CN104017829A - 提高植物直链淀粉含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及提高植物直链淀粉含量的方法。本发明提供了淀粉合成途径中适合进行基因工程操作并显著改变植物中淀粉组成的酶，它们是颗粒结合型淀粉合成酶I(GBSS I)、淀粉分支酶I(SBE Ⅰ)和/或淀粉分支酶II(SBE Ⅱ)。本发明还提供了一种可良好地调节植物中淀粉组成的新方法，包括降低上述酶的表达，获得了直链淀粉和支链淀粉含量比例各不相同的一系列转基因植物。本发明还提供了用于调节植物中淀粉组成的构建物或载体。

Description

提高植物直链淀粉含量的方法

本发明是申请号为CN201110401231.X的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明属于植物学以及分子生物学领域；更具体地，本发明涉及调节植物直链和支链淀粉含量的方法。

背景技术

淀粉(starch)是高等植物、藻类和一些微生物细胞的贮藏物质，是无色无臭的白色粉末，广泛存在于各种植物中。淀粉的性质与其结构有着密切的关系，不同直链淀粉含量的淀粉在性质上有着巨大的差异，直接影响着其在工业上的应用。在淀粉的分布上，尤以植物种子(如米、麦、玉米)和块根块茎(如木薯、甘薯、马铃薯)含量丰富，可作为工业上制取淀粉的原料，例如可由玉米、甘薯、马铃薯、野生橡子、葛根等含淀粉的物质中提取而得。淀粉除食用外，工业上用于制糊精、麦芽糖、葡萄糖，也用于调制印花浆、纺织品的上浆、纸张的上胶、药物片剂的压制等。

淀粉是由许多葡萄糖分子缩合而成的多糖，有直链和支链两种。直链淀粉由α-1，4糖苷键连接的葡萄糖分子组成，呈线状链；支链淀粉在分支处有α-1，6糖苷键连接，其直链部分也是α-1，4连接。一般的淀粉为直链及支链淀粉的混合物，直链淀粉和支链淀粉在淀粉中所占的比例随植物的种类而异，在多数含有淀粉的植物中，通常含有20～30％直链淀粉、70～80％支链淀粉。在哺乳动物的消化道中，淀粉经淀粉酶、麦芽糖酶等作用，水解为葡萄糖，被吸收利用。粮食作物食用品质的优劣在很大程度上与作物中淀粉的组成，即直链淀粉与支链淀粉的比例有关。

目前，以植物块根(如薯类植物块根)为原料的淀粉加工业处于发展阶段，但各种产品的加工对原材料的淀粉品质(如直链淀粉和支链淀粉的含量比例)提出了多样化的需求。依靠传统育种来改变淀粉品质，耗时长，需要大量人力物力，难以满足淀粉加工业的急切需求。

本领域人员已经尝试通过调节淀粉合成的主要基因来调节植物中淀粉的组成和含量，然而与淀粉合成相关的蛋白有许许多多，包括：右旋糖酐蔗糖酶(Dextransucrase，EC:2.4.1.5)、β-1,3-葡聚糖合成酶(1,3-beta-glucan synthase，EC:2.4.1.34)、内切-β-1,3-葡聚糖酶(glucan endo-1,3-beta-D-glucosidase，EC:3.2.1.39)和外切-β-1,3-葡聚糖酶(glucan1,3-beta-D-glucosidase，EC:3.2.1.58)、蔗糖磷酸合成酶(Sucrose Phosphate Synthase，SPS，EC:2.4.1.14)、蔗糖合成酶(SucroseSynthase，SuSy，EC:2.4.1.13)和外切型纤维素水解酶(Cellulose1,4-beta-cellobiosidase，EC:3.2.1.91)、外切型纤维素水解酶(Cellulose1,4-beta-cellobiosidase，EC:3.2.1.91)、葡萄糖-1-磷酸胞嘧啶转移酶(glucose-1-phosphate cytidylyltransferase，EC:2.7.7.33)、外切多聚半乳糖醛酸酶(galacturan1,4-alpha-galacturonidase，exo-PG，EC:3.2.1.67)、淀粉分支酶(1,4-alpha-glucan branching enzyme，SBE，EC:2.4.1.18)和β-淀粉酶(beta-amylase，EC:3.2.1.2)等等。因此，找到适于基因工程操作的蛋白成为本领域发展的瓶颈。

综上，通过基因工程手段培育直链淀粉和支链淀粉的比例各不相同的植物对于淀粉工业化生产是迫切需要的。因此，如何找到合适的靶基因是值得深入研究的课题；如何找到合适的方法来调节相关基因也是值得深入研究的。

发明内容

本发明的目的在于提供调节植物直链和支链淀粉含量的方法。

本发明的另一目的在于提供调节植物直链和支链淀粉含量的构建物。

在本发明的第一方面，提供一种调节植物中直链淀粉含量的方法，所述方法包括：抑制颗粒结合型淀粉合成酶I(Granule-Bound Starch Synthase I，GBSSI)、淀粉分支酶I(SBEI)和/或淀粉分支酶II(SBEⅡ)的表达。

在一个优选例中，所述的方法为提高植物中直链淀粉含量(即降低植物中支链淀粉含量)，包括：抑制淀粉分支酶I和/或淀粉分支酶II的表达。

在另一优选例中，所述的方法为降低植物中直链淀粉含量(即提高植物中支链淀粉含量)，包括：抑制颗粒结合型淀粉合成酶I的表达。

在另一优选例中，以颗粒结合型淀粉合成酶I、淀粉分支酶I和/或淀粉分支酶II多核苷酸序列中的保守性区域为靶点抑制颗粒结合型淀粉合成酶I、淀粉分支酶I和/或淀粉分支酶II的表达。

在另一优选例中，所述的保守性区域包含：

颗粒结合型淀粉合成酶I中SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；

淀粉分支酶I中SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；

淀粉分支酶II中SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；或

淀粉分支酶I中SEQ ID NO:6中第1-165位所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，将构建物或含有该构建物的载体转染到植物中；所述的构建物含有式(I)所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向   式(I)，

式(I)中，

Seq_正向具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列，具有SEQ ID NO:6所示核苷酸序列，具有SEQ ID NO:7所示核苷酸序列，具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7串联而成的核苷酸序列，或具有SEQ ID NO:6中第1-165位和SEQ ID NO:7串联而成的核苷酸序列

Seq_反向具有与Seq_正向互补的核苷酸序列；

X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补。

在另一优选例中，在Seq_正向之前，还包含一启动子，所述启动子是组成型启动子或组织特异性启动子。

在另一优选例中，该启动子为CaMV35S启动子或p54/1.0启动子。

在另一优选例中，所述的Seq_正向具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7串联而成的核苷酸序列，或具有SEQ ID NO:6中第1-165位和SEQ ID NO:7串联而成的核苷酸序列；或

所述的启动子是p54/1.0启动子。

在另一优选例中，所述的Seq_正向具有SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，或具有SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。

更佳地，所述的Seq_正向具有SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述方法包括：

(1)提供携带所述的构建物或含有该构建物的载体的农杆菌；

(2)将植物细胞、组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述构建物转入植物细胞；并整合到植物细胞的染色体上；和

(3)选择转入了构建物的植物细胞、组织或器官，再生成植株。

在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，选自：

具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的多核苷酸；

具有SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的多核苷酸；

具有SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的多核苷酸；

具有SEQ ID NO:6中第1-165位所示核苷酸序列的多核苷酸；

具有SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的多核苷酸；或

具有SEQ ID NO:10所示核苷酸序列的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的多核苷酸选自：具有SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的多核苷酸或具有SEQ ID NO:10所示核苷酸序列的多核苷酸。基于所述的多核苷酸制备的构建物或载体被导入植物后，可使得植物中直链淀粉含量超过50％；55％，60％，更佳地超过65％，70％，更佳地超过75％；85％，90％，95％，更佳地接近100％。

