种SBEIIa或SBEIIb基因。如在此所使用，“重组核酸分子”是指已通过重组DNA技术构建或修饰的一种核酸分子。术语“外来聚核苷酸”或“外源性聚核苷酸”或“异源聚核苷酸”等是指通过实验操作而引入一种细胞的基因组(优选地为小麦基因组)中，但并不天然存在于该细胞中的任何核酸。这些包括在该细胞中发现的基因序列的经修饰的形式，只要该引入的基因相对于天然存在的基因包含一些修饰，例如一个引入的突变或存在一个可选择的标志物基因即可。外来或外源性基因可以是插入一种非天然生物体中的在自然界中发现的基因、引入天然宿主内的一个新的位置中的天然基因、或嵌合基因或基因构建体。一种“转基因”是已通过一种转化程序引入基因组中的一种基因。术语“以遗传方式修饰”包括将基因引入细胞中、使细胞中的基因突变以及对已进行这些动作的一种细胞或生物体或它们的子代中的一种基因的调节进行改变或调制。
本发明涉及可操作地连接(connect或link)的元件。“可操作地连接(operablyconnected)”或“可操作地连接(operablylinked)”等是指处于一种功能关系中的多种聚核苷酸元件的一种连接。典型地，可操作地连接的核酸序列邻接地连接，并且在需要时连接两个蛋白编码区，使它们邻接的并且处于阅读框中。当RNA聚合酶将两个编码序列转录成单一RNA时，一个编码序列“可操作地连接于”另一个编码序列，该单一RNA如果被翻译，那么它接着会被翻译成具有多个来源于这两个编码序列的氨基酸的单一多肽。这些编码序列不必彼此邻接，只要所表达的序列经最终加工从而产生所希望的蛋白即可。
如在此所使用，术语“顺式作用序列”、“顺式作用元件”或“顺式调节区”或“调节区”或类似术语应用于意指对基因序列的表达进行调节的任何核苷酸序列。此序列可以是在其天然环境中的一种天然存在的顺式作用序列，例如调节一种小麦SBEIIa或SBEIIb基因；或在一种基因构建体中的一种序列，当相对于一种可表达的基因序列适当地置放时，它调节该基因序列的表达。这类顺式调节区可以能够在转录或转录后水平激活、沉默、增强、抑制或以其他方式改变一种基因序列的表达水平和/或细胞类型特异性和/或发育特异性。在本发明的优选实施例中，顺式作用序列是一种激活子序列，它会增强或刺激一种可表达的基因序列的表达，如一种启动子。已展示了基因的5′-前导子(UTR)中一种内含子的存在使单子叶植物(如小麦)中的基因的表达增强(田中(Tanaka)等人，1990)。顺式作用序列的另一个类型为一种基质附着区(MAR)，它可能通过将活性染色质域锚定于核基质来影响基因表达。
将一种启动子或增强子元件“可操作地连接”于一种可转录的聚核苷酸意指将该可转录的聚核苷酸(例如编码蛋白的聚核苷酸或其他转录物)放于一种启动子的调节控制之下，该启动子接着控制该聚核苷酸的转录。在异源启动子/结构基因组合的构建中，总体上优选的是将一种启动子或其变异体置放于距可转录的聚核苷酸的转录起始位点一定距离处，该距离和该启动子与它在其天然环境中所控制的基因(即，该启动子所来源的基因)之间的距离大致相同。如本领域中已知，在此距离中可以容纳一些变异而无功能的损失。
本发明利用载体用于嵌合基因或基因构建体的制造、操作或转移。“载体”意指一种核酸分子，优选地一种DNA分子，它源自例如可以插入一种核酸序列的一种质粒、噬菌体或植物病毒。一种载体优选地包含一个或多个独特的限制性位点，并且可以能够在一种界定的宿主细胞(包括一种靶细胞或组织或一种祖细胞或其组织)中自主复制，或者可整合到该界定的宿主的基因组中使得克隆的序列可再生。因此，该载体可以是一种自主复制载体，即，以一种染色体外实体形式存在的一种载体，该载体的复制与染色体复制无关，例如一种线性或闭合环状质粒、一种染色体外元件、一种微型染色体、或一种人造染色体。该载体可以包含任何构件以确保自我复制。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入一种细胞中时整合到该受体细胞的基因组中并且与已整合了它的一个或多个染色体一起复制。一种载体系统可以包括单一载体或质粒、两个或更多个载体或质粒(这类载体或质粒共同包含了有待引入宿主细胞的基因组中的全部DNA)、或一个转座子。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的该细胞的相容性。该载体还可以包含一种选择标志物，如可以用于选择适合的转化体的一种抗生素抗性基因、或使原核生物或真核生物(尤其是小麦)细胞的转化增强的序列(如T-DNA或P-DNA序列)。这些抗性基因和序列的实例为本领域普通技术人员所熟知。
“标志物基因”意指将一种独特的表型赋予会表达该标志物基因的细胞，并且由此使这些经转化的细胞区别于不具有该标志物的细胞的一种基因。一种“可选择的标志物基因”赋予一种性状，基于对一种选择剂(例如一种除草剂、抗生素、辐射、热、或者会对未转化的细胞造成损伤的其他处理)的抗性或基于在一种可代谢的底物存在下的一种生长优势，可以针对该性状进行‘选择’。一种可筛选的标志物基因(或报告基因)赋予一种通过观察或测试，即，通过‘筛选’，可以鉴别的性状(例如β-葡萄糖醛酸酶、荧光素酶、GFP或未转化的细胞中不存在的其他酶活性)。标志物基因与所关注的核苷酸序列不必连锁。
细菌可选择的标志物的实例为赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、卡那霉素、红霉素、氯霉素或四环素抗性)的标志物。用于选择植株转化体的示例性的可选择的标志物包括(但不限于)：一种hyg基因，它赋予潮霉素B抗性；一种新霉素磷酸转移酶(npt)基因，它赋予对卡那霉素、巴龙霉素、G418等的抗性，如例如由波特里库斯(Potrykus)等人，1985所描述；一种谷胱甘肽-S-转移酶基因，它来自大鼠肝脏，赋予对谷胱甘肽衍生的除草剂的抗性，如例如EP-A-256223中所描述；一种谷氨酰胺合成酶基因，它在过度表达后赋予对谷氨酰胺合成酶抑制剂(如草丁膦)的抗性，如例如WO87/05327所描述；一种乙酰基转移酶基因，它来自绿色产色链霉菌，赋予对选择剂草丁膦的抗性，如例如EP-A-275957中所描述；一种编码一种5-烯醇莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的基因，它赋予对N-膦酰甲基甘氨酸的耐受性，如例如由欣奇(Hinchee)等人，1988所描述；一种bar基因，它赋予针对双丙氨磷的抗性，如例如WO91/02071中所描述；一种腈水解酶基因，如来自臭鼻克雷伯氏菌的bxn，它赋予对溴苯腈的抗性(斯托克(Stalker)等人，1988)；一种二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，它赋予对甲氨蝶呤的抗性(蒂耶(Thillet)等人，1988)；一种突变的乙酰乳酸合酶基因(ALS)，它赋予对咪唑啉酮、磺酰脲或其他ALS抑制性化学品的抗性(EP-A-154204)；一种突变的邻氨基苯甲酸盐合酶基因，它赋予对5-甲基色氨酸的抗性；或一种茅草枯脱卤素酶基因，它赋予对除草剂的抗性。
优选的可筛选的标志物包括(但不限于)：一种uidA基因，它编码一种已知不同发色底物的β-葡萄糖醛酸酶(GUS)酶；一种β-半乳糖苷酶基因，它编码一种已知发色底物的酶；一种水母发光蛋白基因(普拉舍(Prasher)等人，1985)，它可以用于钙敏感性生物发光检测；一种绿色荧光蛋白基因(GFP，尼茨(Niedz)等人，1995)或其变异体之一；一种荧光素酶(luc)基因(奥(Ow)等人，1986)，它允许生物发光检测；以及本领域中已知的其他标志物。
在一些实施例中，内源性淀粉分支活性或其他酶活性的水平通过减少小麦植株中编码与这些活性有关的蛋白的基因的表达水平，或增加一种小麦植株中为该酶编码的一种核苷酸序列的表达水平来调制。增加表达可以在转录水平通过使用不同强度的启动子或可诱导的启动子来实现，这些启动子能够控制从编码序列表达的转录物的水平。可以引入多种异源序列，这些异源序列对调制或增强产物使淀粉分支化下调的多种基因的表达的转录因子进行编码。基因的表达水平可以通过改变一种构建体每个细胞的拷贝数来调制，该构建体包含了该编码序列和一种转录控制元件，该转录控制元件可操作地连接于该编码序列并且在细胞中是功能性的。可替代地，可以选择多个转化体，并且针对具有由在转基因整合位点附近的内源性序列的影响所引起的一个有利水平和/或特异性的转基因表达的那些转化体进行筛选。一个有利水平和模式的转基因表达是会引起小麦植株中的淀粉合成或直链淀粉含量实质上增加的转基因表达。这可以通过转化体的简单测试来检测。减少基因表达可以通过被引入小麦植株中的一种“基因沉默嵌合基因”的引入和转录来实现。该基因沉默嵌合基因优选地被稳定地引入小麦基因组、优选地小麦核基因组中。如在此所使用的“基因沉默作用”是指一种小麦细胞、优选地一种胚乳细胞中的一种靶核酸的表达的减少，这可以通过一种沉默RNA的引入来实现。在一个优选实施例中，引入一种基因沉默嵌合基因，它编码使一种或多种内源性基因、优选地SBEIIa和/或SBEIIb基因的表达减少的一种RNA分子。小麦中的靶基因还包括表1中列出的基因。该减少可以是转录减少(包括通过染色质重塑的甲基化)、或RNA分子的转录后修饰减少(包括通过RNA降解)或这两项的结果。基因沉默应不必解释为靶核酸或基因的一个消除。靶核酸在沉默RNA存在的情况下的表达水平比它不存在的情况下更低就足够了。靶基因的表达水平可以减少至少约40％、或至少约45％、或至少约50％、或至少约55％、或至少约60％、或至少约65％、或至少约70％、或至少约75％、或至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％，或有效地消除到一个不可检测的水平。
反义技术可以用于使小麦细胞中的基因表达减少。术语“反义RNA”应用于意指一种RNA分子，它与一种特定mRNA分子的至少一部分互补，并且能够使编码该mRNA的基因、优选地一种SBEIIa和/或SBEIIb基因的表达减少。该减少典型地以一种序列依赖性方式发生，并且被认为是通过干扰一种转录后事件(如mRNA从细胞核转运到细胞质、mRNA稳定性或翻译的抑制)发生的。反义方法的使用为本领域中所熟知的(参见例如哈特曼(Hartmann)和恩德雷斯(Endres)，1999)。反义方法现在是一种公认的用于对植株中的基因表达进行操作的技术。
反义分子典型地包含与一种靶基因的转录区域的一部分相对应的序列或对该基因表达或剪接事件实现控制的序列。举例来说，反义序列可以对应于本发明的基因的靶向蛋白编码区、或5′-非翻译区(UTR)或3′-UTR或这些的组合，优选地仅对应于靶基因的外显子序列。鉴于这些UTR的相关基因之间在总体上更大的发散性，靶向这些区域提供了基因抑制的更大特异性。反义序列的长度应是至少19个邻接的核苷酸、优选地至少50个核苷酸、并且更优选地至少100、200、500或1000个核苷酸、到有待抑制的基因的全长的一个最大值。可以使用与整个基因转录物互补的全长序列。该长度最优选地是100-2000个核苷酸。反义序列与靶向转录物的一致性程度应为至少90％、并且更优选地95％-100％。反义RNA分子当然可以包含无关序列，这些无关序列可以起到使分子稳定的作用。
表达一种反义RNA的基因构建体可以通过将一种启动子序列与靶基因的一个区域以一种“反义”取向连接而容易地制得，如在此所使用的“反义”取向是指相对于植物细胞中的靶基因中的序列的转录和翻译(如果它发生)的取向相反的取向。优选地，通过使用一种胚乳特异性启动子，使反义RNA优选地在一种小麦植株的胚乳中表达。
术语“核酶”是指特异性地识别一种独特底物RNA并且催化其裂解的一种RNA分子。典型地，核酶包含了用于一种靶核酸的特异性识别的一种反义序列、和在此被称为“催化域”的一个酶区。特别适用于本发明的核酶的类型是锤头状核酶(哈泽洛夫(Haseloff)和格拉赫(Gerlach)，1988；佩里曼(Perriman)等人，1992)和发夹状核酶(希皮(Shippy)等人，1999)。
如在此所使用，“人为引入的dsRNA分子”是指优选地在小麦细胞中通过从编码该dsRNA分子的一种嵌合基因转录而合成的双链RNA(dsRNA)分子的引入。RNA干扰(RNAi)特别适用于特异性地减少一种基因的表达或抑制一种特定蛋白的产生(同样在小麦中)(瑞加娜等人，2006)。此项技术依赖于dsRNA分子的存在，这些dsRNA分子包含了与所关注的基因的mRNA或其一部分基本上一致的一种序列和其互补序列，由此形成一种dsRNA。方便地，该dsRNA可以从宿主细胞中的单一启动子产生，其中正义和反义序列被转录而产生一种发夹RNA，在该发夹RNA中，正义和反义序列杂交而形成该dsRNA区，并且一种(与一种SBEII基因)相关或无关的序列形成一种环结构，因此该发夹RNA包含一种茎-环结构。适用于本发明的dsRNA分子的设计和制造完全在一名本领域普通技术人员的能力之内，尤其考虑特豪斯(Waterhouse)等人，1998；史密斯(Smith)等人，2000；WO99/32619；WO99/53050；WO99/49029；以及WO01/34815。
编码dsRNA的DNA典型地包含以一种反向重复形式排列的正义和反义两种序列。在一个优选实施例中，该正义和反义序列通过一个间隔区分开，该间隔区包含一个内含子，该内含子在转录成RNA时被剪除。已展示出此排列使基因沉默的效率更高(史密斯等人，2000)。该双链区可以包含从一个或两个DNA区转录而来的一种或两种RNA分子。该dsRNA可以被归类为长hpRNA，具有可以大部分互补，但不必完全互补的长的正义和反义区(典型地大于约200bp，范围在200-1000bp之间。hpRNA也可以相当小，其中双链部分的大小在从约30到约42bp的范围内，但不会长于94bp(参见WO04/073390)。该双链RNA区的存在被认为是触发了来自一种内源性植物系统的一种反应，该反应会破坏来自靶植株基因的双链RNA以及同源RNA转录物，有效地降低或消除该靶基因的活性。
会杂交的正义和反义序列的长度应各自是至少19个邻接的核苷酸、优选地至少30或50个核苷酸、并且更优选地至少100、200、500或1000个核苷酸。可以使用与整个基因转录物相对应的全长序列。长度最优选地是100-2000个核苷酸。正义和反义序列与靶向转录物的一致性程度应为至少85％、优选地至少90％并且更优选地95％-100％。序列越长，对于总体序列一致性的要求越不严格。该RNA分子当然可以包含无关序列，这些无关序列可以起到使分子稳定的作用。用于表达dsRNA形成构建体的启动子可以是在表达该靶基因的细胞中表达的任何类型的启动子。当该靶基因是在胚乳中选择性地表达的SBEIIa或SBEIIb或其他基因时，一种胚乳启动子是优选的，以便不影响其他组织中的该或这些靶基因的表达。
可以用于下调一种或多种SBEII基因的dsRNA分子的实例提供于实例4中。
其他沉默RNA可以是“未经聚腺苷酸化的RNA”，它包含至少20个连续的核苷酸，这些核苷酸具有与该靶基因的一种RNA转录物的一种核苷酸序列的互补序列至少95％序列一致性，如WO01/12824或US6423885中所描述。沉默RNA的又另一个类型是如WO03/076619(通过引用结合在此)中所描述的一种RNA分子，它包含了具有与该靶核酸的序列或其互补序列至少95％序列一致性的至少20个连续的核苷酸，并且进一步包含一个大部分双链区，如WO03/076619中所描述。
如在此所使用，“沉默RNA”是具有与从该靶基因(优选地为SBEIIa或SBEIIb)转录的mRNA的一个区域互补的21到24个邻接的核苷酸的RNA分子。这21到24个核苷酸的序列优选地与该mRNA的21到24个邻接的核苷酸的一个序列完全互补，即，与该mRNA的该区域的这21到24个核苷酸的互补序列一致。然而，还可以使用在该mRNA的区域中具有至多五个错配的miRNA序列(帕拉特尼克(Palatnik)等人，2003)，并且碱基配对可能涉及一个或两个G-U碱基对。当该沉默RNA的这21到24个核苷酸中不是所有都能够与该mRNA进行碱基配对时，优选的是在该沉默RNA的这21到24个核苷酸与该mRNA的该区域之间存在仅一个或两个错配。就miRNA来说，优选的是向着该miRNA的3′末端发现任何错配，至多五个的最大值。在一个优选实施例中，在该沉默RNA与其靶mRNA的序列之间不超过一个或两个错配。
这些沉默RNA来源于由本发明的这些嵌合DNA编码的多个更长的RNA分子。这些更长的RNA分子(在此也称为“前体RNA”)是通过从小麦细胞中的这些嵌合DNA转录而产生的最初产物，并且具有通过互补区域之间的分子内碱基配对而形成的部分双链特性。这些前体RNA由一个特殊类别的核糖核酸酶(通常被称为“一种或多种切片机”)加工成典型地长为21到24个核苷酸的沉默RNA。如在此所使用的这些沉默RNA包括多种短干扰RNA(siRNA)与多种微RNA(miRNA)，它们在其生物合成方面不同。这些siRNA来源于多种完全或部分双链RNA，这些完全或部分双链RNA具有至少21个邻接的碱基对，包括可能的G-U碱基对，并且无错配或从该双链区凸出的未经碱基配对的核苷酸。这些双链RNA是由以下形成的：单一的自身互补转录物，它通过在自身上向后折叠并且形成一种茎-环结构而形成，在此被称为一种“发夹RNA”；或两个分离的RNA，这两个分离的RNA至少部分地互补并且杂交而形成一个双链RNA区。这些miRNA通过对多个更长的单链转录物进行加工而产生，这些转录物包含了并非完全互补的互补区域并且因此形成一种不完全地碱基配对的结构，因此在该部分双链结构内具有错配或未经碱基配对的核苷酸。该碱基配对的结构还可以包括G-U碱基对。为了形成多个miRNA而加工多个前体RNA引起了具有一种特定序列的一种独特的小型RNA(miRNA)的优选累积。它来源于该前体RNA的一条链，典型地为该前体RNA的“反义”链，然而为了形成多个siRNA而加工长的互补前体RNA产生了多个siRNA的一个群体，这些siRNA的序列并不均一，但对应于该前体的许多部分并且来自该前体的两条链。
miRNA首次是呈一种小型调节性RNA的形式被发现的，该RNA对秀丽隐杆线虫中的lin-4基因进行控制(李(Lee)等人，1993)。从那以后，已报导了与动物和植物中的基因功能的调节有关的大量其他天然存在的miRNA。本发明的这些miRNA前体RNA(在此也被称为“人造miRNA前体”)典型地通过改变天然存在的前体的miRNA部分的核苷酸序列使得它与靶mRNA的21到24个核苷酸区域互补、优选地完全互补，并且改变与该miRNA序列形成碱基配对的miRNA前体的互补区域的核苷酸序列以维持碱基配对，从天然存在的miRNA前体中获得。miRNA前体RNA的剩余部分可以未被改变，并且因此具有与天然存在的miRNA前体相同的序列，或者它还可以通过核苷酸取代、核苷酸插入、或优选地核苷酸缺失、或其任何组合而在序列中发生改变。miRNA前体RNA的剩余部分被认为与被称为切片机样1(DCL1)的切片机酶对结构的识别有关，并且因此优选的是如果对该结构的剩余部分作出任何改变则要很少。举例来说，在不对总体结构产生重大改变下碱基配对的核苷酸可以由其他碱基配对的核苷酸取代。本发明的人造miRNA前体所来源的天然存在的miRNA前体可以是来自小麦、另一种植物(如另一种谷类植物)、或来自非植物来源。这类前体RNA的实例是稻米mi395前体、拟南芥mi159b前体、或mi172前体。
已在多种植物中示范了这些人造miRNA，例如阿尔瓦雷斯(Alvarez)等人，2006；帕里索托(Parizotto)等人，2004；施瓦布(Schwab)等人，2006。
可以使用的另一种分子生物学方法是共抑制。共抑制的机制尚未被完全了解，但被认为与转录后基因沉默(PTGS)有关，并且在那一点上，可能与反义抑制的许多实例极其类似。共抑制涉及了将一个基因或其一个片段的一个额外拷贝相对于一个启动子以“正义取向”引入一个植株中以用于其表达，如在此所使用的“正义取向”是指相对于靶基因中的序列与该序列的转录和翻译(如果它发生)相同的取向。正义片段的大小、它与靶基因区域的对应性以及它与靶基因的同源性程度如同针对以上描述的反义序列一般。在一些情况下，该基因序列的该额外拷贝会干扰该靶植株基因的表达。关于实施共抑制方法的方法，参考专利说明书WO97/20936和欧洲专利说明书0465572。反义、共抑制或双链RNA分子还可以包含一个大部分双链RNA区域，优选地包含一个核定位信号，如WO03/076619中所描述。
用于减少基因表达的这些技术中的任一种都可以用于以协作的方式降低多个基因的活性。举例来说，可以针对相关基因的一个家族，通过靶向这些基因所共有的一个区域而靶向一个RNA分子。可替代地，可以通过在一个RNA分子中包含多个区域，每一区域靶向一个不同的基因，来靶向多种无关的基因。这可以通过在单一启动子的控制下使这多个区域融合来容易地进行。
本领域中工作人员所熟知的许多技术可用于将核酸分子引入一种小麦细胞中。如在此所使用的术语“转化”意指通过引入一种外来或外源性核酸而使一种细胞(例如一种细菌或一种植株，尤其一种小麦植株)的基因型改变。“转化体”意指进行如此改变的一种生物体。转化中并不包括通过使多个亲本植株杂交或通过诱变本身来将DNA引入一种小麦植株中。如在此所使用的术语“转基因”是指一种进行基因修饰的植株，在该植株中，内源性基因组通过一种引入的外来或外源性基因或序列的随机或定点整合、或者呈一种可复制的非整合的形式进行稳定维持而得到补充或修饰。“转基因”意指被引入一种植株中的一种外来或外源性基因或序列。核酸分子可以作为一种染色体外元件被复制，或者优选地稳定地整合于该植株的基因组中。“基因组”意指细胞、植株或植株部分的全部遗传的基因组，并且包括染色体DNA、质体DNA、线粒体DNA以及染色体外DNA分子。在一个实施例中，一个转基因被整合于小麦核基因组中，在六倍体小麦中，该小麦核基因组包含A、B以及D亚基因组(在此被称为A、B以及D“基因组”)。
制造能育的转基因的小麦植株的最常用方法包括两个步骤：将DNA递送到可再生的小麦细胞中以及通过体外组织培养的植株再生。两种方法通常用于递送DNA：使用根癌土壤杆菌或相关细菌的T-DNA转移，以及通过粒子轰击的DNA的直接引入，不过其他方法也已用于将DNA序列整合到小麦或其他谷物中。技术人员将清楚，将一种核酸构建体引入植物细胞中的一种转化系统的特别选择并不是本发明的根本或者一个限制，只要它实现一个可接受水平的核酸转移。用于小麦的这些技术为本领域中所熟知的。
