CN1198777A - 有关谷氨酸脱氢酶α－和β－亚基的新多肽和多核苷酸及用法 - Google Patents

有关谷氨酸脱氢酶α－和β－亚基的新多肽和多核苷酸及用法 Download PDF

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Abstract

公开了有关谷氨酸脱氢酶(GDH)的氨基酸和核苷酸序列。所述GDH酶是以七种不同的诱导同工酶形式发现于Chlorella sorokiniana这种藻类中。这些同工酶以由α－和β－亚基组成的叶绿体定位的六聚体形式存在于藻类中。用编码该酶的α－或β－亚基的核苷酸序列转化的植物表现出改善的性质,例如,生长提高和应力耐受性的改善。具有α－亚基和β－亚基二者的杂六聚体可以比α－均六聚体或β－均六聚体具有更高的胺化:脱氨基活性比。

Description

有关谷氨酸脱氢酶α-和β-亚基的 新多肽和多核苷酸及用法
本发明是在政府资助下完成的，USDA Competitive GrantNumber 87-CRCR-1-2476。政府对本发明拥有一定权利。
本申请是1995年10月6日提交的未决申请No.08/541,033的部分接续申请。
植物获取的无机氮在有机氮代谢中被同化之前就立刻被转化为铵。被认为是在同化过程中所涉及的一种酶是谷氨酸脱氢酶(GDH)，它是一组发现于从微生物到高等植物和动物的几乎所有生物体的普遍存在的酶(Srivastava，H.S.，R.P.Singli[1987]Phytochem.26：597-610)。GDH催化经由还原性胺化作用由α-酮戊二酸至谷氨酸的可逆转化，所述胺化作用利用还原的β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或还原的β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)作为辅因子。自从发现被认为是高等植物铵同化作用的优选途径的谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合酶(GS/GOGAT)途径以来，已开始怀疑植物GDH在铵同化为氨基酸中的作用(Miflin，B.J.，P.J.Lea[1976]Phytochem.15：873-885)。
在植物氮代谢中起主要作用的GDH的主要缺点是它对铵的低亲和力，这就需要高的胞内铵浓度来起合成作用。早期的证据表明，GDH是催化谷氨酸脱氨基作用的分解酶，在谷氨酸合成中只起部分合成功能(Wallgrove，J.C.，N.P.Hall.A.C.Kendall，[1987]Plant Physiol.83：155-158)。各种植物组织和细胞器中存在的大量GDH的生理作用尚不清楚，GDH在碳和氮代谢中可起显著作用的可能条件还没有判定。
迄今所鉴定的大多数GDH定位于线粒体中；然而，已从单细胞绿藻Chlorella sorokiniana鉴定了在几种性质(例如，辅因子特异性、Km值、细胞器定位、热稳定性等)上有差别的一种GDH。已表明，C.sorokiniana细胞具有一种组成型、线粒体的、四聚体NAD-特异性的GDH(下文称为“NAD-GDH”)(Meredith，M.J.，R.M.Gronostajski，R.R.Schmidt[1978]Plant Physiol，61：967-974)，以及七种铵-可诱导的、叶绿体定位的、均-和杂六聚体NADP-特异性的GDH同工酶(下文中称为“NADP-GDH”)(Prunkard，D.E.，N.F.Bascomb，R.W.Robinson，R.R.Schmidt[1986]Plant Physiol.81：349-355；Bascomb，N.F.，R.R.Schmidt [1987]Plant Physiol.83：75-84)。已表明，在非变性PAGE过程中七种叶绿体NADP-GDH同工酶具有不同的电泳迁移率，这可归因于形成了由不同比例α-和β-亚基(分别为53.5和52.3kDa)组成的均-和杂六聚体。
培养于1-2mM铵培养基中的小球藻属(Chlorella)细胞只积累α-均六聚体(Bascomb和Schmidt，上文)。向硝酸盐培养的细胞中添加更高的铵浓度造成NADP-GDH全酶中α-和β-亚基的积累(Prunkard等，上文；Bascomb和Schmidt，上文；Bascomb，N.F.，D.E.Prunkard，R.R.Schmidt[1987]Plant Physiol.83：85-91)。Prunkard等(Prunkard，D.E.，N.F.Bascomb，N.F，W.T.Molin，R.R.Schmidt[1986]Plant Physiol.81：413-422)指出，NADP-GDH亚基比例和同工酶模式受碳和氮源以及细胞培养的光照条件的影响。
从小球藻属细胞纯化的α-和β-NADP-GDH均六聚体具有差别惊人的铵Km值；不过，对它们的其它底物来说Km值非常相似。催化谷氨酸的生物合成的α-均六聚体(由六个相同的α-亚基组成)别构地受NADPH的调节并且具有在0.02-3.5mM间变化的非常低的铵Km，这取决于NADPH浓度(Bascomb和Schmidt，上文)。对迄今所鉴定的任何植物GDH而言，α-均六聚体的铵Km值是报道的最低的铵Km值。与此相反，β-均六聚体(分解形式)是铵Km约为75mM的非别构酶。根据涉及纯化酶的这些研究，迄今已经假设，杂六聚体对铵具有不同程度的亲和力，在α-和β-均六聚体的Km值间变化。不过，令人惊奇的是，我们发现某些杂六聚体可具有比α-或β-均六聚体高的胺化∶脱氨基活性比。
尽管α-和β-亚基具有不同的体内转换比(Bascomb等，上文)而且相应的均六聚体具有显著不同的铵Km值，但是α-和β-亚基源于几乎相同大小的前体蛋白(约58,000Da)而且具有非常相似的肽图(Prunkard等，上文；Bascomb和Schmidt，上文)。此外，制备的抗β-均六聚体的多克隆抗体能够免疫沉淀所有这些NADP-GDH同工酶(Yeung，A.T.，K.J.Turner，N.F.Bascomb，R.R.Schmidt[1981]Anal.Biochem.10：216-228；Bascomb等，上文)，但不与线粒体NAD-GDH发生交叉反应。而且，该试验室中先前的研究提供了基因组克隆化和Southern印迹的证据，它表明C.sorokiniana基因组具有一个单一的NADP-GDH结构基因(Cock，J.M.，K.D，Kim，P.W.Miller，R.G.Hutson，R.R.Schmidt[1991]Plant Mol.Biol.17：17-27)。
C.sorokiniana核编码的叶绿体NADP-GDH同工酶是从植物分离和鉴定的唯一的叶绿体定位的GDH序列。虽然以前已经鉴定过小球藻属GDH同工酶，但本发明中已发现，经由特异性加工两个由两个mRNA所编码的相似前体蛋白而产生两个成熟亚基，所述mRNA是通过旁路剪接得自单一核基因的前-mRNA而形成的。此外，在本发明之前，没有鉴定出成熟功能性GDH亚基的切割位点和氨基端肽序列。
本发明提供了从分离自单细胞绿藻Chlorella sorokiniana的mRNA得到的两个全长cDNA的分离和鉴定。这两个cDNA编码前体蛋白(α-前体，56.35kD；β-前体，57.85kD)，所述前体蛋白经加工可产生组成活性NADP-GDH六聚体同工酶的成熟α-和β-亚基(分别为53.5kD和52.3kDa)。本发明涉及一个单一NADP-GDH基因，该基因被旁路剪接而产生两个编码两个不同叶绿体前体蛋白的mRNA。这些前体蛋白再被加工成NADP-GDH同工酶的成熟α-和β-亚基。还描述了保留住所公开的活性或实用性的核苷酸和氨基酸序列的有用片断或突变体。例如，这里所提供的氨基酸序列的某些片断可用作转运肽(transit peptide)，只要该蛋白有能力进入并保留于某些细胞区室。例如，这里所述的核苷酸序列以及这些核苷酸序列的片断可用作扩增程序中的引物或者用作与感兴趣的互补序列杂交的探针。这里所述的核苷酸和氨基酸序列及其片断也可用作分子量标准参照物或用于鉴定和符合其它核苷酸序列、多肽或与NADP-GDH有关的同工酶的相关性。
本发明还提供了一些方法，在这些方法中，通过表达得自C.sorokiniana的GDH或分离自其它生物体的GDH可以改变高等植物从无机氮到有机氮代谢的同化作用。氮同化作用的改变可具有提高氮同化作用的作用，正如本领域公知的那样，这可以通过对碳代谢的逆向作用例如糖类的积累来影响植物的组成。本发明还涉及用于所述方法的DNA构建物。本发明包括α-和β-亚基的氨基端序列的鉴定，所述α-和β-亚基可以组装形成NADP-GDH同工酶，例如C.sorokinlana叶绿体中发现的天然六聚体NADP-GDH。可利用这一精确的分子信息来表达具有C.sorokiniana叶绿体α-和β-NADP-GDH均六聚体的独特动力学性质的NADP-GDH。本发明还提供重组细胞或生物体，例如转基因作物或植物，通过表达所述多核苷酸序列的基因产生相应的多肽，该转基因作物或植物可提高产量、改善氨同化性质(这可有利地提高它们对氨毒性的耐受性)、改变渗透应力耐受性、改善作物或植物的组成。
图1表示连续光照下于29mM铵培养基中培养240分钟的同步C.sorokiniana细胞的匀浆物中NADP-GDH活性的图式。对得自不同时刻收集到的细胞的澄清匀浆物的等分试样进行胺化(●)和脱氨基(o)NADP-GDH活性的分光光度分析。
图2表示在29mM铵培养基中培养240分钟的照明细胞中NADP-GDH抗原积累的图式。在0时刻，向同步C.sorokiniana子代细胞中添加铵并照明培养物。用激光光密度分析法分析Western印迹的放射性自显影来确定240分钟的诱导期间NADP-GDHα-亚基(●)和β-亚基(o)的相对水平。
SEQ ID NO.1是NADP-特异性的谷氨酸脱氢酶的α-亚基的前体蛋白的cDNA。
SEQ ID NO.2是SEQ ID NO.1的多核苷酸的推定氨基酸序列。
SEQ ID NO.3是NADP-特异性的谷氨酸脱氢酶的β-亚基的前体蛋白的cDNA。
SEQ ID NO.4是SEQ ID NO.3的多核苷酸的推定氨基酸序列。
SEQ ID NO.5是NADP-GDHα-亚基的N端序列。
SEQ ID NO.6是NADP-GDHβ-亚基的N端序列。
SEQ ID NO.7是称为pBGDc53的克隆中cDNA序列。
SEQ ID NO.8是与NADP-GDH mRNA的保守区杂交的引物。
SEQ ID NO.9是按照本发明用作衔接子引物的poly(dT)多核苷酸。
SEQ ID NO.10是按照本发明用作引物的多核苷酸。
SEQ ID NO.11是按照本发明用作引物的多核苷酸。
SEQ ID NO.12是按照本发明用作衔接子引物的多核苷酸。
SEQ ID NO.13是称为pRGDc60的克隆中多核苷酸插入片断。
SEQ ID NO.14是称为pRGDc61的克隆中多核苷酸插入片断。
SEQ ID NO.15是按照本发明用作引物的多核苷酸。
SEQ ID NO.16是称为pGDc63的克隆中多核苷酸插入片断。
SEQ ID NO.17是称为pGDc64的克隆的多核苷酸插入片断。
SEQ ID NO.18是按照本发明连接称为pBGD53和pGDc63的克隆中插入片断的纯化片断而得到的多核苷酸。
SEQ ID NO.19是连接称为pGDc64和pBGDc53的克隆的纯化插入片断而得到的多核苷酸。
SEQ ID NO.20是按照本发明用作引物的多核苷酸。
SEQ ID NO.21是按照本发明用作与模板DNA的3′端杂交的引物的多核苷酸。
SEQ ID NO.22是按照本发明用作引物的多核苷酸。
SEQ ID NO.23是经加工的、成熟NADP-GDHα-亚基的多核苷酸序列(cDNA)。
SEQ ID NO.24是经加工的、成熟NADP-GDHα-亚基的氨基酸序列。
