CN1219199A - 通过修饰淀粉生物合成酶基因的表达而得到的新型淀粉 - Google Patents

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Abstract

本发明披露了将一种cDNA克隆用于构建能抑制玉米的淀粉分支酶的酶促活性的有义和反义基因的用途。更具体地讲,本发明涉及一种控制源于玉米颖果的淀粉的淀粉精细结构的方法,包括:(1)制备一种嵌合基因,该基因包括一个编码一种淀粉分支酶结构基因或其片段的核酸片段,该片段的上游沿其有义或反义方向可操作地连接于编码能指导玉米胚乳组织中的基因表达的启动子的核酸片段上,而其下游可操作地连接于可编码控制转录终止的合适调控序列的核酸片段上,和(2)用上述嵌合基因转化玉米,其中,与源于不具备该嵌合基因的玉米的淀粉精细结构相比,该基因的表达可导致源于所述转化玉米颖果的淀粉的精细结构的改变。

Description

通过修饰淀粉生物合成酶 基因的表达而得到的新型淀粉
                 发明背景淀粉的特征及商业用途
淀粉是两种多糖-直链淀粉和支链淀粉的混合物。直链淀粉是由多达几千个α-D-吡喃葡萄糖单位通过α-1,4糖苷键连接而成的不分支的链。支链淀粉是一种高度分支的分子，是由多达50,000个α-D-吡喃葡萄糖残基通过α-1,4和α-1,6糖苷键连接而成的。支链淀粉中有大约5％的糖苷键是α-1,6键，它会产生聚合物的分支结构。
由直链淀粉和支链淀粉分子组成贮存在质体中的颗粒。大多数植物所产生的淀粉粒有15-30％的直链淀粉和70-85％的支链淀粉。直链淀粉与支链淀粉的比例和支链淀粉的分支度影响着淀粉的物理和功能特性。诸如明胶化淀粉的粘性和稳定性的功能特性决定着其用途，以及淀粉在食品及工业用途中的价值。当需要特定的功能特性时，获自诸如玉米、稻或马铃薯的各种作物的淀粉或许可以满足这种功能性要求。如果一种淀粉不能满足需要的功能特性，例如，假设它必须在高温和酸性条件下具有稳定的粘性，则通过对该淀粉进行化学改性有时可取得上述功能性。在淀粉工业中，采用了各种类型和各种程度的化学改性，而标记和化学改性淀粉的使用必须满足政府的规定。
在含有淀粉的植物器官内，直链淀粉与支链淀粉的比例和支链淀粉的分支度是受遗传控制的。例如，带有纯合隐性的Waxy(wx)基因的植株缺少颗粒结合淀粉合成酶，它能产生将近100％的支链淀粉。带有纯合隐性直链淀粉伸长(ae)基因的植株可以产生含有高达90％直链淀粉的淀粉颗粒(参见美国专利US5,300,145)。业已证实dull基因可以影响淀粉合成酶和淀粉分支酶的活性水平。
大部分谷类作物均被作为商品，而且工业上和动物饲料对这些作物的大部分要求均可由被广泛种植并大量生产的普通品种满足。不过，目前，具有无法由标准组成的谷类满足的特殊最终用途特性的作物的市场正日益扩大。最常见的是，特种玉米和“普通”玉米(又被称为大田玉米)的区别在于，它具有改变了的胚乳特性，例如在蜡质或高直链淀粉玉米中直链淀粉与支链淀粉比例的总体变化，在甜玉米中有较多的糖类积累，或在诸如食品级玉米或爆裂玉米中的胚乳硬度的改变(Glover,D.V.和E.T.Mertz,(1987)见Corn:NutritionalQuality of Cereal Grains；Genetics And Agronomic Improvement,R.A.Olsen和K.J.Frey编，American Society of Agronomy,MadisonWiscousin pp.183-336。Rooney,L.W.和S.D.Serna-Saldivar,(1987)Food Uses of Whole Corn and Dry-milled Fractions，见Corn:Chemistryand Technology,S.A.Watson和P.E.Ramstead编，American Associationof Cereal Chemists,Inc.,St.Paul.Minnesota,pp399-429)。本发明为特种玉米用户提供了一种具有不同于蜡质淀粉的特性的淀粉来源，并为农民提供了种植比普通玉米或蜡质玉米有更高附加值的作物的机会。
通过粉磨处理，能从植物中获取纯化淀粉。玉米淀粉是通过湿粉磨工艺从其种子中提取的。湿粉磨法是一种多步骤工艺，包括浸泡和研磨种子，以及分离淀粉、蛋白、油和纤维组分。S.R.Eckhoff在“第4届玉米应用大会汇编(1992年，6月24-26日，St.Louis,M.O，由National Corn Growers Association,CIBA-GEIGY Seed Division和theUnited States Department ofAgriculture印刷)中对玉米湿粉磨工艺作了综述。淀粉被用于食品和工业目的，而且是人类食物中碳水化合物的主要来源。通常是将淀粉和水混合，并烹制成粘稠的凝胶。淀粉的3个重要特性是：其熬炼温度，所述凝胶可以达到的粘度，和长期保存时该凝胶粘度的稳定性。未改性的淀粉在加热及冷却期间的物理特性限制了它在很多场合的应用。因此，为了克服淀粉的上述缺陷，并拓宽淀粉在工业领域的应用，需要相当大的人力及资金，以期对淀粉进行化学改性。
在Modified Stavches:Properties and Uses,O.B.Wurzburg编，(1986)CRC Press Inc.,Boca Raton,FL中披露了未改性淀粉的某些局限和改性淀粉的特性。未改性淀粉在食品上的应用极为有限，因为其淀粉粒容易膨胀并开裂，由此形成易碎的、不理想的凝胶体。化学改性可被用于稳定淀粉粒，从而使该淀粉适用于数千种食品和工业用途，其中包括婴儿食品、粉状咖啡乳、医用撒用粉、纸和纱线上浆剂和粘合剂。常用的化学改性包括交联，其中，引入化学键作为淀粉分子之间的稳定键；还包括取代，其中，将诸如羟乙基、羟丙基或乙酰基的取代基引入淀粉分子中。
化学改性淀粉在美国的应用受食品与药品管理署(FDA)的管理。“食品淀粉改性的”淀粉可用于食品中，但必须满足规定的处理限制，而“工业淀粉改性的”淀粉可用于诸如与食品接触的容器的制品中，但是，也必须满足规定的处理要求；Code of Federal Regulations，Title 21,Chapter l,Part172,Food Additives Permitted in Food for HumanConsumption,Section172,892,Food Starch Modified,U.S.GovermentPrinting Office,Washington,D.C.1981；(a)Part178,Indirect FoodAdditives、Sect.178.3520,Industrial Starch-Modified。上述规定通过限定可用于化学改性步骤的最大化学试剂量来限制化学改性的程度。对于由所述改性工艺得到的淀粉中的副产品的含量也有所规定。例如，特别关注羟丙基淀粉中的丙氯代醇残基(Tuschhoff,J.V.(1996)Hydroxypropylated Starches，见Modified Starches:Properties and Uses,D.B.Wurzburg编，CRC Press,Boca Raton,FL,pp.55-57)。通过对含有淀粉的植物进行分子遗传学操作改变淀粉的精细结构
已知淀粉分支或聚合度的差异可导致淀粉生理生化特性的改变。业已证实，为特殊目的而订制的淀粉可以通过改变支链淀粉分子的支链分布、直链淀粉与支链淀粉的相对比例或直链淀粉的聚合度而产生。不过，要实现淀粉组成的表型改变一直是有问题的；尽管淀粉生物合成的关键酶已经确定，但其确切作用仍然不明确。因此，特定酶活性与淀粉结构的特定分子特征的相关性，以致与食品和工业制品中淀粉功能的相关性也一直难于确定。尽管可以预见理想淀粉可能需要的理想的功能特性，但是对于该淀粉的分子结构是如何实现上述目的的原理仅有大致的了解，而且对于特定的淀粉生物合成酶是如何具体影响上述参数的了解也相当少。例如，每一种酶在决定分支方式和分支长度方面的作用尚不清楚，而且，由于对淀粉分支酶和淀粉合成酶的相互作用缺乏了解而使这一问题复杂化。
WO94/09144讨论了在高温下具有改善了的合成淀粉能力的植物的生产。该文献提出，在高温下谷粒灌浆的限制因素是某些淀粉生物合成酶，特别是淀粉合成酶(SS)和淀粉分支酶(SBE)的不稳定性。将编码其活性具有较高的最佳温度的酶或对热具有较高耐性的酶的基因导入植物，可以提高淀积在玉米种子里的淀粉量。而且，已提出可将该方法用于产生具有改变了的精细结构的淀粉，这种改变是由于导入了供体基因而造成的，该基因的表达可以改变不同淀粉生物合成酶之间的平衡。所推荐的供体基因包括那些编码与其内源酶相比具有改善的动力学或别构特性的酶的基因，或所述内源基因的一个额外拷贝，它可以弥补因热不稳定性所致的酶活性的损失。WO94/09144还提出了用有义和反义基因改变受体植物中不同淀粉合成酶和淀粉分支酶的天然比例作为一种改变淀粉结构的方法。该文献披露了温度对某些淀粉生物合成酶的催化活性和酶稳定性的影响，不过，没有提供证明所提出的分子方法的数据。
最近，由Virgin等在第4届国际植物分子学大会(the 4thInternational Congress of Plant Moleculer Biology)(1994,6月)上和由Christensen等和Kossman等在植物多糖专题讨论会(the PlantPolysaccharide Symposium)(1994,7月)上报导了试图用反义方法在马铃薯中抑制SBE表达的结果。在任何情况下、虽SBE活性几乎被完全消除，但直链淀粉与支链淀粉的比例依然未改变。Virgin等和Kossman等均报导支链淀粉结构未改变。不过，Christensen等报导了支链淀粉分子上支链分布的变化，其长的分支数量增加了。
在马铃薯上取得的结果是出乎意料的，因为仅从其中提纯了一种淀粉分支酶，而且，即使在低严紧度条件下，在马铃薯基因组DNA的Southern印迹上也仅能检测到一个基因(Kooshnoodi,J.等(1993)FEBS Letters 332:132-138；Kossman.J.，等(1991)Mol.Gen.Genet,230:39-44)。因此，预计可导致酶含量明显降低以及随之而来的淀粉分支酶活性下降的马铃薯中单一淀粉分支酶的反义抑制，会导致淀粉组成及淀粉精细结构的可检测的、可再现的变化。在文献中所报导的相互矛盾的、不一致的结果表明，与所鉴定的基因有较小同源性的其它淀粉分支酶基因在决定马铃薯支链淀粉结构方面也许起着一定作用。或者，马铃薯的淀粉分支酶活性可能由一个基因编码，但是，该酶蛋白存在很大余量，以致当该酶的活性有90％以上受到抑制时支链淀粉的数量或结构仍不受影响。
由于已鉴定出了3种SBE同工型而使得玉米中淀粉精细结构的变化复杂化。在玉米胚乳中，具有淀粉分支酶活性的3种同工型是SBEⅠ、SBEⅡa和SBEⅡb。在直链淀粉伸长(ae)突变型中，已发现缺少SBEⅡb活性，而在dull(du)突变型中，观察到了SBEⅡa含量的降低(Boyer,C.D.and Preiss,J.(1981)Plant Physiol,67:1141-1145)。对玉米淀粉分支酶的催化特性所作的研究表明，上述同工型在底物选择性及其所转移的葡聚糖链长度方面有差异。当底物为直链淀粉时，SBEⅠ活性较高，且其优先转移较长的糖链。对分支程度更高的底物如支链淀粉，则SBEⅡ同工型表现出更高的活性。SBEⅡ优先转移较短的葡聚糖链(Guan等，(1993)Plant Physiol,102:1269-1273；Takeda等(1993)Carbohydrate Res 240:253-263)。
业已克隆了一种玉米SBⅠcDNA，并对其进行了测序(Baba等(1991)Biochem.Biophys.Res.Commun.181:87-94；Fisher等(1995)Plant Physiol,108:1313-1314)。另外，已分离出一种玉米SBEⅡcDNA克隆，而且，该克隆的核苷酸序列也已公开(Fisher等(1993)Plant Physiol.102:1045-1046)。该cDNA克隆定位于ae基因座，证实了该基因座编码玉米SBEⅡb的结构基因(Stinard等(1993)Plent Cell5:l553-1566)。
已知从ae突变型中提取的淀粉在结构上不同于从马齿型玉米中提取的淀粉(Baba等(1984)Agric Biol.Chem.48:1763-1775)。已对ae等位基因对淀粉特性的影响作过研究(Yamada等(1978)Starke30:145-148)。在Waxy(WX)背景中加大ae的剂量可使其凝胶化温度提高，因此，对于纯合突变型来说，即使在95℃的温度下也可观察到淀粉的蒸煮仍不充分。上述作者证实，与ae wx淀粉相关的粘度提高是十分理想的，并提出了一种具有介于wx和ae wx之间的特性的“目标”淀粉。尽管会影响玉米SBEⅡa和SBEⅡb含量的突变是已知的，但SEBⅠ结构基因的突变尚有待证实。SEBⅠ突变型的缺乏可能表明，这种淀粉分支酶同工型对植物是致死的。或者，SBEⅠ无效突变可能会导致察觉不到的种子表型的变化，或者这种变化不容易与现有的淀粉突变型区分开。
与更传统的植物育种方法相比，生产具有改变了的精细结构的玉米淀粉的分子遗传学方法有明显的优势。通过反义抑制或共抑制方法特异抑制一种或几种SBE同工型的表达，可以导致淀粉精细结构的改变。一种反义或共抑制构建体可以作为基因活性的显性负调节物。尽管常规突变可以导致基因活性的负调控，但这种作用更像是隐性的。从育种角度看，由转基因方法实现的显性负调控可能更为可取。另外，通过采用特异启动子将改变了的淀粉表型的表达局限于植物的生殖组织，可以产生比常规突变好的农艺性状，常规突变可影响到其中有突变基因正常表达的所有组织。最后，由染色体位置效应所导致的可变水平的反义抑制或共抑制，能够产生范围比由玉米胚乳中突变型等位基因的剂量效应所致的范围更宽的淀粉表型。
玉米胚乳中淀粉分支酶组构的复杂性及所报导的马铃薯方面的结果，使得通过抑制已知玉米同工型之一的基因表达而操作淀粉精细结构的尝试无法预测。所报导的科学证据表明，一个淀粉分支酶基因的表达抑制和可检测的淀粉分支酶活性的降低，并不预示着淀粉精细结构的相应变化。而且，反义技术本身也具有不确定性，表现在不了解或不能预测究竟是整个基因或是特异片段以及一个基因的哪一个片段在介导强的反义抑制方面影响力最大。某些结果已表明所述反义基因的强表达是必须的；不过，反义转录物的良好表达不一定与反义表型的出现及其强度相关(Bourque,J.(1995)Plant Sci.105:125-149)。尽管已提出了几种解释共抑制现象的理论(Flavell R.B.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci(USA)91:3490-3496)，但显而易见的是，用一种机制似乎不足以解释观察到的所有结果。迄今，已在烟草、Canola、大豆、番茄和拟南芥中报道过共抑制作用，上述植物均为双子叶植物。还没有报导表明这种现象可用于单子叶植物的资料。
虽然能够抑制SBE基因在玉米中的表达，但所产生的淀粉表型变化依然无法预测。尽管其酶促步骤是已知的，但淀粉生物合成的分子细节尚不十分了解。尚不清楚3种SBE同工型是在淀粉生物合成中起着相同的作用，还是每种同工型在组装支链淀粉分子时，在独立的步骤循专有途径起着特殊作用。鉴于淀粉分支酶与影向葡聚糖链延长的多种淀粉合成酶之间可能存在相互作用，可基于每种同工型的催化特性对淀粉结构做出预测。
                    发明概述
本发明披露了将一种cDNA克隆用于构建能抑制玉米颖果或胚乳中淀粉分支酶酶促活性的有义和反义基因的用途。更具体地讲，本发明涉及一种控制玉米淀粉的支链淀粉的支链分布、直链淀粉与支链淀粉的相对比例和直链淀粉组分的聚合度的方法，包括：(1)制备一种嵌合基因，该基因包括一个编码一种淀粉分支酶结构基因或其片段的核酸片段，该片段的上游沿其有义或反义方向可操作地连接于编码能指导玉米胚乳组织中基因表达的启动子的核酸片段上，而其下游可操作地连接于编码控制转录终止的合适调控序列的核酸片段上，和(2)用该嵌合基因转化玉米，其中，与源于不具备该嵌合基因的玉米淀粉的支链淀粉分子组分的支链分布相比，该嵌合基因的表达可导致源于所述转化玉米颖果的淀粉的支链淀粉分子组分的支链分布改变。本发明还涉及用上述方法通过转化而产生的玉米品种，从用上述方法产生的一个玉米品种的颖果中提取的淀粉，以及一种制备增稠的食品的方法，该方法包括混合一种食品、水和有效量的自用上述方法产生的一个玉米品种的颖果中提取的淀粉，还包括蒸煮所得到的组合物，这一步骤是生产所述增稠食品所必须的。附图简述及序列描述
通过下面的详细说明和构成本申请一部分的附图及序列描述，可以更充分地理解本发明。
图1是带有一个cDNA插入片段的质粒pBE240的限制图，该插入片段包括78bp的5′非翻译DNA，一个编码玉米SBEⅡb编码区的2397bp的可读框，和190bp的3′非翻译DNA。
图2是质粒pBE44的限制图，它包括一个相对玉米27kd玉米醇溶蛋白启动子为反义方向的上述pBE240插入片段的414bp的3′片段。
图3是质粒pML103的限制图，它在构建本发明的嵌合基因时被用作中间克隆载体。
图4是特别编码膦丝菌素乙酰转移酶的质粒p35/Ac的限制图。将该质粒导入植物细胞和组织后可以使转化的植物细胞和组织产生对诸如膦丝菌素的除草用谷氨酰胺合酶抑制剂产生抗性。
图5对源于普通马齿形玉米种子、直链淀粉伸长基因(ae)纯合的种子的淀粉的RVA曲线和源于pBE44构建体纯合的种子的淀粉的RVA曲线进行了比较，测定了以搅拌数量单位(SNU)为单位的粘度和温度(℃)，并作为时间(分钟)的函数进行作图。
图6是质粒pBE43的限制图，该质粒包括一个pBE240插入片段的507bp 5′片段，该片段相对玉米27kd玉米醇溶蛋白启动子为反义方向。
图7是质粒pBE45的限制图，该质粒包括一个2165bp的接近pBE240插入片段全长的片段，该片段相对玉米27kd玉米醇溶蛋白启动子为反义方向。
图8是质粒pBE96的限制图，该质粒包括一个2087bp的接近pBE240插入片段全长的片段，该片段相对玉米27kd玉米醇溶蛋白启动子为反义方向。
图9是质粒pBE68的限制图，该质粒包括一个373bp的片段，该片段是pBE65上的玉米SBEⅠcDNA插入片段的3′末端(序列13)，沿反义方向连接于玉米的27kd玉米醇溶蛋白启动子上。
图10是质粒pBE69的限制图，该质粒包括一个570bp的片段，该片段是pBE65上的玉米SBEⅠcDNA插入片段的5′末端，沿反义方向连接于玉米的27kd玉米醇溶蛋白启动子上。
图11是质粒pBE72的限制图，该质粒包括一个2487bp的接近pBE65插入片段全长的片段，该片段相对玉米27kd玉米醇溶蛋白为反义方向。
图12是质粒pBE108的限制图，该质粒包括pBE72的一种潮霉素抗性变体。
图13是质粒pBE97的限制图，该质粒包括一个1865bp的接近pBE65的SBEⅠcDNA插入片段全长的片段(序列20)，该片段沿有义方向连接于27kd玉米醇溶蛋白启动子上。
图14是质粒pBE110的限制图，该质粒包括一个编码全长SBEⅠ的2565bpcDNA片段，该片段沿相对玉米10kd玉米醇溶蛋白启动子的有义方向连接。
图15是质粒pBE111的限制图，该质粒包括一个编码截短了的SBEⅠ的1810bpcDNA片段，该片段沿相对玉米27kd玉米醇溶蛋白启动子的有义方向连接。
图16比较了源于蜡质种子、直链淀粉伸长基因(ae)和蜡质基因纯合的种子的淀粉的RVA曲线和源于含有pBE44构建体+蜡质基因的种子的淀粉的RVA曲线。测定了以搅拌数量单位(SNU)为单位的粘度和温度(℃)，并作为时间(分钟)的函数作图。
序列1表示质粒pBE240上的cDNA插入片段的核苷酸序列，以及相应的完整玉米SBEⅡb酶的氨基酸序列。
序列2表示pBE44的414bp插入片段的核苷酸序列。
序列3和4表示用于制备pBE44的414bp插入片段的PCR引物BE41和BE42。
序列5表示pBE43的507bp插入片段的核苷酸序列。
序列6和7表示用于制备pBE43的507bp插入片段的PCR引物BE39和BE40。
序列8表示pBE45的2165bp插入片段的核苷酸序列。
序列9表示pBE96的2087bp插入片段的核苷酸序列。
序列10和11表示用于制备分离pBE65的2772bp插入片段所用探针的PCR引物BE14和BE15。BE15(序列11)还被用于制备质粒pBE79的插入片段。
序列12表示pBE65的2772bp插入片段的核苷酸序列。
序列13表示pBE68的373bp插入片段的核苷酸序列。
序列14和15表示用于制备pBE68的373bp插入片段的PCR引物BE43和BE52。
序列16表示pBE69的571bp插入片段的核苷酸序列。
序列17和18表示用于制备pBE69的571bp插入片段的PCR引物BE46和BE50。
序列19表示pBE72的2487bp插入片段的核苷酸序列。
序列20表示pBE97的1865bp插入片段的核苷酸序列。
序列21表示用于制备pBE83的805bp插入片段的PCR引物BE67。
序列22和23表示用于制备pBE110的PCR引物BE101和BB3。
序列24表示pBE110的2565bp插入片段的核苷酸序列。
序列25表示pBE111的1809bp插入片段的核苷酸序列。
序列描述中用来表征核苷酸序列的单字母密码和氨基酸的3字母密码的定义与公开于Nucleic Acids Research 13:3021-3030(1985)和Biochemical Journal 219(2):345-373(1984)中的IUPAC-IYUB标准一致，上述文献被收作本文的参考资料。
                   详述
本文所披露的内容中，使用了很多术语。在本文中，“淀粉”一词是指由α-D-(1,4)葡聚糖组成的多糖，它可以含有各种比例的α-D-(1,6)分支。在本文中，“淀粉精细结构”一词是指淀粉聚合物的分子结构、聚合物中α-D-(1,6)键的存在、丰度和分布，以及分支和不分支的α-D-(1,4)葡聚糖的存在、丰度和长度。淀粉精细结构由支链淀粉的支链分布或直链淀粉与支链淀粉的相对比例或直链淀粉的聚合度表示。上述结构性分子组分中任一种的变化均可导致淀粉精细结构的改变。可以相互独立地改变上述3种参数中的一种，两种或全部。“聚合度”一词是指一个分子中或诸如支链淀粉的一个支链的一个分子的特定部分中的α-D-吡喃葡萄糖单位的数量。
在本文中，“支链分布”一词是指α-1,4连接的葡聚糖链的分布，这种分布是在用异淀粉酶消化支链淀粉，接着通过大小排阻层析分离释出的支链之后测出的。可以按照支链的大小和其分布在完整分子上的结晶区(存在很多α-1,6-键(即分支点)的区域)的数目对支链进行分类。A链是不分支的并跨越一个结晶区。B1链也跨越一个结晶区，但它是分支的。B2、B3和B4+链是分支的，并分别跨越2，3和4或更多的结晶区(Hizukuri(1986)Carbohydrate Res.147：342-347)。淀粉粒中重复的结晶和非晶态单位的长度相对有规则，从源于多种植物种的淀粉中观察到的重复距离均为9nm(Jenkins(1993)Starch/Starke 45:417-420)。因此，A和B1链的长度不足9nm,B2和B3链的长度为18～27nm，而B4+链的长度大于36nm。
在本文中，“核酸”一词是指一种大分子，可以是单链或双链的，由含有糖、磷酸和嘌呤或嘧啶的单体(核苷酸)组成。“核酸片段”是指一种特定核酸分子的一部分。在高等植物中，脱氧核糖核酸(DNA)是遗传物质，而核糖核酸(RNA)参与DNA中信息向蛋白的传递。“基因组”是一种生物中每个细胞中所含的全部遗传物质。“核苷酸序列”是指一种DNA或RNA聚合物，它可以是单链或双链的，可任何含有能掺入DNA或RNA聚合物中的合成的、非天然的或改变了的核苷酸碱基。
在本文中，“基本上类似”是指可能发生了碱基变化，但不会导致其所编码的氨基酸改变的DNA序列，或发生了能改变一个或几个氨基酸的碱基变化，但不会影响由其所编码的蛋白的功能特性的DNA序列。因此，可以这样理解，本发明包括具体示例性序列以外的序列。同样可行的是能产生沉默突变的序列修饰，如发生在序列上的缺失、插入或取代，这种修饰不会明显影响所产生的蛋白分子的功能特性。例如，体现遗传密码简并的基因序列改变或导致在特定位点产生化学上等同氨基酸的基因序列改变是可行的；因此，编码一种疏水氨基酸丙氨酸的密码子可以被编码诸如甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的另一种疏水氨基酸残基的密码子所取代。类似地，能导致一种带负电荷的残基取代另一种带负电荷的残基，如由天冬氨酸取代谷氨酸的变化，或能导致一种带正电荷的残基取代另一种带正电荷的残基，如由赖氨酸取代精氨酸的变化，预计也可以产生一种生物学意义上的等同产物。能导致蛋白分子的N-末端和C-末端部分改变的核苷酸变化同样可以期望其不会改变该蛋白的活性。在某些场合，可能正好希望产生序列的某些突变，以研究这种改变对蛋白生物学活性的影响。所提出的修饰的每一种均为本领域技术人员所熟知，编码产物保留的生物学活性的测定亦为本领域技术人员熟知。而且，本领域技术人员了解，本发明所涉及的“基本上类似的”序列也可以通过其在严紧条件下(0.1×SSC,0.1％SDS,65℃)与本文列举的序列杂交的能力确定。
“基因”是指编码一种特定蛋白的全部或部分的核酸片段，并包括该编码区前面(5′非编码区)和后面(3′非编码区)的调控序列。“天然基因”是指具有其自身的调控序列的天然状态的基因。“嵌合基因”是指包括异源调控序列和编码序列的基因。“内源基因”是指正常存在于其在基因组中的天然基因座上的天然基因。“外源基因”是指正常情况下宿主生物中没有的、通过基因转移导入的基因。“外源基因”还可以是指正常存在于宿主生物中的，但又被重新导入其基因组中其天然基因座之外的另一基因座的基因，这种变化会导致一种内源基因的编码序列的一个或几个额外拷贝的出现。
“编码序列”是指编码一种特定蛋白的，除非编码序列以外的DNA序列。
“起始密码子”和“终止密码子”是指编码序列上由3个相邻的核苷酸组成的一个单元，分别由它们规定蛋白合成(mRNA翻译)的起始和终止。“可读框”是指由翻译起始和终止密码子之间的编码序列编码的氨基酸序列。
“RNA转录物”是指由RNA聚合酶催化的DNA序列转录的产物。当RNA转录物是该DNA序列的完全互补的拷贝时，被称为“初级转录物”，它也可以是由初级转录物的转录后加工所产生的RNA序列。“信使RNA(mRNA)”是指能由细胞翻译成蛋白的RNA。“cDNA”是指双链DNA，其中的一条链互补于mRNA，并由该mRNA逆转录而来。“有义”RNA是指一种包括全部或部分mRNA的RNA转录物。“反义RNA”是指一种互补于一种目标初级转录物或mRNA的全部或部分的RNA转录物，它能通过干扰目标基因的初级转录物或mRMA的加工、转运和/或翻译而抑制其表达。反义RNA的互补性可以是针对特定基因转录物的任何部分的；即：5′非编码序列、3′非编码序列、内含子或编码序列。另外，在本文中，反义RNA可以包括核酶序列的区段，它可以增强反义RNA抑制基因表达的效率。“核酶”是指一种催化性RNA，它包括序列特异性的内切核糖核酸酶。
在本文中，合适的“调控序列”是指位于编码序列上游(5′)、中间、和/或下游(3′)的核苷酸序列，由它控制该编码序列的转录和/或表达。所述调控序列包括启动子、翻译前导序列、转录终止序列和聚腺苷酸化序列。在人工DNA构建体中，调控序列还可以控制反义RNA的转录和稳定性。
“启动子”是指基因上的一段DNA序列，通常位于其编码序列上游，由它通过识别RNA聚合酶和正确转录所需的其它因子而控制该编码序列的表达。启动子还可以含有参与蛋白因子结合的DNA序列，所述蛋白因子根据生理或发育状态控制转录起始效率。它还可以含有增强子元件。