转化的小麦植株可以通过以下方式制造：将根据本发明的一种核酸构建体引入一种受体细胞中，并且使包含并且表达根据本发明的一种聚核苷酸的一种新的植株生长。从处于细胞培养中的一种转化的细胞生长出一种新的植株的过程在此被称为“再生”。可再生的小麦细胞包括成熟胚、分生组织(如叶基的叶肉细胞)、或优选地来自开花后12-20天获得的不成熟胚的盾片、或来源于这些中的任一项的愈伤组织的细胞。回收所再生的小麦植株的最常用的途径是使用如补充有一种生长素(如2，4-D)和低水平的细胞分裂素的MS-琼脂的培养基的体细胞胚胎发生，参见斯帕克斯(Sparks)和琼斯(Jones)，2004)。
小麦的土壤杆菌属介导的转化可以通过郑(Cheng)等人，1997；维尔(Weir)等人，2001；坎纳(Kanna)和达加尔(Daggard)，2003或吴(Wu)等人，2003的方法执行。任何具有足够毒性的土壤杆菌属菌株都可以使用，优选地是具有额外毒性基因功能的菌株，如LBA4404、AGL0或AGL1(拉佐(Lazo)等人，1991)或C58的多种型式。还可以使用与土壤杆菌属相关的细菌。从土壤杆菌属转移到受体小麦细胞的DNA(T-DNA)被包含在一种基因构建体(嵌合质粒)中，该基因构建体包含与有待转移的核酸侧接的一种野生型Ti质粒的一个T-DNA区域的一个或两个边界区域。该基因构建体可以包含两个或更多个T-DNA，例如其中一个T-DNA包含所关注的基因并且一个第二T-DNA包含一个可选择的标志物基因，这提供了两个T-DNA的独立插入以及可选择的标志物基因远离所关注的转基因的可能的分离。
可以使用任何可再生的小麦类型；已成功地报导了品种鲍勃怀特(BobWhite)、费尔德(Fielder)、维尔瑞-5(Veery-5)、克丹泽(Cadenza)以及佛罗里达(Florida)。在这些更容易可再生的品种中的一种中的转化事件可以通过标准回交而转移到任何其他小麦栽培品种(包括优良品种)中。使用土壤杆菌属的一种替代方法利用了一种体内接种方法继而使用组织培养对转化的植株进行再生和选择，并且已被证明是有效的，参见WO00/63398。涉及到使用土壤杆菌属的其他方法包括：将土壤杆菌属与培养的分离的原生质体共培养；用土壤杆菌属转化种子、顶端或分生组织；或原位接种，如用于拟南芥的浸花法，如贝克托尔德(Bechtold)等人，1993所描述。此后面的方法是基于一份土壤杆菌属细胞的悬浮液的真空渗入。可替代地，嵌合构建体可以使用土壤杆菌属的根诱导性(Ri)质粒作为载体来引入。
通常用于将核酸构建体引入一种植物细胞中的另一种方法是利用小粒子的高速弹道渗透(也称为粒子轰击或微弹轰击)，其中有待引入的核酸包含在多个小珠粒或粒子的基质内、或在它们的表面上，如例如由克莱因(Klein)等人，1987所描述。此方法已适用于小麦(瓦西尔(Vasil)，1990)。可以依序使用诱发创伤的微弹轰击和与土壤杆菌属的共培养(EP-A-486233)。该基因构建体也可以通过电穿孔被引入植物细胞中，如例如弗罗姆(Fromm)等人，1985和岛本(Shimamoto)等人，1989所描述。可替代地，该核酸构建体可以通过使用机械或化学手段使细胞与核酸接触而引入一种小麦细胞(如一种花粉细胞)中。
供小麦转化中使用的优选的可选择的标志物基因包括吸水链霉菌bar基因或pat基因连同使用除草剂草铵膦选择、hpt基因连同抗生素潮霉素、或nptII基因与卡那霉素或G418。可替代地，可以使用阳性可选择的标志物，如编码磷酸甘露糖异构酶(PMI)的manA基因，其中糖甘露糖-6-磷酸作为单一的C来源。
本发明通过以下非限制性实例进一步描述。
实例1：方法和材料
碳水化合物测定和分析.使用瑞加娜等人，(2006)的方法从发育中的和成熟的这两种小麦籽粒中小规模地分离淀粉。根据瑞加娜等人，(2004)的方法进行大规模的淀粉提取。使用由麦格酶公司(爱尔兰共和国威克洛郡布雷(Bray，CoWicklow，RepublicofIreland))提供的总淀粉分析试剂盒测定淀粉含量，并且在重量的基础上计算为占成熟的未碾磨的籽粒重量的百分比。接着，将淀粉含量与对照植株比较。从总籽粒重量中减去淀粉重量，得到籽粒的一个总非淀粉含量，这确定了总重量的减小是否是由于淀粉含量的减小。
淀粉样品的直链淀粉含量是通过如下略作修改的莫里森(Morrison)和莱涅莱(Laignelet)(1983)比色(碘量滴定)方法测定的。精确称取约2mg(精确到0.1mg)淀粉到盖子中装备有一个橡胶垫圈的一个2ml螺旋盖试管中。为了去除脂质，将1ml85％(v/v)甲醇与淀粉混合，并且将试管在一个65℃水浴中加热1小时，伴以偶尔涡旋。在以13,000g离心5分钟之后，小心地去除上清液，并且重复这些提取步骤。接着，将淀粉在65℃下干燥1小时，并且溶解于尿素-二甲基亚砜溶液(UDMSO；9体积的二甲基亚砜与1体积的6M尿素)中，每2mg淀粉(如上称取)使用1mlUDMSO。立即剧烈地涡旋该混合物，并且在一个95℃水浴中孵育1小时，伴以间歇性涡旋，以达成淀粉的完全溶解。用20μl的I2-KI试剂处理淀粉-UDMSO溶液的一个等分试样(50μl)，该I2-KI试剂包含每毫升水2mg碘和20mg碘化钾。用水将混合物补足到1ml。通过将200μl转移到微量培养板中，并且使用一台EmaxPrecision微量培养板读取器(美国的分子装置公司(MolecularDevices，USA))读取吸光度来测量混合物在620nm下的吸光度。包含0到100％直链淀粉和100％到0支链淀粉的标准样品由马铃薯直链淀粉和玉米(或马铃薯)支链淀粉(西格玛公司(Sigma))制成，并且如测试样品般加以处理。使用从针对标准样品的吸光度获得的一个回归方程由吸光度值确定直链淀粉含量(直链淀粉百分比)。非脱支淀粉的直链淀粉/支链淀粉比率的分析还可以根据凯斯(Case)等人，(1998)进行，或者通过如由贝蒂和柯廷，(1996)描述的用于分离脱支的淀粉的使用90％DMSO的一种HPLC方法进行。
直链淀粉数据的统计分析是使用第8版用于Windows的Genstat(英国赫特福德郡的VSN国际有限公司(VSNInternationalLtd，Herts，UK))进行的。
淀粉中链长的分布是通过在使淀粉样品脱支之后，根据莫雷尔等人，(1998)，使用一种毛细管电泳单元进行荧光团辅助的碳水化合物电泳(FACE)来分析的。淀粉样品的糊化温度特征曲线是在一台Pyris1差示扫描热量计(美国康涅狄格州诺沃克的珀金埃尔默公司(PerkinElmer，NorwalkCT，USA))中测量的。淀粉溶液的粘度是在一台快速粘度分析仪(RVA，悉尼瓦利伍德的新港科学私人有限公司(NewportScientificPtyLtd，Warriewood，Sydney))上，例如使用如由贝蒂等人，(1997)报导的条件测量的。所测量的参数包括峰值粘度(最大热糊粘度)、保持强度、最终粘度和成糊温度。面粉或淀粉的膨胀体积是根据克尼克-罗斯(Konik-Rose)等人，(2001)的方法测定的。水的摄取是通过在将面粉或淀粉样品在界定温度下的水中混合之前和之后以及在糊化物质的收集之后对样品进行称取来测量的。
通过显微术分析淀粉颗粒形态。使用一台Leica-DMR复合显微镜在普通光和偏振光两种光下检查水中的精制淀粉颗粒悬浮液，从而测定淀粉颗粒形态。使用一台JoelJSM35C仪器执行扫描电子显微术。精制淀粉用金溅涂，并且在15kV下在室温下扫描。
β-葡聚醣水平是使用由麦格酶公司(爱尔兰共和国威克洛郡布雷)提供的试剂盒测定的。
胚乳中蛋白表达的分析.通过蛋白印迹程序分析胚乳中的SBEI、SBEIIa以及SBEIIb蛋白的特异性表达，尤其是这些蛋白的表达或累积的水平。从所有母体组织中切下胚乳，并且将约0.2mg的样品在600μl的50mMpH7.5的磷酸钾缓冲液(42mMK2HPO4和8mMKH2PO4)中均质化，该磷酸钾缓冲液包含5mMEDTA、20％甘油、5mMDTT以及1mMPefabloc。经研磨的样品以13,000g离心10分钟，并且将上清液等分并且冷冻在-80℃下直到使用。对于总蛋白估算，使用0.25mg/mlBSA标准品的0、20、40、60、80以及100μl等分试样建立一条BSA标准曲线。用蒸馏水将样品(3μl)补足到100μl，并且向每一份中加入1ml的CoomassiePlus蛋白试剂。5分钟后，使用来自标准曲线的零BSA样品作为空白，在595nm下读取吸光度，并且测定样品中的蛋白水平。使来自每一胚乳的包含20μg总蛋白的样品在包含0.34MTris-HCl(pH8.8)、丙烯酰胺(8.0％)、过硫酸铵(0.06％)以及TEMED(0.1％)的非变性聚丙烯酰胺凝胶上跑胶。在电泳之后，根据莫雷尔等人，1997将蛋白转移到一张硝化纤维素膜上，并且与SBEIIa、SBEIIb或SBEI特异性抗体发生免疫反应。针对小麦SBEIIa蛋白的抗血清(抗wBEIIa)使用一个具有成熟小麦SBEIIa的N端序列的氨基酸序列AASPGKVLVPDGESDDL(SEQIDNO：16)的合成肽产生(拉赫曼等人，2001)。针对小麦SBEIIb的抗血清(抗wBEIIb)以一种类似方式使用N端合成肽AGGPSGEVMI(SEQIDNO：17)产生(瑞加娜等人，(2005)。认为此肽代表了成熟SBEIIb肽的N端序列并且此外与大麦SBEIIb蛋白的N端一致(孙等人，1998)。针对小麦SBEI的一种多克隆抗体以一种类似方式使用N端合成肽VSAPRDYTMATAEDGV(SEQIDNO：18)合成(莫雷尔等人，1997)。这类抗血清是根据标准方法从用这些合成肽免疫的兔中获得的。
针对SBE的酶分析.检测所有三种同工型SBEI、SBEIIa以及SBEIIb的活性的分支酶的酶活性分析是基于西等人，2001的方法，略作修改。电泳后，将凝胶在50mM包含10％甘油的pH7.0的HEPES中洗涤两次，并且在室温下在由以下各项组成的反应混合物中孵育16小时：50mMpH7.4的HEPES、50mM葡萄糖-1-磷酸、2.5mMAMP、10％甘油、50U磷酸化酶、1mMDTT以及0.08％麦芽三糖。这些条带用0.2％(W/V)I2和2％KI的溶液显像。在这些电泳条件下分离SBEI、SBEIIa以及SBEIIb同工型特异性活性。这通过免疫印迹法使用抗SBEI、抗SBEIIa以及抗SBEIIb抗体证实。进行可测量每一条带的强度的使用TotalLab软件包(英国纽卡斯尔的非线性动力学有限公司(NonlinearDynamicsLtd，Neweastle，UK))的免疫印迹法的光密度分析，从而测定每一同工型的酶活性的水平。
淀粉分支酶(SBE)活性可以通过酶分析，例如通过磷酸化酶刺激分析来测量(博耶和普赖斯，1978)。此分析测量了SBE对葡萄糖-1-磷酸通过磷酸化酶A结合到甲醇不溶性聚合物(α-D-葡聚糖)中的刺激。SBE的特定同工型的活性可以在如瑞加娜等人，2004中所描述的单独的同工型的纯化之后通过这一分析测量。将总可溶蛋白提取物施加到用以上描述的提取缓冲液预平衡的一根3mlβ-环糊精(β-CD)亲和柱上。该柱是根据制造商的说明书通过使β-CD结合到环氧基活化的琼脂糖凝胶6B(瑞典乌普萨拉的安玛西亚生物科学公司(AmershamBiosciences，Uppsala，Sweden))上来制备的。结合的蛋白(包含多个SBE)使用1％β-CD的磷酸盐缓冲液洗脱并且接着针对缓冲液A(20mMpH8.0的磷酸盐缓冲液、1mMEDTA以及1mMDTT)透析。透析的样品经受了使用一根1mlMonoQ柱(安玛西亚法玛西亚公司(AmershamPharmacia))的阴离子交换色谱，该柱用缓冲液A预平衡。在未结合的蛋白洗脱之后，通过将缓冲液B(500mMpH8.0的磷酸盐缓冲液、1mMEDTA、1mMDTT)引入缓冲液A中来施加一个30分钟的线性梯度，从而洗脱这些结合的蛋白。
SBE活性也可以通过碘染色分析来测量，该碘染色分析测量了由葡聚糖聚合物的分支产生的一种葡聚糖-多碘络合物的吸光度的减小量。SBE活性也可以通过分支键分析加以分析，该分支键分析测量了在异淀粉酶消化之后还原末端从作为底物的减少的直链淀粉的产生(竹田等人，1993a)。优选地，该活性在不存在SBEI活性的情况下测量。SBE的同工型展示了不同的底物特异性，例如SBEI在分支直链淀粉中展现更高活性，而SBEIIa和SBEIIb在一种支链淀粉底物的情况下展示更高的分支率。这些同工型还可以基于所转移的葡聚糖链的长度加以区分。SBE蛋白还可以通过使用特异性抗体(如在此描述的那些)进行测量。优选地，在籽粒发育过程中在发育中的胚乳中测量SBEII活性。SBEII蛋白水平优选地通过免疫方法(如蛋白印迹分析法)在仍然存在蛋白的成熟籽粒中测量。
小麦植株的DNA分析.使用由斯泰西(Stacey)和艾萨克(Isaac)，(1994)描述的小量制备方法，在从1-2cm2的新鲜叶片材料提取的基因组DNA上进行转化的小麦植株或欲针对转基因的存在而测试的植株的PCR分析。测定发夹RNA构建体的存在的PCR分析使用了引物SBEIIa-正向：5′-CCCGCTGCTTTCGCTCATTTTG-3′(SEQIDNO：19)和SBEIIa-反向：5′-GACTACCGGAGCTCCCACCTTC-3′(SEQIDNO：20)，这些引物被设计用来扩增来自SBEIIa基因的一个片段(462bp)。反应条件如下：“热起动”(94℃，3分钟)，随后是30个循环的变性(95℃，30秒)，退火(55℃，30秒)，延伸(73℃，2分钟)，随后是在73℃下的1个循环(5分钟)。反应产物通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳加以分析。
Southern印迹杂交分析是在来自冻干的基本组织的一个更大规模(9ml)提取的DNA上进行的(斯泰西和艾萨克，1994)。将DNA样品调到0.2mg/ml，并且用如HindIII、EcoRI以及KpnI的限制酶消化。如由斯泰西和艾萨克，(1994)描述，进行限制酶消化、凝胶电泳以及真空印迹。根据麦克里里(McCreery)和海伦塔耶斯(Helentjaris)，(1994)的方法，通过PCR制造出包括ds-SBEII构建体的内含子3区的地高辛标记的探针。探针对Southern印迹的杂交以及利用化学发光的检测是根据麦克里里和海伦塔耶斯，(1994)的方法进行。
利用土壤杆菌属的小麦转化.用于小麦转化的基因构建体通过电穿孔引入了携带vir质粒pAL4404和pSB1的卸甲的根癌土壤杆菌的菌株LBA4404中，并且随后用奇霉素在培养基上进行选择。将转化的土壤杆菌属菌株在固化的YEP培养基上在27℃下孵育2天。接着，细菌被收集并且再悬浮于包含400mM乙酰丁香酮的TSIM1(具有100mg/l肌醇、10g/l葡萄糖、50mg/lpH5.5的MES缓冲剂的MS培养基)中，达到在650nm下2.4的光密度以用于小麦接种。
使小麦植株(品种NB1，从林肯郡罗思韦尔的尼克森种子有限公司(NickersonSeedsLtd，Rothwell，Lincs)获得的一种春小麦品种)在一个温室中在22℃/15℃白天/夜间温度下生长，其中补充光线以得到一个16小时白天。大约开花后14天收获分蘖(胚长约1mm)，从而包括50cm蘖茎。接着，从分蘖中去除掉除旗叶以外的所有叶片，清洁该旗叶以去除污染性真菌孢子。接着，小心地去除每一小穗的颖片以及来自前两个小花的外稃以使未成熟种子暴露。总体上，每一小穗中仅这两个种子裸露。沿着花序的整个长度进行此程序。接着，用70％IMS喷雾麦穗作一个简单的表面灭菌。
使用一个10μl汉密尔顿注射器(Hamiltonsyringe)将土壤杆菌属悬浮液(1μl)接种到大约在盾片：胚乳界面的位置处的未成熟种子中，以便所有暴露的种子都被接种。接着，将这些分蘖放于水中，用一个半透明塑料袋覆盖以防止种子脱水，并且在23℃下在一个照亮的孵育箱中放3天(16小时白天，45μEm-2s-1PAR)。共培养3天后，去除该接种的未成熟种子，并且依序用70％乙醇(30秒)和20％漂白剂(Domestos，20分钟)进行表面灭菌，随后在无菌蒸馏水中彻底洗涤。将不成熟胚在无菌条件下分离，并且放于W3培养基(补充有20g/l蔗糖和2mg/l2，4-D的MS，并且用6g/lI型琼脂糖固化，西格玛公司)上，并且加入150mg/l特美汀(Timentin)(W3T培养基)，并且盾片在最上面(每板20个胚)。将这些培养物放在25℃下光线中(16小时白天，80μEm-2s-1PAR)。在分离之后，对胚上胚轴的发育进行评估约5天，并且必要时去除该轴以改善愈伤组织产生。将这些胚在W3T上维持4周，其中在分离后2周转移到新鲜培养基中，并且针对胚胎发生能力进行评估。
在4周生长之后，从接种的胚获得的愈伤组织与从涂在W3T培养基上的未经接种的胚获得的对照愈伤组织极其相似。细菌的存在似乎并未使从接种的胚获得的愈伤组织的胚胎发生能力实质上减小。将胚胎发生的愈伤组织转移到具有2mg/l黄草灵或25mg/l遗传霉素和150mg/l特美汀的W3培养基(W32AT培养基)中。使愈伤组织在此培养基上维持另一个2周，并且然后将每一个愈伤组织划分成2mm大小的碎片并且再涂于W32AT上。从使用无双元载体构建体的LBA4404的接种物获得的对照胚并未在选择培养基上产生转化的愈伤组织。
另一个2周的培养后，针对胚胎发生的愈伤组织的发育对所有组织进行评估：将在选择起4周之后展示出持续发育信号的任何愈伤组织转移到再生培养基(具有40g/l麦芽糖和150mg/l特美汀的RMT-MS，pH5.8，用6g/l琼脂糖固化，西格玛公司1型)中。芽在此培养基上在4周内再生，并且然后转移到具有150mg/l特美汀的MS30中供芽伸长和生根。接着，将幼株转移到土壤混合物中，并且保持在一个雾化工作台上两周，并且最后转移到一个温室中。
在该方法中也可以使用如菌株AGL1的替代性土壤杆菌属菌株或如编码潮霉素抗性的基因的可选择的标志物。
实例2：使用四种发夹RNA构建体对小麦中的SBEIIA基因的抑制
制得四种发夹RNA(dsRNA)构建体以减少小麦的i)SBEIIa，或ii)SBEIIa、SBEIIb以及SBEI基因的表达。在每一个构建体中，将编码发夹RNA的DNA连接到以下各项：由一种小麦Dx5基因获得的一种高分子量麦谷蛋白(HMWG)启动子序列，从而得到该发夹RNA的胚乳特异性表达；和来自土壤杆菌属的胭脂碱合酶基因的一种转录终止子序列(nos3′)。此启动子提供了编码发夹RNA的合成基因的胚乳特异性表达。
hp5′-SBEIIa.这些结构中的第一种(被指定为hp5′-SBEIIa)的构建和使用描述于瑞加娜等人，(2006)中。hp5′-SBEIIa构建体包含了通过PCR从小麦SBEIIa基因(基因库登录号AF338431)扩增的1536bp的核苷酸序列。此序列包含：一个468bp序列，它包含了外显子1和2的全部以及外显子3的一部分(核苷酸位置1058到1336、1664到1761以及2038到2219(它包含了编码SBEIIa的粗山羊草cDNA(基因库登录号AF338431.1)的核苷酸位置1到578)与在任一侧上的EcoRI和KpnI限制性位点(片段1)；一个512bp序列，它由SBEIIa的外显子3和4的一部分以及内含子3的全部(核苷酸位置2220到2731)与在任一侧上的KpnI和SacI位点组成(片段2)；以及一个528bp片段，它由SBEIIa的完整的外显子1、2以及3(在AF338431中核苷酸位置1058到1336、1664到1761以及2038到2279，它包含了粗山羊草SBEIIacDNA(基因库登录号AF338431.1)的核苷酸位置1到638)与在任一侧上的BamHI和SacI位点组成(片段3)。片段1、2以及3接着接合，以便片段3的序列相对于片段1以反义取向接合到片段2上。这些发夹RNA构建体最初是在包含HMWG启动子序列和nos3′终止子的载体pDVO3000中产生的。
hpc-SBEIIa.被指定为hpc-SBEIIa的SBEIIa构建体包含了对应于SBEIIacDNA(基因库登录号AF338432.1)的核苷酸1255到1547的一个293个碱基对的DNA片段，它对应于SBEIIa基因的外显子12的一部分、外显子13和14以及外显子15的一部分。选择SBEIIa的此区域是因为它具有与SBEIIbcDNA的相应区域的核苷酸序列仅约81％的一致性，由此增加SBEIIa而非SBEIIb沉默的特异性的几率。
hp3′-SBEIIa.被指定为hp3′-SBEIIa的SBEIIa构建体包含了对应于SBEIIacDNA的核苷酸2305到2434的一个130个碱基对的DNA片段，对应于SBEIIa基因的外显子21的一部分、外显子22以及3′非翻译区(3′UTR)的一部分。
hp-combo.除了SBEIIa基因的多个部分以外，被指定为hp-combo的发夹RNA结构还包含了小麦SBEI基因的多个区域，并且包含了i)对应于来自SBEIIacDNA的核苷酸1756到2172的一个417个碱基对的序列，对应于外显子16的一部分、外显子17到19、以及外显子20的一部分；和ii)对应于一种SBEIcDNA(基因库登录号AF076679)的核苷酸267到623的一个357个碱基对的序列，对应于SBEI基因的外显子3的一部分、外显子4、以及外显子5的一部分。SBEIIa基因片段具有与SBEIIb基因的相应区域约86％的一致性，包含数个具有23个连续核苷酸的区域，这些区域具有与它们SBEIIb的相应区域100％的一致性，并且因此设计该组合构建体，并且预期它将减少小麦中编码SBEIIb的基因以及编码SBEIIa和SBEI的基因的表达。
将以上描述的片段中的每一项的两个拷贝插入一个适合的载体中，一个在正义方向上而另一个在反义方向上，使得在这两个拷贝之间存在一个稻米微管蛋白基因内含子。将该合成基因插入一个双元载体中并且用于对小麦进行转化。
这些构建体用于对如实例1中所描述的小麦进行转化。对于对应的结构建体呈PCR阳性的独立的小麦转基因株系的数目如下：hp5′-SBEIIa，27；hpc-SBEIIa，10；hp3′-SBEIIa，10；以及hp-combo，63。
转基因植株的分析：DNA分析.使用由斯泰西和艾萨克，(1994)描述的小量制备方法，使用从1-2cm2的新鲜叶片材料提取的基因组DNA来进行PCR分析，从而检测这些再生的植株中的一种或多种转基因。针对用hp5′-SBEIIa转基因转化的植株，例如使用引物SBEIIa-正向：5′-CCCGCTGCTTTCGCTCATTTTG-3′(SEQIDNO：19)和SBEIIa-反向：5′-GACTACCGGAGCTCCCACCTTC-3′(SEQIDNO：20)，进行PCR反应。这些PCR反应被设计用来扩增从自SBEIIa基因的一个约462bp的片段。反应条件如下：“热起动”(94℃，3分钟)，随后是30个循环的变性(95℃，30秒)，退火(55℃，30秒)和延伸(73℃，2分钟)，随后是在73℃下的1个循环(5分钟)。