SEQ ID NO.25是经加工的、成熟NADP-GDHβ-亚基的多核苷酸(cDNA)序列。
SEQ ID NO.26是经加工的、成熟NADP-GDHβ-亚基的氨基酸序列。
本发明提供了迄今未描述过的多核苷酸序列，例如，得自Chlorellasorokiniana的铵可诱导的、叶绿体-定位的NADP-特异性的谷氨酸脱氢酶(下文称NADP-GDH)的α-和β-亚基的前体蛋白的cDNA。形成NADP-GHD的α-和β-亚基的前体蛋白的核苷酸序列分别示于SEQ ID NO.1和3。得自Chlorella sorokiniana的NADP-GDH酶的α-和β-亚基的前体蛋白的推定氨基酸序列分别示于SEQ ID NO.2和4。
包含主题cDNA插入片断的大肠杆菌(E.coli)宿主保藏于theAmerican Type Culture Collection(ATCC)，12301 ParklawnDrive，Rockville，Maryland 20852 USA。保藏单位给出了培养物的入藏登记号：培养物            入藏登记号                保藏日期大肠杆菌DH5α     ATCC 69925                1995年10月6日α-NADP-GDHSEQ NO.1(+42bp)大肠杆菌DH5α     ATCC 69926                1995年10月6日β-NADP-GDHSEQ NO.1(-42bp)
按照37 CFR 1.14和35USC 122，该主题培养物已于一定条件下保藏，该条件保证在该专利申请未决期间专利商标官员依职权指定的人能够获得该培养物。按照主题申请的相应申请或其子申请已被提交的国家的专利法的要求，可获得该保藏物。不过应该理解的是，可获得一种保藏物并不构成实施主题申请的许可，并不是废除政府行为所授予的专利权。
而且，按照关于微生物保藏的布达佩斯条约的规定，主题培养保藏物将被保存并使公众可获得它，例如，保存时应采取必须措施使之在一定期限内是存活的、未受污染的，该期限是：最近一次要求提交保藏物样品之后至少五年，无论如何，保藏日期之后至少30年或者可能发布公开该培养物的任何专利的可实施期间。如果保藏单位因保藏物的情况而在被要求时不能提供该样品，寄存人承认替换该保藏物的责任。公开这些保藏物的专利一旦被授权，对公众获取主题保藏物的所有限制将最终取消。
自动氨基酸序列分析分别鉴定了α-和β-亚基的20个和10个氨基端氨基酸残基。α-和β-亚基肽序列的对照显示，除了在较大的α-亚基中存在11个氨基酸的突出端之外，这两个亚基是相同的。发现抗α-亚基的单克隆抗体能识别β-亚基，这提供更进一步的证据证明这两个亚基几乎是相同的。对前体蛋白中独特的α-和β-亚基加工位点的鉴定提供了解释α-和β-NADP-GDH均六聚体同工酶的不同动力学性质的分子机理。
上述资料提供了适用于遗传工程植物的信息，所述植物具有特异性的GDH，该GDH具有能影响碳和氮代谢两者的有利动力学性质。根据高的鸟嘌呤/胞嘧啶含量，这些cDNA对高等植物中的异源表达而言是高度适用的。把带有其叶绿体导向序列或带有其它细胞器导向序列的任一亚基或二者导入异源植物系统可以改善氮同化作用并影响碳/氮平衡。
已发现叶绿体定位与α-或β-前体蛋白的N端有关或者取决于它。切割前体的N端产生成熟蛋白。因此，叶绿体转运肽包括一种肽，这种肽形成从前体蛋白切下的N端或者就是它的活性片断。具有相似或等同氨基酸序列的肽，或者具有与这些切割的肽相似的三级结构或构象的肽也可起转运肽的作用。叶绿体-转运肤包括从α-前体(40聚体)或β-前体(37聚体)切下的N端肽的活性片断。本领域普通技术人员可用编码叶绿体-转运肽的多核苷酸序列来产生叶绿体-转运肽，采用这里所述的肽或本领域已知的其它肽。
可通过本领域公知技术，采用添加、消除或取代与一种蛋白(例如GDH酶)结合的叶绿体-转运肽来按需要定位该蛋白。例如，通过把叶绿体-转运肽插入缺乏这种转运肽的氨基酸序列中，可完成酶在细胞叶绿体中的定位。种特异性的叶绿体-转运肽可被添加或者用其替换存在的那些肽，以最优化地插到所需种的叶绿体中。此外，通过用编码表达出的蛋白质的多核苷酸序列直接转化质体可实现在叶绿体中表达出的蛋白质在叶绿体中的定位。类似地，可采用除去叶绿体-转运肽或产生缺乏该肽的重组蛋白，在除叶绿体之外的细胞区室中掩蔽该蛋白。
表达α-均六聚体的转化植物可以对氨毒性有更高的耐受力，更有效地同化铵，通过提供谷氨酸即渗透保护剂脯氨酸的前体而对暂时含盐土壤中遇到的渗透应力更迅速地作出反应。例如，可以利用β-均六聚体或GDH杂六聚体的表达来改变氮的同化速率，有利于果实和其它贮藏器官中糖类的积累。
出乎意料地发现，包含至少一个α-亚基和至少一个β-亚基的六聚体即杂六聚体可具有有利的活性。具体地说，通过把α-和β-亚基二者掺入六聚体蛋白而不是采用仅包含α-亚基或仅包含β-亚基的均六聚体，可以提高叶绿体NADP-GDH同工酶的胺化∶脱氨基活性比(即合成谷氨酸的生物合成能力)。在本发明的一个实施方案中，以不同的比例/水平在同一植物中共表达编码这两种类型亚基的cDNA会是有利的，这样可以在杂六聚体中得到特定比例的α-和β-亚基。例如，我们已经发现，对提高胺化∶脱氨基活性比而言，至少具有一个β-型亚基的NADP-GDH杂六聚体是优选的。更优选的杂六聚体具有2-5个β-亚基。这两种cDNA的不同表达比例可这样达到：将它们置于不同强度的植物启动子控制之下或者置于已修饰成能产生不同表达水平的同一启动子的控制之下。在植物生物技术中应用这种藻类NADP-GDH同工酶系统比使用得自诸如细菌的生物体的NADP-GDH(仅含有单一形式的该酶，即没有同工酶)有优势。
公认的是，通过提高稳定化mRNA转录物的表达可以改善某些重组蛋白在转基因植物中的表达水平；反过来可以利用对这些稳定化RNA转录物的检测来衡量翻译产物(蛋白质)的表达。通过使用得自基因源生物体、确定所需蛋白的、改善的合成基因，可以解决植物中蛋白RNA的低表达问题和由此产生的低蛋白表达问题。
因此，在本发明的一个实施方案中，可以对细胞和植物进行工程化处理以获得具有农业或其它商业价值的新型蛋白的所需表达水平。为提供在植物中表达得到提高的基因，可对该基因的DNA序列进行修饰以包含为高度表达的植物基因所优选的密码子，大体上获得植物中发现的核苷酸碱基组成中的A+T含量，而且还优选形成一个植物起始序列，并且消除那些导致RNA的去稳定作用、不适当的聚腺苷酸化、降解和终止的序列，避免那些构成二级结构发夹和RNA剪接位点的序列。例如，在合成基因中，可以根据高度表达的植物基因中所采用密码子使用的分配频率来选择用于确定一个给定氨基酸的密码子以确定那个氨基酸。正如本领域技术人员所认识到的那样，合成基因中用到的密码子使用的分配频率是表达水平的一个决定因素。
对本发明来说，“优选密码子使用的频率”是指使用核苷酸密码子来确定一个给定氨基酸时由特定宿主细胞所表现出的优先性。为确定一个基因中一个特定密码子的使用频率，把该基因中那个密码子的出现数目除以该基因中确定同一氨基酸的所有密码子的总出现数目。类似地，通过对宿主细胞表达的大量基因中的优选密码子使用的频率进行平均，可以计算出宿主细胞所表现的优选密码子使用的频率。最好将这种分析方法局限于被宿主细胞高度表达的基因。
合成在宿主细胞中的表达得以改善的基因时，希望设计这种基因：使其密码子使用的频率接近宿主细胞的优选密码子使用的频率。
按下述方法计算一个合成基因的优选密码子使用频率与宿主细胞所采用的频率的百分偏差：首先确定单一密码子的使用频率与宿主细胞的频率的百分偏差，再获得所有密码子的平均偏差。如此处所定义，这种计算包括独特的密码子(即ATG和TGG)。一般而言，用下式计算一个合成基因的密码子使用与宿主细胞的密码子使用的总平均偏差： A = Σ n = 1 Z X n - Y n X n x 100 Z 其中Xn＝宿主细胞中密码子n的使用频率；Yn＝合成基因中密码子n的使用频率。当n代表确定一个氨基酸的单个密码子时，密码子总数为Z。对所有氨基酸的密码子使用频率的总偏差A优选应低于约25％，更优选低于约10％。因此，可以设计一种基因，使其密码子使用的分配频率与高度表达的植物基因的分配频率的偏离优选不超过25％，更优选不超过约10％。此外，研究了简并的第三个碱基(单子叶植物在该位置上似乎倾向于G+C，而双子叶植物则不然)的百分G+C含量。还认识到，XCG(其中X是A、T、C或G)核苷酸是双子叶植物中最少优选的密码子，而XTA密码子则在单子叶植物和双子叶植物中都得到避免。本发明的合成基因还优选具有CG和TA双重避免指数，非常接近选定宿主植物的指数。更优选的是，这些指数与宿主指数的偏差不超过大约10-15％。
可利用本领域已知的标准技术进行本发明的NADP-GDH基因的装配。可以用酶促方法把为提高在植物中表达而设计的、特定实施方案的结构基因装配在得自化学法合成的寡核苷酸双链体区段的DNA载体中。然后可将该基困导入植物宿主细胞并用本领域已知手段表达。优选地，在植物中表达合成基团时产生的蛋白质与天然蛋白功能上是等同的，因为具有可比拟的或改善的胺化/脱氨基活性。根据本发明，“功能上等同”是指功能相同或几乎相同。具有至少一个与其活性或功能有关的性质、与天然蛋白相同或相似的合成基因产物被视为与其功能上等同。可以对编码区的核苷酸序列进行修饰，以改变合成基因的DNA碱基组成中A+T含量从而反映用于宿主细胞固有的高度表达的蛋白质的基因中常见的情况。合成基因的A+T含量最好与用于高度表达的蛋白质的所述基因的A+T含量大体相等。在编码高度表达的植物蛋白的基因中，A+T含量大约为55％。该合成基因最好具有接近该值的A+T含量，而不是高得足以造成RNA的去稳定作用从而降低蛋白表达水平。更优选A+T含量不高于大约60％，最优选约为55％。为了在植物中最终表达，可以优选地对合成基因核苷酸序列进行修饰以在编码区的5′端形成一个植物起始序列。另外，最好特别加以注意以保证独特的限制位点处于关键位置，以便在构建合成基因期间有效地装配寡核苷酸区段，并且有利于后续的核苷酸修饰。天然基因的编码区中这些修饰的结果是，在植物中表达了优选的合成基因，与天然结构基因的观察结果相比，该表达水平提高了。
已经知道，在单子叶植物和双子叶植物之间，同义密码子的相对使用有所不同。一般而言，区分单子叶植物和双子叶植物密码子使用模式的最重要因素是简并的第三个碱基的百分G+C含量。对单子叶植物来说，18个氨基酸中有16个偏向于该位置的G+C，而双子叶植物则在18个氨基酸中仅有7个偏向于G+C。
对大豆和玉米而言，玉米的密码子使用模式通常类似于单子叶植物，而大豆密码子使用模式与一般的双子叶植物模式几乎相同。
设计用于在植物中表达的基因时，最好消除那些影响基因表达效能的序列。
也可以为提高表达水平之外的其它目的合成合成基因。例如，按照本发明，可以对编码NADP-GDH的α-亚基或β-亚基的核苷酸序列之一进行修饰，以便有差别地表达出产物，有利于亚基之一的表达。这种有差别的表达的一个结果是所含一种亚基多于另一种亚基的杂六聚体。这种修饰可以包括把用于构建该合成基因的一个或多个(但不是全部)寡核苷酸区段用天然序列的相应区域代替。最好可以采用编码NADP-GDH多肽的α-和β-亚基的核苷酸序列的有差别表达来产生一种杂六聚体，该杂六聚体带有至少一个β-亚基，更优选2-5个β-亚基，最优选3个β-亚基。