“增强子”是能够激发启动子活性的DNA序列。它可以是启动子的天然元件或是插入的外源元件，能提高启动子的含量和/或组织特异性。“组成型”启动子是指能在几乎所有组织中指导基因表达并表现出很小的时序和发育调节的启动子。在本文中，“器官特异”或“发育特异”启动子分别是指几乎仅能在诸如叶或种子的特定器官或在某一器官的特定发育阶段，如胚胎发育前期或后期指导基因表达的启动子。
“可操作地连接”是指一个核酸分子上的若干核酸序列，这些序列相互联系，使其中一个序列的功能受另一个序列的影响。例如，当一个启动子能够影响一个结构基因(即：一个编码一种淀粉分支酶的基因)的表达时，该启动子与该结构基因是可操作地连接的(即：该结构基因是受该启动子的转录控制)。
在本文中，“表达”一词意指由一个基因编码的功能性最终产物的产生。更具体地讲，“表达”是指由本发明的核酸片段转录成有义(mRNA)或反义RNA，该RNA与细胞的蛋白质装置结合，使蛋白产物的含量发生变化。“反义抑制”是指反义RNA转录物的产生能够抑制目标蛋白表达。“超量表达”是指一种基因产物在转基因生物中的产量超过其在正常或非转基因生物中的产量。“共抑制”是指基本上类似于一个内源基因的基因的表达可导致该异位基因和内源基因的表达受到抑制。“改变了的含量”是指一种基因产物在转基因生物中的产生，在数量或比例上不同于正常或非转化生物。本领域技术人员可以理解，本发明所期望的表型效应，即玉米淀粉中支链分布的改变，可以通过改变，可以通过改变转基因生物中所产生的基因产物相对正常的或非转化生物中该基因产物的含量而实现；包括由反义抑制或共抑制介导的基因表达的减弱，和由超量表达介导的基因表达的加强。
“3L非编码序列”是指一个基因的DNA序列部分，包括一个聚腺苷酸化信号和任何能影响mRNA加工或基因表达的调控信号。聚腺苷酸化信号通常以影响向mRNA前体的3′末端加入聚腺苷酸片段为特征。
“转化”是指一种核酸片段转入一种宿主生物的基因组中，导致遗传学上稳定的遗传。含有所述转化核酸片段的宿主生物被称作“转基因”生物。
“糊化”一词是指淀粉粒或淀粉粒悬浮液的一种不可逆转的物理变化，其特征是淀粉粒膨胀和水化、悬浮液粘度的迅速提高和由该悬浮液生成一种溶胶。这种变化也被称作蒸煮或明胶化。缩略语“SNU”是指搅拌数量单位，大致等于10厘泊，它是一种粘度单位。为了转换成SI单位(帕斯卡秒)，用厘泊乘以1000，即，1PaSec=1000cp。因此，1SNU=0.01PaSec。“溶胶”一词是指一种流体胶体系统。“粘度”一词是指一种流体的内部摩擦参数，可将其视为流体的稠度(consistency或thickness)。
本发明涉及转基因玉米植物的构建，其中，对编码参与淀粉分支的酶的基因的表达进行调控，以实现支链淀粉的支链分布、直链淀粉与支链淀粉的相对比例和淀粉中直链淀粉聚合度的变化。上述淀粉精细结构的改变，可导致自所述转基因玉米植物中提取的淀粉的物理特性的变化。淀粉精细结构的这种变化可导致具有有利于食品及工业应用特性的新型淀粉的产生。
业已分离出很多编码糖类分支酶的基因，并进行了测序。其中包括源于下列生物的糖原分支酶：酿酒酵母(Thon等(1992)J.Biol.Chem.267:15224-15228)、大肠杆菌(Baecker等(1986)J.Biol Chem.261:8738-8743)、嗜热脂肪芽胞杆菌(Kiel等(1991)Mol.Gen.Genet.230:136-144)、热溶芽胞杆菌(Kiel等(1992)DNA Seq 3:221-232)、人类(Thon等(1993)J.Biol.Chem.268:7509-7513)、构巢曲霉(Kiel等(1990)Gene89:77-84)、天蓝色链霉菌(EMBL入藏编号X73903)、金霉素链霉菌(Homerova,D.和Kermanec,J.(1994)Biochem.Biopgys.Acta 1200:334-336)，还包括源于玉米(Baba等(1991)Biochem.Biophys.Res.Commun.181:87-94；Fisher等(1993)Plant Physiol.102:1045-1046)；Fisher等(1995)Plant Physiol.108:1313-1314)、豌豆(Burton等(1995)Plant J.7:3-15)、马铃薯(Poulsen,P.和Kreiberg,J.D.(1993)Plant Physiol.102:1053-1054)、木薯(Salehuzzaman等(1992)Plant Mol.Biol.20:809-819)、稻(Kawasaki等(1993)Mol.Gen.Genet.237:10-16；Mizuno等(1993)J.Biol.Chem.268:19084-19091)和拟南芥(EMBL入藏编号为U18817和U22428)的淀粉分支酶。其中，优选玉米淀粉分支酶基因。当目的基因的核苷酸序列已知或源于另一种生物的同源基因的序列是已知的时，可以用本领域技术人员所惯于采用的方法分离该基因。可将目的基因的序列资料用于制备用来从合适的基因文库中鉴定并分离完整分支酶基因的寡核苷酸探针。该文库可以是一个基因组文库，其中，其编码区可包含于一个DNA片段上或包含于几个不同的DNA片段上。而且，可以由一个或几个内含子隔离编码该分支酶的两个或两个以上的外显子。另外，所述文库还可以是cDNA文库，其中，分离到包括作为一个连续序列的完整编码区的cDNA克隆的可能性较大。在任何情况下，均可通过与相应于目的基因的一个或几个部分的探针的DNA-DNA杂交鉴定合适的克隆。另外，可以制备寡核苷酸引物，并将其用作PCR引物，以便扩增并在随后从基因组DNA或从上述基因组或cDNA文库中分离全部或部分分支酶编码区。
可以用几种不同的分析方法测分支酶的活性。在磷酸化酶激发试验(Boyer,C.D.和Preiss,J.(1978)Carbohydr Res.61:321-334)中，活性是根据分支酶激发磷酸酶a由葡萄糖-1-磷酸生成α-D-葡聚糖的能力而间接测定的。碘染色试验是基于葡聚糖-多碘化物复合物的吸收值降低，这种现象是直链淀粉或支链淀粉分支的结果(同上)。在第三种试验，即分支键试验中，将还原的直链淀粉用作底物，而酶的活性是在用异淀粉酶消化产物后通过测定还原末端的产生而测出的(Takeda等(1993)Carbohydr.Res.240:253-262)。Guan和Preiss((1993)Plant Physiol.102:1269-1273)将碘染色试验和分支键试验用于区分玉米中3种淀粉分支酶的催化特性。SBE1在使直链淀粉分支方面具有较高活性，而SBEⅡa和SBEⅡb表现出以支链淀粉为底物的较高分支速率。可以根据其所转移的α-1,4-葡聚糖链的长度进一步区分其同工型：SBEⅠ优先转移较长的葡聚糖链，而SBEⅡa和SBEⅡb倾向于转移较短的链。因此，测定酶活性的试验可用于确定蛋白的功能活性，基于氨基酸水平的同源性或DNA水平的杂交作用，已将该蛋白确认为淀粉或糖原分支酶。还可将其用于鉴定淀粉或糖原分支酶，这种酶用诱变方法做过处理，该诱变方法是为了鉴定或改变在决定催化特性方面起着一定作用的氨基酸残基而设计的。另外，利用Guan和Preiss的发现(同上)，可基于底物或产物选择性将天然或诱变酶分成SBEⅠ或SBEⅡ-样。
为了改变玉米的淀粉精细结构，构建了一种嵌合基因，其中，编码淀粉分支酶的基因的表达受适于在以下场合表达所述基因的调控元件的控制：1)在希望的植物组织中，2)在能产生最大目的效果的发育阶段，和3)在基因表达水平上，它会导致淀粉分支酶功能的改变，使所述表达影响淀粉精细结构的可检测到的、明显的变化。
外源基因在植物中的表达方法已相当完善(De Blaere等(1987)Meth.Enzymol.143:277-291)。有义或反义分支酶基因在玉米中的适当表达水平可能需要采用使用了不同调控元件的不同嵌合基因。而且，通过共抑制或反义抑制而对内源分支酶基因表达所作的有效调控，可能需要构建包括分支酶有义或反义序列不同区段的嵌合基因。共抑制和反义方法的广为人知的不可预测性表明，即使使用不同的遗传构建体，但为了鉴定具有理想表型的植株必须对很多植株进行筛选。
用于在转基因植物中启动基因表达的启动子可来自很多来源，只要所选择的启动子具有足够的转录活性，可通过在希望的宿主组织中表达可翻译的mRNA或反义RNA而完成本发明即可。例如，用于在多种植物器官中表达的启动子包括在花椰菜花叶病毒中指导19S和35S转录物(Odell等(1985)Nature 313:810-812；Hull等(1987)Virology 86:482-493)、核酮糖1,5-二磷酸羧化酶小亚基(Morelli等(1985)Nature 315:200-204；Broglie等(1984)Seience 224:838-843；Hererra-Estrella等(1984)Nature 310:115-120；Coruzzi等(1984)EMBO J.3:1671-1679；Faciotti等(1985)Bio/Technology 3:241)和叶绿素a/b结合蛋白(Lamppa等(1986)Nature 316:750-752)的启动子。
根据应用目的，可能希望选择可以在植物一种或几种器官中表达的启动子。其例子包括核酮糖1,5-二磷酸羧化酶小亚基的光诱导启动子(如果希望在光合器官中进行表达的话)，或专门在种子中起作用的启动子。
优选的启动子为可以在种子中进行特异表达的启动子。这一点是特别有用的，因为种子是长期淀粉积累的主要场所。另外，种子特异性表达可以避免分支酶调控可能对非种子器官造成的任何潜在损害作用。种子特异性启动子的例子包括，但不限于种子贮存蛋白启动子。种子贮存蛋白是受到严格调控的，几乎仅能在种子中以高度器官特异和阶段特异的方式表达(Higgings等(1984)Ann.Rev.Plant Physiol.35:191-221；Goldberg等(1989)Cell 56:149-160；Thompson等(1989)BioEssays 10:108-113)。而且，不同的种子贮存蛋白可以在种子发育的不同阶段表达。
目前已有很多用于在转基因植物中进行种子贮存蛋白的种子特异性表达的例子。其中包括来自单子叶植物的基因，如编码大麦β-大麦醇溶蛋白(Marris等(1988)Plant Mol.Biol.10:359-366)和小麦麦谷蛋白(Colot等(1987)EMBO J.6:3559-3564)的基因。另外，可操作地连接于嵌合基因构建体的异源编码序列上的种子特异基因的启动子，在转基因植物中也保持其时序及空间表达方式。上述例子包括将方扁豆蛋白或拟南芥属2S自蛋白启动子连接于巴西果2S白蛋白编码序列上，并在烟草、拟南芥或蔓菁中表达该结构(Altenbach等(1989)Plant Mol.Biol.13:513-522；Altenbach等(1992)Plant Mol.Biol.18:235-245；De Clercq等(1990)Plant Physiol.94:970-979)，用豆类凝集素和豆类β-云扁豆蛋白启动子表达萤光素酶(Riggs等(1989)Plant Sci.63:47-57)，和用小麦麦谷蛋白启动子表达氯霉素乙酰转移酶(Colot等(1987)EMBO J.6:3559-3564)。
特别适合于表达本发明核酸片段的启动子是来自几种已作过深入研究的玉米种子贮存蛋白基因的启动子，如源于10kD玉米醇溶蛋白基因(Kirihara等(1988)Gene 71:359-370)、15kD玉米醇溶蛋白基因(Hoffman等(1987)EMBO J.6:3213-3221；Schernthaner等(1988)EMBO J.7:1249-1253；Williamson等(1988)Plant Physiol.88:1002-1007)、27kD玉米醇溶蛋白基因(Prat等(1987)Gene 52:51-49；Gallardo等(1988)PlantSci.54:211-281)和19kD玉米醇溶蛋白基因(Marks等(1985)J.Biol.Chem.260:16451-16459)的胚乳特异性启动子。已报导的上述启动子在玉米中的相对转录活性(Kodrzyck等(1989)PlantCell1:105-114)可以作为选择用于在玉米上使用的嵌合基因构建体的启动子的依据。另外，启动编码淀粉生物合成的酶的基因表达的启动子可用来实践本发明。其中，包括蔗糖合成酶基因的5′调控序列(Yang,N.,-S.和Russell,D.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.87:4144-4148)和蜡质或颗粒结合淀粉合成酶Ⅰ基因的5′调控序列(Unger等(1991)Plant Physiol.96:124)。启动子元件可源于其它淀粉合成酶(颗粒结合及可溶性异构型)基因(如果可行的话)，并可源于sh2(Bhave等(1990)Plant Cell2:581-588)和bt2(Bae等(1990)Maydica 35:317-322)基因，该基因的产物构成一种酶，ADP-葡萄糖焦磷酸化酶。可以用相关的cDNA克隆(Baba等(1991)Biochem.Biophys.Res.Commun.181:87-94；Fisher等(1993)Plant Physiol.102:1045-1046)作为探针实现编码淀粉分支酶基因的基因组克隆的分离。这将为分离上述基因的启动子片段提供有用的开端。为了组装SBE构建体，其上游序列可以由关联SBEⅡ基因或由SBEⅠ基因提供。
预计，将增强子或增强子样元件导入其它启动子构建体之后也可产生较高水平的初级转录，以实现本发明。其中，包括诸如存在于35S启动子上的病毒增强子(Odell等(1988)Plant Mol.Biol.10:263-272)、源于冠瘿碱基因的增强子(Fromm等(1989)Plant Cell1:977-984)、或源于任何其它来源的、在插入可操纵地连接于本发明核酸片段上的启动子后能产生较强转录作用的增强子。
自玉米Adh-1和Bz-1基因中分离的内含子(Callis等(1987)Genes Dev.1:1183-1200)，和玉米Shrunken-1(sh-1)基因的内含子1和外显子1(Maas等(1991)Plant Mol.Biol.16:199-207)也可用于加强导入基因的表达。用玉米醇脱氢酶(Adh-1)基因的第一内含子获得的结果表明，当把该DNA元件插入异源基因的转录单位后，mRNA含量可比正常含量提高6.7倍。用玉米肌动蛋白基因的内含子3观察到了类似的内含子增强水平(Luehrsen,K.R.和Walbot,V.(1991)Mol.Gen.Genet.225:81-93)。还注意到了由Adh1内含子6产生的基因表达增强作用(Oard等(1989)Plant Cell Rep 8:156-160)。业已发现，玉米sh-1基因的外显子1和内含子1在玉米悬浮培养物中可分别将报告基因的表达提高10倍和100倍。当组合使用时，发现上述元件可将报导基因的表达提高1000倍(Maas等(1991)PlantMol.Biol.16:199-207)。
能够产生聚腺苷酸化信号的任何3′非编码区及正确表达所必须的其它调控序列均可用于实现本发明。其中包括源于任何贮存蛋白的3′末端，如10kd、15kd、27kd和α-玉米醇溶蛋白基因的3′末端，豆类云扁豆蛋白基因3′末端，大豆b-conglycinin基因3′末端；源于病毒基因的3′末端，如35S或19S花椰菜花叶病毒转录物的3′末端；源于冠瘿碱合成基因的3′末端；核酮糖1,5-二磷酸羧化酶或叶绿素a/b结合蛋白基因的3′末端；或来自任何来源的3′末端，使所采用的序列在其核酸序列中产生必要的调控信息，导致与它可操纵的连接的启动子/编码区组合结构的正确表达。本领域中有很多介绍不同3′-非编码区用途的例子(例如，参见Ingelbrecht等(1989)Plant Cell1:671-680)。
对本领域技术人员来说，有多种将一个DNA序列(即：转化DNA序列)导入高等植物的真核细胞的方法(参见EPO公开号0 295 959 A2和0 138 341 A1)。上述方法包括用涂有核酸构建体的金属粒子进行的高速粒子轰击(参见Klein等(1987)Nature(London)327:70-73，同时参见US4,945,050)，还包括基于以土壤杆菌的Ti和Ri质粒为基础的转化载体，特别是这种载体的二元形式的方法。由Ti衍生的载体能转化多种高等植物，包括单子叶和双子叶植物，如大豆、棉花和油菜(Pacciotti等(1985)Bio/Technology 3:241；Byrne等(1987)Plant Cell,Tissue and Organ Culture 8:3；Sukhapinda等(1987)Plant Mol.Biol.8:209-216；Lorz等(1985)Mol.Gen.Genet.199:178-182；Potrykus等(1985)Mol.Gen.Genet.199:183-188)。
本领域技术人员还了解其它转化方法，如外源DNA构建体的直接摄入(见EPO公开号0 295 959 A2)，和电击技术(见Fromm等(1986)Nature(London)319:791-793)。细胞一旦转化之后，即可由本领域技术人员再生。还涉及几种最近披露的将核酸片段导入有商业价值的作物中的方法，如导入油菜籽(见De Block等(1989)PlantPhysiol.91:694-701)、向日葵(Everett等，(1987)Bio/Technology 5:1201-1204)、大豆(McCabe等(1988)Bio/Technology 6:923-926；Hinchee等(1988)Bio/Technology6:915-922；Chee等(1989)Plant Physiol.91:1212-1218；Christou等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:7500-7504；EPO公开号0 301 749 A2)、和玉米(Gordon-Kamm等(1990)Plant Cell2:603-618；Fromm等(1990)Bio/Technology8:833-839)。
本领域技术人员还熟悉生产转基因玉米植物的其它方法，包括将DNA导入原生质体中并由该原生质体再生植株(Omirulleh等(1993)Plant Mol.Biol.21:415-423)，完整组织的电击作用(D′Hulluin等(1992)Plant Cell4:1495-1505；Lauren等(1994)Plant Mol.Biol.24:51-61)、由碳化硅介导的玉米细胞的纤维转化作用(Kaeppler等(1992)Theor.Appl.Genet.84:560-566；Frame等(1994)Plant J.6:94l-948)。除了上述用粒子轰击玉米愈伤组织细胞的方法之外，本领域技术人员还熟知用粒子轰击玉米胚鳞或悬浮培养物，以产生可育的转基因植物的方法(Koziel等(1993)Bio/Technology11:194-200；Walters等(1992)PlantMol.Biol.18:189-200)。
一旦用上述方法之一获得了转基因植物，就必须筛选能最有效地表现所希望的表型的转基因单株。本领域技术人员熟知的是，带有相同构建体的转基因单株可能在表达水平上有差异；这种现象通常被称为“位置效应”。例如，当相关的构建体被设计成以较高水平表达感兴趣的基因时，植物单株在蛋白产量方面会有所变化，并因此在酶活性方面有所变化；这种变化又会影响其表型。
本领域技术人员可以理解，为了减弱特定基因的表达，要特别注重有关反义或共抑制技术的应用。美国专利US 5,190,931、US5,107,065和US 5,283,323介绍了这类方法的可行性，但广为人知的是其效率无法预测。无论何时，为节省时间起见，本领域技术人员都会制备含有待抑制基因的一个或几个不同部分的多个遗传构建体，因为现有技术未披露一种用于预测对于特定基因来说哪一种构建体最为有效的方法。而且，即使是最有效的构建体也仅能在所分离的一部分转基因单系中产生有效的抑制表型。例如，据WO 93/11245和WO94/11516披露，当试图抑制脂肪酸脱饱和酶基因在canola中的表达时，仅在不足1％的试验过的品系中取得了有效抑制。在其它种中，抑制的百分比略多一些，但抑制百分比没有达到100％的时候。
不应将其视为是对本发明的局限，而应视其为能为本领域技术人员理解和期望的实际情况。因此，本领域技术人员可以提出用于筛选大量转化体的方法。上述筛选的性质通常为根据实际情况进行选择，而且，它不是本发明的固有部分。例如，在本发明中，人们可以通过观察淀粉表型的变化进行筛选，用层析或其它方法方法测定直链淀粉与支链淀粉的相对比例，支链淀粉的支链分布、RVA分析(按实施例所述方式进行)。同样可以利用由受抑制基因编码的蛋白的特异性抗体，或建立专门测定酶活性的分析方法。优选方法应当是可以迅速处理大量样品的方法，因为预计大部分样品将会是阴性的。
被鉴定为在颖果中具有改变了的淀粉结构的植株具有特殊的遗传物质，它能产生超过传统玉米品系和已知淀粉突变型的优点。在玉米育种中使用其SBE异构型表达受到抑制的品系可提供一种显性性状，它可以简化并加快育种过程。可以采用已知的淀粉突变型，但其通常是隐性的，并具有更高的复杂性。另外，用反义或共抑制来抑制SBE异构型，会因为染色体位置效应而导致不同程度的抑制。所产生的不同水平的SBE活性可以导致出现多种表型，而这种情况在使用传统突变型时是不可能的，传统突变型仅能导致在玉米胚乳中出现有限剂量系列的突变型等位基因。通过使新育成的具有受抑制的SBE的玉米品系相互杂交和/或与已知的诸如wx或ae的淀粉突变型杂交，可以产生其它特殊的、有潜在利用价值的淀粉精细结构。
                        实施例
在下面的实施例中将对本发明作进一步说明。应当理解的是，所提供的实施例只是用于说明的，本发明并不局限于在实施例中所披露的用途。可将本发明用于产生转基因玉米植物，其改性了的淀粉可应用于用到其特性的任何目的，例如，包括但不限于食品、纸、塑料、粘合剂或涂料。通过阅读以上说明及以下的实施例，本领域技术人员可以查明，并在不超出本发明构思及范围的前提下对本发明做出各种改变和改进，以使其适应各种用途和条件。所有此类改进均被视为落在所提出的权利要求范围内。
                         例1
制备能表达玉米淀粉分支酶Ⅱb的3′反义转录物的转基因玉米
以质粒克隆pBE 240的cDNA插入片段为起点组建希望在转基因玉米植物中实现SBEⅡb表达抑制的DNA构建体。已按照布达佩斯条约的规定将编码玉米淀粉分支酶Ⅱb(以下称SBEⅡb)的cDNA克隆保存在ATCC(美国典型培养物保藏中心，12301 Parklawn Drive,Rockville,MO20852)，所给的入藏编号为：ATCC97365。pBE240(图1)包括一个自玉米cDNA文库中分离的2.7kbp的EcoRⅠ-XhoⅠ片段，它被插入质粒载体pBluescriptTMSK+(Stratagene)中。该插入片段(序列1)由78bp的5′非翻译DNA、编码玉米SBEⅡb编码区的可读框和190bp的3′非翻译DNA组成。编码3′反义构建体的表达载体的构建
插入质粒构建体pBE44(图2)的嵌合基因包括相对于玉米27kD玉米醇溶蛋白启动子呈反义方向的SBEⅡbcDNA的3′片段，所述27kD片段位于该SBEⅡb片段的5′末端，还包括位于所述SBEⅡb片段3′末端的10kD玉米醇溶蛋白3′末端。该SBEⅡb片段是用合适的寡核苷酸引物通过pBE240的聚合酶链式反应(PCR)而生成的。所述引物是在一台Beckman Oligo 1000TMDNA Synthesizer上合成的。pBE44的414bp片段(序列2)是用寡核苷酸对BE41(序列3)和BE42(序列4)制成的：
BE41 5′-GAATTCCCGGGGTGTTCAACTTCCACTGC-3′(序列3)
BE42 5′-GAATTCCATGGGACACCTTGAAGGTCTT-3′(序列4)
将克隆位点(NcoⅠ或SmaⅠ)掺入所述寡核苷酸中，以便在插入按下述方法消化过的载体pML103中时使该DNA片段为反义方向。扩增是在标准PCR混合物中以100ml的反应体积进行的，该混合物由溶解于10mM Tris-HCl,pH8.3中的0.4mM各种寡核苷酸和0.3pMpBE240、50mMKCl、1.5mMMgCl2、0.001％w/v明胶、200mMdGTP、200mM dATP、200mM dTTP、200mM dCTP和0.025单位AmplitaqTM DNA聚合酶组成。在一台Perkin-Elmer CetusThermocyclerTM上进行30轮次的反应，包括在95℃下1分钟，在55℃下2分钟和在72℃下3分钟，在最后一轮反应之后在72℃进行最后的7分钟延伸。用限制酶NcoⅠ和SmaⅠ消化扩增的DNA，并在0.7％低熔点琼脂糖凝胶上，在40mMTris-乙酸，pH8.5,1mMEDTA中分离。从上述凝胶上切取合适的带，在68℃下熔化，并与质粒pML103(图3)的4.9kb NcoⅠ-SmaⅠ片段混合。已按照布达佩斯条约将质粒pML103保存在ATCC(美国典型培养物保藏中心，12301 ParklawnDrive,Rockville,MD20852)，所给的入藏编号为：ATCC97366。来自pML103的DNA片段，含有一个玉米27kD玉米醇溶蛋白基因的1.05kbSalⅠ-NcoⅠ启动子片段，和一个源于载体pGem9Zf(+)(Promega)上的玉米10kD玉米醇溶蛋白基因的3′末端的0.96kb的SmalⅠ-SalⅠ片段。大致按已知方法(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.(1989)Molecular Cloning,Cold Spring HarborLaboratory Bress,New York；以下称“Maniatis”)在15℃下连接载体与插入DNA过夜。用连接的DNA转化大肠杆菌XL1-Blue(Epicurian Coli XL-lBlueTM；Stratagene)。通过用限制酶消化质粒DNA筛选细菌转化体，并用双脱氧链终止法进行有限的核苷酸序列分析(SequenaseTMDNA Sequencing Kit；U.S.Biothemical)。所得到的质粒构建体pBE44包括一个沿5′→3′方向编码玉米27kD玉米醇溶蛋白启动子、玉米SBEⅡbcDNA的3′片段、和10kD玉米醇溶蛋白3′片段的嵌合基因。
通过碱裂解法制备较大量的pBE44质粒DNA，随后通过CsCl密度梯度离心进行纯化。用3′反义构建体转化玉米
从由近交玉米品系H99和LH132的杂交种所产生的，发育中的颖果上剥离未成熟的玉米胚。在授粉后将该胚隔离10-11天，此时其长度为1.0-1.5mm。使其轴向侧面向下地放置该胚，并保持与琼脂糖固化的N6培养基(Chu等(1975),Sci.Sin.Peking 18:659-668)接触。在27℃下、在黑暗中保持该胚。脆性胚发生愈伤组织由未分化的细胞团组成，它带有生长在由上述未成熟胚的盾盖发育成的胚柄上的体细胞性前胚状体和胚状体。在N6培养基养上述自初级外植体上分离的胚发生愈伤组织，并每隔2-3周在该培养基上进行一次继代培养。
将质粒p35S/Ac(图4；获自Dr.Peter Eckes,Hoechst Ag,Frankfurt,Germany)用于转化实验，以提供合适的选择标记。该质粒含有编码膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)的Pat基因(见欧洲专利公开号0 242 236)。酶PAT可产生对诸如膦丝菌素的除草用谷氨酰胺合成酶抑制剂的抗性。p35S/Ac上的pat基因受源于花椰菜花叶病毒的35S启动子(Odell等(1985)Nature 313:810-812)和源于根瘤土壤杆菌Ti质粒的T-DNA的冠瘿碱合成酶基因的3′区的控制。