在另一优选例中，所述的多核苷酸不包括编码全长的GBSSI、SBEI或SBEII基因的多核苷酸或基因组基因。

在本发明的另一方面，提供所述的多核苷酸的用途，用于制备调节植物中直链淀粉含量的构建物或干扰分子。

在本发明的另一方面，提供一种的构建物，含有式(I)所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向   式(I)，

式(I)中，

Seq_正向具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列，具有SEQ ID NO:6所示核苷酸序列，具有SEQ ID NO:7所示核苷酸序列，具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7串联而成的核苷酸序列，或具有SEQ ID NO:6中第1-165位和SEQ ID NO:7串联而成的核苷酸序列；

Seq_反向具有与Seq_正向互补的核苷酸序列；

X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补。

在另一优选例中，式(I)所示的结构在转入植物细胞转录后，形成式(II)所示的二级结构：

式(II)中，Seq_正向、Seq_反向和X的定义如上述，

||表示在Seq_正向和Seq_反向之间的互补的关系。

在另一优选例中，所述的间隔序列(内含子序列)本身不构成互补双链结构，其长度是在50-200nt(较佳的是60-150nt；更佳的是70-100nt)。

在另一优选例中，在Seq_正向之前，还包含与之操作性连接的启动子，该启动子为CaMV35S启动子或p54/1.0启动子。

在另一优选例中，所述的Seq_正向具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7串联而成的核苷酸序列，或具有SEQ ID NO:6中第1-165位和SEQ ID NO:7串联而成的核苷酸序列；或

所述的启动子是p54/1.0启动子。

在另一优选例中，所述的多核苷酸选自：具有SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的多核苷酸或具有SEQ ID NO:10所示核苷酸序列的多核苷酸。更佳地，所述的Seq_正向具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7串联而成的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供一种载体，所述的载体含有所述的构建物。

在本发明的另一方面，提供所述的构建物或所述的载体的用途，用于导入到植物中，从而调节植物中直链淀粉的含量。

在另一优选例中，所述的构建物或载体还用于：

调节植物中的淀粉糊化特性；

调节植物中的淀粉粘度特性；

改变植物中淀粉颗粒的形态(较佳地，抑制淀粉分支酶I和/或淀粉分支酶II的表达，提高植物中直链淀粉含量，使得植物中淀粉颗粒改变为球形和/或使得植物中淀粉颗粒增大)。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、含目标基因发夹结构(以SBE Ⅰ为例)的中间载体构建。

图2、构建的干扰木薯和甘薯SBE基因的表达盒，并将这些结构分别插入到载体中。

图3目标基因发夹结构(以SBE Ⅰ为例)构建到双元表达载体pP35RNAi和pP54RNAi中。

图4、p54/1.0启动子的微管特异性表达：A、野生型叶片，B、CaMV35S::GUS叶片，C、p54/1.0::GUS叶片，D、野生型块根，E、CaMV35S::GUS块根，F、p54/1.0::GUS块根。

图5、转基因株系的Southern Blot检测：M、λ-HindⅢMarker，1、野生型徐薯22，2、野生型苏薯2号，3、野生型苏薯9号，4、23195095(转入了35S::GBSSIRNAi)，5、23202007(转入了p54::SBEIIRNAi)，6、23201033(转入了35S::SBEIIRNAi)，7、23196001(转入了p54::GBSSIRNAi)，8、11198023(转入了p54::ProRNAi(即p54::UTRRNAi))；9、23196068(转入了p54::GBSSIRNAi)，10、352(转入了35S::GBSSIRNAi)，11、23196104(转入了p54::GBSSIRNAi)，12、23196057(转入了p54::GBSSIRNAi)；13、23196044(转入了p54::GBSSIRNAi)，14、23196052(转入了p54::GBSSIRNAi)，15，23196055(转入了p54::GBSSIRNAi)，16、23196105(转入了p54::GBSSIRNAi)，17、23201012(转入了35S::SBEIIRNAi)，18、23201038(转入了35S::SBEIIRNAi)；19、07195002(转入了35S::GBSSIRNAi)，20、23196014(转入了p54::GBSSIRNAi)，21、23196021(转入了p54::GBSSIRNAi)；22、13201025(转入了35S::SBEIIRNAi)，23、13201026(转入了35S::SBEIIRNAi)，24、13201034(转入了35S::SBEIIRNAi)，25、23201011(转入了35S::SBEIIRNAi)，26、23201015(转入了35S::SBEIIRNAi)；27、23206004(转入了p54::SBEIf-SBEIIRNAi)，P、质粒阳性对照。

图6、转基因株系的直链淀粉含量分布图。横坐标表示不同的转基因株系的计数。

图7、转基因株系直链淀粉含量分布统计。

图8、不同直链淀粉含量甘薯淀粉的糊化曲线(单株样本示例)。右侧的百分数表示直链淀粉的含量；梯形折线表示加热升温线。

图9、野生型(A、C)与高直链含量(B、D)淀粉粒加热前(A、B)后(C、D)倒置光学显微镜观察。

图10、提高直链淀粉含量对甘薯淀粉粒形状的影响：A、野生型(28.6±3.1％)，B、23206006(67.0±5.6％)，C、23204014(89.4±0.4％)，D、23204016(76.7±24.7％)。

图11、与野生型(B、E、H、K)比较降低(A、D、G、J)或提高(C、F、I、L)直链淀粉含量对甘薯叶片(A、B、C)，叶柄(D、E、F)，茎段(G、H、I)和块根(J、K、L)内淀粉粒形态的影响。

具体实施方式

鉴于目前的淀粉加工业中，各种产品的加工对原材料的淀粉品质(特别是直链淀粉和支链淀粉的含量比例)具有不同的要求，为了获得组织中直链淀粉和支链淀粉含量比例各不相同的植物，本发明人致力于对淀粉合成途径中相关的各种酶进行研究和筛选，找到了该途径中适合进行基因工程操作并显著改变植物中淀粉组成的酶，它们是颗粒结合型淀粉合成酶I(Granule-Bound StarchSynthase I，GBSSI)、淀粉分支酶I(SBE Ⅰ)和/或淀粉分支酶II(SBE Ⅱ)。基于此，本发明还开发了一种可良好地调节植物中淀粉组成的新方法，包括改变上述酶的表达，获得了直链淀粉和支链淀粉含量比例各不相同的一系列转基因植物。

术语

如本文所用，所述的“直链淀粉含量(百分含量)”为：植物组织(如种子、块茎或块根)中(直链淀粉量/淀粉总量)×100％。所述的“淀粉总量”等于：植物组织中(直链淀粉量+支链淀粉量)。

如本文所用，所述的“支链淀粉含量(百分含量)”等于：植物组织中(支链淀粉量/淀粉总量)×100％。

甘薯淀粉中直链淀粉含量的测定依据：中华人民共和国国家标准GB/T15683-2008/ISO6647-1：2007。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，所述的“操作性连接”或“操作性相连”或“可操作地连接”可互换使用，指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“操作性连接”到该核酸序列上。

如本文所用，所述的“植物”是指具有淀粉合成途径且在其组织或器官中含有淀粉的植物，包括(但不限于)：块根植物、块茎植物或种子中含有淀粉的植物。所述的植物例如但不限于：薯类植物、块茎类植物、种子类植物。所述的块根植物例如木薯(Manihot esculenta)、甘薯(Ipomoea batatas)、山药(Dioscorea sp.)；所述的块茎类植物例如马铃薯(Solanum tuberosum)。所述的种子类植物例如禾本科植物；包括但不限于：水稻、小麦、高粱、黑麦、玉米等。更特别的，所述的植物是薯类植物。