可利用本领域技术人员熟知的任何方法把包括本发明核苷酸序列的重组DNA分子导入植物组织。用于一给定的植物种或特定类型的植物组织的技术取决于已知的成功技术。因为开发了用于适当地把外源基因插入植物细胞或用于操作已修饰细胞的新手段，所以熟练技术人员应能选择已知手段达到所需目的。把重组DNA导入植物组织的方法包括(但不局限于)：直接DNA摄取(Paszkowski，J.等，(1984)EMBO J.3：2717)，电穿孔法(Fromm，M.等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：5824)，显微注射(Crossway，A.等，(1986)Mol.Gen.Genet.202：179)，T-DNA介导的由根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)至植物组织的转移。就T-DNA对农杆菌属天然宿主范围进行的转化而言，似乎没有根本的限制。已报道了成功的T-DNA介导的单子叶植物的转化(Hooykaas-Van Slogeren，G.等(1984)Nature 311：763)，裸子植物转化(Dandekar，A.等(1987)Biotechnology，5：587)以及藻类转化(Ausich，R.，EPO申请108,580)。代表性的T-DNA载体系统描述于下列文献中：An，G.等(1985)EMBO J.4：277；Herrera-Estrella，L.等(1983)Nature 303：209；Herrera-EstreUa，L.等(1983)EMBO J.2：987；Herrera-Estrella，L.等(1985)见Plant Genetic Engineering，NewYork：Cambridge University Press，P.63。一旦导入植物组织中，就可以通过本领域已知的任何方法分析结构基因的表达，用转录的mRNA或合成的蛋白质衡量表达。已经知道一些体外培养植物组织的技术，在一些情形中，在完整植物中再生的技术。把导入的表达复合体转移入有商业价值的栽培品种的方法是本领域技术人员熟知的。
在一个优选实施方案中，本文所披露的本发明包括：在一种植物可表达启动子的控制下在植物细胞中表达NADP-GDH基因，即：在植物可表达启动子的控制下将该基因插入T-DNA并使用已知手段把含该插入片断的T-DNA导入植物细胞。一旦获得在植物可表达启动子的控制下表达该基因的植物细胞，就可以用本领域熟知的方法和技术再生植物组织和完整植物。然后用常规手段繁殖再生的植物，可以用常规的植物育种技术把导入的基因转移入其它株和栽培品种。
NADP-GDH基因的导入和表达可用于改善(例如提高)作物的产量。对本领域技术人员而言，利用导入植物种中的基因的性质的本发明其它用途是显而易见的。
植物核基因与叶绿体之间在密码子选择方面存在差异。叶绿体与高等植物之间的差别在于：它们只编码30种tRNA。既然叶绿体已限制了其tRNA基因，叶绿体编码的蛋白质的优选密码子的使用似乎更为极端。不过，已经报道了用于一给定氨基酸的同工tRNA水平与叶绿体基因组中这一密码子的使用频率之间的正相关关系(Pfitzinger等(1987)Nucl.Acids Res.15：1377-1386)。一般而言，叶绿体密码子分配与单细胞生物体的更为相似，在简并的第三个碱基上更偏于使用A+T。
下面的实施例阐述了实施本发明的方法，包括最佳方式。不应将这些实施例视为限制性的。除非另有指明，所有的百分数是指重量百分数，所有的溶剂混合物比例按体积。
实施例
实施例1-C.sorokiniana叶绿体谷氨酸脱氢酶的动力学
下列试验中用到的叶绿体谷氨酸脱氢酶α-和β-同工酶是由被鉴定为Clorella sorokiniana的生物体天然产生的。
C.sorokiniana培养条件。为了在胺化和脱氨基这两个方向进行动力学表征，从只积累一种形式的均六聚体GDH同工酶的细胞中纯化α-和β-全酶。
如前面所述(Prunkard等，同上文)，在改进的基本盐培养基中自养法培养C.sorokiniana细胞(UTEX-1230，University of Texas algalculture  collection；3B2NA，Robert R.Schmidt，University of Florida，Microbiology Cell Science Department)。这种改进的培养基含有以mM浓度计的CaCl2，0.34；K2SO4，6.0；KH2PO4，18.4；MgCl2，1.5；以μM浓度计的CoCl2，0.189；CuCl2，0.352；EDTA，72；FeCl3，71.6；H3BO3，38.8；MnCl2，10.1；NH4VO4，0.20；(NH4)6MO7O24，4.19；NiCl2，0.19；SnCl2，0.19；ZnCl2，0.734。该培养基补充有作为氮源的1mM NH4Cl，29mM NH4Cl，或29mMKNO3，这取决于试验条件。在高压灭菌之后，用KOH调节含NH4Cl的培养基至pH7.4，调节含KNO3的培养基至pH6.8。为细胞提供2％(v/v)CO2-空气混合物以及光强，要足以使细胞分裂四代。
NADP-GDH同工酶的纯化。为纯化谷氨酸脱氢酶α-同工酶，如前所述，在30升Plexiglas室中29mM铵培养基中于连续光照下培养C.sorokiniana细胞(  Baker，A.L.，R.R.Schmidt(1963)Biochim.Biophys.Acta.74：75-83)。在Sharples离心机中通过30,000rpm下离心作用收获4.0OD640的细胞，在10mM Tris(pH8.5，4℃)中洗涤两次。把沉淀的细胞(130g)贮藏在-20℃的250ml离心瓶中备用。采用对Yeung等(见上文)的改进方法完成NADP-GDH的纯化。对其方法的改进之处包括：用Sephadex G-200凝胶(Pharmacia)代替凝胶过滤柱中的G-150凝胶，向凝胶过滤缓冲液和所有后继贮存缓冲液中添加作为稳定剂的NADP+至终浓度为0.1mM。作为最后一项改进，省去NADP+亲和树脂步骤，代之以制备型非变性PAGE步骤(Miller，P.W.，W.D.Dunn，R.R.Schmidt[1994]BioRad US/EG Bulletin 1987)。
GDH脱氨基酶分析溶液组成为：44mM Tris，20.4mM谷氨酸和1.02mM NADP+，pH8.8。胺化分析溶液组成为：50mM Tris，25mMα-酮戊二酸，0.357mM NADPH和0.356M(NH4)2SO4，pH7.4。一个酶活性单位定义为：38.5℃下，每分钟还原或氧化1.0μ mol NADP+或NADPH所需的NADP-GDH的量。
收集具有NADP-GDH活性的Sephadex G-200柱级分，经Diaflow过滤而浓缩。通过添加DTT至终浓度为10mM来保护可溶酶(68mg)使之免受氧化，并使该酶在28.8mM Tris，192mM甘氨酸，2mM DTT(pH8.4)中渗析30分钟。4℃下于20,000g下离心10分钟来澄清渗析液，并使其与3ml 40％(w/v)蔗糖和1ml 0.02％溴酚蓝混合。
为进行制备型非变性PAGE，将3cm高的7％丙烯酰胺(w/v，28丙烯酰胺：0.735双丙烯酰胺，pH8.8)分离胶和2cm高的2％丙烯酰胺(w/v，1.6丙烯酰胺：0.4双丙烯酰胺，pH6.6)堆积胶浇注于Model 491 Prep Cell的28mm ID凝胶管中。所有丙烯酰胺原料都用AG501-X8混合床树脂进行过预处理以除去任何污染的丙烯酸残基，从而防止电泳过程中蛋白质的体外N-酰化。将蛋白样品在15mA稳定功率下电泳20分钟，然后在30mA稳定功率下电泳3.5小时。收集6ml级分并分析其NADP-GDH脱氨基活性，汇集含GDH的级分。利用Diaflow超滤把10mM KPO4(pH6.2)，0.1mM NADP+中汇集的级分中的酶浓缩至1mg/ml，浓度测定采用Bradford的方法，将BSA用作标准物。将浓缩的酶制剂贮存于-20℃。通过银染色法测定该制剂的纯度，采用该方法是为显示被10％(w/v)Tris-Tricine SDS-PAGE分离的蛋白质(Schagger，H.，G.von Jagow[1987]Anal.Biochem.166：368-379)。
按照Bascomb和Schmidt(同上文)所述，从下述细胞的混合物纯化NADP-GDHβ-同工酶：于1mM铵培养基中培养240分钟(14g)、1mM铵培养基中培养90分钟、于29mM铵培养基中培养20、40、60和80分钟(每个时刻1g)。采用对Yeung等(见上文)的方法进行缩小的改进方法，对NADP-GDHβ-同工酶进行部分纯化。将DEAE Sephacel离子交换柱(pH7.4，和pH7.6)缩小为40ml柱体积，用400ml线性KCl梯度(0-0.4M)洗脱3ml级分中的蛋白质。把含NADP-GDH的pH6 DEAE离子交换柱级分混入2种汇集物中；相应于NADP-GDH活性峰的前沿部和尾部。如前所述(Bascomb和Schmidt，见上文)，在10mM KPO4(pH6.2)，2mM DTT中把分别汇集的级分渗析16小时，用Type 3 NADP+亲和凝胶(Pharmacia)进行亲和纯化。通过Diaflow超滤浓缩汇集级分中的NADP-GDH，至2mg/ml蛋白，蛋白浓度测定用Bradford的方法(Bradford，M.M.[1976]Anal.Biochem.72：248-254)，于4℃贮存备用。用8％(w/v)Tris-TricineSDS-PAGE分离蛋白质之后，用银染色法测定制剂的纯度。
表1归纳了测定的α-和β-均六聚体同工酶胺化反应两者的Km值。
表1GDH同工型          底物              Km值(mM)α-均六聚体        NADPH             0,14
               NH4 +            0.02-3.5
               α-酮戊二酸       0.35*β-均六聚体        NADPH             0.14
               NH4 +            77
               α-酮戊二酸       12
*按照Shatilov，V.R.，W.L.Kretovich(1977)Mol.Cell  Biochem.15：201-212。
表2归纳了测定的α-和β-均六聚体同工酶脱氨基反应两者的Km值。
表2GDH同工型              底物            Km值(mM)α-均六聚体            NADP+          0.04
                   谷氨酸          38.2β-均六聚体            NADP+          0.04
                   谷氨酸          32.3α-、β-杂六聚体的活性。还在240分钟诱导期内用饱和水平的底物测定了天然NADP-GDH同工酶(由不同比例的α-和β-亚基组成的杂六聚体)的混合物的胺化和脱氨基活性(图1)。胺化和脱氨基活性分别显示20-40分钟的起始诱导延滞期。胺化活性在前100分钟迅速上升，在100-140分钟急剧下降，在140-240分钟又一次急剧上升。形成对比的是，脱氨基活性在起始诱导延滞期之后几乎以线性方式上升。
在29mM铵培养基中的240分钟诱导期过程中，还在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳之后利用Western印迹免疫检测法检测同工酶中Chlorellasorokiniana NADP-GDHα-和β-亚基的积累模式(图2)。在T0时刻检测到NADP-GDHβ-亚基，前40分钟内上升，然后在剩余的诱导期逐渐下降。α-亚基最初是在第20分钟测到的。前80分钟该亚基以低速率积累，在80-100分钟显示出明显增大，然后在剩余的诱导期内以低速率呈线性方式积累。从β-亚基为主要种类到α-亚基为主要种类的转变发生在60-80分钟。
计算胺化∶脱氨基活性比以及α∶β亚基比例，目的是确定在诱导期的时间过程中，NADP-GDH同工酶混合物中亚基比例的变化是否与预期的胺化∶脱氨基活性比相关。出乎意料的是，在60分钟观察到最高的胺化∶脱氨基比，此时亚基比例显示出β-亚基为主要的NADP-GDH抗原；而当胺化∶脱氨基活性比最低时，α-亚基为主要形式。后一结果是事先没有预料到的。
