CN1246894A

CN1246894A - 具有降低的α葡聚糖L－或H－型块茎磷酸化酶活性水平的低冷甜化转基因马铃薯

Info

Publication number: CN1246894A
Application number: CN98802413.6A
Authority: CN
Inventors: L·M·考楚克; J·D·阿姆斯特隆; D·R·林奇; N·R·诺勒斯
Original assignee: Agriculture and Agri Food Canada AAFC
Current assignee: Agriculture and Agri Food Canada AAFC
Priority date: 1997-02-10
Filing date: 1998-02-05
Publication date: 2000-03-08
Also published as: AU724942B2; AR011121A1; CN1300338A; JP2001511007A; CN1113143C; CA2275885C; CA2275885A1; BR9807214A; PL334962A1; EP1009839A1; AU5849398A; NZ336766A; WO1998035051A1; HUP0000542A3; HUP0000542A2

Abstract

提供了一种马铃薯植株,它表现出其块茎中具有降低的α葡L－型块茎磷酸化酶(GLTP)或α葡聚糖H－型块茎磷酸化酶(GHTP)活性水平。特别是当贮存在低于7℃的温度下,表现出具有降低的GLTP或GHTP酶活性的马铃薯块茎中,淀粉变成糖的转化作用降低了。马铃薯中冷甜化作用降低,使马铃薯可贮存在较低的温度,导致休眠期延长,发病率降低,贮存寿命增加。还提供了产生这种马铃薯植株的方法,该植株可产生表现具有降低的GLTP或GHTP酶活性的块茎。通过如下技术可实现使马铃薯块茎中GLTP或GHTP活性降低:用同源性反义RNA抑制基因表达,应用共抑制,调节性沉默序列,化学的和蛋白质抑制剂,或者应用位点定向诱变或分离可替换性等位基因,以便获得具有降低的淀粉亲和性或活性的GLTP或GHTP变体。

Description

具有降低的α葡聚糖L-或H-型块茎磷酸化酶活性水平的低冷甜化转基因马铃薯

本申请要求1997年2月10日提交的美国临时专利申请号60/036,946的优先权，该申请在此全部被引入作为参考。

发明领域

本发明是关于通过降低马铃薯植株中α葡聚糖L-型块茎磷酸化酶或α葡聚糖H-型块茎磷酸化酶水平而抑制马铃薯中糖的积累。

发明背景

由广泛多种因素如疾病，环境和马铃薯块茎(Solanum tuberosum)贮藏引起的植物胁迫，是块茎品质的主要决定因素。收获至出芽之间的休眠期间对保持马铃薯的品质是关键性的。对马铃薯的处理通常是贮藏在7-12℃。与在7-12℃贮藏相比较，在2-6℃冷贮藏通过降低呼吸，减少水分丧失，减少微生物感染，减少发热损耗，以及给予化学出芽抑制剂，可提供最长的耐久保存(Burton，1989)。但是，低温会导致冷诱发性甜化，并且形成的高糖水平会促使其油炸产品出现不可接受的褐色或黑色(Coffin et al.，1987，Weaver et al.，1978)。所积累的糖主要是葡萄糖，果糖和蔗糖。首先是葡萄糖和果糖(还原糖)，当在各种烹调处理如油炸过程中受热时，经由Maillard反应过程与游离的氨基发生反应，导致生成褐色色素(Burton，1989，Shallenberger et al.，1959)。蔗糖在油炸时由于焦糖化作用和炭化产生黑色。理想的还原糖含量一般认为是块茎湿重的0.1％，上限为0.33％，更高的还原糖含量就足以引起形成褐色和黑色色素，导致不可接受的油炸产品(Daviesand Viola，1992)。虽然在较高的温度(7-12℃)下贮藏可减慢还原糖的积累，但是这样会增加微生物感染，并需要使用生芽抑制剂。考虑到与化学剂使用相关的环境危害和对健康的威胁，杀灭剂抗性病原体的形成，以及现行使用的出芽抑制剂可能即将被禁止的事实，需要有一种的马铃薯品种，它能经受胁迫和长时间冷贮存不必使用化学药剂，没有还原糖的积累，并且对淀粉有较好的保存。

植物细胞中碳水化合物的代谢是一个复杂的过程。控制多种不同的酶促反应过程都有可能影响冷贮藏过程中还原糖的积累，例如，抑制淀粉分解可减少游离糖的形成。通过降低糖含量的其它一些方法也可用于提高马铃薯的冷贮藏性能，包括用还原糖再合成淀粉，通过酵解和呼吸除去糖类，或者将糖转化成不能参与Maillard反应的其它形式。但是，许多酶促反应过程都是可逆的，并且对涉及碳水化合物代谢的绝大多数酶的作用尚缺乏了解。困难所在仍然是要找到一种酶，它能给予所希望的结果，能在低温下发挥功能，仍然使产品保持生产者，加工者和消费者所要求的品质。

已有人提出，磷酸果糖激酶(PFK)在冷诱发的甜化过程中起重要作用(Kruger and Hammond，1988，ap Rees et al.，1988，Dixon et al.，1981，Claassen et al.，1991)。ap Reese et al.(1988)指出，冷处理对碳水化合物代谢中的不同途径具有不均衡的作用，其中由于PFK的冷敏感性，酵解过程比较强烈地被降低了。然后，PFK活性降低将导致用于蔗糖生成的可利用的己糖-磷酸增加。欧洲专利0438904(Burrell et al.1991，7，31)中公布的内容是，在贮藏过程中增加PFK活性，通过酵解和进一步代谢除去己糖可减少糖的积累。源于E.Coli的PFK可在马铃薯块茎中表达，并且此专利报告声称，在收获季节测定出PFK活性增加了，蔗糖含量降低了。但是已表明，在低温下焦磷酸：果糖6磷酸转移酶(PFP)仍有活性(Claassen et al.，1991)。象PFK一样，PFP也能为酵解提供果糖6磷酸，因为这二个酶催化相同的反应。因此，这种改善冷贮存块茎品质的策略，其效果仍值得怀疑。而且，通过酵解和进一步代谢除去糖，并不是提高马铃薯块茎贮存性质的优选方法，因为通过呼吸作用会导致有用干物质的丧失。

还表明ADP葡萄糖焦磷酸化酶(ADPGPP)在冷诱发的甜化过程中有重要的作用。在国际专利申请WO 94/28149中(Barry，et al.，1994，5，18提交)曾公布，在贮存中增加ADPGPP活性，通过用还原性糖再合成淀粉可减少糖的积累。源于E.Coli的ADPGPP可在冷诱导性启动子的控制下在马铃薯块茎中表达，此专利报告声称，在收获时和在低温贮存后测定时表明块茎中ADPGPP活性增加了，还原性糖的含量较低。但是，此方案不是消除淀粉的分解代谢，而是代之增加淀粉再合成的速度。因此，通过酵解和呼吸进行糖分解代谢，再掺入淀粉的过程受到限制。上调ADPGPP不是提高马铃薯块茎贮存性质的优选方法，因为通过呼吸作用会导致有用干物质的丧失。再次表明，涉及降低淀粉分解代谢的方法是优选的，因为干物质可被保存。

据认为淀粉降解涉及到几个酶，包括α淀粉酶(内淀粉酶)，β-淀粉酶(外淀粉酶)，淀粉葡糖苷酶和α-葡聚糖磷酸化酶(淀粉磷酸化酶)。通过减缓淀粉分解代谢，可防止还原性糖的积累，并且可使通过酵解和进一步代谢对糖的清除作用减到最小。

已经描述了三种不同的α葡聚糖磷酸化酶的同功酶。块茎L-型α1，4葡聚糖磷酸化酶(EC2.4.1.1)同功酶(GLTP)(Nakano andFukui，1986)对高度分支葡聚糖如糖原具有低亲和性，存在于肌浆中。其单体由916个氨基酸组成，与源于兔肌肉和E.Coli的磷酸化酶进行序列比较表明具有高水平的同源性，分别有51％和40％的氨基酸同源性。此GLTP基因的核苷酸序列和GLTP酶的氨基酸序列分别显示在SEQID NO：1和SEQ ID NO：2中。H-型块茎α葡聚糖磷酸化酶的同功酶H(GHTP)(Mori et al.，1991)对糖原具有高亲和性，定位于细胞质中。该基因编码838氨基酸，显示与块茎L-型磷酸化酶有63％的序列同源性，但发现在L-型多肽中缺少插入的78-残基和50-残基氨基端的延伸。此GHTP基因的核苷酸序列和GHTP酶的氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4中。已有报导(Sonnewald et al.，1995)第三个同功酶由974个氨基酸组成，与块茎L-型磷酸化酶高度同源，对绝大多数多肽有81％的相同性。但是，含有过渡肽和插入序列的区域高度可变。此同功酶被称为叶L-型磷酸化酶，因为其mRNA在叶和块茎中同样地积累，而块茎L-型磷酸化酶的mRNA在马铃薯块茎中大量积累，在叶组织中只有微弱的积累。块茎L-型磷酸化酶主要存在于块茎中，叶L-型磷酸化酶在叶中较丰富(Sonnewald et al.，1995)。叶L-型磷酸化酶基因的核苷酸序列和叶L-型磷酸化酶的氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6中。

对各种淀粉降解酶的作用尚不了解，但是对相矛盾的结果已有相当多的争论。例如，降低叶L-型磷酸化酶的表达(Sannewald et al.，1995)对淀粉积累没有显著的影响。Sonnewald等(1995)曾报导，叶L-型基因特异性的反义RNA的组成型表达，导致叶组织中α葡聚糖L-型磷酸化酶活性大大降低了，但是对马铃薯块茎组织中的酶没有影响。因为α葡聚糖磷酸化酶活性的反义抑制，对转基因马铃薯植株叶中的淀粉积累没有显著的影响，所以该作者得出结论，淀粉降解不是由磷酸化酶催化的。鉴于已确定的α葡聚糖磷酸酶的同功酶具有高水平的序列同源性，预料对于H-型(GHTP)和L-型块茎(GLTP)同功酶也含有类似的阴性反应。

根据上面所述，仍然需要这样一种马铃薯植株，它能产生在以下条件下显示出低的淀粉向糖转化作用的块茎：在繁殖过程中，以及在室温和低温特别是在低于7℃的温度下贮存过程中。

发明概述

本发明者惊奇地发现，马铃薯块茎内α葡聚糖L-型块茎磷酸化酶(GLTP)或α葡聚糖H-型块茎磷酸化酶(GHTP)活性水平降低，可导致在繁殖和贮存过程中，相对于野生型马铃薯，特别是在10℃以下，在4℃贮存时，块茎内糖的积累显著地降低。值得注意的是，在块茎中复杂的碳水化合物代谢之下，单个酶活性降低对减少块茎中糖的积累有效。就Sonnewald等(1995)以前所述的工作而论，本发明者的发现更加令人吃惊，他们报导，降低对叶L-型磷酸化酶的表达对马铃薯植株叶中淀粉的积累没有显著的影响。

本发明可提供巨大的商业利益。其冷诱发的甜化被抑制或降低的块茎，可贮存在较低的温度下，而块茎中不会产生高水平的还原糖，这种还原糖引起马铃薯油炸产品出现令人难以接受的黑色。块茎冷贮存可延长贮存时间，通过限制呼吸和延迟出芽而延长休眠期，还可降低发病率。

可通过多种已知方法中的任何一种，实现降低马铃薯植株和块茎中GLTP或GHTP活性的目的，包括但不局限于GLTP或GHTP mRNA的反义抑制法，共抑制法，野生型GLTP或GHTP基因的位点定向诱变，化学的或蛋白质抑制法，或者通过植物育种程序。

因此，概括地说，本发明提供了一种经修饰的马铃薯植株，与未修饰的马铃薯植株产生的块茎相比较，此植株产生的块茎中具有较低水平的α葡聚糖L-型块茎磷酸化酶(GLTP)或α葡聚糖H-型块茎磷酸化酶(GHTP)活性。在优选的实施方案中，本发明提供了以一种表达盒转化的马铃薯植株，此表达盒具有有效地连接了一个DNA序列的植物启动子序列，此DNA序列当在植株中转录时，将抑制内源性GLTP基因或GHTP基因的表达。如在后面详述中还要论述的，上述DNA序列可按有义或反义取向插入此表达盒。可使本发明的马铃薯植株其GLTP或GHTP之一单独降低活性水平，或者也可使其GLTP和GHTP都降低活性水平。

如上面所述，本发明者发现，马铃薯植株中GLTP或GHTP酶活性水平降低，可导致马铃薯块茎中，特别是在低于10℃的温度长期贮存时糖的积累降低。因此，本发明进一步扩展，提供一种方法，用于降低马铃薯植株所产生的块茎中糖的生成，包括降低此马铃薯植株中GLTP或GHTP的活性水平。在优选的实施方案中，这种方法包括将一个表达盒导入马铃薯植株，此表达盒具有有效地连接于一个DNA序列的植物启动子序列，此DNA序列在植株中转录时将抑制内源性GLTP基因或GHTP基因的表达。如上所述，此DNA序列可以按有义或反义取向插入此表达盒中。

如在本文实施例中所详述的，在通过本发明的方法转化的马铃薯品种Desiree中，已经看到了冷贮存特征的改善。冷贮存特征改善的直接测定指标，是在收获后的冷贮存后所检测的GLTP或GHTP酶活性水平的降低。与未转化植株块茎中在同样条件下贮存后的总α葡聚糖磷酸化酶活性相比较，已形成的转化马铃薯品种，其植株块茎中表示为所产生μmolNADPH/mg蛋白质/小时的总α葡聚糖磷酸化酶活性，在4℃贮存189天后降低达70％。

冷贮存特征改善的另一个比较直接的测定指标是，冷贮存一段时间之后所观察到的马铃薯甜化降低。与未转化植株块茎中在同样条件下贮存后的葡萄糖和果糖总浓度相比较，已形成的转化马铃薯品种其块茎中葡萄糖和果糖总浓度，在4℃贮存91天后降低了39％。

还有一个证明本发明实际好处的冷贮存特征改善的鉴定指标是，在加工(烹调)过程中马铃薯片变黑程度降低。如前面所述，冷贮存过程中马铃薯中糖的积累会促使其油炸产品令人难以接受地变黑。以油炸马铃薯片的反射率为测定指标或薯片记分，可对油炸变黑程度降低作定量测定。在此将对测定薯片记分的技术进行论述。与未转化植株块茎在同样条件下的薯片记分相比较，本发明形成的转化马铃薯品种，其植株块茎的薯片记分在4℃贮存124天后升高达89％。

通过降低马铃薯植株的块茎中GLTP和/或GHTP活性，因此而抑制在低温贮存过程中的糖积累，本发明允许在比相同栽培种的野生型马铃薯更低的温度下贮存马铃薯。如上所述，在此传统所用的较低的温度下贮存马铃薯，可导致通过降低呼吸和生芽而增加贮存时间，延长休眠期，以及降低发病率。显然，对于本领域的技术人员，这样一些附加的好处也构成了改善的冷贮存特征，并可通过已知的技术量度和定量测定。

附图简述

将用如下附图对本发明的实施方案进行说明：

图1是插入pBI121转化载体的块茎L-型α葡聚糖磷酸化酶反义序列的示意图；

图2是插入pBI121转化载体的块茎H-型α葡聚糖磷酸化酶反义序列的示意图；

图3显示三个分离的葡聚糖磷酸化酶同功酶的基本结构。过渡肽(TS)和插入序列(IS)是L-型磷酸化酶的特征，在H-型磷酸化酶中未发现。百分数指示各同工型之间核酸序列的同源性；

图4是马铃薯中碳水化合物相互转化的图解(Sowokinos 1990)；

图5是马铃薯中发现的三个磷酸化酶同工型-区域氨基酸序列的比较，此区域是在此用于实施例中的反义GLTP结构所针对的区域。标明的氨基酸都相同。上面是叶L-型α葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：6的氨基酸21-238)，中间是块茎L-型α葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：2的氨基酸49-266)，下面是块茎H-型α葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：4的氨基酸46-264)；

图6A和6B是马铃薯中发现的三个磷酸化酶同工型某区域核苷酸序列的比较，此区域是在此用于实施例中的反义GLTP结构所针对的区域。标明的核苷酸都相同。上面是叶L-型α葡聚糖磷酸化酶的核苷酸序列(SEQ ID NO：5的核苷酸389-1045)，中间是块茎L-型α葡聚糖磷酸化酶的核苷酸序列(SEQ ID NO：1的核苷酸338-993)，下面是块茎H-型α葡聚糖磷酸化酶的核苷酸序列(SEQ ID NO：3的核苷酸147-805)；

图7是聚腺苷酸化RNA的northern印迹，此种RNA是从野生型，以及用块茎L-型α葡聚糖磷酸化酶转化的品系3，4，5和9的马铃薯块茎中分离出的。是用放射性标记的块茎L-型α葡聚糖磷酸化酶特异性探针进行印迹探测；

图8是总RNA的norther印迹，此种RNA是从野生型，以及用H-型α葡聚糖磷酸酶转化的品系1和2的马铃薯块茎中分离出的。是用放射性标记的H-型α葡聚糖磷酸化酶特异性探针进行印迹探测；

图9显示从如下品系的大田生长块茎，在4℃贮存86天后得到的油炸产品：(A)野生型和块茎L-型α葡聚糖磷酸化酶转化体，(B)ATL1，(C)ATL3，(D)ATL4，(E)ATL5，(F)ATL9，(“ATL”＝反义块茎L-型转化体)；

图10显示α1，4葡聚糖磷酸化酶L-型和H-型同功酶的活性凝胶电泳和免疫印迹，这种酶是从野生型块茎和用L-型同工型反义构建物转化的块茎中提取的；

图11显示α1，4葡聚糖磷酸化酶L-型和H-型同功酶的活性凝胶电泳和免疫印迹，这种酶是从野生型块茎和用H-型同工型反义构建物转化的块茎中提取的。

优选实施方案的详述

提供了一种马铃薯植株，由此植株产生的块茎，与未修饰的马铃薯植株产生的块茎相比较，具有降低水平的α葡聚糖L-型块茎磷酸化酶(GLTP)或α葡聚糖H-型块茎磷酸化酶(GHTP)活性。在此例证性情况下，是通过以一个表达盒转化马铃薯植株来实现降低α葡聚糖磷酸化酶活性的目的，此表达盒具有有效地连接于一个DNA序列的植物启动子序列，此DNA序列在植株中转录时将抑制内源性GLTP基因或GHTP基因的表达。虽然在此例证性情况下，此DNA序列是按反义取向插入表达盒，但是，此DNA序列按有义或反义取向插入表达盒都能达到降低α葡聚糖磷酸化酶活性的目的。1.同源依赖性沉默

用有义或反义基因片段控制基因表达是标准的实验室措施，在文献中已被大量资料确证。反义和有义抑制是二个基因序列的同源-依赖性现象，可被描述为“同源-依赖性沉默”现象。

