JPH08510645A

JPH08510645A - 貯蔵ジャガイモの品質を改良する方法

Info

Publication number: JPH08510645A
Application number: JP7500696A
Authority: JP
Inventors: バリー，ジエラード・フランンシス; キシヨア，ガネシユ・マーシー; スターク，デイビツド・マーテイン; ザレウスキ，ジエイムズ・コンラド
Original assignee: モンサント・カンパニー
Priority date: 1993-05-28
Filing date: 1994-05-18
Publication date: 1996-11-12
Also published as: HU9503394D0; EP0701618A1; CN1127016A; AU6947394A; CA2162383A1; US5648249A; HUT73468A; AU687409B2; PL178628B1; PL311755A1; PL180247B1; WO1994028149A1

Abstract

(57)【要約】環境温度または低減温度で貯蔵中のジャガイモ塊茎内のADPグルコース・ピロホスホリラーゼ活性のレベルを上昇させることにより、低温で貯蔵したジャガイモの品質を改良する方法、および貯蔵ジャガイモの休眠を延長する方法。ADPグルコース・ピロホスホリラーゼ酵素の遺伝子が低温誘導性プロモーターの調節下にあることを特徴とする新規DNA分子、植物細胞、ジャガイモ植物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】貯蔵ジャガイモの品質を改良する方法ジャガイモの長期貯蔵特性は塊茎品質の主要な決定要素を表す。休眠期間（収穫後と発芽前の期間）は上質のジャガイモを維持する上で非常に重要である。商業上、ジャガイモは加工前に長期間（最高10ヶ月以上）、しかも一般的には２〜 10℃の温度で保持されることがある。寒冷貯蔵（２〜６℃）と７〜12℃における貯蔵は、呼吸、水分喪失、微生物感染、および化学的発芽インヒビターの必要性を低減することにより、最高の長期条件を提供する（Burton、1989年）。しかし、低温は低温誘発性加糖につながり、結果として生じた高い糖濃度はフライ製品における容認できない褐色の一因となる（Coffinら、1987年、Weaverら、1978年）。蓄積されている糖類は主としてグルコース、フルクトース、およびスクロースであり、フライなど、様々な調理過程で加熱した際にMaillard反応によって遊離アミノ基と反応するのは主に還元糖（主にグルコースとフルクトース）であり、その結果褐色色素が形成される（Burton、1989年、Shallenbergerら、1959年）。一方、スクロースはカラメル化ならびに炭化を受けやすいため、フライにすると黒く着色する。還元糖濃度は0.2％以上の新鮮重量であれば褐色色素形成を生じるのに十分であり、したがってある種の加工にとって排除する価値がある。糖濃度が0.2％の限度より著しく高くなければ、ジャガイモ加工者は費用と時間のかかる湯通し処理により、糖濃度を低減させることができる。ジャガイモをより高温（18℃）で、より低い糖含量に改良することができるが、多くの場合、糖濃度が十分に低減しないうちに、この温度で発芽が開始するため、化学的発芽インヒビターを使用することが必要である（RyallとLipton、1979年、Hardenburgら、1986年）。しかし、改良は貯蔵設備の必要条件を増大させ、結果として製品の最終価格に影響を及ぼす。さらに、長期貯蔵期間の後では、改良は有効ではないことが証明されている（Coffinら、1987年）。化学薬品の過剰使用に関連した否定的な環境および健康の認識、ならびに現行の発芽インヒビターは間もなく禁止されるという事実が与えられた場合、還元糖が蓄積せず、デンプン濃度の保持力が大きい、化学薬品を使用せずに長期冷蔵に耐えることができるジャガイモ変種が必要である。長期貯蔵期間の後、ジャガイモ塊茎の発芽が問題になる。過剰発芽は市場価値を下げ、塊茎中のアルカロイド類の濃度を上昇させる可能性がある。遺伝子工学の過程で、有意に高濃度のデンプンを含むジャガイモ塊茎が得られた。参考として本明細書に組み入れるWO91／19806号（Kishore）および1991年６月７日に提出したU.S.S.N．07/709,663号を参照されたい。これらの塊茎では、デンプンおよびグリコーゲン生合成における重要なステップを触媒する、ADPグルコース・ピロホスホリラーゼ（ADPGPP）をコードする遺伝子を発現する。好適遺伝子は大腸菌由来のもので、得られる酵素は制御が不十分で、極めて活性な変異体である。例えばクラスＩパタチン（patatin）・プロモーターに由来する、前記遺伝子の突然変異体glgC16が塊茎特異的様式で発現されるとき、収穫時のデンプン濃度は非形質転換コントロール塊茎より高い。植物細胞における炭水化物代謝は複雑な過程である。多数の異なる酵素過程の操作により、冷蔵中の還元糖の蓄積が影響を受ける可能性がある。例えば、糖類がデンプンの再合成に使用され、その結果、遊離糖のプールを低減させる可能性がある。他の方法も、デンプン加水分解の阻害、解糖による糖類の除去、あるいはMaillard反応に関与しない他の型への糖の変換など、糖含量の低減により、ジャガイモの冷蔵特性を高めるのに役立つ可能性がある。これらの方法における挑戦は、望ましい結果をもたらし、低温で機能を達成し、ジャガイモ栽培家、加工者、および消費者が望む製品の品質を今まで通り保持する活性を同定することであろう。ホスホフルクトキナーゼ（PFK）は低温誘発性加糖過程において重要な役割を果たすことが示唆されている（KrugerとHammond、1988年、ap Reesら、1988年、 Dixonら、1981年、Claassenら、1991年）。ap Reesら（1988年）は、PFKが低温不安定であるため解糖がより著しく低減するという点で、低温処理は、炭水化物代謝の異なる経路に対して不釣り合いな影響を示すことを示唆した。スクロース産生に関しては、PFK活性の低減はヘキソースリン酸類の利用性を増大することにつながる。低温不安定ではないPFKを含み、しかも低温下で著量の糖を蓄積しないジャガイモの新育種クローンの観察結果により、この考えは更に裏付けられる。 PFK活性が増強すると、解糖および更なる代謝によるヘキソース除去によって、貯蔵中の糖蓄積が低減することが、欧州特許出願公開第0438904号で最近開示された。大腸菌由来のPFK酵素はジャガイモ塊茎に発現され、収穫時に分析した塊茎中の PFK活性が増強し、スクロース含量が低減することが報告されている。しかし、ピロリン酸：フルクトース６リン酸ホスホトランスフェラーゼ（PFP）は低温でも活性のままであることが証明されている（Claassenら、1991年）。PFPとPFKの２つの酵素は同じ反応を触媒するため、PFP活性は、PFKと同様、解糖にフルクトース６−リン酸を供給することができる。したがって、ジャガイモ塊茎の冷蔵品質を改善する上で本アプローチの有効性は不確かである。さらに、貴重な乾燥分含量が呼吸によって失われるため、解糖および更なる代謝による糖類の除去は、ジャガイモ塊茎の貯蔵特性を高める好ましい方法ではないと考えられる。糖類からデンプンへの再合成またはデンプン分解の緩徐化は、乾燥分が保持されることになるため、好ましいと考えられる。ジャガイモ塊茎内の糖類濃度を低減させる方法を提供し、併せて改善された品質の貯蔵ジャガイモを提供することが本発明の目的である。さらに、低温で貯蔵した後、改良の率および改良の程度が向上したジャガイモを提供することも、本発明の目的である。さらに、環境温度またはより低い温度で保存されたジャガイモの休眠を延長する方法を提供することも、本発明の目的である。発明の要約本発明は、低温貯蔵中のジャガイモ塊茎内に増加レベルのADPグルコース・ピロホスホリラーゼ（ADPGPP）酵素活性を提供することを含む、低温で貯蔵されたジャガイモの品質を改善する方法を提供する。冷蔵中のADPGPP酵素活性を高めることにより、低温で保存されたジャガイモ塊茎内の糖類濃度を低減する方法も提供する。さらに、貯蔵中のADPGPP酵素活性を高めることを含む、貯蔵ジャガイモの休眠を延長する方法を提供する。本法は、好ましくは、次に挙げる（ａ）〜（ｃ）によって完遂される。（ａ）（ｉ）植物内で機能して、標的植物組織においてRNA配列の産生を引き起こすプロモーター、（ii）アミノ末端色素体トランジット・ペプチドおよびADPグルコースピロホスホリラーゼ酵素を含む融合ポリペプチドをコードするRNA配列の産生を引き起こす構造DNA配列、（iii）植物細胞内で機能して転写終止を引き起こし併せてポリアデニル化ヌクレオチドをRNA配列の3′末端に付加させる3′非翻訳DNA配列、を含む組換え二本鎖DNA分子をジャガイモ植物細胞のゲノムに挿入すること、（ｂ）形質転換植物細胞を得ること、（ｃ）形質転換植物細胞から、改善された冷蔵特性を有する遺伝学的に形質転換されたジャガイモ植物を再生すること。（ａ）（ｉ）のプロモーターが、ジャガイモまたはArabidopsis由来のものなど、低温誘導性プロモーターであることを特徴とする、新規組換えDNA分子、植物細胞、および再生されたジャガイモ植物を提供する。これらの再生ジャガイモ植物は本発明の方法の全てに有用である。好ましいADPグルコースピロホスホリラーゼ（ADPGPP）酵素は、glgCとして周知の大腸菌由来のものであり、その遺伝子配列を配列番号：１として以下に示し、そのアミノ酸配列を配列番号：２として以下に示す。さらに好ましいADPGPP酵素は突然変異体ADPGPP、glgC16であり、その遺伝子配列を配列番号：３として以下に示し、そのアミノ酸配列を配列番号：４として以下に示す。この突然変異体は、活性化因子、フルクトース1,6二リン酸（FBP）が存在しない条件下で基質に対するアフィニティが高く、また低濃度のFBPで50％最大活性化に到達することが確認されている。本明細書で使用する、「貯蔵ジャガイモの品質を改良すること」という用語またはその変形は、貯蔵後に、糖類の濃度が低く、デンプンの損失がほとんどないか全くなく、発芽の出現率が低く、および／または改良率または改良の程度が高いジャガイモを提供することを意味するものとする。