这一发现之前，根据对纯化的α-和β-均六聚体的底物动力学研究，人们假设：对铵具有非常高亲和力的α-均六聚体(相对于β-均六聚体)是具有最高胺化活性(即用于谷氨酸合成的生物合成能力)的同工酶形式。这些结果预示着，各亚基胺按其在均-和杂六聚体中的动力学性质独立起作用。
通过比较29mM铵培养基中240分钟诱导期内胺化∶脱氨基活性比与α∶β亚基比例，显示出这些比例的最大值之间的出乎意料的关系(表3)。
表3 C.sorokiniaha细胞中铵诱导期内，NADP-GDH胺化∶脱氨基活性和α-亚基∶β-亚基比例。
表3时间(分钟)            胺化∶脱氨基活性            α∶β亚基0                          2.87                        0.2820                         2.96                        0.5840                         3.81                        0.4960                         4.51                        0.8080                         3.49                        1.57100                        2.73                        8.74140                        1.61                        11.23240                        1.13                        34.79
在第60分钟出现胺化∶脱氨基比的峰值，此时β-亚基是主要的但不是唯一的抗原；而当胺化∶脱氨基比最低时，α-亚基是主要的。令人感兴趣的是，当两种亚基都存在时胺化活性最高，这预示着由α-和β-亚基组合形成的杂六聚体会具有比均六聚体更高的胺化活性。根据纯化的α-均六聚体比β-均六聚体对铵的Km值低得多，以前已有预测指出，α-均六聚体比由两种亚基组成的任何杂六聚体具有更高的胺化活性(Bascomb和Schmidt，1987)。
实施例2-多肽和多核苷酸测序
成熟亚基的氨基端测序。用8％(w/v)Tris-Tricine SDS-PAGE对纯化的NADP-GDHα-亚基(120pmol)制品的一个等分试样以及NADP-GDHα-亚基(80pmol)和β-亚基(50pmol)的部分纯化制品进行分离，并如Plough等所述(Plough，M.，A.L.Jensen，V.Barkholt[1989] Anal.Biochem.181：33-39  )电印迹到PVDF膜(Immobilon-PSQ，Millipore)上。为防止蛋白质氨基端残基的体外酰化，用AG501-X8混合床树脂对PAGE中采用的所有聚丙烯酰胺溶液进行处理以除去污染的丙烯酸。用Applied Biosystems，Inc.470A型气相测序仪进行自动Edman降解氨基序列分析。用RP-HPLC鉴定PTH-aa衍生物。由佛罗里达大学the Interdisciplinary Center for BiotechnologyResearch Protein Chemistry Core facility提供对电印迹的蛋白质的蛋白序列分析。
测定出α-亚基的N端序列如下：AVSLEEQISAMDATTGDFTA(SEQ ID NO.5)。测定出β-亚基的N端序列如下：DATTGDFTAL(SEQ IN NO.6)。这些序列相同于在两个NADP-GDH cDNAs中鉴定的ORF，并指出了被用来除去叶绿体导向肽序列的内部切割位点的位置。叶绿体导向肽序列(或叶绿体-转运肽)可与这些和其它氨基酸序列用于细胞区室定位。编码这些叶绿体-转运肽的多核苷酸序列可与其它多核苷酸序列一起使用来编码叶绿体-转运肽。
cDNA分离和测序。将-70℃下贮藏的C.sorokiniana细胞沉淀物按1-10(w/v)重悬于RNA断裂缓冲液中：0.1M Tris(pH8.5)，0.4MLiCl，10mM EGTA，5mM EDTA，100肝素钠(Sigma，100单位/mg)单位/ml，和1mM金精三羧酸(Sigma)。4℃、7000g下离心细胞悬浮物5分钟，弃去上清液。将细胞沉淀物按1-10(w/v)重悬于RNA断裂缓冲液中并通过20,000p.s.i.下的弗氏压碎器而进行破碎。将细胞匀浆物收集在一次性的50ml锥形管(它含有0.05倍体积20％(w/v)SDS，0.05倍体积0.5M EDTA(pH8)，200μg蛋白酶K/ml)，并使它在室温下保温15分钟。向匀浆物中添加1/2体积的TE缓冲液(Tris 10mM：EDTA 1mM，pH8.0)平衡过的酚，保温3分钟之后添加1/2体积的氯仿∶异戊醇(24∶1，v/v)，在摆环式振荡器中混合10分钟。把提取出的均浆物转入30ml硅烷化Corex管中，在4℃、1000g下离心10分钟。除去上层水相，并如上所述用等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1，v/v)反复提取，直到水界面清晰为止。最终提取之后，合并水相和等体积的2X LiCl-脲缓冲液(4M LiCl，4M脲，2mMEDTA，1mM金精三羧酸；Sigma)，4℃下在冰上沉淀RNA 16小时。4℃、4000g下离心RNA沉淀物20分钟，用1X LiCl-脲缓冲液漂洗所得沉淀物一次，再次离心以沉淀RNA。将RNA沉淀物溶于TE(pH7.5)中，用分光光度法在260nm下对等分试样进行定量。定量后，用oligo(dT)旋柱试剂盒(Spin Column kit)从全部细胞RNA中分离mRNA级分。合并每一制备物中的Poly(A)+RNA(50μg)并用于委托λUni-ZAP XRC.sorokiniana cDNA文库的商业生产(Stratagene CloningSystems，Palo Alto，CA)。
将扩增的λZAP文库(含2×1010pfu/ml)以50,000pfu/板的量铺于20个150mm培养板上，共筛选1×106个pfu。把噬菌斑吸到双Hybond-N 132mm圆形膜上，并按Amersham的噬斑印迹方案进行处理(1985，Amersham International plc.Arlington Heights，IL)。在一个普通容器中，使膜在40℃下杂交于200ml的2X PIPES(0.8MNaCl，20mM PIPES，pH6.5)，50％(w/v)甲酰胺，0.5％(w/v)SDS，100μg/ml变性剪切的鲑精DNA中。在42℃、10个热封袋(4个膜/袋)中，将封闭的膜杂交于在实验室摇摆器上的预杂交缓冲液中，该缓冲液含有1×106cpm/膜的32P-标记的NADP-GDH 242bp HCRcDNA探针。50℃下洗涤这些膜三次，每次用200ml的0.1×SSC，0.1％(w/v)SDS洗20分钟。把双膜包在塑料纸中，在-70℃下在KodakX-Omat AR胶片中暴露28小时。从板上取下双膜上检测到的推定NADP-GDH cDNA噬斑，用242bp保守区探针通过二级和三级筛选纯化噬斑。把初级筛选中选择的推定NADP-GDH cDNA噬菌体克隆合并，用32P-标记的130bp Eco RI/Bgl II cDNA片断(分离自最完整5′端NADP-GDH cDNA克隆的5′端)进行第二次筛选。把10个噬斑纯NADP-GDH克隆亚克隆在pBluescript KS+(Stratagene)中，通过Stratagene提供的体内切除方案转化入大肠杆菌DH 5 αF′(Bethesda Research Laboratories，BRL)。所有质粒分离过程如Kraft等所述(Kraft，R.，J.Tardiff，K.S.Krauter，L.A.Leinwand[1988]Biotechniques 6：544-547)。序列分析显示，所有10个克隆在3′端上是相同的，在5′端因不同程度的截短而有区别。具有完整3′端、称为pBGDc 53的最长cDNA克隆(SEQ ID NO.7)的长度不足以编码任一亚基；因此，用RACE PCR测定5′端序列。
利用用于快速扩增cDNA末端的改进的锚式PCR方法克隆5′端NADP-GDH cDNA序列(Frohman，M.A.[1990]见D.H.Gelford，J.J.Snincky，T.J.White，eds，PCR Protocols，Academic Press，San Diego，CA，pp 28-38；Jain，R.，R.H.Gorner，J.J.Murtagh[1992]Biotechniques12：58-59)。合成λZAP文库中所用的poly(A)+RNA混合物被用来克隆NADP-GDH mRNA的5′端。把100ng该mRNA混合物和10ng为与NADP-GDH mRNAs的保守区杂交而设计的基因特异性引物(5′-CTCAAAGGCAAGGAACTTCATG-3′，SEQ ID NO.8)混合，加热5分钟并在冰上冷却。按照生产者的方案使用SuperscriptTM逆转录酶(BRL)进行第一链DNA合成。终止的逆转录反应物用1单位的核糖核酸酶在37℃下处理20分钟，95℃下5分钟，用氯仿∶异戊醇(24∶1，v/v)提取一次。通过2000rpm下在Ultrafree-MC filterfuge管(30,000Mw截断值，Millipore)中离心来除去过量的引物和dNPs，把保留物在一个Savant Speedvac上浓缩至10μl。将第一链合成产物与10μl加尾混合物(1×加尾缓冲液[Promega Corp.]，0.4mMdATP，10单位的末端脱氧转移酶)混合，37℃下保温10分钟。把反应混合物加热至95℃保持5分钟，用TE(pH8)稀释至0.5ml，用作cDNA库。按Jain等(见上文)所述方法扩增一种混合物，该混合物含5μl的cDNA库、5μl的VentTM聚合酶10×缓冲液(New EnglandBiolabs)、200μM各种dNTP、25pmol基因特异性引物(SEQ IDNO.8)、5pmol poly(dT)衔接子引物(5′-GGGTCGACATTCTAGACAGAATTCGTGGATCC(T)18-3′；SEQ IDNO.9)、0.2单位PerfectmatchTM DNA聚合酶增强子(Stratagene)、1单位VentTM聚合酶(NEB)，体积为50μl。通过2,000rpm下在Ultrafree-MC单元离心来从过剩引物中纯化PCR引物。收集保留物，在每一步利用一种新的嵌套式基因特异性引物(分别为5′-GGACGAGTACTGCACGC-3′，SEQ ID NO.10；5′-GATCTCGGTCAGCAGCTG-3′，SEQ ID NO.11)和一个衔接子引物(5′-GGGTCGACATTCTAGACAGAA-3′；SEQ IDNO.12)来进行另外两轮扩增。在Model 480热循环仪(Perkin-ElmerCetus)中进行PCR扩增，用佛罗里达大学的ICBR DNA合成设施合成所有的委托寡核苷酸。在100μl反应体积中，标准PCR反应混合物含有10μl的10X VentTM聚合酶缓冲液，100μM每一dNTP，0.4单位PerfectmatchTM，50pmol每一引物，1单位VentTM DNA聚合酶。凝胶纯化5′RACE-PCR产物，亚克隆至pUC18的SmaI位点，转化到大肠杆菌DH5α用于进一步鉴定。RACE PCR鉴定了两个5′cDNA克隆，它们与以前鉴定的pBGDc53克隆重叠，两克隆相差42nt的插入片断，在称为pRGDc60的一个克隆(SEQ ID NO.13)中鉴定到该42nt插入片断，在称为pRGDc61的第二个cDNA(SEQ ID NO.14)中则没有。
