TW201720929A - 馬鈴薯栽培品種y9 - Google Patents
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Abstract
本發明揭示一種命名為Y9之馬鈴薯栽培品種。本發明係關於：馬鈴薯栽培品種Y9之塊莖、馬鈴薯栽培品種Y9之種子、馬鈴薯栽培品種Y9之植株、馬鈴薯栽培品種Y9之植物部分、由馬鈴薯栽培品種Y9生產之食品產品及用於產生藉由將馬鈴薯栽培品種Y9與其自身或與另一馬鈴薯變種雜交而產生之馬鈴薯植物的方法。
Description
本發明係關於命名為Y9之新穎馬鈴薯栽培品種及由彼馬鈴薯變種產生之塊莖、植株、植物部分、組織培養物及種子。本發明進一步係關於由馬鈴薯栽培品種Y9產生之食品產品，諸如炸薯條、炸馬鈴薯片、脫水馬鈴薯材料、馬鈴薯雪片及馬鈴薯顆粒。
馬鈴薯為全球第四最重要的糧食作物且迄今為止為最重要的蔬菜。目前，幾乎美國的每個州都商業地種植馬鈴薯。美國馬鈴薯年產量超過1800萬噸且全球馬鈴薯年產量超過3億噸。馬鈴薯之風行主要源於其多功能性及營養價值。馬鈴薯可以新鮮、凍結或乾燥使用，或可加工成麵粉、澱粉或醇。其含有複雜的碳水化合物且富含鈣、菸酸及維生素C。 食品行業中之馬鈴薯的品質受兩個關鍵因素影響：(1)馬鈴薯含有大量天冬醯胺，一種在油炸或烘烤後快速氧化形成丙烯醯胺(一種致癌產物)之非必需游離胺基酸；及(2)馬鈴薯非常容易酶促褐變及變色，此為當多酚氧化酶自經擦傷之馬鈴薯的受損質體滲漏出時發生的非所要事件。在細胞質中，酶使酚類氧化，該等酚類接著快速聚合產生深色色素。塊莖含有大量磷酸化澱粉，一些磷酸化澱粉在儲存期間降解產生葡萄糖及果糖。當在高於120℃之溫度下被加熱時，此等還原糖與胺基酸反應形成包括丙烯醯胺之梅納(Maillard)產物。澱粉磷酸化涉及之兩種酶為水二激酶R1及磷酸化酶-L (R1及PhL)。由於澱粉部分降解成葡萄糖及果糖，因此亦非酶促地觸發褐變。 許多馬鈴薯栽培品種容易患晚疫病，一種由類真菌卵菌病原體致病疫黴(Phytophthora infestans
)引起之破壞性疾病。馬鈴薯之晚疫病藉由在葉及莖幹上可快速擴散且變得壞死之黑色/褐色病變來鑑別。當致病疫黴在宿主作物上快速生長且繁殖時，出現嚴重晚疫病傳染。 因此，需要研發有毒化合物含量減少且對疾病之抗性增加但沒有使用未知或外源核酸之馬鈴薯變種。本發明滿足此需要。 相關技術及其相關限制之前述實例意欲為說明性的且非排他性的。在閱讀說明書之後，對熟習此項技術者而言，相關技術之其他限制將變得顯而易見。
因此，在此項技術中需要產生丙烯醯胺含量低、黑斑擦傷耐受增加、還原糖減少且對晚疫病之抗性增加的塊莖之馬鈴薯植物變種。 結合在範疇中意謂為例示性、非限制性的系統、工具及方法，描述以下實施例及其態樣。在各種實施例中，已減少或消除上述問題中之一或多者，而其他實施例係針對其他改良。 為此目的，本發明提供用核酸序列轉化之新穎馬鈴薯變種Y9，該等核酸序列為馬鈴薯植物基因組原生的且不含有外源DNA、農桿菌(Agrobacterium
) DNA、病毒標記或載體主鏈序列。確切而言，插入至馬鈴薯變種Y9之基因組中之DNA為馬鈴薯原生或野生型馬鈴薯(馬鈴薯性親和植物)原生之非編碼聚核苷酸，該非編碼聚核苷酸使與表現黑斑擦傷、天冬醯胺累積及老化甜化有關之基因沉默。本發明亦係關於用於產生遺傳物質中含有一或多個轉基因之馬鈴薯植物的方法，以及由彼等方法產生之轉基因馬鈴薯植物及植物部分。本發明亦係關於：來源於馬鈴薯變種Y9之馬鈴薯栽培品種或育種栽培品種及植物部分；用於產生來源於馬鈴薯栽培品種Y9之其他馬鈴薯栽培品種、品系或植物部分的方法；及由使用彼等方法得到之馬鈴薯植物、變種及其部分。本發明進一步係關於藉由使馬鈴薯栽培品種Y9與另一馬鈴薯栽培品種雜交而產生之雜種馬鈴薯塊莖、種子、植株及植物部分。 由此，在一個實施例中，本發明提供一種被稱作pSIM1278之植物載體，其包含：第一沉默盒，其含有在反義方向上包含天冬醯胺合成酶-1基因(fAsn1)片段及多酚氧化酶-5基因之3'端非轉譯序列之DNA段的兩個複本；及第二沉默盒，其含有在反義方向上包含馬鈴薯磷酸化酶-L (pPhL)基因片段及馬鈴薯R1基因片段之DNA段的兩個複本。pSIM1278載體包含9,512 bp主鏈區及10,148 bp DNA插入區，該主鏈區在植物轉化之前支撐維護植物DNA且在植物細胞之轉化後不轉移至植物細胞中，該插入區包含在轉化後穩定整合至植物細胞之基因組中的原生DNA。 在另一實施例中，本發明提供一種被稱作pSIM1678之第二植物載體，其包含Rpi - vnt1
表現盒及植物液泡轉化酶基因VInv
之沉默盒。Rpi - vnt1
基因盒由VNT1蛋白質編碼區構成，該編碼區藉由其原生啟動子及終止子序列調節以賦予對晚疫病之廣泛抗性；而沉默盒由來自側接相反植物啟動子pGbss及pAgp的馬鈴薯VInv
基因序列之反向重複序列構成。pSIM1678載體包含9,512 bp主鏈區及9,090 bp DNA插入區，該主鏈區在植物轉化之前支撐維護植物DNA且在植物細胞之轉化後不轉移至植物細胞中，該插入區包含在轉化後穩定整合至植物細胞之基因組中的原生DNA。 在不同實施例中，本發明提供一種用本發明之植物載體中之一者或兩者轉化之植物細胞。在又一實施例中，本發明提供一種馬鈴薯植物變種，其包含用本發明之載體轉化之一或多個細胞。在本發明之一個態樣中，馬鈴薯植物變種表現載體pSIM1278之兩個沉默盒中之至少一個且表現載體pSIM1678之沉默盒，且沉默盒之表現引起天冬醯胺合成酶-1基因、多酚氧化酶-5基因及液泡轉化酶基因在植物塊莖中之下調。在本發明之較佳態樣中，表現至少一個沉默盒之馬鈴薯植物變種之塊莖呈現相同變種之未轉化植物塊莖中不存在的兩個或多於兩個所需性狀。在本發明之最佳態樣中，該兩個或多於兩個所需性狀係選自由以下各者組成之群：天冬醯胺累積少、黑斑擦傷減少、熱誘導之丙烯醯胺形成減少及儲存期間還原糖之累積減少。 在本發明之不同態樣中，馬鈴薯植物變種表現植物DNA載體pSIM1278之兩個沉默盒且表現載體pSIM1678之沉默盒，且沉默盒之表現引起馬鈴薯植物品種之塊莖中天冬醯胺合成酶-1基因、多酚氧化酶-5基因、磷酸化酶-L基因、二激酶R1基因及液泡轉化酶基因之下調。在本發明之較佳態樣中，表現植物DNA載體pSIM1278之兩個沉默盒且表現載體pSIM1678之沉默盒之馬鈴薯植物變種的塊莖呈現相同變種之未轉化植物塊莖中不存在的兩個或多於兩個所需性狀。在一較佳實施例中，該兩個或多於兩個所需性狀係選自由以下各者組成之群：較少天冬醯胺累積、黑斑擦傷減少、儲存期間還原糖之累積減少及熱誘導之丙烯醯胺形成減少。在本發明之一個態樣中，表現植物DNA載體pSIM1278之兩個沉默盒及植物DNA載體pSIM1678之沉默盒的馬鈴薯植物變種為Atlantic Y9變種。 在本發明之另一態樣中，本發明之馬鈴薯植物變種Y9表現植物DNA載體pSIM1678之晚疫病抗性基因(Rpi - vnt1
)。在本發明之又一態樣中，本發明之馬鈴薯植物變種Y9對晚疫病感染之抗性增加。 由此，根據本發明，提供一種馬鈴薯(Solanum tuberosum L.