本明細書で使用される、「冷蔵」または「低温における貯蔵」という用語またはその変形は、冷蔵または環境温度で生じる15℃以下の温度に維持することを意味するものとする。本明細書使用される「低温誘導性プロモーター」という用語は温度が15℃以下のとき、対応するRNAの相補鎖を作るための鋳型としてDNA鎖の１本を使用してmR NAの転写を開始するDNA塩基配列を意味するものとする。本明細書で使用される「休眠を延長する」という用語またはその変形は、塊茎の呼吸および発芽の開始を遅らせることを意味するものとする。本明細書で使用される「glgC16ジャガイモ」、「glgC16塊茎」「glgC16系」という用語またはその変形は、色素体末端トランジット・ペプチド、好ましくは以下に記載するCTPの融合により形質転換されているジャガイモ系または塊茎を意味するものとする。図面の簡単な説明図１は、植物形質転換ベクターpMON17316のプラスミド・マップを示す。図２は、植物形質転換ベクターpMON17279のプラスミド・マップを示す。発明の詳細な説明デンプン・ホスホリラーゼおよびデンプン加水分解酵素が冷蔵中のデンプン分解の原因であり、その結果グルコース１−リン酸および／またはグルコースがデンプンから形成される。グルコースはグルコース１−リン酸に変換されることもあり、ADPGPP酵素、したがってこの酵素を発現している塊茎におけるデンプン生合成の基質として作用する。グルコース１−リン酸はインベルターゼまたはスクロース・シンターゼによるスクロースの分解生成物から形成されることもある。貯蔵中に、インベルターゼの作用によりスクロースよりむしろ還元糖が主として蓄積する（Pressey、1966年）。インベルターゼ活性により放出されたグルコースおよびフルクトースはデンプン生合成の基質の前駆体の役割もする。 ADPGPPの発現は低温誘発性加糖の影響を迎え撃つ効果的な手段である。冷蔵中にデンプン生合成を維持することによるヘキソース・プールに対する持続的要求は、糖蓄積が減少し、その結果として塊茎が加工に適したままであるというようなことと仮定される。しかし、その他の機序も、このADPGPPの作用の原因になることがある。加えて、糖濃度を低く保ち、呼吸、したがって出芽の開始を遅らせることにより、任意の温度で貯蔵されたジャガイモの休眠を延長することも達成されうる。前記のことを達成するために、ADPGPPを発現する遺伝子がジャガイモ植物のゲノム内に組み込まれる。例えば、ホスホフルクトキナーゼ類（EP0438904号）、 α−アミラーゼ類およびβ−アミラーゼ類、リン酸スクロースシンターゼ類、ヘキソキナーゼ類、デンプン・ホスホリラーゼ類、脱分枝酵素類、またはホスホグルコムターゼ類など、ジャガイモのデンプンおよび／または糖の代謝／異化を調節するため、この遺伝子を他の遺伝子（センス配向またはアンチセンス配向において）と組み合わせることが可能である。以上の補足的遺伝子は植物、微生物または動物に由来するものであってもよい。あるいは、ジャガイモ・クローンに突然変異を誘発させ、その結果としてADPG PP酵素活性レベルを高めることにより、貯蔵塊茎中のADPGPPのレベル上昇を達成することも可能である。高値の比活性、高値のVmax、負のエファクター（Pi）による阻害低下、または最大活性を得るための活性化因子（3-PAG）への依存性低下の表現型に基づいて、このような塊茎を選択することができる。二本鎖DNA型に存在する植物遺伝子の発現は、RNAポリメラーゼ酵素によるDNA の１本鎖からのメッセンジャーRNA（mRNA）の転写、それに続く核内部でのmRNA 一次転写体のプロセッシングを含む。このプロセッシングは、ポリアデニレート・ヌクレオチドをRNAの3′末端に付加する3′非翻訳領域を含む。 DNAのmRNAへの転写は、通常「プロモーター」と呼ばれるDNAの領域によって調節される。プロモーター領域には、DNAと結合し、対応するRNAの相補鎖を作るための鋳型としてDNA鎖の１本を使用してmRNAの転写を開始するようRNAポリメラーゼに信号をおくる塩基配列が含まれている。植物細胞において活性な多数のプロモーターが文献に記載されている。この中にはノパリン・シンターゼ（NOS）およびオクトピン・シンターゼ（OCS）プロモーター（Agrobacterium tumefaciensの腫瘍誘導性プラスミドが担持しているプロモーター）、カリフラワー・モザイク・ウイルス（CaMV）19Sおよび35Sなどのcaulimovirusプロモーターやfigwortモザイク・ウイルス35S−プロモーター、リブロース1,5−ビス−ホスフェート・カルボキシラーゼの小サブユニット（ssRUBISCO、非常に豊富な植物ポリペプチド）由来の光誘導性プロモーター、クロロフィルa/b結合蛋白遺伝子プロモーターなどが含まれる。以上のプロモーターは全て、植物に発現された様々な種類のDNA構築物の作製に使用されてきたものである。例えば、PCT公開WO84/02913号を参照されたい。以下の実施例１および２に使用されたクラスＩパタチン・プロモーターは、極めて活性であり、併せて塊茎特異的であることが証明されている（Bevanら、198 6年、Jeffersonら、1990年）。ジャガイモ塊茎ADPGPP遺伝子、大サブユニットおよび小サブユニット（Mullerら、1990年）、スクロース・シンターゼ（Salanoub atとBelliard、1987年、1989年）、22kd蛋白複合体およびプロテイナーゼ・インヒビター類などの主要な塊茎蛋白類（Hannapel、1990年）、顆粒結合デンプン・シンターゼ遺伝子（GBSS）（Rohdeら、1990年）、および他のクラスＩパタチンおよびクラスII パタチン（Rocha-Sosaら、1989年、Migneryら、1988年）など、塊茎特異的発現または発現強化を示す他の多数の遺伝子が知られている。本発明に有用であると予想される他のプロモーター類としては、通常はデンプン生合成酵素遺伝子または修飾酵素遺伝子の発現と関連したジャガイモ塊茎における発現強化または特異的発現を示すプロモーター類や、例えば皮質強化発現または髄強化発現または周皮強化発現によりジャガイモ塊茎内に異なる型の発現を示すか、塊茎発育中の異なる時期に発現されるプロモーター類がある。これらのプロモーター類の例としては、顆粒結合デンプン・シンターゼおよび他のデンプン・シンターゼ、分枝酵素類（Kossmannら、1991年、Blennow，A．とJohansson，G.,1991年、WO92/14827 号、WO92/11375号）、不均等化酵素（Takahaら、1993年）、脱分枝酵素類、アミラーゼ類、デンプン・ホスホリラーゼ類（Nakanoら、1989年、Moriら、1991年）、ペクチン・エステラーゼ類（Ebbelaarら、1993年）、40kDの糖蛋白ユビキチン、アスパラギン酸プロテイナーゼ・インヒビター（Stukerljら、1990年）、カルボキシペプチダーゼ・インヒビター、塊茎ポリフェノール M95196号およびM95197号）、想定上のトリプシン・インヒビターおよび他の塊茎 cDNA類（Stiekemaら、1988年）の遺伝子に関するプロモーター、β−アミラーゼおよびスポラミン類（Ipomoea batatas由来、Yoshidaら、1992年、Ohtaら、1991 年）のプロモーターなどがある。 KishoreはPCT公開WO91/19806号で、様々なジャガイモ・プロモーターの調節下で細菌性ADPGPPを発現すれば、ジャガイモ塊茎中のデンプン含量が増加することを証明した。冷貯蔵中の低還元糖蓄積を達成するために、デンプンの含有率が高い塊茎で開始することは、本法の必要条件ではない。低温誘導性プロモーターの調節下でgl gC16遺伝子をジャガイモに発現させることができるので、貯蔵条件中に、GlgC16 酵素のみが存在する。この酵素が存在すれば、貯蔵中のデンプン生合成を維持することになり、したがって糖類の蓄積を防止することになる。植物プロモーターを始めとする低温誘導性プロモーターの例は多数である（Ya maguchi−Shinozakiら、1993年、Qoronflehら、1992年、Minerら、1992年、Houd eら、1992年、Whiteら、 1992年、Huangら、1987年、Murataら、1992年、Gilmourら、1992年、Hajelaら、 1990年、Kurkelaら、1990年）。ジャガイモ塊茎中に低温誘発蛋白が単離されることが実証されている（van Berkelら、1991年、van Berkelら、1994年）。これらの蛋白の低温誘導発現を駆動するプロモーター類は、当業者に利用できる方法で単離することができる。その一法は、低温ストレス塊茎由来のcDNAライブラリーの作製および次の非ストレス・ライブラリーとの示差ハイブリッド形成による低温特異的クローンの同定を含む。非低温特異的様式で発現されたクローンが構築中にライブラリーから除去されることを特徴とする消去ライブラリーを使用すれば、この過程をさらに効率良くすることができる。これらの制御された転写物から誘導されたcDNAのヌクレオチド配列を決定しても、対応するプロモーター領域の単離が容易になる。このようなcDNA類の各配列は、多数のジャガイモ塊茎低温制御転写物で知られている（van Berkelら、1994年）。次に、低温特異的として同定されたcDNAプローブを使用して、ゲノム・クローンからプロモーター・フラグメントを同定することができる。このような低温制御プロモーターが同定され、配列が決定されている（Yamaguchi−ShinozakiおよびShinozaki、1994年、およびBaker、1994年）。プロモーター・フラグメントを使用して、低温誘導様式で大腸菌glgC16遺伝子を直接発現することができる。加えて、冷蔵ジャガイモ塊茎中の糖濃度に影響を及ぼし、その結果塊茎の品質を改善するよう、このプロモーターの調節下で、他の幾つかのADPGPP酵素の１つを発現させることができる。ハイブリッド・プロモーターまたは、異なるプロモーター類の制御要素の融合体を使用して、低温制御プロモーターの発現水準を高めたり、このような発現を望み通りの植物器官にいっそう特異的にすることも可能である。異なる組織において発現が優先的である（Zhuら、1993年）か、他のストレス効果よりも低温ストレス効果によって遺伝子が特異的に制御されている（ WilhelmとThomashow、1993年、Nordinら、1993年）低温制御遺伝子が報告されている。