由mRNA通过RT-PCR扩增来构建缺少RACE PCR多接头、但具有相应于pRGDc60和61的完整5′端的另两个cDNA克隆，其中使用前述反应条件和基因特异性引物对(5′-CTTTCTGCTCGCCCTCTC-3′，SEQ ID NO.15，和SEQ IDNO.11，见上述)。把两个PCR产物克隆到pBluescript SK+(Stratagene)的SmaI位点，转化进大肠杆菌DH5α用于进一步鉴定。具有该42nt插入片断的cDNA克隆被称为pGDc63(SEQ ID NO.16)，而缺少该插入片断的cDNA称为pGDc64(SEQ ID NO.17)。
通过用限制酶处理带有EcoRI/ApaLI的pGDc63和64、凝胶纯化所得(分别为264bp；222bp)片断来构建全长NADP-GDH cDNAs。把凝胶纯化的片断连接到pBGDc53的纯化的ApaLI/XhoI限制片断上，对全长连接产物(SEQ ID NO.18；SEQ ID NO.19)进行凝胶琼脂糖凝胶纯化并用于后继PCR反应中。
α-和β-均六聚体在大肠杆菌中的表达。使用凝胶纯化的产物(SEQ ID NO.18)进行PCR诱变，以从全长cDNA除去叶绿体导向信号，产生特异性编码成熟α-和β-亚基的cDNA。设计两套引物对来合成α-和β-GDH亚基基因。
设计下列引物来向加工过的成熟α-NADP-GDH亚基的氨基端(丙氨酸-41)添加一个蛋氨酸以起始翻译并产生用于亚克隆目的的5′NdeI位点：5′-CATATGGCCGTCTCGCTGGAGGAG-3′(SEQ ID NO.20)。设计如下的第二个引物以在内源TAA终止密码子的3′的20nt处杂交到模板DNA的3′端：5′-GTTGGATTGCCGGTGAGCC-3′(SEQ ID NO.21)。
设计如下引物来向加工过的成熟β-亚基的氨基端(天冬氨酸-38)添加一个蛋氨酸以起始翻译并产生用于亚克隆目的的5′NdeI位点：5′-CATATGGACGCCACCACCGGC-3′(SEQ IDNO.22)。用于PCR扩增的第二个3′引物是对α-亚基扩增所述的3′端引物(SEQ ID NO.21)。
PCR循环条件如下：95℃，50秒；64℃，1分钟；72℃，1分钟35秒(30个循环)。引物、dNTP、Vent聚合酶和其它反应成分的浓度如前所述。对1506 bp α-NADP-GDH亚基基因(SEQ IDNO.23)和1473bp β-GDH亚基基因(SEQ ID NO.25)PCR产物进行凝胶纯化，通过把纯化的片断与100μ M dATP和Taq聚合酶在72℃下保温15分钟而产生3′腺嘌呤核苷酸突出端。把修饰的PCR产物克隆入PCRII T/A克隆用载体(Invitrogen)并转化入感受态大肠杆菌细胞。通过蓝-白筛选来选择带有插入片断的克隆，进行质粒纯化，用NdeI/BamHI消化以在克隆用载体中选择正确方向。用NdeI和BamHI(由载体提供的BamHI位点)对选择的质粒进行限制处理，在用NdeI/BamHI线性化的pET 11a和pET 15b细菌表达载体(Novagen)的IPTG可诱导T7聚合酶启动子的控制下进行定向克隆，并转化入DH5α。通过NdeI/BamHI限制酶切分析筛选转化体，选择带有正确定向的α-和β-亚基cDNAs(SEQ ID NO23；SEQ ID NO.25)的克隆，进行质粒纯化，为进行蛋白表达而转化进大肠杆菌BL21(DE3)。
用100mM IPTG诱导用pET 11a-α-cDNA和pET 11a-β-cDNA构建物转化过的大肠杆菌BL21(DE3)细胞1小时。用酶分析法检测得自诱导细胞的蛋白提取物的NADP-GDH活性，用SDS凝胶电泳分离变性蛋白，用考马斯染色法使之可视化。由成熟α-亚基cDNA(SEQ ID NO.23)和β-亚基cDNA(SEQ ID No.25)表达的蛋白质具有SEQ ID NO.24(α-亚基)和SEQ ID NO.26(β-亚基)中所示的氨基酸序列。通过与兔抗-小球藻属NADP-GDH抗体的交叉反应性证实了重组GDH亚基。
在不是为最大诱导而最优化过的条件下，具有α-和β-GDHcDNAs、用IPTG诱导的大肠杆菌细胞与未诱导的对照相比，NADP-GDH活性分别提高了60和7,000倍。这时正在分析重组α-和β-NADP-GDHs，以证实动力学和生物化学性质。
C.sorokiniana叶绿体GDHs的超量表达和组装入活性酶中提供了证据，即经PCR工程化的DNA构建物被转录并被翻译成真实的蛋白质。然后将前述构建物用于藻类GDHs在转基因植物中的胞质表达。
植物的转化。用来产生表达高含量特异性GDH的遗传转化植物的方法需要把双链重组DNA分子导入植物细胞的核基因组。该DNA分子必须：(1)含有被导入植物细胞的编码GDH酶的结构DNA；(2)具有一种启动子，该启动子的作用是在植物中以组成型或组织特异性方式调节通过RNA聚合酶进行的RNA序列的产生；(3)具有一个3′-非翻译区，它的作用是导致转录终止和向RNA的3′端添加聚腺苷酸化核苷酸。所得初级RNA分子随后在核中被加工，这一加工过程包括去除内含子序列和向mRNA的3′端添加聚腺苷酸化核苷酸。
在本发明中有用的启动子是那些在需要谷氨酸产生或分解代谢时能以组成方式或组织特异性方式引起转录的启动子。有用的组成型启动子的一个例子是以组织独立性方式指导RNA合成的CaMV增强的35S启动子。能导致在种子、茎、根、叶或者这些组织的特定细胞类型中特异性地产生GDH的启动子在本发明中是有用的。例如，种子特异性的Phaseolin启动子是一个这样的组织特异性启动子。因此，可以获得并在本发明中使用用于玉米、小麦、大麦和大米的天然启动子以及得自其它生物体、以组成型/组织特异性方式起作用的异源启动子。
内含子。通常，当内含子序列插在启动子序列和结构基因序列之间时可以获得在单子叶植物中的最优表达。这种内含子序列的一个例子是WO93/19189中描述的HSP 70内含子。
聚腺苷酸化信号。本发明的DNA构建物可以具有一个3′非翻译区，其在植物中的作用是指导把聚腺苷酸化核苷酸添加到RNA的3′端。合适的3′非翻译区的一个例子是农杆菌属根瘤诱导质粒的聚腺苷酸化信号，即胭脂氨酸合成酶(NOS)基因。
质体导向序列。本发明的DNA构建物可任选含有质体导向序列。该质体导向序列指导蛋白质向质体中的运输，并在输入过程中被去除。该质体导向序列可以是但不局限于：在编码前体蛋白的C.sorokinianaNADP-GDH全长cDNAs中鉴定的天然叶绿体导向肽(CTP)。选择的质体导向序列和成熟α-和β-NADP-GDH亚基序列的融合体可用标准方法制备并用于本发明。通常在细胞质中发现缺少这些导向序列的GDH亚基。这种胞质定位的酶在捕捉区室化于细胞胞质溶胶中的铵或谷氨酸中是有用的。
GDH基因来源。用于本发明DNA构建物中的GDH基因可以是任何GDH基因。它不局限于上述C.sorokiniana GDH基因，尽管它们是优选的。例如，可以使用得自细菌或真菌的GDH基因。所提供的这些实施例使用C.sorokiniana的α-和β-GDH基因的应用，但不应以任何方式解释为对本发明范围的限制。本领域技术人员会认识到，可以用各种其它基因以及变化对本文所述的基因和方法进行修改，而不背离本发明的实质和范围。例如，可以用本领域熟知的技术进行诱变和常规筛选，以产生缺少被辅因子NADPH调节的突变变体。
在玉米原生质体中的瞬时表达。为检查玉米(Zea mays)细胞中C.sorokiniana GDH亚基的表达及其组装成活性酶的情况，构建了载体以包含CaMV E35S启动子，用于成熟α-亚基(pMON21904)或β-亚基(pMON21905)的编码序列，NOS 3′-非翻译的聚腺苷酸化区域，以及用于在大肠杆菌中选择的卡那霉素抗性基因。该α-和β-亚基基因以分别得自pET 11a-α-cDNA和pET 11a-β-cDNA的XbaI-EcoRI片断的形式分离到。把该GDH基因连接到XbaI-EcoRI E35S启动子，NOS 3′，pMON 22072的带卡那霉素抗性基因的区域上，得到pMON21904和pMON21905。按照Sheen等人的方法(The PlantCell Vol.3，225-245)把该DNA构建物电穿孔到玉米和小麦原生质体中。
分析转化的玉米原生质体。在冰上，把用pMON21904(α-亚基)、pMON 21905(β-亚基)、pMON21709(卡那霉素阴性对照DNA)和无DNA转化的沉淀的各种原生质体样品在0.2ml GDH细胞裂解缓冲液(Yeung等，见上文)中解冻。把每种悬浮液中的细胞两次匀浆30秒，在冰上冷却，在14,000rpm下澄清10分钟。38.5℃下，按Yeung等人(见上文)方法对细胞提取物进行脱氨基方向上的分析。采用BioRad微量蛋白质分析法按生产商的方案测定细胞提取物的总蛋白含量。为在不同制备物之间进行比较，把活性对总蛋白含量进行归一化处理。一个GDH活性单位定义为：38.5℃下、每分钟还原1μmol NADP所需的酶量。
用对照载体pMON21709转化的原生质体(n＝3)或未转化过的原生质体(n＝3)没有可检测到的NADP-GDH活性。用pMON 21904转化的原生质体(n＝3)表现出3.31GDH活性单位/mg蛋白，而用pMON21905转化过的原生质体(n＝3)为1.96单位/mg蛋白。
用胞质表达的C.sorokiniana α-和β-NADP-GDH基因转化过的原生质体表现出高水平的活性，这提供证据表明GDH亚基在异源植物系统中得到表达。另外，表达水平证明这些亚基被组装成活性酶。一般而言，对本领域普通技术人员而言，下列情况应视为本发明的一部分：添加到所述序列上的多余序列，或者本文所述核苷酸或氨基酸序列的片断，这些片断产生与本文中明确描述的序列功能相似或等同的多核苷酸或氨基酸序列。它们可以用本领域熟知技术容易而常规地产生，例如，对全长DNA进行时间控制的Bal31外切核酸酶消化，然后如前述实施例中所述表达所得片断并对表达产物进行常规筛选。此外，本领域普通技术人员容易接受的是，通过采用标准技术和方法把突变插入这些序列可以使所述序列的功能、性质或用途无效。这些突变(通过暗示，它们可有效地用来消除所述序列中固有的性质或功能)作为本发明的一部分明确地包括在内。例如，C.sorokiniana的α-和β-亚基之间的明确区别在于α-亚基N端处的11个氨基酸的多肽序列，但β-亚基中没有。这个序列可以影响酶对铵化合物的亲和力、特异性和调节作用。因此，明显的是，本领域普通技术人员能轻易地把适当的序列或其功能等同物插入(不存在的话)或去除(存在的话)，以产生其它GDH基因或其产物某些特性方面的差异。
还应理解的是，本文所述的实施例和实施方案仅是说明性质的，本领域技术人员能根据它们作多种修饰或变化，这些修饰或变化包括在本申请的实质和范围之内，并包括在所附权利要求的范围之内。
序列表
(1)一般信息：
(i)申请人信息：
申请人名称：University of Florida
街道地址：223 Grinter Hall
城市：Gainesville
州/省：Florida
国家：US
邮编：32611
电话号码：(352)392-8929  传真：(352)392-6600
(ii)发明名称：有关谷氨酸脱氢酶α-和β-亚基的新型多肽和多核苷酸及用法
(iii)序列数目：26
(iv)通讯地址：
    (A)地址：Saliwanchik & Saliwanchik
    (B)街道：2421 N.W.41st Street，Suite A-1
    (C)城市：Gainesville
    (D)州：Florida
    (E)国家：USA
    (F)邮编：32606
(v)计算机可读形式：
    (A)介质类型：软盘
    (B)计算机：IBM PC兼容
    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
    (D)软件：PatentIn Release #1.0，Version #1.25
(vi)当前申请资料
    (A)申请号：US
    (B)申请日：
    (C)分类：
(viii)律师/代理人信息：
(A)姓名：Whitlock，Ted W.