淀粉颗粒形态.通过光学显微术观察来自从T0转化的小麦植株获得的成熟T1种子的淀粉颗粒的形态。分析来自25个T0hp5′-SBEIIa植株中的每一个的十颗单独的籽粒。将每一个胚乳轻轻地捣碎以释放淀粉颗粒，将这些淀粉颗粒分散于水中并且在一台光学显微镜下观测。在所分析的25个株系中，12个具有颗粒变形的籽粒，不过目视观察揭露了不同种子中不同的变形水平。针对淀粉颗粒的形态改变，以类似的方式分析来自用hpc-SBEIIa、hp3′-SBEIIa以及hp-combo转基因转化的植株中的每一株的九个种子。在此情况下，分析半种子，以便每一个剩余的半种子都可以生长成一个T1植株，由此维持每一株系。63个hp-combo株系中的五十五个具有颗粒形态改变的种子，其中变形的水平不同。十个hp5′-SBEIIa株系中的所有都具有淀粉颗粒形态改变的种子，同样其中变形的水平不同。在任何SBEIIa3′株系中都未观察到显著的淀粉颗粒形态改变。变形的淀粉颗粒是胚乳的淀粉中直链淀粉水平升高的一项指标，对于高度变形的淀粉颗粒，典型地高于50％直链淀粉、或高于70％直链淀粉。这指示了针对有效沉默构建体中的每一种，观察到表型程度的一个范围。
在发育中的胚乳中利用蛋白印迹法的蛋白表达.对应地便用抗SBEIIa和抗SBEIIb抗体，通过蛋白印迹法，针对SBEIIa和SBEIIb蛋白的水平，分析来自T1转基因株系的四到七个T2发育中的胚乳。在hp-combo株系的情况下，SBEI表达也使用抗SBEI抗体分析。来自所选择的转基因株系的总SBEII蛋白水平(SBEIIa和SBEIIb)被计算为占野生型(品种NB1)中的水平的百分比并且展示于表11中。来自转基因株系的成熟籽粒中的直链淀粉水平(被计算为占籽粒中的总淀粉的百分比)也使用如实例1中所描述的一种碘量滴定法测定(表11)。此水平以图解方式示出于图5中。
在独立株系的转基因植株的籽粒中获得SBEIIa和SBEIIb的表达水平的一个范围。在用任何一种构建体获得的转基因株系中通常预料到这一范围，这归因于不同转基因事件中的转基因的整合位点的变化，通常被称为“位置效应”。这些实验中见到的表达水平的范围被扩大，因为观察到这四种构建体在减少SBEIIa和SBEIIb基因的表达方面并非同等地有效。具体地说，在一些转化的株系中由hp-combo构建体引起的SBEIIb表达减少的程度并不与SBEIIa的表达减少的程度相关，例如株系679.5.3和672.2.3。然而，所有这些构建体都减少大部分的转化的株系中的相应基因的表达。
当直链淀粉的百分比针对总SBEII蛋白水平作图并且从多个数据点产生一条最佳拟合的曲线(参见图5)时，观察到相对于野生型使总SBEII减少至少75％得到了胚乳淀粉中50％(w/w)或更大的一个直链淀粉含量。相对于野生型使总SBEII活性减少至少40％得到了至少40％(w/w)的一个直链淀粉含量。
当直链淀粉的百分比针对剩余SBEIIa蛋白水平作图时，获得一条极其类似的曲线(参见图6)，从而得出结论：小麦胚乳中的SBEIIa的水平是淀粉中的直链淀粉水平的主要决定因素，并且SBEIIb和SBEI的水平是次要决定因素。
基于以下三组的输入值，进一步发展该直链淀粉模型(图6)：
(1)基于SBEIIa和SBEIIb的相对表达水平的理论数据以及来自转基因体的直链淀粉数据
(2)针对单和双无效体的直链淀粉数据以及基于SBEIIa和SBEIIb的相对表达水平的理论数据
(3)来自“额外构建体”转基因体的测量的直链淀粉数据和测量的SBEIIa和SBEIIb水平。
在图6中，一条幂曲线已拟合于此数据。将这三个数据组放在一起产生了一种模型，该模型在输入类型之间高度一致，将该模型加强为一种预测工具。该模型预测了在SBEII基因中产生多个突变以便在面包小麦或四倍体小麦中产生高直链淀粉的重要性。
实例3：来自小麦的SBEII基因序列的克隆和比较
来自一个粗山羊草基因组文库的多种SBEII基因的分离以及它们通过PCR的表征被描述于WO99/14314和WO200162934-A中。来自A、B以及D基因组的SBEIIa基因的内含子5区的DNA序列被描述于WO200162934-A中。进一步的研究已获得了来自不同小麦基因型的小麦SBEIIa基因的其他区域的序列以及这些部分同源基因的进一步表征，例如以下。使用引物AR2aE12F07(5′-CATTCGTCAAATAATACCCTTGACGG-3′(SEQIDNO：21))和AR2aE14R07(5′-CTTCACCAATGGATACAGCATCAG-3′(SEQIDNO：22))，对来自六倍体小麦品种恰拉(Chara)的SBEIIa的外显子12到14区进行扩增。由此得到约656bp的一种PCR产物，该PCR产物被推测为来自三种部分同源基因中的每一种的扩增的片段的混合物。此产物在一种TOPO载体中进行克隆之后被测序。获得三种多态性序列，这些序列覆盖了外显子12到14之间的区域(图7)。基于使用切割扩增多态性(CAP)标志物的中国春染色体工程化的株系的PCR分析，序列F1-1被指定到D基因组，序列F1-13被指定到B基因组，并且序列F1-15被指定到A基因组，如实例4中所详述。
使用引物对AR2akpnIF(5′-GGTACCGGCAAATATACGAGATTGACCCG-3′(SEQIDNO：23))和AR2aSacIR(5′-GAGCTCCCACCTTCATGTTGGTCAATAGC-3′(SEQIDNO：24))，对来自两个六倍体小麦品种顺科和塔斯曼的SBEIIa的内含子3区进行扩增。从顺科和塔斯曼中的每一种中获得了三种多态性序列(图8)。通过与小麦SBEIIaD基因组序列(基因库登录号AF338431.1)比较，序列塔斯曼0257和顺科0242被指定到D基因组。基于一个分离群体中的一种单核苷酸多态性，基于对一种多态性标志物进行定位，塔斯曼0272和顺科0241序列被指定到B基因组。序列塔斯曼0264和顺科0243似乎与B和D基因组序列不同，并且推断出它们必然是来自A基因组。还针对在这三种基因组中的每一种中在顺科与塔斯曼之间的SBEIIa的此区域，观察了基因型特异性多态性。
使用引物AR2a外显子3F(AR2aexon3F)(5′-GATACCTGAAGATATCGAGGAGC-3′(SEQIDNO：25))和AR2a外显子3R9(AR2aexon3R9)(5′-CGGTAGTCAAGATGGCTCCG-3′(SEQIDNO：26))，对来自中国春(CS)的SBEIIa的外显子3区进行扩增。获得了三种多态性序列(图9)。与小麦SBEIIa基因(基因库登录号AF338431.1)的比较揭露了序列CS外显子3a是来自D基因组。基于与被报导为来自一种面包小麦2B染色体的基因库登录号FM865435的100％一致性，序列CS外显子3b被发现是来自B基因组。第三种序列CS外显子3d展示了与基因库登录号Y11282.1的99％一致性，该基因库登录号Y11282.1又具有与被报导来自中国春的A基因组的一种部分编码序列(GenBank登录号EU670724)的高度一致性(99％)。由此预测：序列CS外显子3d是来自A基因组。
使用引物AR2aexon1F(5′-CACACGTTGCTCCCCCTTCTC-3′(SEQIDNO：29))和AR2aexon1R(5′-GAGAGGAGTCCTTCTTCCTGAGG-3′(SEQIDNO：28))，对来自CS的SBEIIa的外显子1区进行扩增。获得了多种序列(图10)。与SBEII基因库登录物比对得出了将序列CS外显子1a指定到B基因组(与FM865435100％同源)，将CS外显子1b指定到A基因组(与Y11282.199％同源)，并且将CS外显子1c指定到D基因组(与AF338431.1100％同源)。
还从以下面包小麦的二倍体祖代或亲缘植物获得了SBEIIa基因序列：乌拉尔图小麦(Triticumurartu)，它被认为是面包小麦的A基因组祖代；拟斯卑尔脱山羊草(也称为拟斯卑尔脱小麦(Triticumspeltoides))，它被认为是B基因组祖代；以及粗山羊草，它被认为与D基因组祖代密切相关。从这些物种获得如下的基因片段：基于D基因组的SBEIIa基因(登录号AF338432)的核苷酸序列或其互补序列设计了十种引物并且覆盖了该序列的全部。这些引物组被用于通过PCR对二倍体物种的SBEIIa基因的片段进行扩增。使用这10种引物，在多个PCR中使用与来自二倍体物种乌拉尔图小麦(AA基因组)、拟斯卑尔脱山羊草(BB)、粗山羊草(DD)以及四倍体物种硬粒小麦(AABB基因组)的DNA的16种组合。总共，从这些扩增中选择了具有足以用于测序的质量的35个片段以测定它们的核苷酸序列。这些序列将使用ContigExpress进行比较和编辑，并且针对来自这些二倍体的祖代SBEIIa基因测定所组合的序列。如多种SNP或多种插入/缺失的多种多态性将被鉴别，这些多态性可以用于区分A、B以及D基因组上的基因，并且使用扩增仪设计多种特异性引物以用于突变体的鉴别。
来自乌拉尔图小麦的SBEIIa基因的外显子11-22区的核苷酸序列展示于SEQIDNO：13中，外显子3-8的核苷酸序列为SEQIDNO：15，并且外显子1-3的核苷酸序列为SEQIDNO：14。粗山羊草的完整SBEIIa基因的核苷酸序列提供于WO2005001098(通过引用结合在此)中。
SBEIIa和SBEIIb的定位——小麦中SBEIIa和SBEIIb的遗传连锁。SBEIIa和SBEIIb基因都位于小麦染色体2的长臂上(瑞加娜等人，2005；拉赫曼等人，2001)，并且基于这些报导，被认为是连锁的，不过并不确切地知道该连锁有多密切。SBEIIa和SBEIIb基因的基因定位是使用从一种4系杂交获得的一个分离群体进行的，该4系杂交涉及亲本栽培变种巴克斯特、依替皮(Yitpi)、恰拉以及韦斯顿尼亚(Westonia)。针对这些基因之间的重组对该群体的分析揭露了在约900个子代中仅有一个重组。从这一数据，计算出SBEIIa与SBEIIb之间的遗传距离仅0.5cM，这是这两种基因之间的一个极其紧密的连锁。
为了测定这两种基因之间的物理距离，对由穆莱(Moullet)等人，(1999)构建的粗山羊草的一个BAC文库进行筛选以鉴别包含SBEII的克隆。用32P标记的杂交探针是由来自SBEIIa和SBEIIb基因中的每一种的5′和3′区制备的并且用于筛选该BAC文库。当用这四种探针的混合物筛选时，九个克隆经鉴别具有阳性杂交信号。接着，用这些探针中的每一种分别筛选这九个克隆，并且选择三个克隆。它们中的一个(BAC2)经完全测序并且展示出包含一种全长SBEIIb基因。在其他克隆中，BAC1通过部分直接测序展示出包含一种SBEIIa基因，并且BAC3如由PCR所展示似乎包含了SBEIIa和SBEIIb这两种基因的多个部分。这指示了这两种基因如何密切地以物理方式连锁。BAC1和BAC3将被完全测序。此物理数据证实了密切的遗传连锁。
因此预测，影响这些基因之一的由如辐射的试剂产生的缺失突变可能扩展到两种基因中或跨越两种基因，即，对于两种基因都是无效的。此外，这提示了我们这些缺失突变体也许能成活并且具有野生型适合度的可能性。至少，所观察到的紧密连锁提高了获得缺失相对较小的突变体的可能性，这些缺失不会扩展到对于存活力或适合度而言所需要的其他连锁基因。因此，如以下实例5-7中所描述，探寻这些突变体。
实例4：区分小麦中的SBEIIA与SBEIIB部分同源基因
基于实例2中获得的序列多态性，PCR分析被设计并且准备用来区分面包小麦中的部分同源SBEIIa基因。一种巢式引物对AR2aI13基因组F2(AR2aI13genomeF2)(5′-GTACAATTTTACCTGATGAGATCATGG-3′(SEQIDNO：29))和AR2aI13基因组R2(AR2aI13genomeR2)(5′-CTTCAGGAATGGATACAGCATCAG-3′(SEQIDNO：30))被设计用来从小麦SBEIIa的外显子12到14之间的区域扩增一种207bp的产物。当用两种限制酶Ssp1和Mse1消化时，使用这些引物从中国春(CS)扩增的产物产生了大小为207bp、147bp、99bp以及108bp的四个清晰条带。在CS染色体工程化的株系上使用此PCR标志物分析揭露了该207bp产物来自A基因组，该147bp产物来自B基因组，并且该99bp和108bp产物来自D基因组(图11)。
基于来自小麦的二倍体原种(即，针对基因组A的乌拉尔图小麦、针对基因组B的拟斯卑尔脱山羊草以及针对基因组D的粗山羊草)的SBEIIa序列，设计了可以从来自不同基因组的SBEIIa基因的不同区域特异性地扩增多个片段并且对它们进行区分的引物对(表4到8)。表6到8列出了一些核苷酸多态性(标记的SNP列)和当使用指定的引物对时获得的扩增的片段的大小。这些相同的引物组合可以用于区分来自硬粒小麦的A与B基因组的部分同源SBEIIa基因。
WO200162934-A中描述了对来自面包小麦的A、B以及D基因组的部分同源SBEIIb基因进行区分的一些PCR引物组的发展以及六倍体小麦中的这些基因组中的每一种中的SBEIIb的鉴别。基于来自小麦的二倍体原种(即，针对基因组A的乌拉尔图小麦、针对基因组B的拟斯卑尔脱山羊草以及针对基因组D的粗山羊草)的SBEIIb序列，设计了可以从SBEIIb的不同区域特异性地扩增这三种基因组中的每一种的引物对(表9到10)。这些相同的引物组合可以用于区分来自硬粒小麦的A与B基因组的部分同源SBEIIb基因。
实例5：SBEII突变体的产生和鉴别
利用重离子轰击对小麦进行诱变.通过对小麦种子的重离子轰击(HIB)，在小麦品种恰拉(一种常用的商业品种)中产生一个经诱变的小麦群体。两种重离子来源(即，碳和氖)被用于在日本崎玉县和光的理化仁科中心(RikenNishinaCentre，Wako，Saitama，Japan)进行的诱变。经诱变的种子被播种在温室中以获得M1植株。这些植株自体受精以产生M2代。针对SBEIIa和SBEIIb基因中的每一种中的突变，使用针对SBEIIa(ARIIaF2/ARIIaR2)和SBEIIb(ARA19F/ARA23R)的基因组特异性PCR引物，对从约15,000个M2植株中的每一个中分离的DNA样品进行单独地筛选(诊断PCR)。野生型DNA样品上的这些PCR反应中的每一个都产生了3种独特的扩增产物，这些产物对应于A、B以及D基因组上的SBEIIa或SBEIIb基因的扩增的区域，而在来自经诱变的M2样品的多个PCR中不存在这些片段中的一种指示了这些基因组中的一种中不存在相应的区域，即，存在基因的至少一部分缺失的一个突变等位基因。这些突变等位基因将几乎一定是无效等位基因。
使用基因组特异性引物对的M2株系的筛选鉴别出总共34个突变体，这些突变体是针对SBEIIa和/或SBEIIb基因突变的。接着，针对SBEIIb基因的存在，对SBEIIa的突变体进行筛选，并且反之亦然。所鉴别的突变体由此被归类到三个群组中：“1型”，其中SBEIIa和SBEIIb基因都是突变体，即，在一种基因组中缺乏两种野生型基因；“2型”，其中仅SBEIIa基因是突变的而SBEIIb基因是野生型的；以及“3型”，其中在特定基因组中仅SBEIIb基因是突变的并且SBEIIa基因是野生型的。因为A、B以及D基因组上的SBEIIa基因通过诊断PCR反应来区分，并且SBEIIb基因也是同样，所以可以根据不存在何种扩增产物来将突变等位基因指定到这些基因组中的一种。如在此所使用，名称“A1”是指A基因组上的SBEIIa和SBEIIb基因都是突变的基因型，“A2”是指A基因组上的SBEIIa基因是突变的而SBEIIb基因是野生型的基因型，并且“A3”是指A基因组上的SBEIIa基因是野生型的而SBEIIb基因是突变的基因型。名称“B1”、“B2”、“B3”、“D1”、“D2”以及“D3”针对B和D基因组具有类似的含义。这九种可能的类型中的每一种的突变体都是在34个突变体的集合中鉴别的。
这34个突变体中的每一个中的染色体缺失的程度是通过微卫星定位而测定的。在这些突变体上对预先定位到染色体2A、2B以及2D的长臂的微卫星标志物(表12)进行测试，从而确定每一个突变体中的每一个标志物的存在或不存在。基于反应中适当扩增产物的产生，推断所有或大多数特异性染色体微卫星标志物被保留的突变植株是相对较小缺失突变体。考虑到其他重要的基因更不可能受到这些突变影响，这些突变体是优选的。所鉴别的突变体和来自微卫星定位的结果被概述于表13中。
突变体的杂交.选择如通过微卫星标志物分析所判断对于更小的缺失是纯合的突变植株用于杂交，从而产生在多种基因组上具有突变SBEII等位基因的子代植株和籽粒。来自杂交的F1子代植株自体受精，并且获得F2种子并且针对它们的SBEII基因型分析。对12个这类F2群体进行筛选，得到了突变等位基因的11种不同组合(“双无效体”)的鉴别(表14)。尽管筛选了该特定杂交的超过1200个F2子代，但并未在第十二次杂交中获得B1D1基因型的双无效组合。对此一个可能的解释可能是在B和D基因组中而非在A基因组中的SBEII基因座的附近存在一个关键基因，并且因此B1和D1双无效突变的组合可能使得种子不能成活。双无效突变体的二十七种组合在理论上是可能的，并且将筛选更多的F2群体以鉴别其他组合。
实例6：小麦的单和双无效SBEII突变体的直链淀粉含量
实例5中描述的单和双无效植株的籽粒淀粉中的直链淀粉百分比是使用如实例1中所描述的碘量滴定法测定的。对直链淀粉含量(Y轴)相对于突变株系数目(X轴)进行作图的一个散点图展示于图4中。突变籽粒中的直链淀粉含量在27.3％到38.7％的范围内。野生型(未经诱变的)恰拉样品的直链淀粉含量在27.4％到29.5％的范围内。二十六个株系记录了高于34％的一个直链淀粉含量。观察到在这26个株系中，有20个是双无效体，在这些双无效体中，一些是来自相同杂交的复制品，属于1型或2型组合。换句话说，与单无效籽粒中的直链淀粉含量相比，在1型和2型双无效组合中存在直链淀粉含量显著递增的一个趋势。
重要的并且出人意料的是，在此研究之前，双无效突变籽粒中没有一个具有直链淀粉大于40％的淀粉。这包括了A1B1、A1D1以及B1D1基因型，这些基因型各自包含了四个SBEIIa和四个SBEIIb无效等位基因，并且保留了两个野生型SBEIIa和两个野生型SBEIIb等位基因。然而，此观察与从实例2中的数据作出的预测是一致的。因此，推断出为了通过组合多种突变而获得直链淀粉超过40％的小麦籽粒，籽粒需要具有SBEIIa的超过四个的突变等位基因，或者可替代地，如果仅存在SBEIIa的四个突变等位基因，那么要有超过四个的突变SBEIIb等位基因与这四个SBEIIa等位基因组合，优选地所有六个SBEIIb基因都是突变的。从该数据也提示了A、B以及D基因组中的每一种上的SBEIIa基因以相对于彼此类似的水平表达，即，面包小麦中的SBEIIa表达并非主要来自任何一种基因组。
有趣的是应注意，“A3”和“A3D3”基因型具有与实例2中数据一致的低直链淀粉含量，证实了SBEIIb相对于SBEIIa在测定小麦中的直链淀粉含量中具有一个更小的作用。
实例7：试图去建立三无效突变体的杂交
为了建立具有超过四个SBEIIa突变等位基因的突变株系，使单无效和双无效株系中的一些杂交，并且使用诊断PCR分析对这些杂交的F2子代进行分析。这些分析针对三种SBEIIa和三种SBEIIb基因的存在进行测试，并且因此用于试图去鉴别在A、B以及D基因组中的每一种中的SBEIIa和/或SBEIIb基因中具有无效突变的植株(针对SBEIIa和/或SBEIIb的三无效株系)。表15中列出了在一个第一实验中进行的杂交以及亲本株系和潜在三无效F2子代的基因型。
淀粉颗粒形态是通过来自这些杂交的所选择的正常外观和干瘪/皱缩的F2种子的显微术来分析的。选择六个干瘪/皱缩的种子，5个来自08/dd杂交并且1个来自08/bb杂交，这些种子中的每一个都是从一个D2单无效亲本植株与一个A1B2双无效亲本植株之间的杂交获得的。这六个种子中的每一个都展示了淀粉颗粒的严重变形，展示了对于这些种子中的大多数颗粒来说是异常的变形的形状，这与在具有升高的直链淀粉水平的转基因种子中观察到的颗粒(实例2)类似。对来自其他杂交的许多干瘪/皱缩的种子和所选择的奇怪外观的种子的检查揭露了淀粉颗粒形态无改变，指示了在08/dd和08/bb种子中观察到的表型是基因型特异性的并且不归因于在种子发育过程中的发育问题。
将从这些具有变形的淀粉颗粒的种子中的6个分离的淀粉汇集，并且使用如实例1中所描述的碘量滴定法针对直链淀粉含量进行测试。该汇集的样品的直链淀粉含量经测量为67％(表16)。栽培品种凯多克斯和恰拉的野生型种子(对照)中的直链淀粉水平是约35％。
具有改变的淀粉颗粒形态的种子的基因型分析.将来自杂交08/dd和08/bb的具有改变的淀粉颗粒形态的种子播种，并且使所得植株生长于温室中。使用实例3中所描述的针对SBEIIa和SBEIIb的基因组特异性引物，分析从这些植株中提取的DNA。来自PCR分析的结果指示了这些种子中的每一个都是纯合的双无效突变体，具有一个A1B2、B2D2或A1D2基因型，而第三种(野生型)基因以纯合或杂合状态存在。使用基因组特异性单独的引物对，使用定量PCR(实时PCR，Rotorgene6000)进一步测试来自这些植株的DNA，从而分析这些植株中3种SBEIIa基因的存在或不存在以及纯合性或杂合性。用于SBEIIa的引物对是Snp6for/Arev5(SEQIDNO：51/SEQIDNO：61)(A基因组，205bp的扩增产物)、BSnp4/Arev5(SEQIDNO：55/SEQIDNO：61)(B基因组，494bp的扩增产物)以及DSnp7for/Drevl(SEQIDNO：58/SEQIDNO：62)(D基因组，278bp的扩增产物)。为了使SBEIIa扩增反应归一化，在对照扩增中使用了一种引物对(SJ156/SJ242)，该引物对从CsIF6基因扩增了一个190bp的产物，该CslF6基因是一种细胞壁生物合成基因，预期它在所有植株中同等地表达并且位于小麦染色体7上。将来自经诱变的群体(指定为2B2)以及来自野生型栽培品种中国春(CS)的一个野生型植株的DNA用作对照模板。在使用SBEIIa引物的反应中产生的相对浓度值用针对每一模板DNA制备物的Cslf6引物的值归一化。相对于株系2B2，计算针对潜在三无效植株和CS的值。
在这三种引物对中，D基因组引物针对被指定为S14的一个植株产生了一个清晰的单一条带，这使得能够进行定量。针对S14的A和B基因组上的SBEIIa基因未获得条带，指示了它对于这些基因组上的突变等位基因是纯合的。该定量指示了与2B2相比，S14具有D等位基因互补序列的约30％-50％，而CS针对D基因组SBEIIa基因给出了2B2的约95％的值。这展示了给出直链淀粉水平约67％的种子的S14除对于A基因组中的SBEIIb无效突变是纯合的以外，对于这些基因组中的两种(A和B)的SBEIIa无效突变是纯合的，并且对于第三种基因组(D)是杂合的。即，S14具有一种A1(纯合)、B2(纯合)、D2/+(杂合)基因型。以一种类似方式，定量PCR展示了被指定为S24的植株具有一个B2(纯合)、D2(纯合)以及A1(杂合)基因型，PCR分析展示了剩余5个植株具有以下基因型：08dd9-B4对于一种A1B2基因型是纯合的，即，对于A基因组上的SBEIIa和SBEIIb是纯合突变的，B基因组上的SBEIIa是纯合突变的而SBEIIb是野生型的，以及对于D基因组上的两种基因都是纯合野生型的，而08bb11-D9对于一种B2D2基因型是纯合的，并且S28和S22对于一种A1D2基因型是纯合的。