用粒子轰击法(Klein等(1987),Nature 327:70-73)将基因转入愈伤组织培养细胞中。用以下方法将金粒子(直径为1μm)涂以DNA。将质粒DNAs(10μgp35S/Ac和10μgpBE44)加入50μl金粒子悬浮液(60mg/m1)中。将CaCl2(50μl2.5M溶液)和精胺游离碱(20μl1.0M溶液)加入该粒子中。在加入上述溶液期间对该悬浮液进行涡旋搅拌。10分钟后对装有悬浮液的试管进行简单地离心处理(15,000rpm,5秒)，并除去上清液。将金粒子再悬浮于200μl无水乙醇中，再次离心并除去上清液。再进行一次乙醇漂洗，并以30μl的最终体积将金粒子重新悬浮于乙醇中。将一份涂有DNA的金粒子等分试样(5μl)放入KaptonTM飞盘(flying disc)(Bio-Rad Labs)中部。用一台BialisticTMpDS-100/He(Bio-Rad Instrunents,Hercules CA)加速所述金粒子，使其进入玉米组织，采用的氦气压力为1000psi，间距为0.5cm，飞行距离为1.0cm。
为了进行轰击，将胚发生组织放在盖在由琼脂糖固化的N6培养基上的滤纸上面。将所述组织排成薄层状，并盖住一个直径约为5cm的圆形部位。将盛有该组织的培养皿放入PDS-1000/He室中，距离停止屏大约8cm。然后排出该室中的空气，使其真空度达到28英寸Hg柱。用爆破膜通过氮气冲击波加速所述大型粒子，当冲击管中的He压力达到1000psi时所述膜炸裂。
在进行轰击7天后将所述组织转移到含有gluphosinate(2mg/l)但缺乏酪蛋白或脯氨酸的N6培养基中。该组织在这种培养基上继续缓慢生长。再过2周后将该组织转移到新的含有gluphosinate的N6培养基上。6周后，在某些盛有添加了glufosinate的培养基的平板上对直径大约为1cm的生长旺盛的愈伤组织部分进行鉴定。在选择培养基上继代后让该愈伤组织继续生长。
通过首次将组织团转移到以0.2mg/l的浓度添加了2,4-D的N6培养基上，由转基因愈伤组织再生植株。2周后将该组织转至再生培养基(Fromm等(1990)Bio/Technology8:833-839)上。在使用pBE44构建体的一次转化实验中，共再生了9个玉米植株。含有3′反义构建体的转基因玉米植物的分子分析
从用pBE44进行的转化实验所再生的植株的叶组织中提取总DNA，大致按Dellaporta等所述方法(Dellaporta等(1983)Plant Mol.Biol.Rep.1(4):9)进行。将冻干的组织在液氮中冷冻，研磨成细粉，并悬浮在由100mMTris-HCl,pH8.0,50mMEDTA,10mMb-巯基乙醇和0.5MNaCl组成的缓冲液中。加入SDS至1％浓度裂解细胞，并用异丙醇使其DNA沉淀。溶解的DNA用无DNase的RNase处理，再用异丙醇沉淀。将所提取的DNA溶于10mMTris-HCl,pH8.0,1mMEDTA中，并在-20℃下保存待用。
为了进行Southern印迹分析，在合适的缓冲液中，在37℃下用限制酶(10单位/mgDNA)消化5mg提取到的DNA6小时左右。将限制DNA加样到放在Tris-硼酸-EDTA缓冲液中的0.8％琼脂糖凝胶(Maniatis)上，并在40V电压下电泳过液。变性并中和，然后用10×SSC将DNA转移到ImmobilonTM膜(Millipore Corporation)上。在已知的(Maniatis)水成缓冲系统中，在65℃下对ImmobilonTM膜进行预杂交，该缓冲体系由6×SSPE、5×Denhardt′s试剂、0.5％SDS和100mg/ml变性的鲑精DNA组成。通过切口平移(BRL NickTranslation Kit)标记pBE44的SBE片段，并以1-2×106cpm/ml的含量加入添加了5％葡聚糖硫酸酯的上述缓冲液中。在65℃下进行18小时杂交。在室温下，依次用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS洗涤杂交膜15分钟，然后在50℃下用0.5％SDS洗涤15分钟。用洗涤过的膜使Dupont RenectionTM胶片曝光，采用增感屏，在-80℃进行。
为了作Northern印迹分析，从在传粉后20-22天(DAP)收获的种子中提取总RNA。每株约收集10粒种子，并在液氮中冷冻。将冷冻的组织研磨成细粉。加入苯酚-三氯甲烷-异戊醇(24∶24∶1；3ml)并用于对该组织糊进行简单的手工均浆。混入4.5ml提取缓冲液(1MTris-HCl,pH9.0,1％SDS,5％β-巯基乙醇)，并使该悬浮液离心(4℃,7500rpm,SS-34)，以除去碎片。用苯酚-三氯甲烷-异戊醇提取上清液，并通过乙醇沉淀收集核酸。从溶解的沉淀物中分离RNA，做法是：用0.2MLiCl进行选择性沉淀，随后再用乙醇二次沉淀。将RNA溶于无菌水，并在-80℃下保持待用。通过在260nM波长下测溶液的吸收值计算RNA浓度(假设A260=1相当于40mg/mL)。
通过与乙二醛反应使总RNA变性，并在1％琼脂糖凝胶上，在10mM磷酸钠缓冲液pH7.0(Maniatis)中进行分离。用20×SSC作为转移介质，将RNA转移到HybondTM尼龙膜上，然后通过在UVStratalinkeTM(Stratagene)中照射将其固定在固体支持物上。在42℃下对印迹作18小时的预杂交，预杂交是在由50％甲酰胺、6×SSPE、5×Denhardt′s,0.5％SDS、100mg/mL变性鲑精DNA组成的缓冲液中进行的。杂交是在42℃下，在添加了5％葡聚糖硫酸酯并含有1-2×106cpm/mL变性的切口平移探针的同一种缓冲液中进行。在室温下，在2×SSC,0.1％SDS中洗涤印迹15分钟，接着在1×SSC,0.1％SDS中洗涤15分钟。接着再在50℃下在0.1×SSC、0.5％SDS中第三次洗涤15分钟。在-80℃下由洗涤过的印迹对Dupont ReflectionTM胶片曝光，使用增感屏。
在由用pBE44构建体进行的粒子轰击再生的9个转基因植物品系中，通过Southern印迹分析证实其中的7个含有所述标记基因。对从上述品系中提取的总RNA进行Northern印迹分析表明，SBEⅡbRNA的含量是变化的；在分析过的6个品系中，同样出现了500个碱基的转录物。这种杂交RNA的大小与预测的pBE44嵌合基因的反义转录物一致。分析从含有3′反义构建体的转化玉米植物中获取的淀粉
从来自3′反义构建体转化的玉米植物上的单粒种子中提取淀粉。在含有1.0％乳酸和0.3％偏亚硫酸氢钠的溶液(pH3.82)中浸泡玉米种子，在52℃下保持22-24小时。排尽浸泡液，漂洗种子，并分别在8-9mL100mMNaCl溶液中匀浆，向每个试管中加入5ml甲苯，并用涂料混合器剧烈振摇2次共6分钟，并沉降30分钟。将2mL100mMNaCl喷在上述溶液上，沉降30分钟，并吸出蛋白-甲苯层。重复以上甲苯洗涤步骤。加入12mL水，并在涂料振荡器上振荡45秒。将该溶液离心10分钟，并除去水。重复水洗步骤，接着用12mL丙酮进行最后的洗涤。在振荡和离心步骤后排出丙酮，并使其蒸发1小时。在40℃下温育淀粉提取物过夜。
按以下方法对提取的淀粉进行酶促脱支。在2mL水中通过加热至115℃保持0.5小时使从单粒种子中提取的淀粉(10mg)明胶化。将含于50mM NaOAc缓冲液，pH4.5中的4个单位的异淀粉酶(Sigma)加至每种明胶化淀粉中，并放入水溶中在45℃下保持2.5小时。将样品加热至115℃保持5分钟使酶失活。通过0.45μm的滤膜过滤每一种样品，并放入单独的自动进样器瓶中。在45℃下保持样品直至加注。
加注50mL脱支的淀粉样品，并在45℃下顺序排列的4个柱(3×250A和1×500A ultrahydrogelTM；Waters)，以0.7mL/分的流速用50mM NaOAc洗脱。取样间隔为65分钟。将折射率检测仪(Waters)、积分仪/绘图仪(Spectra-Physics)和微机分别用于样品检测、记录保留时间和储存层析谱。将收集到的样品的保留时间与支链淀粉标准物(380K、100K、23.7K、5.8K、728和180mw)的保留时间进行比较。
将Spectra-Physics GPC-PC软件用于对所述层析谱进行一切基线校正，包括扣除空白层析谱。将Spectra-Physics GPC-PC软件用于输入支链淀粉标准物的分子量和保留时间。将上述数据输入Microsoft Excel中进行分析，并除去除分子量和层析谱面积百分比之外的所有数据。将其余数据用于通过Jandel Scientific Peafit软件测定支链淀粉的支链分布。按Ong等所述方法((1994)Carbohydrate Res.260:99-117)将一组6条高斯曲线对应于所述层析谱的支链淀粉部分。
对支链淀粉的描述通常是以支链在分子中的分布进行的。支链淀粉分子是由交替的结晶区和非晶区组成。结晶区是有很多分支点(α-1,6键)的部分，而非晶区是少有以至没有分支，且少有支链的部分。链的类型被称为A或B。A链是不分支的，而且跨越一个结晶区。B1链也跨越一个结晶区，但是分支的。B2、B3和B4+链是分支的，并分别跨越2、3和4或4个以上结晶区(Hizukuri(1986)Carbohydrate Res.147:343-347)。将6条高斯曲线下面的相对面积用于测定A、B1、B2、B3和B4+链的面积百分比，所述相对面积相应于层析谱的支链淀粉部分，是用Peakfit软件测定的。将第一峰和第二峰的面积相加，以得到A和B1链的相对量，第三峰和第四峰分别代表B2和B3链，而第五峰与第六峰的和代表B4+链的相对面积。A和B1、B2、B3和B4链的质量平均值分别为14、22、43和69。
用上述方法分析从pBE44(用于玉米SBEⅡb的3′反义构建体)转化的植株的一粒R1种子中获取的淀粉。正如本领域技术人员所熟知的，反义现象并非普遍存在于每一个转基因品系。因此，检验了来自多个品系的单粒种子，而且，恰如所期望的，某些，而不是所有品系都具有能表现改性的淀粉表型的种子。在每一组试验中都包括一粒来自负对照植株的种子(Transformation Control Line 03376；对该品系进行过转化处理，但不具有所述反义基因)，并且对来自一粒种子的淀粉进行重复试验。表1中给出了由具有某种表型的转化玉米品系(0693)获得的一粒种子的结果(种子编号1和7)。其中的数据表示来自转化品系的种子与来自负对照(品系03376，对其作过转化处理，但不具有所述反义基因)种子的各种支链的百分比差。表1.支链淀粉支链分布的百分比差，支链淀粉源于自3′反义SBEⅡb转基因玉米品系(0693)的一粒种子中提取的淀粉和自负对照品系(03376)中提取的淀粉淀粉来源      A+B1  B2    B3     B4+06931         80    95    104    22606937         91    90    100    194
实验(06931和06937)和对照(03376)的数据均为重复测试来自一粒种子的淀粉的平均值。如表中所示，长链(B4+)大约增加了2倍(06931和06937分别为对照的226％和194％)，这表明相对对照淀粉而言，在具有反义基因的淀粉中长链(B4+)的增加是以较短的链(A′s,B1′s和B2′s)的减少为代价的。因此，与非转基因对照植物相比本发明的转基因植物具有独特的淀粉分支表型。上述数据表明，通过抑制编码淀粉分支酶的相关基因表达所致的玉米淀粉分支酶活性的改变，可导致改性的淀粉表型。
种植来自pBE44品系0693的R1种子，并产生R2颖果。用上述分析R1种子的相同方法分析一粒R2种子。在该试验中包括来自负对照品系(04659，对其作过转化处理，但其不具有所述反义基因)的一粒种子。表2中列出了关于R2种子的结果。表中的数据体现了R2种子与来自负对照的种子之间各种支链的百分比差。表2．支链淀粉的支链分布的百分比差，支链淀粉源于自3′反义SBEⅡb转基因玉米品系(05985)的一粒R2种子提取的淀粉和自负对照品系(04659)中提取的淀粉淀粉来源      A+B1  B2    B3     B4+059852        69    91    132    4760598510       71    92    129    455
从表中可以看出，相对对照淀粉(04659)而言，源于具有所述反义基因的R2种子的支链淀粉中长链(B3和B4+)的增多是以较短的链(A′s,B1′s和B2′s)的减少为代价的。因此，与非转基因的对照相比，本发明的转基因植物具有独特的淀粉分支表型。上述数据还表明，在R2种子上所观察到的表型比R1种子(表1)的强，这可能是由于分离所致。
生产R4颖果(品系XAY00681)，收获并提取淀粉。为了测定淀粉支链分布并测定直链淀粉含量，淀粉消化方法与前面实施例的方法相比略有改变，该方法如下。将7mg每种淀粉样品加入装有1.1mL水的螺口试管中。将试管加热至120℃，保持30分钟，然后放入45℃的水浴中。通过用每mL乙酸钠缓冲液(50mM,pH4.5)稀释50μL异淀粉酶(5×106单位/mL,Sigma)制成脱支溶液。向每种淀粉样品中加入40μL脱支溶液，并在45℃下温育3小时。通过加热至110℃，保持5分钟终止反应。将脱过支的淀粉冻干，并重新溶于DMSO中，以便通过凝胶渗透层析(GPC)进行分析。将100μL脱支淀粉加注到在100℃下的2个顺序连接的柱(Polymer Labs,Mixed Bed-C)上并流通，用DMSO以1.0mL/分的流速洗脱。取样间隔为25分钟。将一个折射率检测仪(Waters)与一个运行Chemstation软件(A.02.05版，Hewlett Paekard)的微机一起使用，以分别进行检测和数据收集和储存。将支链淀粉标准物(380K,100K,23.7K,5.8K,728和180mw)的保留时间用于确定脱支淀粉样品的分子量范围。对总淀粉的比例进行24种范围的聚合度(DP)测定，其范围跨越层析图谱的直链淀粉部分和支链淀粉部分。为了与上面报导的数据进行比较，将适当DP范围内的百分比面积相加，以得到该层析图谱支链淀粉部分的A和B1链，B2、B3和B4+链的数值。将超过DP150的总面积比例用于测定直链淀粉含量。
将来自品系XAY00681(R4)的淀粉和马齿型玉米淀粉(对照)脱支并进行分析。结果如下面的表3和表4所示。表3．源于含有玉米SBEⅡb的3′反义转录物的R4颖果的淀粉和普通马齿型玉米淀粉(对照)在特定聚合度(DP)范围内的总层析面积的百分比。给出了平均值(n=12)和平均标准误(SE)。
        马齿型玉米淀粉        XAY00681DP范围    平均值       SE    平均值      SE＞5k      5.45        0.14    5.59      0.633-5k      2.62        0.05    3.15      0.061.8-3k    3.03        0.04    3.89      0.091.2-1.8k  2.49        0.05    3.54      0.100.9-1.2k  1.92        0.04    2.67      0.06600-900   2.86        0.03    3.91      0.09400-600   2.78        0.05    3.83      0.08250-400   2.83        0.05    3.83       SE150-250   2.43        0.04    3.50      0.0990-150    2.38        0.04    3.50      0.0960-90     4.04        0.08    6.10      0.0748-60     4.08        0.07    4.81      0.0440-48     3.95        0.09    3.96      0.0532-40     4.52        0.13    4.45      0.0528-32     3.45        0.12    2.89      0.0424-28     3.69        0.17    3.37      0.0621-24     4.72        0.18    3.74      0.0518-21     6.01        0.03    4.83      0.1015-18     8.42        0.05    6.18      0.1213-15     7.24        0.21    5.34      0.1111-15     6.64        0.17    4.49      0.109-11      6.20        0.08    4.54      0.117-9       4.48        0.06    3.40      0.075-7       3.67        0.07    2.91      0.05表4．从含有玉米SBEⅡb的3′反义转录物的R4(XAY00681)颖果中提取的淀粉中支链淀粉支链分布的百分比差(以A+B1、B2、B3和B4+表示)和直链淀粉含量(占总淀粉量的％)，与对照(马齿型玉米)进行比较。给出了DP范围。A+B1(5-15) B2(15-32) B3(32-60) B4+(60-150)直链淀粉(＞150)83.3      89.0      117.4      184.5       128.4
如表3和4所示，与马齿型对照相比，含有玉米SBEⅡb3′反义转录物的淀粉中，直链淀粉的相对含量随着支链淀粉上较长支链比例的增加而增加。对源于3′反义构建体纯合的品系的淀粉的功能分析
为了获得进行功能测试所需的足够的淀粉，从品系05985的子代中分离pBE44构建体纯合的品系(XAT00025)的植株的种子。从来自品系XAT00025、马齿型玉米和ae玉米的干的成熟种子中提取淀粉。每个品系称取15g种子，放入50mL的锥形烧瓶中，并在52℃下用50mL浸泡液(同上)浸泡18小时。.倾出种子里的浸泡液，并用水漂洗。然后在50mL冷却的50mMNaCl中用20mm Polytron探针(Kinematica GmbH；Kriens-Luzern,Switzerland)将种子匀浆。通过72μm的网筛过滤匀浆液。用50mM NaCl将滤液调整至总体积为400mL,加入等体积甲苯。用磁力搅棒以足够高的速度将上述混合物搅拌1小时，以便两相充分乳化。在带盖的烧杯中使该乳液分离过夜。从烧杯中吸出上面的甲苯层并弃掉。重新悬浮留在烧杯底部的淀粉糊，注入250ml的离心管中，并以25,000 RCF离心15分钟。弃上清液，并以上述摇动和离心方式依次用水和丙酮洗涤。在用丙酮洗涤并离心之后，倾出丙酮，在室温下在通风橱中让淀粉干燥过夜。
将具有高灵敏度选择的Rapid Visco Analyzer(NewportScientific；Sydney,Australia)和Thermocline软件用于进行糊化曲线分析。称取每个品系的1.50g淀粉，放入样品杯中，加入25ml含有1％NaCl的磷酸/柠檬酸缓冲液(pH6.50)。用下列温度分布型进行糊化曲线分析：空载温度50℃，在50℃保持0.5分钟，线性加热至95℃保持2.5分钟，用4分钟时间线性冷却至50℃，在50℃下保持4分钟。
Rapid Visco Analyzer糊化分析的结果如图5所示。如图中所示，在糊化特性方面，由品系XAT00025产生的淀粉不同于普通马齿型玉米淀粉和来自ae突变纯合的品系的淀粉。上述结果表明，通过抑制一种淀粉分支酶表达所导致的淀粉精细结构的改变，可以产生具有新功能的淀粉。
                         例2
              制备能表达玉米淀粉分支酶
            Ⅱb的5′反义转录物的转基因玉米制备编码5′反义构建体的表达载体
插入质粒构建体pBE43的嵌合基因(图6)包括一个相对玉米27kD玉米醇溶蛋白启动子呈反义方向的SBEⅡbcDNA的5′片段，该启动子位于SBEⅡb片段的5′末端，还包括位于SEBⅡb片段3′末端的10kD玉米醇溶蛋白3′末端。该构建体的SBEⅡb片段是用合适的寡核苷酸引物通过pBE240的聚合酶链式反应(PCR)而生成的。所述引物是在一台Beckman Qligo 1000TMDNA Synthesizer上合成的。pBE43(序列5)的507bp片段是由寡核苷酸对BE39(序列6)和BE40(序列7)合成的：
BE395′-GAATTCCCGGGACCCGGATTTCGCTCTT-3′(序列6)
BE405′-GAATTCCATGGTCTATAGAGGCTGTACCG-3′(序列7)
将克隆位点(NcoⅠ或SmaⅠ)引入上述寡核苷酸中，以便将其插入消化过的pML103中时该DNA片段为反义方向，如下文所述。在标准PCR混合物中用100ml的反应体积进行扩增，所述标准PCR混合物由溶于10mM Tris-HCl(pH8.3)中的0.4mM的每种寡核苷酸和0.3pMpBE240、50mKCl、1.5mMMgCl2、0.001％w/v明胶、200mMdGTP、200mMdATP、200mMdTTP、200mMdCTP和0.025单位AmpliotaqTMDNA聚合酶组成。在一台Perkin-Elmer CetusThermocyclerTM中进行30轮反应，包括在95℃下1分钟，在55℃下2分钟和在72℃下3分钟，并在最后一轮反应之后在72℃下进行最后7分钟的延伸。用限制酶NcoⅠ和SmaⅠ消化扩增的DNA，并在0.7％低熔点琼脂糖凝胶上，在40m MTris-乙酸，pH8.5,1mM EDTA中分离。从上述凝胶上切取合适的带，在68℃下熔化，并与质粒pML103(图3)的4.9kbNcoⅠ-SmaⅠ片段混合。所述来自pML103的DNA片段含有玉米27kD玉米醇溶蛋白基因的1.05kbSalⅠ-NcoⅠ启动子片段，和来自载体pGem9Zf(+)(Promega)上的玉米10kD玉米醇溶蛋白基因的3′末端的0.96kbSmaⅠ-SalⅠ片段。在15℃下连接载体与插入DNA过夜，大致按已知方法(Maniatis)进行。用连接的DNA转化大肠杆菌XL1-Blue(Epicurian Coli XL-1 Blue′；StratageneTM)。通过对质粒DNA进行限制酶消化和用双脱氧链终止法(SequenaseTM DNA Sequencing Kit；U.S.Biochemical)进行有限的核苷酸序列分析筛选细菌转化体。所得到的质粒构建体pBE43包括-个沿5′→3′方向编码的嵌合基因，玉米27kD玉米醇溶蛋白启动子，沿反义方向的玉米SBEⅡb的5′片段和10kD玉米醇溶蛋白3′片段。
用碱裂解法制备大量的pBE43质粒DNA，然后通过CsCl密度梯度离心进行纯化。用5′反义构建体转化玉米
用大致如例1所披露的方法通过粒子轰击法将5′反义构建体(pBE43)导入胚发生玉米组织中。在轰击后7天以后，将该组织转移到含有gluphosinate(2mg/l)但缺乏酪蛋白或脯氨酸的N6培养基上。让该组织在该培养基上继续缓慢生长。再经过2周以后将该组织转移到含有gluphosinate的新鲜N6培养基上。6周以后，在某些盛有添加了glufosinate的培养基的平板上对直径大约为1cm的生长旺盛的愈伤组织部分进行鉴定。在选择培养基上继代后让该愈伤组织继续生长。
通过首次将组织团转移到以0.2mg/l的浓度添加了2,4-D的N6培养基上，由转基因愈伤组织再生植株。2周后将该组织转至再生培养基(Fromm)等(1990)Bio/Technology8:833-839)上。在用DNA构建体pBE43进行的2个独立的粒子轰击实验中共产生了99个转基因植物品系。含有5′反义构建体的转基因玉米植物的分子分析
按例1所披露的方法对自所述5′反义构建体(pBE43)转化的玉米植物中提取的DNA和RNA进行Southern印迹和Northern印迹分析。为了进行Southern印迹分析，按例1所述方法制备DNA探针。对由粒子轰击实验所产生的99个转基因植物品系中的28个进行Southern印迹分析，用SBEⅡbcDNA的666 bp的EcoRⅠ-BamHⅠ片段作为杂交探针。鉴定了20个带有标记基因的品系。杂交带的形式在从相当简单至相当复杂的范围内波动，在整合到玉米基因组中后与构建体DNA的复制和重排一致。
从35个pBE43-转化的植物品系中提取总RNA。将该RNA变性，通过凝胶电泳分离，吸印到尼龙膜上，并与含有完整SBEⅡbcDNA或其5′部分的探针杂交。不同品系的SBEⅡbRNA含量有很大差别，但未发现完全缺乏RNA的情况。这一结果是预料之中的，因为所述RNA是从种子的分离群体中制备的。除了2.7kbSBEⅡbRNA之外，在某些分析过的植物品系中还发现一类较小的RNA。这条带的强度是有所变化的，有8个品系表现出中等至弱的信号，而4个品系表现出强的信号。该RNA带的大小大约为600个碱基，与根据源于所述嵌合基因的反义转录物的预测结果吻合。
通过让Northern印迹与链特异性核糖探针杂交证实其身份。为了制备单链RNA探针，将构建体pBE43的SBEⅡbDNA片段亚克隆到修饰过的pBLUSCRIDT SK+载体上，该载体在其多接头的XbaⅠ位点上有一个NcoⅠ位点。为了合成有义(RNA等同)链，首先通过用NcoⅠ消化使所述质粒线性化，并在有(α-32P)rUTP的条件下，用一种RNA Transcription Kit(Stratagene)通过T7 RNA聚合酶进行转录。为了合成反义RNA探针，通过用EcoRⅠ消化使所述质粒线性化，然后进行由T3 RNA聚合酶催化的转录。Northern印迹的预杂交是在60℃下在50％甲酰胺、6×SSPE、1×Denhardt′s溶液和100mg/ml酵母t-RNA中进行的。杂交是在60℃下，在添加了5％葡聚糖硫酸酯，并含有1×106cpm/mlRNA探针的同一种缓冲液中进行18小时。在室温下用2×SSPE洗涤印迹15分钟，在70℃下用1×SSPE、0.1％SDS洗涤30分钟，然后在70℃下用0.1×SSPE,0.5％SDS洗涤30分钟。在-80℃下用洗过的印迹使Dupont Reflection胶片曝光，使用增感屏。相当于反义RNA链的探针仅能检查内源SBEⅡbRNA，而有义探针仅能检测600个碱基的那种RNA。这一结果与所述pBE43的反义转录物的600个碱基的RNA的身份相符。分析获自含有所述5′反义构建体的转化玉米植物的淀粉
用例1中披露的方法提取并分析来自用pBE43(玉米SBEⅡb的5′反义构建体)转化过的植物的一粒R1种子的淀粉。正如本领域技术人员所熟知的，反义或共抑制现象并非普遍存在于每一个转基因品系中。因此，对来自很多品系的一粒种子进行了检测。筛选的转基因品系中可见淀粉支链分布没有变化。据信，检验过的品系数量太少了，以致不能确保发现存在有效反义现象的植株。如上所述，需要筛选的植物数量可能无法预测而且很庞大。据认为，如果对足够大量的单株进行检测的话，就会检测到这种现象。也有可能是这种特定结构不能很有效地抑制该基因的表达；因此，制备并检验了多种构建体。
                         例3
         制备能表达玉米淀粉分支酶Ⅱb的接近完整
                长度的反义转录物的转基因玉米制备编码接近完整长度的反义构建体的表达载体