さらに、長さが９塩基対から数百塩基対の大きさの、明確にされた特異的配列が異なる低温ストレス作用およびアブシジン酸濃度などの他のストレス作用および渇水ストレスに対する応答性を制御することが証明されている（Yamaguch i-ShinozakiおよびShinozaki、1994年）。塊茎に優先的に発現するプロモーター類は周知であり、この優先的発現に必要なこれらのプロモーターの領域も決定されている（Jeffersonら、1990年、Liuら、1990年）。以上のデータにより、例えばcor78、cor15a、またはcor15b由来のプロモーターなどのプロモーター類やパタチン・プロモーターに由来する低温応答性小要素間の融合体を構築することが可能である。パタチン・プロモーターの−500bp領域ないし−2000bp領域に対し、融合体が作られる。ポリメラーゼ連鎖反応や部位特異的突然変異誘発など、現在の分子遺伝学的技法およびオリゴヌクレオチド合成設備により、これらの融合が可能になる。デンプン合成が行われる色素体に酵素を輸送するには、ADPGPP遺伝子と一緒にアミノ末端色素体トランジットペプチドを使用することが必要である。あるいは、トランジット・ペプチドを省略することもでき、色素体に存在するDNA内に遺伝子を挿入することもできる。Svabらが1990年に報告した方法を使用して葉緑素形質転換を実施することも可能である。突然変異誘発による改変ADPグルコース・ピロホスホリラーゼ遺伝子の調製低減されたアロステリック制御（「脱制御(deregulated)」）を受けるADPグルコースピロホスホリラーゼ遺伝子を使用することによって、またさらに好ましくは十分な触媒活性を維持しているが有意なレベルのアロステリック制御を受けない（「非制御(unregulated)」）ADPグルコースピロホスホリラーゼ遺伝子を使用することによって、絶対に必要ではないが、好結果が得られることが、当業者には明確に理解されるであろう。大腸菌のglgC 16遺伝子について記載されている通り、大腸菌または別の適当な宿主で、細菌の ADPグルコース・ピロホスホリラーゼ酵素または植物のADPグルコース・ピロホスホリラーゼの構造コーディング配列に突然変異を誘発し、グリコーゲン産生増大をスクリーニングすることができる。選択された植物に触媒作用を著しく阻害しないレベルで存在するモジュレーター類（活性化因子／インヒビター）のみに左右されるADPグルコース・ピロホスホリラーゼ酵素をコードしている遺伝子を使用すると、酵素（遺伝子）改変を必要としないことを十分に理解すべきである。次に、本明細書に記載されている通り、これらの「非制御」ADPグルコース・ピロホスホリラーゼ遺伝子または「脱制御」ADPグルコース・ピロホスホリラーゼ遺伝子を植物に挿入して、デンプン含量が高いトランスジェニック植物を得ることができる。例えば、任意のADPグルコース・ピロホスホリラーゼ遺伝子を大腸菌B菌株AC70 R1-504（Leung、1986年）にクローニングすることができる。本菌株は欠陥のあるADPグルコース・ピロホスホリラーゼ遺伝子を有し、他のグリコーゲン生合成酵素の５〜７培の抑制を受ける。大腸菌glgCプロモーターまたは他の任意の細菌プロモーターの調節下にあるプラスミドにADPグルコース・ピロホスホリラーゼ遺伝子／cDNAを組み込むことができる。次いで、この構築物を部位特異的又はランダムな突然変異誘発のいずれかに掛けることができる。突然変異誘発後、1％グルコースを含む富裕培地で細胞を平板培養した。コロニーが発育した後、平板にヨウ素溶液（0.2重量／体積％I₂、水中0.4重量／体積％KI、Creuzet-Sigal、1 972年）を充満させた。非突然変異大腸菌が入っている同一平板と比較することにより、より多くのグリコーゲンを産生しているコロニーを、より濃い染色によって検出することができる。突然変異誘発法でプロモーター突然変異が引き起こされた可能性があるため、第一ラウンドのスクリーニングで得られる想定上のあらゆるADPグルコース・ピロホスホリラーゼ突然変異体は、そのADPグルコース・ピロホスホリラーゼ遺伝子を非突然変異ベクターに再クローニングしなければならず、生じるプラスミドを、同じ様式でスクリーニングすることになる。両ラウンドのスクリーニングで得られた突然変異体は、そのADPグルコース・ピロホスホリラーゼ活性を活性化因子およびインヒビターの存在下および非存在下で検定する。突然変異ADPグルコース・ピロホスホリラーゼの活性化因子およびインヒビターに対する応答を非突然変異酵素と比較することによって、新しい突然変異体を特性化することができる。 1987年のPlaxtonとPreissによる報告で、トウモロコシ内乳ADPグルコース・ピロホスホリラーゼは、他の植物ADPグルコース・ピロホスホリラーゼに似た制御特性を有することが明らかにされた（PlaxtonとPreiss、1987年）。彼らは、トウモロコシの内乳ADPグルコース・ピロホスホリラーゼは、活性化因子（3-PGA）の非存在下で活性が高く、インヒビター（P_i）に対する感受性が低いことを主張する初期の報告は、単離手法中の酵素の蛋白分解性開裂に起因することを明らかにした。ADPグルコース・ピロホスホリラーゼ遺伝子を蛋白分解的に開裂したトウモロコシ内乳ADPグルコース・ピロホスホリラーゼに類似した酵素を産生するように改変させることによって、低減されたアロスティック制御が達成されることになる。 ADPグルコース・ピロホスホリラーゼ活性について大腸菌の液体培養物を分析するため、細胞を遠心分離機で回転させ、細胞ペースト１グラム当たり約２mlの抽出バッファー（0.05MグリシルグリシンpH7.0、5.0mM DTE、1.0mM EDTA）に再懸濁させる。フレンチプレス（French Press）を２回通過させることにより、細胞を溶解させる。細胞抽出物を微量遠心分離機で５分間回転させ、G-50スピンカラムを通過させることにより、その上清を脱塩する。公表されている手法（Haugenら、1976年）の変法でADPグルコース合成について酵素活性分析する。各100μlのアッセイは、10μmoleのヘペス（Hepes）pH7.7 、50μgのBSA、0.05μmoleの［¹⁴C］グルコース−１−リン酸、0.15μmoleのATP 0.5μmoleのMgCl₂、0.1μｇの結晶性酵母無機ピロホスファターゼ、1mMのモリブデン酸アンモニウム、酵素、望ましい活性化因子またはインヒビターおよび水を含んでいる。反応混合液を37℃で10分間インキュベートし、60秒間沸騰させて停止させる。分析物を微量遠心分離機で回転させ、40μlの上澄をSynchrom Synchr opak AX-100陰イオン交換HPLCカラムに注入する。65mMのKpi pH5.5でサンプルを溶出させる。未反応の［¹⁴C］グルコース− １−リン酸が７〜８分頃に溶出し、［¹⁴C］ADPグルコースが13分頃に溶出する。 ADPグルコースのピークに存在する放射能の量によって酵素活性を決定する。植物ADPGPP酵素活性は、正のエファクター（3-ホスホグリセレート；3-PGA）と負のエファクター（無機リン酸塩；P_i）の両者によってしっかりと制御され（ GhoshとPreiss、1966年、CopelandとPreiss、1981年、SowokinosとPreiss、1982 年、Morellら、1987年、PlaxtonとPreiss、1987年、Preiss、1988年）、３-PGA ：P_iの比がADPGPP活性の調節によるデンプン生合成の制御において主要な役割を果たす（SantariusとHeber、1965年、Heldtら、1977年、KaiserとBassham、1979 年）。植物ADPGPP酵素は２つの大／「収縮（shrunken）」サブユニットと２つの小／「脆弱（Brittle）」サブユニットのヘテロ四量体であり（Morellら、1987 年、Linら、1988年a、1988年b、Krishnanら、1986年、Okitaら、1990年）、ヘテロ四量体はADPGPPの最も活性な型であることを示唆する強力な証拠がある。この考えは、どちらかのサブユニットが欠乏している植物「無デンプン」突然変異体の単離（TsaiとNelson、1966年、 DickinsonとPreiss、1969年、Linら、1988年a、1988年b）および低い酵素活性だけしかないことが判明した小サブユニットの「ADPGPP」ホモ四量体（Linら、198 8年b）の特性化によって裏付けられる。加えて、提唱された両サブユニットのエフェクター相互作用残基が同定された（Morellら、1988年）。活性型酵素の直接証拠および精製ジャガイモ酵素について報告された動力学的データの更なる裏付けは、大腸菌におけるジャガイモADPGPP活性の発現およびこの物質の動力学的特性とジャガイモ塊茎の動力学的特性の比較によって得られる（Iglesiasら、1993 年）。大腸菌glgC16およびglgC-SG5やCL1136などの関連突然変異体の単離を可能にした方法と類似した方法で、植物ADPGPPの非制御型酵素変異体を同定し、特性化する。大サブユニットの場合も小サブユニットの場合も、単子葉植物と２双子葉植物の両方から、多数の植物ADPGPP cDNA、またはこのような各cDNAの一部がクローニングされている（Andersonら、1989年a、Oliveら、1989年、Mullerら、1990 年、Bhaveら、1990年、du JardinとBerhin、1991年、Smith-WhiteとPreiss、199 2年）。植物cDNA類によりコードされた各蛋白および細菌類由来の各蛋白は、高度の保存性を示す（Bhaveら、1990年）。特に、やはり酵素機能およびエフェクター相互作用に関与する残基の一部を含む、高度に保存された領域が同定されている（Morellら、1988年、du JardinとBerhin、1991年）。ジャガイモ塊茎ADPGPPサブユニット遺伝子の各クローンは単離されている。この中には、同じ遺伝子のほぼ全長のcDNAクローンを備えたゲノム・クローンの第１エキソン由来の配列を付加することによって組み立てた完全な小サブユニットおよび大サブユニットのほぼ完全な遺伝子が含まれる。組み立てられた小サブユニット遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号：７）およびアミノ酸配列（配列番号：８）を以下に示す。