(B)注册号：36，965
(C)参考/卷号：UF155(ix)电信信息：
(A)电话：(904)375-8100
(B)电传：(904)372-5800(2)SEQ ID NO：1：的信息(i)序列特征：
(A)长度：2140个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：cDNA(ix)特征：
(A)名称/键：CDS
(B)位置：33.1610(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：CTCCTTTCTG CTCGCCCTCT CTCCGTCCCG CC ATG CAG ACC GCC CTC GTC GCC53
                                Met Gln Thr Ala Leu Val Ala
                                  1               5AAG CCT ATC GTG GCC GCC CCG CTG GCG GCA CGC CCG CGC TGC CTC GCG101Lys Pro Ile Val Ala Ala Pro Leu Ala Ala Arg Pro Arg Cys Leu Ala
     10                  15                  20CCG TGG CCG TGC GCG TGG GTC CGC TCC GCC AAG CGC GAT GTC CGC GCC149Pro Trp Pro Cys Ala Trp Val Arg Ser Ala Lys Arg Asp Val Arg Ala
 25                  30                  35AAG GCC GTC TCG CTG GAG GAG CAG ATC TCC GCG ATG GAC GCC ACC ACC197Lys Ala Val Ser Leu Glu Glu Gln Ile Ser Ala Met Asp Ala Thr Thr40                 45                  50                  55GGC GAC TTC ACG GCG CTG CAG AAG GCG GTG AAG CAG ATG GCC ACC AAG245Gly Asp Phe Thr Ala Leu Gln Lys Ala Val Lys Gln Met Ala Thr Lys
             60                  65                  70GCG GGC ACT GAG GGC CTG GTG CAC GGC ATC AAG AAC CCC GAC GTG CGC293Ala Gly Thr Glu Gly Leu Val His Gly Ile Lys Asn Pro Asp Val Arg
         75                  80                  85CAG CTG CTG ACC GAG ATC TTC ATG AAG GAC CCG GAG CAG CAG GAG TTC341Gln Leu Leu Thr Glu Ile Phe Met Lys Asp Pro Glu Gln Gln Glu Phe
     90                  95                 100ATG CAG GCG GTG CGC GAG GTG GCC GTC TCC CTG CAG CCC GTG TTC GAG389Met Gln Ala Val Arg Glu Val Ala Val Ser Leu Gln Pro Val Phe Glu
105                 110                 115AAG CGC CCC GAG CTG CTG CCC ATC TTC AAG CAG ATC GTT GAG CCT GAG437Lys Arg Pro Glu Leu Leu Pro Ile Phe Lys Gln Ile Val Glu Pro Glu120                 125                 130                 135CGC GTG ATC ACC TTC CGC GTG TCC TGG CTG GAC GAC GCC GGC AAC CTG485Arg Val Ile Thr Phe Arg Val Ser Trp Leu Asp Asp Ala Gly Asn Leu
            140                 145                 150CAG GTC AAC CGC GGC TTC CGC GTG CAG TAC TCG TCC GCC ATC GGC CCC533Gln Val Asn Arg Gly Phe Arg Val Gln Tyr Ser Ser Ala Ile Gly Pro
       155                  160                 165TAC AAG GGC GGC CTG CGC TTC CAC CCC TCC GTG AAC CTG TCC ATC ATG581Tyr Lys Gly Gly Leu Arg Phe His Pro Ser Val Asn Leu Ser Ile Met
    170                 175                 180AAG TTC CTT GCC TTT GAG CAG ATC TTC AAG AAC AGC CTG ACC ACC CTG629Lys Phe Leu Ala Phe Glu Gln Ile Phe Lys Asn Ser Leu Thr Thr Leu
185                 190                 195CCC ATG GGC GGC GGC AAG GGC GGC TCC GAC TTC GAC CCC AAG GGC AAG677Pro Met Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ser Asp Phe Asp Pro Lys Gly Lys200                 205                 210                 215AGC GAC GCG GAG GTG ATG CGC TTC TGC CAG TCC TTC ATG ACC GAG CTG725Ser Asp Ala Glu Val Met Arg Phe Cys Gln Ser Phe Met Thr Glu Leu
            220                 225                 230CAG CGC CAC ATC AGC TAC GTG CAG GAC GTG CCC GCC GGC GAC ATC GGC773Gln Arg His Ile Ser Tyr Val Gln Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly
        235                 240                 245GTG GGC GCG CGC GAG ATT GGC TAC CTT TTC GGC CAG TAC AAG CGC ATC821Val Gly Ala Arg Glu Ile Gly Tyr Leu Phe Gly Gln Tyr Lys Arg Ile
    250                 255                 260ACC AAG AAC TAC ACC GGC GTG CTG ACC CCG AAG GGC CAG GAG TAT GGC869Thr Lys Asn Tyr Thr Gly Val Leu Thr Pro Lys Gly Gln Glu Tyr Gly
265                 270                 275GGC TCC GAG ATC CGC CCC GAG GCC ACC GGC TAC GGC GCC GTG CTG TTT917Gly Ser Glu Ile Arg Pro Glu Ala Thr Gly Tyr Gly Ala Val Leu Phe280                 285                 290                 295GTG GAG AAC GTG CTG AAG GAC AAG GGC GAG AGC CTC AAG GGC AAG CGC965Val Glu Asn Val Leu Lys Asp Lys Gly Glu Ser Leu Lys Gly Lys Arg
            300                 305                 310TGC CTG GTG TCT GGC GCG GGC AAC GTG GCC CAG TAC TGC GCG GAG CTG1013Cys Leu Val Ser Gly Ala Gly Asn Val Ala Gln Tyr Cys Ala Glu Leu
        315                 320                 325CTG CTG GAG AAG GGC GCC ATC GTG CTG TCG CTG TCC GAC TCC CAG GGC1061Leu Leu Glu Lys Gly Ala Ile Val Leu Ser Leu Ser Asp Ser Gln Gly
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(A)长度：526个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Gln Thr Ala Leu Val Ala Lys Pro Ile Val Ala Ala Pro Leu Ala1               5                  10                  15Ala Arg Pro Arg Cys Leu Ala Pro Trp Pro Cys Ala Trp Val Arg Ser
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    515                 520                 525(2)SEQ ID NO：3的信息：(i)序列特征：
(A)长度：2099个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：cDNA(ix)特征：
(A)名称/键：CDS
(B)位置：33..1568(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：CTCCTTTCTG CTCGCCCTCT CTCCGTCCCG CC ATG CAG ACC GCC CTC GTC GCC53
                                Met Gln Thr Ala Leu Val Ala
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185                 190                 195GGC AAG AGC GAC GCG GAG GTG ATG CGC TTC TGC CAG TCC TTC ATG ACC677Gly Lys Ser Asp Ala Glu Val Met Arg Phe Cys Gln Ser Phe Met Thr200                 205                 210                 215GAG CTG CAG CGC CAC ATC AGC TAC GTG CAG GAC GTG CCC GCC GGC GAC725Glu Leu Gln Arg His Ile Ser Tyr Val Gln Asp Val Pro Ala Gly Asp
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    330                 335                 340GCG GTG CAG GAC ATG AAG AAG AAG AAC AAC AGC GCC CGC ATC TCC GAG1109Ala Val Gln Asp Met Lys Lys Lys Asn Asn Ser Ala Arg Ile Ser Glu
345                 350                 355TAC AAG AGC GAC ACC GCC GTG TAT GTG GGC GAC CGC CGC AAG CCT TGG1157Tyr Lys Ser Asp Thr Ala Val Tyr Val Gly Asp Arg Arg Lys Pro Trp360                 365                 370                 375GAG CTG GAC TGC CAG GTG GAC ATC GCC TTC CCC TGC GCC ACC CAG AAC1205Glu Leu Asp Cys Gln Val Asp Ile Ala Phe Pro Cys Ala Thr Gln Asn
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        395                 400                 405TAC GTG GTG GAG GGC GCC AAC ATG CCC TCC ACC AAC GAG GCC ATC CAC1301Tyr Val Val Glu Gly Ala Asn Met Pro Ser Thr Asn Glu Ala Ile His
    410                 415                 420AAG TAC AAC AAG GCC GGC ATC ATC TAC TGC CCC GGC AAG GCG GCC AAC1349Lys Tyr Asn Lys Ala Gly Ile Ile Tyr Cys Pro Gly Lys Ala Ala Asn
425                 430                 435GCC GGC GGC GTG GCG GTC AGC GGC CTG GAG ATG ACC CAG AAC CGC ATG1397Ala Gly Gly Val Ala Val Ser Gly Leu Glu Met Thr Gln Asn Arg Met440                 445                 450                 455AGC CTG AAC TGG ACT CGC GAG GAGGTT CGC GAC AAG CTG GAG CGC ATC1445Ser Leu Asn Trp Thr Arg Glu Glu Val Arg Asp Lys Leu Glu Arg Ile
            460                 465                 470ATG AAG GAC ATC TAC GAC TCC GCC ATG GGG CCG TCC CGC AGA TAC AAT1493Met Lys Asp Ile Tyr Asp Ser Ala Met Gly Pro Ser Arg Arg Tyr Asn
        475                 480                 485GTT GAC CTG GCT GCG GGC GCC AAC ATC GCG GGC TTC ACC AAG GTG GCT1541Val Asp Leu Ala Ala Gly Ala Asn Ile Ala Gly Phe Thr Lys Val Ala
    490                 495                 500GAT GCC GTC AAG GCC CAG GGC GCT GTT TAAGCTGCCC  AGGCCCAAGC1588Asp Ala Val Lys Ala Gln Gly Ala Val
505                 510CACGGCTCAC CGGCAATCCA ACCCAACCAA CTCAACGGCC AGGACCTTTT CGGAAGCGGC1648GCCTTTTTCC CAGCCAGGGC CCTCACCTGC CCTTTCATAA CCCTGCTATT GCCGCCGTGC1708CCCTGCAATT CCACCCCAAG AAGAACTAGC GGCACTTGAC TGCATCAGGA CGGCTATTTT1768TTTCGCGACG CGCGCTCACC CCGAGAGCCT CTCTCCCCCG AGCCCTAAGC GCTGACGTCC1828GCCCGACTTT GCCTCGCACA TCGCTCGGTT TTGACCCCCT CCAGTCTACC CACCCTGTTG1888TGAAGCCTAC CAGCTCAATT GCCTTTTAGT GTATGTGCGC CCCCTCCTGC CCCCGAATTT1948TCCTGCCATG AGACGTGCGG TTCCTAGCCT GGTGACCCCA AGTAGCAGTT AGTGTGCGTG2008CCTTGCCCTG CGCTGCCCGG GATGCGATAC TGTGACCTGA GAGTGCTTGT GTAAACACGA2068CGAGTCAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA A2099(2)SEQ ID NO：4的信息：(i)序列特征：(A)长度：512个氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：Met Gln Thr Ala Leu Val Ala Lys Pro Ile Val Ala Cys Ala Trp Val1               5                  10                  15Arg Ser Ala Lys Arg Asp Val Arg Ala Lys Ala Val Ser Leu Glu Glu
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     50              55                  60His Gly Ile Lys Asn Pro Asp Val Arg Gln Leu Leu Thr Glu Ile Phe65                  70                  75                  80Met Lys Asp Pro Glu Gln Gln Glu Phe Met Gln Ala Val Arg Glu Val
             85                  90                  95Ala Val Ser Leu Gln Pro Val Phe Glu Lys Arg Pro Glu Leu Leu Pro
        100                 105                 110Ile Phe Lys Gln Ile Val Glu Pro Glu Arg Val Ile Thr Phe Arg Val
    115                 120                 125Ser Trp Leu Asp Asp Ala Gly Asn Leu Gln Val Asn Arg Gly Phe Arg
130                 135                 140Val Gln Tyr Ser Ser Ala Ile Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Leu Arg Phe145                 150                 155                 160His Pro Ser Val Asn Leu Ser Ile Met Lys Phe Leu Ala Phe Glu Gln
            165                 170                 175Ile Phe Lys Asn Ser Leu Thr Thr Leu Pro Met Gly Gly Gly Lys Gly