构建体pBE45类似于pBE43和pBE44，所不同的是其SBEⅡb片段为2.16kb，而且含有其完整的5′非翻译区及2.08kb的编码区(序列8)。首先用EcoRⅠ消化pBE240，再用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段进行末端补平反应(Maniatis)。在低熔点琼脂糖凝胶上分离平端DNA，并将切取的带与质粒pML103(图3)的4.9kbNcoⅠ-SmaⅠ片段混合。来自pML 03的DNA片段含有玉米27kD玉米醇溶蛋白基因的1.05kbSalⅠ-NcoⅠ启动子片段和来自载体pGem 9Zf(+)(Promega)的玉米10kD玉米醇溶蛋白基因的3′末端的0.96kbSmaⅠ-SalⅠ片段。大致按已知方法(Maniatis)将载体和插入DNA在15℃下连接过夜。用连接的DNA转化大肠杆菌XL1-Blue(EpicurianColiXL-1 BlueTM；Stratagene)。通过用KpnⅠ进行限制酶消化筛选细菌转化体中插入DNA的存在及取向，并用双脱氧链终止法(SequenaseTMDNA Sequencing Kit；U.S.Biochemical)进行有限核苷酸序列分析。根据上述分析，pBE45上的SBEⅡb片段是以与27kD玉米醇溶蛋白启动子相反的取向存在。所得到的质粒构建体pBE45包括一个沿5′→3′方向编码的嵌合基因，玉米27kD玉米醇溶蛋白启动子，沿反义方向的玉米SBEⅡb的接近完整长度的片段，和10kD玉米醇溶蛋白3′区(图7)。
通过碱裂解法制备大量pBE45质粒DNA，然后通过CsCl密度梯度离心进行纯化。用接近完整长度的反义构建体转化玉来
用大致如例1所述的粒子轰击法将接近完整长度的反义构建体(pBE45)导入胚发生玉米组织。在轰击后7天，将该组织转移到含有gluphosinate(2mg/l)但缺乏酪蛋白或脯氨酸的N6培养基上。让所述组织在该培养基上继续缓慢生长。再过2周后将该组织转至含有gluphosinate的新鲜N6培养基上。6周以后，在某些盛有添加了glufosinate的培养基的平板上对直径大约为1cm的生长旺盛的愈伤组织部分进行鉴定。在选择培养基上继代后让该愈伤组织继续生长。
通过首次将组织团转移到以0.2mg/l的浓度添加了2,4-D的N6培养基上，由转基因愈伤组织再生植株。2周以后将所述组织转至再生培养基上(Fromm等(1990)Bio/Technology 8:833-839)。在用DNA构建体pBE45进行的一次粒子轰击实验中产生了10个转基因植物品系。含有所述接近完整长度的反义构建体的转化玉米的分子分析
大致按例1所述方法对来自用接近完整长度的反义构建体(pBE45)转化的玉米植物的DNA和RNA进行Southern和Northern分析。为了作Southern分析，大致按例1方法制备DNA探针-pBE240的EcoRⅠ-BamHⅠ5′片段。在所产生的10个转基因植物品系中，测出5个为阳性，存在导入的标记基因。
在用SBEⅡbcDNA的EcoRⅠ-BamHⅠ5′片段检测时，总RNA的Northern印迹仅出现一条带。由于SBEⅡbRNA和pBE45反义转录物在大小上接近，分别为2.7和2.4kb，琼脂糖凝胶电泳似乎不能很好地分辨这两种片段。因此，又用大致如例1所述方法让Northern印迹与链特异性RNA探针杂交。不过，尽管反义链检测到内源SBEⅡbmRNA，但使用有义链探针时无信号出现。分析获自含有所述接近完整长度的反义构建体的转化玉米的淀粉
用例1所述方法分析获自用pBE45(玉米SBEⅡb的接近完整长度的反义构建体)转化的植物的一粒R1种子的淀粉。正如本领域技术人员所熟知的，反义现象并非普遍存在于每一个转基因品系中。因此，对来自多个品系的一粒种子进行了检测，而且，正如所预料的，某些，而不是所有品系都拥有表现改变了的淀粉表型的种子。表5中给出了获自表现出一种表型的转化玉米品系的种子的结果。表中数据体现了转化品系的种子与负对照(品系03376，对其做过转化处理，但不含有反义基因)的种子之间不同支链的百分比差。表5．支链淀粉的支链分布的百分比差，支链淀粉获自从接近完整长度的反义SBEⅡb转基因玉米品系(9228)的一粒种子中提取的淀粉和从负对照品系(03376)中提取的淀粉。淀粉来源    A+B1    B2    B3    B4+92283         92    97    81    192
从上表可以看出，与对照淀粉(03376)相比，在源于具有反义基因的玉米植物中，长链(B4+)的增加是以较短的链(A′s和B1′s，B2′s和B3′s)的减少为代价的。因此，与非转基因对照植物相比，本发明的转基因植物具有独特的淀粉分支表型。上述数据表明，通过抑制编码淀粉分支酶的有关基因的表达导致的玉米淀粉分支酶活性的改变，会导致改变了的淀粉表型。
                         例4
         制备能表达玉米淀粉分支酶Ⅱb的接近完整长度
                的有义转录物的转基因玉米制备编码所述接近完整长度的有义构建体的表达载体
质粒pBE96包括沿反义方向连接于27kD玉米醇溶蛋白启动子的SBEⅡbcDNA(序列9)的2.09kb片段，以及10kD玉米醇溶蛋白的3′末端(图8)。该SBEⅡb片段始于其编码区的起始ATG密码子，并止于其翻译终止密码子5′端312bp。对pBE240进行位点特异性诱变(SoulpterTM Mutagenesis Kit,Amersham)，以便在所述ATG起始位点产生一个NcoⅠ位点。首先用EcoRⅠ消化诱变的质粒，然后通过与Klenow片段反应使其成为平末端。通过用NcoⅠ消化释出该DNA片段，通过在低熔点琼脂糖凝胶上电泳进行分离，并按上述方法连接于pML103的NcoⅠ-SmaⅠ片段上。通过用NcoⅠ和HindⅢ进行限制酶消化检测SBEⅡb片段在大肠杆菌XL1-Blue转化体中的存在，随后进行核苷酸序列测定。由上述分析鉴定了pBE71。用PvuⅡ消化pBE71，以释出完整的嵌合基因(27kD玉米醇溶蛋白启动子-平截的SBEⅡb-10kD玉米醇溶蛋白3′末端)并将该片段克隆到载体pKS17上。pKS17含有潮霉素B磷酸转移酶基因，该基因可产生对抗生素潮霉素的抗性。通过将一个T7启动子-HPT-T7终止子嵌合基因插入除去了b-内酰胺酶基因的多拷贝载体而组建pKS17。所得到的质粒含有插入pKS17上的27kD玉米醇溶蛋白-平截的SBEⅡb-10kD玉米醇溶蛋白片段，将其称作pBE96。
                        例5
     制备能表达玉米分支酶Ⅰ的反义转录物的转基因玉米
用引物BE14(序列10)和BE15(序列11)通过聚合酶链式反应(PCR)由公开的SBEⅠcDNA序列(Baba等(1991)Biochem.Biophys.Res.Commun.181:87-94.)制备玉米SBEⅠDNA片段：
BE145′-AAGCTTGAATTCTGCTCGGTGATGAGACAC-3′(序列10)
BE155′-AAGCTTGAATTCCTTGGAGGTGATGGCTAC-3′(序列11)将BE14和BE15与λDNA混合于标准PCR反应混合物中，所述λDNA是从在λZapⅡ中的12 DAP玉米cDNA文库(Stratagene)的平板裂解物中制备的，所述PCR反应混合物由溶于10mMTris-HCl(pH8.3)中的0.4mM的每种寡核苷酸和0.8mg模板DNA、50mMKCl、1.5mMMgCl2、0.001％w/v明胶、200mMdGPT、200mMdATP、200mMdTTP、200mM dCTP和0.025单位AmplitaqTM DNA聚合酶组成，反应体积为100ml。用限制酶AccⅠ消化875bp PCR片段，以释出一个325bp的片段(包括公开序列的核苷酸2290-2610)，将该片段用作杂交探针，筛选12DAP玉米cDNA文库的全长SBEⅠ克隆。一个分离到的被称为pBE65的克隆，含有一个2772bp的EcoRⅠ插入片段(序列12)。已证实该克隆的核苷酸165-2772与Baba等所披露的玉米SBEⅠcDNA克隆序列((1991)Biochem.Biophys.Res.Commun.181:87-94)的同源性超过99％。然而，该插入片段5′末端的164bp与已知序列不一致。为了解决这一矛盾，我们尝试了用玉米总DNA作模板通过PCR扩增该基因的这一部分。分离到一个571bp的5′端片段，测序，发现它与所述cDNA的核苷酸49-188一致。然后，在制备下述的有义和反义SBEⅠ构建体，包括pBE68和pBE97时，将pBE65作为起点。在制备上述构建体并将其导入玉米中时，就出现了第二种SBEⅠ序列(Fisher等(1995)Plant Physiol.108:1313-1314)。pBE65的5′末端165bp与该序列的一致性不高，正像它与以前的的SBEⅠ序列的一致性不高一样。作为随后实验的结果，现在的结论是pBE65含有一个与SBEⅠ无关的165bp5′末端片段，该片段被假定为在克隆玉米cDNA时所产生的一种假象。该片段后面是一个2607bp的SBEⅠcDNA，该cDNA编码SBEⅠ转运肽的42个氨基酸，成熟SBEⅠ蛋白的760个氨基酸，并含有194bp的3′非翻译DNA。已根据布达佩斯条约规定将质粒pBE65保存于ATCC(美国典型培养物保藏中心，12301Parklawn DriVe,Rockville,MD20852)，所给的入藏编号为：____。制备编码SBEⅠ反义构建体的表达载体
由于尚不清楚所述cDNA序列的哪一部分可最有效地介导SBEⅠ表达的抑制，制备3种具有不同SBEⅠ片段的沿反义方向的构建体。质粒pBE68(图9)的嵌合基因包括相对玉米27kD玉米醇溶蛋白启动子为反义方向的SBEⅠcDNA 3′片段，所述启动子位于该SBEⅠ片段的5′端，还包括一个位于该SBEⅠ片段3′端的10kD玉米醇溶蛋白3′末端。该构建体的373bp SBEⅠ片段(序列13)是用寡核苷酸引物对BE43(序列14)和BE52(序列15)通过pBE65的PCR而获得的：
BE435′-GAATTCCCGGGCCGAACTCGTTCAAAG-3′(序列14)
BE525′-GAATTCCATGGCGGTGATGAGACACCAGTC-3′(序列15)pBE69(图10)的嵌合基因类似于pBE68的，不同的是其SBEⅠ片段由所述SBEⅠcDNA的5′部分组成。该构建体的571bp片段(序列16)是用引物对BE46(序列17)和BE50(序列18)通过扩增pBE65而获得的：
BE465′-GAATTCCATGGCCATCTTATGGTTTGCACC-3′(序列17)
BE505′-GAATTCCCGGGCATAGCATAGATATGACGGC-3′(序列18)将克隆位点(NcoⅠ和SmaⅠ)引入上述寡核苷酸，以便在将该DNA片段按例1所述方法插入载体pML103中时使其为反义方向。扩增是在例1所述标准PCR反应混合物中以100ml的反应体积进行的。在一台Perkin-Elmer Cetus ThermocyclerTM上完成30轮反应，包括在95℃下1分钟，在55℃下2分钟和在72℃下3分钟，在最后一轮反应之后，在72℃下进行最后7分钟延伸。用限制酶NcoⅠ和SmaⅠ消化扩增的DNAs，并在0.7％低熔点琼脂糖凝胶上，在40mMTris-乙酸，pH8.5,1mMEDTA中分离。将相当于SBEⅠcDNA的3′和5′片段的带从所述凝胶上切下来，在68℃下熔化，并按例1所述方法分别与质粒pML103(图3)的4.9kbNcoⅠ-SmaⅠ片段混合。大致按由Maniatis所披露的方法在15℃下连接载体和插入DNA过夜。构建体pBE72(图11)的嵌合基因包括相对玉米27kD玉米醇溶蛋白启动子呈反义方向的2.49kbSBEⅠ片段，该启动子位于该SBEⅠ片段的5′末端，和位于所述SBEⅠ片段3′末端的10kD玉米醇溶蛋白3′末端。pBE72(序列19)的SBEⅠ片段是通过用限制酶EcoRⅠ和HindⅢ消化pBE65，随后再与大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段反应而获得的。将该平端片段连接于pML103的经Klenow处理过的4.9kbNcoⅠ-SmaⅠ片段上，大致按Maniatis披露的方法进行。
将连接的DNAs用于转化大肠杆菌XL1-Blue(Epicurean ColiXL-1BlueTM；Stratagene)。通过限制酶消化质粒DNA初步筛选细菌转化体。对于pBE68和pBE69转化体而言，通过用NcoⅠ和SmaⅠ进行组合消化检测插入片段的存在。对于pBE72转化体而言，用SalⅠ消化DNA，以证实插入DNA的存在，并测定SBEⅠ片段相对27kD玉米醇溶蛋白启动子的取向。通过用双脱氧链终止法进行的有限核苷酸序列分析(SequenaseTMDNA Sequencing Kit；U.S.Biothemical)对确认的转化体作进一步鉴定。
随后将pBE72的嵌合基因导入例4所述的载体pKS17。通过用BamHⅠ进行部分消化方式释出pBE72上27kD玉米醇溶蛋白-BSEⅠ-10kD玉米醇溶蛋白DNA片段，并将其克隆到pKS17的BamHⅠ位点，以产生pBE72的潮霉素抗性等同物，称之为pBE108(图12)。用SBEⅠ反义构建体转化玉米
在独立的实验中，通过大致如例1所述的粒子轰击法将每种SBEⅠ反义构建体导入胚发生玉米组织。在轰击后7天，将该组织转至含有gluphosinate(2mg/l)，但缺乏酪蛋白或脯氨酸的N6培养基上。让该组织在该培养基上继续缓慢生长。再过2周后，将该组织转至含有gluphosinate的新鲜N6培养基上。6周以后，在某些盛有添加了gluphosinate的培养基的平板上对直径大约为1cm的生长旺盛的愈伤组织部分进行鉴定。在选择培养基上继代后让该愈伤组织继续生长。
通过首次将组织团转移到以0.2mg/l的浓度添加了2,4-D的N6培养基上，由转基因愈伤组织再生植株。2周后，将该组织转至再生培养基(Fromm等(1990)Bio/Technology 8:833-839)上。在用DNA构建体pBE68进行的粒子轰击实验中再生了9个转基因植物品系，在用DNA构建体pBE69进行的粒子轰击实验中再生了20个转基因植物品系，而在用DNA构建体pBE72进行的粒子轰击实验中再生了9个转基因品系。含有所述SBEⅠ反义构建体的转基因玉米植物的分子分析
大致按例1所述方法从转基因植物的叶组织中提取总DNA。为了对pBE68、pBE69和pBE72进行Southern印迹分析，在37℃下，在生产商提供的缓冲液中用限制酶XbaⅠ消化10mg提取到的DNA 6小时。在0.8％琼脂糖凝胶上，在Tris-磷酸-EDTA缓冲液(Maniatis)中，以40伏的电压将限制DNA电泳过夜，并转移到ImmobilonTM膜上。按例1所述方法对所述印迹进行预杂交、与切口平移的pBE65插入片段杂交和洗涤。
从转基因植株的发育(20-22DAP)种子中提取总RNA，并按例1所述方法制备Northern印迹。用切口平移的pBE65插入DNA探测印迹，并接着按例1所述方法洗涤。
在由用pBE68构建体进行粒子轰击而再生的9个转基因植物品系中，通过Southern印迹分析确认其中的5个含有标记基因。Northern印迹分析表明，在4个Southern阳性品系中，2.7kbSBEⅠmRNA的含量是不同的。另外，这些品系中的2个含有一个被认为是相当于由pBE68的嵌合基因规定的反义RNA的400个碱基的转录物。在用pBE69轰击而得到的20个转基因植物品系中，发现有8个含有pBE69DNA。在从2个pBE69转基因植物品系中提取的RNA里证实了600个碱基的反义转录物的存在。在9个所得到的pBE72转基因植物品系中，通过Southern印迹分析证实其中的6个为阳性，存在标记基因。分析获自含有所述3′和5′SBEⅠ反义构建体的转化玉米的淀粉
用例1所述方法从用pBE68(玉米SBEⅠ的3′反义构建体)和pBE69(玉米SBEⅠ的5′反义构建体)转化的植物的一粒种子中提取淀粉。正如本领域技术人员所熟知的，反义现象并非普遍存在于每一个转基因品系。因此，对来自多个品系的一粒种子进行了检测，而且正如所预料的，某些而不是所有品系都具有表现改变了的表型的种子。淀粉消化与前面的实施相比略有改变，方法如下。将7.0mg每种淀粉样品加入一个装有1.1mL水的螺口试管中。将该试管加热至120℃保持30分钟，然后放入45℃的水浴中。通过用每mL乙酸钠缓冲液(50mM,pH4.5)稀释50μL异淀粉酶(5×106单位/mL,Sigma)制备脱支溶液。向每种淀粉样品中加入40μL脱支溶液，并在45℃下温育3小时。通过加热至110℃保持5分钟终止反应。将脱支淀粉冻干并重新溶于DMSO中，以便通过凝胶渗透层析(GPC)进行分析。将100μL脱支淀粉加注到100℃下的2个顺序排列的柱(Polymer Labs,MixedBed-C)中，并使其在柱中流通，以1.0mL/分钟的速度用DMSO洗脱。取样间隔为25分钟。将一个折射率检测仪(Waters)与一个运行Chemstation Software(A.02.05版，Hewlet Packard)软件的微机一起使用，以分别进行检测和数据收集和储存。将支链淀粉标准物(380K,100K,23.7K,5.8K,728和180mW)的保留时间用于确定脱支淀粉样品的分子量范围。对于总淀粉的比例进行了24种范围的聚和度(DP)测定，其范围跨越层析谱的直链淀粉部分和支链淀粉部分。为了与上面报导的数据进行比较，将适当DP范围内的百分比面积相加，以得到该层析谱支链淀粉部分的A和B1链、B2、B3和B4+链的数值。将超过DP150的总面积比例用于测定直链淀粉含量。
用上述方法对从pBE69构建体呈阳性的品系(XAY01414)的12粒种子中制备的淀粉进行脱支和分析，并与来自非转化玉米的12粒种子进行比较。表6和7中给出了品系XAY01414及非转化对照的平均值和标准误。
表6．源于含有玉米SBEⅠ的5′反义转录物的R4种子的淀粉(XAY01414)和马齿型玉米淀粉(对照)在特定聚合度(DP)范围内的总层析面积百分比。给出了12粒种子的平均值和平均标准误(SE)。
          马齿型玉米淀粉    XAY01414
 DP围     平均值   SE   平均值  SE
＞5k        5.45 0.14    5.92 0.14
 3-5k       2.62 0.05    2.58 0.04
 1.8-3k     3.03 0.04    2.95 0.08
 1.2-1.8k   2.49 0.05    2.66 0.03
 0.9-12k    1.92 0.04    2.01 0.04
 600-900    2.86 0.03    2.94 0.06
 400-600    2.78 0.05    3.07 0.04
 250-400    2.83 0.05    3.23 0.04
 150-250    2.43 0.04    2.97 0.05
 90-150     2.38 0.04    3.61 0.06
 60-90      4.04 0.08    5.72 0.15
 48-60      4.08 0.07    4.94 0.10
 40-48      3.95 0.09    4.86 0.04
 32-40      4.52 0.13    5.59 0.14
 28-32      3.45 0.12    3.58 0.17
 24-28      3.69 0.17    4.40 0.08
 21-24      4.72 0.18    4.06 0.18
 18-21      6.01 0.03    5.64 0.23
 15-18      8.42 0.05    6.17 0.16
 13-15      7.24 021     5.92 0.28
 11-15      6.64 0.17    5.33 0.15
 9-11       6.20 0.08    4.71 0.13
 7-9        4.48 0.06    3.58 0.09
 5-7        3.67 0.07    3.44 0.06表7．从含有玉米SBEⅠ的5′反义转录物的R4种子中提取的淀粉(XAY01414)和对照(马齿型玉米)淀粉的支链淀粉支链分布的百分比差(以A+B1、B2、B3和B4+表示)和直链淀粉含量(占总淀粉量的％)的比较。给出了DP范围。A+B1(5-15) B2(15-32) B3(32-60) B4+(60-150) 直链淀粉(＞150)83.5      93.1      126.0      149.4         107.3
所述转化体的淀粉中直链淀粉和支链淀粉部分均已改变。在XAY01414系中，直链淀粉的总含量略有提高。支链淀粉的结构也有所改变，体现在较长链(B3和B4+)相对马齿型对照有所增加，而较短链的丰度不及马齿型玉米淀粉。
按上述方法从一个pBE68构建体呈阳性的品系(XAY00013)的12粒R4种子中制备淀粉并进行分析。表8和9中给出了该分析的结果。表8．源于含有玉米SBEⅠ3′反义转录物的R4种子的淀粉(XAY00013)和马齿型玉米淀粉(对照)在特定聚合度(DP)范围内的总层析面积百分比。给出了12粒种子的平均值和平均标准误(SE)。
         马齿型玉米淀粉   XAY00013
DP范围    平均值  SE   平均值  SE
＞5k        5.45 0.14    6.13 0.39
3-5k        2.62 0.05    2.46 0.06
1.8-3k      3.03 0.04    2.92 0.05
1.2-1.8k    2.49 0.05    2.51 0.06
0.9-1.2k    1.92 0.04    2.02 0.04
600-900     2.86 0.03    2.93 0.05
400-600     2.78 0.05    3.02 0.06
250-400     2.83 0.05    3.19 0.05
150-250     2.43 0.04    2.83 0.06
90-150      2.38 0.04    3.15 0.07
60-90       4.04 0.08    5.33 0.10
48-60       4.08 0.07    4.77 0.13
40-48       3.95 0.09    4.73 0.16
32-40       4.52 0.13    5.62 0.18
28-32       3.45 0.12    3.99 0.16
74-28       3.69 0.17    3.97 0.19
21-24    4.72    0.18    4.67    0.18
18-21    6.01    0.03    5.40    0.12
15-18    8.42    0.05    6.64    0.16
13-15    7.24    0.21    5.73    0.22
11-15    6.64    0.17    5.23    0.11
9-11     6.20    0.08    5.27    0.10
7-9      4.48    0.06    4.08    0.09
5-7      3.67    0.07    3.31    0.10表9．从含有玉米SBEⅠ3′反义转录物的R4种子中提取的淀粉与对照(马齿型)的支链淀粉支链分布百分比差(以A+B1、B2、B3和B4+表示)和直链淀粉含量(占总淀粉量的％)的比较。给出了DP范围。A+B1(5-15) B2(15-32) B3(32-60) B4+(60-150) 直链淀粉(＞150)
85.6     95.9     123.1     135.1          106.0与XAY01414品系类似，用pBE68构建体转化的品系在其淀粉的直链淀粉和支链淀粉组分两方面均有所改变。直链淀粉含量相对对照有所提高，而且支链淀粉中较长的链(B4+和B3)也增加了。直链淀粉含量的提高主要归功于DP大于5000的直链淀粉的增加。
因此，本发明的转基因植物与对照植物相比具有独特的淀粉分支特征，上述数据表明，通过抑制编码淀粉分支酶的相关基因的表达所导致的玉米淀粉分支酶活性的改变，可产生改变了的淀粉表型。
                         例6
制备能表达玉米淀粉分支酶Ⅰ的有义转录物的转基因玉米制备编码接近完整长度的有义构建体的表达载体
质粒pBE97包括pBE65的SBEⅠcDNA(序列20)的一个1.87kb片段，该片段沿有义方向连接于27kD玉米醇溶蛋白启动子和10kD米醇溶蛋白3′末端(图13)。该SBEⅠ片段包括cDNA克隆pBE65的核苷酸55-1919，因此也含有在SBEⅠ编码区DNA的其余1748bp之前的117bp的未知序列。该DNA片段是通过PCR一介导的位点特异性诱变而产生的，在pBE65序列的53位核苷酸处引入了一个NcoⅠ位点。在例1所述的标准PCR反应物中将合适的核苷酸引物与pBE65模板DNA混合。所产生的PCR片段含有一个ClaⅠ位点，其后有一个NcoⅠ位点，并止于pBE65序列的核苷酸612。用ClaⅠ和PstⅠ消化该DNA片段，并与pBE65上的相应部分交换，以得到pBE79。用BstEⅡ消化pBE97，并通过与DNA聚合酶的Klenow片段反应使其成为平端(Maniatis)。通过用NcoⅠ进行部分消化释出该DNA片段，通过在低熔点琼脂糖凝胶上电泳进行分离，并连接于例1所述的pML103的NcoⅠ-SmaⅠ片段上。通过用NcoⅠ和BamHⅠ进行限制酶消化筛选大肠杆菌XL-Blue转化体中SBEⅠ片段的存在。通过上述分析鉴定了pBE88。用BamHⅠ对pBE88进行部分消化，并通过在0.7％的低熔点琼脂糖凝胶上电泳分离含有27kD玉米醇溶蛋白-截短了的SBEⅠ-10kD玉米醇溶蛋白嵌合基因的3.87kb片段(Maniatis)。将该DNA片段克隆到在例4中披露的由BamHⅠ消化过的载体pKS17上。所得到的含有pKS17上的27kD玉米醇溶蛋白-截短了的SBEⅠ-10kD玉米醇溶蛋白插入片段的质粒被称作pBE97。
制备了玉米SBEⅠ的另外两种有义构建体：pBE110和pBE111。通过切除pBE65的假象5′序列并代之以SBEⅠ编码区的正确5′末端序列制备上述构建体的完整长度的有义片段及截短了的有义片段。为了制备完整长度的有义构建体，对上述质粒pBE97加以修饰，在pBE65插入片段的2674个核苷酸之后插入一个SmaⅠ限制位点。为了实现这一目的，通过用寡核苷酸对BE15(序列11)和BE67(序列21)作引物，以pBE65作模板DNA在例1所述的标准PCR反应混合物中进行PCR获得SBEⅠ cDNA的805bp 3′片段。其中：
BE155′-AAGCTTGAATTCCTTGGAGGTGATGGCTAC-3′(序列11)
BE675′-CGCGGATCCCGGGTTCCAAGGGCGCCAGCGG-3′(序列21)用限制酶BstEⅡ和SmaⅠ消化该PCR产物，并将消化产物克隆到由BstEⅡ和SmaⅠ消化过的pBE79上，得到pBE83。分两步将pBE83的SBEⅠ编码区片段亚克隆到载体pCC6上：首先克隆相当于其编码区片段3′末端的NcoⅠ-SmaⅠ片段，然后克隆相当于其编码区片段的5′末端的NcoⅠ片段。载体pCC6含有玉米10kD玉米醇溶蛋白基因的924bpEcoRⅠ-NcoⅠ启动子片段，其后面是一个含有10kD玉米醇溶蛋白编码区的453bp NcoⅠ-SmaⅠ片段，以及克隆载体pTZ18R(Pharmacia)上10kD玉米醇溶蛋白基因的944bp3′片段。含有该NcoⅠ-SmaⅠSBEⅠ片段的pCC6衍生物被命名为pBE85。用PvuⅡ对pBE85进行部分消化，并将4.7kb10kD玉米醇溶蛋白-SBEⅠ-10kD玉米醇溶蛋白片段插入PvuⅡ消化过的pKS17(例4)中。所得到的构建体被命名为pBE98，其含有SBEⅠcDNA片段5′末端的110bp的未鉴定序列。用寡核苷酸BE101(序列22)和BB3(序列23)：
BE1015′-AACTGCAGAAGGATCCCATGGTGTTGCCTCGTGTCGCCC-3′(序列22)
BB35′-GGATGCTTAAATGTGTACC-3′(序列23)以及用从19DAP玉米胚乳cDNA文库的平板裂解物中制备的λDNA(Stratagene)作模板，通过PCR获得SBEⅠcDNA的正确5′序列。用NcoⅠ和SstⅠ消化该748bp的PCR产物，以得到673bp的片段。用该DNA片段与pBE98上的相应部分进行交换，以得到pBE110。构建体pBE110的长度为7203bp，由包括SBEⅠ编码区的全部823个氨基酸的2565bp的SBEⅠcDNA片段(序列24)和96bp的3′非翻译DNA组成(图14)。该SBEⅠDNA片段的前面为玉米10kD玉米醇溶蛋白基因的启动子区，其后面是玉米10kD玉米醇溶蛋白基因的3′末端。