如本文所用，术语“RNA干扰(RNA interference，RNAi)”是指一些RNA可以特异地阻断体内特定基因的表达，促使mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，其也称为RNA干预或者干涉。RNA干扰是高度特异的在mRNA水平上的基因沉默机制。

如本文所用，“互补”的序列通常是指将5’-3’方向的序列转换为其3’-5’方向的序列(如5’ATCG3’→GCTA)，然后再取其互补序列(如GCTA→5’CGAT3’)。本发明所述的“互补”包括“完全互补”以及“基本上互补”。“基本上互补”是指两段核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如发夹结构，hpRNA)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70％的核苷酸是互补的；优选的，至少有80％的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90％的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95％的核苷酸是互补的；如96％、98％、99％或100％。对于基因的RNAi这一领域熟悉的技术人员均公知，干扰RNA与靶基因的互补结合可以是不完全互补的，但完全能够达到基因沉默的目的。

如本文所用，“发夹”结构又称为“茎环”结构，是指一种核酸构建物，其可形成一种包括双链区域(茎部，含有本发明的多核苷酸)的二级结构，所述的双链区域由该构建物的两个区域(位于同一条多聚核苷酸链上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域(内含子)。即使该构建物的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。

如本文所用，所述的“启动子”或“启动子区(域)”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中，所述的启动子或启动子区包括启动子的变体，其通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。

如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

靶基因

本发明人针对多种淀粉合成途径中的基因进行了研究，发现抑制颗粒结合型淀粉合成酶I(GBSS I)、淀粉分支酶I(SBE Ⅰ)和/或淀粉分支酶II(SBE Ⅱ)的表达可有效地调节植物中淀粉的组成，获得直链淀粉和直链淀粉比例各异的一系列植株。其中，抑制所述的GBSS I的表达可以显著降低植物中直链淀粉的含量，提高支链淀粉的含量；分别或同时抑制SBE Ⅰ和SBE Ⅱ的表达可显著提高植物中直链淀粉的含量，降低支链淀粉的含量。

所述的GBSSI基因的序列可与SEQ ID NO:1所示的序列(甘薯来源)基本上相同。本发明也包括与SEQ ID NO:1所示序列的基因为同源基因的其它植物来源的GBSS I基因。

SBE基因在支链淀粉合成中能够水解1,4-糖苷键，并引入1,6-糖苷键分支点。在植物体内，可以找到两种类型的SBE基因，SBE I和SBE II，根据遗传学方法研究SBE I和SBE II突变体发现，SBE I对直链淀粉的亲和性比SBE II要高，倾向于转移较长的分支链，两者对于支链淀粉的结构起着重要的决定作用。如果能将这两种酶的活性抑制掉，则支链淀粉的比例会随着抑制效果的不同而得到不同程度的下降，另一组分直链淀粉的比例将相应提高。

所述的SBE Ⅰ基因的序列可与SEQ ID NO:2所示的序列(甘薯来源)或SEQ ID NO:11所示的序列(木薯来源)基本上相同。本发明也包括与SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:11所示序列(NCBI Accession No.X77012.1)的基因为同源基因的其它植物来源的SBE Ⅰ基因。

所述的SBE Ⅱ基因的序列可与SEQ ID NO:3所示的序列(甘薯来源)或SEQ ID NO:12所示的序列(木薯来源)基本上相同。本发明也包括与SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:12所示序列的基因为同源基因的其它植物来源的SBE Ⅱ基因。

进一步地，本发明人在反复比较的基础上确定了分别对于干扰植物中GBSSI、SBE Ⅰ或SBE Ⅱ的基因表达异常有效的多核苷酸，其通过在导入植物后被植物细胞剪切或加工形成小分子RNA而有效地干扰GBSSI、SBE Ⅰ或SBE Ⅱ的基因表达。目前已知的小分子干扰方式有以下几种：miRNA调控的基因沉默，正义RNA引起的共抑制(Cosuppression)，反义RNA抑制，病毒介导的基因沉默(Virus Induced Gene Silencing，VIGS)，发卡式RNA(hairpinRNA，hpRNA)介导的基因沉默。植物中正义RNA，反义RNA介导的基因沉默的效率比较低，成功转基因的报道很少见，microRNA对于植物的调控机理研究所知更少，目前停留在基础研究阶段，利用miRNA进行转基因的应用研究甚少。本发明人发现，当用于干扰GBSSI、SBE Ⅰ或SBE Ⅱ的基因表达时，采用hpRNA技术与基于miRNA等原理的干扰方式相比，具有显著的优势，干扰效果非常好。

因此，本发明提供一种分离的多核苷酸片段，所述的多核苷酸片段(基因片段)来源于GBSSI、SBE Ⅰ或SBE Ⅱ基因的一部分，其长度是100-800bp；较佳的是150-700p；更佳的约200-650bp。所述的多核苷酸片段既是一种靶基因片段，又可以作为设计干扰分子(构建物)的材料，用于通过转基因的手段制备直链淀粉和直链淀粉含量比例各异的植物。优选地，所述的多核苷酸选自：核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的多核苷酸片段，其是来源于GBSSI基因的多核苷酸片段；核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的多核苷酸片段，其是来源于SBE Ⅰ基因的多核苷酸片段；核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的多核苷酸片段，其是来源于SBE Ⅱ基因的多核苷酸片段；核苷酸序列如SEQ ID NO:6中第1-165位所示的多核苷酸片段，其是来源于SBE Ⅰ基因的多核苷酸片段；核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示的多核苷酸片段，其是来源于SBE Ⅰ基因和SBE Ⅱ基因的融合基因；或核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示的多核苷酸片段，其是来源于SBE Ⅰ基因和SBE Ⅱ基因的融合基因。所述的多核苷酸片段的制备方法是本领域技术人员熟知的，例如通过基因工程方法或通过人工合成的方法。

作为本发明的优选方式，所述的多核苷酸片段选自：核苷酸序列如SEQ IDNO:9所示的多核苷酸片段或核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示的多核苷酸片段。本发明人通过深入研究和巧妙设计将SBE Ⅰ基因和SBE Ⅱ基因上的上述靶序列片段融合于一条序列中，且在导入植物细胞内后可以更高效地发挥基因沉默地作用，在效果上显著优于分别将SBE Ⅰ基因和SBE Ⅱ基因构建于不同构建物中导入植物细胞内的情况，分析转基因株系可以发现这样构建的转基因植株直链淀粉含量显著更高，成功率更高。基于所述的多核苷酸片段制备的hpRNA构建物或载体被导入植物后，可使得植物中直链淀粉含量在总淀粉含量中所占比例超过50％；55％，60％，更佳地超过65％，70％，更佳地超过75％；85％，90％，95％，更佳地接近100％。目前的报道的关于甘薯的直链淀粉含量(包括RNAi技术改造的)没有本发明的直链淀粉含量高。融合序列当用于转化时，从操作上简化了流程和时间。

作为本发明的优选方式，所述的多核苷酸片段是如SEQ ID NO:5所示的多核苷酸片段。基于该多核苷酸设计的hpRNA构建物在导入到植物细胞内后形成的小分子RNA可特别有效地抑制植物细胞内GBSSI的表达，可提高植物中支链淀粉含量至90％以上，较佳地95％以上，更佳地接近100％。