)屬種之新型馬鈴薯栽培品種，命名為Y9。由此，本發明係關於：馬鈴薯栽培品種Y9、馬鈴薯栽培品種Y9之塊莖、馬鈴薯栽培品種Y9之植株、馬鈴薯栽培品種Y9之種子、由馬鈴薯栽培品種Y9生產之食品產品，及用於產生馬鈴薯植物之方法，該馬鈴薯植物係藉由使馬鈴薯栽培品種Y9自交或使馬鈴薯栽培品種Y9與另一馬鈴薯栽培品種雜交，及藉由突變誘發或轉化馬鈴薯栽培品種Y9產生變體而產生。 因此，使用栽培品種Y9之任何此類方法皆為本發明之實施例：自交、回交、產生雜種、群體雜交及其類似方法。使用馬鈴薯栽培品種Y9作為至少一個親本所產生之所有植物皆在本發明之範疇內。有利地，馬鈴薯栽培品種可用於與其他不同的馬鈴薯植物雜交以產生具有優良特徵之第一代(F1
)馬鈴薯雜種塊莖、種子及植株。 在另一實施例中，本發明提供馬鈴薯栽培品種Y9之單基因或多基因轉換植物。在一個實施例中，一或多個轉移基因可為一或多個顯性或隱性對偶基因。在一些實施例中，該或該等轉移基因將賦予諸如以下性狀：除草劑抗性；昆蟲抗性；對細菌性、真菌性或病毒性疾病之抗性；雄性可育性；雄性不育；營養品質增強；均一性；及澱粉及其他碳水化合物之濃度增加；擦傷傾向降低；以及澱粉轉化為糖之速率降低。該或該等基因可為天然存在的馬鈴薯基因或經由遺傳工程技術、回交或突變引入的轉基因。 在另一實施例中，本發明提供供馬鈴薯栽培品種Y9之組織培養物中使用的可再生細胞。在一個實施例中，組織培養物將能夠使具有前述馬鈴薯植物之所有生理學及形態學特徵之植物再生，且能夠使實質上與前述馬鈴薯植物具有相同基因型之植物再生。在一些實施例中，此類組織培養物中之可再生細胞將為：胚芽、原生質體、分生組織細胞、癒合組織(callus)、花粉、葉、花藥、雌蕊、子葉、下胚軸、根、根尖、花、種子、葉柄、塊莖、芽眼或莖幹。再者，本發明提供自本發明之組織培養物再生之馬鈴薯植物。 在另一實施例中，本發明提供由馬鈴薯植物變種Atlantic Y9之塊莖製成之食品產品。較佳地，該食品產品為熱處理產品。甚至更佳地，該食品產品為新鮮完整馬鈴薯、炸薯條、炸馬鈴薯片、脫水馬鈴薯材料、馬鈴薯雪片或馬鈴薯顆粒。 除上文所描述例示性態樣及實施例以外，藉由以下描述之研究，其他態樣及實施例將變得顯而易見。
定義
在以下實施方式及表中，使用若干術語。為提供對本說明書及申請專利範圍(包括欲給出此類術語之範疇)之清楚且一致的理解，提供以下定義。 術語「一(a或an)」係指該實體中的一或多者；舉例而言，「一引物」係指一或多個引物或至少一個引物。因此，術語「一(a或an)」、「一或多個」及「至少一個」在本文中可互換使用。另外，藉由不定冠詞「一(a或an)」提及「一元件」並不排除存在多於一個元件的可能性，除非上下文明確要求存在一個且僅存在一個元件。對偶基因。
對偶基因為與一個性狀或特徵相關之基因的一或多種替代形式中之任一者。在二倍體細胞或生物體中，給定基因之兩個對偶基因在一對同源染色體上佔據對應基因座。胺基酸序列。
如本文所使用，包括自植物中分離之原生或天然存在或合成製得但包含內源性對應物之核酸序列的寡肽、肽、多肽或蛋白質及其片段。人工操縱之。
如本文所使用，「人工操縱之」意謂藉由手工或藉由機械方式或重組方式(諸如，藉由遺傳工程技術)移動、排列、操作或控制植物或植物細胞，以便產生與未經操縱、天然存在之對應物相比具有不同生物學、生物化學、形態學或生理學表現型及/或基因型的植物或植物細胞。無性繁殖。
藉由自葉插、莖幹插、根插、塊莖芽眼、匍匐莖、單個植物細胞原生質體、癒合組織及其類似者生成整個植物來產生子代，該過程不涉及配子之融合。主鏈 。
除去意欲用於轉移之DNA插入序列之外的二元載體之核酸序列。回交 。
回交為育種者讓雜種子代反覆地與親本之一雜交(例如，讓第一代雜種F1
與F1
雜種之親本基因型之一雜交)的過程。細菌性環腐病。
細菌性環腐病為由細菌馬鈴薯棒狀環腐菌(Clavibacter michiganense)亞種引起之疾病。細菌性環腐病之名稱源自於塊莖內之維管環的分解特徵。此環通常呈乳黃色至淡褐色，乾酪樣腐病。在馬鈴薯之外表面上，嚴重患病之塊莖可展現輕微凹陷、乾癟及裂開的區域。受感染塊莖之維管組織中之細菌性環腐病症狀可沒有上文所描述之症狀那麼明顯，僅表現為零碎的、零星出現的深色線或連續的淡黃色變色。黑斑擦傷。
擦傷之塊莖組織中發現的黑斑由被稱為黑色素之色素造成，黑色素在細胞損傷之後產生且使組織呈褐色、灰色或黑色外觀。當酚底物與適當的酶由於細胞損傷而開始彼此接觸時，形成黑色素。損傷不需要破損細胞。然而，通常當組織受到衝擊時，一定會出現底物與酶之混合。黑斑主要出現在恰好在維管環下方的環髓組織中，但可能足夠大而包括皮層組織中之一部分。邊緣樣序列。
「邊緣樣」序列係分離自待修飾之所選植物物種，或分離自與待修飾之植物物種性親和之植物，且功能類似於農桿菌之邊緣序列。亦即，本發明之邊緣樣序列促進且有助於其連接至之聚核苷酸的整合。本發明之DNA插入序列較佳地含有邊緣樣序列。DNA插入序列之邊緣樣序列之長度在以下長度範圍之間：5至100 bp、10至80 bp、15至75 bp、15至60 bp、15至50 bp、15至40 bp、15至30 bp、16至30 bp、20至30 bp、21至30 bp、22至30 bp、23至30 bp、24至30 bp、25至30 bp或26至30 bp。DNA插入序列之左側及右側邊緣序列係分離自及/或原生於待修飾之植物的基因組。DNA插入序列之邊緣樣序列與任何已知農桿菌衍生之T-DNA邊緣序列就核苷酸序列而言為不相同的。因此，DNA插入序列之邊緣樣序列可具有與來自農桿菌種(諸如，根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens
)或發根農桿菌(Agrobacterium rhizogenes
))之T-DNA邊緣序列不同的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個核苷酸。亦即，本發明之DNA插入序列之邊緣序列或邊緣樣序列與來自農桿菌種(諸如，根癌農桿菌或發根農桿菌)之T-DNA邊緣序列具有至少95%、至少90%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%或至少50%序列一致性，但並不為100%序列一致性。如本文中所使用，描述性術語「DNA插入序列邊緣」及「DNA插入序列邊緣樣」可互換。邊緣樣序列可自植物基因組分離且經修飾或突變以改變功效，從而能夠將一個核苷酸序列整合至另一核苷酸序列中。其他聚核苷酸序列可添加至或併入在本發明之邊緣樣序列內。因此，DNA插入序列左側邊緣或DNA插入序列右側邊緣可經修飾以具有5'端及3'端多個選殖位點或額外限制位點。DNA插入序列邊緣序列可經修飾以增加來自隨附載體之主鏈DNA不整合至植物基因組中之可能性。基本上由……構成。
「基本上由」某些元件「構成」之組合物受限於包括彼等元件以及不實質上影響本發明組合物之基本特徵及新穎特徵的彼等元件。因此，只要組合物不影響本發明之基本特徵及新穎特徵，亦即不含有外源DNA (並非來自所選植物物種或與所選植物物種性親和之植物)，則可認為彼組合物為本發明組合物之由「基本上由……構成」措辭表徵的組分。子葉 (cotyledon) 。
子葉為種子葉(seed leaf)的一種類型。子葉含有種子之食物貯藏組織。簡併引物。
「簡併引物」為寡核苷酸，其含有充足的核苷酸變異，當雜交至相似但不完全同源之序列時，該等核苷酸變異可適應鹼基錯配。雙子葉植物 ( Dicotyledon / dicot ) 。
胚芽具有兩個種子葉或子葉之開花植物。雙子葉植物之實例包括(但不限於)：菸草、番茄、馬鈴薯、甘薯、木薯、豆科植物(包括苜蓿及大豆)、胡蘿蔔、草莓、萵苣、橡樹、楓樹、胡桃、玫瑰、薄荷、南瓜、菊及仙人掌。DNA 插入序列。
根據本發明，待插入至植物之基因組中之DNA插入序列包含原生於彼植物或具有彼植物之原生遺傳元件的聚核苷酸序列。舉例而言，在一個實例中，來自本發明之馬鈴薯變種Y9之pSIM1278的DNA插入序列為原生於馬鈴薯或野生型馬鈴薯(一種馬鈴薯性親和植物)之非編碼聚核苷酸，該非編碼聚核苷酸在轉化後穩定地整合至植物細胞之基因組中，且使與表現黑斑擦傷、天冬醯胺累積及老化甜化有關之基因沉默。DNA插入序列較佳地包含兩個表現盒，且插入至被稱作pSIM1278轉化載體之轉化載體中。第一盒包含天冬醯胺合成酶-1基因(Asn
1)及多酚氧化酶-5基因(Ppo5
)兩者之片段，該等片段以反向重複序列之形式排列在ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因(Agp
)之Agp啟動子與顆粒結合合成酶基因(Gbss
)之Gbss啟動子之間。此等啟動子在塊莖中具有顯著活性。第二盒之功能為使澱粉相關基因二激酶-R1 (R1
)及磷酸化酶-L基因(PhL
)之啟動子沉默。此盒由澱粉相關基因二激酶-R1 (R1
)及磷酸化酶-L基因(PhL
)之啟動子的片段構成，該等片段可操作地連接至與第一盒相同的Agp及Gbss啟動子。第二DNA插入序列來自被稱作pSIM1678之轉化載體，其包含Rpi - vnt1
表現盒及植物液泡轉化酶基因VInv
之沉默盒。Rpi - vnt1
基因盒由VNT1蛋白質編碼區構成，該編碼區藉由其原生啟動子及終止子序列調節以賦予對晚疫病之廣泛抗性；而沉默盒由來自側接相反植物啟動子pGbss及pAgp的馬鈴薯VInv