ここに示すヌクレオチド配列は、以下のようにして最初に単離された遺伝子とは異なる。オリゴヌクレオチド・プライマー配列を使用して部位特異的突然変異誘発により大腸菌および植物発現ベクターへの遺伝子クローニングを容易にするために、BglII＋NcoI部位をATGコドンに導入した。オリゴヌクレオチド・プライマー配列を使用して停止コドンにSacIを導入した。 SacI部位は3’クローニング部位の役割をする。オリゴヌクレオチド・プライマー配列を使用して、内部BglII部位を除去した。組み立てられたこの遺伝子は、P recA−遺伝子10L発現カセットのrecAプロモーターのコントロール下で大腸菌に発現され（Wongら、1988年）、測定可能なレベルの蛋白を産生した。成熟遺伝子を発現させるため、オリゴヌクレオチド・プライマー配列を使用して部位特異的突然変異誘発により、開始メチオニン・コドンを配置した。ほぼ完全な大サブユニット遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号：９）およびアミノ酸配列（配列番号：10）を以下に示す。オリゴヌクレオチド・プライマー配列を使用して、部位特異的突然変異誘発により、開始メチオニン・コドンを成熟Ｎ末端に配置した。開始メチオニンの目的は、この大サブユニット遺伝子の大腸菌における発現を容易にすることである。 HindIII部位は停止コドン後103bpにあり、3′クローニング部位として作用する。5’RACE法（Rapid Amplification of cDNA Ends（cDNA末端の迅速増幅）、Fro hman、1990年、Frohmanら、1988年、Lohら、1989年）により、完全な大ADPGPP遺伝子が単離される。本法の場合、オリゴヌクレオチド・プライマーは次の通りである：はじめの２つは、それぞれLohら（1989年）のANpolyCプライマーおよびANプライマーと同等であり、３番目は大ADPGPP遺伝子の配列の逆方向相補体である。PC R5′配列産物はEcoRI／HindIII/BamHI-PstIフラグメントとしてクローニングされ、既存の遺伝子部分と一緒に容易に組み立てられる。１％のグルコースを含むルリア寒天（Luria-Agar）平板上の24〜48時間コロニーのヨード染色で高値のグリコーゲン合成を示す、突然変異誘発大腸菌培養由来のコロニーを最初に評点し、次に、ADPGPP酵素活性の正のエフェクターおよび負のエフェクターに対する、これらの単離コロニー由来のADPGPP酵素の応答を特性化することにより、ADPGPPの弱制御化酵素突然変異体が同定される（Cattaneoら、1969年、Preissら、1971年）。このような植物ADPGPP酵素の変異体の単離に、類似したアプローチが使用される。各サブユニット遺伝子の発現システムが与えられれば、様々な既知の手段のいずれかにより、遺伝子または精製されたDNAを含む培養物に対して、物理的にも化学的にも各遺伝子の突然変異誘発が別々に行われる（Miller、1972年）。別のアプローチでは、ヌクレオチド類の誤った組み込みを高率に導く条件である Mn⁺⁺阻害イオンの存在下で、完全な遺伝子に対してPCR法（Ehrlich、1989年）が使用される。遺伝子の特定の領域にちょうど隣接するプライマーとともにPCR法を使用し、この突然変異フラグメントを非突然変異遺伝子フラグメントに再クローニングすることも可能である。無作為合成オリゴヌクレオチド法を使用し、合成反応でヌクレオチド類を混合することにより、高度に突然変異を起こした短い遺伝子領域を生じさせ、結果としてこの領域の全ての位置で誤った組み込みが起こる可能性もある。この領域を残りの遺伝子に再挿入するのに使用される制限部位により、この小領域をフランキングする。その結果生じた培養物または形質転換細胞のうち、コントロールより高いグリコーゲン・レベルを示すものを、標準ヨード法でスクリーニングする。ADPGPP活性のみが欠乏しており、表現型としてはグリコーゲン−マイナスであり、glgCによって完全なグリコーゲン−プラスになる大腸菌株で、このスクリーニングを実施することが好ましい。この大腸菌株は、グリコーゲン産生に必要なこれら他の活性を保持しなければならない。異なる選択可能なマーカー遺伝子を有する適合性プラスミド上に遺伝子を配置することにより、同じ大腸菌宿主で両遺伝子がともに発現され、ヘテロ四量体形成を最大にするため、これらのプラスミドも細菌宿主中で類似のコピー数を持つ。このような発現系の例は、pMON17335とpMON17336の組み合わせである（Iglesiasら、1993）。別個のプラスミドを使用することにより、１遺伝子のみの突然変異集団、または他の遺伝子を発現しているコンピテント宿主への形質転換後の第２の遺伝子と一緒に突然変異を起こした集団のスクリーニングが可能になり、また同じ宿主においてこれらの組み合わせにより突然変異した２種類の集団のスクリーニングが可能になる。ヨード染色が増強したコロニー由来のプラスミドDNAの再クローニング後、表現型を確認した発現ベクターにADPGPPコーディング配列を再クローニングし、ADPGPP活性およびそのエフェクター分子に対する応答を決定した。改良型変異体は増加V_max、負のエフェクター（P_i）による阻害低下、または最大活性を得るための活性化因子（3- PGA）への依存性低減を示す。このような改良された特性の分析には、0.045mM（ I_0.5＝0.045mM）のP_i存在下または0.075mM（A_0.5＝0.075mM）の3-PGA存在下におけるADPGPP活性の測定が含まれる。有用な変異体はこのP_i濃度で40％未満の阻害を示し、この3-PGA濃度で50％を越える活性を示す。改良型変異体を単離し、サブユニットまたは諸サブユニットの応答性を決定した後、ヌクレオチド配列決定により突然変異を測定する。部位特異的突然変異誘発によるこの変化を再現することと、活性化因子およびインヒビターの存在下でADPGPP活性を再分析することにより突然変異を確認する。次に、変化した細菌の発現型からアミロプラスト標的配列を含む植物型への変化を含む領域を再クローニングすることにより、あるいは天然型の完全ADPGPP植物遺伝子の部位特異的突然変異誘発により、この突然変異を等価の完全なADPGPP cDNA遺伝子に転移させる。実施例１ glgC16発現用DNAベクターの構築大腸菌glgC16遺伝子を植物細胞に発現させるため、また酵素を色素体（plasti d）に到達させるために、色素体標的トランジット・ペプチド（以後、CTP/ADPグルコース・ピロホスホリラーゼ遺伝子と呼ぶ）をコードしているDNAおよび適当な植物制御領域に前記遺伝子を融合することが必要であった。これは、必要な配列を含む一連のプラスミド・ベクターにglgC16遺伝子をクローニングすることによって達成された。プラスミドpLP226は、HincII部位でpUC8ベクターにクローニングされた、Hinc IIフラグメント上のglgC16遺伝子を含む（Leungら、1986年）。pLP226は、ミシガン州立大学のDr.Jack Preissから入手し、塩化カルシウム法で調製した、凍結したコンピテント大腸菌JM101細胞に形質転換した（Sambrookら、1989年）。形質転換細胞を100μg/mlのアンピシリンを含む2XYT（下）平板上で平板培養した。急速アルカリ抽出法（RAE）により5ml一晩培養からプラスミドpLP226を精製した（BirnboimとDoly、1979年）。葉緑体トランジット・ペプチドをコード化しているDNAにglgC16遺伝子を融合するため、その遺伝子の5’末端にNcoI部位も必要であった。CTP/ADPグルコース・ピロホスホリラーゼ遺伝子を次のベクター内に移動させるには、終止コドンの下流にSacI部位も必要であった。これらの部位を導入するために、約20ngの急速アルカリ抽出精製プラスミドpLP226を鋳型に使用してPCR反応（#13）を行った。製造元（Perkin Elmer Cetus）の推奨に従って、反応を組み立てた。プライマーはQSP3およびQSP7であった。glgC16遺伝子の開始コドンを含むことになるNcoI部位を導入するため、QSP3を設計した。QSP7プライマーはglgC16遺伝子の3’非翻訳領域でハイブリッド形成し、SacI部位を付加した。1分94℃変性ステップ、２分50℃アニーリングステップ、３分72℃伸張ステップで、熱サイクラー（Therma l Cycler）を30サイクル、プログラムした。各サイクルの後、伸 SacIおよびHindIIIで消化しておいた、HindIII部位で連結した改変型Arabidop sis 小サブユニットCTPのDNAを有するベクターpGEM3zf＋（Promega、Madison、WI）に、PCR産物をクローニングした。このCTPのDNA配列およびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号：５および配列番号：６に示す。線状化したベクターを５単位のウシ腸アルカリホスファターゼで、56℃、30分間処理する。次に、ベクターと、新しいNcoIおよびSacI部位を含むglgC16遺伝子を有するPCR#13フラグメントの両方を、アガロース・ゲル上で泳動し、DEAE膜に結合させることにより、そのフラグメントを精製した。DEAE膜によるフラグメントの精製に使用したプロトコールは、SchleicherとSchuellのもので、“Binding and Recovery of DNA and RNA Using S and S DEAE Membrane（S-S DEAE膜を使用するDNAおよびRNAの結合および回収）と題するものであった。連結#5は、pGEM3zf＋を含む改変型Arabidopsis SSU CTPのDNAにglgC16遺伝子を融合した。連結には、NcoIおよびSacIで消化しておいたベクター３μlと、やはりNcoIおよびSacIで切断し、ゲルで再精製しておいたPCR#13生成物３μlとを用いた。５μl（合計20μlのうち）の連結#5を凍結したコンピテントJM101細胞に形質転換し、アンピシリンを含む2XYT平板（16g/lバクトトリプトン（Bactotr yptone）、10g/l酵母抽出物、 10g/l NaCl、pH7.3、1.5％寒天で固化）で形質転換細胞を平板培養した。一晩増殖させた後、平板からサンプル１を取り上げた。