F3种子的分析.将S28、S22、S14以及S24株系的种子播种在温室中，所得植株自体受精，并且从每一植株获得种子(F3代)。观察到，这些植株的能育性受到影响，因为每一个穗的种子数目和能育的麦穗的百分比与在相同时间下并且在相同条件下生长的野生型、单无效和其他双无效突变体相比显著减少，但并未消除(表17)。
在来自株系S28、S14以及S22中的每一种的100-200个种子上通过光学显微术测定淀粉颗粒形态。从株系S22中，从所测试的200个种子中鉴别出具有变形的淀粉颗粒的102个F3种子。该数据揭露了分离比率偏离预期的1∶2∶1(纯合突变体∶杂合体∶野生型)的一个扭曲，其中与所预期的相比正常表型的数目更高。为了看出是否可以鉴别出具有一种高直链淀粉表型的一个纯合的植株，将具有变形的颗粒的102个种子放在适于发芽的条件下。这102个种子中的六十一个发芽。通过SBEIIa基因组特异性PCR分析来自这61个植株的DNA，并且所有61个植株都似乎是一种A1D2基因型的双无效体，并且未鉴别出纯合的三无效体。B基因组上的野生型SBEIIa基因展示为杂合的，即，对于B基因组，野生型和突变等位基因都存在。
对具有变形的淀粉颗粒但并未发芽的这41个种子针对它们的SBEIIa基因型进行分析。观察到这些种子中的许多是三无效体，即，展示了针对SBEIIa基因不存在任何扩增产物，并且因此具有针对SBEIIa的六个无效等位基因。这证实了可以产生三无效种子，但这些种子具有会影响发芽的缺陷。将来自这些种子中的一些的胚切除，并且使用组织培养基在促进这些胚发芽的条件下培养。一些胚成功地发芽，产生了绿色小植株。然而，当将这些小植株转移到土壤中时，它们生长得不好并且不产生能育的小麦植株。
从这些数据，推断出基于HIB产生的缺失突变的一个纯合的三无效突变种子、和来源于这些种子并且具有六个无效SBEIIa等位基因并且完全缺乏SBEIIa的小植株是从这些杂交中可回收的，但在发芽和生长方面受到影响，指示了在这些过程中对于一些SBEIIa的一个必需的作用。相比之下，对于第三个无效等位基因是杂合的并且因此具有五个无效SBEIIa等位基因的针对SBEIIa的双无效突变体被回收，生长正常并且是能育的，虽然具有能育性降低。
株系S28的蛋白表达分析.在从来自一个S28植株的一个完整的麦穗获得的发育中的胚乳中的SBEIIa蛋白表达是通过蛋白印迹法使用一种SBEIIa特异性抗体分析的。该麦穗中的所有15个胚乳都展示了缺乏SBEIIa的A和D基因组同工型两项的一个模式(AD双无效体)，并且仅存在从B基因组表达的一个SBEIIa条带。在这15个胚乳中，7个具有比其余和对照株系NB1的B基因组SBEIIa表达水平显著更低的一个B基因组SBEIIa表达水平。基于条带强度，对每一胚乳中的SBEIIa表达进行定量。
来自这些胚乳的剩余淀粉颗粒使用90％Percoll纯化。在再悬浮于200μl水中之后，在显微镜下检查这些颗粒。观察到SBEIIa的表达水平低于野生型的约36％的所有胚乳都具有特点为一种高直链淀粉表型的形态变形的淀粉颗粒。在来自一个S24植株的一个麦穗的发育中的籽粒中观察到SBEIIa蛋白表达水平的一个范围，下降到比野生型的5％更低。具有更低水平的SBEIIa的胚乳也展示了改变的淀粉颗粒形态；因此，这些表型在此实验中完全相关。所有这些胚乳中的SBEIIb表达水平也使用一种SBEIIb特异性抗体进行分析。这些结果清楚地展示了与SBEIIa表达减少相对应，SBEIIb表达伴随减少。
讨论.对来自具有A1B2突变基因型(概述于表18中)的具有四个突变SBEIIa等位基因的植株的种子的分析指示了直链淀粉含量针对该基因型仅稍微升高，得到了低于40％的一个直链淀粉水平。比较起来，来自S14、S22、S24以及S28种子的数据示范了第五个SBEIIa突变等位基因的加入使直链淀粉水平升高到约67％。因此，数目从四个SBEIIa无效等位基因增加到最少五个突变SBEIIa等位基因是使直链淀粉水平提高到大于50％(w/w)、实际上大于60％(w/w)的关键。此结论符合从实例2中的数据作出的预测。所观察到的等位基因组成与直链淀粉含量的关系指示了植株中SBEIIa突变等位基因的总数目在决定直链淀粉含量中是重要的(表18)。还推断出SBEIIb突变等位基因的数目也起到一定作用，不过与SBEIIa突变等位基因的数目相比更不重要。
还推断出纯合的三无效突变种子和具有六个无效SBEIIa等位基因并且完全缺乏SBEIIa的小植株可以从包含HIB产生的缺失的单无效突变体中产生，但这些种子和小植株在发芽和生长方面受到影响，指示了在这些过程中对于一些SBEIIa的一个必需的作用。相比之下，对于第三个无效等位基因是杂合的并且因此具有五个无效SBEIIa等位基因的针对SBEIIa的双无效突变体被回收，生长正常并且是能育的。
实例8：进一步试图去制造完全缺乏SBEIIA或SBEIIB的三无效突变体
在以上实例中所观察到的不能产生完全缺乏SBEIIa的一种三无效突变体可能取决于在杂交中用作亲本的特定突变植株。为了对此进行测试，使用额外的亲本突变体(也是从HIB诱变获得的)，进行一个第二组杂交，概述于表19中。收获来自38个杂交的F2种子，并且提取了DNA。通过PCR对各自来自25个杂交的至少96份DNA进行筛选，从而确定分离的趋势，这96份DNA中的12份是来自目的在于制造一种A1B2D2基因型(三无效突变体)但使用了与实例7中所描述不同的亲本株系的杂交。未从这些杂交中的任一个中鉴别出能成活的三无效体。双无效体的回收也取决于杂交而变化，但在大多数情况下，获得了预期的基因型。来自这些A1B2D2杂交中的六项的F2种子也在显微镜下被筛选，从而鉴别出具有一种高直链淀粉表型的种子。这些种子以一个适度的频率鉴别。
来自A2B2D2杂交08/mm-1的种子的筛选.在表19中所列出的杂交中，12个是在具有一种A2基因型的一个亲本与具有一种B2D2基因型的一个亲本之间的杂交，即，两个亲本针对所有三种SBEIIb基因都是野生型的，目的在于产生出具有A2B2D2基因型的三无效SBEIIa突变体。通过PCR对来自从08/mm-1杂交获得的约672个F2种子的DNA制备物进行筛选。分离比率与预期的孟德尔比率发生扭曲，其中所鉴别的双无效体比所预期的显著更少(表20)。尽管如此，在能成活的种子中鉴别出双无效突变的所有可能的组合。在这672个种子中未鉴别出A2B2D2基因型的三无效体，尽管通过孟德尔分离已预期会有约10个。
并行地，通过显微术对08/mm-1杂交的F2种子进行筛选，以鉴别出具有一种高直链淀粉/扭曲的淀粉颗粒(HA)表型的任何种子。在所筛选的576个F2种子中，未鉴别出具有该HA表型的种子。此种子群体应包括了一个低频率的具有5个突变SBEIIa等位基因的种子，这些种子针对SBEIIa在两种基因组中为纯合突变的并且在第三种基因组中为杂合突变的/野生型的。所观察的在A2B2D2杂交中具有一种HA表型的种子的缺乏指示了在不存在任何SBEIIb突变等位基因的情况下，5个突变SBEIIa等位基因似乎并不足以提供一种高直链淀粉(＞50％直链淀粉)表型。即，需要在5个突变SBEIIa等位基因和一个野生型SBEIIa等位基因情形下，除SBEIIa水平大大降低以外，SBEIIb水平相对于野生型降低，或者在一种或多种SBEIIa基因中具有部分功能丢失突变的一个胚乳中一个同等水平的SBEIIa活性，来提供大于50％的直链淀粉。
对来自在其他两种基因组上的单一SBEIIa突变亲本(针对SBEIIb为野生型的)和双SBEIIa突变亲本之间的十一个额外杂交的F2种子的筛选也并未鉴别出A2B2D2基因型的任何能成活的三无效突变种子。
涉及3型突变的杂交.对涉及3型突变的杂交予以进行，目的在于发现具有与四个突变SBEIIa等位基因组合的两个、四个或六个突变SBEIIb等位基因的纯合突变体，并且测定所得植株和其籽粒的表型。表21概述了涉及3型突变的杂交的筛选的结果。鉴别出来自A3B3D3和A3B2D2杂交的三无效体，这两个展示了野生型淀粉颗粒形态。
实例9：针对高直链淀粉的突变体的进一步筛选
进一步试图从所鉴别的单突变体制造三无效SBEIIa突变体，采用了一种改变的策略。此策略加入了这些单突变体在它们鉴别之后的一些最初回交的步骤，以便从具有单一SBEIIa突变的M2植株中去除非连锁的和无关的突变。将此步骤包括在内以减少突变的背景的作用，由于使用了高水平的诱变处理，故这些突变的背景会在植株中产生与所希望的SBEIIa突变无关的额外突变，这些额外突变在组合这些突变时可能具有不利影响。这些最初的回交是通过使这些M2突变体与冬小麦栽培品种阿帕奇(Apache)或春小麦栽培品种恰拉的植株杂交而进行的。
起初，进行13个杂交以对所有三种基因组上的突变进行组合，并且在来自21,400个F2半种子的DNA上进行分子分析，其中保留每一个种子的第二半以维持该株系。为检测突变而进行的一种初步筛选使用了显性SSR标志物，这些标志物对于SBEIIa或SBEIIb是基因组特异性的。从此筛选中，通过基因组特异性扩增产物的不存在，鉴别出21个种子为推定的三无效突变体，并且793个种子为推定的双突变体(表22)。
小麦种子基因型的基于Q-PCRTaqMan的分析.使用如上所描述的显性标志物的第一轮筛选无法在对于任何一种SBEIIa基因为杂合的或纯合的野生型的种子之间加以区分。因此，发展了一种基于TaqMan的PCR分析以区分针对第三种基因组上的SBEIIa基因的杂合体与纯合体，并且证实来自该最初筛选的基因型。因为TaqMan分析是在半种子上进行的，并且因为小麦胚乳针对每一种基因组是三倍体(3n)，所以对于第三种基因组上的野生型SBEIIa等位基因杂合的胚乳可能有以下两个类型的特征曲线：2n，其中野生型等位基因由母系亲本提供；或1n，其中野生型等位基因由父系亲本通过花粉提供。基于Q-PCRTaqMan的分析使用了AppliedBiosystems7900HT快速实时PCR系统(加利福尼亚州福斯特城的ABI公司(ABI，FosterCity，CA))，从而检测推定的双突变小麦种子的第三种基因组上的SBEIIa基因的拷贝数。这些分析使用了通过磁珠法(Nucleomag，目录参考号744400.24)从半种子提取的基因组DNA。将DNA加载于384孔板上并且针对每一板按一式两份进行双重Q-PCR反应。这些PCR反应被设计用来使用引物SBE2aQPCRABDF4(正向引物)：5′-ACGATGCACTCTTTGGTGGAT-3′(SEQIDNO：31)和SBE2aQPCRABDR4(反向引物)：5′-ACTTACGGTTGTGAAGTAGTCGACAT(SEQIDNO：32)，从SBEIIa基因的外显子21扩增一个65bp的片段。用于在Q-PCR反应过程中递送荧光信号的探针是SBE2aQPCRABDS4(探针MGB、FAM)5′-CAGCAGGCTTGATCAT-3′(SEQIDNO：33)。使用引物GamyB1F(正向引物)：5′-GATCCGAATAGCTGGCTCAAGTAT-3′(SEQIDNO：34)和GamyB2R(反向引物)：5′-GGAGACTGCAGGTAGGGATCAAC-3′(SEQIDNO：35)，将来自一种内源性基因GamyB的一个序列用作一种内部对照以使每一个样品的信号值归一化。反应条件如下：“热起动”(95℃，10分钟)，随后是40个循环的变性(95℃，15秒)，退火(58℃，60秒)。反应产物使用相对定量管理软件分析，该软件整合到7900HT快速实时PCR系统中。
使用此TaqMan分析，所有这21个推定的三无效突变体都被证实为双无效体，而非三无效体。最初筛选中的不正确的鉴别被认为是归因于假阴性，可能由不良的模板DNA质量引起。当通过光学显微术针对淀粉颗粒形态对这些种子中的14个进行检查时，观察到所有14个都具有一种与作为双无效突变体而非三无效突变体的种子一致的野生型颗粒表型。这些分析也从杂交M76、M77、M82、M83以及M86中鉴别出在第三种基因组上是2n杂合的少数推定的双突变种子。然而，那些结果需要被证实，因为即使在双无效SBEIIa背景存在下，也难以将2n杂合的基因型与3n纯合的基因型区分开来。这将在子代的下一代中予以证实。这些分析还展示了，从杂交M79、M81、M74、M75、M78以及M80中未获得在第三种基因组上是杂合的突变SBEIIa/野生型的SBEIIa双无效突变体。杂交M84和M85给出了明确鉴别的纯合的双无效SBEIIa突变体的最高数目，这些突变体是针对在第三种基因组上是1n杂合体(突变SBEIIa/野生型)的良好候选物。还鉴别出一些2n杂合体，但需要被证实。
在这些杂交中，单和双无效SBEIIa突变体的数目比从孟德尔分离所预期的频率更低。进一步研究了分离的这一扭曲。当纯合的单突变体的预期频率应为25％时，在一些杂交中，频率远为更低，在1％到25％范围内。用于产生三无效突变体的杂交的子代中的双纯合突变体的数目理论上应为每个组合约6％(1/4×1/4)(6％AB、6％AD、以及6％AB)。所鉴别的双突变体的实际数目远为更低并且在0到5.2％范围内。这提示了突变的一些组合对植株、例如对种子发育来说是有害的，引起了与所预期的相比突变组合的一个更低的回收。两种杂交M74和M75给出了与所预期的相比最低的频率。应注意，用于那些杂交中的亲本在进行这些杂交之前尚未与阿帕奇或恰拉回交，这提示了由诱变处理产生的亲本中的额外的无关突变可能在分离比率的扭曲中具有一定作用。即使是对于给出了一个更高数目的单突变体的杂交M76和M86来说，双无效突变体的频率也较低，尤其是针对一些组合。举例来说，对于杂交M76，D基因组和A基因组中的单无效体的频率对应地是23％和17％，而A和D两种基因组中的双无效突变体的频率仅0.8％。这提示了SBEIIa突变的一些组合与其他相比对植物更不利，并且因此进行相反选择。包含五个突变SBEIIa等位基因的突变体(在第三种基因组上是杂合突变的双无效体)的比例也是极低的。对于M84和M85杂交，预期的频率将为9％(1/4×1/4×1/2×3)，而最高观察的百分比是1.1％。
M74和M75杂交中的纯合的单与双突变体的频率之间的相关性对于A和D基因组上的SBEIIa突变是十分良好的(对应地为0.789和0.558)，而对于B基因组则远为更低(0.386)。一个可能的解释将为M74和M75杂交中使用的亲本(19.832(D1)/20.257(A2)[08/b12])之一从一开始就是一个杂合体而非一个双纯合的突变体。
在这些条件下，获得一种三无效突变体(6个无效突变SBEIIa等位基因)的机率极低并且与1/64的预期的频率相比远为更低。然而，预期在第三种基因组上也为杂合的双突变体(尤其是来自M84和M85杂交)的自体受精以证实这些三无效突变体从这些亲本突变体中是否可回收。将对自体受精的植株的子代进行分析以鉴别任何三突变种子。
实例10：通过NIR对突变的小麦种子进行筛选
发展了一种快速的非破坏性并且高通量的方法，用来针对与高直链淀粉含量相关的一种表型对单一种子进行筛选。实例4-6中描述的基于PCR的筛选法虽然成功地检测了15,000个种子的一个群体中的突变体，但需要在手动切割每一个种子之后从每一个半种子制备DNA，并且因此是耗时并且繁琐的。已确定了近红外光谱法(NIRS)可以用于区分高直链淀粉与正常直链淀粉表型。近红外红色光谱法(NIRS)为一项非破坏性的技术，它已被用于测定一些小麦种子性质(麦克卢尔(McClure)，2003)。德尔维什(Delwiche)等人(2006)已在硬粒小麦上发展了针对一种蜡质淀粉表型(低直链淀粉)的小麦单一种子NIRS分析。道尔(Dowell)等人(2009)开发了一种自动化的单一种子NIR分选系统以对蜡质、部分蜡质以及正常硬粒小麦和六倍体小麦进行分离。据我们所知，先前尚未使用此方法来区分六倍体小麦中高直链淀粉的种子。
测量经研磨的种子材料中的表观直链淀粉含量的缩小比例的生物化学参考方法的发展和验证.为了校准单独的种子中根据表观直链淀粉含量的NIRS测量值，必须建立一种数学模型以使对相同样品(在此情况下为单一种子)上的表观直链淀粉含量进行测量的NIRS光谱数据与一种生物化学方法相关。标准的碘量滴定法(例如实例1中描述的方法)常规地使用了一定数量的种子，将这些种子在淀粉溶液化之前被组合，得到大量的(组合的)淀粉，该淀粉进行正常脱脂，随后基于碘结合进行直链淀粉含量的比色测量。为了适用于NIRS校准的目的，此方法进行修改、简化以及缩小比例，从而允许单一种子中的表观直链淀粉含量的测量，由此顾及种子之间直链淀粉含量的变化。在此情况下使用术语“表观直链淀粉含量”是因为所修改的方法并未从经研磨的籽粒中纯化该淀粉，淀粉中与直链淀粉相互作用的脂质未被去除，并且结果被表示为新鲜种子重量的百分比而非从种子中分离的淀粉的百分比。出于这些原因，针对“表观直链淀粉含量”获得的值与使用如实例1中所描述的标准方法获得的值相比远为更低。
作为一个第一步骤，通过在无淀粉纯化的情况下使用经研磨的小麦籽粒对比色反应与直链淀粉含量之间的线性进行评估来发展此方法。用于此步骤的高直链淀粉的材料为用hp5′-SBEIIa构建体转化并且具有降低的SBEIIa的小麦籽粒(WM，株系85.2c，参见实例2)以及是在相同时间下并且在相同条件下生长的一种野生型小麦的具有正常直链淀粉水平的小麦(WMC)。如由实例1的标准方法所测定，经研磨的WM籽粒包含约80％直链淀粉，而经研磨的WMC籽粒具有约25％的一个直链淀粉含量。具有不同的WM与WMC比率的样品由经研磨的种子材料制备但未经进一步纯化。约17mg样品被用于该分析。将WM和WMC混合物精确称取到1.5ml微量离心管中。为了使样品中的淀粉溶解，每17mg样品加入1mlDMSO，然后将这些混合物在一个95℃水浴中加热90分钟，伴以偶尔涡旋。将来自每一个混合物的一份10μl等分试样加入1.98ml的水中，并且用10μl含0.3％I2+3％KI的0.01NNaOH溶液处理。测量每一个混合物在605nm下的吸光度，并且使用一条标准曲线将吸光度值转换成直链淀粉百分比。该标准曲线使用呈从0到100％直链淀粉的比率并且用与经研磨的小麦样品相同的方法处理的玉米支链淀粉(西格玛公司目录号A7780)和马铃薯直链淀粉(西格玛公司，A0512)制得。
这些结果展示了WM结合水平与表观直链淀粉含量之间的一个线性关系，展示了该简化的碘量滴定法可以用于NIRS校准并且针对此目的不需要淀粉纯化。
对测量半种子中的表观直链淀粉含量的该生物化学参考方法进行测试将来自从在亚利桑那州和华盛顿州中进行的田间试验实验中获得的WM和WMC(对照)株系的种子用于此测试。整个地，将去除了胚的47个半种子单独地放于1.5ml微量离心管中，并且精确称取，随后向每一管中加入0.6mlDMSO。将这些试管在一个水浴中在95℃下孵育20分钟，此后使用一根玻璃棒在这些试管中捣碎这些样品。每一个混合物的体积被调到恰好每17mg样品1mlDMSO，此后将这些试管在95℃下在一个水浴中再孵育70分钟，伴以偶尔涡旋。通过取每一个混合物的10μl等分试样并且用10μl含0.3％I2+3％KI的0.01NNaOH溶液处理它们并且用H2O稀释到2ml来测量表观直链淀粉，如前所述。测量每一个样品在605nm下的吸光度，并且使用如上所描述的一条标准曲线将吸光度值转换成“表观直链淀粉”百分比。
使用此方法，WM种子的表观直链淀粉含量在20％到41％范围内(平均27％)，而WMC种子的表观直链淀粉含量在7.5％到17％范围内(平均11.4％)。上文描述了这些值与如由实例1的方法所测定的直链淀粉含量相比远为更低的原因。因此，此简化的方法允许具有高直链淀粉的种子与具有野生型直链淀粉含量的那些种子区分开来。
NIRS校准.使用一台多用途分析仪(MPA)NIRS光谱仪(法国马恩河畔田园F-77420的布鲁克光学公司(BrukerOptics，F-77420ChampsSurMarnes，France))获得WM和WMC种子上的单一种子NIRS扫描。将每一个种子放在用铝箔包裹的一个玻璃管的底部并且扫描两次。光谱是使用装备有一种纤维探头的一台BrukerMPA多用途分析仪光谱仪(布鲁克光学公司)记录。光谱是使用32个扫描参考和16个样品扫描在4000-12,500cm-1范围内以16cm-1的一个分辨率记录，产生1100个数据点。所使用的光纤探头是用于固体的IN261探头。
为了确定表观直链淀粉水平与NIR读数之间的相关性，对表观直链淀粉含量在6％到44％范围内的226个单独的WM或WMC种子进行分析。首先，针对每一个种子获取双份的NIRS光谱，此后根据以上描述的方法针对每一个种子以生物化学方式测量该表观直链淀粉含量。离群光谱(6个样品)被鉴别为与整个数据组的光谱相比异常的光谱并且被剔除，并且在处理前用归一化最小值-最大值分析其余光谱。使用全(弃一)交叉验证的偏最小二乘软件被用于建立该模型。用于模型形成的光谱窗口为9827-7150cm-1和6271-4481cm-1。用于形成该校准的PLS因子的数目为14。校准模型的准确性由正交验证的标准误差(SECV)和决定系数(R2)表示。一个校准的效率由RPD展示，RPD是预测标准误差(RMSECV)与该组参考数据的标准偏差的比率。
在生物化学数据与NIR光谱数据之间获得了一个正相关(R2＝0.702)(图15)。推断出，该模型稳健到足以区分高直链淀粉的小麦种子与正常直链淀粉的小麦种子，但尚未准确到足以精确地测量任一个种子中的直链淀粉含量。因此，该方法能够对种子的一个极大群体进行筛选，从而针对具有高直链淀粉表型的籽粒进行富集。此方法验证如下。
NIRS验证.为了在区分高直链淀粉的籽粒与对照籽粒方面验证该NIR方法，通过NIR将60多个WM种子和34个WMC种子扫描两次，并且计算预测的表观直链淀粉含量。当对如此测定的表观直链淀粉值作图以获得针对WM和WMC群体的分布特征曲线时，看出这两个群组大多是分开的，其中略微有重叠(图16)。根据这些结果，具有等于或高于30％的由NIRS测定的一种预测的表观直链淀粉表型的种子可以被视为是高直链淀粉的种子的良好候选物。
来自小麦杂交的F2种子的NIRS筛选.进行NIRS筛选以检测具有高直链淀粉含量的突变种子。该筛选使用了来自以下两个不同杂交的2,700个F2种子：M80和M85，这些杂交对应地为：21.142(B2)/I型-20257(A1)[08/h-111]//I型-19.832(D1)/恰拉和5.706(D2)/21.668(B2)//20.257(A1)/恰拉。因此，该筛选的目的在于对应地鉴别具有一种A1B2D1或A1B2D2基因型的种子。如上所描述，记录每个种子的两个NIRS光谱。