基因序列之反向重複序列構成。此等表現盒不含有外源DNA，且僅由來自所選植物物種或來自與所選植物物種性親和之植物的DNA構成。胚芽。
胚芽為包含於成熟種子內之未成熟植物。外源 。
就核酸而言之「外源」意謂該核酸來源於非植物生物體，或來源於物種與待轉化之植物不同的植物，或並非來源於不可與待轉化之植物雜交的植物，不屬於目標植物的物種。根據本發明，外源DNA或RNA表示真菌、細菌、病毒、哺乳動物、魚或鳥類的遺傳構成中天然存在，但不在待轉化之植物中天然存在的核酸。因此，外源核酸為編碼(例如)並非由經轉化植物天然產生之多肽的核酸。外源核酸不一定必須編碼蛋白質產物。根據本發明，所需基因內植物為不含有整合至其基因組中之任何外源核酸的植物。基因。
如本文中所使用，「基因」係指編碼區且不包括5'端或3'端至該區之核苷酸序列。功能性基因為可操作地連接至啟動子或終止子之編碼區。可使用轉化或各種育種方法將一基因引入至一物種之基因組中，無論其來自不同物種抑或相同物種。基因轉換 ( Converted 或 Conversion ) 。
基因轉換植物係指藉由被稱為回交之植物育種技術研發之植物，其中除經由回交技術、經由遺傳工程或經由突變轉移至變種中之一或多個基因外，基本上復原該變種之所有所需形態學及生理學特徵。亦可轉移一或多個基因座。遺傳重排。
係指可在活體內以及活體外自發地發生的遺傳元件之重新組合，其引入遺傳物質之新組構。舉例而言，不同染色體基因座處之聚核苷酸的彼此拼接可在活體內在植物發育及有性重組兩者期間自發地發生。因此，在活體外藉由非天然基因修飾技術進行的遺傳元件重組類似於亦可經由活體內有性重組發生之重組事件。金線蟲。
馬鈴薯金線蟲(Globodera rostochiensis
) (通常被稱為金線蟲)為影響馬鈴薯植物的根及塊莖之植物寄生線蟲。症狀包括不良植物生長、枯萎、水分脅迫及養分缺乏。下胚軸。
下胚軸為胚芽或幼苗之在子葉與根之間的部分。因此，其可被視為嫩芽與根之間的過渡區。框架內。
核苷酸三聯體(密碼子)轉譯成植物細胞中之所需重組蛋白質的初生胺基酸序列。具體言之，本發明涵蓋以閱讀框架連接至第二核酸之第一核酸，其中第一核苷酸序列為基因且第二核苷酸為啟動子或相似調節元件。整合。
係指將來自所選植物物種、或來自與所選植物相同物種之植物或與所選植物物種性親和之植物的核酸序列插入至所選植物物種之細胞的基因組中。「整合」係指僅將原生遺傳元件併入至植物細胞基因組中。為藉由(諸如)同源重組來整合原生遺傳元件，本發明可「使用」非原生DNA作為此類方法中之一步驟。因此，本發明將「使用」特定DNA分子與「整合」特定DNA分子至植物細胞基因組中區別開。引入。
如本文中所使用，係指藉由包括感染、轉染、轉化或轉導之方法將核酸序列插入至細胞中。分離。
「分離」係指在實體上與其正常、原生環境分離之任何核酸或化合物。經分離物質可維持在含有(例如)溶劑、緩衝液、離子或其他組分之適合溶液中且可呈純化形式或未純化形式。晚疫病。
一種由卵菌致病疫黴引起之馬鈴薯疾病，且亦被稱為『馬鈴薯疫病』，該疾病可感染且破壞馬鈴薯植物之葉、莖幹、果實及塊莖。前導序列。
基因之前(或5'端)的經轉錄但不經轉譯之序列。基因座。
基因座賦予一或多個性狀，諸如雄性不育、除草劑抗性、昆蟲抗性、疾病抗性、蠟質澱粉、經修飾之脂肪酸代謝、經修飾之植酸代謝、經修飾之碳水化合物代謝及經修飾之蛋白質代謝。舉例而言，性狀可由藉由回交、自然突變或誘發突變引入至變種之基因組中的天然存在基因或經由遺傳轉化技術引入的轉基因來賦予。基因座可包含整合在單一染色體位置處之一或多個對偶基因。可銷售產量。
可銷售產量為收穫的直徑在2吋與4吋之間的所有塊莖的重量。可銷售產量按cwt (英擔)計量，其中cwt=100磅。單子葉植物 ( Monocotyledon 或 monocot ) 。
胚芽具有一個子葉或種子葉之開花植物。單子葉植物之實例包括(但不限於)草皮草、玉米、水稻、燕麥、小麥、大麥、高梁、蘭花、鳶尾、百合、洋蔥及棕櫚。原生。
「原生」遺傳元件係指天然存在於、來源於或屬於待轉化之植物之基因組的核酸。因此，自待轉化之植物或植物物種之基因組分離或自與待轉化之植物物種性親和或可雜交之植物或物種分離的任何核酸、基因、聚核苷酸、DNA、RNA、mRNA或cDNA分子為該植物物種「原生」的，亦即原產的。換言之，原生遺傳元件表示植物育種者可獲得以用於經由傳統植物育種改良植物的全部遺傳物質。根據本發明，原生核酸的任何變體亦被視為「原生」的。就此而言，「原生」核酸亦可自植物或其性親和物種分離且經修飾或突變，使得所得變體與自植物分離之未經修飾之原生核酸的核苷酸序列相似度大於或等於99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%、66%、65%、64%、63%、62%、61%或60%。原生核酸變體之核苷酸序列相似度亦可小於約60%、小於約55%或小於約50%。自植物分離之「原生」核酸亦可編碼自該核酸轉錄及轉譯之天然存在蛋白質產物的變體。因此，原生核酸可編碼與自其分離該核酸之植物中表現之未經修飾的原生蛋白質具有以下胺基酸序列相似度的蛋白質：大於或等於99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%、66%、65%、64%、63%、62%、61%或60%。原生遺傳元件。
根據本發明，「原生遺傳元件」可併入且整合至所選植物物種基因組中。原生遺傳元件係自屬於所選植物物種之植物分離或自與所選植物物種性親和之植物分離。舉例而言，併入至所栽培馬鈴薯(馬鈴薯(Solanum tuberosum
))中之原生DNA可來源於任何基因型的馬鈴薯(S . tuberosum
)或與馬鈴薯性親和之任何基因型的野生型馬鈴薯物種(例如，S . demissum
)。天然存在核酸。
天然存在核酸存在於所選植物物種之基因組內，且可為DNA分子或RNA分子。正常存在於植物物種之基因組中之限制位點的序列可經工程改造為外源性DNA分子(諸如，載體或寡核苷酸)，即使彼限制位點並未實體地自彼基因組分離。因此，本發明准許合成生成核苷酸序列(諸如，限制酶識別序列)，只要彼序列為所選植物物種之基因組中天然存在的或與待轉化之所選植物物種性親和之植物中天然存在的。可操作地連接。
以使得兩個或更多個分子在組合時在植物細胞中適當地起作用之方式來組合該等分子。舉例而言，當啟動子控制結構基因之轉錄時，啟動子可操作地連接至結構基因。植物。
如本文中所使用，術語「植物」包括(但不限於)被子植物及裸子植物，諸如馬鈴薯、番茄、菸草、苜蓿、萵苣、胡蘿蔔、草莓、甜菜、木薯、甘薯、大豆、玉米、草皮草、小麥、水稻、大麥、高梁、燕麥、橡樹、桉樹、胡桃及棕櫚。因此，植物可為單子葉植物或雙子葉植物。如本文中所使用，詞「植物」亦涵蓋植物細胞、種子、植物子代、有性產生抑或無性產生之繁殖體，及此等者中任一者之後代，諸如插條或種子。植物細胞包括懸浮培養物、癒合組織(callus)、胚芽、分生組織區、癒合組織(callus tissue)、葉、根、嫩芽、配子體、孢子體、花粉、種子及小孢子。植物可處於成熟期之各階段，且可在液體或固體培養物中生長，或在盆、溫室或田間中之土壤或適合培養基中生長。所引入前導序列、尾部序列或基因序列在植物中之表現可為暫時性或永久性的。「所選植物物種」可為(但不限於)此等「植物」中之任一者的物種。植物部分。
如本文中所使用，術語「植物部分」(或馬鈴薯植物或其部分)包括(但不限於)原生質體、葉、莖幹、根、根尖、花藥、雌蕊、種子、胚芽、花粉、胚珠、子葉、下胚軸、花、塊莖、芽眼、組織、葉柄、細胞、分生組織細胞及其類似者。植物物種。
屬於至少呈現某些性親和性的各種正式命名之植物物種的植物組。植物轉化及細胞培養。
廣義係指遺傳修飾植物細胞且將其轉移至適當的植物培養基中以維持、進一步生長及/或進一步發育的方法。精確育種。
係指藉由將核酸，諸如自所選植物物種、或自與所選植物物種相同之另一植物或自與所選植物物種性親和之物種中分離的原生基因及調節元件，穩定地引入至個別植物細胞中，且隨後將此等遺傳修飾之植物細胞再生成整個植物以改良植物。由於沒有未知的或外源核酸永久地併入至植物基因組中，因此本發明之技術利用經由習知植物育種亦可獲得之相同遺傳物質。子代。
如本文中所使用，其包括藉由使兩種馬鈴薯植物(其中至少一種植物包括馬鈴薯栽培品種Y9)雜交而產生之F1
馬鈴薯植物，且子代進一步包括(但不限於)與輪迴親本系之F2
、F3
、F4
、F5
、F6
、F7
、F8
、F9
及Y9代雜種。數量性狀基因座 ( QTL ) 。
數量性狀基因座(QTL)係指在一定程度上控制可用數值表示之性狀的遺傳基因座，該等性狀通常為連續分佈的。重組。
如本文中所使用，其廣義上描述藉以可選殖基因、可定序DNA以及可產生蛋白質產物的各種技術。如本文中所使用，該術語亦描述在將基因轉移至植物宿主系統之細胞中之後所產生的蛋白質。再生。
再生係指由組織培養物培育植物。調節序列。
其係指對熟習此項技術者而言為標準且已知的彼等序列，該等序列可包括於表現載體中以在植物系統中增加及/或最大化相關基因之轉錄或所得RNA之轉譯。此等序列包括(但不限於)啟動子、肽輸出信號序列、內含子、聚腺苷酸化及轉錄終止位點。修飾核酸結構以增加在植物中之表現水準的方法一般而言亦為此項技術中已知的(例如參見Rogers等人，260J . Biol . Chem .
3731-38，1985；Cornejo等人，23Plant Mol . Biol .