通过将一个截短了的SBEⅠ编码区片段组装到载体pBC24上制备截短了的有义SBEⅠ构建体pBE111。pBC24是一种pSK+衍生物，其中的XbaⅠ位点已通过与DNA聚合酶的Klenow片段反应补平，并连接于NcoⅠ接头上。因此pBC24缺乏XbaⅠ位点，并在其多接头区含有一个NcoⅠ位点。用限制酶NcoⅠ和BamHⅠ消化上述5′SBEⅠ片段，并将694bp的片段克隆到NcoⅠ-BamHⅠ消化过的pBC24上。再用BamHⅠ和SmaⅠ消化该中间产物，并连接于pBE83的1874bp BamHⅠ-SmaⅠ片段上，以得到pBE112。用BstEⅡ消化pBE112，与Klenow反应，然后用NcoⅠ进行部分消化。将释出的1809bp片段克隆到NcoⅠ-SmaⅠ部分消化的pBT752上。载体pBT752是例4所述pKS17的衍生物，它含有一个27kD玉米醇溶蛋白-玉米高硫玉米醇溶蛋白-10kD玉米醇溶蛋白嵌合基因，并且在潮霉素磷酸转移酶基因的翻译起始位点处缺乏NcoⅠ位点。对所得到的在NovaBlue(Novagen)上的转化体进行的分析消化表明，在克隆过程中，10kD玉米醇溶蛋白3′末端作为SmaⅠ片段被切除。由此从pBT752上提取到963bp SmaⅠ片段，并将其插入一个补平的HindⅢ位点，该位点恰好位于中间质粒pBE110.5的BstEⅡ/SmaⅠ接合点的下游。为了测定该3′末端片段相对嵌合的SBEⅠ基因的方向，通过用DraⅠ消化筛选转化体。通过该分析鉴定了pBE111。pBE111含有一个SBEⅠcDNA(序列25)的1809bp片段，该片段前面是27kD玉米醇溶蛋白启动子，其后面是10kD玉米醇溶蛋白3′末端(图15)。
                      例7
          将能表达玉米淀粉分支酶Ⅱb的
     反义转录物的转基因玉米用于与蜡质突变型组合
将一种带有玉米淀粉分支酶Ⅱb(pBE44)的3′反义转录物的玉米品系与已研究清楚的玉米淀粉突变型-蜡质突变型(WX)杂交。在杂交子代中鉴定蜡质突变型纯合的单个分离子。选择来自带有所述3′反义构建体的XAY00096品系(wx纯合)的种子。从这些种子中提取淀粉，并按例1所述方法用Rapid Visco Analyzer进行糊化分析。对照给出蜡质(wx)和纯合双突变型，直链淀粉延伸蜡质(ae wx)。在图16中可以发现品系XAY00096的特殊功能。如图16所示，与蜡质淀粉相比，XAY00096淀粉的糊化特性的糊化温度有所提高，但低于纯合ae wx型的糊化温度。其粘度比ae wx型高得多，而且在冷却后仍得以保持，这与wx型有所不同，wx型在糊化期间会损失其粘度。因此，这种新型淀粉具有独特的糊化特性，该特性有别于单蜡质型、SBEⅡb无义突变型(ae)、上述两种突变型的组合(ae wx)、或单转基因品系的糊化特性。因此，本发明具有通过将转基因品系与已知的淀粉突变型组合产生具有独特功能的淀粉的能力。
                序列表
  (1)一般资料：
  (ⅰ)申请人：
    (A)名称：E.I.DU PONT DENEMOURS AND COMPANY
    (B)街道：1007 MARKET STREET
    (C)城市：WILMINGTON
    (D)州：DELAWARE
    (E)国家：UNITED STATES OF AMERICA
    (F)邮编(ZIP):19898
    (G)电话：302-992-4927
    (H)传真：302-773-0164
    (I)电传：6717325
  (ⅱ)发明名称：通过修饰淀粉生物合成酶基因的表达而得到的新型淀粉
  (ⅲ)序列数：25
  (ⅳ)计算机可读形式：
    (A)媒体类型：塑料磁盘，3.50英寸
    (B)计算机：IBM PC兼容
    (C)操作系统：Windows 3.1
    (D)软件：Microsoft Word 6.0A
  (ⅴ)当前申请数据：
    (A)申请号：
    (B)申请日：
    (C)分类号：
  (ⅵ)在先申请数据：
    (A)申请号：06/009,113
    (B)申请日：1995年12月20日
  (ⅶ)律师/代理人资料：
    (A)姓名：BRUCE W.MORRISSEY
    (B)注册号：30,663
    (C)文件/档案号：BB-1066
(2)序列1资料：
  (ⅰ)序列特征：
    (A)长度：2665bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链链
    (D)拓扑结构：线性
  (ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
  (ⅸ)特征：
    (A)名称/关键词：CDS
    (B)位置：79..2476
(ⅹⅰ)序列描述：序列1：ACCCGGATTT CGCTCTTGCG GTCGCTGGGG TTTTAGCATT GGCTGATCAG TTCGATCCGA    60TCCGGCTGCG AAGGCGAG ATG GCG TTC CGG GTT TCT GGG GCG GTG CTC GGT     111
                Met Ala Phe Arg Val Ser Gly Ala Val Leu Gly
                  1               5                  10GGG GCC GTA AGG GCT CCC CGA CTC ACC GGC GGC GGG GAG GGT AGT CTA     159Gly Ala Val Arg Ala Pro Arg Leu Thr Gly Gly Gly Glu Gly Ser Leu
         15                  20                  25GTC TTC CGG CAC ACC GGC CTC TTC TTA ACT CGG GGT GCT CGA GTT GGA     207Val Phe Arg His Thr Gly Leu Phe Leu Thr Arg Gly Ala Arg Val Gly
     30                  35                  40TGT TCG GGG ACG CAC GGG GCC ATG CGC GCG GCG GCC GCG GCC AGG AAG     255Cys Ser Gly Thr His Gly Ala Met Arg Ala Ala Ala Ala Ala Arg Lys
 45                  50                      55GCG GTC ATG GTT CCT GAG GGC GAG AAT GAT GGC CTC GCA TCA AGG GCT     303Ala Val Met Val Pro Glu Gly Glu ASn Asp Gly Leu Ala Ser Arg Ala60                  65                  70                  75GAC TCG GCT CAA TTC CAG TCG GAT GAA CTG GAG GTA CCA GAC ATT TCT     351Asp Ser Ala Gln Phe Gln Ser Asp Glu Leu Glu Val Pro Asp Ile Ser
             80                  85                  90GAA GAG ACA ACG TGC GGT GCT GGT GTG GCT GAT GCT CAA GCC TTG AAC     399Glu Glu Thr Thr Cys Gly Ala Gly Val Ala Asp Ala Gln Ala Leu ASn
         95                 100                 105AGA GTT CGA GTG GTC CCC CCA CCA AGC GAT GGA CAA AAA ATA TTC CAG     447Arg Val Arg Val Val Pro Pro Pro Ser Asp Gly Gln Lys Ile Phe Gln
    110                 115                 120ATT GAC CCC ATG TTG CAA GGC TAT AAG TAC CAT CTT GAG TAT CGG TAC     495Ile Asp Pro Met Leu Gln Gly Tyr Lys Tyr His Leu Glu Tyr Arg Tyr
125                 130                 135AGC CTC TAT AGA AGA ATC CGT TCA GAC ATT GAT GAA CAT GAA GGA GGC     543Ser Leu Tyr Arg Arg Ile Arg Ser Asp Ile Asp Glu His Glu Gly Gly140                 145                 150                 155TTG GAA GCC TTC TCC CGT AGT TAT GAG AAG TTT GGA TTT AAT GCC AGC     591Leu Glu Ala Phe Ser Arg Ser Tyr Glu Lys Phe Gly Phe Asn Ala Ser
            160                 165                 170GCG GAA GGT ATC ACA TAT CGA GAA TGG GCT CCT GGA GCA TTT TCT GCA     639Ala Glu Gly Ile Thr Tyr Arg Glu Trp Ala Pro Gly Ala Phe Ser Ala
        175                 180                 185GCA TTG GTG GGT GAC TTC AAC AAC TGG GAT CCA AAT GCA GAT CGT ATG     687Ala Leu Val Gly Asp Phe Asn Asn Trp Asp Pro Asn Ala Asp Arg Met
    190                 195                 200AGC AAA AAT GAG TTT GGT GTT TGG GAA ATT TTT CTG CCT AAC AAT GCA     735Ser Lys Asn Glu Phe Gly Val Trp Glu Ile Phe Leu Pro ASn Asn Ala
205                 210                 215GAT GGT ACA TCA CCT ATT CCT CAT GGA TCT CGT GTA AAG GTG AGA ATG     783Asp Gly Thr ser Pro Ile Pro His Gly Ser Arg Val Lys Val Arg Met220                 225                 230                 235GAT ACT CCA TCA GGG ATA AAG GAT TCA ATT CCA GCC TGG ATC AAG TAC     831Asp Thr Pro Ser Gly Ile Lys Asp Ser Ile Pro Ala Trp Ile Lys Tyr
            240                 245                 250TCA GTG CAG GCC CCA GGA GAA ATA CCA TAT GAT GGG ATT TAT TAT GAT     879Ser Val Gln Ala Pro Gly Glu Ile Pro Tyr Asp Gly Ile Tyr Tyr Asp
        255                 260                 265CCT CCT GAA GAG GTA AAG TAT GTG TTC AGG CAT GCG CAA CCT AAA CGA     927Pro Pro Glu Glu Val Lys Tyr Val Phe Arg His Ala Gln Pro Lys Arg
    270                 275                 280CCA AAA TCA TTG CGG ATA TAT GAA ACA CAT GTC GGA ATG AGT AGC CCG     975Pro Lys Ser Leu Arg Ile Tyr Glu Thr His Val Gly Met Ser Ser Pro
285                 290                 295GAA CCG AAG ATA AAc ACA TAT GTA AAC TTT AGG GAT GAA GTC CTC CCA    1023Glu Pro Lys Ile Asn Thr Tyr Val Asn Phe Arg Asp Glu Val Leu Pro300                 305                 310                 315AGA ATA AAA AAA CTT GGA TAC AAT GCA GTG CAA ATA ATG GCA ATC CAA    1071Arg Ile Lys Lys Leu Gly Tyr Ash Ala Val Gln Ile Met Ala Ile Gln
            320                 325                 330GAG CAC TCA TAT TAT GGA AGC TTT GGA TAC CAT GTA ACT AAT TTT TTT    1119Glu His Ser Tyr Tyr Gly Ser Phe Gly Tyr His Val Thr Asn Phe Phe
        335                 340                 345GCG CCA AGT AGT CGT TTT GGT ACC CCA GAA GAT TTG AAG TCT TTG ATT    1167Ala Pro Ser Ser Arg Phe Gly Thr Pro Glu Asp Leu Lys Ser Leu Ile
    350                 355                 360GAT AGA GCA CAT GAG CTT GGT TTG CTA GTT CTC ATG GAT GTG GTT CAT    1215Asp Arg Ala His Glu Leu Gly Leu Leu Val Leu Met Asp Val Val His
365                 370                 375AGT CAT GCG TCA AGT AAT ACT CTG GAT GGG TTG AAT GGT TTT GAT GGT    1263Ser His Ala Ser Ser Asn Thr Leu Asp Gly Leu Asn Gly Phe Asp Gly380                 385                 390                 395ACA GAT ACA CAT TAC TTT CAC AGT GGT CCA CGT GGC CAT CAC TGG ATG    1311Thr Asp Thr His Tyr Phe His Ser Gly Pro Arg Gly His His Trp Met
            400                 405                 410TGG GAT TCT CGC CTA TTT AAC TAT GGG AAC TGG GAA GTT TTA AGA TTT    1359Trp Asp Ser Arg Leu Phe Asn Tyr Gly Asn Trp Glu Val Leu Arg Phe
        415                 420                 425CTT CTC TCC AAT GCT AGA TGG TGG CTC GAG GAA TAT AAG TTT GAT GGT    1407Leu Leu Ser Asn Ala Arg Trp Trp Leu Glu Glu Tyr Lys Phe Asp Gly
    430                 435                 440TTC CGT TTT GAT GGT GTG ACC TCC ATG ATG TAC ACT CAC CAC GGA TTA    1455Phe Arg Phe Asp Gly Val Thr Ser Met Met Tyr Thr His His Gly Leu
445                 450                 455CAA GTA ACA TTT ACG GGG AAC TTC AAT GAG TAT TTT GGC TTT GCC ACC    1503Gln Val Thr Phe Thr Gly Asn Phe Asn Glu Tyr Phe Gly Phe Ala Thr460                 465                 470                 475GAT GTA GAT GCA GTG GTT TAC TTG ATG CTG GTA AAT GAT CTA ATT CAT    1551Asp Val Asp Ala Val Val Tyr Leu Met Leu Val Asn Asp Leu Ile His
            480                 485                 490GGA CTT TAT CCT GAG GCT GTA ACC ATT GGT GAA GAT GTT AGT GGA ATG    1599Gly Leu Tyr Pro Glu Ala Val Thr Ile Gly Glu Asp Val Ser Gly Met
        495                 500                 505CCT ACA TTT GCC CTT CCT GTT CAC GAT GGT GGG GTA GGT TTT GAC TAT    1647Pro Thr Phe Ala Leu Pro Val His Asp Gly Gly Val Gly Phe Asp Tyr
    510                 515                 520CGG ATG CAT ATG GCT GTG GCT GAC AAA TGG ATT GAC CTT CTC AAG CAA    1695Arg Met His Met Ala Val Ala Asp Lys Trp Ile Asp Leu Leu Lys Gln
525                 530                 535AGT GAT GAA ACT TGG AAG ATG GGT GAT ATT GTG CAC ACA CTG ACA AAT    1743Ser Asp Glu Thr Trp Lys Met Gly Asp Ile Val His Thr Leu Thr Asn540                 545                 550                 555AGG AGG TGG TTA GAG AAG TGT GTA ACT TAT GCT GAA AGT CAT GAT CAA    1791Arg Arg Trp Leu Glu Lys Cys Val Thr Tyr Ala Glu Ser His Asp Gln
            560                 565                 570GCA TTA GTC GGC GAC AAG ACT ATT GCG TTT TGG TTG ATG GAC AAG GAT    1839Ala Leu Val Gly Asp Lys Thr Ile Ala Phe Trp Leu Met Asp Lys Asp
        575                 580                 585ATG TAT GAT TTC ATG GCC CTC GAT AGA CCT TCA ACT CCT ACC ATT GAT    1887Met Tyr Asp Phe Met Ala Leu Asp Arg Pro ser Thr Pro Thr Ile Asp
    590                 595                 600CGT GGG ATA GCA TTA CAT AAG ATG ATT AGA CTT ATC ACA ATG GGT TTA    1935Arg Gly Ile Ala Leu His Lys Met Ile Arg Leu Ile Thr Met Gly Leu
605                 610                 615GGA GGA GAG GGC TAT CTT AAT TTC ATG GGA AAT GAG TTT GGA CAT CCT    1983Gly Gly Glu Gly Tyr Leu Asn Phe Met Gly Asn Glu Phe Gly His Pro620                 625                 630                 635GAA TGG ATA GAT TTT CCA AGA GGT CCG CAA AGA CTT CCA AGT GGT AAG    2031Glu Trp Ile Asp Phe Pro Arg Gly Pro Gln Arg Leu Pro Ser Gly Lys
            640                 645                 650TTT ATT CCA GGG AAT AAC AAC AGT TAT GAC AAA TGT CGT CGA AGA TTT    2079Phe Ile Pro Gly Asn Asn Asn Ser Tyr Asp Lys Cys Arg Arg Arg Phe
        655                 660                 665GAC CTG GGT GAT GCA GAC TAT CTT AGG TAT CAT GGT ATG CAA GAG TTT    2127ASp Leu Gly Asp Ala Asp Tyr Leu Arg Tyr His Gly Met Gln Glu Phe
    670                 675                 680GAT CAG GCA ATG CAA CAT CTT GAG CAA AAA TAT GAA TTC ATG ACA TCT    2175Asp Gln Ala Met Gln His Leu Glu Gln Lys Tyr Glu Phe Met Thr Ser
685                  690                695GAT CAC CAG TAT ATT TCC CGG AAA CAT GAG GAG GAT AAG GTG ATT GTG    2223Asp His Gln Tyr Ile Ser Arg Lys His Glu Glu Asp Lys Val Ile Val700                 705                 710                 715TTC GAA AAG GGA GAT TTG GTA TTT GTG TTC AAC TTC CAC TGC AAC AAC    2271Phe Glu Lys Gly Asp Leu Val Phe Val Phe Asn Phe His Cys Asn Asn
            720                 725                 730AGC TAT TTT GAC TAC CGT ATT GGT TGT CGA AAG CCT GGG GTG TAT AAG    2319Ser Tyr Phe Asp Tyr Arg Ile Gly Cys Arg Lys Pro Gly Val Tyr Lys
        735                 740                 745GTG GTC TTG GAC TCC GAC GCT GGA CTA TTT GGT GGA TTT AGC AGG ATC    2367Val Val Leu Asp Ser Asp Ala Gly Leu Phe Gly Gly Phe Ser Arg Ile
    750                 755                 760CAT CAC GCA GCC GAG CAC TTC ACC GCC GAC TGT TCG CAT GAT AAT AGG    2415His His Ala Ala Glu His Phe Thr Ala Asp Cys Ser His Asp Asn Arg
765                 770                 775CCA TAT TCA TCC TCG GTT TAT ACA CCA AGC AGA ACA TGT GTC GTC TAT    2463Pro Tyr Ser Ser Ser Val Tyr Thr Pro Ser Arg Thr Cys Val Val Tyr780                 785                 790                 795GCT CCA GTG GAG T GATAGCGGGG TACTCGTTGC TGCGCGGCAT GTGTGGGGCT      2516Ala Pro Val GluGTCGATGTGA GGAAAAACCT TCTTCCAAAA CCGGCAGATG CATGCATGCA TGCTACAATA  2576AGGTTCTGAT ACTTTAATCG ATGCTGGAAA GCCCATGCAT CTCGCTGCGT TGTCCTCTCT  2636ATATATATAA GACCTTCAAG GTGTCAATT                                    2665
(2)序列2资料：
  (ⅰ)序列特征：
    (A)长度：414bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
  (ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