本发明对所述多核苷酸片段的制备方法没有特别的限制，包括但不限于：化学合成法，体外转录法等。应理解，本领域技术人员可以以各种途径制备出所述的多核苷酸片段。

构建物

根据本发明所提供的多核苷酸序列，可设计出在被导入植物中后可被植物加工成干扰GBSSI、SBE Ⅰ或SBE Ⅱ的基因表达的多核苷酸构建物，从而通过影响GBSSI、SBE Ⅰ或SBE Ⅱ的基因表达来调节植物中淀粉的组成。因此，本发明提供了一种分离的或人工构建的多核苷酸构建物，所述的多核苷酸构建物可被植物细胞转录且在细胞内表达成所述的小分子RNA。作为本发明的一种优选方式，所述的多核苷酸构建物含有式(I)所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向   式(I)，

Seq_正向为核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的多核苷酸片段，核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的多核苷酸片段，核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的多核苷酸片段，核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示的多核苷酸片段或核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示的多核苷酸片段；Seq_反向为与Seq_正向互补的多核苷酸片段；X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补。间隔序列并非是靶基因的互补序列，间隔序列的特点及其设计方法对于本领域技术人员而言是熟知的。且目前现有技术中很多商业化的载体中也包括了一些间隔序列，是本领域技术人员易于获得的。

式(I)所示的结构在导入到植物体内转录后，可折叠成稳定的发夹结构(茎环结构)，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。也即，形成式(II)所示的二级结构：

||表示在Seq_正向和Seq_反向之间的基本上互补的关系。

所述的发夹结构可被植物体内的各种物质进一步作用、加工或剪切，并且形成具有基因干扰作用的RNA。

为了更特异地、更高效地下调GBSSI、SBE Ⅰ或SBE Ⅱ的基因表达，本发明人作了广泛地研究，找到了效果较为优异的启动子。因此，作为本发明的优选方式，在Seq_正向之前，还包含一启动子，该启动子为CaMV35S启动子或p54/1.0启动子。最优选的，所述的启动子是p54/1.0启动子(维管束特异表达启动子)，在该启动子的驱动下，所述构建物可特异地在植物体内有效地形成干扰RNA，干扰效果优异，形成直链淀粉和支链淀粉含量比例完全不同于野生型的植株。

通常，所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。例如，所述的载体是pCAMBIA系列的载体(如pCAMBIA1300、pCAMBIA1301)或基于该系列载体改造的载体。

包含上述的适当基因序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主。所述的宿主通常是含有GBSSI、SBE Ⅰ或SBE Ⅱ基因的植物细胞(例如是甘薯细胞)，或也可以是任何适合于携带所述表达载体并能够将所述表达载体传递给植物细胞的细胞，例如所述的宿主为农杆菌。对于发生转化的植物细胞、组织、或器官可以用本领域已知的常规方法再生成植株，从而获得所需的转基因植物。

调节植物直链和支链淀粉含量的方法

本发明还涉及一种调节植物中淀粉组成的方法，该方法包括：抑制(干扰)植物中GBSSI、SBE Ⅰ或SBE Ⅱ基因的表达，该方法可获得一系列直链淀粉和支链淀粉含量比例各异的植株，从而可用于不同的工业化目的。

优选地，基于本发明的多核苷酸片段来制备在导入植物细胞后可特异性干扰GBSSI、SBE Ⅰ或SBE Ⅱ基因的表达的多核苷酸构建物，将该构建物导入到植物细胞，从而调节植物中淀粉的组成。

作为本发明的优选方式，一种调节植物中淀粉组成的方法是：

(1)提供携带所述的构建物(式(I)构建物)或含有该构建物的载体的农杆菌；

(2)将植物细胞、组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述构建物的目标序列插入到植物基因组上；和

(3)选择出基因组改变的植物细胞、组织或器官，再生成植株。

其中，可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施以上的方法。

所述植物细胞、组织或器官再生成植株后，该转基因植物中相应的GBSSI、SBE Ⅰ或SBE Ⅱ基因的表达与野生型植物不同。

本发明还包括利用前述方法获得的植物，所述的植物包括：转入了所述构建物的转基因植物；或者组织或器官(如种子、块根)中GBSSI、SBE Ⅰ或SBE Ⅱ基因表达量降低(包括低表达或不表达)的植物等。

可以从这些转基因植物中选择组织或器官中GBSSI、SBE Ⅰ或SBE Ⅱ基因表达量降低的植物，用于培植植物的后代(如杂交后代)，所述的植物后代的淀粉组成与野生型不同。

定性或定量测定植物中淀粉的含量以及淀粉组成(即直链淀粉与支链淀粉的含量或比例)的方法是本领域人员熟知的。除非另外说明，植物中淀粉含量的测定按照国家标准和公知技术，例如甘薯的直链淀粉含量的测定遵循中华人民共和国国家标准GB/T15683-2008/ISO6647-1：2007。此外，在分子水平上鉴定淀粉中直链和支链淀粉含量及比例，以及淀粉在工业生产中的各项指标(如黏度，糊化温度等)的方法也是本领域已知的。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社(2002)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

I.材料和方法

1.材料

1.1甘薯(Ipomoea batatas[L.]Lam.)

5个品种(Ayamurasaki，苏薯11号，苏薯2号，苏薯9号，徐薯22)的胚性悬浮细胞系作为受体材料进行根癌农杆菌介导的转基因研究，另一品种(徐25-2；用作杂交分析的亲本材料。

1.2菌株、质粒、试剂盒、抗生素和培养基

1.2.1菌株

大肠杆菌(Escherichia coli)：DH5α，TOP10。

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)：LBA4404(Rif^rChl^r)参见van derFits L,Deakin EA,Hoge JH,Memelink J.The ternary transformation system:constitutive virG on a compatible plasmid dramatically increasesAgrobacterium-mediated plant transformation.Plant Mol Biol.2000Jul；43(4):495-502。

1.2.2质粒

pCAMBIA1301(Kan^r，CAMBIA，Black Mountain，Australia)，pBSRNAi(pBluescriptSK骨架，Amp^r)，pP35RNAi(pCAMBIA1300骨架，Kan^r)，pP54RNAiB(pP35RNAi骨架，Kan^r)，pP54::GUS(pCAMBIA1301骨架，Kan^r)。

其中，pBSRNAi如下构建：在商购载体pBluescriptSK自身的ClaI、XhoI酶切位点之间插入91nt的intron(ctcgagcgctcgtacctgcatgatatcataaaaccatggaaaatgttagccaaaaaaatggaaaagaagaaataaataatttaaatatcga)，获得pBSRNAi载体。在该Intron两端分别带有Kpn Ⅰ/Cla Ⅰ位点、Xho Ⅰ/BamH Ⅰ酶切位点，从而后续可插入正反向的DNA序列片段，构建发夹结构。

pP35RNAi如下构建：将上述pBSRNAi中发夹结构部分利用KpnI和BamHI双酶切连接到pCAMBIA1300中CaMV35S启动子之后；

pP54RNAiB如下构建：将上述pP35RNAi中CaMV35S启动子利用KpnI和XbaI双酶切替换成p54/1.0启动子；其中，p54/1.0启动子的克隆参见PengZhang，Planta(2003)218:192–203。

pCAMBIA1301(CaMV35S::GUS)为商业化载体(Kan^r，CAMBIA，BlackMountain，Australia)。

pP54::GUS(p54/1.0::GUS)如下构建：将pCAMBIA1301(CaMV35S::GUS)中CaMV35S启动子利用KpnI和XbaI双酶切替换成p54/1.0启动子。