在两个双份的筛选中的至少一个中给出了高于34％的一个预测的表观直链淀粉值的种子被首先选择用于进一步分析。在这2,700个种子中，选择27个种子，并且接着通过光学显微术评估，从而测定淀粉颗粒形态。小心地刮削每一个种子以维持该胚，但获得待检查的足够的胚乳材料。观察到这27个中的四个种子具有变形的淀粉颗粒形态。这四个种子刚好具有来自NIR筛选的最高预测的表观直链淀粉含量，并且是两种预测的表观直链淀粉值都高于30％的仅有的种子。其他23个种子展示了正常(野生型)颗粒形态。
通过NIRS筛选所选择的种子上的分子数据.在这四个种子上进行PCR分析以测定每一个种子的SBEIIa基因型。最初分析使用了展示三种基因组上的每一种SBEIIa基因的存在或不存在的显性PCR标志物。这些种子中的三个展示为双无效突变体，而第四个为一种推定的三无效突变体。然而，当用一种辅显性PCR标志物进一步测试(参见下文)时，所有这四个种子都展示为针对SBEIIa的双无效突变体(即，在两种基因组中缺乏SBEIIa)以及针对在第三种基因组上的一种突变SBEIIa基因为杂合的。因此，这些种子包含了5个突变SBEIIa等位基因和至少两个突变SBEIIb等位基因。
当来自每一个种子的胚被放在发芽的条件下时，它们中没有一个成功地发芽，可能是因为它们被过度损伤或者突变的组合过度有害。
为了设法鉴别更多的候选物，在来自M80和M85杂交的更多的F2子代种子上进行进一步的NIRS筛选，其中候选种子的选择更不严格。用于第二次筛选的选择准则是所预测的表观直链淀粉值中的一个必须高于30％并且第二个为至少23％。通过光学显微术针对淀粉颗粒评估来选择新的一组22个种子。在那22个候选物中，1个种子BD85；9F08(P279-F08-834)展示了一个变形的淀粉颗粒表型。此突变体通过PCR进一步分析并且展示为在A和B基因组上的一个双无效SBEIIa突变体并且针对D基因组上的突变SBEIIa基因是杂合的。它已成功发芽供繁殖。
实例11：对具有改变的淀粉结合亲和力的淀粉分支酶的等位基因的检测
对通过用化学诱变剂叠氮化钠或EMS处理而产生的经诱变的小麦籽粒的群体进行筛选以鉴别在SBEIIa基因中具有点突变，并且因此使SBEIIa-A、-B或-D活性、或SBEIIb-A、-B或-D活性相对于野生型小麦潜在地降低但不消除(部分突变体)的突变体。针对突变体的筛选是基于通过使用蛋白印迹法用对SBEIIa或SBEIIb具有特异性的抗体(参见实例2)或通过如下基于亲和力的技术对SBEIIa或SBEIIb蛋白的量进行测量。还预期此筛选可检测完全缺乏SBEIIa-A、-B、或-D活性的具有点突变的突变体以及具有部分活性的突变体。
来自籽粒的包括淀粉分支酶的蛋白提取物通过包含糖原、支链淀粉、直链淀粉或β-极限糊精的一种聚丙烯酰胺基质的非变性凝胶电泳(亲和凝胶电泳)提供了一种用于鉴别对具有改变的淀粉结合能力的SBEIIa或SBEIIb进行编码的SBEIIa或SBEIIb的等位基因的方法。假定淀粉分支酶的活性位点包含一个淀粉结合位点，那么具有改变的结合效率的SBEII多肽很可能在催化速率和/或亲和力方面具有改变。具体地说，具有降低的结合效率的多肽预期会具有降低的SBEII活性。
基于莫雷尔等人，(1997)；和科萨尔-哈什米(Kosar-Hashemi)等人，(2006)，作一定的修改，使用以下方法。
蛋白的制备.可溶性蛋白通过将来自发育中的种子(开花后约15天)的分离的胚乳在包含5mMEDTA、5mMDTT、0.4％蛋白酶抑制剂混合液和20％甘油的50mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)中均质化来提取。在以14,000g离心10分钟之后，将上清液用于凝胶电泳。提取物中的蛋白浓度使用一种CoomassiePlus蛋白分析试剂估算。
亲和电泳.在一项用于对SBEIIa蛋白同工型进行分离的二维(2D)亲和电泳技术中，将蛋白提取物的等分试样(40或100μg)加载于第一维凝胶(浇在一个HoeferSE600垂直16cm平板凝胶单元中的一块非变性聚丙烯酰胺凝胶)上。第二维凝胶的溶解组分是包含10％甘油的一种6％非变性凝胶(14×16cm或16×16cm，1.5mm厚)，其中适量多糖靶(支链淀粉、β-极限糊精或糖原)固定在凝胶结构内。将一份积层凝胶(不含多糖)倾注到距玻璃板的顶部1cm，使用一根梳子来形成，从而形成多个孔。在4℃下在恒定电压(对于包含糖原和β-极限糊精的凝胶为100V以及对于包含支链淀粉的凝胶为135V)下使凝胶跑胶过夜。
可替代地，使用一种一维系统来分离多种SBEIIa蛋白，在该一维系统中，蛋白提取物(20μg)被加载于一块非变性聚丙烯酰胺凝胶上。该凝胶的溶解组分是包含10％甘油的一种6％非变性凝胶，其中0.15％的β-极限糊精固定在凝胶结构内，而积层凝胶是不含多糖的。凝胶在4℃下在每个凝胶20mA恒定电流和最高200V电压下跑胶。
SBEIIb蛋白也可以在一种Bis-Tris4％-12％梯度凝胶(英杰公司(Invitrogen))上分离。该凝胶在4℃下在每个凝胶20mA恒定电流和最高200V电压下跑胶。
免疫检测.对于在电泳之后的SBEII蛋白的免疫化学检测，使用一个TE70PWR半干转移单元(安玛西亚生物科学公司)将这些蛋白从凝胶转移到硝化纤维素膜上。转移缓冲液包含39mM甘氨酸、48mMTris、0.0375％SDS以及20％甲醇。转移以0.8mA/cm2的一个恒定电流进行1-1.5h。该膜用5％脱脂奶封闭，随后使用对小麦SBEIIa具有特异性的一级兔多克隆抗体进行蛋白印迹法。
当通过一维亲和凝胶电泳方法分析时，由来自小麦A、B以及D基因组的部分同源等位基因编码的SBEII同工型的迁移模式在不同小麦品种之间展示出差异。在一些品种中，A、B以及D部分同源形式的清晰分离是可能的，允许对来自那些品种的经诱变的群体中的多态性进行简单评分。举例来说，来自野生型小麦品种阳光州和NB1的胚乳的蛋白提取物的亲和凝胶电泳展示了SBEIIa-A、-B以及-D同工型的清晰分离。对淀粉具有一个降低的亲和力的分支酶等位基因与对应的天然部分同源等位基因相比通过包含多糖的聚丙烯酰胺凝胶迁移了一段更长的距离。包含了表达减少的等位基因或不存在一种特定的部分同源等位基因的表达的株系是通过存在/不存在纯合状态中的一个条带以及通过测量杂合株系中的条带强度的密度测定法来鉴别的。为了验证此方法，通过基因型分析(实例6)而鉴别的SBEIIa-和SBEIIb-突变植株通过亲和凝胶电泳被证实为缺乏特定SBEIIa或SBEIIb蛋白，与它们的基因型一致。这些实验验证了此蛋白分析法用于检测一种SBEII同工型的量或活性降低的突变体。
使用β-极限糊精亲和凝胶电泳，对品种阳光州的2100个经诱变(如兹瓦尔和钱德勒(1995)中所描述用叠氮化钠处理)的小麦株系的一个群体进行筛选，得到了18个突变体的鉴别，这些突变体在SBEIIa蛋白中的一种的亲和凝胶上具有改变的迁移率(亲和突变体)，或基于由该基因编码的可检测蛋白的缺乏，针对SBEIIa基因中的一种为无效突变体。在这些亲和突变体中的一种中，针对SBEIIa同工型中的每一种的淀粉-酶相互作用的解离常数(Kd)是通过在如科萨尔-哈什米等人，2006中所描述的一种1-D亲和凝胶中测量随β-极限糊精浓度而变的酶迁移率的变化来计算的。此亲和突变体具有SBEIIa蛋白，这些SBEIIa蛋白具有以下Kd值：针对SBEIIa-A、SBEIIa-B以及SBEIIa-D同工型对应地为0.53g/L、0.52g/L以及1.69g/L(图13)。与A和B同工型的Kd值相比，针对D同工型所观察到的更高Kd值指示了此同工型对于结合到淀粉上具有一个更低的减小的亲和力，指示了此株系对于SBEIIa-D基因是一种亲和突变体。预期此株系的D基因组同工型(SBEIIa-D)与其他两种同工型相比，具有一个更低的酶活性，但活性并不完全丢失。此预期通过在SBEIIa-A和SBEIIa-B的无效等位基因的存在下进行SBEII活性分析来证实。
从经叠氮化钠诱变的阳光州群体中鉴别的SBEIIa单一突变体接着与先前鉴别的HIB双无效突变体杂交，以用于对三突变体进行分离，这些三突变体缺乏来自两种基因组的SBEIIa活性，并且来自第三种基因组的活性完全或部分丢失。进行了分离A1B2D2的四个杂交，各自分离A2B2D2和A2B2D1的两个杂交以及分离A1B2D1基因型的一个杂交。利用显微术对来自A1B2D2杂交中的一个的F2种子的淀粉颗粒形态的检查鉴别出与高直链淀粉的淀粉(至少70％直链淀粉)中所见相似的淀粉颗粒严重变形的种子。这些种子的基因型和直链淀粉表型是通过对种子和子代中的SBEIIa等位基因进行分析以及通过对来自子代籽粒的淀粉进行提取和分析来证实的。在亲和单突变体之间还进行了八个杂交，从而制造SBEIIa的亲和双突变体。这包括了旨在分离A2B2、A2D2以及B2D2双亲和突变体而产生的杂交。F2子代通过以上描述的方法加以分析，从而鉴别出双纯合亲和突变体。
实例12：来自高直链淀粉的小麦籽粒的淀粉颗粒和淀粉的性质
淀粉颗粒形态和双折射率的改变.淀粉和淀粉颗粒的性质是在实例2中所描述的转基因的高直链淀粉的小麦中检查。扫描电子显微术被用于鉴别淀粉颗粒大小和结构的大体改变。与未转化的对照相比，来自SBEIIa表达减少的胚乳的淀粉颗粒展示了显著的形态改变。它们在形状上高度不规则，并且A颗粒(直径＞10μm)中的许多似乎为镰刀状的。相比之下，来自SBEIIb表达减少和SBEIIa表达未改变的胚乳的A和B两种(直径＜10μm)淀粉颗粒都是表面平滑的，形状为球形或椭球形，并且难以与野生型小麦淀粉颗粒区分。
当在偏振光下在显微镜下观察时，野生型淀粉颗粒典型地展示出一种强双折射图案。然而，对于包含高直链淀粉的淀粉的颗粒来说，双折射率大大减小。当在偏振光下观测时，来自具有减少的SBEIIa表达和70％-80％直链淀粉含量的株系的淀粉颗粒中低于10％是双折射的。对于基本上无SBEIIb表达但有野生型SBEIIa表达的株系来说，与未转化的对照相比，在双折射率方面未观察到变化。在野生型和SBEIIb抑制型两种株系中，约94％的淀粉颗粒展现出完全的双折射。该数据在表23中给出。因此，双折射率的损失与高直链淀粉含量密切相关。
转基因小麦籽粒的直链淀粉含量.转基因小麦籽粒的直链淀粉含量通过两种独立的方法加以分析，即，一种碘量滴定法和一种尺寸排阻色谱(SEC)法。直链淀粉含量的碘量滴定测定是基于参照使用已知浓度的纯化的马铃薯直链淀粉和支链淀粉产生的一条标准曲线，对在碘结合到α-1，4葡聚糖的线性区域时所诱发的颜色变化进行测量，如实例1中所描述。尺寸排阻色谱法是基于通过柱色谱法，对尚未脱支的直链淀粉和支链淀粉进行分离，随后对从该柱中洗脱的洗脱份中的淀粉浓度进行测量。分析了籽粒的三种基因型。第一，用hp-SBEIIa构建体转化并且具有极低水平的SBEIIa表达的植株；第二，包含hp-SBEIIb构建体并且不具有可检测的SBEIIb表达但针对SBEIIa是野生型的植株；以及第三，未转化的野生型对照(NB1)。来自于缺乏SBEIIb表达的植株(008)的籽粒具有通过碘量滴定法测定的27.3％以及根据SEC法的32％的一个直链淀粉含量。这与来自未转化的对照株系NB1的籽粒的直链淀粉含量并无显著不同(31.8％碘量滴定，25.5％SEC)。然而，在具有减少的SBEIIa表达的籽粒(株系087)中，直链淀粉含量显著升高(碘量滴定是88.5％，SEC是74.4％)。针对株系087的这两个数值的差异被认为是存在一些“中间物质”，该中间物质非常像直链淀粉地结合碘并且在碘量滴定分析中被当作直链淀粉测量，但在柱色谱法中与更大的支链淀粉分离。
根据FACE的淀粉的链长分布.异淀粉酶脱支的淀粉的链长分布是通过荧光团辅助的碳水化合物电泳(FACE)测定的。此项技术提供了在DP1到50范围内的链长的分布的高分辨率分析。从将未转化的对照的归一化的链长分布从转基因株系的归一化的分布中减去的摩尔差异图中，观察到在来自SBEIIa表达减少的籽粒的淀粉中，DP6-12的链长的比例明显减少，并且大于DP12的链长相应增多。当与野生型相比时，观察到在来自hp-SBEIIb株系的淀粉的链长分布方面无统计学上显著的改变。
支链淀粉和直链淀粉的分子量.淀粉的分子量分布是通过尺寸排阻-HPLC(SE-HPLC)测定的。该HPLC系统包括了装备有自动采样器(GBC，LCI610)和蒸发光散射检测器(ELSD)(美国迪尔菲尔德的奥泰公司(ALLTech，Deerfield，USA))的一台GBC泵(LC1150，澳大利亚维多利亚的GBC仪器公司(GBCInstruments，Vic，Australia))。在HPLC操作过程中使用UltrahydrogelTM1000柱、UltrahydrogelTM250柱以及保护柱(7.8mm×300mm，日本沃特斯公司(Waters，Japan))并且维持在35℃下。乙酸铵缓冲液(0.05M；pH5.2)以0.8mLmin-1的流动速率用作流动相。
SBEIIa减少的籽粒的淀粉中的支链淀粉的分子量与NB1(野生型，非转基因)和SBEIIb减少的籽粒的淀粉中的支链淀粉的分子量相比似乎远为更低(7166kDa相对于45523、43646kDa的峰值位置)。相比之下，来自SBEIIb减少的籽粒的直链淀粉的分子量与来自未转化的品种NB1的野生型籽粒的分子量相比并无显著不同。该数据是在表24中。
具有减少的SBEIIa表达的小麦的胚乳中的总淀粉含量.对籽粒中的总淀粉含量占籽粒重量的百分比的分析揭露了hp-SBEIIa株系的胚乳淀粉含量(43.4％)与对照中的52％和hp-SBEIIb株系中的50.3％相比略微降低(表23)。这指示了当SBEIIa表达通过抑制性构建体减少时，存在总淀粉合成的一定的减少。
淀粉膨胀能力(SSP).糊化淀粉的淀粉膨胀能力根据克尼克-罗斯等人，(2001)的小规模测试来测定，该测试测量了在淀粉糊化过程中水的吸收。与来自对照(9.31)和SBEIIb减少的籽粒(10.74)的淀粉相比，SSP的估算值对于来自SBEIIa减少的株系的淀粉来说显著更低，其中数值为3.51(表23)。
淀粉成糊性质。淀粉糊粘度参数基本上如瑞加娜等人，(2004)中所描述般使用一台快速粘度分析仪(RVA)来测定。用于RVA的温度特征曲线包括以下阶段：在60℃下保持2分钟，在6分钟内加热到95℃，在95℃下保持4分钟，在4分钟内冷却到50℃，以及在50℃下保持4分钟。这些结果(表25)展示了与对照小麦淀粉相比，在来自SBEIIa减少的籽粒的淀粉中，峰值和最终粘度显著更低。
淀粉糊化性质.淀粉的糊化性质是如瑞加娜等人，(2004)中所描述，使用差示扫描量热法(DSC)研究的。DSC是在一台PerkinElmerPyris1差示扫描量热计上进行的。淀粉和水以1∶2的比率预混合，并且将约50mg称取到一个DSC盘中，将该DSC盘密封并且静置平衡过夜。使用每分钟10℃的一个加热速率，从而将测试和参考样品从30℃加热到130℃。使用与仪器一起可用的软件来分析数据。这些结果(表26)清楚地展示了与对照(66.6℃)相比，针对来自SBEIIa减少的籽粒的淀粉的一个延迟的糊化终点的温度(72.6℃)。与对照淀粉(61.16℃)相比，在SBEIIa减少的淀粉中峰值糊化温度也更高(63.51℃)。
实例13：在加工过程中对高直链淀粉的小麦面粉的分析
与韦里比的CSIRO食品与营养科学(CSIROFoodandNutritionalSciences，Werribee)合作的加压加工研究.高直链淀粉的小麦淀粉与天然淀粉相比的结构表征是使用小角度X-射线散射(SAXS)进行的。该研究被设计成包括：a)对粗小麦面粉进行表征和b)在大于100℃的温度下在加压蒸煮面粉或淀粉样品的同时对糊化过程的实时分析以及c)在于0到10天的时间内冷却、以及回生时的结构变化。该研究使用了在从约25％(野生型)到约75％(以约10％的增量增加)范围内的不同直链淀粉含量的小麦面粉样品。
这些实验中包括了三组面粉样品。第一，在未从来自SBEIIa减少的株系的高直链淀粉的小麦汇集的纯株系的情况下，一个中等水平直链淀粉的小麦株系AC45.1，它用hp-combo构建体转化，具有约50％直链淀粉(实例2)并且来自对照小麦(NB1)。第二，在从如实例2中所描述的转化的株系汇集的小麦材料的情况下，将样品以10％递增的直链淀粉含量的增量汇集。第三，比较来自不同物种的面粉，这些物种包括小麦(高直链淀粉、野生型、以及缺乏SSIIa的小麦)、大麦(野生型、通过SBEIIa和SBEIIb减少而得到的高直链淀粉、以及通过SSII减少而得到的高直链淀粉)、以及高直链淀粉的玉米。来自在具有一系列直链淀粉含量的汇集的小麦材料上的抗性淀粉分析的结果揭露了从≥40％的一个直链淀粉含量起抗性淀粉的一个线性增加。
实例14：面包和其他食物产品的制造
将一个籽粒(如高直链淀粉的小麦)递送到膳食中的最有效方式之一是通过面包。为了展示高直链淀粉的小麦可以容易地结合到面包中并且检查允许面包制作质量保留的因素，制造面粉的样品，分析并且用于烘焙。采用以下方法。
方法.将小麦籽粒调节到16.5％水分含量过夜，并且用一台Buhler实验室规模的碾磨机在澳大利亚的BRI有限公司(BRILtd，Australia)碾磨，或使用一台QuadromatJunior碾磨机碾磨继而筛选，来实现150μm的一个最终粒子大小。样品的蛋白和水分含量根据AACC方法39-11(1999)通过红外反射(NIR)来测定，或根据AACC方法44-15A(AACC51999)通过杜马斯法(Dumasmethod)和空气烘箱来测定。
微型Z形臂混合.使用微型Z形臂混合器，每次混合使用4g测试面粉，对小麦面粉的最佳吸水率值进行测定(格拉斯(Gras)等人，(2001)；贝克斯(Bekes)等人，(2002)。在所有混合过程中使用了分别用于快速和慢速刀片的96和64rpm的恒定角速度与轴转速。混合是按一式三份进行，每次持续20分钟。在将水加入面粉中之前，通过仅将固体组分混合来自动地记录基线(30秒)。使用一台自动水泵在一个步骤中进行水添加。通过采用平均值从单独的混合实验中测定以下参数：WA％-吸水率是在500布拉班德尔单位(BrabenderUnit；BU)生面团稠度下测定的；生面团成熟时间(DDT)：达到峰值抗性的时间(秒)。
揉混曲线图谱.为了测定在改性的小麦面粉的情况下的最佳生面团混合参数，将具有与通过微型Z形臂混合器测定的吸水率相对应的可变吸水率的样品在一台10gCSIRO原型揉面仪中混合，保持总生面团质量恒定。针对面粉样品中的每一份，记录以下参数：MT-混合时间(秒)；PR-揉面仪峰值抗性(任意单位，AU)；BWPR-在峰值抗性下的带宽(任意单位，AU)；RBD-抗性丧失(％)；BWBD-带宽丧失(％)；TMBW-达到最大带宽的时间(秒)；以及MBW-最大带宽(任意单位，A.U.)。
微型拉伸测试.如下测量生面团拉伸性参数：在一台10g原型揉面仪中将生面团混合到峰值生面团成熟。拉伸测试在具有一种经修改的几何形状Kieffer生面团和麸质拉伸性装备的一台TA.XT2i物性分析仪上以1cm/s进行(曼恩(Mann)等人，2003)。用于拉伸测试的生面团样品(约1.0克/测试)用一台Kieffer模制机模制并且在30℃和90％RH下静置45分钟，随后进行拉伸测试。借助于ExceedExpert软件从该数据中确定R_Max和Ext_Rmax(斯缪英(Smewing)，使用SMS/Kieffer装备和TA.TX2物性分析仪测量生面团和麸质拉伸性的手册(ThemeasurementofdoughandglutenextensibilityusingtheSMS/KiefferrigandtheTA.TX2textureanalyzerhandbook)，英国萨里的SMS有限公司(SMSLtd：Surrey，UK)，1995；曼恩，(2002)。
基于14g占100％的面粉的一种示意性配方如下：面粉100％、盐2％、干酵母1.5％、植物油2％、以及改良剂(抗坏血酸100ppm、真菌直链淀粉15ppm、木聚糖酶40ppm、大豆粉0.3％，从澳大利亚古德曼费尔德私人有限公司(GoodmanFielderPtyLtd，Australia)获得)1.5％。水加入水平是基于微型Z形臂吸水率值，这些值经调整以用于完整公式。在一台35g揉面仪中将面粉(14g)和其他成分混合到峰值生面团成熟时间。在两个分阶段的检验步骤中在40℃下在85％RH下进行模制和淘选。烘焙在一台Rotel烘箱中在190℃下进行15分钟。在于一个支架上冷却2小时之后，进行面包体积(通过芥花种子置换法测定)和重量的测量。净失水量是通过随时间推移对面包进行称重来测量的。
该面粉或全麦粉可以与来自非改性的小麦或其他谷物(如大麦)的面粉或全麦粉共混，从而提供所希望的生面团和面包制作或营养质量。举例来说，来自栽培品种恰拉或格莱利(Glenlea)的面粉具有一个高的生面团强度，而来自栽培品种简兹的面粉具有一个中等的生面团强度。具体地说，面粉中的高和低分子量麦谷蛋白亚基的水平与生面团强度正相关，并且进一步受存在的等位基因的性质影响。
来自SBEIIa减少的转基因小麦株系的面粉以100％、60％以及30％加入水平使用，例如来自不同的小麦株系的所有面粉或60％或30％被加入到烘焙对照(B.extra)面粉中。百分比是占面包配制品中的总面粉。使用如下四种转基因小麦株系：072(SBEIIa减少)、212(从杂交，SBEIIa减少×SBEI三无效体小麦获得的一种小麦株系)、H7(从杂交，SBEIIa减少×SSIIa三无效体小麦获得的一种小麦株系)以及008(SBEIIb减少)与一种未转化的对照小麦(NB1)一起测试。所有小麦都在一台BrabenderQuadramatJunior碾磨机中碾磨。如上所描述，所有共混物的吸水率都在4gZ形臂混合器上测定，并且最佳混合时间在10g揉面仪上测定。这些条件被用于制备10g测试面包块。
混合性质.除了对照株系(烘焙对照，NB1和008)以外，所有其他小麦株系都给出了大大升高的吸水率值(图17(a))。株系212和072给出了随加入水平增加而增加的吸水率值，包括在212面粉的100％加入下高达95％的一个高吸水率。来自这些株系的面粉的增加的结合水平也引起了最佳揉面仪混合时间的减少(图17(b))。如同吸水率数据一样，非对照株系展示出随加入水平增加而大大减小的比面包体积(面包体积/面包重量)。该作用对于212株系尤其强烈。
这些研究展示了具有商业潜力(包括可接受的团块状结构、物性以及外观)的面包可以使用与对照面粉样品共混的高直链淀粉的小麦面粉来获得。此外，高直链淀粉的小麦与以下各项组合使用：优选的遗传背景特征(例如优选的高和低分子量麦谷蛋白)；如麸质、抗坏血酸盐或乳化剂的改良剂的加入；或使用不同面包制作方式(例如发面团面包制作、酸面团、混粒、或全麦粉)，从而提供具有特定效用和营养功效的一系列产品以用于改善肠和代谢健康状况。