1996年发表的一篇科学研究论文的述评，提及几百篇有关转基因植物中同源-依赖性沉默的报告。虽然对奠定同源-依赖性沉默基础的机理尚未完全理解，但是已在许多植物基因中研究了此现象的特征，并且对这些工作的主要部分已作了广泛的评述(Meyer and Saedler 1996，Matzke and Matzke 1995，Weintraub 1990，Van der Krol et al 1988)。同源-依赖性沉默看来是可用于控制许多内源性基因活性的普遍现象。在导入同源序列后表现出降低表达的基因实例包括：二氢黄烷醇还原酶(Van der Krol 1990)，多聚半乳糖醛酸酶(Smith et al 1990)，八氢蕃茄红素合成酶(Fray and Grierson 1993)，果胶酯酶(Seymour etal 1993)，苯丙氨酸氨裂解酶(De Carvalho et al.1992)，β-1，3-葡聚糖酶(Hart et al.1992)，几丁质酶(Dorlhac et al.1994)，硝酸还原酶(Napoli et al.1990)，以及苯基苯乙烯酮合成酶(14)。已有报告表明，以马铃薯卷叶病病毒的包被蛋白基因的有义或反义构建体转化Russet Burbank马铃薯植株，可赋予植株对马铃薯卷叶病病毒感染的抗性(Kawchuk et al.1991)。同源有义或反义序列的转移通常可产生具有降低内源性基因表达的转化体，如在此实施例中所详述的，表现出指示降低GLTP或GHTP表达的转化的马铃薯植株易被鉴定。

在反义抑制技术中，装配了一种基因构建体或表达盒，当它包括入植物细胞时，将导致与由靶基因产生的mRNA互补的RNA序列的表达。推理认为，由于此互补的RNA序列形成了双螺旋，因此抑制了蛋白质翻译过程。在文献中，包括“反义研究及其应用”(CRC出版，1993)pp.125-148，已对决定有义和反义抑制基础的理论进行了论述。此互补序列的长度可以是与靶基因的全部序列相同，但是一个片段通常是足够的，而且操作更方便。例如，Cannon等(1990)揭示，短至41个碱基对的反义序列就足以达到基因抑制的目的。美国专利号5,585,545(Bennett et al.，December 1996)描述了借助于只有21个碱基对的反义序列的基因抑制作用。在专利文献中，有很多对用于通常将反义序列导入机体而抑制剂基因表达的方法进行描述和申请专利保护的例子包括例如，美国专利号5,545,815(Fischer et al.，1996年8月13日)和美国专利号5,387,757(Bridges et al.，1995年2月7日)。

有义序列的同源-依赖性沉默可按照与反义抑制相类似的方式进行，不同的是将核苷酸序列按正常有义取向插入表达盒。包括美国专利5,034,323，5,231,020和5,283,184在内的许多专利公开了导入有义序列而导致基因表达抑制的方法。

同源-依赖性沉默的二种形式，有义和反义抑制都可用于实现本发明下调GLTP或GHTP的目的。本领域的人员知道，这二种技术对基因抑制是同等有效的策略。例如，美国专利号5,585,545(Bennett et al.，1996，12，17)和美国专利号5,451,514(Boudet et al.，1995，9，15)，都对类似于有义和反义抑制技术的用于抑制基因表达的方法，或对在抑制基因表达方法中有用的重组DNA序列申请了专利保护。2.用于降低块茎中GHTP和/或GLTP活性的替代技术

虽然同源-依赖性沉默是本发明用于下调马铃薯植株中GLTP或GHTP的优选技术，但是，另外几种通常采用的策略也可用于降低特异性基因产物的活性，本领域的专业人员将意识到它们也适合于本发明。将相关的基因或启动子插入植物，可诱发同源的内源性转录物的快速周转，是一种被称为共抑制作用的过程，并据信与负责反义RNA抑制的机制有许多相似之处(Jorgensen，1995，Brusslan and Tobin，1995)。DNA的各种调节序列都可以改变(启动子，聚腺苷酸化信号，转录后加工部位)，或者可用于改变特异性mRNA的表达水平(增强和抑制)。另一种降低基因表达和减少其编码蛋白的策略是用核酶消化，特异性地断开靶标mRNA，使它不能产生功能完整的蛋白质(Hasseloff and Gerlech1988)。对一种已鉴定是决定某特异性品质的重要酶，可通过鉴别其天然存在的等位基因，或形成基因工程等位基因，改变其活性水平，并用于经典的育种程序(Oritz and Huaman，1994)。位点定向诱变法也常用于改变某一被鉴定的基因产物的活性。可在E.Coli或其它适合的宿主内，使磷酸化酶的结构编码序列发生诱变，并对降低的淀粉磷酸酶解作用进行筛选。另一方面，还可鉴别具有降低亲和性和/或具有特异亲和性的磷酸化酶天然存在的等位基因。此外，特定酶的活性还可用各种抑制剂来改。这些方法都是常规使用的，可在如Sambrook et al(1989)的教科书中找到。3.GLTP和GHTP酶的变异体和用于同源依赖性沉默的序列

如在发明背景中所述，以及Nakano et al.(1986)，Mori et al.(1991)，和Sonnewald et al.(1990)的详述，在马铃薯植株中存在三种已知的α葡聚糖磷酸化酶的同功酶。本发明关系到下调GLTP和/或GHTP的同功酶。尽管据认为所有已知的商业用马铃薯品种的GLTP和GHTP基因都基本上相同，但是预期本发明的原理和技术对某些马铃薯植株是有作用的，这些植株具有某些不同的全长聚苷酸序列或亚序列，这些序列能编码具有所述GLTP和GHTP酶的淀粉分解代谢催化活性的多肽。如在此和权利要求中所用的术语“GLTP”和“GHTP”，意在包括上述的变异体。上述的变异体可包括由于密码子的简并性而与作为例子的序列不同，但仍然编码相同多肽的GLTP和GHTP核苷酸序列变异体，以及编码能被特定抗体识别的蛋白质的变异体，这种抗体是针对在SEQ ID NO：2和4中所列出的GLTP和GHTP氨基酸序列而产生的。

类似地，本领域的技术人员将意识到，用不同于作为例证的有义或反义序列，也可能实现使马铃薯中的GLTP和/或GHTP同源-依赖性沉默的目的。首先，从中衍生反义序列的GLTP或GHTP cDNA序列区不是必不可少的。其次，如上所述，所用反义序列的长度可能有相当大的差别。另外，有义或反义序列不必与将被抑制的靶标GLTP或GHTP基因的序列相同。如在此实施例中所述，本发明者已观察到，以来源于GHTP基因的反义DNA序列转化马铃薯植株，不仅能充分地抑制GHTP基因的活性，而且可引起GLTP基因活性的一定程度抑制。GHTP和GLTP基因的反义序列有56.8％的序列相同。Sonnewald et al(1990)描述的GLTP反义序列和相应的叶型α葡聚糖磷酸化酶序列之间的同一性是71.3％。根据本发明者的研究资料，当用来源于GLTP基因的反义DNA序列转化马铃薯植株时，没有观察到同样的交叉下调现象。然而，这些结果清楚地表明，在GLTP活性被具有约57％的序列与靶标GLTP序列相同的反义序列抑制的条件下，靶标内源性α葡聚糖磷酸化酶基因和重组DNA之间序列完全相同是不必要的。

因此，本领域的专业人员将能理解到，将与在此作例证的序列不同的有义或反义序列，以及不同于与靶标内源性GLTP或GHTP基因具有完全序列同一性的有义或反义序列导入马铃薯植株细胞时，都能有效地引起内源性GLTP或GHTP基因抑制剂。借助于在为比较的目的而排列的部分序列上保守氨基酸的取代，或者相匹配核苷酸或氨基酸的百分数差异，有用的有义或反义序列可能不同于作为例证的反义序列，或者不同于来源于内源性GHTP或GLTP基因序列的其它序列。

美国专利5,585,545(Bennett等，1996，12，17)提供了有关如下技术的有益论述：比较多核苷酸和多肽序列的同一性，保守氨基酸的取代，以及指示序列同一性程度的杂交条件。在此将概述此论述的有关部分。

通过在一个比较窗口比较二个最佳匹配的序列，可确定多核苷酸和多肽序列同一性百分数，当为了最佳匹配这二个序列而与参照序列(它不包含增补或缺失)相比较时，其中在比较窗口内的部分多核苷酸或多肽序列可能包含有增补或缺失(即缺口)。此百分数的计算步骤如下：(a)确定二个序列内存在相同核酸碱基或氨基酸残基位置的数目，得到匹配位置的数目；(b)以此匹配位置数目除以比较窗口内位置的总数；以及(c)将此结果乘以100，得到序列同一性百分数。最佳的序列匹配比较可借助于已知算法的计算机执行程序来进行(例如Wisconsin遗传软件包中的GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA，遗传计算机组(GCG)，575 Science Dr.，Madison，WI，或从国家生物技术信息中心可获得的BlastN和BlastX)，或者通过检测法进行。

可通过保守氨基酸的更换来区别特定的多肽，这种多肽除了不同的残基位置之外，具有基本上类似于上述的共有序列。保守氨基酸的取代是指具有类似侧链的残基的可互换性。例如，具有α侧链的氨基酸组有甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸；具有α-羟基侧链的氨基酸组有丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸组有天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳基侧链的氨基酸组有苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸组有赖氨酸，精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的氨基酸组有半胱氨酸和甲硫氨酸。

如果二个核酸分子能在严格条件下相互特异性地杂交，是其核苷酸序列基本相同的另一个指示。严格条件是与序列有关的，并且随不同的环境条件而不同。一般而言，对于特定的序列，在确定的离子强度和pH下，严格条件选择为比热熔点(Tm)低大约10℃。Tm是50％靶标序列能与准确匹配的探针杂交的温度(在确定的离子强度和pH7)。杂交的Tm是探针的长度和碱基组成的函数，可按Sanbrook et al(1989)的描述计算。一般来说，用于DNA印迹试验方案的严格条件包括用0.2×SSC在65℃下漂洗。对于优选的寡核苷酸探针，漂洗条件通常是在6×SSC中大约42℃。4.一般方法

可用各种方法对植物细胞导入和表达外来的DNA序列。简略地说，制备反义α葡聚糖磷酸化酶cDNA，并将它导入植物细胞的步骤包括：(1)从马铃薯植株分离出mRNA，并从此mRNA制备cDNA；(2)从此cDNA中筛选出所需序列；(3)按磷酸化酶基因表达的相反取向将一个启动子连接于此所需的cDNA；(4)转化适合的宿主植物细胞；以及(5)选择和再生转录此反义序列的细胞。

在此例证性情况下，是将来源于马铃薯GLTP和GHTP基因的DNA用于构成表达盒，此表达盒具有有效地连接于一个反义DNA序列的植物启动子序列，此反义DNA序列在植株中转录时将抑制内源性GLTP基因或GHTP基因的表达。根瘤土壤杆菌可用作将此DNA传递给马铃薯苗茎外植体的载体。从转化的外植株再生的植株转录抑制此酶活性的反义DNA。

在此所述的重组DNA技术，包括本领域技术人员熟知的标准的实验室技术，在权威性参考文献如Sambrook et al(1989)中已有描述。一般来说，包括DNA连接酶，DNA聚合酶，限制性内切核酸酶等的酶促反应，可根据制造商的说明书进行。5.制备GHTP和GLTP cDNA

通过逆转录从分离出的马铃薯块茎mRNA制备cDNA。使引物对此mRNA退火，形成可借助于逆转录酶用于延伸的游离的3′末端。当被与mRNA模板配对的互补碱基定向时，此酶可参与通常的5′-3′延伸，形成杂交分子，此杂交分子是由模板RNA链与互补的cDNA链碱基配对组成。在原来的mRNA降解之后，DNA聚合酶被用于合成互补的DNA链，以便将此单链cDNA转化成为双链DNA。

在DNA扩增之后，可将此双链cDNA插入一个载体，用于在E.Coli中进行增殖。一般来说，如果使用了表达载体，可通过核酸杂交，或对所编码蛋白的免疫检测，对带有所需cDNA的克隆进行鉴定。在此例证性情况下，问题被简化了，其中，如适合的引物序列一样，GLTP和GHTP基因的DNA序列是已知的(Brisson et al.，1990；Fukui et al.，1991)。所用的引物在GLTP和GHTP基因内杂交了。因此，不需要进一步分析就可以预计，所制备的扩增cDNA是GLTP和GHTP基因的一部分。可通过颜色选择对以携带磷酸化酶DNA插入片段的PUC 19质粒转化的E.Coli进行鉴别。以不携带插入片段的质粒转化的适当E.Coli菌株，生长呈兰色菌落。以携带插入片段的pBluescript质粒转化的菌株生长呈白色菌落。对从转化的E.Coli分离出的质粒进行测序，以便证实此磷酸化酶插入片段的序列。6.载体构建

可将所制备的cDNA按反义或有义取向插入表达载体中的表达盒，用于转化马铃薯植株，抑制马铃薯块茎中GLTP和/或GHTP基因的表达。

在涉及反义抑制的本例证性情况下，所需的重组载体将包含为启动植株中反义cDNA转录而设计的表达盒。包括一些额外序列以使载体能在细菌或噬菌体宿主中被克隆。

载体可优选地包含具有广泛宿主范围的原核生物复制起点。还应该包含一个可选择性标记，以便能选择具有所需构建物的细菌细胞。适合的原核生物选择性标记包括对抗菌素如氨苄青霉素的抗性。

如本领域专业人员所知，在载体内还可能存在编码辅助功能的其它DNA序列。例如，在土壤杆菌转化的情况之下，还应包含为随后转移至植物染色体的T-DNA序列。

为了在植物中表达，除了所需的序列之外，此重组表达盒还应包含植物启动子区，转录起始位点(如果待转录的序列缺少它)，以及转录终止序列。在此盒的5′和3′末端，通常还包括独特的限制性酶切位点，使之易插入预先存在的载体。控制真核生物基因表达的序列对本领域专业人员也是熟知的。

将DNA转录成为mRNA是由被称为启动子的DNA区调控。启动子区含有提供RNA聚合酶与DNA关联的信号的碱基序列，并启动mRNA转录，用一条DNA链作模板，形成相应的互补RNA链。启动子序列成分包括TATA盒共有序列(TATAAT)，它通常是转录起始位点上游(按照常规是相对转录起始位点的-30--20bp)的20-30个碱基对(bp)。在绝大多数情况下，为了精确的转录启动需要TATA盒。TATA盒是相对于起始位点具有较固定定位的唯一的上游启动子成分。

CAAT盒共有序列集中在-75，但是可在显著不同于起始点的距离内发挥功能，并可在二个方向发挥功能。

另一种通用启动子成分是在-90包含共有序列GGGCGG的GC盒，它可能以多拷贝和双取向的形式存在。

在启动子区还可能发现赋予组织特异性，对环境信号起反应的、或使转录最大有效的其它序列。这些序列常常发现在转录起始区的400bp内，但是可能延伸远至2000bp或更多。在异源性启动子/结构基因组合中，启动子优选地定位在距异源性转录起始位点大约相同的距离，与它在天然的定位中距转录起始位点一样的位置。但是，此距离可以有某些改变而不丧失启动子的功能。

用于此表达盒的特定启动子对本发明不是关键性的。在植物细胞中指导转录的许多启动子中的任何一种都适合的。此启动子可以是组成型的或者是诱导型的。

在文献中已描述了多种在植物细胞中有活性的启动子。它们包括胭脂碱合成酶(NOS)和章鱼碱合成酶(OCS)启动子(它们被携带在根瘤土壤杆菌的诱导肿瘤的质粒中)，花椰菜花叶病毒属启动子如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S和35S，及玄参花叶病毒35S启动子，来源于核酮糖-1，5-二-磷酸羧化酶小亚单位(ssRUBISCO，一种含量非常丰富的植物多肽)的光诱导性启动子，以及叶绿素a/b结合蛋白基因启动子等。所有这些启动子都已用于构成各种类型的DNA构建体，并在植物中进行了表达，参见例如PCT WO 8402913。

在此用于实施例中的CaMV 35S启动子，已在绝大多数组织中显示出高度活性，并进行了组成型表达(Bevan et al.，1986)。已知存在其它许多具有块茎特异性或加强表达的基因，包括马铃薯块茎ADPGPP基因的大和小亚单位(Muller et al.，1990)。预期在本发明中有用的其它一些启动子包括，那些在马铃薯块茎中显示增强或特异性表达的启动子，通常情况下与淀粉生物合成或修饰酶基因的表达有关的启动子，或者是那些显示出不同表达模式的启动子，例如在块茎发育过程中的不同时间表达的启动子。这些启动子的例子包括那些用于如下蛋白质基因的启动子：颗粒连接的和其它淀粉合成酶，分支酶(Blennow et al.，1991；WO 9214827；WO 9211375)，岐化酶(Takaha et al.，1993)，脱支酶，糖化酶，淀粉磷酸化酶(Nakano et al.，1989；Mori et al.，1991)，果胶酯酶(Ebbelaar et al.，1993)，40kD糖蛋白；遍在蛋白质，天冬氨酸蛋白酶抑制剂(Stukerlj et al.，1990)，羧肽酶抑制剂，块茎多酚氧化酶(Shahar et al.，1992，GenBank保存号M 95196和M 95197)，公认的胰蛋白酶抑制剂和其它的块茎cDNA(Stiekeme et al.，1988)，以及糖化酶和Sporemins基因的启动子(Yoshida et al.，1992；Ohta et al.，1991)。

除了启动子序列之外，此表达盒还应包含位于结构基因下游的转录终止区，以便提供有效的终止作用。此终止区可从与启动子序列相同的基因获得，或者也可以从不同的基因获得。在本例证性情况下，使用了胭脂碱合成酶NOS 3′终止子序列(Bevan et al.1983)。

如果由结构基因编码的mRNA将被有效地翻译，通常还要对载体构建体加入聚腺苷酸化序列(Alber and Kawasaki，1982)。据认为聚腺苷酸化对mRNA具有稳定化作用。聚腺苷酸化序列包括但不局限于土壤杆菌章鱼碱合成酶信号(Gielen et al.，1984)或胭脂碱合成酶信号(Depicker et al.，1982)。

此载体一般还应包含一个可选择性标记基因，通过此基因可对培养的转化植物细胞进行鉴别。一般情况下，标记基因编码抗菌素抗性。这些标记包括对G 418，潮霉素，争光霉素，卡那霉素，和庆大霉素的抗性。在本例证性情况下，标记基因赋予对卡那霉素的抗性。在转化植物细胞之后，通过它们在含有特定抗菌素的培养基中生长的能力，可鉴别那些含有此载体的细胞。7.转化植物细胞

虽然在本例证性情况下，马铃薯植株的苗茎外植体是通过以一种根瘤土壤杆菌接种而转化的，此根瘤土壤杆菌携带有连接于二元载体的反义序列，但是也可以采用本领域已知的直接转化技术来转移此重组DNA。此载体可被直接微注射进入植物细胞。另一种方法是，可借助于带有包埋在微粒基质内或在其表面的所需核酸的微小颗粒，通过高速发射穿透作用，将核酸导入植物细胞，还可应用原生质体同脂质包被体如携带有所需DNA的小型细胞，细胞或溶酶体的融合作用。还可以通过电穿孔法将DNA导入植物细胞，其中是在携带有此表达盒的质粒存在下使植物原生质体电穿孔。