  (ⅹⅰ)序列2描述：序列2：GACACCTTGA AGGTCTTATA TATATAGAGA GGACAACGCA GCGAGATGCA TGGGCTTTCC   60AGCATCGATT AAAGTATCAG AACCTTATTG TAGCATGCAT GCATGCATCT GCCGGTTTTG  120GAAGAAGGTT TTTCCTCACA TCGACAGCCC CACACATGCC GCGCAGCAAC GAGTACCCCG  180CTATCACTCC ACTGGAGCAT AGACGACACA TGTTCTGCTT GGTGTATAAA CCGAGGATGA  240ATATGGCCTA TTATCATGCG AACAGTCGGC GGTGAAGTGC TCGGCTGCGT GATGGATCCT  300GCTAAATCCA CCAAATAGTC CAGCGTCGGA GTCCAAGACC ACCTTATACA CCCCAGGCTT  360TCGACAACCA ATACGGTAGT CAAAATAGCT GTTGTTGCAG TGGAAGTTGA ACAC        414
(2)序列3资料：
  (ⅰ)序列特征：
    (A)长度：29bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
  (ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
  (ⅹⅰ)序列描述：序列3：GAATTCCCGG GGTGTTCAAC TTCCACTGC                           29
(2)序列4资料：
  (ⅰ)序列特征：
    (A)长度：28bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
  (ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
  (ⅹⅰ)序列描述：序列4：GAATTCCATG GGACACCTTG AAGGTCTT                            28
(2)序列5资料：
  (ⅰ)序列特征：
    (A)长度：507bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
  (ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
  (ⅹⅰ)序列描述：序列5：TCTATAGAGG   CTGTACCGAT   ACTCAAGATG   GTACTTATAG   CCTTGCAACA   TGGGGTCAAT       60CTGGAATATT   TTTTGTCCAT   CGCTTGGTGG   GGGGACCACT   CGAACTCTGT   TCAAGGCTTG      120AGCATCAGCC   ACACCAGCAC   CGCACGTTGT   CTCTTCAGAA   ATGTCTGGTA   CCTCCAGTTC      180ATCCGACTGG   AATTGAGCCG   AGTCAGCCCT   TGATGCGAGG   CCATCATTCT   CGCCCTCAGG      240AACCATGACC   GCCTTCCTGG   CCGCGGCCGC   CGCGCGCATG   GCCCCGTGCG   TCCCCGAACA      300TCCAACTCGA   GCACCCCGAG   TTAAGAAGAG   GCCGGTGTGC   CGGAAGACTA   GACTACCCTC      360CCCGCCGCCG   GTGAGTCGGG   GAGCCCTTAC   GGCCCCACCG   AGCACCGCCC   CAGAAACCCG      420GAACGCCATC TCGCCTTCGC AGCCGGATCG GATCGAACTG ATCAGCCAAT GCTAAAACCC    480CAGCGACCGC AAGAGCGAAA TCCGGGT                                        507
(2)序列6资料：
  (ⅰ)序列特征：
    (A)长度：28bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
  (ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
  (ⅹⅰ)序列描述：序列6：GAATTCCCGG GACCCGGATT TCGCTCTT                            28
(2)序列7资料：
  (ⅰ)序列特征：
    (A)长度：29bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
  (ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
  (ⅹⅰ)序列描述：序列7：GAATTCCATG GTCTATAGAG GCTGTACCG                           29
(2)序列8资料：
  (ⅰ)序列特征：
    (A)长度：2165bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
  (ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
  (ⅹⅰ)序列描述：序列8：
AATTCATATT TTTGCTCAAG ATGTTGCATT GCCTGATCAA ACTCTTGCAT ACCATGATAC 60
CTAAGATAGT CTGCATCACC CAGGTCAAAT CTTCGACGAC ATTTGTCATA ACTGTTGTTA 120
TTCCCTGGAA TAAACTTACC ACTTGGAAGT CTTTGCGGAC CTCTTGGAAA ATCTATCCAT 180TCAGGATGTC CAAACTCATT TCCCATGAAA TTAAGATAGC CCTCTCCTCC TAAACCCATT  240GTGATAAGTC TAATCATCTT ATGTAATGCT ATCCCACGAT CAATGGTAGG AGTTGAAGGT  300CTATCGAGGG CCATGAAATC ATACATATCC TTGTCCATCA ACCAAAACGC AATAGTCTTG  360TCGCCGACTA ATGCTTGATC ATGACTTTCA GCATAAGTTA CACACTTCTC TAACCACCTC  420CTATTTGTCA GTGTGTGCAC AATATCACCC ATCTTCCAAG TTTCATCACT TTGCTTGAGA  480AGGTCAATCC ATTTGTCAGC CACAGCCATA TGCATCCGAT AGTCAAAACC TACCCCACCA  540TCGTGAACAG GAAGGGCAAA TGTAGGCATT CCACTAACAT CTTCACCAAT GGTTACAGCC  600TCAGGATAAA GTCCATGAAT TAGATCATTT ACCAGCATCA AGTAAACCAC TGCATCTACA  660TCGGTGGCAA AGCCAAAATA CTCATTGAAG TTCCCCGTAA ATGTTACTTG TAATCCGTGG  720TGAGTGTACA TCATGGAGGT CACACCATCA AAACGGAAAC CATCAAACTT ATATTCCTCG  780AGCCACCATC TAGCATTGGA GAGAAGAAAT CTTAAAACTT CCCAGTTCCC ATAGTTAAAT  840AGGCGAGAAT CCCACATCCA GTGATGGCCA CGTGGACCAC TGTGAAAGTA ATGTGTATCT  900GTACCATCAA AACCATTCAA CCCATCCAGA GTATTACTTG ACGCATGACT ATGAACCACA  960TCCATGAGAA CTAGCAAACC AAGCTCATGT GCTCTATCAA TCAAAGACTT CAAATCTTCT 1020GGGGTACCAA AACGACTACT TGGCGCAAAA AAATTAGTTA CATGGTATCC AAAGCTTCCA 1080TAATATGAGT GCTCTTGGAT TGCCATTATT TGCACTGCAT TGTATCCAAG TTTTTTTATT 1140CTTGGGAGGA CTTCATCCCT AAAGTTTACA TATGTGTTTA TCTTCGGTTC CGGGCTACTC 1200ATTCCGACAT GTGTTTCATA TATCCGCAAT GATTTTGGTC GTTTAGGTTG CGCATGCCTG 1260AACACATACT TTACCTCTTC AGGAGGATCA TAATAAATCC CATCATATGG TATTTCTCCT 1320GGGGCCTGCA CTGAGTACTT GATCCAGGCT GGAATTGAAT CCTTTATCCC TGATGGAGTA 1380TCCATTCTCA CCTTTACACG AGATCCATGA GGAATAGGTG ATGTACCATC TGCATTGTTA 1440GGCAGAAAAA TTTCCCAAAC ACCAAACTCA TTTTTGCTCA TACGATCTGC ATTTGGATCC 1500CAGTTGTTGA CGTCACCCAC CAATGCTGCA GAAAATGCTC CAGGAGCCCA TTCTCGATAT 1560GTGATACCTT CCGCGCTGGC ATTAAATCCA AACTTCTCAT AACTACGGGA GAAGGCTTCC 1620AAGCCTCCTT CATGTTCATC AATGTCTGAA CGGATTCTTC TATAGAGGCT GTACCGATAC 1680TCAAGATGGT ACTTATAGCC TTGCAACATG GGGTCAATCT GGAATATTTT TTGTCCATCG 1740CTTGGTGGGG GGACCACTCG AACTCTGTTC AAGGCTTGAG CATCAGCCAC ACCAGCACCG 1800CACGTTGTCT CTTCAGAAAT GTCTGGTACC TCCAGTTCAT CCGACTGGAA TTGAGCCGAG 1860TCAGCCCTTG ATGCGAGGCC ATCATTCTCG CCCTCAGGAA CCATGACCGC CTTCCTGGCC 1920GCGGCCGCCG CGCGCATGGC CCCGTGCGTC CCCGAACATC CAACTCGAGC ACCCCGAGTT 1980AAGAAGAGGC CGGTGTGCCG GAAGACTAGA CTACCCTCCC CGCCGCCGGT GAGTCGGGGA 2040GCCCTTACGG CCCCACCGAG CACCGCCCCA GAAACCCGGA ACGCCATCTC GCCTTCGCAG 2100CCGGATCGGA TCGAACTGAT CAGCCAATGC TAAAACCCCA GCGACCGCAA GAGCGAAATC 2160CGGGT                                                             2165
(2)序列9资料：
  (ⅰ)序列特征：
    (A)长度：2087bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
  (ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
  (ⅹⅰ)序列描述：序列9：ATGGCGTTCC   GGGTTTCTGG   GGCGGTGCTC   GGTGGGGCCG   TAAGGGCTCC   CCGACTCACC     60GGCGGCGGGG   AGGGTAGTCT   AGTCTTCCGG   CACACCGGCC   TCTTCTTAAC   TCGGGGTGCT    120CGAGTTGGAT   GTTCGGGGAC   GCACGGGGCC   ATGCGCGCGG   CGGCCGCGGC   CAGGAAGGCG    180GTCATGGTTC   CTGAGGGCGA   GAATGATGGC   CTCGCATCAA   GGGCTGACTC   GGCTCAATTC    240CAGTCGGATG   AACTGGAGGT   ACCAGACATT   TCTGAAGAGA   CAACGTGCGG   TGCTGGTGTG    300GCTGATGCTC   AAGCCTTGAA   CAGAGTTCGA   GTGGTCCCCC   CACCAAGCGA   TGGACAAAAA    360ATATTCCAGA   TTGACCCCAT   GTTGCAAGGC   TATAAGTACC   ATCTTGAGTA   TCGGTACAGC    420CTCTATAGAA   GAATCCGTTC   AGACATTGAT   GAACATGAAG   GAGGCTTGGA   AGCCTTCTCC    480CGTAGTTATG   AGAAGTTTGG   ATTTAATGCC   AGCGCGGAAG   GTATCACATA   TCGAGAATGG    540GCTCCTGGAG   CATTTTCTGC   AGCATTGGTG   GGTGACTTCA   ACAACTGGGA   TCCAAATGCA    600GATCGTATGA   GCAAAAATGA   GTTTGGTGTT   TGGGAAATTT   TTCTGCCTAA   CAATGCAGAT    660GGTACATCAC   CTATTCCTCA   TGGATCTCGT   GTAAAGGTGA   GAATGGATAC   TCCATCAGGG    720ATAAAGGATT   CAATTCCAGC   CTGGATCAAG   TACTCAGTGC   AGGCCCCAGG   AGAAATACCA    780TATGATGGGA   TTTATTATGA   TCCTCCTGAA   GAGGTAAAGT   ATGTGTTCAG   GCATGCGCAA    840CCTAAACGAC   CAAAATCATT   GCGGATATAT   GAAACACATG   TCGGAATGAG   TAGCCCGGAA    900CCGAAGATAA   ACACATATGT   AAACTTTAGG   GATGAAGTCC   TCCCAAGAAT   AAAAAAACTT    960GGATACAATG   CAGTGCAAAT   AATGGCAATC   CAAGAGCACT   CATATTATGG   AAGCTTTGGA   1020TACCATGTAA   CTAATTTTTT   TGCGCCAAGT   AGTCGTTTTG   GTACCCCAGA   AGATTTGAAG   1080TCTTTGATTG   ATAGAGCACA   TGAGCTTGGT   TTGCTAGTTC   TCATGGATGT   GGTTCATAGT   1140CATGCGTCAA   GTAATACTCT   GGATGGGTTG   AATGGTTTTG   ATGGTACAGA   TACACATTAC   1200TTTCACAGTG   GTCCACGTGG   CCATCACTGG   ATGTGGGATT   CTCGCCTATT   TAACTATGGG   1260AACTGGGAAG   TTTTAAGATT   TCTTCTCTCC   AATGCTAGAT   GGTGGCTCGA   GGAATATAAG   1320TTTGATGGTT   TCCGTTTTGA   TGGTGTGACC   TCCATGATGT   ACACTCACCA   CGGATTACAA   1380GTAACATTTA   CGGGGAACTT   CAATGAGTAT   TTTGGCTTTG   CCACCGATGT   AGATGCAGTG   1440GTTTACTTGA   TGCTGGTAAA   TGATCTAATT   CATGGACTTT   ATCCTGAGGC   TGTAACCATT   1500GGTGAAGATG   TTAGTGGAAT   GCCTACATTT   GCCCTTCCTG   TTCACGATGG   TGGGGTAGGT   1560TTTGACTATC   GGATGCATAT   GGCTGTGGCT   GACAAATGGA   TTGACCTTCT   CAAGCAAAGT   1620GATGAAACTT GGAAGATGGG TGATATTGTG CACACACTGA CAAATAGGAG GTGGTTAGAG 1680AAGTGTGTAA CTTATGCTGA AAGTCATGAT CAAGCATTAG TCGGCGACAA GACTATTGCG 1740TTTTGGTTGA TGGACAAGGA TATGTATGAT TTCATGGCCC TCGATAGACC TTCAACTCCT 1800ACCATTGATC GTGGGATAGC ATTACATAAG ATGATTAGAC TTATCACAAT GGGTTTAGGA 1860GGAGAGGGCT ATCTTAATTT CATGGGAAAT GAGTTTGGAC ATCCTGAATG GATAGATTTT 1920CCAAGAGGTC CGCAAAGACT TCCAAGTGGT AAGTTTATTC CAGGGAATAA CAACAGTTAT 1980GACAAATGTC GTCGAAGATT TGACCTGGGT GATGCAGACT ATCTTAGGTA TCATGGTATG 2040CAAGAGTTTG ATCAGGCAAT GCAACATCTT GAGCAAAAAT ATGAATT               2087
(2)序列10资料：
  (ⅰ)序列特征：
    (A)长度：30bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
  (ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
  (ⅹⅰ)序列描述：序列10：AAGCTTGAAT TCTGCTCGGT GATGAGACAC                          30
(2)序列11资料：
  (ⅰ)序列特征：
    (A)长度：30bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
  (ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
  (ⅹⅰ)序列描述：序列11：AAGCTTGAAT TCCTTGGAGG TGATGGCTAC                          30
(2)序列12资料：
  (ⅰ)序列特征：
    (A)长度：2772bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
  (ⅱ)分子类型：cDNA
  (ⅸ)特征：
    (A)名称/关键词：CDS
    (B)位置：49..2580(ⅹⅰ)序列描述：序列12：TGCTGATCGA GTGAGGGAAT TCAGCAGCAG CAGCAGCAGG TAGCATAG CAT AGA TAT        57
                                                 His Arg Tyr
                                                   1GAC GGC GGC GGA GGT GGA GGC CGC CAA GGA CAT CGC CGA GGA GAA GGC        105Asp Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Gln Gly His Arg Arg Gly Glu Gly
 5                   10                  15CGT CGT GCC GTT GCC ACC GTC GCC CGC CAA GCC GGC CGA CGA CGA CTC        153Arg Arg Ala Val Ala Thr Val Ala Arg Gln Ala Gly Arg Arg Arg Leu20                  25                  30                  35CAA GGC CAT CGT CGC TCT TGC TCG CAT GCT GAT CGG GCG GCA CCG CCG        201Gln Gly His Arg Arg Ser Cys Ser His Ala Asp Arg Ala Ala Pro Pro
             40                  45                  50GGG ATC GCG GGT GGC GGC AAT GTG CGC CTG AGT GTG TTG TCT GTC CAG        249Gly Ile Ala Gly Gly Gly Asn Val Arg Leu Ser Val Leu Ser Val Gln
         55                  60                  65TGC AAG GCT CGC CGG TCA GGG GTG CGG AAG GTC AAG AGC AAA TTC GCC        297Cys Lys Ala Arg Arg Ser Gly Val Arg Lys Val Lys Ser Lys Phe Ala
     70                  75                  80ACT GCA GCT ACT GTG CAA GAA GAT AAA ACT ATG GCA ACT GCC AAA GGC        345Thr Ala Ala Thr Val Gln Glu Asp Lys Thr Met Ala Thr Ala Lys Gly
 85                  90                  95GAT GTC GAC CAT CTC CCC ATA TAC GAC CTG GAC CCC AAG CTG GAG ATA        393Asp Val Asp His Leu Pro Ile Tyr Asp Leu Asp Pro Lys Leu Glu Ile100                 105                 110                 115TTC AAG GAC CAT TTC AGG TAC CGG ATG AAA AGA TTC CTA GAG CAG AAA        441Phe Lys Asp His Phe Arg Tyr Arg Met Lys Arg Phe Leu Glu Gln Lys
            120                 125                 130GGA TCA ATT GAA GAA AAT GAG GGA AGT CTT GAA TCT TTT TCT AAA GGC        489Gly Ser Ile Glu Glu Asn Glu Gly Ser Leu Glu Ser Phe Ser Lys Gly
        135                 140                 145TAT TTG AAA TTT GGG ATT AAT ACA AAT GAG GAT GGA ACT GTA TAT CGT        537Tyr Leu Lys Phe Gly Ile Asn Thr Asn Glu Asp Gly Thr Val Tyr Arg
    150                 155                 160GAA TGG GCA CCT GCT GCG CAG GAG GCA GAG CTT ATT GGT GAC TTC AAT        585Glu Trp Ala Pro Ala Ala Gln Glu Ala Glu Leu Ile Gly Asp Phe Asn
165                 170                 175GAC TGG AAT GGT GCA AAC CAT AAG ATG GAG AAG GAT AAA TTT GGT GTT        633Asp Trp Asn Gly Ala Asn His Lys Met Glu Lys Asp Lys Phe Gly Val180                 185                 190                 195TGG TCG ATC AAA ATT GAC CAT GTC AAA GGG AAA CCT GCC ATC CCT CAC     681Trp Ser Ile Lys Ile Asp His Val Lys Gly Lys Pro Ala Ile Pro His
            200                 205                 210AAT TCC AAG GTT AAA TTT CGC TTT CTA CAT GGT GGA GTA TGG GTT GAT     729Asn Ser Lys Val Lys Phe Arg Phe Leu His Gly Gly Val Trp Val Asp
        215                 220                 225CGT ATT CCA GCA TTG ATT CGT TAT GCG ACT GTT GAT GCC TCT AAA TTT     777Arg Ile Pro Ala Leu Ile Arg Tyr Ala Thr Val Asp Ala Ser Lys Phe
    230                 235                 240GGA GCT CCC TAT GAT GGT GTT CAT TGG GAT CCT CCT GCT TCT GAA AGG     825Gly Ala Pro Tyr Asp Gly Val His Trp Asp Pro Pro Ala Ser Glu Arg
245                 250                 255TAC ACA TTT AAG CAT CCT CGG CCT TCA AAG CCT GCT GCT CCA CGT ATC     873Tyr Thr Phe Lys His Pro Arg Pro Ser Lys Pro Ala Ala Pro Arg Ile260                 265                 270                 275TAT GAA GCC CAT GTA GGT ATG AGT GGT GAA AAG CCA GCA GTA AGC ACA     921Tyr Glu Ala Hil Val Gly Met Ser Gly Glu Lys Pro Ala Val Ser Thr