567: 81，1993)。在工程改造植物系統以影響蛋白質之轉錄速率中，此項技術中已知之各種因素可產生影響，該等因素包括諸如正面作用序列或負面作用序列(強化子及沉默子)之調節序列以及染色體結構。本發明規定，此等因素中之至少一者可用於工程改造植物以表現相關蛋白質。本發明之調節序列為原生遺傳元件，亦即係自待修飾之所選植物物種中分離的。選擇性標記。
「選擇性標記」通常為編碼賦予對抗生素、除草劑或有毒化合物之某種抗性之蛋白質且用於鑑定轉化事件的基因。選擇性標記之實例包括：編碼鏈黴素抗性之鏈黴素磷酸轉移酶(spt
)基因、將甘露糖-6-磷酸轉化為果糖-6磷酸之磷酸甘露糖異構酶(pmi
)、編碼卡那黴素(kanamycin)抗性及遺傳黴素抗性之新黴素磷酸轉移酶(nptII
)基因、編碼對潮黴素之抗性的潮黴素磷酸轉移酶(hpt
或aphiv
)基因、編碼對磺醯脲型除草劑之抗性的乙醯乳酸合成酶(als
)基因、編碼對用於抑制麩醯胺酸合成酶之作用的除草劑(諸如草丁膦(phosphinothricin)或巴斯特(basta))之抗性的基因(例如，bar基因)或此項技術中已知之其他類似基因。有義抑制。
藉由在轉基因植物中表現內源性基因之全部或部分基因的一或多個額外複本來減少該基因之表現。比重。
如本文中所使用，「比重」為密度之表示且為馬鈴薯品質之量測值。塊莖同澱粉含量之比重與乾物質或總固體之百分比之間存在高相關性。更高比重有助於加工產品之更高回收率及更佳品質。T - DNA 樣 ( T - DNA - Like ) 。
「T-DNA樣」序列為自所選植物物種、或自與所選植物物種性親和之植物中分離的核酸，且其與農桿菌種T-DNA具有至少75%、80%、85%、90%或95%但非100%之序列一致性。T-DNA樣序列可含有分別能夠將核苷酸序列整合至另一聚核苷酸中之一或多個邊緣或邊緣樣序列。總產量。
總產量係指所有所收穫塊莖之總重量。尾部序列。
基因之後(或3'端)的經轉錄但不經轉譯之序列。轉錄之 DNA 。
包含基因及與該基因相關聯之未經轉譯之前導序列及尾部序列兩者的DNA，其藉由前面的啟動子之作用經轉錄為單一mRNA。植物細胞之轉化。
將DNA穩定地整合至植物細胞之基因組中的方法。「穩定地」係指聚核苷酸在細胞基因組中及藉由細胞基因組的永久性或非暫時性的保留及/或表現。因此，經穩定地整合之聚核苷酸為在經轉化細胞基因組內為固定物之聚核苷酸，且可經由細胞或所得經轉化植物之連續子代來加以複製及繁殖。轉化可在天然條件下或使用此項技術中各種熟知方法的人工條件下發生。轉化可依賴於用於將核酸序列插入至原核或真核宿主細胞中之任何已知方法，包括農桿菌介導之轉化方案、病毒感染、晶鬚(whisker)、電穿孔、熱休克、脂質體轉染、聚乙二醇處理、微注射及粒子轟擊。轉基因。
計畫插入至宿主基因組中之包含蛋白質編碼區的基因。在本發明之上下文中，自宿主基因組中分離包含轉基因之元件。轉基因植物。
含有至少一個轉基因之經遺傳修飾的植物。變體。
如本文中所使用，「變體」應被理解為意謂偏離特定基因或蛋白質之標準或給定核苷酸或胺基酸序列的核苷酸或胺基酸序列。術語「同功異型」、「同型」及「類似物」亦係指核苷酸或胺基酸序列的「變體」形式。藉由添加、移除或替換一或多個胺基酸或改變核苷酸序列而變更的胺基酸序列可被視為「變體」序列。變體可具有「保守」改變，其中經取代之胺基酸具有類似的結構或化學特性，例如用異白胺酸置換白胺酸。變體可具有「非保守」改變，例如用色胺酸置換甘胺酸。類似的微小變化亦可包括胺基酸的缺失或插入或兩者都有。判定哪些胺基酸殘基可經替換、插入或缺失的指導可使用此項技術中熟知之電腦程式(例如 Vector NTI Suite (InforMax，MD)軟體)獲得。蔓藤成熟度 ( Vine Maturity ) 。
蔓藤成熟度係指植物持續利用碳水化合物及光合作用的能力。蔓藤成熟度按1至5之等級評分，其中1 =死蔓藤且5 =綠色、仍開花之蔓藤。 由於馬鈴薯為四倍體植物、高度異型接合且對近交衰退敏感，因此將所需性狀插入至馬鈴薯植物之基因組中特別困難。因此，有效研發在使用習知育種處理期間產生較少丙烯醯胺及較少有害梅納反應產物之轉基因馬鈴薯植物係極其困難的，該等梅納反應產物包括N-亞硝基-N-(3-酮基-1,2-丁二醇)-3'-硝基酪胺(Wang等人，Arch Toxicol
70: 10-5，1995)、5-羥基甲基-2-糠醛(Janzowski等人，Food Chem Toxicol
38: 801-9，2000)及具有誘發突變特性之其他梅納反應產物(Shibamoto,Prog Clin Biol Res
304: 359-76，1989)。 已試驗若干方法且正進行研究以經由過程改變、減少右旋糖及諸如天冬醯胺酶、檸檬酸鹽之添加劑以及競爭性胺基酸來減少丙烯醯胺。貫穿馬鈴薯產業實施過程改變之所需資金費用將花費數百萬美元。除費用以外，此等過程改變具有相當多的缺點，包括與諸如天冬醯胺酶或檸檬酸鹽之添加劑相關聯的潛在不良風味。通常，炸薯條製造商在炸薯條之加工期間添加右旋糖以產生所需金褐色顏色，但右旋糖亦增加經由梅納反應之丙烯醯胺的形成。僅藉由自該過程中省略右旋糖，即出現丙烯醯胺之顯著減少；然而，必須用某種其他方式產生特徵標誌金褐色(諸如，經由添加類似胭脂樹紅之色素)。替代色素之使用引起經由彼等褐變反應產生之典型風味的缺失。使用添加劑來減少類似天冬醯胺之反應物的另一挑戰為，凍結儲存期間發生之水分遷移使得天冬醯胺返回至表面且丙烯醯胺增加。最後，在馬鈴薯被擦傷後發生之變黑影響經加工之炸薯條及炸薯片的品質及回收率。在加工之前必須修減或丟棄經破壞及擦傷之馬鈴薯，從而導致品質挑戰或經濟損失。 本發明之「原生技術」策略藉由以下方法解決馬鈴薯產業改良馬鈴薯之農藝特徵及營養價值之需要：減少造成黑斑擦傷之多酚氧化酶-5 (PPO-5)的表現；減少造成天冬醯胺累積之天冬醯胺合成酶-1 (Asn-1)的表現，天冬醯胺為丙烯醯胺形成之前體；減少將蔗糖轉化為葡萄糖及果糖之酶液泡轉化酶的表現；及/或減少磷酸化酶-L及激酶-R1的表現，該等酶為與還原糖之累積相關聯的酶，該等還原糖與諸如天冬醯胺之胺基酸正常反應且形成包括丙烯醯胺之有毒梅納產物。塊莖中之此等基因的部分或完全沉默降低產生丙烯醯胺之可能性。使用本發明之原生技術允許在不將任何外源遺傳物質整合至植物之基因組中的情況下，僅藉由用僅含有非編碼調節區之「原生」遺傳物質(亦即，自馬鈴薯植物或與馬鈴薯植物性親和之植物獲得的遺傳物質)轉化馬鈴薯而將所需性狀併入至有商業價值的馬鈴薯植物變種之基因組中。所需性狀包括對碰撞誘發之黑斑擦傷的高抗性、對晚疫病感染之抗性增加、丙烯醯胺前驅體天冬醯胺之形成減少及還原糖之累積減少，其結果為有毒梅納產物(包括丙烯醯胺)之堆積減少、經改良品質及食品顏色控制。由於馬鈴薯為四倍體植物、高度異型接合且對近交衰退敏感，因此經由傳統育種將此等所需性狀併入至現有馬鈴薯變種中係不可能達成的。 本發明中使用之非編碼馬鈴薯植物DNA插入序列為馬鈴薯植物基因組原生的且不含有任何農桿菌DNA。DNA插入序列中之一者較佳地包含兩個表現盒，且經插入至被稱作pSIM1278轉化載體之轉化載體中。第一盒包含天冬醯胺合成酶-1基因(Asn
1)及多酚氧化酶-5基因(Ppo5
)兩者之片段，該等片段以反向重複序列之形式排列在ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因(Agp
)之Agp啟動子與顆粒結合合成酶基因(Gbss
)之Gbss啟動子之間。此等啟動子在塊莖中具有顯著活性。第二盒之功能為使澱粉相關基因二激酶-R1 (R1
)及磷酸化酶-L基因(PhL
)之啟動子沉默。此盒由澱粉相關基因二激酶-R1 (R1
)及磷酸化酶-L基因(PhL
)之啟動子的片段構成，該等片段可操作地連接至與第一盒相同的Agp及Gbss啟動子。此等表現盒不含有外源DNA，且僅由來自所選植物物種或來自與所選植物物種性親和之植物的DNA構成。第二DNA插入序列來自被稱作pSIM1678之轉化載體，其包含Rpi - vnt1
表現盒及植物液泡轉化酶基因VInv
之沉默盒。Rpi - vnt1
基因盒由VNT1蛋白質編碼區構成，該編碼區藉由其原生啟動子及終止子序列調節以賦予對晚疫病之廣泛抗性；而沉默盒由來自側接相反植物啟動子pGbss及pAgp的馬鈴薯VInv
基因序列之反向重複序列構成。第一盒之功能為賦予對晚疫病之抗性，而第二盒之功能為使液泡轉化酶基因沉默從而減少葡萄糖及果糖。 本發明中使用之具有商業價值的馬鈴薯植物變種為Atlantic。Atlantic為Y9之親本變種。植物中等大小，具有厚實豎直的莖幹及略微隆起、具有稀疏柔毛的結節。葉鮮明、中等綠色、平滑且具有適當柔毛，具有明顯的翼瓣、較大的不對稱初級小葉及許多二級及三級小葉。花朵較多，具有綠色錐形的有柔毛的萼裂片、淺淡紫色花冠、橙色花藥及大量可育花粉。該栽培品種對瘡痂病及輪枝菌(Verticillium