不同于直接转化的方法，本例证性情况采取了使用根瘤土壤杆菌的载体转化法。根瘤土壤杆菌是一种革兰氏阴性土壤细菌，它对双子叶植物引起被称为冠瘘的赘生物疾病。瘤的诱导作用是由被称为Ti质粒的瘤诱导性质粒引起的。Ti质粒在感染的植物中定向合成冠瘿碱。冠瘿碱被土壤杆菌用作碳源和/或氮源。

此细菌并不进入植物细胞，但只转移部分被称为T-DNA部分的Ti质粒，此T-DNA可稳定地整合进入植物基因组，在此它表达合成冠瘿碱所需的功能，并转化植物细胞。Ti质粒上T-DNA区外部的Vir(毒力)基因，对转移T-DNA是必须的。但是，Vir区不被转移。实际上，虽然Vir区是T-DNA转移所需要的，但Vir区不需要真的连接于T-DNA，而可能是在单独的质粒上被提供。

T-DNA的瘤诱导性部分可以被断开或被删除，而不丧失其转移和整合功能，以致可产生正常的和健康的转化植物细胞，这种细胞已丧失了肿瘤细胞的所有特性，但仍然保有并能表达T-DNA的某些部分，特别是T-DNA边缘区的某些部分。因此，可用其中已删除了疾病引发性基因的被修饰Ti质粒作载体，用于将本发明的有义和反义基因构建体转移进入马铃薯植株(一般性地可参见Winnecker，1987)。

用土壤杆菌转化植物细胞和再生完整的植株，通常包括与分离的培养原生质体一起共培养土壤杆菌，或者用土壤杆菌转化完整的细胞或组织。在本例证性情况下，是用土壤杆菌转化来源于马铃薯幼苗培植物的茎外植体。

另一种选择是，可用花椰菜花叶病毒(CaMV)作载体将有义或反义DNA导入茄科植物。例如，美国专利号No.4,407,956(Howell，1983，10，4)阐述了以花椰菜花叶病毒DNA作植物载体的用处。8.转化植株细胞的选择和再生

转化之后，必须对携带有反义或有义DNA的转化细胞或植株进行鉴别。一般是应用可选择性标记如抗菌素抗性。在本例证性情况下，是通过使细胞在含有卡那霉素的生长培养基中培养而对转化的植株细胞进行选择。其它的可选择性标记对本领域技术人员也是熟知的。例如，当用土壤杆菌转化植株时，冠瘿碱的存在可用于鉴别转化体。

应用熟知的方法如RNA印迹杂交法，通过检测由插入的DNA所编码的RNA，可确证对此外来DNA的表达。同样，借助于DNA印迹杂交或聚合酶链反应，可对插入的DNA序列本身进行鉴别(一般可参阅Sambrook et al.(1989))。

一般地说，在确定此转化的植物细胞携带有重组DNA之后，可将全部植株再生。在本例证性情况下，是用携带有所需反义DNA和卡那霉素标记基因的根瘤土壤杆菌培养物，接种马铃薯幼苗培养物的茎和叶外植体。在含有卡那霉素的生长培养基上选择转化体。转移至适当的培养基作幼苗诱导之后，将幼苗转移至适合生根的培养基。然后将植株转移至土壤使之强化。将此培养再生的植株移植后，使之在暖房条件下生长至成熟。9.分析转化的块茎中GHTP和GLTP的活性水平

使以来源于GHTP和GLTP基因的反义DNA序列转化的马铃薯植株再生之后，用几种方法对转化的块茎组织进行生化分析。按照Steup(1990)的方法测定了在体外磷酸化反应中α葡聚糖磷酸化酶的活性(表1)。在含糖原的聚丙烯酰胺凝胶上对酶同工型作电泳分离之后，对在合成反应中的酶活性，以及酶蛋白的含量进行了比较(图7)。在与葡萄糖-1-磷酸和淀粉引物共温育之后，借助于对凝胶的碘染色测定了块茎L-型和H-型酶同工型的淀粉合成作用(Steup，1990)。通过将来自相同的未温育原凝胶中的蛋白质印迹在硝酸纤维素膜上，并用对块茎L型和H型葡聚糖磷酸化酶的同工型特异的多克隆抗体作探针，进行了蛋白质印迹分析。借助于HPLC对块茎组织中还原糖(葡萄糖和果糖)的水平作定量分析(表2，3和4)。通过油炸后确定薄片的得分检定了Maillard反应的程度，此反应与块茎中还原糖的浓度成正比(表5和图6)。10.定义

在此和权利要求中使用的术语规定如下：

“大约3个月”，“大约4个月”和“大约6个月”分别意指3个月±2周，4个月±2周，和6个月±2周的一段时间；

“反义取向”意指相对于其天然存在时的取向，被插入表达盒中来源于结构基因的核酸序列，是按倒转的方式取向。当此序列是双链时，按天然存在取向的作为模板的链成为编码链，反之亦然；

块茎“薯片记分”意指对中心切片的马铃薯薄片，在豆油中205°F油炸大约3分钟至起泡为止，然后以Agtron E-15-FP型直读式简易分光光度计(Agtron Inc.1095 Spice Island Drive#100，Sparks Nevada89431)测定的反射读数；

“冷贮存”或“低温贮存”，或者其变化形式，都将意指保持在低于10℃的温度，可通过致冷作用或环境温度达到；

“内源性”当它用于马铃薯植株的α葡聚糖磷酸化酶基因时，将意指在导入携带有来自α葡聚糖磷酸化酶基因DNA序列的表达盒之前，已存在于马铃薯植株基因组中的天然存在的基因；

“表达”是指结构基因的转录和翻译，以致蛋白质被合成；

“异源性序列”或“异源性表达盒”是来源于外来种的序列，或者，如其是来源于相同种，已被修饰基本上不同于其原来的形式；

“改善的冷贮存特征”包括而不局限于薯片记分的改善和在收获时或10℃以下贮存一段时间之后测定的块茎中糖积累降低，以及进一步包括由于在比传统采用的较低温度贮存马铃薯而获得的改善、优点和好处，包括但不局限于，增加马铃薯的贮存时间，通过降低马铃薯呼吸和发芽而增加休眠时间，以及降低发病率。除非通过特殊的测定或试验另有限制，冷贮存特征的改善指的是相对于对照，野生型或未修饰的马铃薯植株的所描述特征差异。

“修饰”或其改变形式，当用于描述马铃薯植株或块茎时，是用于区分已通过如下方法使之不同于其天然存在状态的马铃薯植株或块茎：导入来源于相同或不同种的核苷酸序列，无论按有义或反义取向，也无论是通过重组DNA技术或借助于传统的杂交育种法，包括导入修饰的结构性序列或调控序列；通过位点定向诱变作用修饰天然的核酸序列或相反情况；或者用化学剂或蛋白质抑制剂处理马铃薯植株。“未修饰的”马铃薯植株或块茎意指未经上述修饰的对照，野生型或天然存在的马铃薯植株或块茎；

“核酸序列”或“核酸区段”指的是从5′末端至3′末端解读的单链或双链脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的多聚体。它包括自我复制的质粒，感染性DNA或RNA多聚体，以及非功能性DNA或RNA；

“有效地连接”是指启动子和第二个序列之间的功能性连接，其中，启动子序列可启动相应于第二序列的RNA转录；

“植株”包括整株植物，植物器官(例如叶，茎，根等)，幼苗和植物细胞；

“启动子”是指结构基因上游的DNA区，此区与对启动转录的RNA聚合酶和其它蛋白质的识别和连接有关。“植物启动子”是能够在植物细胞中启动转录的启动子；

“降低的活性”或其改变形式，当用于马铃薯块茎中GLTP或GHTP酶活性时，包括如下情况引起的GLTP或GHTP酶活性降低：GLTP或GHTP基因产物的表达降低，GLTP或GHTP酶的底物亲和性降低，以及GLTP或GHTP酶的催化活性降低；

“降低”或其改变形式，在此可用于，而不局限于马铃薯块茎中GLTP或GHTP酶的活性水平，马铃薯块茎中糖的积累，以及油炸时马铃薯薄片的变黑。除非通过特殊的测定或试验另有限制，降低的水平或降低的活性指的是所描述的特征相对于对照，野生型或未修饰的马铃薯植株的特征有可证明的统计学显著性差异；

“胁迫”或其改变形式，当用于关系到马铃薯植株和块茎经历的胁迫时，包括影响植株或块茎品质的环境，肥料，湿度，温度，处理，疾病，大气和老化的作用，并且在马铃薯植株生命循环的所有阶段，在马铃薯块茎生长发育循环的所有阶段，以及在随后的收获，运输，贮存和加工过程中都可能经历的作用；

“胁迫抗性”或其改变形式将意指温度，老化，疾病，大气，物理处理，湿度，化学残留，环境，虫害和其它胁迫的影响降低了；

“适合的宿主”指的是可与重组的质粒，DNA序列或重组的表达盒共存的微生物或细胞，并且将允许此质粒复制，掺入其基因组，或进行表达；

“未断裂的”指的是包含缺少间插，未翻译序列的开放读框的DNA序列(例如cDNA)。

实施例1

此实施例描述，通过以包含特定DNA序列的表达盒转化马铃薯植株来降低马铃薯植株块茎中GHTP和/或GLTP的活性，此DNA序列是来自以反义取向连接于启动子的GLTP和GHTP基因序列。A分离马铃薯块茎mRNA

在液氮下用研钵和研杵将1克块茎组织研磨成细粉，然后用高压灭菌的试剂在4℃下从其中精制马铃薯总RNA。将此细粉转移至30ml的Corex管内，加入3倍体积的100mM Tris-Cl，pH8.0，100mMNaCl，和10mM EDTA(10×TNE)，其中含有0.2％(w/v)SDS和0.5％(v/v)2-巯基乙醇。加入等体积苯酚-氯仿(1∶1)，缓慢旋转搅拌样品，然后在4℃用SS34转子以8000rpm转速离心5分钟。有机相用0.5体积含0.2％(w/v)SDS和0.5％(v/v)2-巯基乙醇的10×TNE再提取，合并水相，用氯仿提取。用乙酸钠和无水乙醇从水相中沉淀出核酸，离心收集沉淀并再悬浮于3ml 1×TNE中。加入等体积5M LiCl，将样品在-20℃放置4小时，然后在SS 34转子内，以8000rpm的转速在4℃离心10分钟。用70％乙醇洗此RNA沉淀、干燥后再悬浮于DEPC处理的水中。

应用寡脱氧胸苷酸纤维素(Boehringer Mannheim)柱层析分离出聚(A⁺)RNA(Poly(A⁺)RNA)。从再悬浮于无RNAse水中的总RNA分离出了Poly(A⁺)RNA。柱制备法是用高压灭菌的10ml Bio-Rad Poly-Prep柱，加入50mg悬浮于1ml加样缓冲液B中的寡脱氧胸苷酸(oligo(dT))纤维素，此加样缓冲液B含有20mM Tris-Cl，pH7.4，0.1M NaCl，1mM EDTA和0.1％(w/v)SDS。先用3倍体积含有5mM EDTA的0.1M NaOH洗柱，然后用DEPC处理的水洗柱，直至用pH试纸检测时流出液的pH小于8为止。然后用5倍体积含有40mM Tric-Cl，pH7.4，1M NaCl，1mM EDTA和0.1％(w/v)SDS的加样缓冲液A洗柱。

将RNA样品加热至65℃持续5分钟，在此时间内，加入预热至65℃的加样缓冲液A 400μl。混匀样品，在室温下冷却2分钟。然后对柱加样。收集洗脱液，加热至65℃持续5分钟，冷却至室温2分钟，再对柱加样。随后用5倍体积的加样缓冲液A洗脱，再用4倍体积加样缓冲液B洗脱。用3倍体积的10mM Tris-Cl，pH7.4，1mM EDTA，和0.05％(w/v)SDS洗脱出Poly(A⁺)RNA。收集各组分，对含有RNA的组分用溴化乙啶试验板鉴定，这是一种用含有EtBr的TAE制成的有1％琼脂糖的培养皿。使RNA沉淀，再悬浮成10μl，取1μl用分光光度计作定量分析。B分离GLTP和GHTP DNA序列

用于形成反义构建体的核苷酸序列随机地选自GLTP(SEQ IDNO：1)和GHTP(SEQ ID NO：3)的5′序列。应用逆转录-聚合酶链反应获得了用于形成反义构建体的DNA序列。根据已发表的序列(Brisson et al.，1990，Fukui et al.1991)进行较小的修饰以便于酶限制性内切，设计了GLTP(SPL1和SPL2)-和GHTP(SPH1和SPH2)特异性引物：SPL1引物：5′ATTCGAAAAGCTCGAGATTTGCATAGA 3′(SEQID NO：7)(补充的CG构成XhoI位点)；SPL2引物：5′GTGTGCTCTCGAGCATTGAAAGC 3′(SEQ IDNO：8)(将C改变为G构成XhoI位点)；SPH1引物：5′GTTTATTTTCCATCGATGGAAGGTGGTG 3′(SEQID NO：9)(加入CGAT构成ClaI位点)；SPH2引物：5′ATAATATCCTGAATCGATGCACTGC 3′(SEQ IDNO：10)(将G改变为T构成ClaI位点)。

在15μl的体积内进行逆转录，其中含有1×PCR缓冲液(10mMTris-Cl pH8.2，50mM KCl，0.001％明胶，1.5mM MgCl₂)，670μl各种dNTP，6μg马铃薯块茎cv.Russet Burbank RNA，1mM每种引物(SPH1和SPL2，或SPH1和SPH2)，以及200 U Maloney鼠白血病病毒逆转录酶(BRL)。此反应在37℃进行30分钟，然后在94℃热灭活5分钟，再在冰上快速冷却。对此逆转录反应物加入在35μl1×PCR缓冲液中的2.5 U Taq DNA聚合酶(BRL)。在PerkinElmer 480中进行DNA扩增，编程30个循环，1分钟的94℃变性步骤，1分钟的56℃(SPL1和SPL2)或58℃(SPH1和SPH2)退火步骤，以及2分钟的72℃延伸步骤。以最后10分钟72℃延伸完成PCR。C构建用于磷酸化酶抑制作用的SP载体

为了在植物细胞中表达反义构建体，有必要使此基因与适合的植物调节区融合。可通过将此反义DNA克隆进入含有所需序列的质粒载体来实现这种融合。

使扩增的DNA形成平端，并被克隆进入pUC19载体的SmaI位点。将此重组质粒转化进入有效亚克隆的E.Coli DH 5α细胞(BRL)。将此转化的细胞接种在含氨苄青霉素100μg/ml的LB(15g/LBactotptone，5g/L酵母浸膏，10g/L NaCl，pH7.3，以1.5％琼脂固化)平板上。应用颜色选择法，对包含带有插入植物磷酸化酶序列的质粒的细菌进行了选择。在LacZ基因片段的N-端部分存在多接头及T3和T7 RNA聚合酶启动子序列。在多接头没有插入片段的pUC19质粒，在适当的菌株如DH 5α内生长呈兰色菌落。通过在接种转化体之前30分钟，将100μl 2％X-gal(在二甲基甲酰胺中配制的)分散在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB平板上制备颜色选择平板。在37℃培育12-18小时之后，包含没有插入片段质粒的菌落呈兰色，而带有会插入片段质粒的菌落仍然呈白色。对分离的质粒测序证实了磷酸化酶插入片段的序列。用ABI Prism染色终止了循环测序核心试剂盒(AppliedBiosystems，foster City，CA)，M13通用和反引物，以及ABI自动DNA测序仪，进行序列测定。通过从5ml过夜的培养物进行快速碱提取程序，对此工程质粒进行了纯化(Bimboim and Doly，1979)。通过限制性酶切消化确定了pUC19中SPL和SPH片段的取向。对重组pUC19载体和二元载体pBI121(Clonetech)作限制性酶切，进行琼脂糖凝胶电泳，并通过凝胶分离纯化各片段，如Thuring et al(1975)所描述。

通过连接反应将此反义序列融合于二元载体pBI121。此连接体含有已被BamHI和SacI消化的pBI121载体，以及已用BamHI和SacI从pUC19亚克隆切开的SPL或SPH磷酸化酶DNA产物。使连接的DNA转化进入SCE E.Coli DH 5α细胞，并将此转化细胞接种在含氨苄青霉素的LB平板上。反义DNA SPL和SPH的核苷酸序列分别是SEQ IDNO：1的核苷酸338-993，以及SEQ ID NO：3的核苷酸147-799。以CAMV和NOS特异性引物对带有磷酸化酶插入片段的pBI 121进行选择。

培养过夜之后，从平板上挑选出了代表块茎L-型和块茎H-型磷酸化酶DNA片段的样品1和样品2。将这些样品接种进入5ml LB培养基中，37℃培养过夜。通过快速碱提取程序分离出质粒，其DNA被电穿孔转化进入根瘤土壤杆菌。

通过基因工程，使含有CaMV 35S启动子(Kay et al.1987)和NOS3′终止子(Bevan et al.1983)序列的构建体构建进入pBI121载体。此pBI121质粒是由如下明确鉴定的DNA区段组成。从转座子Tn7中从离出的0.93kb片段，它编码细菌的壮观霉素/链霉素(Spc/Str)抗性，并且是在E.Coli和根瘤土壤杆菌中进行选择的决定因子(Fling et al.1985)。将此片段连接于为植物表达构建的嵌合的卡那霉素抗性基因，使之能够对转化的组织进行选择。此嵌合基因是由0.35kb的花椰菜花叶病毒35S启动子(P-35S)(Odell et al.，1985)，0.83kb的新霉素磷酸转移酶II型基因(NPTH)，以及0.26kb的胭脂碱合成酶基因的3′非翻译区(NOS 3′)(Fraley et al.，1983)组成。另一个区段是来自RK2质粒的0.75kb的复制起点(ori-V)(Stalker et al.，1981)。此区段连接于pBR 322的3.1kb的SalI-PvuI区段，它提供保持在E.Coli中的复制起点(ori-322)以及用于在根瘤土壤杆菌细胞中接合转移的bom位点。再一个区段是来自pTiT37质粒的0.36kbPvuI片段，它包含胭脂碱型T-DNA的右边缘区(Fraley et al.，1985)。通过使其基因置于组成型组织非特异性启动子的控制之下，此反义序列被构建在块茎中进行表达。D植株的转化/再生

按照Block(1988)的方法，使SPL和SPH载体转化进入Desiree马铃薯栽培种。为了转化“Desiree”马铃薯，将“Desiree”的无菌幼苗培养物保存在试管内，其中含有8ml S1(以2％蔗糖和0.5g/L MESpH5.7补充的，以6g/L Phytagar固化的Murashige和Skoog(MS)培养基)。当小植株达到大约5cm长度时，用单面刀片沿基部切下叶片，并以1∶10稀释的培养过夜的根瘤土壤杆菌接种叶片。在S1培养基上，20℃共培养外植体2天(De Block，1988)。共培养之后，将此外植体转移至S4培养基培养1周，然后再培养2周诱发愈伤组织形成(S4培养基是没有蔗糖，以0.5g/L MFS pH5.7，200mg/L谷氨酰胺，0.5g/L PVP，20g/L甘露糖醇，20g/L葡萄糖，40mg/L腺嘌呤，1mg/L反式玉米素，0.1mg/L NAA，1g/L羧苄青霉素，50mg/L卡那霉素补充的，以6g/L phytagar固化的MS培养基)。