            280                 285                 290TAT AGG GAA TTT GCA GAC AAT GTG TTG CCA CGC ATA CGA GCA AAT AAC     969Tyr Arg Glu Phe Ala Asp Asn Val Leu Pro Arg Ile Arg Ala Asn Asn
        295                 300                 305TAC AAC ACA GTT CAG TTG ATG GCA GTT ATG GAG CAT TCG TAC TAT GCT    1017Tyr Asn Thr Val Gln Leu Met Ala Val Met Glu His Ser Tyr Tyr Ala
    310                 315                 320TCT TTC GGG TAC CAT GTG ACA AAT TTC TTT GCG GTT AGC AGC AGA TCA    1065Ser Phe Gly Tyr His Val Thr Asn Phe Phe Ala Val Ser Ser Arg Ser
325                 330                 335GGC ACA CCA GAG GAC CTC AAA TAT CTT GTT GAT AAG GCA CAC AGT TTG    1113Gly Thr Pro Glu Asp Leu Lys Tyr Leu Val Asp Lys Ala His Ser Leu340                 345                 350                 355GGT TTG CGA GTT CTG ATG GAT GTT GTC CAT AGC CAT GCA AGT AAT AAT    1161Gly Leu Arg Val Leu Met Asp Val Val His Ser His Ala Ser Asn Asn
            360                 365                 370GTC ACA GAT GGT TTA AAT GGC TAT GAT GTT GGA CAA AGC ACC CAA GAG    1209Val Thr Asp Gly Leu Asn Gly Tyr Asp Val Gly Gln Ser Thr Gln Glu
        375                 380                 385TCC TAT TTT CAT GCG GGA GAT AGA GGT TAT CAT AAA CTT TGG GAT AGT    1257Ser Tyr Phe His Ala Gly Asp Arg Gly Tyr His Lys Leu Trp Asp Ser
    390                  395                400CGG CTG TTC AAC TAT GCT AAC TGG GAG GTA TTA AGG TTT CTT CTT TCT    1305Arg Leu Phe Asn Tyr Ala Asn Trp Glu Val Leu Arg Phe Leu Leu Ser
405                 410                 415AAC CTG AGA TAT TGG TTG GAT GAA TTC ATG TTT GAT GGC TTC CGA TTT    1353Asn Leu Arg Tyr Trp Leu Asp Glu Phe Met Phe Asp Gly Phe Arg Phe420                 425                 430                 435GAT GGA GTT ACA TCA ATG CTG TAT CAT CAC CAT GGT ATC AAT GTG GGG    1401Asp Gly Val Thr Ser Met Leu Tyr His His His Gly Ile Asn Val Gly
            440                 445                 450TTT ACT GGA AAC TAC CAG GAA TAT TTC AGT TTG GAC ACA GCT GTG GAT    1449Phe Thr Gly Asn Tyr Gln Glu Tyr Phe Ser Leu Asp Thr Ala Val Asp
        455                 460                 465GCA GTT GTT TAC ATG ATG CTT GCA AAC CAT TTA ATG CAC AAA CTC TTG    1497Ala Val Val Tyr Me5 Met Leu Ala Asn His Leu Met His Lys Leu Leu
    470                 475                 480CCA GAA GCA ACT GTT GTT GCT GAA GAT GTT TCA GGC ATG CCG GTC CTT    1545Pro Glu Ala Thr Val Val Ala Glu Asp Val Set Gly Met Pro Val Leu
485                 490                 495TGC CGG CCA GTT GAT GAA GGT GGG GTT GGG TTT GAC TAT CGC CTG GCA    1593Cys Arg Pro Val Asp Glu Gly Gly Val Gly Phe Asp Tyr Arg Leu Ala500                 505                 510                 515ATG GCT ATC CCT GAT AGA TGG ATT GAC TAC CTG AAG AAT AAA GAT GAC    1641Met Ala Ile Pro Asp Arg Trp Ile Asp Tyr Leu Lys Asn Lys Asp Asp
            520                 525                 530TCT GAG TGG TCG ATG GGT GAA ATA GCG CAT ACT TTG ACT AAC AGG AGA    1689Ser Glu Trp Ser Met Gly Glu Ile Ala His Thr Leu Thr Asn Arg Arg
        535                 540                 545TAT ACT GAA AAA TGC ATC GCA TAT GCT GAG AGC CAT GAT CAG TCT ATT    1737Tyr Thr Glu Lys Cys Ile Ala Tyr Ala Glu Ser His Asp Gln Ser Ile
    550                 555                 560GTT GGC GAC AAA ACT ATT GCA TTT CTC CTG ATG GAC AAG GAA ATG TAC    1785Val Gly Asp Lys Thr Ile Ala Phe Leu Leu Met Asp Lys Glu Met Tyr
565                 570                 575ACT GGC ATG TCA GAC TTG CAG CCT GCT TCA CCT ACA ATT GAT CGA GGG    1833Thr Gly Met Ser Asp Leu Gln Pro Ala Ser Pro Thr Ile Asp Arg Gly580                 585                 590                 595ATT GCA CTC CAA AAG ATG ATT CAC TTC ATC ACA ATG GCC CTT GGA GGT    1881Ile Ala Leu Gln Lys Met Ile His Phe Ile Thr Met Ala Leu Gly Gly
            600                 605                 610GAT GGC TAC TTG AAT TTT ATG GGA AAT GAG TTT GGT CAC CCA SAA TGG    1929Asp Gly Tyr Leu Asn Phe Met Gly Asn Glu Phe Gly His Pro Glu Trp
        615                 620                 625ATT GAC TTT CCA AGA GAA GGG AAC AAC TGG AGC TAT GAT AAA TGC AGA    1977Ile Asp Phe Pro Arg Glu Gly Asn Asn Trp Ser Tyr Asp Lys Cys Arg
    630                 635                 640CGA CAG TGG AGC CTT GTG GAC ACT GAT CAC TTG CGG TAC AAG TAC ATG    2025Arg Gln Trp Ser Leu Val Asp Thr Asp His Leu Arg Tyr Lys Tyr Met
645                 650                 655AAT GCG TTT GAC CAA GCG ATG AAT GCG CTC GAT GAG AGA TTT TCC TTC    2073Asn Ala Phe Asp Gln Ala Met Asn Ala Leu Asp Glu Arg Phe Ser Phe660                 665                 670                 675CTT TCG TCG TCA AAG CAG ATC GTC AGC GAC ATG AAC GAT GAG GAA AAG    2121Leu Ser Ser Ser Lys Gln Ile Val Ser Asp Met Asn Asp Glu Glu Lys
            680                 685             690GTT ATT GTC TTT GAA CGT GGA GAT TTA GTT TTT GTT TTC AAT TTC CAT    2169Val Ile Val Phe Glu Arg Gly Asp Leu Val Phe Val Phe Asn Phe His
        695                 700                 705CCC AAG AAA ACT TAC GAG GGC TAC AAA GTG GGA TGC GAT TTG CCT GGG             2217Pro Lys Lys Thr Tyr Glu Gly Tyr Lys Val Gly Cys Asp Leu Pro Gly
    710                 715                 720AAA TAC AGA GTA GCC CTG GAC TCT GAT GCT CTG GTC TTC GGT GGA CAT             2265Lys Tyr Arg Val Ala Leu Asp Ser Asp Ala Leu Val Phe Gly Gly His
725                 730                 735GGA AGA GTT GGC CAC GAC GTG GAT CAC TTC ACG TCG CCT GAA GGG GTG             2313Gly Arg Val Gly His Asp Val Asp His Phe Thr Ser Pro Glu Gly Val740                 745                 750                 755CCA GGG GTG CCC GAA ACG AAC TTC AAC AAC CGG CCG AAC TCG TTC AAA             2361Pro Gly Val Pro Glu Thr Asn Phe Asn Asn Arg Pro Asn Ser Phe Lys
            760                 765                 770GTC CTT TCT CCG CCC CGC ACC TGT GTG GCT TAT TAC CGT GTA GAC GAA             2409Val Leu Ser Pro Pro Arg Thr Cys Val Ala Tyr Tyr Arg Val Asp Glu
        775                 780                 785GCA GGG GCT GGA CGA CGT CTT CAC GCG AAA CGA GAG ACA GGA AAG ACG             2457Ala Gly Ala Gly Arg Arg Leu His Ala Lys Arg Glu Thr Gly Lys Thr
    790                 795                 800TCT CCA GCA GAG AGC ATC GAC GTC AAA GCT TCC AGA GCT AGT AGC AAA             2505Ser Pro Ala Glu ser Ile Asp Val Lys Ala Ser Arg Ala Ser Ser Lys
805                 810                 815GAA GAC AAG GAG GCA ACG GCT GGT GGC AAG AAG GGA TGG AAG TTT GCG             2553Glu Asp Lys Glu Ala Thr Ala Gly Gly Lys Lys Gly Trp Lys Phe Ala820                 825                 830                 835CGG CAG CCA TCC GAT CAA GAT ACC AAA TGAAGCCAGG AGTCCTTGGT                   2600Arg Gln Pro Ser Asp Gln Asp Thr Lys
            840GAGGACTGGA   CTGGCTGCCG   GCGCCCTGTT  AGTAGTCCTG   CTCTACTGGA  CTAGCCGCCG   2660CTGGCGCCCT   TGGAACGGTC   CTTTCCTGTA  GCTTGCAGGC   GACTGGTGTC  TCATCACCGA   2720GCAGGCAGGC   ACTGCTTGTA   TAGCTTTTCT  AGAATAATAA   TCAGGGATGG  AT           2772
(2)序列13资料：
  (ⅰ)序列特征：
    (A)长度：373bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
  (ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
  (ⅳ)反义：是
  (ⅹⅰ)序列描述：序列13：CGGTGATGAG   ACACCAGTCG   CCTGCAAGCT   ACAGGAAAGG   ACCGTTCCAA   GGGCGCCAGC    60GGCGGCTAGT   CCAGTAGAGC   AGGACTACTA   ACAGGGCGCC   GGCAGCCAGT   CCAGTCCTCA   120CCAAGGACTC   CTGGCTTCAT   TTGGTATCTT   GATCGGATGG   CTGCCGCGCA   AACTTCCATC   180CCTTCTTGCC   ACCAGCCGTT   GCCTCCTTGT   CTTCTTTGCT   ACTAGCTCTG   GAAGCTTTGA   240CGTCGATGCT   CTCTGCTGGA   GACGTCTTTC   CTGTCTCTCG   TTTCGCGTGA   AGACGTCGTC   300CAGCCCCTGC   TTCGTCTACA   CGGTAATAAG   CCACACAGGT   GCGGGGCGGA   GAAAGGACTT   360TGAACGAGTT   CGG                                                              373
(2)序列14资料：
  (ⅰ)序列特征：
    (A)序列长度：27bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
  (ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
  (ⅹⅰ)序列描述：序列14：GAATTCCCGG GCCGAACTCG TTCAAAG                             27
(2)序列15资料：
  (ⅰ)序列特征：
    (A)长度：30bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
  (ⅱ)分子类型：DNA(基因组)
  (ⅹⅰ)序列描述：序列1 5：GAATTCCATG GCGGTGATGA GACACCAGTC                          30
(2)序列16资料：
  (ⅰ)序列特征：
    (A)长度：571bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
  (ⅱ)分子类型：cDNA
  (ⅹⅰ)序列描述：序列16:CCATCTTATG   GTTTGCACCA   TTCCAGTCAT   TGAAGTCACC   AATAAGCTCT   GCCTCCTGCG    60CAGCAGGTGC   CCATTCACGA   TATACAGTTC   CATCCTCATT   TGTATTAATC   CCAAATTTCA   120AATAGCCTTT   AGAAAAAGAT   TCAAGACCTT   CCCTCATTTT   CTTCAATTGA   TCCTTTCTGC   180TCTAGGAATC   TTTTCATCCG   GTACCTGAAA   TGGTCCTTGA   ATATCTCCAG   CTTGGGGTCC   240AGGTCGTATA   TGGGGAGATG   GTCGACATCG   CCTTTGGCAG   TTGCCATAGT   TTTATCTTCT   300TGCACAGTAG   CTGCAGTGGC   GAATTTGCTC   TTGACCTTCC   GCACCCCTGA   CCGGCGAGCC   360TTGCACTGGA   CAGACAACAC   ACTCAGGCGC   ACATTGCCGC   CACCCGCGAT   CCCCGGCGGT   420GCCGCCCGAT   CAGCATGCGA   GCAAGAGCGA   CGATGGCCTT   GGAGTCGTCG   TCGGCCGGCT   480TGGCGGGCGA   CGGTGGCAAC   GGCACGACGG   CCTTCTCCTC   GGCGATGTCC   TTGGCGGCCT   540CCACCTCCGC   CGCCGTCATA   TCTATGCTAT   G                                      571
(2)序列17资料：
  (ⅰ)序列特征：
    (A)长度：30bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
  (ⅱ)分子类型：其它核酸
    (A)说明：/desc=“PCR引物”
  (ⅹⅰ)序列描述：序列17：GAATTCCATG GCCATCTTAT GGTTTGCACC                          30
(2)序列18资料：
  (ⅰ)序列特征：
    (A)长度：31bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
  (ⅱ)分子类型：其它核酸
    (A)说明：/desc=“PCR引物”
  (ⅹⅰ)序列描述：序列18：GAATTCCCGG GCATAGCATA GATATGACGG C                        31
(2)序列19资料：
  (ⅰ)序列特征：
    (A)长度：2487bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
  (ⅱ)分子类型：cDNA
  (ⅹⅰ)序列描述：序列19：AGCTTTGACG   TCGATGCTCT   CTGCTGGAGA   CGTCTTTCCT   GTCTCTCGTT   TCGCGTGAAG       60ACGTCGTCCA   GCCCCTGCTT   CGTCTACACG   GTAATAAGCC   ACACAGGTGC   GGGGCGGAGA      120AAGGACTTTG   AACGAGTTCG   GCCGGTTGTT   GAAGTTCGTT   TCGGGCACCC   CTGGCACCCC      180TTCAGGCGAC   GTGAAGTGAT   CCACGTCGTG   GCCAACTCTT   CCATGTCCAC   CGAAGACCAG      240AGCATCAGAG   TCCAGGGCTA   CTCTGTATTT   CCCAGGCAAA   TCGCATCCCA   CTTTGTAGCC      300CTCGTAAGTT   TTCTTGGGAT   GGAAATTGAA   AACAAAAACT   AAATCTCCAC   GTTCAAAGAC      360AATAACCTTT   TCCTCATCGT   TCATGTCGCT   GACGATCTGC   TTTGACGACG   AAAGGAAGGA      420AAATCTCTCA   TCGAGCGCAT   TCATCGCTTG   GTCAAACGCA   TTCATGTACT   TGTACCGCAA      480GTGATCAGTG   TCCACAAGGC   TCCACTGTCG   TCTGCATTTA   TCATAGCTCC   AGTTGTTCCC      540TTCTCTTGGA   AAGTCAATCC   ATTCTGGGTG   ACCAAACTCA   TTTCCCATAA   AATTCAAGTA      600GCCATCACCT   CCAAGGGCCA   TTGTGATGAA   GTGAATCATC   TTTTGGAGTG   CAATCCCTCG      660ATCAATTGTA   GGTGAAGCAG   GCTGCAAGTC   TGACATGCCA   GTGTACATTT   CCTTGTCCAT      720CAGGAGAAAT   GCAATAGTTT   TGTCGCCAAC   AATAGACTGA   TCATGGCTCT   CAGCATATGC      780GATGCATTTT   TCAGTATATC   TCCTGTTAGT   CAAAGTATGC   GCTATTTCAC   CCATCGACCA      840CTCAGAGTCA   TCTTTATTCT   TCAGGTAGTC   AATCCATCTA   TCAGGGATAG   CCATTGCCAG      900GCGATAGTCA   AACCCAACCC   CACCTTCATC   AACTGGCCGG   CAAAGGACCG   GCATGCCTGA      960AACATCTTCA   GCAACAACAG   TTGCTTCTGG   CAAGAGTTTG   TGCATTAAAT   GGTTTGCAAG     1020CATCATGTAA   ACAACTGCAT   CCACAGCTGT   GTCCAAACTG   AAATATTCCT   GGTAGTTTCC     1080AGTAAACCCC   ACATTGATAC   CATGGTGATG   ATACAGCATT   GATGTAACTC   CATCAAATCG     1140GAAGCCATCA   AACATGAATT   CATCCAACCA   ATATCTCAGG   TTAGAAAGAA   GAAACCTTAA     1200TACCTCCCAG   TTAGCATAGT   TGAACAGCCG   ACTATCCCAA   AGTTTATGAT   AACCTCTATC   1260TCCCGCATGA   AAATAGGACT   CTTGGGTGCT   TTGTCCAACA   TCATAGCCAT   TTAAACCATC   1320TGTGACATTA   TTACTTGCAT   GGCTATGGAC   AACATCCATC   AGAACTCGCA   AACCCAAACT   1380GTGTGCCTTA   TCAACAAGAT   ATTTGAGGTC   CTCTGGTGTG   CCTGATCTGC   TGCTAACCGC   1440AAAGAAATTT   GTCACATGGT   ACCCGAAAGA   AGCATAGTAC   GAATGCTCCA   TAACTGCCAT   1500CAACTGAACT   GTGTTGTAGT   TATTTGCTCG   TATGCGTGGC   AACACATTGT   CTGCAAATTC   1560CCTATATGTG   CTTACTGCTG   GCTTTTCACC   ACTCATACCT   ACATGGGCTT   CATAGATACG   1620TGGAGCAGCA   GGCTTTGAAG   GCCGAGGATG   CTTAAATGTG   TACCTTTCAG   AAGCAGGAGG   1680ATCCCAATGA   ACACCATCAT   AGGGAGCTCC   AAATTTAGAG   GCATCAACAG   TCGCATAACG   1740AATCAATGCT   GGAATACGAT   CAACCCATAC   TCCACCATGT   AGAAAGCGAA   ATTTAACCTT   1800GGAATTGTGA   GGGATGGCAG   GTTTCCCTTT   GACATGGTCA   ATTTTGATCG   ACCAAACACC   1860AAATTTATCC   TTCTCCATCT   TATGGTTTGC   ACCATTCCAG   TCATTGAAGT   CACCAATAAG   1920CTCTGCCTCC   TGCGCAGCAG   GTGCCCATTC   ACGATATACA   GTTCCATCCT   CATTTGTATT   1980AATCCCAAAT   TTCAAATAGC   CTTTAGAAAA   AGATTCAAGA   CTTCCCTCAT   TTTCTTCAAT   2040TGATCCTTTC   TGCTCTAGGA   ATCTTTTCAT   CCGGTACCTG   AAATGGTCCT   TGAATATCTC   2100CAGCTTGGGG   TCCAGGTCGT   ATATGGGGAG   ATGGTCGACA   TCGCCTTTGG   CAGTTGCCAT   2160AGTTTTATCT   TCTTGCACAG   TAGCTGCAGT   GGCGAATTTG   CTCTTGACCT   TCCGCACCCC   2220TGACCGGCGA   GCCTTGCACT   GGACAGACAA   CACACTCAGG   CGCACATTGC   CGCCACCCGC   2280GATCCCCGGC   GGTGCCGCCC   GATCAGCATG   CGAGCAAGAG   CGACGATGGC   CTTGGAGTCG   2340TCGTCGGCCG   GCTTGGCGGG   CGACGGTGGC   AACGGCACGA   CGGCCTTCTC   CTCGGCGATG   2400TCCTTGGCGG   CCTCCACCTC   CGCCGCCGTC   ATATCTATGC   TATGCTACCT   GCTGCTGCTG   2460CTGCTGAATT   CCCTCACTCG   ATCAGCA                                             2487