このサンプルを4mlの2 XYT培地中でインキュベートし、37℃で一晩増殖させた。急速アルカリ抽出法でプラスミドを単離し、EcoRI、NcoI、およびEcoRIとNcoIでDNAを消化させた。この消化物をアガロース・ゲルで分離すると、予測通りのフラグメントが得られた。サンプル１から単離したプラスミドはpMON20100と呼ばれ、pGEM3zf＋、改変型Arabidopsis SSU CTPのDNA、glgC16遺伝子で構成された。この融合体は、SP6ポリメラーゼ・プロモーターから転写されることが可能な位置にあった。この構築物のADPグルコース・ピロホスホリラーゼが、単離したレタス葉緑体に移入するのを試験するためには、CTP/ADPグルコース・ピロホスホリラーゼ融合体が転写され、翻訳されて「³⁵S］標識ADPグルコース・ピロホスホリラーゼを産生することが必要であった。SP6ポリメラーゼによる転写のDNA鋳型を作るため、pMON20100のCTP/ADPグルコース・ピロホスホリラーゼ領域をPCRで増幅し、大量の線状DNAを生成させた。これを行うために、急速アルカリ抽出で精製しておいたpMON 20100約0.1μlをPCR反応体#80の鋳型として使用した。プライマーは市販のSP6プロモーター・プライマー（Promega）およびオリゴQSP7（配列番号：20）であった。SP6プライマーはベクターのSP6プロモーターにハイブリッド形成し、SP6プロモーター配列全体を含んでいた。したがって、このオリゴでプライムしたPCR 産物はSP6ポリメラーゼの認識配列を含むことになる。QSP7（配列番号：20）プライマーは、glgC16遺伝子の3′非翻訳領域でハイブリッド形成することになる。これは、glgC16終止コドンの下流にSacI部位を導入するために使用したプライマーと同じであった。94℃で１分変性ステップ、55℃で２分アニーリングステップ、72℃で３分伸張ステップで、熱サイクラーを30サイクル、プログラムした。各サイクルの後、伸張ステップを15秒追加した。５μlのPCR反応体#80をアガロース・ゲル上で泳動し、DEAE膜に結合させることによって精製した。DNAを溶出させ、20μlのTEに溶解した。イン・ビトロ転写反応においてSP6RNAポリメラーゼ中に、２μlのゲル精製PCR#80産物を使用した。反応条件は供給者（Promega）が大量のRNA（100μl反応）合成について記述したものであった。ウサギ網赤血球溶解物システム（Promega）を用いるイン・ビトロ翻訳に、PCR反応体#80DNAから作られたRNAを使用した。前記の通り、イン・ビトロ葉緑体移入分析（chloroplast import assay）にpMON20100（すなわち、PCR反応体#80）から作製した³⁵S標識蛋白を使用した。葉緑体移入アッセイのサンプルを処理した後、サンプルを３〜17％のポリアクリルアミド勾配のSDS-PA GEゲルによる電気泳動法にかけた。40％メタノールおよび10％酢酸を含む溶液中で20〜30分間、ゲルを固定した。次に、ゲルをEN³HANCE^TMに20〜30分間、浸漬し、続いてゲル乾燥器でゲルを乾燥させた。強化スクリーンおよび一晩曝露を使用して、オートラジオグラフィーでゲルを撮像した。その結果、単離された葉緑体に融合蛋白が移入されたことが実証された。次に、pMON20100中の構築体を、pMON999から単離した強化CaMV35Sプロモーター（Kay,R．1987年）およびNOS3′末端（Bevan，M.1983年）に融合されるように操作した。PCR反応体114にはプラスミドpMON20100が鋳型として含まれ、プライマーQSM11およびプライマーQSM10を使用した。QSM11は、改変型Arabidopsis SSU CTPのDNAにアニーリングし、ATG開始コドンから7bp上流に BglII部位を生じさせた。QSM10はglgC16遺伝子の3’末端にアニーリングし、終止コドンの直後にXbaI部位を付加し、終止コドンの5bp後にSacI部位を付加した。先にglgC16遺伝子に付加しておいたSacI部位は終止コドンの約100bp下流であった。94℃で１分変性ステップ、55℃で２分アニーリングステップ、72℃で３分伸張ステップで、熱サイクラーを25サイクル、プログラムした。各サイクルで、伸張ステップに15秒加えた。 PCR反応体#114のうち95μl（総量100μlから）をエタノール沈殿させ、TE20μ lに再懸濁した。このうち５μlを、Bgl II（４単位）およびSacI（10単位）により37℃で一晩消化させた。強化CaMV35SプロモーターおよびNOS3’末端を含むベクターpMON999、５μl（５μg）を同じ様式で消化させた。制限酵素で消化させた後、DNAをアガロース・ゲル上で泳動し、 DEAE膜に結合させることによって精製した。各DNAをTE20μlに溶解した。総量20 μl中で、１μlのPCR114を３μlのベクターと連結させた。連結混合物を14℃で７時間、インキュベートした。連結物10μlを、凍結したコンピテントMM294細胞に形質転換し、アンピシリン100μg/mlを含むLB平板（10g/lバクトトリプトン（ Bacto-tryptone）、5g/l酵母抽出物、10g/lNaCl、固化するための1.5％寒天）で平板培養した。コロニーを選び取り、アンピシリン100μg/mlを含むLB培地5mlが入っている試験管内で一晩インキュベートした。急速アルカリ抽出に一晩培養物 5mlを使用し、プラスミドDNAを単離した。DNAをEcoRIで消化させ、個々のアリコートをNotIで消化させた。これらのサンプルをアガロース・ゲルで分析した後、プラスミドpMON20102が、glgC16の特徴である497bpのEcoRIフラグメントを有することを確認した。このプラスドには、強化CaMV35Sプロモーター、改変型Arabi dopsis SSU CTPのDNA、glgC16遺伝子、およびNOS3’末端を含む2.5kbのNotIも含まれていた。次に、pMON20102プラスミドを使用して、塊茎特異的方法でglgC16遺伝子を発現し、ジャガイモの形質転換に使用されることになるDNAベクターを構築した。この構築物はジャガイモ塊茎にADPGPPの特異的発現を引き起こし、塊茎中のデンプン・レベルを上昇させる。ジャガイモ形質転換に使用されるベクターは、Agrobacterium仲介性植物形質転換ベクターpMON886の誘導体である。pMON886プラスミドは、次に挙げる十分に特性化されたDNAセグメントで構成される。細菌のスペクチノマイシン／ストレプトマイシン（Spc/Str）耐性をコードし、しかも大腸菌およびAgrobacterium tumefaciens における選択決定要素であるトランスポゾンTn7からの0.93kbのフラグメントを単離した（Flingら、1985年）。これを、植物発現に適するように操作したキメラ・カナマイシン耐性遺伝子に結合し、形質転換組織の選択を可能にする。キメラ遺伝子は0.35kbのカリフラワー・モザイク・ウイルス35Sプロモーター（P-35S）（Odellら、1985年）、0.83kbのネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼII型遺伝子（NPTII）、およびノパリン・シンターゼ遺伝子（NOS3′）の0.26kbの3’非翻訳領域（Fraleyら、1983年）から成る。次のセグメントは、R K2プラスミドに由来する0.75kbの複製起点（ori-V）である（Stalkerら、1981年）。これを、大腸菌における保守のための複製起点（ori-322）、およびAgrobacterium tumefaciens細胞への接合的移入のためのbom部位を提供するpBR 322のSalI〜PvuIの3.1kbのセグメントに結合する。次は、ノパリン−Ｔ型−DNA 右境界領域を含むpTiT37プラスミド由来の、0.36kbのPvuIフラグメントである（ Fraleyら、1985年）。遺伝子を塊茎特異的プロモータのコントロール下に置くことによって、主として塊茎における発現に適するように、glgC16遺伝子を操作した。Arabidopsis t haliana 由来のSSU1Aの由来のものから誘導された葉緑体標的配列（CTP）をコードしているＮ末端蛋白部分とのC末端融合物として合成されるために、GlgC16蛋白は植物細胞内の色素体（plastid）に指向した（Timkoら、1989年）。この移入過程の間にCTP部分を除去して、GlgC16酵素を放出させる。他の植物発現シグナルも、発現カセットのコーディング部分から下流に位置するNOS3′配列によって提供される3’ポリアデニル化配列を含む。このカセットを、次のように組み立てた。HindIII-BamHIフラグメントとして、pBI241.3プラスミドからパタチン・プロモーターを切除し（pBI241.3プラスミドは、1323位に付加されたHindIIIリンカーおよび2289位に付加されたBamHIリンカーを含む1323位の AccI部位から2289位のDraI部位までを含むパタチン−１プロモーター・セグメントを含む（位置はBevanら、1986年の配列を指す）、Bevanら、1986年）、CTP1-g lgC16融合物（pMON20102由来のBglII-SacIフラグメント）およびHindIIIおよびS acIで切断したpUC型プラスミド・ベクターと一緒に連結した（これらの、ベクターのクローニング部位には、NotI認識部位が並んでいる）。次に、このカセットを、glgC16遺伝子の発現がNPTII（カナマイシン）遺伝子のそれと同じ向きの、p MON886のNotI部位として導入した。この誘導体は、pMON20113と呼ばれ、Kishore のWO91/19806号の図７に図示されている。植物形質転換／再生ヘルパー・プラスミドpRK2013を使用する３親（triparental）接合システムにより、pMON20113ベクターを、非病原体Agrobacterium tumefaciens菌株に移動させた（Dittaら、1980年）。クラウンゴール病の原因である植物ホルモン遺伝子を除去することによって非病原性としたTiプラスミドを担持する、非病原性菌株ABIを使用した。本ABI株は、非病原性pTiC58プラスミドpMP90RKを担持するA20 8 Agrobacterium tumefaciensである（KonczとSchell、1986年）。