3周之后，将外植体转移至S6培养基(没有NAA和具有一半羧苄青霉素浓度(500mg/L)的S4培养基)。再过2周之后，将此外植体转移至S8培养基(只含有250mg/L羧苄青霉素和0.01mg/L赤霉酸，GA3的S6培养基)，促进幼苗形成。转移至S8苗诱导培养基后约2周幼苗开始形成。切取这些幼苗，转移至S1培养基的小瓶内生根。在生根培养基上繁殖约6周之后，将此植株转移至土壤，使之逐渐变强壮。

将在培养中再生的Desiree植株移植至1加仑容量的花盆中，在温室条件下生长至成熟。收获块茎，使其在室温下栓化二天。收集长度大于2cm的所有块茎，在4℃高湿度下贮存。E田间试验

将未转化的对照，表达SPL构建体的植株，以及表达SPH构建体的植株，按单重复随机化设计在田间试验中繁殖。使所有的植株在同一田间并排生长，接受相似的农药，肥料和灌溉安排。收获块茎，先在10℃贮存2周，然后从每个品系随机选择部分块茎置于4℃贮存。F糖分析

将块茎贮存于4℃，不允许其在室温下恢复就立即进行糖分析测定。从每个块茎的中心部分切取完整的纵向切片(1cm厚，宽度可变，相当于块茎的外径)，这代表所有的块茎组织，每次收获时，将来自每个克隆(3个重复样品)的4个块茎的中心块共同切成1cm的小立方体，从此合并的组织随机选择15g用于分析。用polytron匀浆器，在4℃下以含有2mM硫酸氢钠，2mM EDTA，0.5mM PMSF和10％(w/w)甘油的15ml Tris缓冲液(50mM，pH7.0)提取葡聚糖磷酸化酶(见下面)和糖类。将提取液在4℃离心(30000g，30分钟)，然后将上清液稀释10倍，用装有折光指数检测器的Spectra Physics高效液相层析仪测定还原糖(葡萄糖和蔗糖)。在80℃下，在30×0.78cm的Aminex HPX 87C柱(Biorad)上，用0.6ml/分钟流速的水作流动相进行分离。借助于标准d-葡萄糖和d-蔗糖对仪器进行校准。Gα葡聚糖磷酸化酶活性分析

对贮存于4℃的块茎，不使其温暖就立即进行提取和α葡聚糖磷酸化酶活性和同功酶分析。按Steup(1990)所述的方法，测定葡聚糖磷酸化酶在体外磷酸化反应中的活性。简单地说，是将所获得用于糖分析的提取物样品加到一种反应基质中，这种反应基质通过葡糖磷酸变位酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的连续反应，使淀粉的磷酸化作用与NADP的还原作用相偶联。此反应过程中NADP的还原速率与从淀粉基质葡萄糖-1-磷酸产生的速率具有理想的化学计量配比。用Varian Cary双光束分光光度计在340nm对NADP的还原作用进行了监测。按照Bredford(1976)的方法测定了提取物中的蛋白质的水平。

基本上按照Steup(1990)的方法，进行了葡聚糖磷酸化酶活性的凝胶展开。在含有1.5％糖原的天然聚丙烯酰胺凝胶(8.5％)上蛋白质被分开了。在80V电泳15小时(4℃)之后，将凝胶在37℃在含有20mM葡萄糖-1-磷酸和0.05％(w/v)水解马铃薯淀粉的0.1M柠檬酸-NaOH缓冲液(pH6.0)中温育(1-2小时)。然后漂洗凝胶，以碘溶液染色。为了蛋白质印迹分析，如上所述使蛋白质在含糖原的聚丙烯酰胺凝胶上电泳。将蛋白质电印迹至硝酸纤维素膜，以针对GHTP和GLTP产生的多克隆抗体对印迹进行探测。与偶联于抗兔第二抗体的碱性磷酸酶(Sigma)形成免疫印迹。H薯片颜色测定

将5个表达GLTP反义序列的转基因马铃薯品系，2个表达GHTP反义序列的转基因品系，非转基因Desiree对照品系，以及2个以pBI121载体T-DNA转化的对照品系，在加拿大Alberta的田间条件下培植生长。块茎收获后贮存在10℃和4℃。通过对每个品质的样品作中心切片，在豆油中205°F油炸约3分钟直至起泡为止，对所有马铃薯品系的薯片颜色进行了测定。I结果

从相同的栽培种(Desiree)，相同的年龄，以及在同样生长条件下并排生长的植株收获了所有的块茎。块茎的RNA印迹分析显示出在表达同源反义转录的转基因植株中，内源性GLTP转录有相当大的降低(图5)。葡聚糖磷酸化酶测定显示，对于表达GLTp反义DNA的转基因植株，在收获时，以及在收获后至少6个月，其活性(μmol NADPH/mg蛋白质/小时)降低了(表1)。制成表1的结果表明，相对于野生型对照株，对于各种转化的马铃薯品种，在4℃贮存了189天的块茎中，α葡聚糖磷酸化酶的活性降低了大约16％-70％。活性凝胶电泳和蛋白质印迹分析显示出同源性酶特别低的表达，以及异源性酶降低较少的表达(图8)。对于同源性产物的这种特异性，可能是由于磷酸化酶间的差异引起的(图3和4)。

对收获时(0天)的块茎分析表明，与对照块茎相比较，那些表达反义GLTP转录物的块茎具有低达1/5的还原糖(表2)。而且，4℃贮存91天后，与野生型对照株相比较，转化的块茎降低了28-39％的还原糖浓度。在表达反义GLTP转录物的块茎中，葡萄糖和果糖的浓度都显著降低了(表3和4)。这些结果暗示，降低的GLTP活性减慢了块茎中淀粉变成还原性糖的分解代谢过程，而对照块茎中糖在持续地积累。总磷酸化酶活性和还原性糖之间的这种相互关系不是直接的，这表明在淀粉的分解代谢过程中某些磷酸化酶的同功酶可能起较重要的作用；与其它方式相比，降低表达特定磷酸化酶同功酶的特异性水平可能是比较最有利的方式；以及/或者可能还存在未发现的与还原糖水平降低有关的相互作用。

表达反义GLTP或GHTP转录物的转基因马铃薯植株已在田间条件下种植，并且它们的块茎贮存在4℃。在冷贮存之前以及冷贮存86和124天之后，测定了与糖含量相关的薯片颜色。相对于在同样条件下贮存的对照块茎薯片颜色(较暗)，来自表达反义GLTP转染物的所有转基因植株块茎的薯片颜色有显著的改善(较浅)(表5和图7)。在分别在10℃和4℃贮存86天后，当用Agtron E-15-FP型直读式简易分光光度计(Agtron Inc.1095 Spice Island Drive #100，Sparks Nevada89431)测定时，来自表达GLTP转录物的“Desiree”马铃薯植株块茎的薯片记分改善了至少4.3个点和8.9个点。相对于野生型，4℃贮存124天后测定的GLTP转化体薯片记分改善了44％-89％(表5)。

Desiree栽培种不是用于薯片的商业上所希望的马铃薯，由它具有高含量天然糖类，并且在冷贮存中倾向于迅速变甜。然而，使用转化的“Desiree”马铃薯，发现油炸薯片颜色有显著的改善。可以预料，如果将本发明的方法用于商业加工的马铃薯品种，将可获得优等浅色的薯片。

对贮存于10℃和4℃的块茎分析表明，那些表达反义GHTP转录物的块茎，有时可提供比对照块茎颜色浅的油炸薯片，指示有较低的还原糖积累(表5)。显示异源性和同源性磷酸化酶活性降低的结果(图8)指示，这种改善可能是一种或二种磷酸化酶活性降低的结果。但是，这些结果暗示，在淀粉变成还原糖的分解代谢中，L-型磷酸化酶起重要的作用。

进而这些结果还表明，在野生型植株块茎和表达块茎磷酸化酶反义RNA的块茎之间，还原糖水平(表2)和薯片记分(表5)的差异，在长时间贮存过程中是持久的。如在表5中所示，在86天和124天薯片记分大致相同。在4℃贮存49天和91天之后，还原糖浓度也未见进一步明显增加(表2)。糖浓度的这种平均状态可能与块茎磷酸化酶的动力学有关。这种保持较低糖水平的能力，有可能使贮存期延长至少几个月。目前，待加工的马铃薯在10℃-12℃通常最多只能贮存3-6个月，其后糖积累将达到降低品质的水平。必须进口新鲜的产品，直至可得到马铃薯的季节。延长马铃薯贮存期数月，可减少进口费用。

表6给出了一个改善百分数的概括结果，显示相对于未转化的对照植株，以来自GLTP基因序列(ATL3-ATL9)，和GHTP基因序列(ATH1，和TH2)的反义DNA转化的马铃薯植株的块茎，其各种改善的块茎冷贮存特征的改善百分数。从概括于表6中的结果表明，通过本发明的方法，可恒定地获得块茎冷贮存特征的重大改善。特别值得注意的是，贮存于4℃大约4个月(124天)之后观察到的优于野生型的薯片记分百分数改善。观察到相对于野生型的薯片记分相对改善达到89％。改善的薯片记分反映出本发明的商业利用价值。也就是说，通过降低冷诱发的甜化，块茎可贮存于较冷的温度下，不会引起马铃薯油炸产品令人难以接受的变黑。

在收获时和贮存91天之后，相对于野生型转化的马铃薯品系糖积累减少，也证明本发明有显著的优点。糖积累降低与观察到的薯片记分改善有关，并且还反映块茎比重的改善，这是块茎品质的另一个重要的测定指标。

相对于野生型，转化的品系即使在收获时也观察到薯片记分和糖积累降低的重大改善。因此，本发明的好处不局限于仅仅延长冷贮存时间之后产生的改善，并且包括收获时出现的改善。在此意义上，本发明不仅仅局限于冷贮存特征的改善，并且包括块茎品质特征的改善，在收获时的薯片记分或糖积累，造成成熟较早。

再回到表6中概括的特定改善，可以看到，相对于野生型，在收获时，以及贮存91天和189天之后，GLTP型转化体(ATL3-ATL9)的α葡聚糖磷酸化酶活性分别显示出达66％，70％和69％的降低。相对于野生型在收获时以及贮存91天和189天之后，绝大多数也显示出超过10％和30％的改善。在贮存91天和189天之后，相对于野生型，GHTP-型转化体(ATH1和ATH2)分别显示出达28％和39％的相对改善，一般表现出至少10％的改善。

在收获时和91天后，相对于野生型，GLTP-型转化体分别显示出达80％和39％的糖积累降低。在收获时，所有的GLTP-型转化体显示出至少10％和至少30％的相对改善。在91天，所有的GLTP型转化体显示出至少10％的相对改善，绝大多数显示出至少30％的相对改善。

在收获时以及贮存86天和124天之后，相对于野生型，GLTP-型转化体分别显出达46％，89％，和89％的薯片记分改善。在收获时以有贮存86天和124天之后，几乎全都显示出至少10％和30％的相对改善。在收获时以及贮存86天和124天之后，相对于野生型，至少一个GHTP-型转化体显示出至少5％和至少10％的改善。贮存124天之后，至少一个GHTP-型转化体显示出达25％的薯片记分相对改善。

这些结果清楚地证明，通过本发明的方法，可容易地获得块茎冷贮存特征的重大改善。结果会有变，这是由于特别是重组的反义或有义DNA在植物基因组中插入的位置和存在的插入片段数目不同。重要的是，尽管在不同的转化品系中间，其结果存在易变性，但是在单一马铃薯转化品系中样品间的结果几乎没有改变(见表1-5的附注)。对于所有用GHTP或GLTP反义DNA成功地转化的马铃薯植株品系，其结果显示在表6中。因此，所有的转化体都显示出一个或几个冷贮存特征的至少某些改善，如薯片记分增加(烹调后颜色较淡)和糖积累降低，并且大多数显示出非常显著的改善。根据在此实施例中所见到的大部分阳性转化体，可以预料，应用本实施例中所述冷贮存特征测定程序，可容易地筛选出通过本发明方法转化的马铃薯植株，以便鉴别表现有冷贮存特征显著改善的转化品系。通过将在此公开的技术用于商业重要性的马铃薯品种，将可能容易地产生和选择出具有冷贮存特征显著改善的转化体。那些显示出优于野生型对照的最大相对改善的转化体，可用于发展新的商用马铃薯品种。

表1

反义转录物对葡聚糖磷酸化酶活性的影响，对从田间

生长的“Desiree”块茎的酶提取物测定结果。

葡聚糖磷酸酶活性

在4℃贮存的时间(天)克隆 0 49 91 140 189

μmol NADPH/mg蛋白质/小时Wt^a 10.50 11.83 9.94 11.90 13.04ATL3 4.90 4.86 4.49 4.73 4.88ATL4 11.45 7.17 8.09 11.32 10.99ATL5 3.58 3.56 2.97 4.59 4.79ATL9 3.59 3.88 3.84 4.72 3.98LSD_0.05 ^b 1.97 2.94 1.59 2.34 2.58LSD_0.01 2.87 4.28 2.31 3.41 3.75克隆^c 0.01^dWT vs.ATL′s 0.01天数 NS克隆×天数 0.05WT 11.49 8.90 12.66 13.66ATH-1 10.40 9.69 10.79 10.10ATH-2 6.46 6.40 6.56 8.38LSD_0.05 ^b 2.02 0.41 3.00 NSLSD_0.01 4.78 0.95 NS NS克隆^c 0.01WT vs.ATL′s 0.01天数 0.05克隆×天数 NS^aWT，未转化的野生型块茎。^bLSD，对每种贮存时间在0.05或0.01水平的最小显著性差异。^c因子分析中变异的来源。^d指示变异来源的显著性水平。

表2

反义GLTP转录物对田间生长的Desiree

块茎低温诱导的甜化的影响

还原性糖(葡萄糖+蔗糖)

在4℃贮存的时间(天)克隆 0 49 91

mg/g湿重Wt^a 5.63 31.8 28.0ATL3 1.88 17.3 17.3ATL4 1.11 14.3 20.1ATL5 1.51 18.3 17.0ATL9 1.36 17.3 18.5WT vs.ATL′s^b 0.01 0.01 0.05克隆^c 0.01^d天数 0.01克隆×天数 NS^aWT，未转化的野生型块茎。^bLSD，对每种贮存时间在0.05或0.01水平的最小显著性差异。^c因子分析中变异的来源。^d指示变异来源的显著性水平。

表3

反义GLTP转录物对田间生长的Desiree

块茎低温诱导的果糖积累的影响

果糖

在4℃贮存时间(天)克隆 0 49 91

mg/g湿重Wt^a 5.53 15.10 12.20ATL3 1.21 8.40 8.79ATL4 0.79 7.22 8.56ATL5 0.61 10.00 8.09ATL9 0.54 8.38 8.72WT vs.ATL′s^b 0.01 0.01 NS克隆^c 0.01^d天数 0.01克隆×天数 NS^aWT，未转化的野生型块茎。^b在每个贮存期间对ANOVA的垂直比较。^c因子分析中变异的来源。^d指示变异来源的显著性水平。

表4

反义GLTP转录物对田间生长的“Desiree”

块茎低温诱导的葡萄糖积累的影响

葡萄糖

在4℃贮存的时间(天)克隆 0 49 91

mg/g湿重Wt^a 2.10 16.60 15.90ATL3 0.68 8.94 8.49ATL4 0.32 7.07 11.06ATL5 1.05 8.33 8.91ATL9 0.83 8.87 9.78WT vs.ATL′s^b 0.01 0.01 0.05克隆^c 0.01^d天数 0.01克隆×天数 NS^aWT，未转化的野生型块茎。^b在每个贮存期间对ANOVA的垂直比较。^c因子分析中变异的来源。^d指示变异来源的显著性水平。

表5田间生长的“Desiree”块茎薯片平均颜色。为了测定油炸马铃薯片的颜色，使用类似于工业用的Agtron计进行薯片颜色分级测定。在此读数中，数值越大薯片产品颜色越浅，但颜色与读数不呈直线关系。

收获 86天 86天 124天

10C 4C 4CWt^a 26 25.3 15.4 17.1ATL3^c 25 37.4 26.7 30.8ATL4 35 43.7 29.1 32.3ATL5 36 29.6 24.7 24.6ATL9 38 38.7 24.3 26.6ATH1^d 26 49.7 17.5 21.4ATH2 29 31.2 15.6 15.9GMP1^e 31 15.7 15.7GMP2 35 16.7 16.6

^aAgtron Inc.1095 Spice Island Drive#100，Sparks Nevada 89431。Agtron model E-15-EP型(直读式简易分光光度计)。以双光谱模式在红外和绿光附近测定反射率。结果是6-8个薯片的测定值。薯片来自3个直径约3-4cm的随机选择的块茎。

^bWT，阴性对照，野生型未转化的块茎。

^cATL，用块茎L-型α葡聚糖磷酸化酶转化的块茎。

^dATH，用块茎H-型α葡聚糖磷酸化酶转化的块茎。

^eGMP，阴性对照，用pBI121 T-DNA转化的块茎。

表6

结果摘要

样品	相对于野生型α葡聚糖磷酸化酶活性降低的百分数收获时 91 189天后天后			相对于野生型糖积累降低的百分数收获时 91天后		相对于野生型薯片记分改善的百分数收获时 86 124天后天后
样品	相对于野生型α葡聚糖磷酸化酶活性降低的百分数收获时 91 189天后天后			相对于野生型糖积累降低的百分数收获时 91天后		相对于野生型薯片记分改善的百分数收获时 86 124天后天后			ATL3	53	55	63	67	38	-4	73	80
ATL4	-9	19	16	80	28	35	89	89	ATL3	53	55	63	67	38	-4	73	80
ATL4	-9	19	16	80	28	35	89	89	ATL5	66	70	63	73	39	38	60	44
ATL9	66	61	69	76	34	46	58	56	ATL5	66	70	63	73	39	38	60	44
ATL9	66	61	69	76	34	46	58	56	ATH1	n/a	-9	26	n/a	n/a	0	14	25
ATH2	n/a	28	39	n/a	n/a	12	1	-7	ATH1	n/a	-9	26	n/a	n/a	0	14	25

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Winnacker，Ernst L.(1987)从基因到克隆VCHVerlagsgesellschaft mbH.联邦德国