1.2.3试剂盒

琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(博大泰克，天根，北京)；

植物总RNA提取试剂盒(天根，北京)；

PCR产物回收试剂盒(天根，北京)；

质粒小抽试剂盒(天根，北京)；

Real-time PCR检测试剂盒(TOYOBO，上海)；

PCR法DNA探针标记试剂盒(Roche Applied Science，Mannheim，Germany)；

Southern Blot检测试剂盒(Roche Applied Science，Mannheim，Germany)。

1.2.4抗生素和培养基

所用抗生素如表1。所用培养基如表2。

表1抗生素的用途和浓度

表2培养基名称、用途和组分

^*固体培养基附加15g/L琼脂，pH＝7.0，所有植物培养基灭菌前调节pH＝5.8。

1.2.5其他

Reverse Transcription System(TaKaRa，Shuzou，Kyoto，Japan)；

核酸分子量标准：PCR Ladder，KB Ladder，DL2000，λ-HindⅢ；

MS培养基(含维生素，Duchefa，Harlem，Netherlands)。

2,4-D，6-BA，乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)，Gelrite(Sigma，St.Louis，MO，USA)。

2.方法

2.1淀粉品质改良载体构建

DNA琼脂糖凝胶电泳、目的片段酶切、纯化和连接参考分子克隆实验指南和相关试剂盒或产品说明书。

2.1.1干扰片段扩增

甘薯GBSS I、SBE I和SBE II基因序列信息均来自NCBI公共数据库。其中，甘薯GBSS I基因序列如SEQ ID NO:1所示、SBE I基因序列如SEQ ID NO:2所示，SBE II基因序列如SEQ ID NO:3所示。利用以上序列通过序列比对分析各选取保守序列构建干扰表达载体。

针对GBSS Ⅰ、SBE Ⅰ、SBE Ⅱ的保守区域(分别是SEQ ID NO:5，SEQ IDNO:6，SEQ ID NO:7)分别设计含Kpn Ⅰ和Cla Ⅰ位点的特异引物进行扩增，再将酶切位点换成Xho Ⅰ和BamH Ⅰ扩增同一片段用作反向重复序列，片段长度依次为280bp、300bp、300bp；针对SBEⅡ扩增其ORF上游从TATA box之前到起始密码子之后一段490bp的序列(SEQ ID NO:8)；利用Xho Ⅰ的同尾酶Sal Ⅰ将SBE Ⅰ和SBE Ⅱ片段连接后经PCR扩增获得二者471bp的融合片段(SEQ ID NO:9)和606bp的融合片段(SEQ ID NO:10)，中间融合处为Taq Ⅰ位点不影响后续酶切工作。各引物见表3。

2.1.2RNAi中间载体构建

中间载体构建如图1(以SBE Ⅰ为例)：pBSRNAi先利用Kpn Ⅰ和Cla Ⅰ酶切，将扩增获得的正向链插入到pBSRNAi的Kpn Ⅰ和Cla Ⅰ酶切位点内；之后利用Xho Ⅰ和BamH Ⅰ酶切前述获得的载体，将扩增获得的反向链插入到pBSRNAi的Xho Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点之间。扩增正向链和反向链的引物如表3。在插入正向链后菌落PCR选取单克隆测序验证片段正确性，在插入反向链后利用外侧引物(表3，FP和RP)或内含子上引物(表3，IFP和IRP)PCR选取单克隆，抽提质粒酶切、PCR验证所构建发夹结构的正确性。其中内含子为中间载体自带的无关序列，与载体上的其它序列不互补，长度为91nt。

表3、载体构建及鉴定用引物列表

^*下划线示限制性内切酶识别位点，不含酶切位点的引物用于载体的PCR鉴定。

如构建针对SBE Ⅰ的RNAi中间载体相似地，构建了针对SBE II的RNAi中间载体，以及针对GBSS Ⅰ的中间载体，经PCR验证所构建发夹结构正确。

融合基因的RNAi分子的构建与前述的方法类似，即先获得融合序列SEQID NO:9或SEQ ID NO:10，分别将正向链引入载体pBSRNAi的Kpn Ⅰ和Cla Ⅰ酶切位点之间，反向链引入载体的Xho Ⅰ和BamH Ⅰ之间，形成带有发夹结构的载体。

获得的用于干扰SBE基因表达的表达盒示意图如图2。

2.1.3pP54RNAiB改造

pP54RNAiB中1805bp处的BamH Ⅰ位点对干扰表达载体的构建带来不便，利用PCR定点突变的方法将BamH Ⅰ位点5’GGATCC3’突变为5’GGATCT3’，然后通过Xba Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切置换掉含BamH Ⅰ切点的原p54/1.0启动子，改造后获得的质粒称为pP54RNAi，菌落PCR选取单克隆抽提质粒酶切验证是否突变成功。

2.1.4RNAi表达载体构建

通过Kpn Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切将中间载体上已构建的各发夹结构置换到pP35RNAi和pP54RNAi中构成最终RNAi表达载体，如图3所示(以SBE Ⅰ为例)。所有载体在导入根癌农杆菌前后作PCR和酶切验证。

综上，获得了如表4的质粒。

表4

其中，P54是p54/1.0的简称；35S是CaMV35的简称。

2.2PCR反应

2.2.1PCR反应体系

根据目的选用不同保真度的DNA聚合酶，以Ex-Taq(TaKaRa，Shuzou，Kyoto，Japan)扩增目的片段。反应体系如下：ddH₂O38μL；10×Ex-Taq Buffer5μL；dNTP(2.5mmol/L)4μL；Ex-Taq0.25μL；正向引物(20mmol/L)1μL；反向引物(20mmol/L)1μL；模板1μL。

2.2.2PCR反应条件

PCR反应的退火温度和延伸时间分别由引物对(理论T_m值减4-5℃)和扩增长度(1kb/min)决定。反应条件为：94℃变性4min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1min，40个循环数；72℃延伸10min，16℃保温。PCR引物详情见表3。

2.3大肠杆菌转化

2.3.1感受态细胞制备

超低温冰箱储存的大肠杆菌TOP10或DH5α经划线培养、挑取单菌落振摇培养、预冷收集菌体、CaCl₂重悬和分装后液氮速冻，超低温冰箱保存备用。

2.3.2转化

将连接液或质粒加入快速融化的感受态细胞中，冰镇25-30min，42℃热激90s，冰镇3-5min，加入800μL液体LB于37℃摇1-2h，4000rpm离心1min，吸去800μL上清液，其余200μL吸打均匀，涂筛选LB平板37℃培养10-16h。

2.4根癌农杆菌转化

2.4.1感受态细胞制备

取超低温冰箱储存的根癌农杆菌LBA4404，在YEB平板(Rif25mg/L，Chl75mg/L)上划线28℃培养，挑取单菌落于5mL液体YEB(Rif25mg/L，Chl75mg/L)中，200rpm培养过夜后按1:50的比例放大接种到相同液体培养基中，培养至OD₆₀₀为0.5-1.0，5000rpm于4℃离心10min收集菌体，用1/2培养体积的70mmol/L CaCl₂重悬，离心弃上清，菌体最后用l/10培养体积的70mmol/LCaCl₂重悬，100μL分装，液氮速冻，超低温冰箱保存备用。

2.4.2转化

按每100μL感受态细胞加1μg DNA的量将质粒加到快速融化的菌液中，冰镇30min，液氮冷冻1min，37℃水浴解冻后加入1mL液体YEP于28℃轻摇培养2-4h，4000rpm离心1min，吸去1mL上清，剩余约100μL吸打均匀，涂筛选YEB平板28℃培养2-3天。

2.5甘薯遗传转化

2.5.1侵染和共培养

含双元载体的根癌农杆菌在含相应抗生素的液体YEB中培养至OD₆₀₀值为0.5-1.0，6000rpm于4℃离心10min收集菌体，相同体积的LCP-AS侵染液重悬清洗菌体后再次离心，沉淀悬浮于1/2体积的LCP-AS中调节OD₆₀₀至1.0备用。悬浮培养获得的甘薯胚性愈伤组织用LCP清洗控干培养液后，浸没于准备好的侵染液中，抽真空10-20min后控干侵染液，然后转移至滤纸上(平铺于SBM-AS上)，于光照培养箱中共培养4-7天，参数设定为温度25℃，相对湿度50％，16h光照，8h黑暗，光强约为50μmol m^-2s^-1。