非病原性Ti プラスミドはABI株に接合させた後に、pMONベクターの自律複製に必要なtrfA遺伝子機能を提供する。植物組織をABI::pMON接合体とともにインキュベートすると、非病原性pMP90RK Tiプラスミドによりコードされるvir機能によって、ベクターは植物細胞に移入する。細菌のADPGPP遺伝子（配列番号：１）をコードしているpMON20113構築物を、次の手法でRusset Burbankジャガイモ変種Williamsに形質転換した。Russet Bur bankジャガイモを形質転換するため、25mg/Lのアスコルビン酸を補充したPM培地（MurashigeとSkoog（MS）無機塩、30g/lスクロース、0.17g/lNaH₂ PO₄ H₂O、0. 4mg/l塩酸チアミン、および100mg/lのミオイノシトール、pH6.0で2g/lのゲルライト（Gelrite）により固化）8mlが入っているサンデー・カップ中で、Russet B urbankの新芽無菌培養を維持する。新芽が長さ約5cmに達したとき、3〜5mmの幹節間（stem internode）セグメントを切除し、４日齢平板培養由来のAgrobacter ium tumefaciensの一晩培養の1:10希釈液を接種する。1/10P培地（Jarretら（1 980年）のカゼンインを含まない、1/10強度のMS無機塩および有機追加物、30g/l のスクロースおよび8.0g/l寒天）に重層したタバコ細胞支持細胞層1.5mlの上にかけた滅菌フィルター・ペーパー上で、幹外植片を20℃で２日間、共培養する。共培養後、MS無機塩、カゼインを除くJa rretら（1980年）の有機追加物、5.0mg/lのゼアチン・リボシド（ZR）、および0 .10mg/lの酢酸ナフタレン（NAA）（Jarretら、1980a、1980b）を含む、カルス誘導用の完全強度のP-1培地に外植片を移す。細菌の増殖を抑制するため、カルベニシリン（500mg/l）およびセフォタキシム（100mg/L）を含め、形質転換細胞を選択するため、100mg/lのカナマイシンを加える。４週後、新芽形成を促進するため、NAAの代わりに0.3mg/lのジベレリン酸（GA 3）を含む以外は同じ組成の培地に外植片を移す。新芽誘導培地に移した約２週間後に新芽は発育しはじめる。これらの新芽を切除し、出根用PM培地のバイアルに移す出根培地で約４週後、植物を土壌に移し、徐々に寒気にさらして強くする。形質転換細胞を選択するため、50mg/lのカナマイシンを含む出根用PM培地上に新芽を置くことにより、酵素ネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼIIによって与えられた新芽のカナマイシン耐性を試験する。培地中に再生したRusset Burbank Williams植物を６インチ（〜15.24cm）のポットに移植し、温室条件下で成熟するまで栽培した。塊茎を収穫し、室温で２日間、コルク質化させた。長さ2cm以上の全ての塊茎を集め、高湿下、３℃で貯蔵した。貯蔵塊茎の比重およびデンプン測定寒冷（３℃）貯蔵の３ヶ月後および４ヶ月後に、各植物由来の最も大きい塊茎２〜３個の、比重（SG）を測定したところ、代表的な重量は塊茎当たり20〜40g であった。比重を測定する前に２〜３時間、塊茎を室温まで暖まらせたが、再調整（recondition）はしなかった。SG＝空気中の重量／（空気中の重量−水中の重量）である、空気中の重量／水中の重量法により、比重を算出した。比重を基にしたパーセント・デンプンおよびパーセント乾燥分の計算は、下記の式に従った（Von Scheele、1937年）。％デンプン＝17.546＋（199.07）（SG-1.0988）％乾燥分＝24.182＋（211.04）（SG-1.0988）記述されている通りに（Linら、1988年）、貯蔵塊茎組織の新鮮な、中央区分で、デンプン分析を実施した。組織を収穫する前に、塊茎を暖めなかった。簡単に記述すると、約100mgの中央区分を切断し、重量を測定して、1.5mlの遠心管に入れ、ドライアイスで凍結させた。Savant Speed-Vac Concentrator内で、安定した重量まで該組織を乾燥させ、最終乾燥重量を測定した。80％エタノール1mlで３回、70℃で、処理当たり20分間、抽出することにより、可溶性糖類を最初に除去した。最終インキュベーションの後、Speed-Vac Concentrator内で完全に乾燥することにより、残りのエタノールを除去した。0.2Mの水酸化カリウム400μlに固形物を再懸濁し、すりつぶし、100℃で30分間インキュベートし、デンプンを可溶化させた。その溶液を冷却し、1Nの酢酸80μlを加えて中和させた。37℃で30分間、14.8単位の膵液α−アミラーゼ（Sigma Chemical，St．Louis）で処理することにより、デンプンをグルコースに分解し、続いて55℃で60分間、10単位のアミログルコシダーゼ（Sigma Chemical，St．Louis）で処理した。Sigma（St．Lo uis）ヘキソキナーゼ・キットで、酵素的消化で放出されたグルコースを測定し、これらの値を使用してデンプン含量を算出した。糖分析塊茎を３℃に貯蔵し、糖分析前に室温で再調整することはしなかった。貯蔵塊茎から中央切片を入手し、新鮮重量を測定し、 Savant Speed-Vac Concentrator内で完全に乾燥させる前にドライアイスで組織を凍結させた。サンプル当たりのおおよその新鮮重量は100mgであった。乾燥塊茎材料を粗くすりつぶし、80％エタノール0.5mlで３回、70℃で、抽出当たり20 分間、糖を抽出した。各インキュベーションの後、微量遠心分離機で２分間、可溶性物質を回転させ、上澄を集めた。３回の抽出物全ての上澄をあわせ、乾燥させ、100mMのTrisバッファー、pH7.5、１mlに再懸濁した。各糖分析に、サンプル 10μlを使用した。各糖サンプルで、製造元のプロコールに従って、グルコース［HK］診断用キット（Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO）を使用してグルコース含量を測定した。簡単に記述すると、再構成した試薬1mLをサンプル10μlと共に、室温で10分間インキュベートし、水中のサンプル10μlの吸光度を減算して340nmにおける吸光度を測定することにより、サンプル濃度を決定した。次式で、パーセント・グルコースを算出した。％グルコース＝［(A₃₄₀×2.929)／mg新鮮重量］×100％グルコース決定用の上記反応にホスホグルコイソメラーゼ１μgを加え、その結果得られたパーセント・グルコース＋フルクトースの値をパーセント・グルコースから減算することにより、フルクトース含量を測定した。グルコースＨＫ分析にホスホグルコイソメラーゼ１μgおよび酵母インベルターゼ100μgを加え、インキュベーション時間を室温で30分間延長することにより、スクロース含量を決定した。上記のように、得られたグルコース含量およびフルクトース含量の値を減算してパーセント・スクロースを決定した。貯蔵塊茎のウエスタン・ブロット分析分析用組織を分離する前に、３℃で貯蔵した塊茎を室温に暖めることはしなかった。ウエスタン・ブロット分析のため、100mMのTris pH7.5、35mMのKCl、5mM のジチオトレイトール、５mMのアスコルビン酸塩、１mMのEDTA、１mMのベンズアミジン、および20％のグリセロール中、完全に乾燥し、すりつぶして粗く粉末にした塊茎組織1:1から蛋白を抽出した。Pierce BCA法を使用して抽出物の蛋白濃度を測定し、３〜17％のSDSポリアクリルアミド・ゲルで蛋白を分離させた（Lae mmli、1970年）。精製大腸菌ADPGPPに対するヤギ抗体およびアルカリ・ホスファターゼ結合ウサギ抗ヤギ抗体（Promega，Madison，WI）を使用して大腸菌ADPGPP を検出した。フライ色の測定大腸菌glgC16遺伝子を発現しているトランスジェニックジャガイモ8系統、および大腸菌glgC16遺伝子を発現しないpMON20113形質転換事象由来の系統の組み合わせから成るコントロール20系統、および非トランスジェニックRusset Burba nkコントロール数系統を、アイダホ州Parmaの路地条件下で栽培した。塊茎を収穫し、40℃で２ヶ月間貯蔵した。各系統の代表サンプルから中央切片を採取し、 375°Ｆの大豆油で３分30秒間、揚げることにより、全てのジャガイモ系統のフライ色を測定した。光起電測定によりフライ色を決定し、新鮮な冷凍フライ用の USDA色分類チャートに従って、その値を記録した。結果塊茎は全て、同一変種（Russet Burbank Williams82）、同一齢、同一栽培条件下で並べて栽培した植物から収穫した。ウエスタン・ブロット分析では、大腸菌ADPGPPのレベルは、収穫時に決定されたレベルと本質的に同等であり（表１）、大腸菌ADPGPP蛋白のレベルは冷蔵中安定していると考えられた。高湿下、３℃ で貯蔵した塊茎の分析から、大腸菌glgC16遺伝子発現塊茎は、コントロール塊茎より５〜６培少ない還元糖を蓄積していることがわかる（表２、３、４、５、および６）。スクロース濃度は、コントロール塊茎とトランスジェニック塊茎との間で類似していたが、デンプン濃度はトランスジェニック塊茎で有意に高値であった。以上の結果から、大腸菌glgC 16遺伝子発現塊茎では、貯蔵中にデンプンが分解されるにつれて、生じた糖類はデンプンに再合成される傾向が認められるが、コントロール塊茎では糖類は蓄積する傾向がみられる。大腸菌glgC16遺伝子を発現しているトランスジェニックジャガイモは路地条件下で栽培し、GlgC16ジャガイモ系統由来の塊茎は、異なるコントロール数系統と一緒に40°Ｆ（４℃）で貯蔵した。２ヶ月間の冷蔵後、糖含量と直接相関関係があるフライ色を決定した。トランスジェニックジャガイモ塊茎の平均フライ色は、同一条件下で貯蔵したコントロール塊茎の色（より濃い色）に比べて有意に改善されており（明るい）（表７）、大腸菌glgC16遺伝子発現塊茎では糖濃度が低いことが証明された。３℃で14週間貯蔵した、路地栽培塊茎のサンプル中の還元糖含量の直接測定で、大腸菌glgC16遺伝子発現塊茎はコントロールより有意に少ない還元糖を含んでいたため、フライ色の結果が支持された（表８）。トランスジェニックジャガイモ植物由来の塊茎の、冷蔵後の改良率および改良（reconditioning）の程度を試験した。