)萎蔫病耐受，對紅眼病(pinkeye)具有抗性，對種類A金線蟲、病毒X、塊莖網狀壞死具有高度抗性，且對黑斑擦傷展現一定抗性。塊莖易患內部熱壞死，特別在溫熱乾季之砂質土壤中。在一些種植區域中，較大直徑塊莖(直徑＞4吋)之空心可能很嚴重。塊莖為卵形至圓形，具有淺色至深色的鱗片狀網狀皮、中等淺度芽眼及白色果肉。塊莖休眠期中等時長。由於高產量潛能、高比重及均一塊莖大小及形狀，因此Atlantic為用於自田間或自極短期儲存之切成薄片的標準變種(Webb等人，1978年)。該變種為可育的且主要在東北及東南部種植，尤其用於生產薯片。 本發明提供一種具有重要市場價值的馬鈴薯變種(亦即，Atlantic)，其藉由轉化載體pSIM1278轉化之後藉由第二轉化載體pSIM1678轉化，使用聚合酶鏈式反應而非標記來進行鑑別且成功地被繁殖。亦提供由本發明之馬鈴薯植物變種Y9之塊莖製成的食品製品。根據經濟合作及發展組織(OECD)，馬鈴薯栽培品種Y9具有以下獨特植物變種標識符： 用原生DNA沉默目標基因減少馬鈴薯植物變種Y9之塊莖中目標基因的RNA轉錄物含量。馬鈴薯栽培品種Y9含有藉由多種機制減少塊莖中還原糖含量的表現盒。經由用pSIM1278轉化，引入用於澱粉相關基因(R1
)及磷酸化酶-L基因(PhL
)之啟動子的沉默盒，而用pSIM1678之轉化引入用於轉化酶基因(VInv
；Ye等人，2010)之沉默盒。總言之，此等性狀藉由延緩將澱粉及蔗糖轉化為還原糖(葡萄糖及果糖)而起作用。 因此，本發明之馬鈴薯植物變種Y9之塊莖併有高度合乎需要的性狀，包括游離醯胺胺基酸天冬醯胺及麩醯胺酸之比例降低，此與油炸或烘焙後丙烯醯胺形成減少相關聯。具體言之，本發明之馬鈴薯變種Y9之特徵在於：游離天冬醯胺含量減少兩倍至大於四倍、與黑斑擦傷相關聯之變色減少及對晚疫病之抗性增加。此外，本發明之馬鈴薯變種Y9展現在儲存期間延遲澱粉降解為還原糖葡萄糖及果糖。澱粉至糖轉化之障礙進一步減少老化甜化及丙烯醯胺形成且限制熱誘發之褐變。 由於本發明之馬鈴薯變種Y9之塊莖在熱處理後產生顯著較少的丙烯醯胺且不帶有任何潛在有害的外源基因，因此其在馬鈴薯行業及食品市場中係極其有價值的。實例
本發明使用原生技術將原生非編碼DNA整合至所選馬鈴薯植物變種之基因組中，以研發新型基因內馬鈴薯植物變種。該方法包括：性狀鑑定、載體設計、將載體併入至農桿菌中、選擇受體馬鈴薯變種、植物轉化、證明開放閱讀框之缺失及確認新型馬鈴薯植物變種僅含有原生DNA。本發明之馬鈴薯栽培品種Y9相比於其未經轉化之對應物，具有形成丙烯醯胺之降低之可能性、較少量之蔗糖，且對黑斑擦傷更具有抗性。此外，本發明之馬鈴薯栽培品種Y9對晚疫病之抗性增加。實例 1 ： pSIM1278 轉化載體主鏈
質體pSIM1278為用於轉化馬鈴薯之19.7 kb二元轉化載體。此實例展示遺傳元件之來源、主鏈之選殖步驟及T-DNA序列，以及元件在質體中之次序。 質體主鏈(圖 1
及表 1
)含有兩種明確表徵之細菌性複製起點。pVS1 (pVS1 Sta及Rep)使得能夠將質體維持於農桿菌中，且pBR322 (pBR322 bom及ori)使得能夠將質體維持於大腸桿菌(Escherichia coli
)中。農桿菌DNA超驅動區序列促進RB處之裂解，且大腸桿菌nptII基因為細菌性卡那黴素選擇性標記。主鏈含有包含農桿菌異戊烯基轉移酶(ipt
)基因之表現盒，該異戊烯基轉移酶基因側接有Ranger Russet馬鈴薯多聚泛素(Ubi7
)啟動子及Ranger Russet馬鈴薯多聚泛素(Ubi3
)終止子。ipt
盒為用於選擇質體主鏈DNA整合於宿主植物中之可篩選表現型。當ipt
存在於經轉化植物組織中時，其過度表現引起植物激素細胞分裂素之過度產生，從而導致植物具有發育不良的表現型，葉子異常且不能生根。 主鏈部分並未轉移至植物細胞中。主鏈之各種元件描述於表 1
中。表 1 . pSIM1278 主鏈之 遺傳元件 1
http://www.cambia.org/daisy/cambia/585.html - (pCAMBIA載體之通式結構圖譜)實例 2 ： pSIM1278 轉化載體 T - DNA
用於pSIM1278之包括側接邊緣序列的pSIM1278 DNA插入區長10,148 bp，自1 bp至10,148 bp。pSIM1278 DNA插入序列僅由原生DNA構成且穩定地整合至馬鈴薯基因組中。pSIM1278 DNA插入序列或其功能性部分為整合於本發明之馬鈴薯植物變種中之載體pSIM1278的唯一遺傳物質。 pSIM1278 DNA插入序列描述於下文圖 1
(連同載體主鏈區)、圖 2
及表 2
中。LB及RB序列(各自25 bp)經合成設計成類似於根癌農桿菌之T-DNA邊緣且與其功能類似。修訂GenBank寄存號AY566555以闡明邊緣區域之DNA來源。描述為遺傳元件5及10之ASN1被稱為StAst1 (Chawla等人，2012年)。 質體pSIM1278 T-DNA含有兩個表現盒： 第一盒(元件4至12，表 2
)引起Asn1
及Ppo5
在經轉化馬鈴薯變種中之下調。其由Asn
1之兩個相同405 bp片段及Ppo5
之兩個相同144 bp片段構成。Asn
1及Ppo5
之片段經排列為由非編碼157 bp Ranger Russet馬鈴薯核苷酸間隔元件分離之反向重複序列。Asn1
及Ppo5
片段排列在兩個彙集馬鈴薯啟動子之間，排列在ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因(Agp
)之Agp
啟動子與顆粒結合澱粉合成酶基因(Gbss
)之Gbss啟動子之間，該等啟動子在塊莖中具有主要活性。此等啟動子驅動反向重複序列之表現以產生雙鏈RNA且下調Asn1
及Ppo5
。 第二盒(元件14至21，表 2
)引起PhL
及R1
在經轉化馬鈴薯變種中之下調。其由PhL
啟動子區(pPhL
)之兩個相同509 bp片段及R1
啟動子區(pR1
)之兩個相同532 bp片段構成。pPhL
及pR1
片段經排列為由Ranger Russet馬鈴薯多聚泛素基因之非編碼258 bp片段分離之反向重複序列。類似於第一盒，pPhL
及pR1
片段排列在馬鈴薯Agp
啟動子與Gbss
啟動子之間，且藉由該等啟動子轉錄。表 2 . pSIM1278 T - DNA 之遺傳元件 ， 自左側邊緣位點至右側邊緣
由此，如可自表 1
及表 2
看出，pSIM1278質體為經設計用於馬鈴薯植物轉化之二元載體。載體主鏈含有在大腸桿菌及農桿菌兩者中用於複製之序列以及用於篩選以消除帶有載體主鏈DNA之植物的ipt
標記。T-DNA區由側接有LB及RB序列之兩個表現盒構成。在用含有pSIM1278載體之農桿菌接種宿主植物組織後，pSIM1278之T-DNA區轉移至宿主基因組中。 描述於表 2
中用於產生本發明之馬鈴薯栽培品種Y9之DNA插入序列並不激活鄰近基因且不會不利地影響馬鈴薯植物變種之表現型。實例 3 ： pSIM1678 轉化載體主鏈
質體pSIM1678為用於轉化馬鈴薯之18.6 kb二元轉化載體。此實例展示遺傳元件之來源、主鏈之選殖步驟及T-DNA序列，以及元件在質體中之次序。 質體主鏈(圖 3
；表 3
)含有兩種明確表徵之細菌性複製起點。pVS1 (pVS1 Sta及Rep)使得能夠將質體維持於農桿菌中，且pBR322 (pBR322 bom及ori)使得能夠將質體維持於大腸桿菌中。農桿菌DNA超驅動區序列促進RB處之裂解，且大腸桿菌nptII基因為細菌性卡那黴素選擇性標記。主鏈含有包含農桿菌異戊烯基轉移酶(ipt
)基因之表現盒，該農桿菌異戊烯基轉移酶基因側接有Ranger Russet馬鈴薯多聚泛素(Ubi7
)啟動子及Ranger Russet馬鈴薯多聚泛素(Ubi3
)終止子(Garbarino及Belknap，1994年)。ipt
盒為用於選擇質體主鏈DNA整合於宿主植物中之可篩選表現型。當ipt
存在於經轉化植物組織中時，其過度表現引起植物激素細胞分裂素之過度產生，從而導致植物具有發育不良的表現型，葉子異常且不能生根。 主鏈部分並未轉移至植物細胞中。主鏈之各種元件描述於表 3
中。表 3 . pSIM1678 主鏈之 遺傳元件 實例 4 ： pSIM1678 轉化載體 T - DNA
用於pSIM1678之包括側接邊緣序列的pSIM1678 DNA插入區長9,090 bp，自1 bp至9,090 bp。pSIM1678 DNA插入序列僅由原生DNA構成且穩定地整合至馬鈴薯基因組中。pSIM1678 DNA插入序列或其功能性部分為整合於本發明之馬鈴薯植物變種中之載體pSIM1678的唯一遺傳物質。 pSIM1678 DNA插入序列描述於下文圖 3
(連同載體主鏈區)及表 4
中。在表 4
中，LB及RB序列(各自25 bp)經合成設計成類似於根癌農桿菌之T-DNA邊緣且與其功能類似。修訂GenBank寄存號AY566555以闡明邊緣區域之DNA來源。 質體pSIM1678 T-DNA為1-bp至9,090-bp且含有兩個表現盒(圖 3