(2)序列20资料：
  (ⅰ)序列描述：
    (A)长度：1865bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
  (ⅱ)分子类型：cDNA
  (ⅹⅰ)序列描述：序列20：ATGGCGGCGG CGGAGGTGGA GGCCGCCAAG GACATCGCCG AGGAGAAGGC CGTCGTGCCG   60TTGCCACCGT CGCCCGCCAA GCCGGCCGAC GACGACTCCA AGGCCATCGT CGCTCTTGCT  120CGCATGCTGA TCGGGCGGCA CCGCCGGGGA TCGCGGGTGG CGGCAATGTG CGCCTGAGTG  180TGTTGTCTGT CCAGTGCAAG GCTCGCCGGT CAGGGGTGCG GAAGGTCAAG AGCAAATTCG  240CCACTGCAGC TACTGTGCAA GAAGATAAAA CTATGGCAAC TGCCAAAGGC GATGTCGACC  300ATCTCCCCAT ATACGACCTG GACCCCAAGC TGGAGATATT CAAGGACCAT TTCAGGTACC  360GGATGAAAAG ATTCCTAGAG CAGAAAGGAT CAATTGAAGA AAATGAGGGA AGTCTTGAAT  420CTTTTTCTAA AGGCTATTTG AAATTTGGGA TTAATACAAA TGAGGATGGA ACTGTATATC  480GTGAATGGGC ACCTGCTGCG CAGGAGGCAG AGCTTATTGG TGACTTCAAT GACTGGAATG  540GTGCAAACCA TAAGATGGAG AAGGATAAAT TTGGTGTTTG GTCGATCAAA ATTGACCATG  600TCAAAGGGAA ACCTGCCATC CCTCACAATT CCAAGGTTAA ATTTCGCTTT CTACATGGTG  660GAGTATGGGT TGATCGTATT CCAGCATTGA TTCGTTATGC GACTGTTGAT GCCTCTAAAT  720TTGGAGCTCC CTATGATGGT GTTCATTGGG ATCCTCCTGC TTCTGAAAGG TACACATTTA  780AGCATCCTCG GCCTTCAAAG CCTGCTGCTC CACGTATCTA TGAAGCCCAT GTAGGTATGA  840GTGGTGAAAA GCCAGCAGTA AGCACATATA GGGAATTTGC AGACAATGTG TTGCCACGCA  900TACGAGCAAA TAACTACAAC ACAGTTCAGT TGATGGCAGT TATGGAGCAT TCGTACTATG  960CTTCTTTCGG GTACCATGTG ACAAATTTCT TTGCGGTTAG CAGCAGATCA GGCACACCAG 1020AGGACCTCAA ATATCTTGTT GATAAGGCAC ACAGTTTGGG TTTGCGAGTT CTGATGGATG 1080TTGTCCATAG CCATGCAAGT AATAATGTCA CAGATGGTTT AAATGGCTAT GATGTTGGAC 1140AAAGCACCCA AGAGTCCTAT TTTCATGCGG GAGATAGAGG TTATCATAAA CTTTGGGATA 1200GTCGGCTGTT CAACTATGCT AACTGGGAGG TATTAAGGTT TCTTCTTTCT AACCTGAGAT 1260ATTGGTTGGA TGAATTCATG TTTGATGGCT TCCGATTTGA TGGAGTTACA TCAATGCTGT 1320ATCATCACCA TGGTATCAAT GTGGGGTTTA CTGGAAACTA CCAGGAATAT TTCAGTTTGG 1380ACACAGCTGT GGATGCAGTT GTTTACATGA TGCTTGCAAA CCATTTAATG CACAAACTCT 1440TGCCAGAAGC AACTGTTGTT GCTGAAGATG TTTCAGGCAT GCCGGTCCTT TGCCGGCCAG 1500TTGATGAAGG TGGGGTTGGG TTTGACTATC GCCTGGCAAT GGCTATCCCT GATAGATGGA 1560TTGACTACCT GAAGAATAAA GATGACTCTG AGTGGTCGAT GGGTGAAATA GCGCATACTT 1620TGACTAACAG GAGATATACT GAAAAATGCA TCGCATATGC TGAGAGCCAT GATCAGTCTA 1680TTGTTGGCGA CAAAACTATT GCATTTCTCC TGATGGACAA GGAAATGTAC ACTGGCATGT 1740CAGACTTGCA GCCTGCTTCA CCTACAATTG ATCGAGGGAT TGCACTCCAA AAGATGATTC 1800ACTTCATCAC AATGGCCCTT GGAGGTGATG GCTACTTGAA TTTTATGGGA AATGAGTTTG 1860GTCAC                                                             1865
(2)序列21资料：
  (ⅰ)序列特征：
    (A)长度；31bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
  (ⅱ)分子类型：其它核酸
    (A)说明：/desc=“PCR引物”
  (ⅹⅰ)序列描述：序列21：CGCGGATCCC GGGTTCCAAG GGCGCCAGCG G                        31
(2)序列22资料：
  (ⅰ)序列特征：
    (A)长度：38bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
  (ⅱ)分子类型：其它核酸
    (A)说明：/desc=“PCR引物”
  (ⅹⅰ)序列描述：序列22：AACTGCAGAA GGATCCCATG GTGTGCCTCG TGTCGCCC                 38
(2)序列23资料：
  (ⅰ)序列特征：
    (A)长度：19bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
  (ⅱ)分子类型：其它核酸
    (A)说明：/desc=“PCR引物”
  (ⅹⅰ)序列描述：序列23：GGATGCTTAA ATGTGTACC                                      19
(2)序列24资料：
  (ⅰ)序列特征：
    (A)长度：2565bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
  (ⅱ)分子类型：cDNA
  (ⅹⅰ)序列描述：序列24：ATGGTGTGCC TCGTGTCGCC CTCTTCCTCG CCGACTCCGC TTCCGCCGCC GCGGCGCTCT    60CGCTCGCATG CTGATCGGGC GGCACCGCCG GGGATCGCGG GTGGCGGCAA TGTGCGCCTG   120AGTGTGTTGT CTGTCCAGTG CAAGGCTCGC CGGTCAGGGG TGCGGAAGGT CAAGAGCAAA   180TTCGCCACTG CAGCTACTGT GCAAGAAGAT AAAACTATGG CAACTGCCAA AGGCGATGTC   240GACCATCTCC CCATATACGA CCTGGACCCC AAGCTGGAGA TATTCAAGGA CCATTTCAGG   300TACCGGATGA AAAGATTCCT AGAGCAGAAA GGATCAATTG AAGAAAATGA GGGAAGTCTT   360GAATCTTTTT CTAAAGGCTA TTTGAAATTT GGGATTAATA CAAATGAGGA TGGAACTGTA   420TATCGTGAAT GGGCACCTGC TGCGCAGGAG GCAGAGCTTA TTGGTGACTT CAATGACTGG   480AATGGTGCAA ACCATAAGAT GGAGAAGGAT AAATTTGGTG TTTGGTCGAT CAAAATTGAC   540CATGTCAAAG GGAAACCTGC CATCCCTCAC AATTCCAAGG TTAAATTTCG CTTTCTACAT   600GGTGGAGTAT GGGTTGATCG TATTCCAGCA TTGATTCGTT ATGCGACTGT TGATGCCTCT   660AAATTTGGAG CTCCCTATGA TGGTGTTCAT TGGGATCCTC CTGCTTCTGA AAGGTACACA   720TTTAAGCATC CTCGGCCTTC AAAGCCTGCT GCTCCACGTA TCTATGAAGC CCATGTAGGT   780ATGAGTGGTG AAAAGCCAGC AGTAAGCACA TATAGGGAAT TTGCAGACAA TGTGTTGCCA   840CGCATACGAG CAAATAACTA CAACACAGTT CAGTTGATGG CAGTTATGGA GCATTCGTAC   900TATGCTTCTT TCGGGTACCA TGTGACAAAT TTCTTTGCGG TTAGCAGCAG ATCAGGCACA   960CCAGAGGACC TCAAATATCT TGTTGATAAG GCACACAGTT TGGGTTTGCG AGTTCTGATG   1020GATGTTGTCC ATAGCCATGC AAGTAATAAT GTCACAGATG GTTTAAATGG CTATGATGTT   1080GGACAAAGCA CCCAAGAGTC CTATTTTCAT GCGGGAGATA GAGGTTATCA TAAACTTTGG   1140GATAGTCGGC TGTTCAACTA TGCTAACTGG GAGGTATTAA GGTTTCTTCT TTCTAACCTG   1200AGATATTGGT TGGATGAATT CATGTTTGAT GGCTTCCGAT TTGATGGAGT TACATCAATG   1260CTGTATCATC ACCATGGTAT CAATGTGGGG TTTACTGGAA ACTACCAGGA ATATTTCAGT   1320TTGGACACAG CTGTGGATGC AGTTGTTTAC ATGATGCTTG CAAACCATTT AATGCACAAA   1380CTCTTGCCAG AAGCAACTGT TGTTGCTGAA GATGTTTCAG GCATGCCGGT CCTTTGCCGG   1440CCAGTTGATG AAGGTGGGGT TGGGTTTGAC TATCGCCTGG CAATGGCTAT CCCTGATAGA   1500TGGATTGACT ACCTGAAGAA TAAAGATGAC TCTGAGTGGT CGATGGGTGA AATAGCGCAT   1560ACTTTGACTA   ACAGGAGATA   TACTGAAAAA   TGCATCGCAT   ATGCTGAGAG   CCATGATCAG   1620TCTATTGTTG   GCGACAAAAC   TATTGCATTT   CTCCTGATGG   ACAAGGAAAT   GTACACTGGC   1680ATGTCAGACT   TGCAGCCTGC   TTCACCTACA   ATTGATCGAG   GGATTGCACT   CCAAAAGATG   1740ATTCACTTCA   TCACAATGGC   CCTTGGAGGT   GATGGCTACT   TGAATTTTAT   GGGAAATGAG   1800TTTGGTCACC   CAGAATGGAT   TGACTTTCCA   AGAGAAGGGA   ACAACTGGAG   CTATGATAAA   1860TGCAGACGAC   AGTGGAGCCT   TGTGGACACT   GATCACTTGC   GGTACAAGTA   CATGAATGCG   1920TTTGACCAAG   CGATGAATGC   GCTCGATGAG   AGATTTTCCT   TCCTTTCGTC   GTCAAAGCAG   1980ATCGTCAGCG   ACATGAACGA   TGAGGAAAAG   GTTATTGTCT   TTGAACGTGG   AGATTTAGTT   2040TTTGTTTTCA   ATTTCCATCC   CAAGAAAACT   TACGAGGGCT   ACAAAGTGGG   ATGCGATTTG   2100CCTGGGAAAT   ACAGAGTAGC   CCTGGACTCT   GATGCTCTGG   TCTTCGGTGG   ACATGGAAGA   2160GTTGGCCACG   ACGTGGATCA   CTTCACGTCG   CCTGAAGGGG   TGCCAGGGGT   GCCCGAAACG   2220AACTTCAACA   ACCGGCCGAA   CTCGTTCAAA   GTCCTTTCTC   CGCCCCGCAC   CTGTGTGGCT   2280TATTACCGTG   TAGACGAAGC   AGGGGCTGGA   CGACGTCTTC   ACGCGAAACG   AGAGACAGGA   2340AAGACGTCTC   CAGCAGAGAG   CATCGACGTC   AAAGCTTCCA   GAGCTAGTAG   CAAAGAAGAC   2400AAGGAGGCAA   CGGCTGGTGG   CAAGAAGGGA   TGGAAGTTTG   CGCGGCAGCC   ATCCGATCAA   2460GATACCAAAT   GAAGCCAGGA   GTCCTTGGTG   AGGACTGGAC   TGGCTGCCGG   CGCCCTGTTA   2520GTAGTCCTGC   TCTACTGGAC   TAGCCGCCGC   TGGCGCCCTT   GGAAC                     2565
(2)序列25资料：
  (ⅰ)序列特征：
    (A)长度：1809bp
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
  (ⅱ)分子类型：cDNA
  (ⅹⅰ)序列描述：序列25:ATGGTGTGCC   TCGTGTCGCC   CTCTTCCTCG   CCGACTCCGC   TTCCGCCGCC   GCGGCGCTCT    60CGCTCGCATG   CTGATCGGGC   GGCACCGCCG   GGGATCGCGG   GTGGCGGCAA   TGTGCGCCTG   120AGTGTGTTGT   CTGTCCAGTG   CAAGGCTCGC   CGGTCAGGGG   TGCGGAAGGT   CAAGAGCAAA   180TTCGCCACTG   CAGCTACTGT   GCAAGAAGAT   AAAACTATGG   CAACTGCCAA   AGGCGATGTC   240GACCATCTCC   CCATATACGA   CCTGGACCCC   AAGCTGGAGA   TATTCAAGGA   CCATTTCAGG   300TACCGGATGA   AAAGATTCCT   AGAGCAGAAA   GGATCAATTG   AAGAAAATGA   GGGAAGTCTT   360GAATCTTTTT   CTAAAGGCTA   TTTGAAATTT   GGGATTAATA   CAAATGAGGA   TGGAACTGTA   420TATCGTGAAT   GGGCACCTGC   TGCGCAGGAG   GCAGAGCTTA   TTGGTGACTT   CAATGACTGG   480AATGGTGCAA   ACCATAAGAT   GGAGAAGGAT   AAATTTGGTG   TTTGGTCGAT   CAAAATTGAC   540CATGTCAAAG   GGAAACCTGC   CATCCCTCAC   AATTCCAAGG   TTAAATTTCG   CTTTCTACAT   600GGTGGAGTAT   GGGTTGATCG   TATTCCAGCA   TTGATTCGTT   ATGCGACTGT   TGATGCCTCT   660AAATTTGGAG   CTCCCTATGA   TGGTGTTCAT   TGGGATCCTC   CTGCTTCTGA   AAGGTACACA   720TTTAAGCATC   CTCGGCCTTC   AAAGCCTGCT   GCTCCACGTA   TCTATGAAGC   CCATGTAGGT   780ATGAGTGGTG   AAAAGCCAGC   AGTAAGCACA   TATAGGGAAT   TTGCAGACAA   TGTGTTGCCA   840CGCATACGAG   CAAATAACTA   CAACACAGTT   CAGTTGATGG   CAGTTATGGA   GCATTCGTAC   900TATGCTTCTT   TCGGGTACCA   TGTGACAAAT   TTCTTTGCGG   TTAGCAGCAG   ATCAGGCACA   960CCAGAGGACC   TCAAATATCT   TGTTGATAAG   GCACACAGTT   TGGGTTTGCG   AGTTCTGATG   1020GATGTTGTCC   ATAGCCATGC   AAGTAATAAT   GTCACAGATG   GTTTAAATGG   CTATGATGTT   1080GGACAAAGCA   CCCAAGAGTC   CTATTTTCAT   GCGGGAGATA   GAGGTTATCA   TAAACTTTGG   1140GATAGTCGGC   TGTTCAACTA   TGCTAACTGG   GAGGTATTAA   GGTTTCTTCT   TTCTAACCTG   1200AGATATTGGT   TGGATGAATT   CATGTTTGAT   GGCTTCCGAT   TTGATGGAGT   TACATCAATG   1260CTGTATCATC   ACCATGGTAT   CAATGTGGGG   TTTACTGGAA   ACTACCAGGA   ATATTTCAGT   1320TTGGACACAG   CTGTGGATGC   AGTTGTTTAC   ATGATGCTTG   CAAACCATTT   AATGCACAAA   1380CTCTTGCCAG   AAGCAACTGT   TGTTGCTGAA   GATGTTTCAG   GCATGCCGGT   CCTTTGCCGG   1440CCAGTTGATG   AAGGTGGGGT   TGGGTTTGAC   TATCGCCTGG   CAATGGCTAT   CCCTGATAGA   1500TGGATTGACT   ACCTGAAGAA   TAAAGATGAC   TCTGAGTGGT   CGATGGGTGA   AATAGCGCAT   1560ACTTTGACTA   ACAGGAGATA   TACTGAAAAA   TGCATCGCAT   ATGCTGAGAG   CCATGATCAG   1620TCTATTGTTG   GCGACAAAAC   TATTGCATTT   CTCCTGATGG   ACAAGGAAAT   GTACACTGGC   1680ATGTCAGACT   TGCAGCCTGC   TTCACCTACA   ATTGATCGAG   GGATTGCACT   CCAAAAGATG   1740ATTCACTTCA   TCACAATGGC   CCTTGGAGGT   GATGGCTACT   TGAATTTTAT   GGGAAATGAG   1800TTTGGTCAC                                                                     1809

Claims (21)

1．一种控制源于玉米颖果的淀粉的淀粉精细结构的方法，包括：
(a)制备一种嵌合基因，它包括一个编码一种淀粉分支酶结构基因或其片段的核酸片段，该核酸片段的上游端沿有义或反义方向可操纵地连接于一个编码一种能指导基因在玉米胚乳组织中表达的启动子的核酸片段上，其下游端可操纵地连接于一个编码一种用于控制转录终止的合适调控序列的核酸片段上，
(b)用步骤(a)的嵌合基因转化玉米，
其中，所述嵌合基因的表达可导致源于所述转化玉米颖果的淀粉的精细结构发生变化，使其不同于源于不具有所述嵌合基因的玉米的淀粉的精细结构。
2．如权利要求1的方法，其中，所述淀粉精细结构的变化包括所述淀粉中支链淀粉分子组分支链分布的变化。
3．如权利要求1的方法，其中，所述淀粉精细结构的变化包括所述淀粉中直链淀粉分子组分与支链淀粉分子组分比例的变化。
4．如权利要求1的方法，其中，所述淀粉精细结构的变化，包括所述淀粉中直链淀粉分子组分聚合度的变化。
5．如权利要求1的方法，其中，所述淀粉精细结构的变化，包括所述淀粉中支链淀粉分子组分支链分布的变化和直链淀粉分子组分与支链淀粉分子组分比例的变化。
6．如权利要求1的方法，其中，所述淀粉精细结构的变化包括所述淀粉中支链淀粉分子组分支链分布的变化和直链淀粉分子组分聚合度的变化。
7．如权利要求1的方法，其中，所述淀粉精细结构的变化包括所述淀粉中直链淀粉分子组分与支链淀粉分子组分比例的变化和直链淀粉分子组分聚合度的变化。
8．如权利要求1的方法，其中，所述淀粉精细结构的变化包括所述淀粉中支链淀粉分子组分支链分布的变化、直链淀粉分子组分与支链淀粉分子组分比例的变化、以及直链淀粉分子组分聚合度的变化。
9．如权利要求1的方法，其中，所述编码淀粉分支酶结构基因或其片段的核酸片段源于玉米。
10．如权利要求1的方法，其中，所述编述淀粉分支酶结构基因或其片段的核酸片段能编码全部或部分玉米SBEⅡb酶。
11．如权利要求1的方法，其中，所述编码淀粉分支酶结构基因或其片段的核酸片段能编码全部或部分玉米SBEⅠ酶。
12．如权利要求1的方法，其中，所述编码淀粉分支酶结构基因或其片段的核酸片段的上游端沿反义方向可操纵地连接于一个编码一种能在玉米胚乳组织中指导基因表达的启动子的核酸片段上，其下游端连接于编码一种用于控制转录终止的合适调控序列的核酸片段上。
13．如权利要求1的方法，其中，所述编码淀粉分支酶结构基因或其片段的核酸片段的上游端沿有义方向可操纵地连接于一个编码一种能在玉米胚乳组织中指导基因表达的启动子的核酸片段上，其下游端连接于编码一种用于控制转录终止的合适调控序列的核酸片段上。
14．用权利要求1的方法制备的玉米品种或其任何子代。
15．如权利要求14的玉米品种，其中，从该玉米品种的颖果中提取的淀粉的直链淀粉分子组分与支链淀粉分子组分的比例高于从非转化玉米颖果中提取的淀粉的直链淀粉分子组分与支链淀粉分子组分的比例。
16．如权利要求14的玉米品种，其中，与从非转化玉米颖果中提取的淀粉的支链淀粉分子组分相比，从该玉米品种颖果中提取的淀粉的支链淀粉分子组分包括较大比例的较长α-1,4-连接的葡聚糖链和较小比例的较短α-1,4-连接的葡聚糖链。
17．如权利要求16的玉米品种，其中，与从非转化玉米颖果中提取的淀粉的支链淀粉分子组分的支链分布相比，从该玉米品种颖果中提取的淀粉的支链淀粉组分具有较大比例的B3和B4+链。
18．从用权利要求1的方法制备的玉米品种或其任何子代的颖果中提取的淀粉。
19一种制备稠化食品的方法，包括混合一种食品、水和有效量的权利要求18的淀粉，还包括生产该稠化食品所必须的蒸煮所得组合物的步骤。
20．一种用嵌合基因转化的玉米品种或其任何子代，该嵌合基因包括一个编码一种淀粉分支酶结构基因或其片段的核酸片段，该核酸片段的上游端沿有义或反义方向可操纵地连接于一个编码一种能在玉米胚乳组织中指导基因表达的启动子的核酸片段上，其下游端可操纵地连接于编码一种用于控制转录终止的合适调控序列的核酸片段上。
21．一种控制玉米淀粉中支链淀粉分子组分的支链分布的方法，包括：
(a)制备一种嵌合基因，该基因包括一个编码一种淀粉分支酶结构基因或其片段的核酸片段，该核酸片段的上游端沿有义或反义方向可操纵地连接于一个编码一种能在玉米胚乳组织中指导基因表达的启动子的核酸片段上，其下游端可操纵地连接于一个编码一种用于控制转录终止的合适调控序列的核酸片段上，
(b)用步骤(a)的嵌合基因转化玉米，
其中，与源于不具有所述嵌合基因的玉米的淀粉的支链淀粉分子组分的支链分布相比，所述嵌合基因的表达会导致所述转化玉米颖果中提取的淀粉的支链淀粉分子组分的支链分布的变化。
CN96199243A 1995-12-20 1996-12-12 通过修饰淀粉生物合成酶基因的表达而得到的新型淀粉 Pending CN1219199A (zh)

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