        180                 185                 190Gly Ser Asp Phe Asp Pro Lys Gly Lys Ser Asp Ala Glu Val Met Arg
    195                 200                 205Phe Cys Gln Ser Phe Met Thr Glu Leu Gln Arg His Ile Ser Tyr Val
210                 215                 220Gln Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly Val Gly Ala Arg Glu Ile Gly225                 230                 235                 240Tyr Leu Phe Gly Gln Tyr Lys Arg Ile Thr Lys Asn Tyr Thr Gly Val
            245                 250                 255Leu Thr Pro Lys Gly Gln Glu Tyr Gly Gly Ser Glu Ile Arg Pro Glu
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290                 295                 300Asn Val Ala Gln Tyr Cys Ala Glu Leu Leu Leu Glu Lys Gly Ala Ile305                 310                 315                 320Val Leu Ser Leu Ser Asp Ser Gln Gly Tyr Val Tyr Glu Pro Asn Gly
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(C)链型：双链
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(A)长度：1506个碱基对
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(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：cDNA(ix)特征：
(A)名称/键：CDS
(B)位置：4..1464(xi)序列描述：SEQ ID NO：24：CAT ATG GCC GTC TCG CTG GAG GAG CAG ATC TCC GCG ATG GAC GCC ACC48
Met Ala Val Ser Leu Glu Glu Gln Ile Ser Ala Met Asp Ala Thr
        515                 520                 525ACC GGC GAC TTC ACG GCG CTG CAG AAG GCG GTG AAG CAG ATG GCC ACC96Thr Gly Asp Phe Thr Ala Leu Gln Lys Ala Val Lys Gln Met Ala Thr
    530                 535                 540AAG GCG GGC ACT GAG GGC CTG GTG CAC GGC ATC AAG AAC CCC GAC GTG144Lys Ala Gly Thr Glu Gly Leu Val His Gly Ile Lys Asn Pro Asp Val
545                 550                 555CGC CAG CTG CTG ACC GAG ATC TTC ATG AAG GAC CCG GAG CAG CAG GAG192Arg Gln Leu Leu Thr Glu Ile Phe Met Lys Asp Pro Glu Gln Gln Glu560                 565                 570                 575TTC ATG CAG GCG GTG CGC GAG GTG GCC GTC TCC CTG CAG CCC GTG TTC240Phe Met Gln Ala Val Arg Glu Val Ala Val Ser Leu Gln Pro Val Phe
            580                 585                 590GAG AAG CGC CCC GAG CTG CTG CCC ATC TTC AAG CAG ATC GTT GAG CCT288Glu Lys Arg Pro Glu Leu Leu Pro Ile Phe Lys Gln Ile Val Glu Pro
        595                 600                 605GAG CGC GTG ATC ACC TTC CGC GTG TCC TGG CTG GAC GAC GCC GGC AAC336Glu Arg Val Ile Thr Phe Arg Val Ser Trp Leu Asp Asp Ala Gly Asn
    610                 615                 620CTG CAG GTC AAC CGC GGC TTC CGC GTG CAG TAC TCG TCC GCC ATC GGC384Leu Gln Val Asn Arg Gly Phe Arg Val Gln Tyr Ser Ser Ala Ile Gly
625                 630                 635CCC TAC AAG GGC GGC CTG CGC TTC CAC CCC TCC GTG AAC CTG TCC ATC432Pro Tyr Lys Gly Gly Leu Arg Phe His Pro Ser Val Asn Leu Ser Ile640                 645                 650                 655ATG AAG TTC CTT GCC TTT GAG CAG ATC TTC AAG AAC AGC CTG ACC ACC480Met Lys Phe Leu Ala Phe Glu Gln Ile Phe Lys Asn Ser Leu Thr Thr
            660                 665                 670CTG CCC ATG GGC GGC GGC AAG GGC GGC TCC GAC TTC GAC CCC AAG GGC528Leu Pro Met Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ser Asp Phe Asp Pro Lys Gly
        675                 680                 685AAG AGC GAC GCG GAG GTG ATG CGC TTC TGC CAG TCC TTC ATG ACC GAG576Lys Ser Asp Ala Glu Val Met Arg Phe Cys Gln Ser Phe Met Thr Glu
    690                 695                 700CTG CAG CGC CAC ATC AGC TAC GTG CAG GAC GTG CCC GCC GGC GAC ATC624Leu Gln Arg His Ile Ser Tyr Val Gln Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile
705                 710                 715GGC GTG GGC GCG CGC GAG ATT GGC TAC CTT TTC GGC CAG TAC AAG CGC672Gly Val Gly Ala Arg Glu Ile Gly Tyr Leu Phe Gly Gln Tyr Lys Arg720                 725                 730                 735ATC ACC AAG AAC TAC ACC GGC GTG CTG ACC CCG AAG GGC CAG GAG TAT720Ile Thr Lys Asn Tyr Thr Gly Val Leu Thr Pro Lys Gly Gln Glu Tyr
            740                 745                 750GGC GGC TCC GAG ATC CGC CCC GAG GCC ACC GGC TAC GGC GCC GTG CTG768Gly Gly Ser Glu Ile Arg Pro Glu Ala Thr Gly Tyr Gly Ala Val Leu
        755                 760                 765TTT GTG GAG AAC GTG CTG AAG GAC AAG GGC GAG AGC CTC AAG GGC AAG816Phe Val Glu Asn Val Leu Lys Asp Lys Gly Glu Ser Leu Lys Gly Lys
    770                 775                 780CGC TGC CTG GTG TCT GGC GCG GGC AAC GTG GCC CAG TAC TGC GCG GAG864Arg Cys Leu Val Ser Gly Ala Gly Asn Val Ala Gln Tyr Cys Ala Glu
785                 790                 795CTG CTG CTG GAG AAG GGC GCC ATC GTG CTG TCG CTG TCC GAC TCC CAG912Leu Leu Leu Glu Lys Gly Ala Ile Val Leu Ser Leu Ser Asp Ser Gln800                 805                 810                 815GGC TAC GTG TAC GAG CCC AAC GGC TTC ACG CGC GAG CAG CTG CAG GCG960Gly Tyr Val Tyr Glu Pro Asn Gly Phe Thr Arg Glu Gln Leu Gln Ala
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        835                 840                 845AAG AGC GAC ACC GCC GTG TAT GTG GGC GAC CGC CGC AAG CCT TGG GAG1056Lys Ser Asp Thr Ala Val Tyr Val Gly Asp Arg Arg Lys Pro Trp Glu
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        915                 920                 925GGC GGC GTG GCG GTC AGC GGC CTG GAG ATG ACC CAG AAC CGC ATG AGC1296Gly Gly Val Ala Val Ser Gly Leu Glu Met Thr Gln Asn Arg Met Ser
    930                 935                 940CTG AAC TGG ACT CGC GAG GAG GTT CGC GAC AAG CTG GAG CGC ATC ATG1344Leu Asn Trp Thr Arg Glu Glu Val Arg Asp Lys Leu Glu Arg Ile Met
945                 950                 955AAG GAC ATC TAC GAC TCC GCC ATG GGG CCG TCC CGC AGA TAC AAT GTT1392Lys Asp Ile Tyr Asp Ser Ala Met Gly Pro Ser Arg Arg Tyr Asn Val960                 965                 970                 975GAC CTG GCT GCG GGC GCC AAC ATC GCG GGC TTC ACC AAG GTG GCT GAT1440Asp Leu Ala Ala Gly Ala Asn Ile Ala Gly Phe Thr Lys Val Ala Asp
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        995CGGCAATCCA AC1506(2)SEQ ID NO：24的信息(i)序列特征：
(A)长度：487个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：24：Met Ala Val Ser Leu Glu Glu Gln Ile Ser Ala Met Asp Ala Thr Thr1               5                  10                  15Gly Asp Phe Thr Ala Leu Gln Lys Ala Val Lys Gln Met Ala Thr Lys
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    355                 360                 365Asp Glu His Asp Ala Glu Leu Leu Ile Lys His Gly Cys Gln Tyr Val
370                 375                 380Val Glu Gly Ala Asn Met Pro Ser Thr Asn Glu Ala Ile His Lys Tyr385                 390                 395                 400Asn Lys Ala Gly Ile Ile Tyr Cys Pro Gly Lys Ala Ala Asn Ala Gly
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    435                 440                 445Asp Ile Tyr Asp Ser Ala Met Gly Pro Ser Arg Arg Tyr Asn Val Asp
450                 455                 460Leu Ala Ala Gly Ala Asn Ile Ala Gly Phe Thr Lys Val Ala Asp Ala465                 470                 475                 480Val Lys Ala Gln Gly Ala Val
            485(2)SEQ ID NO：25的信息：(i)序列特征：
(A)长度：1473个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：cDNA(ix)特征：
(A)名称/键：CDS
(B)位置：4..1431(xi)序列描述：SEQ ID NO：25：CAT ATG GAC GCC ACC ACC GGC GAC TTC ACG GCG CTG CAG AAG GCG GTG48
Met Asp Ala Thr Thr Gly Asp Phe Thr Ala Leu Gln Lys Ala Val
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    505                 510                 515AAG AAC CCC GAC GTG CGC CAG CTG CTG ACC GAG ATC TTC ATG AAG GAC144Lys Asn Pro Asp Val Arg Gln Leu Leu Thr Glu Ile Phe Met Lys Asp
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            555                 560                 565CAG ATC GTT GAG CCT GAG CGC GTG ATC ACC TTC CGC GTG TCC TGG CTG288Gln Ile Val Glu Pro Glu Arg Val Ile Thr Phe Arg Val Ser Trp Leu
        570                 575                 580GAC GAC GCC GGC AAC CTG CAG GTC AAC CGC GGC TTC CGC GTG CAG TAC336Asp Asp Ala Gly Asn Leu Gln Val Asn Arg Gly Phe Arg Val Gln Tyr
    585                 590                 595TCG TCC GCC ATC GGC CCC TAC AAG GGC GGC CTG CGC TTC CAC CCC TCC384Ser Ser Ala Ile Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Leu Arg Phe His Pro Ser
600                 605                 610GTG AAC CTG TCC ATC ATG AAG TTC CTT GCC TTT GAG CAG ATC TTC AAG432Val Asn Leu Ser Ile Met Lys Phe Leu Ala Phe Glu Gln Ile Phe Lys615                 620                 625                 630AAC AGC CTG ACC ACC CTG CCC ATG GGC GGC GGC AAG GGC GGC TCC GAC480Asn Ser Leu Thr Thr Leu Pro Met Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ser Asp
            635                 640                 645TTC GAC CCC AAG GGC AAG AGC GAC GCG GAG GTG ATG CGC TTC TGC CAG528Phe Asp Pro Lys Gly Lys Ser Asp Ala Glu Val Met Arg Phe Cys Gln
        650                 655                 660TCC TTC ATG ACC GAG CTG CAG CGC CAC ATC AGC TAC GTG CAG GAC GTG576Ser Phe Met Thr Glu Leu Gln Arg His Ile Ser Tyr Val Gln Asp Val
    665                 670                 675CCC GCC GGC GAC ATC GGC GTG GGC GCG CGC GAG ATT GGC TAC CTT TTC624Pro Ala Gly Asp Ile Gly Val Gly Ala Arg Glu Ile Gly Tyr Leu Phe
680                 685                 690GGC CAG TAC AAG CGC ATC ACC AAG AAC TAC ACC GGC GTG CTG ACC CCG672Gly Gln Tyr Lys Arg Ile Thr Lys Asn Tyr Thr Gly Val Leu Thr Pro695                 700                 705                 710AAG GGC CAG GAG TAT GGC GGC TCC GAG ATC CGC CCC GAG GCC ACC GGC720Lys Gly Gln Glu Tyr Gly Gly Ser Glu Ile Arg Pro Glu Ala Thr Gly