2.5.2筛选和植株再生

共培养后的愈伤组织用无菌水清洗三次，500mg/L羧苄青霉素或200mg/L头孢霉素清洗两次，转移至含潮霉素的培养基上进行筛选和再生，培养1-2月后将获得的抗性胚状体转移到不含潮霉素的培养基上，继续培养并萌发形成甘薯小植株。

2.6杂交后代的获得

为调查外源基因在有性生殖过程中的遗传稳定性，将选定的转基因植株和亲本(徐25-2)苗尖作为接穗嫁接到普通牵牛(Ipomoea purpurea)砧木上，存活后短日照处理催花、交叉授粉收获种子，甘薯杂交制种在泰安农科院完成。获得甘薯种子后，置于有湿透滤纸的平皿内25℃下光照培养，待种子萌芽后移植到灭菌配制土壤(蛭石、黑土和珍珠岩比例：2:1:1)中继续生长。

2.7Southern blot检测

20μg基因组DNA按EcoRⅠ(货号D1040AH，TaKaRa，Shuzou，Kyoto，Japan)使用说明于400μL体系中充分酶切，酶切产物在0.7％(w/v)琼脂糖胶上电泳分离后毛细管法过夜转印至Hybond⁺尼龙膜(Amersham PharmaciaBiotech，Piscataway，New Jersey，USA)上。探针标记、杂交、检测参考相关产品或试剂盒说明文件(Roche Applied Science，Mannheim，Germany)。

2.8直链淀粉含量测定

2.8.1吸光度法

甘薯淀粉中直链淀粉含量测定借鉴参考中华人民共和国国家标准GB/T15683-2008/ISO6647-1：2007。主要步骤为：称取50mg±0.5mg甘薯淀粉、直链淀粉标样(Sigma，St.Louis，MO，USA)和支链淀粉标样(Sigma，St.Louis，MO，USA)于试管中，加入500μL95％乙醇将粘在试管内壁上的样品冲下，轻轻摇匀并加入4.5mL1.0mol/L氢氧化钠溶液混匀后沸水浴10min以上直至淀粉样完全分散，冷却至室温后转移到50mL容量瓶中定容；同时按相同步骤制备不加任何淀粉样的空白对照；利用定容的直链淀粉和支链淀粉标样配制直链淀粉含量为0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和100％的系列标准含量溶液各1mL备用；8mL2％碘液稀释后加4mL1.0mol/L HAC溶液并定容至200mL即为淀粉显色液，现配现用，同一批样品使用相同的显色液；空白对照、甘薯淀粉样、标准含量溶液各取100μL加入1mL淀粉显色液中混匀显色，空白对照取4次，其他样品取3次，显色后在分光光度计LibraS22(Biochrom Ltd.，UK)上进行多波长测量(360nm、530nm、555nm、680nm、720nm)和全波长扫描(200-900nm)测定；利用标准含量溶液在720nm处的吸光度值进行一元线性回归并求取相关系数，建立直链淀粉含量与吸光度的方程式，将待测甘薯淀粉样吸光度代入方程式求取其直链淀粉含量。

II.实施例

实施例1、甘薯再生植株的检测

1.生根测试

从再生植株中随机选取379个株系在含潮霉素的培养基上进行生根测试，结果表明在含10mg/L潮霉素的SBM上92.35％(350个)的株系可以正常生根和生长，当潮霉素浓度提高到20mg/L进行更严格的筛选时，这些株系中的349个仍然可以在一周内顺利生根存活。鉴于高浓度潮霉素对转基因植株生长有一定的抑制效应，表现为植株生长减缓，通过10mg/L潮霉素筛选来消除假阳性株系是廉价、方便、快捷有效的方式，同时可以进行转基因株系的扩繁，为后续实验提供足够的材料。

2.PCR检测

针对hpt基因(该基因是筛选标记，存在于最终表达载体中)设计一对特异引物(HF，5’TTCTACACAGCCATCGGTCC3’(SEQ ID NO:35)；HR，5’CCCATGTGTATCACT GGCAA3’(SEQ ID NO:36))，在随机选取的248个株系中进行PCR检测，发现其中的243个(97.98％)有500bp目标条带，当检测T-DNA整合片段的其它序列时同样给出类似的结果，可进一步确认外源基因已整合到基因组上。

3.GUS染色

p54/1.0是来源于木薯的一个维管束特异的启动子(Zhang P,Bohl-Zenger S,Puonti-Kaerlas J,et al.Two cassava promoters related to vascular expression and storageroot formation[J].Planta,2003,218(2):192-203)，pP54::GUS(p54/1.0::GUS)转基因甘薯组织染色结果表明该启动子在甘薯中同样也具有维管束特异表达活性(图4C、F)，与pCAMBIA1301(CaMV35S::GUS)转基因植株进行比较，发现两种启动子在甘薯中具有一定的组织互补特性，表现在CaMV35S::GUS主要在叶肉细胞和块根薄壁细胞中显色，而p54/1.0::GUS在叶脉和块根微管束中高表达。

4.Southeren Blot

外源片段插入拷贝数是判断插入片段表达稳定性和转基因植株遗传稳定性的一个重要依据，单拷贝插入也是转基因作物获得环境释放许可的一项必要条件，Southern blot检测表明根癌农杆菌介导的甘薯遗传转化能够获得大量单拷贝插入的转基因植株(图5)，在检测的62个株系中鉴定出不超过59个独立株系，其中38个株系是单拷贝插入，16个株系是双拷贝插入，其余株系插入拷贝数都在三个以上(表5)。

表5、转基因株系的T-DNA插入拷贝数检测

注：拷贝数中，具有相同上标(a，b或c)的株系的Southern分析带型一致，可能来自同一抗性愈伤组织。

实施例2、转基因新型淀粉的品质测定

1、直链淀粉含量

参考大米直链淀粉含量测定的标准方法，对未经本发明人转基因的已有甘薯和常见作物淀粉的直链淀粉含量进行了测定，如表6。结果表明，用作遗传转化的5个甘薯品种的直链淀粉平均含量在28％到31％之间。

受限于吸光度法的局限性和精确性，在大米中当直链淀粉低于5％时只能定性说明直链淀粉含量很低而不能准确测得，表5中糯米淀粉的直链含量测定值也证实这一结论。因此当测得的甘薯淀粉直链含量低于5％时可定义为新型糯性甘薯，所有转基因株系(约300株)的直链淀粉含量分布图(图6)表明转基因株系中甘薯直链淀粉含量分布广泛，已经拓展至0-100％，可根据实际需要选择栽培不同的转基因株系。

表6、常见作物淀粉的直链淀粉含量

^*2008、2009、2010年收集的大田、温室薯块共11份样品测定后求平均值，除小麦外所有淀粉样品均在实验室采用相同方法制备。

从总体上，分析所有转基因株系(约300株)的直链淀粉百分含量分布状况发现：在以改变淀粉组成为目的的288个转基因株系中，通过GBSSI RNAi手段导致直链淀粉显著下降(按低于20％计)的株系有80个，占所有株系的27.78％；通过SBEI和/或SBEII RNAi手段导致直链淀粉显著上升(按高于40％计)的株系有78个，占所有株系的27.08％；突破常规甘薯品种中直链淀粉含量在20％到40％之间的限制，获得了一系列直链淀粉含量梯度变化的株系(图7)。而在10％-20％之间的株系数量较少(图7)。