其他食物产品：使用标准BRI研究面条制造方法(AFL029)在一台Hobart混合器中制备黄色碱性面条(YAN)(100％面粉、32％水、1％Na2CO3)。在一台Otake面条机的不锈钢滚筒中形成面条片。在静置(30分钟)之后，面条片缩小并被切成数股。面条的尺寸为1.5×1.5mm。
使用标准BRI研究面条制造方法(AFL028)在一台Hobart混合器中制备方便面(100％面粉、32％水、1％NaCl以及0.2％Na2CO3)。在一台Otake面条机的不锈钢滚筒中形成面条片。在静置(5分钟)之后，面条片缩小并被切成数股。面条的尺寸为1.0×1.5×25mm。将面条股汽蒸3.5分钟，然后在150℃下在油中煎炸45秒。
发面团(S&D)面包。BRI研究发面团烘焙涉及一种两步工艺。在第一个步骤中，发面通过将全部面粉的一部分与水、酵母以及酵母食料混合来制造。允许发面发酵4小时。在第二个步骤中，发面与余下的面粉、水以及其他成分结合以制得生面团。该工艺的发面阶段是用200g面粉进行并且给出4小时的发酵。生面团通过将其余100g面粉和其他成分与发酵的发面混合来制备。
意大利面-意大利式细面条.用于意大利面制造的方法如西森斯(Sissons)等人，(2007)中所描述。来自高直链淀粉的小麦(SBEIIa减少)和对照小麦(NB1)的测试样品面粉与Manildra粗粒小麦粉以不同的百分比(测试样品：0、20％、40％、60％、80％、100％)混合，从而获得面粉混合物以用于小规模意大利面制备。将样品校正到30％水分。将所希望的水量加入样品中，并且简单混合，随后转移到一台50g淀粉测定记录仪碗中供进行一个2分钟的进一步混合。将所得生面团(它类似于咖啡豆大小的团块)转移到一个不锈钢的腔室中，并且在7000kPa的一个压力下在50℃下静置9分钟。意大利面接着以一个恒定速率挤出并且被切成约48cm的长度。针对每一个样品制得两批意大利面。该意大利面使用一台Thermoline温度和湿度箱(TEC2604)(澳大利亚史密斯菲尔德的萨莫来恩科学设备公司(ThermolineScientificEquipment，Smithfield，Australia))干燥。该干燥循环由以下各项组成：25℃的一个保持温度，随后增加到65℃，持续45分钟，接着在50℃下约13小时的时间，继而冷却到25℃。在该循环过程中对湿度进行控制。将干燥的意大利面切成7cm的股供后续测试。
实例15：食物样品的血糖指数(GI)和抗性淀粉(RS)的体外测量
如下对包括如在此所描述般制得的面包的食物样品的血糖指数(GI)进行体外测量：用一台家用食物加工器将食物样品均质化。将代表约50mg碳水化合物的样品的量称取到一个120ml塑料样品容器中，并且加入不具有α-淀粉酶的100μl碳酸盐缓冲液。加入碳酸盐缓冲液后约15-20秒，将5ml胃蛋白酶溶液(65mg胃蛋白酶(西格玛公司)溶解于65ml0.02MpH2.0HCl中，在使用当天配制)加入，并且在37℃下将混合物在70rpm的一个往复运动的水浴中孵育30分钟。在孵育之后，样品用5mlNaOH(0.02M)中和，并且加入25ml0.2M乙酸盐缓冲液(pH6)。接着加入被溶解于乙酸钠缓冲液(乙酸钠缓冲液，0.2M，pH6.0，包含0.20M氯化钙和0.49mM氯化镁)中的包含2mg/mL胰酶(α-淀粉酶，西格玛公司)和来自黑曲霉的28U/mL淀粉葡糖苷酶的5ml酶混合物，并且将该混合物孵育2-5分钟。将1ml溶液从每一个烧瓶中转移到一个1.5ml试管中，并且以3000rpm离心10分钟。将上清液转移到一个新的试管中并且储存在一台冷冻机中。每一个样品的剩余部分用铝箔覆盖，并且将容器在37℃下在一个水浴中孵育5小时。接着，从每一个烧瓶中再收集1ml溶液，离心并且如先前进行般转移上清液。此上清液也储存在一台冷冻机中直到可以读取吸光度为止。
将所有样品解冻到室温，并且以3000rpm离心10分钟。必要时对样品进行稀释(1比10稀释通常足够)，按一式两份或一式三份将10μl上清液从每一个样品中转移到96孔微量滴定板中。使用葡萄糖(0mg、0.0625mg、0.125mg、0.25mg、0.5mg以及1.0mg)制备针对每一微量滴定板的一条标准曲线。将200μl葡萄糖Trinder试剂(新南威尔士丽琴的显微遗传学诊断私人有限公司(MicrogeneticsDiagnosticsPtyLtd，Lidcombe，NSW))加入每一个孔中，并且将这些板在室温下孵育约20分钟。使用一台板式读取器在505nm下测量每一个样品的吸光度，并且参照标准曲线计算葡萄糖的量。
如下对包括如在此所描述般制作的面包的食物样品中的抗性淀粉(RS)的水平进行体外测量。此方法描述了样品制备和食物中淀粉的体外消化(如正常食用般)。该方法具有两个部分：第一，在模拟的生理条件下将食物中的淀粉水解；第二，通过洗涤去除副产物，并且在样品进行均质化和干燥之后测定残留的淀粉。在消化处理结束时定量的淀粉代表了食物的抗性淀粉含量。
在第1天，以一种模拟消耗的方式，例如通过用一台家用食物加工器均质化到如通过咀嚼将达到的一个稠度来对食物样品进行加工。在均质化之后，将代表至多500mg碳水化合物的食物的量称取到一个125mL爱伦美氏烧瓶(Erlenmeyerflask)中。一份碳酸盐缓冲液是通过将121mgNaHCO3和157mgKCl溶解于约90mL纯化水中，加入159μL1MCaCl2.6H2O溶液和41μl0.49MMgCl2.6H2O，用0.32MHCl将pH值调到7到7.1，并且将体积调到100mL来制备。此缓冲液在4℃下储存至多五天。制备每毫升碳酸盐缓冲液包含250个单位α-淀粉酶(SigmaA-3176VI-B型，来自猪胰脏)的一份人造唾液溶液。将近似等于食物重量的人造唾液溶液的量加入烧瓶中。在加入该唾液之后约15-20秒，将5mL胃蛋白酶的HCl溶液(1mg/mL胃蛋白酶(西格玛公司)于0.02MpH2.0HCl中，在使用当天配制)加入每一个烧瓶中。淀粉酶和胃蛋白酶的依序混合模拟了一个人在吞咽食物之前咀嚼食物。混合物在以85rpm振荡的情况下在37℃下孵育30分钟。接着，混合物用5mL0.02MNaOH中和。每个烧瓶加入25mL乙酸盐缓冲液(0.2M，pH6)和于乙酸盐缓冲液(pH6)中的包含2mg/mL胰酶(西格玛公司，猪胰脏在4×USP活性下)与来自黑曲霉的28U淀粉葡糖苷酶(AMG，西格玛公司)的5mL胰酶混合物。每一个烧瓶用铝箔加盖，并且在37℃下在一个设置为85rpm的往复运动水浴中孵育16小时。
在第2天，将每一烧瓶的内含物定量转移到一个50mL聚丙烯试管中并且以2000×g在室温下离心10分钟。将上清液丢弃，并且用20mL水将每一离心块洗涤三次，在每一次洗涤的情况下轻轻地涡旋该试管以使离心块破碎，随后离心。针对游离葡萄糖的不存在，用葡萄糖Trinder试剂测试50μl的最后一次水洗涤液。接着，将每一个离心块再悬浮于约6mL的纯化水中，并且使用具有一种S25N-8G分散工具的一种UltraTurraxTP18/10均质化三次持续10秒。将内含物定量转移到一个25mL容量瓶中并且补足体积。将内含物彻底混合，并且送回聚丙烯试管中。将每一个悬浮液的一份5mL样品转移到一个25mL培养管中，并且立即在液氮中壳式冷冻并且冻干。
在第3天，使用Megazyme总淀粉程序试剂盒中所提供的试剂测量每一个样品中的总淀粉。制备淀粉标准品(常规玉米淀粉，SigmaS-5296)和一个分析试剂空白。将样品、对照以及试剂空白用0.4mL80％乙醇润湿以帮助分散，随后涡旋。即刻，加入2mLDMSO，并且通过涡旋对溶液进行混合。将试管放在一个沸水浴中5分钟，并且直接加入含3mL热稳定α-淀粉酶(100U/ml)的MOPS缓冲液(pH7，包含5mMCaCl2和0.02％叠氮化钠)。将溶液在沸水浴中再孵育12分钟，其中以3分钟间隔时间涡旋混合。接着，将试管放在一个50℃水浴中，并且加入4mL乙酸钠缓冲液(200mM，pH4.5，包含0.02％叠氮化钠)和0.1mL的300U/ml淀粉葡糖苷酶。将这些混合物在50℃下孵育30分钟，其中以10分钟间隔时间轻轻混合。在一个容量瓶中将体积补足到25mL并且充分混合。等分试样以2000×g离心10分钟。用1.0mL葡萄糖Trinder试剂测定50μL上清液中的葡萄糖的量，并且在将这些试管在室温下在黑暗中孵育最少18分钟以及最大45分钟之后在505nm下测量吸光度。
将从来自四种转基因小麦株系(即，072(SBEIIa减少)、212(从杂交，SBEIIa减少×SBEI三无效体小麦获得的一种小麦株系)、H7(从杂交，SBEIIa减少×SSIIa三无效体小麦获得的一种小麦株系)以及008(SBEIIb减少))的面粉烘焙的面包块与一种未转化的对照小麦(NB1)一起在100％、60％以及30％面粉(剩余的40％或70％面粉来自野生型籽粒)的结合水平之后针对RS和GI测试。212、072、以及H7面粉的增加的结合引起了RS显著增加(图18(a)和预测的GI减小(图18(b))。当使用来自株系212的面粉时，变化的幅度最大。举例来说，在此高直链淀粉的面粉100％加入的情况下制作的面包具有约10％的一个RS含量，这代表了高于针对30％包含水平的RS含量的一个150％增加以及与NB1对照相比的一个9倍增加。来自008株系的面粉的结合程度增加对所得面包的RS和GI无影响，并且结果与烘焙对照面粉的结果可比。
实例16：高直链淀粉的小麦的加工以及所得RS水平
进行一项小规模研究以测定在来自已经轧制或成薄片状的高直链淀粉的小麦的经加工的籽粒中的抗性淀粉(RS)含量。该项技术涉及将这些籽粒调节到25％的水分含量，持续一小时，随后对这些籽粒进行汽蒸。在汽蒸之后，使用一个小规模滚筒使籽粒成薄片状。接着，将这些薄片在一个烘箱中在120℃下焙烧35分钟。在来自SBEIIa减少的高直链淀粉的小麦(HAW，株系85.2c)和野生型对照小麦(栽培品种哈托格(Hartog))的约200g样品上使用两种滚筒宽度和三种汽蒸时间安排。所测试的滚筒宽度为0.05mm和0.15mm。所测试的汽蒸时间安排为60′、45′以及35′。
此研究展示出与对照相比经加工的高直链淀粉的小麦中的RS的量清楚且实质上增加(表27，图18)。似乎加工条件对RS水平也存在一定作用。举例来说，在高直链淀粉的籽粒的情况下，增加的汽蒸时间引起RS水平略微减小，这很可能归因于在汽蒸过程中淀粉糊化的增加(表27)。除了在最长汽蒸时间下之外，更宽的滚筒间隙产生了一个更高的RS水平。这可能归因于当籽粒在更窄间隙处轧制时淀粉颗粒的剪切破坏增加，使RS水平略微降低。更窄的滚筒间隙也在哈托格对照中引起更高的RS水平，虽然总体RS水平远为更低。与高直链淀粉结果对比，增加的汽蒸时间引起更高的RS水平，可能是由于在更长汽蒸时间下淀粉糊化的增加有助于在后续加工和冷却过程中更多淀粉回生。
在来自不同的产品的RS上的统一的数据。从如实例10中所描述般制备的不同的产品(如面条、发面团面包以及意大利式细面条)中获得的RS数据呈现于表28中。并未针对所有产品测试所有结合水平，但在所分析的大多数产品中使用了20％、40％以及60％的结合水平。这些结果展示了在高直链淀粉的面粉的RS含量与结合水平之间的一个线性关系。
实例17：在SBEIIA中具有点突变的植株的分离
使用标准EMS处理条件，在小麦栽培品种阿切(Arche)或阿帕奇的种子的EMS诱变之后，发展突变的植株株系的一个群体。约5000个阿帕奇和900个阿切的单独的M1植株从经诱变的种子生长，自体受精，并且将来自每一个植株和后续子代的种子作为潜在地突变体株系维持，每一个从一个单独的M1植株中获得。针对三种部分同源SBEIIa基因中的突变通过下一代Solexa测序(亿明达公司(Illumina))对这些株系进行筛选。为了进行这一筛选，制备7个DNA池，每一个通过将来自阿切群体的约130个M1家族以及阿帕奇群体的96个M1家族的DNA汇集来制备。针对每一个部分同源基因3或4个区域在汇集的DNA上进行PCR，靶向那些包括基因剪接位点的外显子区域。基因组特异性引物阐述于表29中。
在PCR产物的归一化之后，将来自相同的DNA池的10个扩增子(扩增产物)融合，并且在每个DNA池一个流通池的情况下完成测序。对序列数据进行分析，从而基于所观察的多态性的频率，从所有多态性中选择最可能归因于突变而非测序误差的多态性。从覆盖外显子区域和剪接位点的第一次序列分析中观察到来自阿切群体的64个推定的突变体以及来自阿帕奇群体的48个。基于卡斯帕(kaspar)技术针对每一多态性设计SNP分析，并且在针对特定多态性为阳性的每一个池中的130个家族上进行基因分型。由此，鉴别出包含每一个突变基因的单独的突变体株系，并且证实了突变SBEIIa序列。
通过这一方法，鉴别出各自具有一个SBEIIa突变的来自阿帕奇群体的31个突变体株系和来自阿切群体的9个，并且保留每一个的M2谷粒。从每一个突变体株系中，取决于可获得性，将约10个M2种子切成两半，将不具有胚的半个用于DNA提取和分析，将具有胚的另一半保存用于播种。在来自阿切群体的半个种子上证实了总共5个突变体并且来自阿帕奇群体是28个：将相应种子播种以产生子代植株，从而通过在M2植株叶片材料上重复分析来证实这些突变以孟德尔方式遗传，提供了远为更好的DNA质量。这些分析证实了19个突变体(4个来自阿切群体和15个来自阿帕奇群体)，并且允许它们取决于它们的DNA以及由这些突变体编码的推断的蛋白质序列而排序。
所获得的突变体包括了具有突变的SBEIIa基因的突变体，在B或D基因组上的SBEIIa基因的蛋白编码区中具有终止密码子，引起SBEIIa蛋白的翻译提前终止；以及在SBEIIa-B或-D基因中具有剪接位点突变的株系。这些突变预期为无效突变。还获得了SBEIIa-A、SBEIIa-B以及SBEIIa-D基因中的点突变(如氨基酸取代突变)并且使用Blosum62和Pam250矩阵预测它们对所编码的蛋白的结构的影响。
使来自最有前景的8个突变株系的植株与适当基因型(包括A1D2、A2D2、A1B2、B2D2基因型)的双无效SBEIIa突变体杂交，以便在F2代中产生三突变体植株和种子。选择会产生在淀粉含量中具有至少50％直链淀粉的种子的能育植株。突变体植株还与硬粒小麦(栽培品种索尔德(Soldur))杂交以将突变引入四倍体小麦中。
表1.从多种谷物表征的多种淀粉分支酶基因
表2.氨基酸亚分类
表3.示例性和优选的保守氨基酸取代
表4.用于小麦SBEIIa基因的多种基因组特异性引物
表5.SBEIIa的多种基因组特异性引物的核苷酸序列
表6.被设计用来使特定地来自小麦的A基因组的SBEIIa基因的多个部分扩增的多种引物-检测的多态性和片段大小
表7.被设计用来使特定地来自小麦的B基因组的SBEIIa基因的多个部分扩增的多种引物-检测的多态性和片段大小
表8.被设计用来使特定地来自小麦的D基因组的SBEIIa基因的多个部分扩增的多种引物-检测的多态性和片段大小
表9.用于小麦SBEIIb基因的多种基因组特异性引物
基因组 引物 预期大小(bp)
A SbeIIb_A_deb1F/2R 741
A SbeIIb_A_deb1F/4R 1007
A SbeIIb_A_deb4F/4R 772
B SbeIIb_B_deb3F/2R 615
B SbeIIb_B_deb2F/3R 929
B SbeIIb_B_deb3F/4R 772
D SbeIIb_D_deb1F/1R 1126
D SbeIIb_D_deb3F/3R 827
D SbeIIb_D_deb4F/4R 669
表10.SBEIIb的多种基因组特异性引物的核苷酸序列
引物名称 核苷酸序列(5′到3′) SEQ ID NO：
SbeIIb_A_deb1F ACCCCGTAATTATTGGCGCT 135
SbeIIb_A_deb4F ACTCTGATGATCTGAAGGTAG 136
SbeIIb_A_deb2R TCATGCAGGCAGGTACTAG 137
SbeIIb_A_deb4R GTGGCAGAATGCGTAATTTCTCT 138
SbeIIb_B_deb2F CAGCGATCTTACGTTCCCTA 139
SbeIIb_B_deb3F ATGTCTGTAGGTGCCGTCA 140
SbeIIb_B_deb2R CAACAAATTAGAAAGAGGATATTCC 141
SbeIIb_B_deb3R CCGTAGATGATTCTTTGTCCATTA 142
SbeIIb_B_deb4R ATGGAACCTAACACAATGTGC 143
SbeIIb_D_deb1F GCGCCACCTTTCTCACTCA 144
SbeIIb_D_deb3F CGGTCCCGTTCAGTTCGAT 145
SbeIIb_D_deb4F CCTGAGTAAATACTGCCACCA 146
SbeIIb_D_deb1R AGAATGCGTAATTTCTCCCTCG 147
SbeIIb_D_deb3R TGTCTTCAGCATCAATTTCTTCAC 148
SbeIIb_D_deb4R CTGTAGGCTTGTTTCATCATCA 149
表11.小麦的多个RNAi株系的SBEII表达对比直链淀粉含量
表12.多种突变体中测试的多种微卫星标志物的清单
表13.从HIB群体鉴别的多种突变体和微卫星定位数据
表14.所鉴别的SBEII的多种双无效突变体
表15.在双与单无效突变体之间进行的杂交
杂交名称 亲本1代码 P1基因型 亲本2代码 P2基因型 潜在F2基因型
08/aa 5-173 B1 08/b-18 A1D1 A1B1D1
08/aa-2 5-173 B1 08/b-33 A1D1 A1B1D1
08/bb 5-706 D2 08/h-92 A1B2 A1B2D2
08/dd 5-706 D2 08/h-111 A1B2 A1B2D2
08/ee 5-173 B1 08/b-12 A1D1 A1B1D1
08/ff 21-142 B2 08/b-12 A1D1 A1B2D1
08/gg 20-365 B2 08/b-12 A1D1 A1B2D1
表16.来自双无效突变体与单无效突变体之间的杂交的子代籽粒淀粉中的直链淀粉含量
株系 基因型 直链淀粉％
HIB突变体 三无效体杂交的F2 67.38
凯多克斯 WT 35.4
85.2c hp-SBEIIa 74.99
008(IIb敲除) hp-SBEIIb 36.1
恰拉 WT 36.09
表17.对多种F2子代植株能育性的观察结果
表18.具有多个SBEIIa和SBEIIb无效等位基因的突变体的SBEII等位基因组成
表19.在单与双无效突变体之间的进一步杂交
表20.来自一个A2B2D2杂交的正常发芽中的籽粒的多种基因型的观察的频率。括号中的数字指示了基于孟德尔分离的预期的频率
表21.在单与双无效突变体之间的进一步杂交
表22.在使用显性标志物的一个初始筛选中鉴别的SBEIIa基因中的多种推定的双和三无效突变体
表23.来自多个转基因小麦株系的籽粒淀粉的淀粉表征
表24.来自多个小麦转基因株系的淀粉部分的分子量分布
表25.hp5′-SBEIIa转基因小麦淀粉的RVA参数
*来自SBEIIa减少的籽粒(株系85.2c)的淀粉在用于RVA运作的温度特征曲线下不成糊。
表26.与对照NB1相比hp5′-SBEIIa转基因小麦淀粉的糊化峰的DSC参数
表27.多种轧制和成薄片的籽粒产品中的RS含量
表28.在高直链淀粉的小麦(HAW)的不同结合水平的多种食物产品中的抗性淀粉含量
NT：未测试
表29.多种基因组特异性引物

Claims (51)

1.小麦全麦粉或面粉，所述小麦全麦粉或面粉由包含胚、胚乳、淀粉以及降低的水平或活性的总淀粉分支酶II(SBEII)蛋白的六倍体小麦籽粒制造，所述小麦是普通小麦(Triticumaestivum)，其中所述胚包含在选自由以下各项组成的组的内源性SBEII基因的5到12个等位基因中的每一个中的功能丢失突变：SBEIIa-A、SBEIIa-B、SBEIIa-D、SBEIIb-A、SBEIIb-B以及SBEIIb-D，使得所述籽粒中总SBEII蛋白的水平或活性为在野生型小麦籽粒中的总SBEII蛋白的水平或活性的2％和30％之间，所述5到12个等位基因包括各自包含功能丢失突变的4、5或6个SBEIIa等位基因，其中当包含功能丢失突变的SBEIIa等位基因的数目仅为4时，那么包含功能丢失突变的SBEIIb等位基因的数目为6，并且其中所述籽粒包含占所述籽粒中的总淀粉的比例至少50％w/w的直链淀粉含量。
2.如权利要求1所述的小麦全麦粉或面粉，其中
a)所述籽粒的胚对于在2或3个SBEIIa基因的每一个中的突变的等位基因来说是纯合的，
b)所述籽粒包含包括部分功能丢失突变的等位基因，所述等位基因以对应于相应的野生型等位基因的量或活性的2％和60％之间的量和/或活性表达SBEIIa或SBEIIb酶，
c)所述胚中SBEIIa基因的无效等位基因的数目为2或4，
d)所述六倍体小麦胚具有SBEIIa基因的6个无效等位基因，
e)所述胚不具有SBEIIb基因的无效等位基因，或所述胚中SBEIIb基因的无效等位基因的数目为2、4或6，
f)所述胚包含两个各自包含部分功能丢失突变的SBEIIb等位基因，
g)所述籽粒在A基因组、B基因组、D基因组、A和B基因组、A和D基因组、或B和D基因组上包含所述SBEIIa基因的无效等位基因，
h)所述籽粒在A基因组、B基因组、D基因组、A和B基因组、A和D基因组、B和D基因组、或所有三种A、B和D基因组上包含所述SBEIIb基因的无效等位基因，
i)所述籽粒包含仅一种或仅两种当在发育中的胚乳中产生时具有淀粉分支酶活性的SBEIIb蛋白、或仅一种或仅两种通过蛋白印迹分析法可检测的SBEIIb蛋白，
j)所述籽粒包含为A、B或D基因组中的缺失突变的无效突变，所述缺失突变缺失该基因组上的SBEIIa基因的至少一部分和SBEIIb基因的至少一部分，
k)所述籽粒包含为A、B或D基因组中的缺失突变的无效突变，所述缺失突变缺失该基因组上的整个所述SBEIIa基因和/或整个所述SBEIIb基因，
l)所述籽粒包含为氨基酸取代突变的无效突变，
m)所述籽粒包含至少一个无效突变，其中每个无效突变独立地选自由以下各项组成的组：缺失突变、插入突变、剪接位点突变、翻译提前终止突变和移码突变，
n)所述籽粒通过蛋白印迹分析法测定仅具有一种SBEIIa蛋白，其中所述蛋白由SBEIIa-A、SBEIIa-B和SBEIIa-D基因中的一种编码，并且当与由相应的野生型基因编码的SBEIIa蛋白相比时，当在发育中的胚乳中产生时具有降低的淀粉分支酶活性，或
o)a)到n)中多于一种的组合。
3.如权利要求1或权利要求2所述的小麦全麦粉或面粉，其中所述籽粒中的总SBEII蛋白的水平或活性是在所述野生型小麦籽粒中的总SBEII蛋白的水平或活性的2％和15％之间。