Yoshida et al.(1992)Geneg 10：255-259。

在此详述中所提到的所有文献都显示出本发明涉及的本领域技术水平。正如每篇单独的文献被特别地单独指明作为参考一样，在此将所有的文献引入作为参考。

虽然上述发明通过以明确理解为目的的说明和实施例，在某种程度上已被详述，但是显然，在所附权利要求的范围内还可以实施某些变化和修改。

序列表(1)一般信息：

(i)申请人：Her Majesty the Queen in Right of Canada as

Represented by the Department of Agriculture

and Agri-Food Canada

(ii)发明名称：具有改善品质特征的马铃薯及其生产方法

(iii)序列数：10

(iv)通讯地址：

(A)地址：Mckay-Carey & Company

(B)街道：2125 Commerce Place，10155-102nd Street

(C)城市：Edmonton

(D)州：Alberta

(E)国家：Canada

(F)邮编：T5J 4G8

(v)计算机可读形式：

(A)媒体类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容机

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30

(vi)目前申请资料：

(A)申请号：WO

(B)申请日期：10-FEB-1998

(C)分类：

(vii)在先申请资料：

(A)申请号：US 60/036,946

(B)申请日期：10-FEB-1997

(vii)在先申请资料：

(A)申请号：US 08/868,786

(B)申请日期：04-JUN-1997

(viii)代理人/事务所信息：

(A)姓名：Mckay-Carey，Mary Jane

(B)注册号：3790

(C)参考/文档号：24002WO0

(ix)电讯信息：

(A)电话：(403)424-0222

(B)电传：(403)421-0834(2)SEQ ID NO：1信息：

(i)序列特征：

(A)长度：3101碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(vi)原始来源：

(A)生物体：Solanum tuberosum

(ix)特征：

(A)名称/要点：CDS

(B)定位：44..2944

(D)其它信息：/产物＝“马铃薯α葡聚糖L-型块茎磷酸

化酶”

(ix)特征：

(A)名称/要点：成熟_肽

(B)定位：194..2941

(ix)特征：

(A)名称/要点：信号_肽

(B)定位：44..193

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：ATCACTCTCA TTCGAAAAGC TAGATTTGCA TAGAGAGCAC AAA ATG GCG ACT GCA 55

Met Ala Thr Ala

-50AAT GGA GCA CAC TTG TTC AAC CAT TAC AGC TCC AAT TCC AGA TTC ATC 103Asn Gly Ala His Leu Phe Asn His Tyr Ser Ser Asn Ser Arg Phe Ile

-45 -40 -35CAT TTC ACT TCT AGA AAC ACA AGC TCC AAA TTG TTC CTT ACC AAA ACC 151His Phe Thr Ser Arg Asn Thr Ser Ser Lys Leu Phe Leu Thr Lys Thr-30 -25 -20 -15TCC CAT TTT CGG AGA CCC AAA CGC TGT TTC CAT GTC AAC AAT ACC TTG 199Ser His Phe Arg Arg Pro Lys Arg Cys Phe His Val Asn Asn Thr Leu

-10 -5 1AGT GAG AAA ATT CAC CAT CCC ATT ACT GAA CAA GGT GGT GAG AGC GAC 247Ser Glu Lys Ile His His Pro Ile Thr Glu Gln Gly Gly Glu Ser Asp

5 l0 15CTG AGT TCT TTT GCT CCT GAT GCC GCA TCT ATT ACC TCA AGT ATC AAA 295Leu Ser Ser Phe Ala Pro Asp Ala Ala Ser Ile Thr Ser Ser Ile Lys

20 25 30TAC CAT GCA GAA TTC ACA CCT GTA TTC TCT CCT GAA AGG TTT GAG CTC 343Tyr His Ala Glu Phe Thr Pro Val Phe Ser Pro Glu Arg Phe Glu Leu35 40 45 50CCT AAG GCA TTC TTT GCA ACA GCT CAA AGT GTT CGT GAT TCG CTC CTT 391Pro Lys Ala Phe Phe Ala Thr Ala Gln Ser Val Arg Asp Ser Leu Leu

55 60 65ATT AAT TGG AAT GCT ACG TAT GAT ATT TAT GAA AAG CTG AAC ATG AAG 439Ile Asn Trp Asn Ala Thr Tyr Asp Ile Tyr Glu Lys Leu Asn Met Lys

70 75 80CAA GCG TAC TAT CTA TCC ATG GAA TTT GTG CAG GGT AGA GCA TTG TTA 487Gln Ala Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu Gln Gly Arg Ala Leu Leu

85 90 95AAT GCA ATT GGT AAT CTG GAG CTT ACT GGT GCA TTT GCG GAA GCT TTG 535Asn Ala Ile Gly Asn Leu Glu Leu Thr Gly Ala Phe Ala Glu Ala Leu

100 105 110AAA AAC CTT GGC CAC AAT CTA GAA AAT GTG GCT TCT CAG GAA CCA GAT 583Lys Asn Leu Gly His Asn Leu Glu Asn Val Ala Ser Gln Glu Pro Asp115 120 125 130GCT GCT CTT GGA AAT GGG GGT TTG GGA CGG CTT GCT TCC TGT TTT CTG 631Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser Cys Phe Leu

135 140 145GAC TCT TTG GCA ACA CTA AAC TAC CCA GCA TGG GGC TAT GGA CTT AGG 679Asp Ser Leu Ala Thr Leu Asn Tyr Pro Ala Trp Gly Tyr Gly Leu Arg

150 155 160TAC AAG TAT GGT TTA TTT AAG CAA CGG ATT ACA AAA GAT GGT CAG GAG 727Tyr Lys Tyr Gly Leu Phe Lys Gln Arg Ile Thr Lys Asp Gly Gln Glu

165 170 175GAG GTG GCT GAA GAT TGG CTT GAA ATT GGC AGT CCA TGG GAA GTT GTG 775Glu Val Ala Glu Asp Trp Leu Glu Ile Gly Ser Pro Trp Glu Val Val

180 185 190AGG AAT GAT GTT TCA TAT CCT ATC AAA TTC TAT GGA AAA GTC TCT ACA 823Arg Asn Asp Val Ser Tyr Pro Ile Lys Phe Tyr Gly Lys Val Ser Thr195 200 205 210GGA TCA GAT GGA AAG AGG TAT TGG ATT GGT GGA GAG GAT ATA AAG GCA 871Gly Ser Asp Gly Lys Arg Tyr Trp Ile Gly Gly Glu Asp Ile Lys Ala

215 220 225GTT GCG TAT GAT GTT CCC ATA CCA GGG TAT AAG ACC AGA ACC ACA ATC 919Val Ala Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr Lys Thr Arg Thr Thr Ile

230 235 240AGC CTT CGA CTG TGG TCT ACA CAG GTT CCA TCA GCG GAT TTT GAT TTA 967Ser Leu Arg Leu Trp Ser Thr Gln Val Pro Ser Ala Asp Phe Asp Leu

245 250 255TCT GCT TTC AAT GCT GGA GAG CAC ACC AAA GCA TGT GAA GCC CAA GCA 1015Ser Ala Phe Asn Ala Gly Glu His Thr Lys Ala Cys Glu Ala Gln Ala

260 265 270AAC GCT GAG AAG ATA TGT TAC ATA CTC TAC CCT GGG GAT GAA TCA GAG 1063Asn Ala Glu Lys Ile Cys Tyr Ile Leu Tyr Pro Gly Asp Glu Ser Glu275 280 285 290GAG GGA AAG ATC CTT CGG TTG AAG CAA CAA TAT ACC TTA TGC TCG GCT 1111Glu Gly Lys Ile Leu Arg Leu Lys Gln Gln Tyr Thr Leu Cys Ser Ala

295 300 305TCT CTC CAA GAT ATT ATT TCT CGA TTT GAG AGG AGA TCA GGT GAT CGT 1159Ser Leu Gln Asp Ile Ile Ser Arg Phe Glu Arg Arg Ser Gly Asp Arg

310 315 320ATT AAG TGG GAA GAG TTT CCT GAA AAA GTT GCT GTG CAG ATG AAT GAC 1207Ile Lys Trp Glu Glu Phe Pro Glu Lys Val Ala Val Gln Met Asn Asp

325 330 335ACT CAC CCT ACA CTT TGT ATC CCT GAG CTG ATG AGA ATA TTG ATA GAT 1255Thr His Pro Thr Leu Cys Ile Pro Glu Leu Met Arg Ile Leu Ile Asp

340 345 350CTG AAG GGC TTG AAT TGG AAT GAA GCT TGG AAT ATT ACT CAA AGA ACT 1303Leu Lys Gly Leu Asn Trp Asn Glu Ala Trp Asn Ile Thr Gln Arg Thr355 360 365 370GTG GCC TAC ACA AAC CAT ACT GTT TTG CCT GAG GCA CTG GAG AAA TGG 1351Val Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu Glu Lys Trp

375 380 385AGT TAT GAA TTG ATG CAG AAA CTC CTT CCC AGA CAT GTC GAA ATC ATT 1399Ser Tyr Glu Leu Met Gln Lys Leu Leu Pro Arg His Val Glu Ile Ile

390 395 400GAG GCG ATT GAC GAG GAG CTG GTA CAT GAA ATT GTA TTA AAA TAT GGT 1447Glu Ala Ile Asp Glu Glu Leu Val His Glu Ile Val Leu Lys Tyr Gly

405 410 415TCA ATG GAT CTG AAC AAA TTG GAG GAA AAG TTG ACT ACA ATG AGA ATC 1495Ser Met Asp Leu Asn Lys Leu Glu Glu Lys Leu Thr Thr Met Arg Ile

420 425 430TTA GAA AAT TTT GAT CTT CCC AGT TCT GTT GCT GAA TTA TTT ATT AAG 1543Leu Glu Asn Phe Asp Leu Pro Ser Ser Val Ala Glu Leu Phe Ile Lys435 440 445 450CCT GAA ATC TCA GTT GAT GAT GAT ACT GAA ACA GTA GAA GTC CAT GAC 1591Pro Glu Ile Ser Val Asp Asp Asp Thr Glu Thr Val Glu Val His Asp

455 460 465AAA GTT GAA GCT TCC GAT AAA GTT GTG ACT AAT GAT GAA GAT GAC ACT 1639Lys Val Glu Ala Ser Asp Lys Val Val Thr Asn Asp Glu Asp Asp Thr

470 475 480GGT AAG AAA ACT AGT GTG AAG ATA GAA GCA GCT GCA GAA AAA GAC ATT 1687Gly Lys Lys Thr Ser Val Lys Ile Glu Ala Ala Ala Glu Lys Asp Ile

485 490 495GAC AAG AAA ACT CCC GTG AGT CCG GAA CCA GCT GTT ATA CCA CCT AAG 1735Asp Lys Lys Thr Pro Val Ser Pro Glu Pro Ala Val Ile Pro Pro Lys

500 505 510AAG GTA CGC ATG GCC AAC TTG TGT GTT GTG GGC GGC CAT GCT GTT AAT 1783Lys Val Arg Met Ala Asn Leu Cys Val Val Gly Gly His Ala Val Asn515 520 525 530GGA GTT GCT GAG ATC CAT AGT GAA ATT GTG AAG GAG GAG GTT TTC AAT 1831Gly Val Ala Glu Ile His Ser Glu Ile Val Lys Glu Glu Val Phe Asn

535 540 545GAC TTC TAT GAG CTC TGG CCG GAA AAG TTC CAA AAC AAA ACA AAT GGA 1879Asp Phe Tyr Glu Leu Trp Pro Glu Lys Phe Gln Asn Lys Thr Asn Gly

550 555 560GTG ACT CCA AGA AGA TGG ATT CGT TTC TGC AAT CCT CCT CTT AGT GCC 1927Val Thr Pro Arg Arg Trp Ile Arg Phe Cys Asn Pro Pro Leu Ser Ala

565 570 575ATC ATA ACT AAG TGG ACT GGT ACA GAG GAT TGG GTC CTG AAA ACT GAA 1975Ile Ile Thr Lys Trp Thr Gly Thr Glu Asp Trp Val Leu Lys Thr Glu

580 585 590AAG TTG GCA GAA TTG CAG AAG TTT GCT GAT AAT GAA GAT CTT CAA AAT 2023Lys Leu Ala Glu Leu Gln Lys Phe Ala Asp Asn Glu Asp Leu Gln Asn595 600 605 610GAG TGG AGG GAA GCA AAA AGG AGC AAC AAG ATT AAA GTT GTC TCC TTT 2071Glu Trp Arg Glu Ala Lys Arg Ser Asn Lys Ile Lys Val Val Ser Phe

615 620 625CTC AAA GAA AAG ACA GGG TAT TCT GTT GTC CCA GAT GCA ATG TTT GAT 2119Leu Lys Glu Lys Thr Gly Tyr Ser Val Val Pro Asp Ala Met Phe Asp

630 635 640ATT CAG GTA AAA CGC ATT CAT GAG TAC AAG CGA CAA CTG TTA AAT ATC 2167Ile Gln Val Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gln Leu Leu Asn Ile

645 650 655TTC GGC ATC GTT TAT CGG TAT AAG AAG ATG AAA GAA ATG ACA GCT GCA 2215Phe Gly Ile Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Met Lys Glu Met Thr Ala Ala

660 665 670GAA AGA AAG ACT AAC TTC GTT CCT CGA GTA TGC ATA TTT GGG GGA AAA 2263Glu Arg Lys Thr Asn Phe Val Pro Arg Val Cys Ile Phe Gly Gly Lys675 680 685 690GCT TTT GCC ACA TAT GTG CAA GCC AAG AGG ATT GTA AAA TTT ATC ACA 2311Ala Phe Ala Thr Tyr Val Gln Ala Lys Arg Ile Val Lys Phe Ile Thr

695 700 705GAT GTT GGT GCT ACT ATA AAT CAT GAT CCA GAA ATC GGT GAT CTG TTG 2359Asp Val Gly Ala Thr Ile Asn His Asp Pro Glu Ile Gly Asp Leu Leu

710 715 720AAG GTA GTC TTT GTG CCA GAT TAC AAT GTC AGT GTT GCT GAA TTG CTA 2407Lys Val Val Phe Val Pro Asp Tyr Asn Val Ser Val Ala Glu Leu Leu

725 730 735ATT CCT GCT AGC GAT CTA TCA GAA CAT ATC AGT ACG GCT GGA ATG GAG 2455Ile Pro Ala Ser Asp Leu Ser Glu His Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu

740 745 750GCC AGT GGA ACC AGT AAT ATG AAG TTT GCA ATG AAT GGT TGT ATC CAA 2503Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ala Met Asn Gly Cys Ile Gln755 760 765 770ATT GGT ACA TTG GAT GGC GCT AAT GTT GAA ATA AGG GAA GAG GTT GGA 2551Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Arg Glu Glu Val Gly

775 780 785GAA GAA AAC TTC TTT CTC TTT GGT GCT CAA GCT CAT GAA ATT GCA GGG 2599Glu Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Gln Ala His Glu Ile Ala Gly

790 795 800CTT AGA AAA GAA AGA GCT GAC GGA AAG TTT GTA CCT GAT GAA CGT TTT 2647Leu Arg Lys Glu Arg Ala Asp Gly Lys Phe Val Pro Asp Glu Arg Phe

805 810 815GAA GAG GTG AAG GAA TTT GTT AGA AGC GGT GCT TTT GGC TCT TAT AAC 2695Glu Glu Val Lys Glu Phe Val Arg Ser Gly Ala Phe Gly Ser Tyr Asn

820 825 830TAT GAT GAC CTA ATT GGA TCG TTG GAA GGA AAT GAA GGT TTT GGC CGT 2743Tyr Asp Asp Leu Ile Gly Ser Leu Glu Gly Asn Glu Gly Phe Gly Arg835 840 845 850GCT GAC TAT TTC CTT GTG GGC AAG GAC TTC CCC AGT TAC ATA GAA TGC 2791Ala Asp Tyr Phe Leu Val Gly Lys Asp Phe Pro Ser Tyr Ile Glu Cys

855 860 865CAA GAG AAA GTT GAT GAG GCA TAT CGC GAC CAG AAA AGG TGG ACA ACG 2839Gln Glu Lys Val Asp Glu Ala Tyr Arg Asp Gln Lys Arg Trp Thr Thr

870 875 880ATG TCA ATC TTG AAT ACA GCG GGA TCG TAC AAG TTC AGC AGT GAC AGA 2887Met Ser Ile Leu Asn Thr Ala Gly Ser Tyr Lys Phe Ser Ser Asp Arg

885 890 895ACA ATC CAT GAA TAT GCC AAA GAC ATT TGG AAC ATT GAA GCT GTG GAA 2935Thr Ile His Glu Tyr Ala Lys Asp Ile Trp Asn Ile Glu Ala Val Glu

900 905 910ATA GCA TAA GAGGGGGAAG TGAATGAAAA ATAACAAAGG CACAGTAAGT 2984Ile Ala *915AGTTTCTCTT TTTATCATGT GATGAAGGTA TATAATGTAT GTGTAAGAGG ATGATGTTAT 3044TACCACATAA TAAGAGATGA AGAGTCTCAT TTTGCTTCAA AAAAAAAAAA AAAAAAA 3101(2)SEQ ID NO：2信息：(i)序列特征：

(A)长度：967个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Ala Thr Ala Asn Gly Ala His Leu Phe Asn His Tyr Ser Ser Asn-50 -45 -40 -35Ser Arg Phe Ile His Phe Thr Ser Arg Asn Thr Ser Ser Lys Leu Phe

-30 -25 -20Leu Thr Lys Thr Ser His Phe Arg Arg Pro Lys Arg Cys Phe His Val

-15 -10 -5Asn Asn Thr Leu Ser Glu Lys Ile His His Pro Ile Thr Glu Gln Gly

1 5 10Gly Glu Ser Asp Leu Ser Ser Phe Ala Pro Asp Ala Ala Ser Ile Thr15 20 25 30Ser Ser Ile Lys Tyr His Ala Glu Phe Thr Pro Val Phe Ser Pro Glu

35 40 45Arg Phe Glu Leu Pro Lys Ala Phe Phe Ala Thr Ala Gln Ser Val Arg

50 55 60Asp Ser Leu Leu Ile Asn Trp Asn Ala Thr Tyr Asp Ile Tyr Glu Lys

65 70 75Leu Asn Met Lys Gln Ala Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu Gln Gly

80 85 90Arg Ala Leu Leu Asn Ala Ile Gly Asn Leu Glu Leu Thr Gly Ala Phe95 100 105 110Ala Glu Ala Leu Lys Asn Leu Gly His Asn Leu Glu Asn Val Ala Ser

115 120 125Gln Glu Pro Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala

130 135 140Ser Cys Phe Leu Asp Ser Leu Ala Thr Leu Asn Tyr Pro Ala Trp Gly

145 150 155Tyr Gly Leu Arg Tyr Lys Tyr Gly Leu Phe Lys Gln Arg Ile Thr Lys

160 165 170Asp Gly Gln Glu Glu Val Ala Glu Asp Trp Leu Glu Ile Gly Ser Pro175 180 185 190Trp Glu Val Val Arg Asn Asp Val Ser Tyr Pro Ile Lys Phe Tyr Gly

195 200 205Lys Val Ser Thr Gly Ser Asp Gly Lys Arg Tyr Trp Ile Gly Gly Glu

210 215 220Asp Ile Lys Ala Val Ala Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr Lys Thr

225 230 235Arg Thr Thr Ile Ser Leu Arg Leu Trp Ser Thr Gln Val Pro Ser Ala

240 245 250Asp Phe Asp Leu Ser Ala Phe Asn Ala Gly Glu His Thr Lys Ala Cys255 260 265 270Glu Ala Gln Ala Asn Ala Glu Lys Ile Cys Tyr Ile Leu Tyr Pro Gly