)： 第一盒(元件4至6，表 4
)含有來源於馬鈴薯(Solanum venturii)之2,626 bpRpi - vnt1
(Vnt1
)基因。基因產物VNT1為與保護馬鈴薯免受致病疫黴引起之晚疫病感染之植物免疫反應有關的R型蛋白質。基因在原生Vnt1
啟動子pVnt1及終止子tVnt1下表現。 第二盒(元件8至14，表 4
)引起維管轉化酶(VInv
)在經轉化馬鈴薯變種中之下調。其由兩個VInv
片段(元件10及12，表 4
)構成，該等片段經排列為分離開之反向重複序列。VInv
片段排列在兩個彙集馬鈴薯啟動子之間，排列在ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因(Agp
)之Agp
啟動子與顆粒結合澱粉合成酶基因(Gbss
)之Gbss啟動子之間，該等啟動子在塊莖中具有顯著活性。此等啟動子驅動反向重複序列之表現以產生雙鏈RNA且下調VInv
。表 4 . pSIM1678 T - DNA 之遺傳元件 ， 自左側邊緣位點至右側邊緣
由此，如可自表 3
及表 4
看出，pSIM1678質體為經設計用於馬鈴薯植物轉化之二元載體。載體主鏈含有在大腸桿菌及農桿菌兩者中用於複製之序列以及用於篩選以消除帶有載體主鏈DNA之植物的ipt
標記。T-DNA區由側接有LB及RB序列之兩個表現盒構成。在用含有pSIM1678載體之農桿菌接種宿主植物組織後，pSIM1678之T-DNA區轉移至宿主基因組中。實例 5 ：農桿菌菌株及轉染
藉由精確地使高毒力質體pTiBo542之轉移DNA缺失來研發C58源性農桿菌菌株AGL1 (Lazo等人，1991年)。將轉座子插入一般性重組基因(recA)中使諸如pSIM1278之重組質體載體穩定(圖 1
)。AGL1呈現對羧苄青黴素(carbenicillin)及立複黴素(rifampicin)之抗性，且使用特泯菌(timentin)自經轉化馬鈴薯組織消除。在選擇之後，藉由插入至植物基因組中之源於馬鈴薯之表現盒，植物不含有抗生素及農桿菌兩者。 將母株植物維持於具有40 ml半強度(half-strength) M516 (Phytotechnology)培養基之培養箱(magenta box)中，該培養基含有3%蔗糖及2 g/l結冷膠(繁殖介質)。自四週齡植物切下四至六毫米之馬鈴薯節間段，用攜載pSIM1278之農桿菌AGL1菌株感染，且轉移至含有3%蔗糖及6 g/l瓊脂(共栽培介質)之組織培養基中。在兩天之後，將經感染外植體轉移至含有3%蔗糖、6 g/l瓊脂及150 mg/l特泯菌之M404 (Phytotechnology)培養基中以消除農桿菌(無激素培養基)。該等方法之細節描述於Richael等人(2008年)中。 在一個月之後，將經感染外植體轉移至缺乏任何合成激素之新鮮培養基中，且在Percival生長箱中在24℃下於16小時光週期下進行培育，該等經感染外植體在生長箱中開始形成嫩芽。許多嫩芽表現ipt
基因且呈現細胞分裂素過度產生之表現型；不考慮將此等嫩芽用於進一步分析。PCR基因分型表明，其餘嫩芽中有約0.3%至1.5%在缺乏ipt
基因的同時，亦含有至少部分P-DNA。因此，未使用標記來選擇經轉化植物。關於不含基於ipt
之標記之植物轉化的細節由Richael等人公開(2008年)。 在外植體感染兩天後，開始進行消除農桿菌之程序。出於此目的，使組織經受抗生素特泯菌(150 mg/L)處理，直至證實其不含活的農桿菌為止。藉由在28℃下，在營養培養液酵母提取物(NBY培養基)上培育具有轉化事件之莖幹片段2週而獲得證據。(重複兩次)。根據97 CFR第340部分，僅當不含活的農桿菌時才運輸經轉化植物且將其種植在田間。 Atlantic Y9項目含有由用具有不同質體進行之兩個獨立轉化得到的插入序列。第一插入序列，即質體pSIM1278，含有由經設計以使塊莖中多達四個馬鈴薯基因，即Asn1、Ppo5、R1及PhL沉默之反向重複序列構成之兩個盒。類似地，第二質體pSIM1678含有由使塊莖中之VInv基因沉默之反向重複序列構成之盒，該盒同時亦含有在原生馬鈴薯啟動子下之Rpi-vnt1基因之複本。 藉由DNA凝膠印跡分析來分析馬鈴薯植物變種，以測定所整合之DNA插入序列之結構及複本數且確認不存在載體主鏈序列。實例
6： 證明不存在載體主鏈
DNA 不同於許多商業轉基因作物，本發明之馬鈴薯栽培品種藉由以下兩種不同方法來確認不含用於轉化之源於農桿菌之DNA序列(諸如，載體主鏈DNA)：1)首先，判定載體主鏈中負選擇性異戊烯基異構酶(ipt
)標記基因之存在或缺失，如將包含ipt
基因表現盒之主鏈DNA自農桿菌無意轉移至植物細胞將觸發ipt
基因表現，且因此形成細胞分裂素類型激素異戊烯基腺苷，若植物具有與該質體主鏈中之負選擇性異戊烯基異構酶(ipt
)標記基因相關聯之表現型，則棄去該等植物；及2)接著對已經過第一輪篩選方法之經轉化馬鈴薯植物使用南方墨點(southern blot)雜交以確認不存在主鏈DNA。 由此，以上兩個分析已展示，Atlantic Y9項目不含有來自用於轉化之任一質體之主鏈。實例 7 ： 所插入 DNA 之穩定性
細菌性T-DNA在插入至植物中之後並非總是穩定的。所估計不穩定率(0.5-5.9×10- 4
)與減數分裂相關聯(Müller等人，1987年；Conner等人，1998年)，此與馬鈴薯不相關，因為馬鈴薯係以無性繁殖再產生的。因此，預期DNA插入序列為穩定的。由於塊莖為商業種植的，故使用塊莖而非種子來定義後續代。 使用分子及表現型分析來評定遺傳穩定性。對三代Y9馬鈴薯(G0至G3)內分離之基因組DNA使用南方墨點分析展示，插入序列之結構係穩定的，而藉由量測第二代田間種植塊莖中之多酚氧化酶活性來評定表現型穩定性。此方法展示在向馬鈴薯之切割表面施加兒茶酚之後PPO沉默之可視證據。進行此等研究以確保Y9中之所需遺傳變化在維持性狀的同時在多個純系循環內保持穩定。 藉由使用南方墨點法比較三個連續純系代(G1、G2及G3)與初始轉化體(G0)來評估DNA插入序列之穩定性。預期穩定的DNA插入序列維持相同結構且因此在植物之多個代內產生相同酶切剪切模式。為測試Y9項目中之插入序列之穩定性，使用雜合至pSIM1278及pSIM1678兩者之插入序列之區域的兩個探針(GBS1及AGP)及對pSIM1678插入序列具有特異性之兩個探針(INV及VNT1)來比較其剪切模式。由於與此等探針雜合之DNA序列包含於馬鈴薯基因組中以及在一或多個DNA插入序列內，因此預期內源性及插入序列特異性條帶兩者皆在南方墨點中。 所有基因組DNA樣品皆用限制酶EcoRV來進行酶切，且與對AGP或GBS1中任一者具有特異性之探針雜交。選擇EcoRV用於此等研究，此係由於EcoRV在兩個插入序列內剪切以提供獨特條帶模式，在pSIM1278插入序列中具有預測大小(例如，2.3 kb)之固有條帶。在所有Y9樣品之間的條帶模式對於兩個探針彼此等同。存在於Atlantic對照組中之多個條帶亦在Y9中發現，但Y9亦含有對應於pSIM1278及pSIM1678插入序列之條帶。在所有所分析之Y9之代之間此等條帶類似地為一致的，從而指示兩個插入序列之遺傳穩定性。 使用對pSIM1678插入序列具有特異性之兩個探針進行第二分析。對於此分析，用限制酶(XbaI)剪切基因組DNA樣品，並與VNT1及INV探針雜交。選擇XbaI作為限制酶用於此等研究，此係由於XbaI內部地剪切pSIM1678並產生已知大小(例如，用於針對INV探針為4.6 kb)之一條帶。再者，內源性及特異性插入序列條帶兩者皆偵測具有與三個所分析代之間一致的條帶模式。遺傳及表現型分析指示，自pSIM1278及pSIM1678兩者之轉化產生之插入序列在三代內係穩定的。鑒於三代內所表明之穩定性，有可能在後續無性繁殖之循環期間將維持穩定性。實例 8 ： 基因沉默之效果及組織特異性
藉由引入含有來源於基因之序列的反向重複序列及靶向用於沉默之啟動子，來達成沉默。儘管存在與雙鏈RNA介導之沉默有關之若干平行路徑，但認為此等反向重複序列之轉錄為經與病毒防衛有關之細胞機制加工(Fusaro等人，2006年)。Y9馬鈴薯含有三個獨特盒，該等盒含有來自總共五個不同馬鈴薯基因之序列。pSIM1278結構由兩個基因沉默盒構成(參見圖 4
，上游結構)。一個盒含有來自兩個基因(天冬醯胺合成酶-1 (Asn1
)及多酚氧化酶-5 (Ppo5
))之序列之反向重複序列。第二個盒包括來自澱粉相關基因(R1
(531-bp)及磷酸化酶-L (PhL
) (508-bp))之啟動子的序列。經由pSIM1678結構引入最後一個盒，該盒包括含有來自液泡轉化酶(VInv
)基因之序列的反向重複序列(參見圖 4
，下游結構)。 所有三個沉默盒受自馬鈴薯之Agp
及Gbss