比重が1.083以上の塊茎を産生するトランスジェニック系統のフライ色は、コントロールに比べて、65°Ｆにおける改良率および改良の程度が高かった（表９）。実施例２低温貯蔵後、糖濃度上昇のため、ジャガイモがフライに適さなくなることがしばしばある。これらの貯蔵ジャガイモは、湯通し（blanching）や再調整（recon ditioning）などの処理によって改善される。前者の処理ではジャガイモ薄片を熱湯で処理することによって糖を除去し、また後者では、より高温（〜65°Ｆ）における塊茎貯蔵中に糖が代謝される。湯通しを使用して主に酵素を不活性化するが、糖が高い時、このステップが使用される期間は正常の何倍にもおよぶ。このステップを延長すると、生成物の回収率が低下し、香りが喪失することになり、時間がかかり、高エネルギー消費を要し、生物学的酸素要求量が高い老廃物を作り出し、その結果、廃水に関する制限が追加される。再調整には管理された温度の貯蔵設備が必要であり、最適結果を得るには、異なる温度における多数のステップを必要とする可能性がある。高温では、また時間とともに、発芽および病気の出現率が上昇する。冷蔵したGlgC16塊茎から作ったフライ類のフライ色は、多くの場合、コントロールより低値（良好）であり、３〜４ヶ月後であっても再調整を必要としないほど低値の場合もある。これらの試験は、50°Ｆで２ヶ月間貯蔵した塊茎にも拡大され、次には38°Ｆで３ヶ月間貯蔵した塊茎にも拡大され、しかも改良率の測定も含められている。 pMON17316（パタチン3.5プロモーターを含む）およびpMON17279（ジャガイモA DPGPPの小サブユニットを含む）ベクターを用いて形質転換した植物の塊茎、ならびに前記のパタチン1.0プロモーター／glgC16ベクターを含む植物の塊茎を試験した。以上のベクターは、次の様に構築した。プラスミドpBI240.7からパタチン3.5プロモーターを入手した（Bevan、1986年）。HindIII部位（-3500位）から-337位のXbaI部位までの、pBI240.7から3.5プロモーターの大半を切除し、XbaI部位から＋22位のBglII部位（以前はDraI部位）までのプロモーターの残りと、pMON17280を形成するためのBglII部位を提供するベクターへの３重連結で結合させた。このとき、この後者のプラスミドは、（ pMON17282における）塊茎発現カセットを形成するために前述した、完全な3.5プロモーターの３重連結のベクターおよびpMON20102由来の色素体標的ペプチドGlgC16融合物として作用した。パタチン3.5プロモーター、色素体標的ペプチド−GlgC16融合物、およびNOS3′配列から成る本カセットを、NotIフラグメント上の、参照により本明細書に組み込まれるWO92/04449号（1991年）にBarryらが開示し、記載したTiプラスミド・ベクターである、植物形質転換ベクターpMON17227に導入して、pMON17316を形成した。図１を参照のこと。ジャガイモ塊茎ADPGPP小サブユニット遺伝子のプロモーター、配列番号：24を、ゲノムクローン１〜２のXbaI-BglIIフラグメントとして入手し、XbaIおよびBl uescript II KS-のBamHI部位に挿入した（Nakataら、1992年）。使用したプロモーター・フラグメントは、想定上の開始メチオニンから約2.0kbの5′のClaI部位から、このATGより12bp前に位置するHindIII部位にわたる部分から成る。別のpU Cベクターによるサブクローニングによって、BglII部位を、このHindIII部位に隣接して配置し、後者の部位を介してCTP標的配列およびglgC16コーディング配列の融合物に連結した。植物の3’認識配列を有する本カセットを植物形質転換ベクターにクローニングしてpMON17279 を形成させた（やはり、同じ小さなジャガイモADPGPPプロモーターから大腸菌ui dA［GUS］遺伝子が発現されるカセットを含む）。図２を参照のこと。以上のベクターを、Agrobacterium形質転換に続きグリホセート選択により、ジャガイモ細胞に挿入した。選択可能な因子としてグリホセートを使用してジャガイモを形質転換するために、２mlのLBSCK中で適切なAgrobacteriumを一晩培養した。翌日、細菌類をMSOで１：10に希釈するか、0.2〜0.33の光学密度の示度が確定するまで希釈した。無菌条件下、25mg/mlのアスコルビン酸を補充したPM培地で３週間栽培しておいたジャガイモ植物の幹から葉を取り除き、幹を３〜５mm のセグメントに切断し、前述の希釈細菌を接種した。準備した共培養平板に外植片を載せた。共培養平板には、湿らせたフィルター・ペーパーを上に載せたTxD 細胞1.5mLを含む1/10 MSOが入っていた。平板当たり約50の外植片を載せた。２日間の共培養期間の後、5.0mg/lのゼアチン・リボシド、10mg/lのAgNO₃および0. 1mg/lのNAAを含むカルス誘導培地に外植片を２日間、載せた。次に、選択用の0. 025mMグリホセートを含む、カルス誘導培地に外植片を移した。４週間後、5.0mg /lのゼアチン・リボシド＋10mg/lのAgNO₃および0.3mg/lのGA3、ならびに選択用に0.025mMグリホセートを含む新芽誘導培地に外植片を載せた。８週に、新芽が出現しはじめた。４週間毎に12週間、新たな新芽誘導培地に外植片を移した。新芽を切除し、約２週間または土壌に植えられるほど十分な大きさになるまで、PM培地に載せた。パタチン1.0（HS01、HS03、MT01）、パタチン3.5（HS13）、およびジャガイモ ADPGPP（HS10）プロモーターの小サブユニット由来のGlgC16を発現する系など、 GlgC16 Russet Burbank系統のデータを以下に示す（表９）。多数のGlgC16ジャガイモ（変種Atlantic）系統も試験した（MT01、パタチン1.0プロモーター）。2 .0以上のスコアで、加工業者は一般に湯通しして製品を許容できるものにしなければならないであろう。冷蔵をやめた直後に、多数のRusset Burbank GlgC16系統が2.0未満のフライ・スコアを示したので、直接加工することができた。非常に短期間の再調整（reconditioning）後に、多数の系統で2.0未満のフライ色スコアが得られる。この再調整応答の改善は、固形分が増加した系統でみられ、比重の上昇を示さなかったGlgC16系統でもみられる。この改善は、塊茎にGlgC16発現させるために使用したこれらのプロモーターの全てでみられる。貯蔵をやめてすぐにフライにする可能性がある系統および急速に再調整する系統を得ることの効果は、GlgC16 Atlanticに関しても証明される。試験した系統の比重はAtlanticコントロールの比重と有意に違わなかったため、MT01-27系統も、塊茎中のデンプンを増加させるために、強化された冷蔵特性を得る必要がないことを示した。実施例３ 60°Ｆで貯蔵した塊茎集団（これらの塊茎は前もって38〜40°Ｆで３ヶ月間貯蔵してあった）を対象に、GlgC16の発芽遅延に対する作用を試験した。塊茎（４〜６）を間隔をあけて試験し、0.5cmを越える発芽の有無をスコア化した（表10 ）。50％が発芽するまでの日数として表した発芽の遅延は、多くの場合、GlgC16 系統で改善され、試験した３変種でみられ（Russet Burbank、Atlantic、および Norchip）、パタチン1.0（HS01、HS03、およびMT01）プロモーター、パタチン3. 5（HS13）プロモーター、およびジャガイモ小ADPGPP（HS10）プロモーターからG lgC16が発現された系統で観察され、固形分含量が増加した系統および増加しなかった系統で認められた。遅延した系統は、土壌に植えた時は正常に発芽した。実施例４異なる２種類のプロモーターの制御下にあるglgC16を用いて形質転換したジャガイモで追加試験を実施した。ジャガイモ塊茎ADPGPPの大サブユニット用のプロモーターを２種類のジャガイモ変種、Russet Burbank（配列番号：25）およびDesiree（配列番号：26）から単離した。ADPグルコース・ピロホスホリラーゼの大サブユニット由来のcDNAの5′末端由来のプローブとのプラーク・ハイブリッド形成を使用してクローンを同定した。植物コンセンサスにより、これらのクローンの翻訳開始部位（ATG）を同定した（Lutck eら、1987年）。PCRプライマーを使用して、ATGの下流の3’末端にBAMHI部位を導入し、両プロモーターの5′末端にHINDIII部位を導入した。E35Sプロモーターの代わりに、結果として得られた600bpのRusset Burbankプロモーターおよび160 0bpのDesireeプロモーターをそれぞれ独立にpMON10098に連結し、CTP-glgC16キメラ遺伝子を含むpMON20102由来のBglII-SacIフラグメントと融合させた。これらのプラスミドからE35S-NPTII-Nosカセットを除去し、上で検討した、pMON1722 7のFMV-CTP-CP4-E9カセットを含むNotI-SalIフラグメントと置き換え、結果としてpMON21522が得られた（Russet Burbank由来プロモーター）およびpMON21523（ Desiree由来プロモーター）。pMON10098プラスミドは次に挙げるDNA領域を含む。１）形質転換組織の選択を可能にするための、植物発現のために操作したキメラ・カナマイシン耐性遺伝子。キメラ遺伝子は0.35Kb カリフラワー・モザイク・ウイルス35Sプロモーター（P-35S）（ Odellら、1985年）、0.83Kb NPTII遺伝子、NOS3′の0.26Kb 3’−非翻訳領域から成る。