275 280 285Asp Glu Ser Glu Glu Gly Lys Ile Leu Arg Leu Lys Gln Gln Tyr Thr

290 295 300Leu Cys Ser Ala Ser Leu Gln Asp Ile Ile Ser Arg Phe Glu Arg Arg

305 310 315Ser Gly Asp Arg Ile Lys Trp Glu Glu Phe Pro Glu Lys Val Ala Val

320 325 330Gln Met Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Cys Ile Pro Glu Leu Met Arg335 340 345 350Ile Leu Ile Asp Leu Lys Gly Leu Asn Trp Asn Glu Ala Trp Asn Ile

355 360 365Thr Gln Arg Thr Val Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala

370 375 380Leu Glu Lys Trp Ser Tyr Glu Leu Met Gln Lys Leu Leu Pro Arg His

385 390 395Val Glu Ile Ile Glu Ala Ile Asp Glu Glu Leu Val His Glu Ile Val

400 405 410Leu Lys Tyr Gly Ser Met Asp Leu Asn Lys Leu Glu Glu Lys Leu Thr415 420 425 430Thr Met Arg Ile Leu Glu Asn Phe Asp Leu Pro Ser Ser Val Ala Glu

435 440 445Leu Phe Ile Lys Pro Glu Ile Ser Val Asp Asp Asp Thr Glu Thr Val

450 455 460Glu Val His Asp Lys Val Glu Ala Ser Asp Lys Val Val Thr Asn Asp

465 470 475Glu Asp Asp Thr Gly Lys Lys Thr Ser Val Lys Ile Glu Ala Ala Ala

480 485 490Glu Lys Asp Ile Asp Lys Lys Thr Pro Val Ser Pro Glu Pro Ala Val495 500 505 510Ile Pro Pro Lys Lys Val Arg Met Ala Asn Leu Cys Val Val Gly Gly

515 520 525His Ala Val Asn Gly Val Ala Glu Ile His Ser Glu Ile Val Lys Glu

530 535 540Glu Val Phe Asn Asp Phe Tyr Glu Leu Trp Pro Glu Lys Phe Gln Asn

545 550 555Lys Thr Asn Gly Val Thr Pro Arg Arg Trp Ile Arg Phe Cys Asn Pro

560 565 570Pro Leu Ser Ala Ile Ile Thr Lys Trp Thr Gly Thr Glu Asp Trp Val575 580 585 590Leu Lys Thr Glu Lys Leu Ala Glu Leu Gln Lys Phe Ala Asp Asn Glu

595 600 605Asp Leu Gln Asn Glu Trp Arg Glu Ala Lys Arg Ser Asn Lys Ile Lys

610 615 620Val Val Ser Phe Leu Lys Glu Lys Thr Gly Tyr Ser Val Val Pro Asp

625 630 635Ala Met Phe Asp Ile Gln Val Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gln

640 645 650Leu Leu Asn Ile Phe Gly Ile Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Met Lys Glu655 660 665 670Met Thr Ala Ala Glu Arg Lys Thr Asn Phe Val Pro Arg Val Cys Ile

675 680 685Phe Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Val Gln Ala Lys Arg Ile Val

690 695 700Lys Phe Ile Thr Asp Val Gly Ala Thr Ile Asn His Asp Pro Glu Ile

705 710 715Gly Asp Leu Leu Lys Val Val Phe Val Pro Asp Tyr Asn Val Ser Val

720 725 730Ala Glu Leu Leu Ile Pro Ala Ser Asp Leu Ser Glu His Ile Ser Thr735 740 745 750Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ala Met Asn

755 760 765Gly Cys Ile Gln Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Arg

770 775 780Glu Glu Val Gly Glu Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Gln Ala His

785 790 795Glu Ile Ala Gly Leu Arg Lys Glu Arg Ala Asp Gly Lys Phe Val Pro

800 805 810Asp Glu Arg Phe Glu Glu Val Lys Glu Phe Val Arg Ser Gly Ala Phe815 820 825 830Gly Ser Tyr Asn Tyr Asp Asp Leu Ile Gly Ser Leu Glu Gly Asn Glu

835 840 845Gly Phe Gly Arg Ala Asp Tyr Phe Leu Val Gly Lys Asp Phe Pro Ser

850 855 860Tyr Ile Glu Cys Gln Glu Lys Val Asp Glu Ala Tyr Arg Asp Gln Lys

865 870 875Arg Trp Thr Thr Met Ser Ile Leu Asn Thr Ala Gly Ser Tyr Lys Phe

880 885 890Ser Ser Asp Arg Thr Ile His Glu Tyr Ala Lys Asp Ile Trp Asn Ile895 900 905 910Glu Ala Val Glu Ile Ala *

915(2)SEQ ID NO：3信息：(i)序列特征：

(A)长度：2655碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组的)(iii)假设：无(iv)反义：无(vi)原始来源：

(A)生物体：Solanum tuberosum(ix)特征：

(A)名称/要点：CDS

(B)定位：12..2528

(D)其它信息：/产物＝“马铃薯α葡聚糖H-型块茎磷酸

化酶”(ix)特征：

(A)名称/要点：成熟_肽

(B)定位：12..2525(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：GTTTATTTTC C ATG GAA GGT GGT GCA AAA TCG AAT GAT GTA TCA GCA GCA 50

Met Glu Gly Gly Ala Lys Ser Asn Asp Val Ser Ala Ala

1 5 10CCT ATT GCT CAA CCA CTT TCT GAA GAC CCT ACT GAC ATT GCA TCT AAT 98Pro Ile Ala Gln Pro Leu Ser Glu Asp Pro Thr Asp Ile Ala Ser Asn

15 20 25ATC AAG TAT CAT GCT CAA TAT ACT CCT CAT TTT TCT CCT TTC AAG TTT 146Ile Lys Tyr His Ala Gln Tyr Thr Pro His Phe Ser Pro Phe Lys Phe30 35 40 45GAG CCA CTA CAA GCA TAC TAT GCT GCT ACT GCT GAC AGT GTT CGT GAT 194Glu Pro Leu Gln Ala Tyr Tyr A la Ala Thr Ala Asp Ser Val Arg Asp

50 55 60CGC TTG ATC AAA CAA TGG AAT GAC ACC TAT CTT CAT TAT GAC AAA GTT 242Arg Leu Ile Lys Gln Trp Asn Asp Thr Tyr Leu His Tyr Asp Lys Val

65 70 75AAT CCA AAG CAA ACA TAC TAC TTA TCA ATG GAG TAT CTC CAG GGG CGA 290Asn Pro Lys Gln Thr Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Tyr Leu Gln Gly Arg

80 85 90GCT TTG ACA AAT GCA GTT GGA AAC TTA GAC ATC CAC AAT GCA TAT GCT 338Ala Leu Thr Asn Ala Val Gly Asn Leu Asp Ile His Asn Ala Tyr Ala

95 100 105GAT GCT TTA AAC AAA CTG GGT CAG CAG CTT GAG GAG GTC GTT GAG CAG 386Asp Ala Leu Asn Lys Leu Gly Gln Gln Leu Glu Glu Val Val Glu Gln110 115 120 125GAA AAA GAT GCA GCA TTA GGA AAT GGT GGT TTA GGA AGG CTC GCT TCA 434Glu Lys Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser

130 135 140TGC TTT CTT GAT TCC ATG GCC ACA TTG AAC CTT CCA GCA TGG GGT TAT 482Cys Phe Leu Asp Ser Met Ala Thr Leu Asn Leu Pro Ala Trp Gly Tyr

145 150 155GGC TTG AGG TAC AGA TAT GGA CTT TTT AAG CAG CTT ATC ACA AAG GCT 530Gly Leu Arg Tyr Arg Tyr Gly Leu Phe Lys Gln Leu Ile Thr Lys Ala

160 165 170GGG CAA GAA GAA GTT CCT GAA GAT TGG TTG GAG AAA TTT AGT CCC TGG 578Gly Gln Glu Glu Val Pro Glu Asp Trp Leu Glu Lys Phe Ser Pro Trp

175 180 185GAA ATT GTA AGG CAT GAT GTT GTC TTT CCT ATC AGG TTT TTT GGT CAT 626Glu Ile Val Arg His Asp Val Val Phe Pro Ile Arg Phe Phe Gly His190 195 200 205GTT GAA GTC CTC CCT TCT GGC TCG CGA AAA TGG GTT GGT GGA GAG GTC 674Val Glu Val Leu Pro Sar Gly Ser Arg Lys Trp Val Gly Gly Glu Val

210 215 220CTA CAG GCT CTT GCA TAT GAT GTG CCA ATT CCA GGA TAC AGA ACT AAA 722Leu Gln Ala Leu Ala Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr Arg Thr Lys

225 230 235AAC ACT AAT AGT CTT CGT CTC TGG GAA GCC AAA GCA AGC TCT GAG GAT 770Asn Thr Asn Ser Leu Arg Leu Trp Glu Ala Lys Ala Ser Ser Glu Asp

240 245 250TTC AAC TTG TTT CTG TTT AAT GAT GGA CAG TAT GAT GCT GCT GCA CAG 818Phe Asn Leu Phe Leu Phe Asn Asp Gly Gln Tyr Asp Ala Ala Ala Gln

255 260 265CTT CAT TCT AGG GCT CAG CAG ATT TGT GCT GTT CTC TAC CCT GGG GAT 866Leu His Ser Arg Ala Gln Gln Ile Cys Ala Val Leu Tyr Pro Gly Asp270 275 280 285GCT ACA GAG AAT GGA AAA CTC TTA CGG CTA AAG CAA CAA TTT TTT CTG 914Ala Thr Glu Asn Gly Lys Leu Leu Arg Leu Lys Gln Gln Phe Phe Leu

290 295 300TGC AGT GCA TCG CTT CAG GAT ATT ATT GCC AGA TTC AAA GAG AGA GAA 962Cys Ser Ala Ser Leu Gln Asp Ile Ile Ala Arg Phe Lys Glu Arg Glu

305 310 315GAT GGA AAG GGT TCT CAC CAG TGG TCT GAA TTC CCC AAG AAG GTT GCG 1010Asp Gly Lys Gly Ser His Gln Trp Ser Glu Phe Pro Lys Lys Val Ala

320 325 330ATA CAA CTA AAT GAC ACA CAT CCA ACT CTT ACG ATT CCA GAG CTG ATG 1058Ile Gln Leu Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Thr Ile Pro Glu Leu Met

335 340 345CGG TTG CTA ATG GAT GAT GAA GGA CTT GGG TGG GAT GAA TCT TGG AAT 1106Arg Leu Leu Met Asp Asp Glu Gly Leu Gly Trp Asp Glu Ser Trp Asn350 355 360 365ATC ACT ACT AGG ACA ATT GCC TAT ACG AAT CAT ACA GTC CTA CCT GAA 1154Ile Thr Thr Arg Thr Ile Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu

370 375 380GCA CTT GAA AAA TGG TCT CAG GCA GTC ATG TGG AAG CTC CTT CCT AGA 1202Ala Leu Glu Lys Trp Ser Gln Ala Val Met Trp Lys Leu Leu Pro Arg

385 390 395CAT ATG GAA ATC ATT GAA GAA ATT GAC AAA CGG TTT GTT GCT ACA ATA 1250His Met Glu Ile Ile Glu Glu Ile Asp Lys Arg Phe Val Ala Thr Ile

400 405 410ATG TCA GAA AGA CCT GAT CTT GAG AAT AAG ATG CCT AGC ATG CGC ATT 1298Met Ser Glu Arg Pro Asp Leu Glu Asn Lys Met Pro Ser Met Arg Ile

415 420 425TTG GAT CAC AAC GCC ACA AAA CCT GTT GTG CAT ATG GCT AAC TTG TGT 1346Leu Asp His Asn Ala Thr Lys Pro Val Val His Met Ala Asn Leu Cys430 435 440 445GTT GTC TCT TCA CAT ACG GTA AAT GGT GTT GCC CAG CTG CAT AGT GAC 1394Val Val Ser Ser His Thr Val Asn Gly Val Ala Gln Leu His Ser Asp

450 455 460ATC CTG AAG GCT GAG TTA TTT GCT GAT TAT GTC TCT GTA TGG CCC ACC 1442Ile Leu Lys Ala Glu Leu Phe Ala Asp Tyr Val Ser Val Trp Pro Thr

465 470 475AAG TTC CAG AAT AAG ACC AAT GGT ATA ACT CCT CGT AGG TGG ATC CGA 1490Lys Phe Gln Asn Lys Thr Asn Gly Ile Thr Pro Arg Arg Trp Ile Arg

480 485 490TTT TGT AGT CCT GAG CTG AGT CAT ATA ATT ACC AAG TGG TTA AAA ACA 1538Phe Cys Ser Pro Glu Leu Ser His Ile Ile Thr Lys Trp Leu Lys Thr

495 500 505GAT CAA TGG GTG ACG AAC CTC GAA CTG CTT GCT AAT CTT CGG GAG TTT 1586Asp Gln Trp Val Thr Asn Leu Glu Leu Leu Ala Asn Leu Arg Glu Phe510 515 520 525GCT GAT AAT TCG GAG CTC CAT GCT GAA TGG GAA TCA GCC AAG ATG GCC 1634Ala Asp Asn Ser Glu Leu His Ala Glu Trp Glu Ser Ala Lys Met Ala

530 535 540AAC AAG CAG CGT TTG GCA CAG TAT ATA CTG CAT GTG ACA GGT GTG AGC 1682Asn Lys Gln Arg Leu Ala Gln Tyr Ile Leu His Val Thr Gly Val Ser

545 550 555ATC GAT CCA AAT TCC CTT TTT GAC ATA CAA GTC AAA CGT ATC CAT GAA 1730Ile Asp Pro Asn Ser Leu Phe Asp Ile Gln Val Lys Arg Ile His Glu

560 565 570TAC AAA AGG CAG CTT CTA AAT ATT CTG GGC GTC ATC TAT AGA TAC AAG 1778Tyr Lys Arg Gln Leu Leu Asn Ile Leu Gly Val Ile Tyr Arg Tyr Lys

575 580 585AAG CTT AAG GGA ATG AGC CCT GAA GAA AGG AAA AAT ACA ACT CCT CGC 1826Lys Leu Lys Gly Met Ser Pro Glu Glu Arg Lys Asn Thr Thr Pro Arg590 595 600 605ACA GTC ATG ATT GGA GGA AAA GCA TTT GCA ACA TAC ACA AAT GCA AAA 1874Thr Val Met Ile Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Thr Asn Ala Lys

610 615 620CGA ATT GTC AAG CTC GTG ACT GAT GTT GGC GAC GTT GTC AAT AGT GAC 1922Arg Ile Val Lys Leu Val Thr Asp Val Gly Asp Val Val Asn Ser Asp

625 630 635CCT GAC GTC AAT GAC TAT TTG AAG GTG GTT TTT GTT CCC AAC TAC AAT 1970Pro Asp Val Asn Asp Tyr Leu Lys Val Val Phe Val Pro Asn Tyr Asn

640 645 650GTA TCT GTG GCA GAG ATG CTT ATT CCG GGA AGT GAG CTA TCA CAA CAC 2018Val Ser Val Ala Glu Met Leu Ile Pro Gly Ser Glu Leu Ser Gln His

655 660 665ATC AGT ACT GCA GGC ATG GAA GCA AGT GGA ACA AGC AAC ATG AAA TTT 2066Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe670 675 680 685GCC CTT AAT GGA TGC CTT ATC ATT GGG ACA CTA GAT GGG GCC AAT GTG 2114Ala Leu Asn Gly Cys Leu Ile Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val

690 695 700GAA ATT AGG GAG GAA ATT GGA GAA GAT AAC TTC TTT CTT TTT GGT GCA 2162Glu Ile Arg Glu Glu Ile Gly Glu Asp Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala

705 710 715ACA GCT GAT GAA GTT CCT CAA CTG CGC AAA GAT CGA GAG AAT GGA CTG 2210Thr Ala Asp Glu Val Pro Gln Leu Arg Lys Asp Arg Glu Asn Gly Leu

720 725 730TTC AAA CCT GAT CCT CGG TTT GAA GAG GCA AAA CAA TTT ATT AGG TCT 2258Phe Lys Pro Asp Pro Arg Phe Glu Glu Ala Lys Gln Phe Ile Arg Ser

735 740 745GGA GCA TTT GGG ACG TAT GAT TAT AAT CCC CTC CTT GAA TCA CTG GAA 2306Gly Ala Phe Gly Thr Tyr Asp Tyr Asn Pro Leu Leu Glu Ser Leu Glu750 755 760 765GGG AAC TCG GGA TAT GGT CGT GGA GAC TAT TTT CTT GTT GGT CAT GAT 2354Gly Asn Ser Gly Tyr Gly Arg Gly Asp Tyr Phe Leu Val Gly His Asp

770 775 780TTT CCG AGC TAC ATG GAT GCT CAG GCA AGG GTT GAT GAA GCT TAC AAG 2402Phe Pro Ser Tyr Met Asp Ala Gln Ala Arg Val Asp Glu Ala Tyr Lys

785 790 795GAC AGG AAA AGA TGG ATA AAG ATG TCT ATA CTG AGC ACT AGT GGG AGT 2450Asp Arg Lys Arg Trp Ile Lys Met Ser Ile Leu Ser Thr Ser Gly Ser

800 805 810GGC AAA TTT AGT AGT GAC CGT ACA ATT TCT CAA TAT GCA AAA GAG ATC 2498Gly Lys Phe Ser Ser Asp Arg Thr Ile Ser Gln Tyr Ala Lys Glu Ile

815 820 825TGG AAC ATT GCC GAG TGT CGC GTG CCT TGA GCACACTTCT GAACCTGGTA 2548Trp Asn Ile Ala Glu Cys Arg Val Pro *830 835TCTAATAAGG ATCTAATGTT CATTGTTTAC TAGCATATGA ATAATGTAAG TTCAAGCACA 2608ACATGCTTTC TTATTTCCTA CTGCTCTCAA GAAGCAGTTA TTTGTTG 2655(2)SEQ ID NO：4信息：(i)序列特征：

(A)长度：839个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：Met Glu Gly Gly Ala Lys Ser Asn Asp Val Ser Ala Ala Pro Ile Ala1 5 10 15Gln Pro Leu Ser Glu Asp Pro Thr Asp Ile Ala Ser Asn Ile Lys Tyr

20 25 30His Ala Gln Tyr Thr Pro His Phe Ser Pro Phe Lys Phe Glu Pro Leu

35 40 45Gln Ala Tyr Tyr Ala Ala Thr Ala Asp Ser Val Arg Asp Arg Leu Ile

50 55 60Lys Gln Trp Asn Asp Thr Tyr Leu His Tyr Asp Lys Val Asn Pro Lys65 70 75 80Gln Thr Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Tyr Leu Gln Gly Arg Ala Leu Thr

85 90 95Asn Ala Val Gly Asn Leu Asp Ile His Asn Ala Tyr Ala Asp Ala Leu

100 105 110Asn Lys Leu Gly Gln Gln Leu Glu Glu Val Val Glu Gln Glu Lys Asp

115 120 125Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser Cys Phe Leu

130 135 140Asp Ser Met Ala Thr Leu Asn Leu Pro Ala Trp Gly Tyr Gly Leu Arg145 150 155 160Tyr Arg Tyr Gly Leu Phe Lys Gln Leu Ile Thr Lys Ala Gly Gln Glu