基因之同一組明確表徵及組織特異性啟動子調控，相比於光合活性組織及根，該等啟動子在塊莖中具有高度活性(Nakata等人，1994年；Visser等人，1991年)。因此，預期表現及基因沉默在塊莖中最有效且很大程度上受限於塊莖。 所有五個靶標基因之表現以北方印跡(northern blot)分析來表徵，以測定每一盒之基因沉默效果。且如下文表 5
所展示，所有五個基因在塊莖中皆展示為下調。表 5 . RNAi 靶基因在 Y9 組織中表現之彙總 1
ü = 下調，- =不下調，n/o =未觀測到。 在Y9項目中觀測到Asn1
、Ppo5
、PhL
、R1
及VInv
基因之塊莖特異性下調。除葉中之Asn1
以及花中之Asn1
及VInv
部分下調以外，其他組織中之表現水準不受影響。實例 9 ：馬鈴薯栽培品種 Y9 特徵概述
藉由提高對晚疫病之抗性、減少造成黑斑擦傷之酶的表現及經由降低反應物(亦即天冬醯胺及還原糖)之濃度而減少丙烯醯胺，馬鈴薯變種Y9解決馬鈴薯產業改良品質之需要。用原生於馬鈴薯植物基因組且不含有外源DNA、農桿菌DNA、病毒標記或載體主鏈序列之核酸序列來轉化馬鈴薯變種Y9。另外，進行農藝研究以確保除與性狀相關聯之特徵外，項目與常規對照組相同生長。 在2014年期間在七個美國地點進行田間試驗。此研究之目的係評估Y9馬鈴薯相比於未轉化對照組(親本變種Atlantic)之表現型效能、塊莖及生態交互作用。 表現型、塊莖及生態交互作用研究確實指示，Y9與Atlantic對照組之間無任何有意義的差異。 針對表現型特徵中之任一者之偵測不存在統計學差異，從而指示就表現型而言Y9與Atlantic相當。 對於塊莖評定，Y9之比重高於對照組，但在可見於常規馬鈴薯之值之範圍內。 此改變不會更改Y9之環境影響，該環境影響與常規馬鈴薯係相同的。 對於昆蟲、疾病、及非生物應激源以及節肢動物豐度無差異支援Y9之生態交互作用與習知馬鈴薯相同之結論。表 6 . 表現型、產量及定級特徵
表現型效能、塊莖評估及生態交互作用研究未指示Y9與Atlantic對照組之間存在任何有意義的差異。對於表現型特徵中之任一者之偵測不存在統計學差異。對於塊莖評估，Y9之比重高於對照組，但在可見於常規馬鈴薯中之值之範圍內。此改變不會更改Y9之環境影響，該環境影響與常規馬鈴薯係相同的。對於昆蟲、疾病、及非生物應激源以及節肢動物豐度無差異支援Y9之生態交互作用與常規馬鈴薯相同之結論。實例 10A ： 2013 年 實驗 ， 馬鈴薯栽培品種 Y9 晚疫病效果
此研究之目的係評估馬鈴薯項目Y9對葉面晚疫病(致病疫黴)之田間效果。 在2013年期間在三個地點進行田間試驗。用US-8、US-22及/或US-23晚疫病菌株來接種樣地。在整個季節中對葉面感染之程度進行定級。 相比於Y9之非轉化親本對照組，在Y9中觀測到晚疫病葉面感染顯著減少，從而表明晚疫病抗性性狀對所測試致病疫黴菌株之效果。實例 10B ： 2014 年 實驗 ， 馬鈴薯栽培品種 Y9 晚疫病效果
此研究之目的係評估馬鈴薯項目Y9對葉面晚疫病(致病疫黴)之田間效果。 在2014年期間在兩個地點進行田間試驗。用US-23晚疫病菌株來接種樣地。在整個季節中對葉面感染之程度進行定級。 相比於Y9之非轉化親本對照組，在Y9中觀測到晚疫病葉面感染顯著減少，從而表明晚疫病抗性性狀對所測試致病疫黴菌株之效果。以引用之方式併入
本文中所引用之所有參考文獻、論文、公開案、專利、專利公開案以及專利申請案皆出於所有目的以全文引用的方式併入。然而，提及本文引用之任何參考文獻、論文、公開案、專利、專利公開案以及專利申請案，不視為且不應認為係承認或以任何形式暗示其構成有效現有技術或形成世界上任何國家的公共常識的部分。 應理解，上文描述僅為說明性實施例及實例之表示。出於讀者之便利性，上文描述聚焦於教示本發明之原理之所有可能實施例、實例之受限數量的代表性實例。描述不試圖窮盡列舉所有可能變化或甚至所有彼等所描述變化之組合。可能本發明之特定部分未提出替代實施例，或對部分而言可能可獲得之其他未描述替代實施例，但不應認為不承認彼等替代實施例。一般技術者應瞭解，許多彼等未描述實施例包括在技術及材料上之差異而非在本發明之原理之應用上差異。因此，本發明並不意欲受限於小於以下申請專利範圍中所闡述之範疇及等效物。參考文獻
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, 523-531.寄存資訊
J. R. Simplot Company專用馬鈴薯栽培品種Y9 (上文所揭示且在所附申請專利範圍中敍述)之塊莖已寄存在美國典型培養物保藏中心(ATCC)，10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110。寄存日期為2015年6月17日。自本申請案之申請日之前，50小瓶微管之寄存係自由J.R. Simplot Company維持之同一寄存取出。所有限制將在專利授予後不可撤銷地移除，且該寄存意欲滿足37 C.F.R. §§ 1.801-1.809之所有需求。ATCC寄存編號為PTA - 122247
。寄存將在儲藏所中維持三十年時間、或在最後一次請求之後五年或專利之有效期，視較長時間而定，且在彼時期間將視需要進行替換。
圖 1
描繪pSIM1278轉化載體。左側之載體主鏈區長9,512 bp，如其在位置10,149 bp處開始且在位置19,660 bp處結束。主鏈DNA主要由細菌DNA構成，該細菌DNA在植物轉化之前提供對DNA插入序列之支撐維護。包括側接邊緣序列之DNA插入區(右側)長10,148 bp (自1 bp至10,148 bp)。DNA插入序列在轉化後穩定地整合至馬鈴薯基因組中。圖 2
提供插入於pSIM1278轉化載體中之DNA插入序列中的沉默盒之示意性表示。每一沉默盒含有由間隔區分隔之兩種基因片段的兩個複本。包含四個靶向基因片段(亦即Asn-1、Ppo-5、Phl及R1)之DNA段的兩個複本以反向重複序列之形式插入於在塊莖中具有顯著活性的兩個彙集啟動子(表示為Pro)之間。含有所得沉默盒之植物在塊莖中產生多樣化且未聚腺苷酸化之RNA分子陣列，該RNA分子陣列動態地且劇烈地使所欲靶基因沉默。RNA分子之大小一般小於兩個所採用啟動子之間的距離，此係因為彙集轉錄引起碰撞轉錄。圖 3
描繪本發明之pSIM1678轉化載體。左側之載體主鏈區長9,512 bp，如其在位置9,091 bp處開始且在位置18,602 bp處結束。主鏈DNA主要由細菌DNA構成，該細菌DNA在植物轉化之前提供對DNA插入序列之支撐維護。包括側接邊緣序列之DNA插入區(右側)長9,090 bp (自1 bp至9,090 bp)。DNA插入序列僅由原生DNA構成且在轉化後穩定地整合至馬鈴薯基因組中。圖 4
提供插入於pSIM1278轉化載體(上游結構)中之DNA插入序列中之沉默盒及插入於pSIM1678轉化載體(下游結構)中之DNA插入序列中之沉默盒的示意性表示。圖 5
說明用於利用如表 1
及表 2
中所描述之DNA序列來構建質體pSIM1278之方法。起始載體pCAMBIA1301含有最終pSIM1278主鏈中之複製起點。圖 6
說明pSIM1278中之T-DNA表現盒之結構。使用融合PCR來擴增元件1A (pAgp第一複本)、元件1B (pAgp第二複本)、元件2 (Asn1、Ppo5)、元件3 (Ppo5、Asn1)、元件4 (pGbss第一複本)及元件7 (間隔區1、Ppo5、Asn1)。基於來自馬鈴薯基因組之序列藉由Blue Heron Biotechnology, Inc. (Bothell, WA)合成元件5 (PhL、R1)及元件6 (間隔區2、R1、PhL、pGbss)。藉由接合圖式中展示之建構嵌段而產生元件8、9及10。最後，形成三個片段(10、11及6)以涵括所需表現盒。接合此等三個片段且將其插入至圖 5
中展示之KpnI-SacI限制位點中以產生pSIM1278。圖 7
說明用於利用如表 3
及表 4
中所描述之DNA序列來構建質體pSIM1678之方法。起始載體pSIM1278含有最終pSIM1678主鏈。
Claims (29)
- 一種馬鈴薯栽培品種Y9之馬鈴薯塊莖或塊莖之部分，其中該塊莖之代表性樣本以ATCC寄存編號PTA - 122247 寄存。
- 一種馬鈴薯植物或其部分，其係藉由種植如請求項1之塊莖或該塊莖之部分而產生。
- 一種馬鈴薯植物，其具有如請求項2之植物的所有生理學及形態學特徵，且該馬鈴薯植物包含存在於栽培品種Y9中之pSIM1278插入區，該pSIM1278插入區除了含有磷酸化酶-L基因及二激酶R1基因之內源性馬鈴薯啟動子之反向重複序列外，亦含有有效抑制內源性天冬醯胺合成酶-1基因及內源性多酚氧化酶-5基因之表現的馬鈴薯DNA之反向重複序列，且該馬鈴薯植物進一步包含存在於Y9中之pSIM1678插入區，該pSIM1678插入區含有馬鈴薯晚疫病抗性基因Rpi -vnt1 及有效抑制內源性液泡轉化酶基因VInv 之表現的馬鈴薯DNA之反向重複序列。