4.如权利要求3所述的小麦全麦粉或面粉，其中所述籽粒中的总SBEII蛋白的水平或活性是在所述野生型小麦籽粒中的总SBEII蛋白的水平或活性的3％和10％之间。
5.如权利要求1或权利要求2所述的小麦全麦粉或面粉，其中所述籽粒中的SBEIIa蛋白的量或活性是在所述野生型小麦籽粒中的SBEIIa蛋白的量或活性的2％和15％之间。
6.如权利要求1或权利要求2所述的小麦全麦粉或面粉，其中所述籽粒中的SBEIIa蛋白的量或活性是在所述野生型小麦籽粒中的SBEIIa蛋白的量或活性的低于2％。
7.如权利要求1或权利要求2所述的小麦全麦粉或面粉，其中所述籽粒包含占所述籽粒的总淀粉的比例至少60％w/w的直链淀粉含量。
8.如权利要求7所述的小麦全麦粉或面粉，其中所述籽粒包含占所述籽粒的总淀粉的比例至少67％w/w的直链淀粉含量。
9.如权利要求1或权利要求2所述的小麦全麦粉或面粉，其中所述籽粒是非转基因的或者不含任何对使SBEIIa基因表达减少的RNA进行编码的外源性核酸。
10.如权利要求1或权利要求2所述的小麦全麦粉或面粉，其中所述籽粒具有相对于野生型籽粒的发芽率在70％和90％之间或在90％和100％之间的发芽率。
11.如权利要求1或权利要求2所述的小麦全麦粉或面粉，其中所述总SBEII蛋白的水平或活性是通过当籽粒在小麦植株中发育的时候分析所述籽粒中的酶活性，或通过利用免疫手段分析SBEII蛋白的水平或活性而测定的。
12.如权利要求1或权利要求2所述的小麦全麦粉或面粉，其中所述籽粒的淀粉相对于野生型籽粒的淀粉的特征在于选自由以下各项组成的组的一种或多种性质：
(i)包含至少2％抗性淀粉，
(ii)包含降低的血糖指数，
(iii)包含降低水平的支链淀粉，
(iv)包含变形的淀粉颗粒，
(v)减小的淀粉颗粒双折射率，
(vi)减小的膨胀体积，
(vii)改变的链长分布和/或分支频率，
(viii)延迟的糊化终点温度和增加的峰值温度，
(ix)减小的粘度，
(x)增大的支链淀粉分子量，
(xi)改变的淀粉结晶度百分比，和
(xii)改变的A型或B型结晶淀粉百分比。
13.一种食物产品，包含以干重计在至少10％水平的如权利要求1或权利要求2所述的小麦全麦粉或面粉。
14.如权利要求13所述的食物产品，其中所述小麦全麦粉或面粉中总SBEII蛋白的水平或活性是野生型小麦全麦粉或面粉中总SBEII蛋白的水平或活性的2％和15％之间。
15.如权利要求14所述的食物产品，其中所述小麦全麦粉或面粉中总SBEII蛋白的水平或活性是野生型小麦全麦粉或面粉中总SBEII蛋白的水平或活性的3％和10％之间。
16.如权利要求13、权利要求14或权利要求15所述的食物产品，其中所述小麦全麦粉或面粉中SBEIIa蛋白的量或活性是野生型小麦全麦粉或面粉中SBEIIa蛋白的量或活性的2％和15％之间。
17.如权利要求13、权利要求14或权利要求15所述的食物产品，其中所述小麦全麦粉或面粉中SBEIIa蛋白的量或活性是野生型小麦全麦粉或面粉中SBEIIa蛋白的量或活性的低于2％。
18.如权利要求13、权利要求14或权利要求15所述的食物产品，其中所述小麦全麦粉或面粉包含占所述小麦全麦粉或面粉的总淀粉的比例至少60％w/w的直链淀粉含量。
19.如权利要求18所述的食物产品，其中所述小麦全麦粉或面粉包含占所述小麦全麦粉或面粉的总淀粉的比例至少67％w/w的直链淀粉含量。
20.如权利要求13、权利要求14或权利要求15所述的食物产品，其中所述小麦全麦粉或面粉是非转基因的或者不含任何对使SBEIIa基因表达减少的RNA进行编码的外源性核酸。
21.如权利要求13、权利要求14或权利要求15所述的食物产品，其中所述小麦全麦粉或面粉所获自的籽粒具有相对于野生型小麦籽粒的发芽率在70％和90％之间或在90％和100％之间的发芽率。
22.如权利要求13、权利要求14或权利要求15所述的食物产品，其中总SBEII蛋白的水平或活性通过免疫手段测定。
23.如权利要求13、权利要求14或权利要求15所述的食物产品，其中相对于所述野生型籽粒的淀粉，所述小麦全麦粉或面粉的淀粉的特征在于选自由以下各项组成的组的一种或多种性质：
(i)包含至少2％抗性淀粉，
(ii)包含降低的血糖指数，
(iii)包含降低水平的支链淀粉，
(iv)包含变形的淀粉颗粒，
(v)减小的淀粉颗粒双折射率，
(vi)减小的膨胀体积，
(vii)改变的链长分布和/或分支频率，
(viii)延迟的糊化终点温度和增加的峰值温度，
(ix)减小的粘度，
(x)增大的支链淀粉分子量，
(xi)改变的淀粉结晶度百分比，和
(xii)改变的A型或B型结晶淀粉百分比。
24.一种制造淀粉的方法，包括以下步骤：i)获得包含胚、胚乳、淀粉和降低的水平或活性的总淀粉分支酶II(SBEII)蛋白的六倍体小麦籽粒，所述小麦是普通小麦，其中所述胚包含在选自由以下各项组成的组的内源性SBEII基因的5到12个等位基因中的每一个中的功能丢失突变：SBEIIa-A、SBEIIa-B、SBEIIa-D、SBEIIb-A、SBEIIb-B和SBEIIb-D，使得所述籽粒中总SBEII蛋白的水平或活性为在野生型小麦籽粒中的总SBEII蛋白的水平或活性的2％和30％之间，所述5到12个等位基因包括各自包含功能丢失突变的4、5或6个SBEIIa等位基因，其中当包含功能丢失突变的SBEIIa等位基因的数目仅为4时，那么包含功能丢失突变的SBEIIb等位基因的数目为6，并且其中所述籽粒包含占所述籽粒中的总淀粉的比例至少50％w/w的直链淀粉含量，和ii)从所述籽粒中提取所述淀粉，由此制造所述淀粉。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述籽粒的特征在于：
a)所述籽粒的胚对于在2或3个SBEIIa基因的每一个中的突变的等位基因来说是纯合的，
b)所述籽粒包含包括部分功能丢失突变的等位基因，所述等位基因以对应于相应的野生型等位基因的量或活性的2％和60％之间的量和/或活性表达SBEIIa或SBEIIb酶，
c)所述胚中SBEIIa基因的无效等位基因的数目为2或4，
d)所述六倍体小麦胚具有SBEIIa基因的6个无效等位基因，
e)所述胚不具有SBEIIb基因的无效等位基因，或所述胚中SBEIIb基因的无效等位基因的数目为2、4或6，
f)所述胚包含两个各自包含部分功能丢失突变的SBEIIb等位基因，
g)所述籽粒在A基因组、B基因组、D基因组、A和B基因组、A和D基因组、或B和D基因组上包含所述SBEIIa基因的无效等位基因，
h)所述籽粒在A基因组、B基因组、D基因组、A和B基因组、A和D基因组、B和D基因组、或所有三种A、B和D基因组上包含所述SBEIIb基因的无效等位基因，
i)所述籽粒包含仅一种或仅两种当在发育中的胚乳中产生时具有淀粉分支酶活性的SBEIIb蛋白、或仅一种或仅两种通过蛋白印迹分析法可检测的SBEIIb蛋白，
j)所述籽粒包含为A、B或D基因组中的缺失突变的无效突变，所述缺失突变缺失该基因组上的SBEIIa基因的至少一部分和SBEIIb基因的至少一部分，
k)所述籽粒包含为A、B或D基因组中的缺失突变的无效突变，所述缺失突变缺失该基因组上的整个所述SBEIIa基因和/或整个所述SBEIIb基因，
l)所述籽粒包含为氨基酸取代突变的无效突变，
m)所述胚包含至少一个无效突变，其中每个无效突变独立地选自由以下各项组成的组：缺失突变、插入突变、剪接位点突变、翻译提前终止突变和移码突变，
n)所述籽粒通过蛋白印迹分析法测定仅具有一种SBEIIa蛋白，其中所述蛋白由SBEIIa-A、SBEIIa-B和SBEIIa-D基因中的一种编码，并且当与由相应的野生型基因编码的SBEIIa蛋白相比时，当在发育中的胚乳中产生时具有降低的淀粉分支酶活性，或
o)a)到n)中多于一种的组合。
26.如权利要求24或权利要求25所述的方法，其中所述淀粉相对于所述野生型籽粒的淀粉的特征在于选自由以下各项组成的组的一种或多种性质：
(i)包含至少2％抗性淀粉，
(ii)包含降低的血糖指数，
(iii)包含降低水平的支链淀粉，
(iv)包含变形的淀粉颗粒，
(v)减小的淀粉颗粒双折射率，
(vi)减小的膨胀体积，
(vii)改变的链长分布和/或分支频率，
(viii)延迟的糊化终点温度和增加的峰值温度，
(ix)减小的粘度，
(x)增大的支链淀粉分子量，
(xi)改变的淀粉结晶度百分比，和
(xii)改变的A型或B型结晶淀粉百分比。
27.一种筛选小麦植株或小麦籽粒的方法，所述方法包括以下步骤：(i)测定相对于野生型植株或籽粒中的量或活性的SBEIIa和/或SBEIIb的量或活性，和(ii)选择具有在野生型植株或籽粒中的总SBEII蛋白的量或活性的2％到30％之间的植株或籽粒，其中所选的植株或籽粒包含在选自由以下各项组成的组的内源性SBEII基因的5到12个等位基因中的每一个中的功能丢失突变：SBEIIa-A、SBEIIa-B、SBEIIa-D、SBEIIb-A、SBEIIb-B和SBEIIb-D，使得所述籽粒中总SBEII蛋白的水平或活性为在所述野生型小麦籽粒中的总SBEII蛋白的水平或活性的2％和30％之间，所述5到12个等位基因包括各自包含功能丢失突变的4、5或6个SBEIIa等位基因，其中当包含功能丢失突变的SBEIIa等位基因的数目仅为4时，那么包含功能丢失突变的SBEIIb等位基因的数目为6，并且其中所述籽粒包含占所述籽粒中的总淀粉的比例至少50％w/w的直链淀粉含量。
28.一种制造食物或饮料的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)获得包含胚、胚乳、淀粉和降低水平或活性的总淀粉分支酶II(SBEII)蛋白的六倍体小麦籽粒，所述小麦是普通小麦，其中所述胚包含在选自由以下各项组成的组的内源性SBEII基因的5到12个等位基因中的每一个中的功能丢失突变：SBEIIa-A、SBEIIa-B、SBEIIa-D、SBEIIb-A、SBEIIb-B和SBEIIb-D，使得所述籽粒中总SBEII蛋白的水平或活性为在野生型小麦籽粒中的总SBEII蛋白的水平或活性的2％和30％之间，所述5到12个等位基因包括各自包含功能丢失突变的4、5或6个SBEIIa等位基因，其中当包含功能丢失突变的SBEIIa等位基因的数目仅为4时，那么包含功能丢失突变的SBEIIb等位基因的数目为6，并且其中所述籽粒包含占所述籽粒中的总淀粉的比例至少50％w/w的直链淀粉含量，
(ii)对所述籽粒进行加工以制造食物或饮料成分，和
(iii)将来自(ii)的食物或饮料成分加入另一种食物或饮料成分中，由此制造所述食物或饮料。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述籽粒的特征在于：
a)所述籽粒的胚对于在2或3个SBEIIa基因的每一个中的突变的等位基因来说是纯合的,
b)所述籽粒包含包括部分功能丢失突变的等位基因，所述等位基因以对应于相应的野生型等位基因的量或活性的2％和60％之间的量和/或活性表达SBEIIa或SBEIIb酶，
c)所述胚中SBEIIa基因的无效等位基因的数目为2或4，
d)所述六倍体小麦胚具有SBEIIa基因的6个无效等位基因，
e)所述胚不具有SBEIIb基因的无效等位基因，或所述胚中SBEIIb基因的无效等位基因的数目为2、4或6，
f)所述胚包含两个各自包含部分功能丢失突变的SBEIIb等位基因，
g)所述籽粒在A基因组、B基因组、D基因组、A和B基因组、A和D基因组、或B和D基因组上包含所述SBEIIa基因的无效等位基因，
h)所述籽粒在A基因组、B基因组、D基因组、A和B基因组、A和D基因组、B和D基因组、或所有三种A、B和D基因组上包含所述SBEIIb基因的无效等位基因，
i)所述籽粒包含仅一种或仅两种当在发育中的胚乳中产生时具有淀粉分支酶活性的SBEIIb蛋白、或仅一种或仅两种通过蛋白印迹分析法可检测的SBEIIb蛋白，
j)所述籽粒包含为A、B或D基因组中的缺失突变的无效突变，所述缺失突变缺失该基因组上的SBEIIa基因的至少一部分和SBEIIb基因的至少一部分，
k)所述籽粒包含为A、B或D基因组中的缺失突变的无效突变，所述缺失突变缺失该基因组上的整个所述SBEIIa基因和/或整个所述SBEIIb基因，
l)所述籽粒包含为氨基酸取代突变的无效突变，
m)所述胚包含至少一个无效突变，其中每个无效突变独立地选自由以下各项组成的组：缺失突变、插入突变、剪接位点突变、翻译提前终止突变和移码突变，
n)所述籽粒通过蛋白印迹分析法测定仅具有一种SBEIIa蛋白，其中所述蛋白由SBEIIa-A、SBEIIa-B和SBEIIa-D基因中的一种编码，并且当与由相应的野生型基因编码的SBEIIa蛋白相比时，当在发育中的胚乳中产生时具有降低的淀粉分支酶活性，或
o)a)到n)中多于一种的组合。
30.如权利要求28或权利要求29所述的方法，其中所述籽粒中的总SBEII蛋白的水平或活性是在所述野生型小麦籽粒中的总SBEII蛋白的水平或活性的2％和15％之间。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述籽粒中的总SBEII蛋白的水平或活性是在所述野生型小麦籽粒中的总SBEII蛋白的水平或活性的3％和10％之间。
32.如权利要求28或权利要求29所述的方法，其中所述籽粒中的SBEIIa蛋白的量或活性是在所述野生型小麦籽粒中的SBEIIa蛋白的量或活性的2％和15％之间。
33.如权利要求28或权利要求29所述的方法，其中所述籽粒中的SBEIIa蛋白的量或活性是在所述野生型小麦籽粒中的SBEIIa蛋白的量或活性的低于2％。
34.如权利要求28或权利要求29所述的方法，其中所述籽粒包含占所述籽粒的总淀粉的比例至少60％w/w的直链淀粉含量。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述籽粒包含占所述籽粒的总淀粉的比例至少67％w/w的直链淀粉含量。
36.如权利要求28或权利要求29所述的方法，其中所述籽粒是非转基因的或者不含任何对使SBEIIa基因表达减少的RNA进行编码的外源性核酸。
37.如权利要求28或权利要求29所述的方法，其中所述籽粒具有相对于野生型籽粒的发芽率在70％和90％之间或在90％和100％之间的发芽率。
38.如权利要求28或权利要求29所述的方法，其中所述总SBEII蛋白的水平或活性是通过当籽粒在小麦植株中发育的时候分析所述籽粒中的酶活性，或通过利用免疫手段分析SBEII蛋白的水平或活性而测定的。
39.如权利要求28或权利要求29所述的方法，其中所述籽粒的淀粉相对于所述野生型籽粒的淀粉的特征在于选自由以下各项组成的组的一种或多种性质：
(i)包含至少2％抗性淀粉，
(ii)包含降低的血糖指数，
(iii)包含降低水平的支链淀粉，
(iv)包含变形的淀粉颗粒，
(v)减小的淀粉颗粒双折射率，
(vi)减小的膨胀体积，
(vii)改变的链长分布和/或分支频率，
(viii)延迟的糊化终点温度和增加的峰值温度，
(ix)减小的粘度，
(x)增大的支链淀粉分子量，
(xi)改变的淀粉结晶度百分比，和
(xii)改变的A型或B型结晶淀粉百分比。
40.一种制造小麦籽粒的方法，所述方法包括以下步骤：i)获得产生籽粒的六倍体小麦植株，所述小麦是普通小麦，所述籽粒包含胚、胚乳、淀粉和降低水平或活性的总SBEII蛋白，其中所述胚包含在选自由以下各项组成的组的内源性SBEII基因的5到12个等位基因中的每一个中的功能丢失突变：SBEIIa-A、SBEIIa-B、SBEIIa-D、SBEIIb-A、SBEIIb-B和SBEIIb-D，使得所述籽粒中总SBEII蛋白的水平或活性为在野生型小麦籽粒中的总SBEII蛋白的水平或活性的2％和30％之间，所述5到12个等位基因包括各自包含功能丢失突变的4、5或6个SBEIIa等位基因，其中当包含功能丢失突变的SBEIIa等位基因的数目仅为4时，那么包含功能丢失突变的SBEIIb等位基因的数目为6，其中所述籽粒包含占所述籽粒中的总淀粉的比例至少50％w/w的直链淀粉含量，并且其中所述小麦植株是雄性和雌性能育的，ii)从所述植株收获小麦籽粒；和iii)任选地对所述籽粒进行加工。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述籽粒的特征在于：
a)所述籽粒的胚对于在2或3个SBEIIa基因的每一个中的突变的等位基因来说是纯合的,
b)所述籽粒包含包括部分功能丢失突变的等位基因，所述等位基因以对应于相应的野生型等位基因的量或活性的2％和60％之间的量和/或活性表达SBEIIa或SBEIIb酶，
c)所述胚中SBEIIa基因的无效等位基因的数目为2或4，
d)所述六倍体小麦胚具有SBEIIa基因的6个无效等位基因，
e)所述胚不具有SBEIIb基因的无效等位基因，或所述胚中SBEIIb基因的无效等位基因的数目为2、4或6，
f)所述胚包含两个各自包含部分功能丢失突变的SBEIIb等位基因，
g)所述籽粒在A基因组、B基因组、D基因组、A和B基因组、A和D基因组、或B和D基因组上包含所述SBEIIa基因的无效等位基因，
h)所述籽粒在A基因组、B基因组、D基因组、A和B基因组、A和D基因组、B和D基因组、或所有三种A、B和D基因组上包含所述SBEIIb基因的无效等位基因，
i)所述籽粒包含仅一种或仅两种当在发育中的胚乳中产生时具有淀粉分支酶活性的SBEIIb蛋白、或仅一种或仅两种通过蛋白印迹分析法可检测的SBEIIb蛋白，
j)所述籽粒包含为A、B或D基因组中的缺失突变的无效突变，所述缺失突变缺失该基因组上的SBEIIa基因的至少一部分和SBEIIb基因的至少一部分，
k)所述籽粒包含为A、B或D基因组中的缺失突变的无效突变，所述缺失突变缺失该基因组上的整个所述SBEIIa基因和/或整个所述SBEIIb基因，
l)所述籽粒包含为氨基酸取代突变的无效突变，
m)所述胚包含至少一个无效突变，其中每个无效突变独立地选自由以下各项组成的组：缺失突变、插入突变、剪接位点突变、翻译提前终止突变和移码突变，
n)所述籽粒通过蛋白印迹分析法测定仅具有一种SBEIIa蛋白，其中所述蛋白由SBEIIa-A、SBEIIa-B和SBEIIa-D基因中的一种编码，并且当与由相应的野生型基因组编码的SBEIIa蛋白相比时，当在发育中的胚乳中产生时具有降低的淀粉分支酶活性，或
o)a)到n)中多于一种的组合。
42.如权利要求40或权利要求41所述的方法，其中所述籽粒中的总SBEII蛋白的水平或活性是在所述野生型小麦籽粒中的总SBEII蛋白的水平或活性的2％和15％之间。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述籽粒中的总SBEII蛋白的水平或活性是在所述野生型小麦籽粒中的总SBEII蛋白的水平或活性的3％和10％之间。
44.如权利要求40或权利要求41所述的方法，其中所述籽粒中的SBEIIa蛋白的量或活性是在所述野生型小麦籽粒中的SBEIIa蛋白的量或活性的2％和15％之间。
45.如权利要求40或权利要求41所述的方法，其中所述籽粒中的SBEIIa蛋白的量或活性是在所述野生型小麦籽粒中的SBEIIa蛋白的量或活性的低于2％。
46.如权利要求40或权利要求41所述的方法，其中所述籽粒包含占所述籽粒的总淀粉的比例至少60％w/w的直链淀粉含量。
47.如权利要求40或权利要求41所述的方法，其中所述籽粒包含占所述籽粒的总淀粉的比例至少67％w/w的直链淀粉含量。
48.如权利要求40或权利要求41所述的方法，其中所述籽粒是非转基因的或者不含任何对使SBEIIa基因表达减少的RNA进行编码的外源性核酸。
49.如权利要求40或权利要求41所述的方法，其中所述籽粒具有相对于野生型籽粒的发芽率在70％和90％之间或在90％和100％之间的发芽率。
50.如权利要求40或权利要求41所述的方法，其中所述总SBEII蛋白的水平或活性是通过当籽粒在小麦植株中发育的时候分析所述籽粒中的酶活性，或通过利用免疫手段分析SBEII蛋白的水平或活性而测定的。
51.如权利要求40或权利要求41所述的方法，其中所述籽粒的淀粉相对于所述野生型籽粒的淀粉的特征在于选自由以下各项组成的组的一种或多种性质：
(i)包含至少2％抗性淀粉，
(ii)包含降低的血糖指数，
(iii)包含降低水平的支链淀粉，
(iv)包含变形的淀粉颗粒，
(v)减小的淀粉颗粒双折射率，
(vi)减小的膨胀体积，
(vii)改变的链长分布和/或分支频率，
(viii)延迟的糊化终点温度和增加的峰值温度，
(ix)减小的粘度，
(x)增大的支链淀粉分子量，
(xi)改变的淀粉结晶度百分比，和
(xii)改变的A型或B型结晶淀粉百分比。
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Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE517994T1 (de) 2003-06-30 2011-08-15 Commw Scient Ind Res Org Weizen mit veränderter verzweigungsenzymaktivität sowie daraus erhaltene stärke und stärkehaltige produkte
KR101274849B1 (ko) 2003-10-27 2013-06-13 코몬웰스 싸이언티픽 엔드 인더스트리얼 리서치 오가니제이션 아밀로스 비율이 증가된 전분을 갖는 쌀 및 이의 생성물
CA2693630C (en) 2006-07-14 2021-08-31 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Altering the fatty acid composition of rice
BRPI0819669A2 (pt) * 2007-11-27 2014-10-07 Commw Scient Ind Res Org Plantas com metabolismo de amido modificado
CA2653883C (en) 2008-07-17 2022-04-05 Colin Leslie Dow Jenkins High fructan cereal plants
CN102202498B (zh) 2008-07-21 2016-09-07 澳大利亚联邦科学与工业研究组织 改良的棉籽油及应用
EP2458974A4 (en) 2009-07-30 2013-04-03 Commw Scient Ind Res Org BARLEY AND USE THEREOF