165 170 175Glu Val Pro Glu Asp Trp Leu Glu Lys Phe Ser Pro Trp Glu Ile Val

180 185 190Arg His Asp Val Val Phe Pro Ile Arg Phe Phe Gly His Val Glu Val

195 200 205Leu Pro Ser Gly Ser Arg Lys Trp Val Gly Gly Glu Val Leu Gln Ala

210 215 220Leu Ala Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr Arg Thr Lys Asn Thr Asn225 230 235 240Ser Leu Arg Leu Trp Glu Ala Lys Ala Ser Ser Glu Asp Phe Asn Leu

245 250 255Phe Leu Phe Asn Asp Gly Gln Tyr Asp Ala Ala Ala Gln Leu His Ser

260 265 270Arg Ala Gln Gln Ile Cys Ala Val Leu Tyr Pro Gly Asp Ala Thr Glu

275 280 285Asn Gly Lys Leu Leu Arg Leu Lys Gln Gln Phe Phe Leu Cys Ser Ala

290 295 300Ser Leu Gln Asp Ile Ile Ala Arg Phe Lys Glu Arg Glu Asp Gly Lys305 310 315 320Gly Ser His Gln Trp Ser Glu Phe Pro Lys Lys Val Ala Ile Gln Leu

325 330 335Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Thr Ile Pro Glu Leu Met Arg Leu Leu

340 345 350Met Asp Asp Glu Gly Leu Gly Trp Asp Glu Ser Trp Asn Ile Thr Thr

355 360 365Arg Thr Ile Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu Glu

370 375 380Lys Trp Ser Gln Ala Val Met Trp Lys Leu Leu Pro Arg His Met Glu385 390 395 400Ile Ile Glu Glu Ile Asp Lys Arg Phe Val Ala Thr Ile Met Ser Glu

405 410 415Arg Pro Asp Leu Glu Asn Lys Met Pro Ser Met Arg Ile Leu Asp His

420 425 430Asn Ala Thr Lys Pro Val Val His Met Ala Asn Leu Cys Val Val Ser

435 440 445Ser His Thr Val Asn Gly Val Ala GlnLeu His Ser Asp Ile Leu Lys

450 455 460Ala Glu Leu Phe Ala Asp Tyr Val Ser Val Trp Pro Thr Lys Phe Gln465 470 475 480Asn Lys Thr Asn Gly Ile Thr Pro Arg Arg Trp Ile Arg Phe Cys Ser

485 490 495Pro Glu Leu Ser His Ile Ile Thr Lys Trp Leu Lys Thr Asp Gln Trp

500 505 510Val Thr Asn Leu Glu Leu Leu Ala Asn Leu Arg Glu Phe Ala Asp Asn

515 520 525Ser Glu Leu His Ala Glu Trp Glu Ser Ala Lys Met Ala Asn Lys Gln

530 535 540Arg Leu Ala Gln Tyr Ile Leu His Val Thr Gly Val Ser Ile Asp Pro545 550 555 560Asn Ser Leu Phe Asp Ile Gln Val Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg

565 570 575Gln Leu Leu Asn Ile Leu Gly Val Ile Tyr Arg Tyr Lys Lys Leu Lys

580 585 590Gly Met Ser Pro Glu Glu Arg Lys Asn Thr Thr Pro Arg Thr Val Met

595 600 605Ile Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Thr Asn Ala Lys Arg Ile Val

610 615 620Lys Leu Val Thr Asp Val Gly Asp Val Val Asn Ser Asp Pro Asp Val625 630 635 640Asn Asp Tyr Leu Lys Val Val Phe Val Pro Asn Tyr Asn Val Ser Val

645 650 655Ala Glu Met Leu Ile Pro Gly Ser Glu Leu Ser Gln His Ile Ser Thr

660 665 670Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ala Leu Asn

675 680 685Gly Cys Leu Ile Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Arg

690 695 700Glu Glu Ile Gly Glu Asp Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Thr Ala Asp705 710 715 720Glu Val Pro Gln Leu Arg Lys Asp Arg Glu Asn Gly Leu Phe Lys Pro

725 730 735Asp Pro Arg Phe Glu Glu Ala Lys Gln Phe Ile Arg Ser Gly Ala Phe

740 745 750Gly Thr Tyr Asp Tyr Asn Pro Leu Leu Glu Ser Leu Glu Gly Asn Ser

755 760 765Gly Tyr Gly Arg Gly Asp Tyr Phe Leu Val Gly His Asp Phe Pro Ser

770 775 780Tyr Met Asp Ala Gln Ala Arg Val Asp Glu Ala Tyr Lys Asp Arg Lys785 790 795 800Arg Trp Ile Lys Met Ser Ile Leu Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Phe

805 810 815Ser Ser Asp Arg Thr Ile Ser Gln Tyr Ala Lys Glu Ile Trp Asn Ile

820 825 830Ala Glu Cys Arg Val Pro *

835(2)SEQ ID NO：5信息：(i)序列特征：

(A)长度：3171碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组的)(iii)假设：无 (iv)反义：无(vi)原始来源：

(A)生物体：Solanum tuberosum(ix)特征：

(A)名称/要点：CDS

(B)定位：87..3011

(D)其它信息：/产物＝“马铃薯α葡聚糖L-型叶磷酸

化酶”(ix)特征：

(A)名称/要点：成熟_肽

(B)定位：330..3008(ix)特征：

(A)名称/要点：信号_肽

(B)定位：87..329(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：TTTTTTTTTT CAACATGCAC AACAATTATT TTGATTAAAT TTTGTATCTA AAAATTTAGC 60ATTTTGAAAT TCAGTTCAGA GACATC ATG GCA ACT TTT GCT GTC TCT GGA TTG 113

Met Ala Thr Phe Ala Val Ser Gly Leu

-81 -80 -75AAC TCA ATT TCA AGT ATT TCT AGT TTT AAT AAC AAT TTC AGA AGC AAA 161Asn Ser Ile Ser Ser Ile Ser Ser Phe Asn Asn Asn Phe Arg Ser Lys

-70 -65 -60AAC TCA AAC ATT TTG TTG AGT AGA AGG AGG ATT TTA TTG TTC AGT TTT 209Asn Ser Asn Ile Leu Leu Ser Arg Arg Arg Ile Leu Leu Phe Ser Phe

-55 -50 -45AGA AGA AGA AGA AGA AGT TTC TCT GTT AGC AGT GTT GCT AGT GAT CAA 257Arg Arg Arg Arg Arg Ser Phe Ser Val Ser Ser Val Ala Ser Asp Gln-40 -35 -30 -25AAG CAG AAG ACA AAG GAT TCT TCC TCT GAT GAA GGA TTT ACA TTA GAT 305Lys Gln Lys Thr Lys Asp Ser Ser Ser Asp Glu Gly Phe Thr Leu Asp

-20 -15 -10GTT TTT CAG CCG GAC TCC ACG TCT GTT TTA TCA AGT ATA AAG TAT CAC 353Val Phe Gln Pro Asp Ser Thr Ser Val Leu Ser Ser Ile Lys Tyr His

-5 1 5GCT GAG TTC ACA CCA TCA TTT TCT CCT GAG AAG TTT GAA CTT CCC AAG 401Ala Glu Phe Thr Pro Ser Phe Ser Pro Glu Lys Phe Glu Leu Pro Lys

10 15 20GCA TAC TAT GCA ACT GCA GAG AGT GTT CGA GAT ACG CTC ATT ATA AAT 449Ala Tyr Tyr Ala Thr Ala Glu Ser Val Arg Asp Thr Leu Ile Ile Asn25 30 35 40TGG AAT GCC ACA TAC GAA TTC TAT GAA AAG ATG AAT GTA AAG CAG GCA 497Trp Asn Ala Thr Tyr Glu Phe Tyr Glu Lys Met Asn Val Lys Gln Ala

45 50 55TAT TAC TTG TCT ATG GAA TTT CTT CAG GGA AGA GCT TTA CTC AAT GCT 545Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu Gln Gly Arg Ala Leu Leu Asn Ala

60 65 70ATT GGT AAC TTG GGG CTA ACC GGA CCT TAT GCA GAT GCT TTA ACT AAG 593Ile Gly Asn Leu Gly Leu Thr Gly Pro Tyr Ala Asp Ala Leu Thr Lys

75 80 85CTC GGA TAC AGT TTA GAG GAT GTA GCC AGG CAG GAA CCG GAT GCA GCT 641Leu Gly Tyr Ser Leu Glu Asp Val Ala Arg Gln Glu Pro Asp Ala Ala

90 95 100TTA GGT AAT GGA GGT TTA GGA AGA CTT GCT TCT TGC TTT CTG GAC TCA 689Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser Cys Phe Leu Asp Ser105 110 115 120ATG GCG ACA CTA AAC TAC CCT GCA TGG GGC TAT GGA CTT AGA TAC CAA 737Met Ala Thr Leu Asn Tyr Pro Ala Trp Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr Gln

125 130 135TAT GGC CTT TTC AAA CAG CTT ATT ACA AAA GAT GGA CAG GAG GAA GTT 785Tyr Gly Leu Phe Lys Gln Leu Ile Thr Lys Asp Gly Gln Glu Glu Val

140 145 150GCT GAA AAT TGG CTC GAG ATG GGA AAT CCA TGG GAA ATT GTG AGG AAT 833Ala Glu Asn Trp Leu Glu Met Gly Asn Pro Trp Glu Ile Val Arg Asn

155 160 165GAT ATT TCG TAT CCC GTA AAA TTC TAT GGG AAG GTC ATT GAA GGA GCT 881Asp Ile Ser Tyr Pro Val Lys Phe Tyr Gly Lys Val Ile Glu Gly Ala

170 175 180GAT GGG AGG AAG GAA TGG GCT GGC GGA GAA GAT ATA ACT GCT GTT GCC 929Asp Gly Arg Lys Glu Trp Ala Gly Gly Glu Asp Ile Thr Ala Val Ala185 190 195 200TAT GAT GTC CCA ATA CCA GGA TAT AAA ACA AAA ACA ACG ATT AAC CTT 977Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr Lys Thr Lys Thr Thr Ile Asn Leu

205 210 215CGA TTG TGG ACA ACA AAG CTA GCT GCA GAA GCT TTT GAT TTA TAT GCT 1025Arg Leu Trp Thr Thr Lys Leu Ala Ala Glu Ala Phe Asp Leu Tyr Ala

220 225 230TTT AAC AAT GGA GAC CAT GCC AAA GCA TAT GAG GCC CAG AAA AAG GCT 1073Phe Asn Asn Gly Asp His Ala Lys Ala Tyr Glu Ala Gln Lys Lys Ala

235 240 245GAA AAG ATT TGC TAT GTC TTA TAT CCA GGT GAC GAA TCG CTT GAA GGA 1121Glu Lys Ile Cys Tyr Val Leu Tyr Pro Gly Asp Glu Ser Leu Glu Gly

250 255 260AAG ACG CTT AGG TTA AAG CAG CAA TAC ACA CTA TGT TCT GCT TCT CTT 1169Lys Thr Leu Arg Leu Lys Gln Gln Tyr Thr Leu Cys Ser Ala Ser Leu265 270 275 280CAG GAC ATT ATT GCA CGG TTC GAG AAG AGA TCA GGG AAT GCA GTA AAC 1217Gln Asp Ile Ile Ala Arg Phe Glu Lys Arg Ser Gly Asn Ala Val Asn

285 290 295TGG GAT CAG TTC CCC GAA AAG GTT GCA GTA CAG ATG AAT GAC ACT CAT 1265Trp Asp Gln Phe Pro Glu Lys Val Ala Val Gln Met Asn Asp Thr His

300 305 310CCA ACA CTT TGT ATA CCA GAA CTT TTA AGG ATA TTG ATG GAT GTT AAA 1313Pro Thr Leu Cys Ile Pro Glu Leu Leu Arg Ile Leu Met Asp Val Lys

315 320 325GGT TTG AGC TGG AAG CAG GCA TGG GAA ATT ACT CAA AGA ACG GTC GCA 1361Gly Leu Ser Trp Lys Gln Ala Trp Glu Ile Thr Gln Arg Thr Val Ala

330 335 340TAC ACT AAC CAC ACT GTT CTA CCT GAG GCT CTT GAG AAA TGG AGC TTC 1409Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu Glu Lys Trp Ser Phe345 350 355 360ACA CTT CTT GGT GAA CTG CTT CCT CGG CAC GTG GAG ATC ATA GCA ATG 1457Thr Leu Leu Gly Glu Leu Leu Pro Arg His Val Glu Ile Ile Ala Met

365 370 375ATA GAT GAG GAG CTC TTG CAT ACT ATA CTT GCT GAA TAT GGT ACT GAA 1505Ile Asp Glu Glu Leu Leu His Thr Ile Leu Ala Glu Tyr Gly Thr Glu

380 385 390GAT CTT GAC TTG TTG CAA GAA AAG CTA AAC CAA ATG AGG ATT CTG GAT 1553Asp Leu Asp Leu Leu Gln Glu Lys Leu Asn Gln Met Arg Ile Leu Asp

395 400 405AAT GTT GAA ATA CCA AGT TCT GTT TTG GAG TTG CTT ATA AAA GCC GAA 1601Asn Val Glu Ile Pro Ser Ser Val Leu Glu Leu Leu Ile Lys Ala Glu

410 415 420GAA AGT GCT GCT GAT GTC GAA AAG GCA GCA GAT GAA GAA CAA GAA GAA 1649Glu Ser Ala Ala Asp Val Glu Lys Ala Ala Asp Glu Glu Gln Glu Glu425 430 435 440GAA GGT AAG GAT GAC AGT AAA GAT GAG GAA ACT GAG GCT GTA AAG GCA 1697Glu Gly Lys Asp Asp Ser Lys Asp Glu Glu Thr Glu Ala Val Lys Ala

445 450 455GAA ACT ACG AAC GAA GAG GAG GAA ACT GAG GTT AAG AAG GTT GAG GTG 1745Glu Thr Thr Asn Glu Glu Glu Glu Thr Glu Val Lys Lys Val Glu Val

460 465 470GAG GAT AGT CAA GCA AAA ATA AAA CGT ATA TTC GGG CCA CAT CCA AAT 1793Glu Asp Ser Gln Ala Lys Ile Lys Arg Ile Phe Gly Pro His Pro Asn

475 480 485AAA CCA CAG GTG GTT CAC ATG GCA AAT CTA TGT GTA GTT AGC GGG CAT 1841Lys Pro Gln Val Val His Met Ala Asn Leu Cys Val Val Ser Gly His

490 495 500GCA GTT AAC GGT GTT GCT GAG ATT CAT AGT GAA ATA GTT AAG GAT GAA 1889Ala Val Asn Gly Val Ala Glu Ile His Ser Glu Ile Val Lys Asp Glu505 510 515 520GTT TTC AAT GAA TTT TAC AAG TTA TGG CCA GAG AAA TTC CAA AAC AAG 1937Val Phe Asn Glu Phe Tyr Lys Leu Trp Pro Glu Lys Phe Gln Asn Lys

525 530 535ACA AAT GGT GTG ACA CCA AGA AGA TGG CTA AGT TTC TGT AAT CCA GAG 1985Thr Asn Gly Val Thr Pro Arg Arg Trp Leu Ser Phe Cys Asn Pro Glu

540 545 550TTG AGT GAA ATT ATA ACC AAG TGG ACA GGA TCT GAT GAT TGG TTA GTA 2033Leu Ser Glu Ile Ile Thr Lys Trp Thr Gly Ser Asp Asp Trp Leu Val

555 560 565AAC ACT GAA AAA TTG GCA GAG CTT CGA AAG TTT GCT GAT AAC GAA GAA 2081Asn Thr Glu Lys Leu Ala Glu Leu Arg Lys Phe Ala Asp Asn Glu Glu

570 575 580CTC CAG TCT GAG TGG AGG AAG GCA AAA GGA AAT AAC AAA ATG AAG ATT 2129Leu Gln Ser Glu Trp Arg Lys Ala Lys Gly Asn Asn Lys Met Lys Ile585 590 595 600GTC TCT CTC ATT AAA GAA AAA ACA GGA TAC GTG GTC AGT CCC GAT GCA 2177Val Ser Leu Ile Lys Glu Lys Thr Gly Tyr Val Val Ser Pro Asp Ala

605 610 615ATG TTT GAT GTT CAG ATC AAG CGC ATC CAT GAG TAT AAA AGG CAG CTA 2225Met Phe Asp Val Gln Ile Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gln Leu

620 625 630TTA AAT ATA TTT GGA ATC GTT TAT CGC TAT AAG AAG ATG AAA GAA ATG 2273Leu Asn Ile Phe Gly Ile Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Met Lys Glu Met

635 640 645AGC CCT GAA GAA CGA AAA GAA AAG TTT GTC CCT CGA GTT TGC ATA TTT 2321Ser Pro Glu Glu Arg Lys Glu Lys Phe Val Pro Arg Val Cys Ile Phe

650 655 660GGA GGA AAA GCA TTT GCT ACA TAT GTT CAG GCC AAG AGA ATT GTA AAA 2369Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr Tyr Val Gln Ala Lys Arg Ile Val Lys665 670 675 680TTT ATC ACT GAT GTA GGG GAA ACA GTC AAC CAT GAT CCC GAG ATT GGT 2417Phe Ile Thr Asp Val Gly Glu Thr Val Asn His Asp Pro Glu Ile Gly

685 690 695GAT CTT TTG AAG GTT GTA TTT GTT CCT GAT TAC AAT GTC AGT GTA GCA 2465Asp Leu Leu Lys Val Val Phe Val Pro Asp Tyr Asn Val Ser Val Ala

700 705 710GAA GTG CTA ATT CCT GGT AGT GAG TTG TCC CAG CAT ATT AGT ACT GCT 2513Glu Val Leu Ile Pro Gly Ser Glu Leu Ser Gln His Ile Ser Thr Ala

715 720 725GGT ATG GAG GCT AGT GGA ACC AGC AAC ATG AAA TTT TCA ATG AAT GGC 2561Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ser Met Asn Gly

730 735 740TGC CTC CTC ATC GGG ACA TTA GAT GGT GCC AAT GTT GAG ATA AGA GAG 2609Cys Leu Leu Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Arg Glu745 750 755 760GAA GTT GGA GAG GAC AAT TTC TTT CTT TTC GGA GCT CAG GCT CAT GAA 2657Glu Val Gly Glu Asp Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Gln Ala His Glu

765 770 775ATT GCT GGC CTA CGA AAG GAA AGA GCC GAG GGA AAG TTT GTC CCG GAC 2705Ile Ala Gly Leu Arg Lys Glu Arg Ala Glu Gly Lys Phe Val Pro Asp

780 785 790CCA AGA TTT GAA GAA GTA AAG GCG TTC ATT AGG ACA GGC GTC TTT GGC 2753Pro Arg Phe Glu Glu Val Lys Ala Phe Ile Arg Thr Gly Val Phe Gly