- 一種由如請求項2之植物產生之細胞的組織培養物，其中該組織培養物之該等細胞係由選自由葉、花粉、胚芽、子葉、下胚軸、分生組織細胞、根、根尖、雌蕊、花藥、花、莖幹及塊莖組成之群的植物部分產生，且其中該等組織培養細胞包含存在於栽培品種Y9中之pSIM1278插入區，該pSIM1278插入區除了含有磷酸化酶-L基因及二激酶R1基因之內源性馬鈴薯啟動子之反向重複序列外，亦含有有效抑制內源性天冬醯胺合成酶-1基因及內源性多酚氧化酶-5基因之表現的馬鈴薯DNA之反向重複序列，且該等組織培養細胞進一步包含存在於Y9中之pSIM1678插入區，該pSIM1678插入區含有馬鈴薯晚疫病抗性基因Rpi - vnt1 及有效抑制內源性液泡轉化酶基因VInv 之表現的馬鈴薯DNA之反向重複序列。
- 一種由如請求項4之組織培養物再生之馬鈴薯植物，其中該植物具有馬鈴薯栽培品種Y9之所有生理學及形態學特徵。
- 一種馬鈴薯種子，其係藉由種植如請求項1之馬鈴薯塊莖或該塊莖之部分而產生，其中該種子包含存在於栽培品種Y9中之pSIM1278插入區，該pSIM1278插入區除了含有磷酸化酶-L基因及二激酶R1基因之內源性馬鈴薯啟動子之反向重複序列外，亦含有有效抑制內源性天冬醯胺合成酶-1基因及內源性多酚氧化酶-5基因之表現的馬鈴薯DNA之反向重複序列，且該種子進一步包含存在於Y9中之pSIM1678插入區，該pSIM1678插入區含有馬鈴薯晚疫病抗性基因Rpi - vnt1 及有效抑制內源性液泡轉化酶基因VInv 之表現的馬鈴薯DNA之反向重複序列。
- 一種馬鈴薯植物或其部分，其係藉由種植如請求項6之種子而產生。
- 一種由如請求項7之馬鈴薯植物的組織培養物再生之馬鈴薯植物，其中該再生植物包含存在於栽培品種Y9中之pSIM1278插入區，該pSIM1278插入區除了含有磷酸化酶-L基因及二激酶R1基因之內源性馬鈴薯啟動子之反向重複序列外，亦含有有效抑制內源性天冬醯胺合成酶-1基因及內源性多酚氧化酶-5基因之表現的馬鈴薯DNA之反向重複序列，且該再生植物進一步包含存在於Y9中之pSIM1678插入區，該pSIM1678插入區含有馬鈴薯晚疫病抗性基因Rpi - vnt1 及有效抑制內源性液泡轉化酶基因VInv 之表現的馬鈴薯DNA之反向重複序列。
- 一種用於產生馬鈴薯種子之方法，該方法包含使兩種馬鈴薯植物雜交且收穫所得馬鈴薯種子，其中至少一種馬鈴薯植物為如請求項2之馬鈴薯植物。
- 一種用於產生馬鈴薯種子之方法，該方法包含使兩種馬鈴薯植物雜交且收穫所得馬鈴薯種子，其中至少一種馬鈴薯植物為如請求項7之馬鈴薯植物。
- 一種由如請求項10之方法產生之馬鈴薯種子，其中該種子包含存在於栽培品種Y9中之pSIM1278插入區，該pSIM1278插入區除了含有磷酸化酶-L基因及二激酶R1基因之內源性馬鈴薯啟動子之反向重複序列外，亦含有有效抑制內源性天冬醯胺合成酶-1基因及內源性多酚氧化酶-5基因之表現的馬鈴薯DNA之反向重複序列，且該種子進一步包含存在於Y9中之pSIM1678插入區，該pSIM1678插入區含有馬鈴薯晚疫病抗性基因Rpi - vnt1 及有效抑制內源性液泡轉化酶基因VInv 之表現的馬鈴薯DNA之反向重複序列。
- 一種馬鈴薯植物或其部分，其係藉由種植如請求項11之馬鈴薯種子而產生。
- 一種由如請求項12之植物產生之馬鈴薯種子，其中該種子包含存在於栽培品種Y9中之pSIM1278插入區，該pSIM1278插入區除了含有磷酸化酶-L基因及二激酶R1基因之內源性馬鈴薯啟動子之反向重複序列外，亦含有有效抑制內源性天冬醯胺合成酶-1基因及內源性多酚氧化酶-5基因之表現的馬鈴薯DNA之反向重複序列，且該種子進一步包含存在於Y9中之pSIM1678插入區，該pSIM1678插入區含有馬鈴薯晚疫病抗性基因Rpi - vnt1 及有效抑制內源性液泡轉化酶基因VInv 之表現的馬鈴薯DNA之反向重複序列。
- 如請求項9之方法，其中該等馬鈴薯植物中之一者為馬鈴薯栽培品種Y9且第二種馬鈴薯植物為轉基因。
- 一種產生馬鈴薯種子之方法，該方法包含使兩種馬鈴薯植物雜交且收穫所得馬鈴薯種子，其中該等馬鈴薯植物中之一者為如請求項7之馬鈴薯植物且第二種馬鈴薯植物為轉基因。
- 一種馬鈴薯植物或其部分，其係藉由種植由如請求項14之方法產生的種子而產生，其中該植物包含存在於栽培品種Y9中之pSIM1278插入區，該pSIM1278插入區除了含有磷酸化酶-L基因及二激酶R1基因之內源性馬鈴薯啟動子之反向重複序列外，亦含有有效抑制內源性天冬醯胺合成酶-1基因及內源性多酚氧化酶-5基因之表現的馬鈴薯DNA之反向重複序列，且該植物進一步包含存在於Y9中之pSIM1678插入區，該pSIM1678插入區含有馬鈴薯晚疫病抗性基因Rpi - vnt1 及有效抑制內源性液泡轉化酶基因VInv 之表現的馬鈴薯DNA之反向重複序列。
- 一種將所需性狀引入至馬鈴薯栽培品種Y9中之方法，其中該方法包含: (a) 使Y9植物與包含所需性狀之另一馬鈴薯栽培品種之植物雜交以產生子代植物，其中該Y9植物之塊莖之代表性樣本以ATCC寄存編號PTA - 122247 寄存，其中該所需性狀係選自由以下各者組成之群：雄性不育、除草劑抗性、昆蟲抗性、經修飾之脂肪酸代謝、經修飾之碳水化合物代謝及對細菌性疾病、真菌性疾病或病毒性疾病之抗性； (b) 選擇具有該所需性狀之一或多個子代植物； (c) 使該等所選子代植物與Y9植物回交以產生回交子代植物； (d) 選擇具有該所需性狀之回交子代植物；及 (e) 依次地重複步驟(c)及(d)兩次或多於兩次，以產生包含該所需性狀之所選第三代或更高代回交子代植物。
- 一種由如請求項17之方法產生之馬鈴薯植物，其中該植物具有所需性狀且包含存在於栽培品種Y9中之pSIM1278插入區，該pSIM1278插入區除了含有磷酸化酶-L基因及二激酶R1基因之內源性馬鈴薯啟動子之反向重複序列外，亦含有有效抑制內源性天冬醯胺合成酶-1基因及內源性多酚氧化酶-5基因之表現的馬鈴薯DNA之反向重複序列，且該植物進一步包含存在於Y9中之pSIM1678插入區，該pSIM1678插入區含有馬鈴薯晚疫病抗性基因Rpi - vnt1 及有效抑制內源性液泡轉化酶基因VInv 之表現的馬鈴薯DNA之反向重複序列。
- 如請求項18之馬鈴薯植物，其中該所需性狀為除草劑抗性且賦予對選自由以下各者組成之群之除草劑的抗性：咪唑啉酮、磺醯脲、草甘膦(glyphosate)、草銨膦(glufosinate)、L-草丁膦(L-phosphinothricin)、三嗪及苯甲腈。
- 如請求項18之馬鈴薯植物，其中該所需性狀為昆蟲抗性且該昆蟲抗性由編碼蘇力菌(Bacillus thuringiensis )內毒素之轉基因賦予。
- 如請求項18之馬鈴薯植物，其中該所需性狀為經修飾之脂肪酸代謝或經修飾之碳水化合物代謝，且該所需性狀由編碼選自由果糖基轉移酶、聚果糖蔗糖酶、α-澱粉酶、轉化酶及澱粉分支酶組成之群之蛋白質的核酸或編碼硬脂醯-ACP去飽和酶之反義鏈的DNA賦予。
- 一種製造商業植物產品之方法，其包含獲得如請求項2之植物或其部分，及自該植物或其植物部分製造該商業植物產品，其中該商業植物產品係選自由以下各者組成之群：新鮮的完整馬鈴薯、炸薯條、馬鈴薯片、脫水馬鈴薯材料、馬鈴薯雪片及馬鈴薯顆粒。
- 一種由如請求項22之方法製造之商業植物產品，其中該產品包含存在於栽培品種Y9中之pSIM1278插入區，該pSIM1278插入區除了含有磷酸化酶-L基因及二激酶R1基因之內源性馬鈴薯啟動子之反向重複序列外，亦含有有效抑制內源性天冬醯胺合成酶-1基因及內源性多酚氧化酶-5基因之表現的馬鈴薯DNA之反向重複序列，且該產品進一步包含存在於Y9中之pSIM1678插入區，該pSIM1678插入區含有馬鈴薯晚疫病抗性基因Rpi - vnt1 及有效抑制內源性液泡轉化酶基因VInv 之表現的馬鈴薯DNA之反向重複序列。
- 一種由如請求項1之馬鈴薯塊莖製成之食品產品。
- 一種由如請求項1之馬鈴薯塊莖製成之食品產品，其中該食品產品為切片之馬鈴薯塊莖食品產品。
- 一種由如請求項1之馬鈴薯塊莖製成之食品產品，其中該食品產品為炸薯條或薯片。
- 一種由如請求項1之馬鈴薯塊莖獲得之熱加工塊莖產品。
- 一種由如請求項1之馬鈴薯塊莖獲得之熱加工塊莖產品，其中該熱加工塊莖產品係選自由炸薯條、薯片及烘焙馬鈴薯組成之群。
- 一種由如請求項1之馬鈴薯塊莖獲得之熱加工塊莖產品，其中該熱加工塊莖產品係選自由炸薯條、薯片及烘焙馬鈴薯組成之群，其中該熱加工塊莖產品具有比對照熱加工塊莖產品之丙烯醯胺濃度至少低50%、低60%、低70%、低80%、低85%或低更多之丙烯醯胺濃度，該對照熱加工塊莖產品係由不包含存在於栽培品種Y9中之pSIM1278插入區及pSIM1678插入區之對照馬鈴薯植物獲得。
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