对获得的转基因株系(以改变淀粉组成为目的的288个转基因株系)进行种植，收获块根提取淀粉测定直链淀粉含量可以发现，单独干扰SBE I基因表达的载体提高直链淀粉含量平均能达到33％，35S::SBEIIRNAi干扰SBE II基因表达时平均直链淀粉含量能达到40％，P54::SBEIIRNAi干扰SBE II基因表达时平均直链淀粉含量能达到52％，35S::SBEI+IIRNAi干扰SBE I和SBE II基因表达时平均直链淀粉含量也能达到52％，所有载体中以P54::SBEI-SBEII载体(其中包一半利用SBEI和SBEII融合序列1(SEQ ID NO:9)以及一半利用SBEI和SBEII融合序列2(SEQ ID NO:10)设计的干扰载体同时干扰SBE I和SBE II基因表达时平均直链淀粉含量达到最高，为65％。

由此可见，P54/1.0启动子显著优于35S启动子，P54/1.0启动子的维管束特异性可能是产生该结果的重要原因。

2、快速粘度测定

粘度是淀粉浆最重要的流变性质，直接反应了淀粉在工业应用中的范围和潜力。在淀粉糊化特性测定过程中随着温度的上升，悬浊液中的淀粉粒急剧膨胀并胀裂，粘度开始迅速上升时的温度，称为糊化温度(Pasting temperature)；随着温度的继续上升，悬浊液逐渐变成凝胶状态，粘度直线上升，达到高峰时的粘度称为高峰粘度(Peak viscosity)；温度在95℃持续时，溶液变为松懈的溶胶，粘度快速下降，降至最低时的粘度称为低谷粘度(Trough或Hold-through)；当温度降低并保持在50℃时，溶液开始由溶胶变回凝胶状态，粘度又快速升高，最后维持在一定粘度，此时的粘度为最后粘度(Final viscosity)。高峰粘度与低谷粘度之差称松懈值(Breakdown)，最后粘度与低谷粘度之差称反弹值(Setback)，达到高峰粘度所需的时间为高峰时间(Peak time)。这七项是描述糊化曲线的最常用指标。

利用快速粘度分析仪测定了抽提自不同栽培和气候条件下(温室、山东泰安、上海新桥)的共259个转基因株系427份样品的糊化特性。比较不同株系或样品间糊化曲线可以发现，随着直链淀粉含量的上升出现有规律的变化(图8)。同野生型相比，当转基因株系直链淀粉含量明显降低时(0.0％，8.7％)出现高峰粘度上升和最后粘度下降的改变；直链淀粉含量在22％-38％之间时，糊化曲线与野生型(30％)差异较小、变化模式相似；直链淀粉含量在50％时无论是高峰粘度还是最后粘度都达到最高值；随后直链淀粉含量的升高对高峰粘度和最后粘度的影响都是负相关的(如59％、68％、78％)；当直链淀粉含量高于68％时糊化行为异常，无明显糊化温度，在加热和冷却过程中粘度基本不变或持续上升(图8，虚线代表直链淀粉含量78％的情形)。

剔除糊化行为异常样品后，针对直链淀粉含量在0-68％之间的淀粉样品，比较转基因和野生型甘薯的淀粉糊化指标(表7)可以发现转基因株系的淀粉各项指标具有更宽广的范围，与野生型相比，尤其是工业应用中的重要指标高峰粘度和最后粘度分别提高到了野生型的1.5倍和2.0倍以上。通过分析直链淀粉含量和这些指标的相关性(表8)发现：直链淀粉含量与七项指标中的松懈值决定系数最高(R²＝0.7136)，负相关系数为-0.8447，鉴于直链淀粉含量是无量纲量，对5个粘度参数进行组合获得无量纲量后再分析它们与直链淀粉含量的相关性，发现大多数变换指标与直链淀粉含量高度相关(表8)。

表7、转基因和野生型甘薯淀粉糊化指标统计表

其中，Min表示最小、Max表示最大、Avg表示平均，S.D.表示标准差。

表8、直链淀粉含量和糊化特性指标的相关性

^*松懈值(B＝P-T)，反弹值(S＝F-T)，S/T＝F/T-1，T/B＝P/B-1，B/T＝P/T-1，F/S＝T/S-1。

3、淀粉粒形态观察

高直链淀粉在快速粘度测定中表现为极低的粘度特性(图8，虚线代表直链淀粉含量78％的情形)暗示着淀粉粒结构的剧烈改变。倒置光学显微镜下观察加热前后淀粉浆/淀粉糊的结果如图9：发现该样品中淀粉粒从野生型的多边形和钟罩形(图9A)改变成圆球形(图9B)；野生型淀粉浆加热后淀粉粒完全崩解形成淀粉糊，只有极少量的淀粉粒残留物(图9C)；而高直链含量淀粉粒吸水溶胀保持加热前的圆球形(图9D)。

为证实和研究直链淀粉含量和淀粉粒形态之间的关系，选取部分样品进行扫描电镜观察(图10)，进一步证实了提高直链淀粉含量可使甘薯淀粉粒改变成圆球形。这一结果提示干扰淀粉分支酶的功能可致使淀粉粒的起始合成从有极性向无极性转变。为阐明p54/1.0启动子是否对整个植株的淀粉合成代谢都产生影响还是仅限于块根内部，选取了P54::GBSSIRNAi和P54::SI+IIRNAi各一个株系(不含直链淀粉的23196105和含80％直链淀粉的23204017)和野生型进行比较(图11)，发现不含直链淀粉的淀粉粒在甘薯的叶片、叶柄、茎段和块根中与野生型差异不明显；而提高直链淀粉含量的淀粉粒在以上四个部位中与野生型截然不同，表现为叶片和叶柄中的临时性淀粉粒由野生型的光滑圆盘状改变为表面凹凸不平的不规则形状，茎段和块根中的贮藏性淀粉粒从野生型的多边形和钟罩形转变成圆球形，并且在各部位中都有部分淀粉粒明显变大的趋势。表明p54/1.0启动子虽然只在维管束中启动基因表达(图4C、F)，但是其作为发夹结构的启动子时能够抑制维管束周围其他细胞中目的基因的表达，一种可能是dsRNA在非维管束细胞中的低表达足以抑制目标基因表达，另一种可能是dsRNA或其剪切产物可以在植物细胞间传递，究竟是何种机制需要在后续研究中进一步阐明。

(2)产量品质复选

在2009年产量数据和直链淀粉含量测定结果的基础上剔除了参试株系中产量严重下降或直链淀粉含量变化不明显(20-40％之间)的株系，2010年在山东泰安对优选的62个株系(表5)进行进一步田间中试，并提取淀粉进行下游产品开发。而在上海五厍针对各干扰载体选取代表性株系进行产量分析。总结分析两年四点产量数据，涉及转基因株系181个，有两点以上产量数据的107个，三点以上的50个，四点都进行产量分析的有12个。综合各株系的直链淀粉含量、外源基因插入拷贝数和平均产量比例遴选出拟申请环境释放株系如表9。