NZ610181A (en) 2010-11-04 2015-03-27 Arista Cereal Technologies Pty Ltd High amylose wheat
WO2012103594A1 (en) 2011-02-03 2012-08-09 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Barley with modified ssiii
AR086993A1 (es) 2011-06-20 2014-02-05 Gen Biscuit Masa de galletita
EP3539372B1 (en) 2011-10-04 2023-12-06 Arcadia Biosciences Inc. Wheat with increased resistant starch levels
AU2012327161B8 (en) * 2011-11-04 2016-12-08 Arista Cereal Technologies Pty Ltd High amylose wheat - II
US10323209B2 (en) 2012-04-25 2019-06-18 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation High oleic acid oils
MX2015002075A (es) * 2012-08-24 2016-03-31 Commw Scient Ind Res Org Trigo con nuevos alelos de rht-b1.
BR112015030970B8 (pt) 2013-06-13 2021-09-14 Griffith Laboratories Produtos aglomerados texturados, produto alimentício, método para formar um produto aglomerado texturizado e uso do produto aglomerado texturizado e de amido resistente a rs4 de curto tempo e alta pressão
CN105830184A (zh) * 2013-08-06 2016-08-03 联邦科学与工业研究组织 具有高水平β-葡聚糖的小麦
US10537122B2 (en) 2013-12-17 2020-01-21 Alltech, Inc. Systems and methods for adjusting animal feed
US9672331B2 (en) * 2013-12-17 2017-06-06 Alltech, Inc. Systems and methods for computer models of animal feed
CN103936872B (zh) * 2014-04-29 2015-12-30 四川农业大学 小麦直链淀粉和支链淀粉的纯化方法
JP6882160B2 (ja) 2014-07-07 2021-06-02 コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガナイゼーション 植物脂質から工業製品を製造する工程
CN105671183B (zh) * 2016-03-28 2019-05-07 浙江师范大学 稻米直链淀粉含量微控基因agpl3分子标记及应用
CN106053501A (zh) * 2016-06-22 2016-10-26 江南大学 一种结晶型抗性淀粉含量的测定方法
CA3029641A1 (en) * 2016-07-05 2018-01-11 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation High amylose wheat - iii
BR112019004530A2 (pt) 2016-09-02 2019-10-22 Commw Scient Ind Res Org plantas com traços modificados
CN106706527B (zh) * 2016-11-17 2019-04-05 扬州大学 一种高直链淀粉各组分含量的分析方法
GB201702500D0 (en) * 2017-02-16 2017-04-05 Univ Sheffield Stable vamp reporter assay
CN107058328A (zh) * 2017-06-22 2017-08-18 江苏三黍生物科技有限公司 一种提高植物直链淀粉含量的方法及应用
JP2021521874A (ja) * 2018-05-02 2021-08-30 セレクティスＣｅｌｌｅｃｔｉｓ 増大した食物繊維を含むコムギの操作
CN110218694A (zh) * 2019-05-30 2019-09-10 华中农业大学 一种猕猴桃果实淀粉体提取方法
CN110819654B (zh) * 2019-11-01 2021-08-20 中国农业科学院作物科学研究所 一种通过基因组编辑提高小麦抗性淀粉含量的方法及其技术体系
CN110760532B (zh) * 2019-11-18 2022-08-12 南京农业大学 一种淀粉分支酶及其基因、含有该基因的工程菌及其应用
CA3172525A1 (en) 2020-03-23 2021-09-30 Tanya Jeradechachai Rapid high amylose wheat seed purity test
CN111670692B (zh) * 2020-05-25 2022-05-10 河北省农林科学院农业资源环境研究所 一种低水分苜蓿青贮原料外源性粗灰份控制方法
FR3120318B1 (fr) 2021-03-02 2023-03-03 Arista Cereal Tech Pty Ltd Procédé de meunerie industrielle à rendement augmenté, farines obtenues par ce procédé, produits notamment de panification fabriqués à partir de ces farines

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005001098A1 (en) * 2003-06-30 2005-01-06 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Wheat with altered branching enzyme activity and starch and starch containing products derived thereform
WO2006069422A1 (en) * 2004-12-30 2006-07-06 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Method and means for improving bowel health

Family Cites Families (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3690896A (en) 1970-05-15 1972-09-12 Gen Mills Inc Process for forming a multi-colored food product
US4770710A (en) 1987-07-02 1988-09-13 American Maize-Products Company Novel starch and products produced therefrom
US6013861A (en) 1989-05-26 2000-01-11 Zeneca Limited Plants and processes for obtaining them
US5051271A (en) 1989-11-22 1991-09-24 Opta Food Ingredients, Inc. Starch-derived, food-grade, insoluble bulking agent
NZ239977A (en) 1990-11-14 1993-08-26 Pioneer Hi Bred Int Transforming plants by the use of agrobacterium
KR950703286A (ko) 1992-12-24 1995-09-20 이안 매커티 길모어 저항성 전분을 포함하는 식품 조성물(food compositions including resistant starch)
AU1684697A (en) 1995-12-20 1997-07-14 E.I. Du Pont De Nemours And Company Novel starches via modification of expression of starch biosynthetic enzyme genes
DE69737448T2 (de) 1996-05-29 2007-11-15 Bayer Cropscience Ag Nukleinsäuremoleküle, die für enzyme aus weizen kodieren, welche an der stärkesynthese beteiligt sind
CA2280230A1 (en) 1997-02-21 1998-08-27 Danisco A/S Antisense intron inhibition of starch branching enzyme expression
CA2303407C (en) 1997-09-12 2011-01-04 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Regulation of gene expression in plants
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
ATE526406T1 (de) 1998-03-20 2011-10-15 Commw Scient Ind Res Org Kontrolle der genexpression
CN1202246C (zh) 1998-04-08 2005-05-18 联邦科学和工业研究组织 获得修饰表型的方法和措施
US6635756B1 (en) 1998-06-15 2003-10-21 National Starch And Chemical Investment Holding Corporation Starch obtainable from modified plants
ATE458061T1 (de) 1998-09-10 2010-03-15 Monsanto Uk Ltd Isoformen des stärke-verzweigungsenzyms ii (sbe- iia und sbe-iib) aus weizen
AUPQ005299A0 (en) 1999-04-29 1999-05-27 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Novel genes encoding wheat starch synthases and uses therefor
US6897354B1 (en) 1999-06-04 2005-05-24 National Institute Of Agrobiological Sciences High amylose wheat starch and wheat containing the same
CA2273673A1 (en) 1999-06-04 2000-12-04 Makoto Yamamori High amylose wheat starch and wheat containing the same
AU1122701A (en) 1999-10-29 2001-05-14 National Research Council Of Canada Starch branching enzymes
US7041484B1 (en) 1999-10-29 2006-05-09 National Research Council Of Canada Starch branching enzymes
US6326193B1 (en) 1999-11-05 2001-12-04 Cambria Biosciences, Llc Insect control agent
AUPQ574200A0 (en) 2000-02-21 2000-03-16 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Starch branching enzyme
US20020002713A1 (en) 2000-03-01 2002-01-03 Allen Stephen M. Starch branching enzyme IIb
GB2360521A (en) 2000-03-20 2001-09-26 Danisco Genetic modification of starch in plants
ATE539608T1 (de) 2000-11-09 2012-01-15 Commw Scient Ind Res Org Gerste mit reduzierter ssii-aktivität und stärkehaltige produkte mit reduziertem amylopectingehalt
US20030035857A1 (en) 2001-03-22 2003-02-20 Sroka Pongpun Elisa Process for preparing wheat bread and dough mix for same
US7009092B1 (en) 2001-06-04 2006-03-07 Iowa State University Research Foundation Transgenic corn plants having seeds with modified cornstarch characteristics and method of making the transgenic corn plants
ATE394497T1 (de) 2001-06-12 2008-05-15 Bayer Cropscience Ag Transgene pflanzen die stärke mit hohem amylosegehalt herstellen
WO2003023024A1 (fr) 2001-09-10 2003-03-20 Japan Science And Technology Agency Synthetases d'amidon
US20030213013A1 (en) 2002-05-07 2003-11-13 Caimi Perry G. Fructose polymer synthesis in monocot plastids
AUPS219802A0 (en) 2002-05-09 2002-06-06 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Barley with altered branching enzyme activity and starch and starch containing products with a reduced amylopectin content
US20040231016A1 (en) 2003-02-19 2004-11-18 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization Efficient gene silencing in plants using short dsRNA sequences
ITTO20030533A1 (it) * 2003-07-10 2005-01-11 Atmel Corp Procedimento e circuito per la limitazione di corrente in
KR101274849B1 (ko) 2003-10-27 2013-06-13 코몬웰스 싸이언티픽 엔드 인더스트리얼 리서치 오가니제이션 아밀로스 비율이 증가된 전분을 갖는 쌀 및 이의 생성물
US7993686B2 (en) 2004-12-30 2011-08-09 Commonwealth Scientific And Industrial Organisation Method and means for improving bowel health
PL1833291T3 (pl) 2004-12-30 2017-05-31 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Metoda i środki poprawy stanu zdrowia jelit
BRPI0819669A2 (pt) 2007-11-27 2014-10-07 Commw Scient Ind Res Org Plantas com metabolismo de amido modificado
CA2653883C (en) 2008-07-17 2022-04-05 Colin Leslie Dow Jenkins High fructan cereal plants
EP2458974A4 (en) 2009-07-30 2013-04-03 Commw Scient Ind Res Org BARLEY AND USE THEREOF
NZ610181A (en) * 2010-11-04 2015-03-27 Arista Cereal Technologies Pty Ltd High amylose wheat
WO2012103594A1 (en) 2011-02-03 2012-08-09 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Barley with modified ssiii
EP3539372B1 (en) 2011-10-04 2023-12-06 Arcadia Biosciences Inc. Wheat with increased resistant starch levels
AU2012327161B8 (en) 2011-11-04 2016-12-08 Arista Cereal Technologies Pty Ltd High amylose wheat - II

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005001098A1 (en) * 2003-06-30 2005-01-06 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Wheat with altered branching enzyme activity and starch and starch containing products derived thereform
WO2006069422A1 (en) * 2004-12-30 2006-07-06 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Method and means for improving bowel health

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A reverse genetic nontransgenic approach to wheat crop improvement by TILLING;SLADE ANN J ET AL;《NATURE BIOTECHNOLOGY》;20050101;75-81 *

Also Published As

Publication number Publication date
AR083767A1 (es) 2013-03-20
MX345402B (es) 2017-01-30
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EP2635683B1 (en) 2023-06-07
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CA2816916A1 (en) 2012-05-10
WO2012058730A1 (en) 2012-05-10
US20140044826A1 (en) 2014-02-13
RU2013123023A (ru) 2014-12-10
JP6063869B2 (ja) 2017-01-18
US9585413B2 (en) 2017-03-07
US20170367382A1 (en) 2017-12-28
JP2014501500A (ja) 2014-01-23
AU2011325875A1 (en) 2013-05-02
BR112013011025A8 (pt) 2018-07-03
US11304432B2 (en) 2022-04-19
ZA201304075B (en) 2014-08-27
US20120114770A1 (en) 2012-05-10
EP2635683A4 (en) 2014-05-14
US10750766B2 (en) 2020-08-25
BR112013011025B1 (pt) 2021-03-02
US20200345045A1 (en) 2020-11-05
EP2635683C0 (en) 2023-06-07
CN103298940A (zh) 2013-09-11

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