            715                 720                 725TAC GGC GCC GTG CTG TTT GTG GAG AAC GTG CTG AAG GAC AAG GGC GAG768Tyr Gly Ala Val Leu Phe Val Glu Asn Val Leu Lys Asp Lys Gly Glu
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    745                 750                 755CAG TAC TGC GCG GAG CTG CTG CTG GAG AAG GGC GCC ATC GTG CTG TCG864Gln Tyr Cys Ala Glu Leu Leu Leu Glu Lys Gly Ala Ile Val Leu Ser
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840                 845                 850CAC GGC TGC CAG TAC GTG GTG GAG GGC GCC AAC ATG CCC TCC ACC AAC1152His Gly Cys Gln Tyr Val Val Glu Gly Ala Asn Met Pro Ser Thr Asn855                 860                 865                 870GAG GCC ATC CAC AAG TAC AAC AAG GCC GGC ATC ATC TAC TGC CCC GGC1200Glu Ala Ile His Lys Tyr Asn Lys Ala Gly Ile Ile Tyr Cys Pro Gly
            875                 880                 885AAG GCG GCC AAC GCC GGC GGC GTG GCG GTC AGC GGC CTG GAG ATG ACC1248Lys Ala Ala Asn Ala Gly Gly Val Ala Val Ser Gly Leu Glu Met Thr
        890                 895                 900CAG AAC CGC ATG AGC CTG AAC TGG ACT CGC GAG GAG GTT CGC GAC AAG1296Gln Asn Arg Met Ser Leu Asn Trp Thr Arg Glu Glu Val Arg Asp Lys
    905                 910                 915CTG GAG CGC ATC ATG AAG GAC ATC TAC GAC TCC GCC ATG GGG CCG TCC1344Leu Glu Arg Ile Met Lys Asp Ile Tyr Asp Ser Ala Met Gly Pro Ser
920                 925                 930CGC AGA TAC AAT GTT GAC CTG GCT GCG GGC GCC AAC ATC GCG GGC TTC1392Arg Arg Tyr Asn Val Asp Leu Ala Ala Gly Ala Asn Ile Ala Gly Phe935                 940                 945                 950ACC AAG GTG GCT GAT GCC GTC AAG GCC CAG GGC GCT GTT TAAGCTGCCC1441Thr Lys Val Ala Asp Ala Val Lys Ala Gln Gly Ala Val
            955                 960AGGCCCAAGC CACGGCTCAC CGGCAATCCA AC1473(2)SEQ ID NO：26的信息：(i)序列特征：
(A)长度：476个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：26：Met Asp Ala Thr Thr Gly Asp Phe Thr Ala Leu Gln Lys Ala Val Lys1               5                  10                  15Gln Met Ala Thr Lys Ala Gly Thr Glu Gly Leu Val His Gly Ile Lys
         20                  25                  30Asn Pro Asp Val Arg Gln Leu Leu Thr Glu Ile Phe Met Lys Asp Pro
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 50                  55                  60Gln Pro Val Phe Glu Lys Arg Pro Glu Leu Leu Pro Ile Phe Lys Gln65                  70                  75                  80Ile Val Glu Pro Glu Arg Val Ile Thr Phe Arg Val Ser Trp Leu Asp
             85                  90                  95Asp Ala Gly Asn Leu Gln Val Asn Arg Gly Phe Arg Val Gln Tyr Ser
        100                 105                 110Ser Ala Ile Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Leu Arg Phe His Pro Ser Val
    115                 120                 125Asn Leu Ser Ile Met Lys Phe Leu Ala Phe Glu Gln Ile Phe Lys Asn
130                 135                 140Ser Leu Thr Thr Leu Pro Met Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ser Asp Phe145                 150                 155                 160Asp Pro Lys Gly Lys Ser Asp Ala Glu Val Met Arg Phe Cys Gln Ser
            165                 170                 175Phe Met Thr Glu Leu Gln Arg His Ile Ser Tyr Val Gln Asp Val Pro
        180                 185                 190Ala Gly Asp Ile Gly Val Gly Ala Arg Glu Ile Gly Tyr Leu Phe Gly
    195                 200                 205Gln Tyr Lys Arg Ile Thr Lys Asn Tyr Thr Gly Val Leu Thr Pro Lys
210                 215                 220Gly Gln Glu Tyr Gly Gly Ser Glu Ile Arg Pro Glu Ala Thr Gly Tyr225                 230                 235                 240Gly Ala Val Leu Phe Val Glu Asn Val Leu Lys Asp Lys Gly Glu Ser
            245                 250                 255Leu Lys Gly Lys Arg Cys Leu Val Ser Gly Ala Gly Asn Val Ala Gln
        260                 265                 270Tyr Cys Ala Glu Leu Leu Leu Glu Lys Gly Ala Ile Val Leu Ser Leu
    275                 280                 285Ser Asp Ser Gln Gly Tyr Val Tyr Glu Pro Asn Gly Phe Thr Arg Glu
290                 295                 300Gln Leu Gln Ala Val Gln Asp Met Lys Lys Lys Asn Asn Ser Ala Arg305                 310                 315                 320Ile Ser Glu Tyr Lys Ser Asp Thr Ala Val Tyr Val Gly Asp Arg Arg
            325                 330                 335Lys Pro Trp Glu Leu Asp Cys Gln Val Asp Ile Ala Phe Pro Cys Ala
        340                 345                 350Thr Gln Asn Glu Ile Asp Glu His Asp Ala Glu Leu Leu Ile Lys His
    355                 360                 365Gly Cys Gln Tyr Val Val Glu Gly Ala Asn Met Pro Ser Thr Asn Glu
370                 375                 380Ala Ile His Lys Tyr Asn Lys Ala Gly Ile Ile Tyr Cys Pro Gly Lys385                 390                 395                 400Ala Ala Asn Ala Gly Gly Val Ala Val Ser Gly Leu Glu Met Thr Gln
            405                 410                 415Asn Arg Met Ser Leu Asn Trp Thr Arg Glu Glu Val Arg Asp Lys Leu
        420                 425                 430Glu Arg Ile Met Lys Asp Ile Tyr Asp Ser Ala Met Gly Pro Ser Arg
    435                 440                 445Arg Tyr Asn Val Asp Leu Ala Ala Gly Ala Asn Ile Ala Gly Phe Thr
450                 455                 460Lys Val Ala Asp Ala Val Lys Ala Gln Gly Ala Val465                 470                 475

Claims (40)

1.一种多核苷酸，它包括编码选自SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.26的氨基酸序列的核苷酸序列，或者其片断或突变体。
2.一种多核苷酸，它包括选自SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.3，SEQID NO.7，SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.10，SEQ IDNO.11，SEQ ID NO.12，SEQ ID NO.13，SEQ ID NO.14，SEQ IDNO.15，SEQ ID NO.16，SEQ ID NO.17，SEQ ID NO.18，SEQ IDNO.19，SEQ ID NO.20，SEQ ID NO.21，SEQ ID NO.22，SEQ IDNO.23和SEQ ID NO.25的核苷酸序列，或者其片断或突变体。
3.根据权利要求2的多核苷酸，它包括选自SEQ ID NO.1，SEQ IDNO.3，SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.25中所示核苷酸序列的核苷酸序列，或者其片断或突变体。
4.根据权利要求2的多核苷酸，它形成一种能在植物细胞中表达的嵌合基因，该基因包括与该多核苷酸可操作地连接的植物可表达启动子。
5.根据权利要求2的多核苷酸，其中该多核苷酸与一种植物聚腺苷酸化序列可操作地连接。
6.根据权利要求2的多核苷酸，它包括至少一个编码NADP-GDHα-亚基的核苷酸序列和至少一个编码NADP-GDHβ-亚基的核苷酸序列。
7.根据权利要求6的多核苷酸，其中所述多核苷酸进一步包括一个用于所述编码NADP-GDHα-亚基和NADP-GDHβ-亚基的多核苷酸的启动子。
8.根据权利要求7的多核苷酸，其中该启动子对α-亚基和β-亚基有所不同。
9.根据权利要求7的多核苷酸，其中所述启动子对α-和β-亚基具有不同的活性。
10.根据权利要求6的多核苷酸，它包括一个选自SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.23的核苷酸序列以及一个选自SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.25的核苷酸序列。
11.一种转化的宿主细胞，它包括编码选自SEQ ID NO.2，SEQ IDNO.4，SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.26的氨基酸序列的多核苷酸，或者其片断或突变体。
12.根据权利要求11的转化的宿主细胞，其中所述多核苷酸编码一个选自SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.24的氨基酸序列以及一个选SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.26的氨基酸序列。
13.根据权利要求11的转化的宿主细胞，其中所述多核苷酸包括一个选自SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.23和SEQ IDNO.25中所示核苷酸序列的核苷酸序列。
14.根据权利要求13的转化的宿主细胞，它包括一个选自SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.23的核苷酸序列以及一个选自SEQ ID NO.3和SEQID NO.25的核苷酸序列。
15.调节植物细胞中氮代谢的方法，该方法包括转化所述植物细胞以包括一种多核苷酸，所述多核苷酸具有选自SEQ ID NO.1，SEQ IDNO.3，SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.25的核苷酸序列，或者其片断或突变体。
16.根据权利要求15的方法，其中所述多核苷酸具有一个编码至少一个NADP-GDHα-亚基的核苷酸序列和至少一个编码NADP-GDHβ-亚基的核苷酸序列。
17.根据权利要求16的方法，其中所述多核苷酸包括一个选自SEQID NO.1和SEQ ID NO.23的核苷酸序列以及一个选自SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.25的核苷酸序列。
18.根据权利要求15的方法，其中所述氮调节包括提高无机氮到有机氮的同化作用。
19.根据权利要求15的方法，其中所述多核苷酸与一种植物可表达启动子可操作地连接。
20.根据权利要求15的方法，其中所述多核苷酸与一种植物聚腺苷酸化序列可操作地连接。
21.一种调节植物性质的方法，该方法包括在所述植物中表达编码选自SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.26的氨基酸序列的多核苷酸，或者其片断或突变体。
22.根据权利要求21的方法，其中所述多核苷酸编码一种多肽，该多肽包括一个选自SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.24的氨基酸序列以及一个选自SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.26的氨基酸序列。
23.根据权利要求21的方法，其中所述调节包括提高作物产量，改变铵的同化，改变渗透应力耐受性，或改变植物的组成。
24.一种表达具有NADP-GDH六聚体动力学性质的GDH的方法，该方法包括使用所述六聚体的一个亚基的氨基端序列，其中所述氨基端序列选自SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。
25.一种多肽，它包括选自SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.4，SEQ IDNO.5，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.26的氨基酸序列，或者其片断或突变体。
26.根据权利要求25的多肽，它包括选自SEQ ID NO.2，SEQ IDNO.4，SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.26的氨基酸序列，或者其片断或突变体。
27.根据权利要求26的多肽，其中所述多肽包括SEQ ID NO.2的氨基酸序列或者其片断或突变体。
28.根据权利要求26的多肽，其中所述多肽包括SEQ ID NO.4的氨基酸序列或者其片断或突变体。
29.根据权利要求26的多肽，其中所述多肽包括SEQ ID NO.24的氨基酸序列。
30.根据权利要求26的多肽，其中所述多肽包括SEQ ID NO.26的氨基酸序列。
31.根据权利要求25的多肽，它形成β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-谷氨酸脱氢酶亚基的一个氨基端，该氨基端包括选自SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6的氨基酸序列。
32.一种包括多个亚基的多肽，所述多肽具有至少一个NADP-GDHα-亚基和至少一个NADP-GDHβ-亚基。
33.根据权利要求32的多肽，其中所述α-亚基包括具有选自SEQID NO.2和SEQ ID NO.24的氨基酸序列或者其片断或突变体的多肽。
34.根据权利要求32的多肽，其中所述β-亚基包括选自SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.26的多肽。
35.根据权利要求32的多肽，其中该多肽是杂六聚体。
36.根据权利要求35的多肽，其中该多肽包括至少两个β-亚基。
37.根据权利要求36的多肽，其中该多肽包括2-5个β-亚基。
38.根据权利要求37的多肽，其中该多肽包括3个β-亚基。
39.一种叶绿体-转运肽，它具有一种氨基酸序列或其片断，所述氨基酸序列包括选自SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4的氨基酸末端。
40.一种编码叶绿体-转运肽的多核苷酸序列，所述核苷酸序列包括选自SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3的5′端序列。
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