表9、综合优选株系列表

其中，“平均产比”计算如下：所有鲜薯产量均以该试点的徐薯22(非转基因野生型)产量作归一化处理，即以产量除以徐薯22在该试点的平均产量。

结论

1、直链淀粉含量显著改变的新型植株

为实现甘薯淀粉品质的改良，构建了干扰甘薯淀粉合成关键酶基因(GBSS Ⅰ，SBE Ⅰ和SBE Ⅱ)表达的双元载体，利用优化后的甘薯遗传转化体系在5个甘薯品种(Ayamurasaki，苏薯11号，苏薯2号，苏薯9号，徐薯22)中开展了淀粉品质改良的研究，获得了大量的转基因株系，通过Southern blot筛选出单拷贝插入株系；直链淀粉含量的测定表明转基因株系合成的淀粉中直链淀粉含量拓展至0-100％的范围；快速粘度测定结果说明转基因甘薯淀粉的糊化特性随直链淀粉含量变化发生巨大改变；随机区组产量测定暗示降低直链淀粉含量对转基因甘薯产量基本没有影响，但提高直链淀粉含量会造成转基因甘薯产量明显下降；块根干率测定也进一步确定了提高直链淀粉含量导致淀粉合成代谢受阻、总淀粉含量降低、总干物质产量降低的事实；收获指数测定表明转基因株系的产量有提升的空间，并为优选转基因株系的进一步改良提供了方向；杂交后代稳定性分析证明在甘薯中干扰基因表达的发夹结构可以通过杂交育种稳定遗传并发挥作用，因此转基因株系可用作杂交亲本进一步利用。对转基因株系进行的较为广泛和系统的研究着重于探讨直链淀粉含量与上述其他指标的相关关系，以确定进一步改良的策略和方向；优选出的两类具有经济价值的多个改良株系可用于大面积推广种植，其生产的糯性淀粉(不含直链淀粉)或高直链淀粉可以提高甘薯的经济附加值，达到平抑甘薯淀粉生产中污染处理高成本的效果，推动甘薯产业化向前良性发展，促使甘薯产业在我国粮食安全和可持续发展中发挥巨大的作用。同时近红外预测模型的建立很大程度上解决了转基因糯性甘薯或高直链甘薯品种大规模种植和产业化过程中的质量控制问题。

降低(通过GBSSI RNAi)直链淀粉含量或提高(通过SBEI和/或SBEII RNAi)直链淀粉含量的转基因株系中68.86％(199/289)的背景为徐薯22，对这些株系合成的淀粉粒观察发现提高直链淀粉含量的淀粉粒形态明显向球形转变。鉴于淀粉粒的结构及其形成机理一直是研究者们关注的问题，这些转基因株系中新型淀粉粒的出现为研究该问题，尤其对阐明直链淀粉和支链淀粉在淀粉粒结构建成中的作用和位置，提供了极佳的材料；不含直链淀粉的糯性甘薯淀粉更高的高峰粘度特性说明了该类淀粉在造纸、纺织、胶黏剂等应用中将产生更好的效果，直接应用的潜力巨大；直链淀粉含量50％的甘薯淀粉在高峰粘度和最后粘度都有大幅度提升，是生产新型淀粉胶黏剂的理想原材料；而高直链淀粉可应用于淀粉塑料工业取代石油基产品，同时高直链新型淀粉粒的抗糊化特性也为开发新的淀粉基生物材料带来了契机。

2、块根类作物产量形成机制解析利用

直链淀粉合成酶(GBSS Ⅰ)在淀粉粒生成过程中作用有限，由其合成的直链淀粉对淀粉形态建成也不具有决定作用，可能只对淀粉粒结构的维持和稳定有所贡献，对薯类作物的产量形成贡献不大。而淀粉分支酶类基因(SBE Ⅰ和SBE Ⅱ)，尤其是淀粉分支酶Ⅱ(SBE Ⅱ)，是产量形成的关键基因；由淀粉分支酶和去分支酶(DBE)共同作用合成的支链淀粉也是淀粉粒形态建成的决定因素，高直链淀粉中淀粉粒形态的改变预示着其中支链淀粉结构发生了巨大的改变，需要在后续研究中进一步阐明。单个直链淀粉分子只有一个可以接受腺苷二磷酸葡萄糖(ADPG)的非还原端，因此仅在淀粉合成酶类(GBSS和SSS)作用下从葡萄糖到淀粉的沉积速度相当有限；当淀粉分支酶Ⅱ(SBE Ⅱ)作用于直链淀粉分子时会生成一个新的非还原端，因此加速了淀粉的累积。考察直链淀粉合成酶(GBSS Ⅰ)和淀粉分支酶Ⅱ(SBE Ⅱ)被干扰时的产量表现间接证明了分支酶类对淀粉累积速度的关键作用是为淀粉合成酶类(GBSS和SSS)提供了更多可接受腺苷二磷酸葡萄糖(ADPG)的非还原端。这也可以解释在块根发育表达谱中所揭示的分支酶类持续上调表达的现象，这是块根类作物产量形成机制中的关键环节之一。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (16)

1.一种提高植物中直链淀粉含量的方法，所述方法包括：抑制淀粉分支酶I和/或淀粉分支酶II的表达。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，以淀粉分支酶I和/或淀粉分支酶II核苷酸序列中的保守性区域为靶点抑制淀粉分支酶I和/或淀粉分支酶II的表达。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的保守性区域包含：

淀粉分支酶I中SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；

淀粉分支酶II中SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；或

淀粉分支酶I中SEQ ID NO:6中第1-165位所示的核苷酸序列。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将构建物或含有该构建物的载体转染到植物中；所述的构建物含有式(I)所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向   式(I)，

式(I)中，

Seq_正向具有SEQ ID NO:6所示核苷酸序列，具有SEQ ID NO:7所示核苷酸序列，具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7串联而成的核苷酸序列，或具有SEQ ID NO:6中第1-165位和SEQ ID NO:7串联而成的核苷酸序列

Seq_反向具有与Seq_正向互补的核苷酸序列；

X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，在Seq_正向之前，还包含一启动子，所述启动子是组成型启动子或组织特异性启动子。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，该启动子为CaMV35S启动子或p54/1.0启动子。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的Seq_正向具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7串联而成的核苷酸序列，或具有SEQ ID NO:6中第1-165位和SEQ ID NO:7串联而成的核苷酸序列；或

所述的启动子是p54/1.0启动子。

8.如权利要求4-7任一所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)提供携带所述的构建物或含有该构建物的载体的农杆菌；

(2)将植物细胞、组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述构建物转入植物细胞；并整合到植物细胞的染色体上；和

(3)选择转入了构建物的植物细胞、组织或器官，再生成植株。

9.一种分离的多核苷酸，选自：

具有SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的多核苷酸；

具有SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的多核苷酸；

具有SEQ ID NO:6中第1-165位所示核苷酸序列的多核苷酸；

具有SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的多核苷酸；或

具有SEQ ID NO:10所示核苷酸序列的多核苷酸。

10.权利要求9所述的多核苷酸的用途，用于制备提高植物中直链淀粉含量的构建物或干扰分子。

11.一种的构建物，含有式(I)所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向   式(I)，

式(I)中，

Seq_正向具有SEQ ID NO:6所示核苷酸序列，具有SEQ ID NO:7所示核苷酸序列，具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7串联而成的核苷酸序列，或具有SEQ ID NO:6中第1-165位和SEQ ID NO:7串联而成的核苷酸序列；

Seq_反向具有与Seq_正向互补的核苷酸序列；

X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补。

12.如权利要求11所述的构建物，其特征在于，在Seq_正向之前，还包含与之操作性连接的启动子，该启动子为CaMV35S启动子或p54/1.0启动子。

13.如权利要求11或12所述的构建物，其特征在于，所述的Seq_正向具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7串联而成的核苷酸序列，或具有SEQ ID NO:6中第1-165位和SEQ ID NO:7串联而成的核苷酸序列；或

所述的启动子是p54/1.0启动子。

14.一种载体，所述的载体含有权利要求11-13任一所述的构建物。

15.权利要求11-13任一所述的构建物或权利要求14所述的载体的用途，用于导入到植物中，从而提高植物中直链淀粉的含量。

16.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述的构建物或载体还用于：

调节植物中的淀粉糊化特性；

调节植物中的淀粉粘度特性；

改变植物中淀粉颗粒的形态。