２）T-DNA左境界領域を含む、pTi15955オクトピンTiプラスミド由来のD raIフラグメントまでの0.45Kb ClaI（Barkerら、1983年）、３）RK2プラスミド（ori-V）由来の複製起点を含む0.75Kbセグメント（Stalkerら、1981年）、４）大腸菌における維持のための複製起点（ori-322）、およびAgrobacterium tume faciens 細胞への接合的移入のためのbom部位を提供するpBR322の3.0Kb SalI-Pst Iセグメント、５）細菌のスペクチノマイシン／ストレプトマイシン耐性（Spc/S tr）（Flingら、1985年）をコードするトランスポゾンTn7から単離し、大腸菌及びAgrobacterium tumefaciensにおける選択のための決定要素である、0.93Kbフラグメント、６）ノパリン−T型−DNA右境界領域を含む、pTiT37プラスミド由来の0.36Kb PvuI-BclIフラグメント（Fraleyら、1985年）、および７）最後のセグメントは、プロモーター配列（P-E35S）の二重化により強化された0.65Kbのカリフラワー・モザイク・ウイルス（CaMV）35Sプロモーター（Kayら、1987年）、ユニークなクローニング部位を数個有する合成マルチリンカー、エンドウマメrbcS-E9遺伝子（E93′）の0.7Kb 3′非翻訳領域である。３親交配システムを使用して、プラスミドをAgrobacterium tumefacie ns 菌株ABIに交配し、Russet Burbank Williams82系統を形質転換するために使用した。 pMON22152およびpMON21523を用いて形質転換したRusset Burbankの貯蔵特性の改善も明らかにされており、そこではジャガイモ塊茎ADPGPPの大サブユニット用のプロモーターからGlgC16が発現されている。路地栽培塊茎は最初、収穫後約１ヶ月間50°Ｆで貯蔵し、その後４ケ月間、40°Ｆの寒冷貯蔵に入れた。１試験で、貯蔵をやめてすぐに、これらの塊茎から作ったフライのフライ色を、フライ材料の反射率を測定することによって評価した（低値が好ましい）。再調整における応答を決定するため、２番目の試験で、冷蔵塊茎の一部を55°Ｆに移した。塊茎の幹と芽体末端の両方について、これらの評価のデータを表11に示す。すぐにフライにした場合も再調整後にフライにした場合も、多くの系統がコントロールより良好な色値を示した。例えば、 pMON21522-144、pMON21523-79、および他の多くがコントロールより優れた劇的な改善を示した。明白であり、しかも本発明に固有である利点とともに上述した全ての目的および結果を達成するために、本発明を効果的に改変しうることが上記の説明から解るであろう。ある種の特徴およびサブコンビネーションが有用であり、他の特徴およびサブコンビネーションを参照せずに使用することも可能である。これは、請求の範囲により企図されるか、あるいは請求の範囲内である。本発明の範囲から逸脱することなく、本発明から多くの可能な実施態様がなされる可能性があるため、本明細書に記述された全ての事項または図面を添えて示した全ての事項は例示であって制限の意味ではないと解釈すべきである。下記の文献は明細書中に引用されたものである

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者スターク，デイビツド・マーテインアメリカ合衆国、ミズーリ・63026、フエントン、サマーポイント・レーン・1218 (72)発明者ザレウスキ，ジエイムズ・コンラドアメリカ合衆国、アイダホ・83716、ボイズ、イースト・ネイチヤー・ドライブ・ 3009

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）ジャガイモ内で作用して塊茎内でRNA配列を産生させるプロモーターと、（ｂ）アミノ末端色素体トランジット・ペプチドおよびＡＤＰグルコース・ピロホスホリラーゼ酵素を含む融合ポリペプチドをコードするRNA配列を産生させる構造DNA配列と、（ｃ）植物細胞内で作用して、転写を終止させ、RNA配列の3′末端にポリアデニル化ヌクレオチド類を付加させる3′非翻訳DNA配列を含む、組換え２本鎖DNA分子を用いてジャガイモ植物を形質転換することにより低減温度で貯蔵中の塊茎内に増加レベルのADPグルコース・ピロホスホリラーゼ酵素活性を提供すること、およびこのような形質転換ジャガイモ植物から塊茎を得ることを含み、前記ADPグルコース・ピロホスホリラーゼ酵素が脱制御されていることを特徴とする、低減温度で貯蔵したジャガイモ塊茎の品質を改良する方法。２．前記ADPグルコース・ピロホスホリラーゼ酵素が大腸菌glgC酵素であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。３．前記ADPグルコース・ピロホスホリラーゼ酵素が突然変異体大腸菌酵素であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。４．前記ADPグルコース・ピロホスホリラーゼ酵素が配列番号：４に示した配列をもつことを特徴とする、請求項３に記載の方法。５．ａ）ジャガイモ内で作用して塊茎内でRNA配列を産生させるプロモーターと、（ｂ）アミノ末端色素体トランジット・ペプチドおよびADPグルコース・ピロホスホリラーゼ酵素を含む融合ポリペプチドをコードするRNA配列を産生させる構造DNA配列と、（ｃ）植物細胞内で作用して、転写を終止させ、RNA配列の3 ′末端にポリアデニル化ヌクレオチド類を付加させる3′非翻訳DNA配列を含む、組換え２本鎖DNA分子を用いてジャガイモ植物を形質転換することにより低減温度で貯蔵中増加レベルのADPグルコース・ピロホスホリラーゼ酵素活性を提供すること、およびこのような形質転換ジャガイモ植物から塊茎を得ることを含み、前記ADPグルコース・ピロホスホリラーゼ酵素が脱制御されていることを特徴とする、低減温度で貯蔵したジャガイモ塊茎内の糖類の濃度を低減させる方法。６．前記ADPグルコース・ピロホスホリラーゼ（ADPGPP）酵素が大腸菌glgC酵素であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。７．前記ADPグルコース・ピロホスホリラーゼ酵素が突然変異体大腸菌酵素であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。８．前記ADPグルコース・ピロホスホリラーゼ酵素が配列番号：４に示した配列をもつことを特徴とする、請求項７に記載の方法。９．操作配列に、（ａ）植物内で作用して、標的植物組織内でRNA配列を産生させる低温誘導性プロモーターと、（ｂ）アミノ末端色素体トランジット・ペプチドおよびADPグルコース・ピロホスホリラーゼ酵素を含む融合ポリペプチドをコードするRNA配列を産生させる構造DNA配列と、（ｃ）植物細胞内で作用して、転写を終止させ、RNA配列の3′末端にポリアデニル化ヌクレオチド類を付加させる3′非翻訳DNA配列とを含み、前記ADPグルコース・ピロホスホリラーゼ酵素が脱制御されていることを特徴とする、組換え、２本鎖DNA分子。 10．前記ADPグルコース・ピロホスホリラーゼ酵素が大腸菌 glgC酵素であることを特徴とする、請求項９に記載のDNA分子。 11．前記ADPグルコース・ピロホスホリラーゼ酵素が突然変異体大腸菌酵素であることを特徴とする、請求項９に記載のDNA分子。 12．前記ADPグルコース・ピロホスホリラーゼ酵素が配列番号：４に示した配列をもつことを特徴とする、請求項11に記載のDNA分子。 13．前記プロモーターがジャガイモに由来することを特徴とする請求項９に記載のDNA分子。 14．操作配列に、（ａ）植物内で作用して、標的植物組織内でRNA配列を産生させる低温誘導性プロモーターと、（ｂ）アミノ末端色素体トランジット・ペプチドおよびADPグルコース・ピロホスホリラーゼ酵素を含む融合ポリペプチドをコードするRNA配列を産生させる構造DNA配列と、（ｃ）植物細胞内で作用して、転写を終止させ、RNA配列の3′末端にポリアデニル化ヌクレオチド類を付加させる3′非翻訳DNA配列とを含み、前記ADPグルコース・ピロホスホリラーゼ酵素が脱制御されていることを特徴とする、組換え２本鎖DNA分子を含む、ジャガイモ植物細胞。 15．前記ADPグルコース・ピロホスホリラーゼ酵素が大腸菌glgC酵素であることを特徴とする、請求項14に記載のジャガイモ植物細胞。 16．前記ADPグルコース・ピロホスホリラーゼ酵素が突然変異体大腸菌酵素であることを特徴とする、請求項14に記載のジャガイモ植物細胞。 17．前記ADPグルコース・ピロホスホリラーゼ酵素が配列番号：４に示した配列をもつことを特徴とする、請求項16に記載のジャガイモ植物細胞。 18．前記プロモーターがジャガイモに由来することを特徴とする、請求項14に記載のジャガイモ植物細胞。 19．請求項14に記載の細胞から成るジャガイモ植物。 20．前記ADPグルコース・ピロホスホリラーゼ酵素が大腸菌glgC酵素であることを特徴とする、請求項19に記載のジャガイモ植物。 21．前記ADPグルコース・ピロホスホリラーゼ酵素が突然変異体大腸菌酵素であることを特徴とする、請求項19に記載のジャガイモ植物。 22．前記ADPグルコース・ピロホスホリラーゼ酵素が配列番号：４に示した配列をもつことを特徴とする、請求項21に記載のジャガイモ植物。 23．前記プロモーターがジャガイモに由来することを特徴とする、請求項19に記載のジャガイモ植物。 24．（ａ）ジャガイモ内で作用して塊茎内でRNA配列を産生させるプロモーターと、（ｂ）アミノ末端色素体トランジット・ペプチドおよびADPグルコース・ピロホスホリラーゼ酵素を含む融合ポリペプチドをコードするRNA配列を産生させる構造DNA配列と、（ｃ）植物細胞内で作用して、転写を終止させ、RNA配列の 3′末端にポリアデニル化ヌクレオチド類を付加させる3′非翻訳DNA配列を含む、組換え２本鎖DNA分子を用いてジャガイモ植物を形質転換することにより貯蔵中の塊茎内に増加レベルのADPグルコース・ピロホスホリラーゼ酵素活性を提供すること、およびこのような形質転換ジャガイモ植物から塊茎を得ることを含み、前記ADPグルコース・ピロホスホリラーゼ酵素が脱制御されていることを特徴とする、貯蔵ジャガイモ塊茎の休眠を延長させる方法。 25．前記貯蔵が低減温度であることを特徴とする、請求項24に記載の方法。 26．前記ADPGPP酵素が低温誘導性プロモーターの調節下にある大腸菌glgC酵素であることを特徴とする、請求項25に記載の方法。 27．前記ADPGPP酵素が低温誘導性プロモーターの調節下にある突然変異体大腸菌酵素であることを特徴とする、請求項25に記載の方法。 28．前記ADPGPP酵素が配列番号：４に示した配列をもつことを特徴とする、請求項27に記載の方法。 29．前記塊茎が請求項19に記載の植物に由来することを特徴とする、請求項24 に記載の方法。