795 800 805ACC TAC AAC TAT GAA GAA CTC ATG GGA TCC TTG GAA GGA AAC GAA GGC 2801Thr Tyr Asn Tyr Glu Glu Leu Met Gly Ser Leu Glu Gly Asn Glu Gly

810 815 820TAT GGT CGT GCT GAC TAT TTT CTT GTA GGA AAG GAT TTC CCC GAT TAT 2849Tyr Gly Arg Ala Asp Tyr Phe Leu Val Gly Lys Asp Phe Pro Asp Tyr825 830 835 840ATA GAG TGC CAA GAT AAA GTT GAT GAA GCA TAT CGA GAC CAG AAG AAA 2897Ile Glu Cys Gln Asp Lys Val Asp Glu Ala Tyr Arg Asp Gln Lys Lys

845 850 855TGG ACC AAA ATG TCG ATC TTA AAC ACA GCT GGA TCG TTC AAA TTT AGC 2945Trp Thr Lys Met Ser Ile Leu Asn Thr Ala Gly Ser Phe Lys Phe Ser

860 865 870AGT GAT CGA ACA ATT CAT CAA TAT GCA AGA GAT ATA TGG AGA ATT GAA 2993Ser Asp Arg Thr Ile His Gln Tyr Ala Arg Asp Ile Trp Arg Ile Glu

875 880 885CCT GTT GAA TTA CCT TAA AAGTTAGCCA GTTAAAGGAT GAAAGCCAAT 3041Pro Val Glu Leu Pro *

890TTTTTCCCCC TGAGGTTCTC CCATACTGTT TATTAGTACA TATATTGTCA ATTGTTGCTA 3101CTGAAATGAT AGAAGTTTTG AATATTTACT GTCAATAAAA TACAGTTGAT TCCATTTGAA 3161AAAAAAAAA 3171(2)SEQ ID NO：6信息：(i)序列特征：

(A)长度：975个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：Met Ala Thr Phe Ala Val Ser Gly Leu Asn Ser Ile Ser Ser Ile Ser-81 -80 -75 -70Ser Phe Asn Asn Asn Phe Arg Ser Lys Asn Ser Asn Ile Leu Leu Ser-65 -60 -55 -50Arg Arg Arg Ile Leu Leu Phe Ser Phe Arg Arg Arg Arg Arg Ser Phe

-45 -40 -35Ser Val Ser Ser Val Ala Ser Asp Gln Lys Gln Lys Thr Lys Asp Ser

-30 -25 -20Ser Ser Asp Glu Gly Phe Thr Leu Asp Val Phe Gln Pro Asp Ser Thr

-15 -10 -5Ser Val Leu Ser Ser Ile Lys Tyr His Ala Glu Phe Thr Pro Ser Phe

1 5 10 15Ser Pro Glu Lys Phe Glu Leu Pro Lys Ala Tyr Tyr Ala Thr Ala Glu

20 25 30Ser Val Arg Asp Thr Leu Ile Ile Asn Trp Asn Ala Thr Tyr Glu Phe

35 40 45Tyr Glu Lys Met Asn Val Lys Gln Ala Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe

50 55 60Leu Gln Gly Arg Ala Leu Leu Asn Ala Ile Gly Asn Leu Gly Leu Thr

65 70 75Gly Pro Tyr Ala Asp Ala Leu Thr Lys Leu Gly Tyr Ser Leu Glu Asp80 85 90 95Val Ala Arg Gln Glu Pro Asp Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly

100 105 110Arg Leu Ala Ser Cys Phe Leu Asp Ser Met Ala Thr Leu Asn Tyr Pro

115 120 125Ala Trp Gly Tyr Gly Leu Arg Tyr Gln Tyr Gly Leu Phe Lys Gln Leu

130 135 140Ile Thr Lys Asp Gly Gln Glu Glu Val Ala Glu Asn Trp Leu Glu Met

145 150 155Gly Asn Pro Trp Glu Ile Val Arg Asn Asp Ile Ser Tyr Pro Val Lys160 165 170 175Phe Tyr Gly Lys Val Ile Glu Gly Ala Asp Gly Arg Lys Glu Trp Ala

180 185 190Gly Gly Glu Asp Ile Thr Ala Val Ala Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly

195 200 205Tyr Lys Thr Lys Thr Thr Ile Asn Leu Arg Leu Trp Thr Thr Lys Leu

210 215 220Ala Ala Glu Ala Phe Asp Leu Tyr Ala Phe Asn Asn Gly Asp His Ala

225 230 235Lys Ala Tyr Glu Ala Gln Lys Lys Ala Glu Lys Ile Cys Tyr Val Leu240 245 250 255Tyr Pro Gly Asp Glu Ser Leu Glu Gly Lys Thr Leu Arg Leu Lys Gln

260 265 270Gln Tyr Thr Leu Cys Ser Ala Ser Leu Gln Asp Ile Ile Ala Arg Phe

275 280 285Glu Lys Arg Ser Gly Asn Ala Val Asn Trp Asp Gln Phe Pro Glu Lys

290 295 300Val Ala Val Gln Met Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Cys Ile Pro Glu

305 310 315Leu Leu Arg Ile Leu Met Asp Val Lys Gly Leu Ser Trp Lys Gln Ala320 325 330 335Trp Glu Ile Thr Gln Arg Thr Val Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu

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385 390 395Lys Leu Asn Gln Met Arg Ile Leu Asp Asn Val Glu Ile Pro Ser Ser400 405 410 415Val Leu Glu Leu Leu Ile Lys Ala Glu Glu Ser Ala Ala Asp Val Glu

420 425 430Lys Ala Ala Asp Glu Glu Gln Glu Glu Glu Gly Lys Asp Asp Ser Lys

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450 455 460Glu Thr Glu Val Lys Lys Val Glu Val Glu Asp Ser Gln Ala Lys Ile

465 470 475Lys Arg Ile Phe Gly Pro His Pro Asn Lys Pro Gln Val Val His Met480 485 490 495Ala Asn Leu Cys Val Val Ser Gly His Ala Val Asn Gly Val Ala Glu

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515 520 525Leu Trp Pro Glu Lys Phe Gln Asn Lys Thr Asn Gly Val Thr Pro Arg

530 535 540Arg Trp Leu Ser Phe Cys Asn Pro Glu Leu Ser Glu Ile Ile Thr Lys

545 550 555Trp Thr Gly Ser Asp Asp Trp Leu Val Asn Thr Glu Lys Leu Ala Glu560 565 570 575Leu Arg Lys Phe Ala Asp Asn Glu Glu Leu Gln Ser Glu Trp Arg Lys

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595 600 605Thr Gly Tyr Val Val Ser Pro Asp Ala Met Phe Asp Val Gln Ile Lys

610 615 620Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gln Leu Leu Asn Ile Phe Gly Ile Val

625 630 635Tyr Arg Tyr Lys Lys Met Lys Glu Met Ser Pro Glu Glu Arg Lys Glu640 645 650 655Lys Phe Val Pro Arg Val Cys Ile Phe Gly Gly Lys Ala Phe Ala Thr

660 665 670Tyr Val Gln Ala Lys Arg Ile Val Lys Phe Ile Thr Asp Val Gly Glu

675 680 685Thr Val Asn His Asp Pro Glu Ile Gly Asp Leu Leu Lys Val Val Phe

690 695 700Val Pro Asp Tyr Asn Val Ser Val Ala Glu Val Leu Ile Pro Gly Ser

705 710 715Glu Leu Ser Gln His Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu Ala Ser Gly Thr720 725 730 735Ser Asn Met Lys Phe Ser Met Asn Gly Cys Leu Leu Ile Gly Thr Leu

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865 870 875Tyr Ala Arg Asp Ile Trp Arg Ile Glu Pro Val Glu Leu Pro *880 885 890(2)SEQ ID NO：7信息：(i)序列特征：

(A)长度：27碱基对

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(A)长度：27碱基对

(B)类型：核酸

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(A)生物体：Solanum tuberosum(ix)特征：

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(B)定位：1..27

(D)其它信息：/功能＝“引物”/标记＝SPL2(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：GTTTATTTTC CATCGATGGA AGGTGGT 27(2)SEQ ID NO：9信息：(i)序列特征：

(A)长度：23碱基对

(B)类型：核酸

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(B)定位：1..23

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(A)长度：25碱基对

(B)类型：核酸

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(B)定位：1..25

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Claims

1.一种具有改善的块茎冷贮存特征的马铃薯植株，包括一种经修饰的马铃薯植株，相对于由未经修饰的马铃薯植株产生的块茎，此修饰植株产生的块茎中，具有降低的选自α葡聚糖L-型块茎磷酸化酶(GLTP)和α葡聚糖H-型块茎磷酸化酶(GHTP)的α葡聚糖磷酸化酶活性水平。

2.权利要求1的马铃薯植株，是以具有有效地连接于一个DNA序列的植物启动子序列的表达盒转化的，此DNA序列当在此植株中转录时，将抑制选自GLTP基因和GHTP基因的内源性α葡聚糖磷酸化酶基因的表达。

3.一种具有改善的冷贮存特征的马铃薯植株，包括一种以具有有效地连接于一个DNA序列的植物启动子序列的表达盒转化的马铃薯植株，此DNA序列包括编码选自α葡聚糖L-型块茎磷酸化酶(GLTP)和α葡聚糖H-型块茎磷酸化酶(GHTP)的α葡聚糖磷酸化酶基因的至少20个核苷酸。

4.权利要求3的马铃薯植株，其中编码的α葡聚糖磷酸化酶是GLTP。

5.权利要求3的马铃薯植株，其中编码的α葡聚糖磷酸化酶是GHTP。

6.权利要求3的马铃薯植株，其中的DNA序列包含SEQ ID NO：1的核苷酸338-993。

7.权利要求3的马铃薯植株，其中的DNA序列包含SEQ ID NO：3的核苷酸147-799。

8.权利要求2，3，4，5，6或7中任何之一的马铃薯植株，其中的DNA序列按反义取向连接于启动子序列。

9.权利要求4的马铃薯植株，其中该植株块茎在收获时测定的葡萄糖和果糖总浓度，比未转化的植株块茎在收获时测定的葡萄糖和果糖总浓度，低至少10％。

10.权利要求4的马铃薯植株，其中该植株块茎在收获时测定的葡萄糖和果糖总浓度，比未转化的植株块茎在收获时测定的葡萄糖和果糖总浓度，低至少30％。

11.权利要求4的马铃薯植株，其中该植株块茎在收获时测定的葡萄糖和果糖总浓度，比未转化的植株块茎在收获时测定的葡萄糖和果糖总浓度，低至少80％。

12.权利要求4的马铃薯植株，其中该植株块茎在4℃贮存约3个月后的葡萄糖和果糖总浓度，比未转化的植株块茎在相同条件下贮存后的葡萄糖和果糖总浓度，低至少10％。

13.权利要求4的马铃薯植株，其中该植株块茎在4℃贮存约3个月后的葡萄糖和果糖总浓度，比未转化的植株块茎在相同条件下贮存后的葡萄糖和果糖总浓度，低至少30％。

14.权利要求4的马铃薯植株，其中该植株块茎在4℃贮存约3个月后的葡萄糖和果糖总浓度，比未转化的植株块茎在相同条件下贮存后的葡萄糖和果糖总浓度，低至少39％。

15.权利要求4的马铃薯植株，其中该植株块茎在收获时测定的表示为所产生μmol NADPH/mg蛋白质/小时的总α葡聚糖磷酸化酶活性，比未转化的植株块茎在收获时测定的总α葡聚糖磷酸化酶活性，低至少10％。

16.权利要求4的马铃薯植株，其中该植株块茎在收获时测定的表示为所产生μmol NADPH/mg蛋白质/小时的总α葡聚糖磷酸化酶活性，比未转化的植物块茎在收获时测定的总α葡聚糖磷酸化酶活性，低至少30％。

17.权利要求4的马铃薯植株，其中该植株块茎在收获时测定的表示为所产生μmol NADPH/mg蛋白质/小时的总α葡聚糖磷酸化酶活性，比未转化的植株块茎在收获时测定的总α葡聚糖磷酸化酶活性，低至少66％。

18.权利要求4的马铃薯植株，其中该植株块茎在4℃贮存约3个月后测定的表示为所产生μmol NADPH/mg蛋白质/小时的总α葡聚糖磷酸化酶活性，比未转化的植株块茎在相同条件下贮存后的总α葡聚糖磷酸化酶活性，低至少10％。

19.权利要求4的马铃薯植株，其中该植株块茎在4℃贮存约3个月后测定的表示为所产生μmol NADPH/mg蛋白质/小时的总α葡聚糖磷酸化酶活性，比未转化的植物块茎在相同条件下贮存后的总α葡聚糖磷酸化酶活性，低至少30％。

20.权利要求4的马铃薯植株，其中该植物块茎在4℃贮存约3个月后测定的表示为所产生μmol NADPH/mg蛋白质/小时的总α葡聚糖磷酸化酶活性，比未转化的植株块茎在相同条件下贮存后的总α葡聚糖磷酸化酶活性，低至少70％。

21.权利要求5的马铃薯植株，其中该植株块茎在4℃贮存约3个月后测定的表示为所产生μmol NADPH/mg蛋白质/小时的总α葡聚糖磷酸化酶活性，比未转化的植株块茎在相同条件下贮存后的总α葡聚糖磷酸化酶活性，低至少10％。

22.权利要求5的马铃薯植株，其中该植株块茎在4℃贮存约3个月后测定的表示为所产生μmol NADPH/mg蛋白质/小时的总α葡聚糖磷酸化酶活性，比未转化的植株块茎在相同条件下贮存后的总α葡聚糖磷酸化酶活性，低至少28％。

23.权利要求4的马铃薯植株，其中该植株块茎在4℃贮存约6个月后测定的表示为所产生μmol NADPH/mg蛋白质/小时的总α葡聚糖磷酸化酶活性，比未转化的植株块茎在相同条件下贮存后的总α葡聚糖磷酸化酶活性，低至少10％。

24.权利要求4的马铃薯植株，其中该植株块茎在4℃贮存约6个月后测定的表示为所产生μmol NADPH/mg蛋白质/小时的总α葡聚糖磷酸化酶活性，比未转化的植株块茎在相同条件下贮存后的总α葡聚糖磷酸酶活性，低至少30％。

25.权利要求4的马铃薯块茎，其中该植株块茎在4℃贮存约6个月后测定的表示为所产生μmol NADPH/mg蛋白质/小时的总α葡聚糖磷酸化酶活性，比未转化的植株块茎在相同条件下贮存后的总α葡聚糖磷酸化酶活性，低至少69％。

26.权利要求5的马铃薯植株，其中该植株块茎在4℃贮存约6个月后测定的表示为所产生μmol NADPH/mg蛋白质/小时的总α葡聚糖磷酸化酶活性，比未转化的植株块茎在相同条件下贮存后的总α葡聚糖磷酸化酶活性，低至少10％。

27.权利要求5的马铃薯植株，其中该植株块茎在4℃贮存约6个月后测定的表示为所产生μmol NADPH/mg蛋白质/小时的总α葡聚糖磷酸化酶活性，比未转化的植株块茎在相同条件下贮存后的总α葡聚糖磷酸化酶活性，低至少39％。

28.权利要求4的马铃薯植株，其中该植株块茎在收获时测定的薯片记分，比未转化的植株块茎在收获时测定的薯片记分，高至少5％。

29.权利要求4的马铃薯植株，其中该植株块茎在收获时测定的薯片记分，比未转化的植株块茎在收获时测定的薯片记分，高至少30％。

30.权利要求4的马铃薯植株，其中该植株块茎在收获时测定的薯片记分，比未转化的植株块茎在收获时测定的薯片记分，高至少46％。

31.权利要求5的马铃薯植株，其中该植株块茎在收获时测定的薯片记分，比未转化的植株块茎在收获时测定的薯片记分，高至少5％。

32.权利要求5的马铃薯植株，其中该植株块茎在收获时测定的薯片记分，比未转化的植株块茎在收获时测定的薯片记分，高至少10％。

33.权利要求4的马铃薯植株，其中该植株块茎在4℃贮存约3个月后的薯片记分，比未转化的植株块茎在相同条件下贮存后的薯片记分，高至少5％。

34.权利要求4的马铃薯植株，其中该植株块茎在4℃贮存约3个月后的薯片记分，比未转化的植株块茎在相同条件下贮存后的薯片记分，高至少30％。

35.权利要求4的马铃薯植株，其中该植株块茎在4℃贮存约3个月后的薯片记分，比未转化的植株块茎在相同条件下贮存后的薯片记分，高至少89％。

36.权利要求5的马铃薯植株，其中该植株块茎在4℃贮存约3个月后的薯片记分，比未转化的植株块茎在相同条件下贮存后的薯片记分，高至少5％。

37.权利要求5的马铃薯植株，其中该植株块茎在4℃贮存约3个月后的薯片记分，比未转化的植株块茎在相同条件下贮存后的薯片记分，高至少10％。

38.权利要求4的马铃薯植株，其中该植株块茎在4℃贮存约4个月后的薯片记分，比未转化的植株块茎在相同条件下贮存后的薯片记分，高至少5％。

39.权利要求4的马铃薯植株，其中该植株块茎在4℃贮存约4个月后的薯片记分，比未转化的植株块茎在相同条件下贮存后的薯片记分，高至少30％。

40.权利要求4的马铃薯植株，其中该植株块茎在4℃贮存约4个月后的薯片记分，比未转化的植株块茎在相同条件下贮存后的薯片记分，高至少89％。

41.权利要求5的马铃薯植株，其中该植株块茎在4℃贮存约4个月后的薯片记分，比未转化的植株块茎在相同条件下贮存后的薯片记分，高至少5％。

42.权利要求5的马铃薯植株，其中该植株块茎在4℃贮存约4个月后的薯片记分，比未转化的植株块茎在相同条件下贮存后的薯片记分，高至少25％。

43.一种改善马铃薯块茎冷贮存特征的方法，包括提供一种马铃薯植株，此植株已被修饰降低了块茎中选自α葡聚糖L-型块茎磷酸化酶(GLTP)和α葡聚糖H-型块茎磷酸化酶(GHTP)的α葡聚糖磷酸化酶活性水平。

44.权利要求43的方法，包括：

将具有有效地连接于一个DNA序列的植物启动子序列的表达盒导入马铃薯植株，此DNA序列当在此植株中转录时，将抑制选自GLTP基因和GHTP基因的内源性α葡聚糖磷酸化酶基因的表达。

45.一种改善马铃薯块茎冷贮存特征的方法，包括：

将具有有效地连接于一个DNA序列的植物启动子序列的表达盒导入马铃薯植株，此DNA序列包含编码选自GLTP和GHTP的α葡聚糖磷酸化酶基因的至少20个核苷酸。

46.权利要求45的方法，其中编码的α葡聚糖磷酸化酶是GLTP。

47.权利要求45的方法，其中编码的α葡聚糖磷酸化酶是GHTP。

48.权利要求45的方法，其中的DNA序列包含SEQ ID NO：1的核苷酸338-993。

49.权利要求45的方法，其中的DNA序列包含SEQ ID NO：3的核苷酸147-799。

50.权利要求44，45，46，47，48，或49中任何之一的方法，其中的DNA序列按反义取向连接于启动子序列。