JP6204571B2 - バレイショ栽培品種e12 - Google Patents
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- C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
- C12N15/8289—Male sterility
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
Description
本出願は、米国仮特許出願第61/818,752号(2013年5月2日出願)に対する優先権を主張し、その全体は、本書中で参考によって組み込まれる。
対立遺伝子。対立遺伝子は、1つの形質又は特徴に関する遺伝子の1つ以上の代替形態のいずれかである。二倍体細胞又は生物において、所定の遺伝子の2つの対立遺伝子は、一対の相同染色体上の対応する遺伝子座を占める。
本発明において使用される形質転換ベクターpSIM1278は、pSIM106に由来し、これを、0.4−kbバレイショ植物DNA断片(GenBank登録番号AY566555として寄託される)を、プラスミドpVS1及びpBR322由来の細菌の複製起点並びにカナマイシンに対する細菌耐性のためのnptIII遺伝子を有するpCAMBIA1301(CAMBIA,Canberra,Australia)の5.9−kb SacII−SphI断片に連結することによって作製した。アグロバクテリウムipt遺伝子、並びにそれに先行するUbi−3プロモーター(Garbarino and Belknap,1994)及び後に従うUbi−3ターミネーターを含む発現カセットを、ベクター骨格内に、2.6−kb SacII断片として導入した(Rommens et al.,2004)。2つのサイレンシングカセットを有するネイティブな10−kb DNAセグメントのpSIM106のDNA挿入物への挿入は、pSIM1278を生じた。このベクターを、全ての形質転換に用いた。pSIM1278ベクターマップを、図1に示す。ベクター骨格領域は、9,511bpであり、9,957bpの位置にて開始し、19,468bpの位置にて終わる。骨格DNAは、主に、細菌DNAから成り、植物形質転換の前のDNA挿入物の維持の指示を提供する。骨格部分は、植物細胞内に形質移入されない。骨格の種々のエレメントを、表1に記載する。
pSIM1278において使用したDNA挿入領域は、10,147bp長(19,469bp〜19,660bp及び1bp〜9,956bp)である。DNA挿入物は、ネイティブのDNAのみから成り、バレイショ遺伝子内に安定的に組み込まれる。DNA挿入物及びその機能的部分は、ベクターpSIM1278の遺伝物質のみであり、本発明のバレイショ植物変種内に組み込まれる。DNA挿入物は、図2及び以下の表2に記載される。
C58由来のアグロバクテリウム株AGL1を、強毒性プラスミドpTiBo542(Lazo et al.,1991).の運搬DNAの正確な結失によって開発した。一般的組換え遺伝子(recA)におけるトランスポゾン挿入は、pSIM1278のような組換えプラスミドベクターを安定化する(図1)。AGL1は、カルベニシリン及びリファンピシンに対する耐性を示し、チメンチンを用いて形質転換したバレイショ組織から除去される。
多くの市販のトランスジェニック作物と違い、本発明のバレイショ栽培品種E12は、ベクター骨格DNAなどの形質転換のために使用したアグロバクテリウム由来配列を非含有であることを、3つの異なる方法によって確認した:1)第1に、ベクター骨格内のネガティブ選択可能イソペンテニルイソメラーゼ(ipt)マーカー遺伝子の存在又は非存在を、ipt遺伝子発現及びその結果であるサイトキニン型ホルモンイソペンテニルアデノシンの形成を引き起こす、アグロバクテリウム由来のipt遺伝子発現カセットを含む骨格DNAの植物細胞への偶発性輸送として決定した、2)次いで、サザンブロットハイブリダイゼーションが形質転換バレイショ植物に対して使用され、骨格DNAの非存在を確認するための第1スクリーニング方法に回され、並びに3)次いで、境界領域と隣接する骨格DNAとの結合部又はDNA挿入物に隣接する骨格DNA内の領域を示す断片を増幅するためのPCRを設計した。本方法の有効性を、pSIM1278 DNAを陽性対照として使用して確認した。本発明のバレイショ栽培品種E12は、ベクター骨格DNAの存在の指標であるPCRバンドを生成しなかった。
DNA挿入物の安定性を、元の形質転換体において、並びに増殖させた植物材料において再び、どちらもDNAゲルブロットハイブリダイゼーション及び形質評価を用いて評価した。これらの研究を、遺伝子内事象が、信頼のできる様式で一定して組み込まれた形質を発現することを確認するために行った。不安定性は、稀な組換え事象によって起こり得るか、又は、メチル化によっても起こり得る。バレイショは、通常、クローン的に増殖されるので、生殖増殖作物についての標準的評価は、直接適用可能ではなく、種子よりもむしろ塊茎を、その後の世代を決定するために使用した。DNAブロットハイブリダイゼーションの結果は、一定のバンドが多くの世代において存在したことを示し、従って、安定的であることを示した。安定性についてのさらなる証拠を、1及び2の塊茎種子の世代において形質有効性を確認することによって得た。
少なくとも1つのDNA挿入物/隣接DNA結合部を、アダプター連結媒介型PCR又は熱非対称インターレースPCRのいずれかを用いて配列決定した。連結部配列を、バレイショ栽培品種E12についてのプライマーを設計するために用い、これらのプライマーを、変種特異的PCRベース検出方法のために適用した。開発したこの方法を、野外及び貯蔵において植物及び塊茎をモニタリングするために使用し、塊茎又は加工食品中の遺伝子内材料の非存在を確認し、有機種子の純度を保証した。
遺伝子サイレンシング方法を使用し、Asn1、Ppo5、PhL及びR1のネイティブなタンパク質の活性を低下させ、タンパク質量よりもむしろ転写物レベルを評価し、新規な表現型形質と分子レベルでの変化とを結びつけた。
2009、2010及び2011年の試験を、収穫を容易にするために機械的に植え、遺伝子内バレイショが、非改変材料と離れていることを確実にした。2009年評価のために、各事象及び対照変種由来の「核種子」小塊茎を、一列に4〜5プロット植えるために使用し(プロットあたり20個の小塊茎)、プロットを、野外を横切るブロック内で無作為に置いた。この無作為完全ブロック設計(RCB)は、代表的には、新規なバレイショ変種及び事象の評価のためのものであった。2010及び2011年に取られたアプローチは、1カ所あたり1つの事象及び対照あたり2つの無作為プロットを使用し、また、ブロックの数と同数又は同反復回数(1事象あたりのプロット数)で、RCB設計をも使用した。2010年における各プロットは、2009年にRusset BurbankについてCherry County,NEで産生された第1世代(G1)塊茎からの各20種子片の3行から成る。2011年試験のためのRusset Burbank種子は、2010年にCherry County,NEで産生された第2世代(G2)であった。全ての試験において、遺伝子内系統の種子を、その非改変対照と同様に操作した。野外で生育した塊茎は、種子として小塊茎よりも望ましい。何故なら、これらは、より生育がよく、より高い収量及び品質の塊茎を産生する均一な植物を産生するからである。
バレイショ栽培品種E12は、黒色斑傷を担う酵素の発現を低減させること、及び反応物、すなわちアスパラギン及び還元糖の濃度を低下させることを通してアクリルアミドを低減することによる、品質の改善を指向する。バレイショ栽培品種E12を、バレイショ植物ゲノムに対してネイティブであり外来性DNA、アグロバクテリウムDNA、ウイルスマーカー又はベクター骨格配列を含まない核酸配列によって形質転換した。加えて、農業研究を行い、本形質に伴う特徴を除いて従来対照と同じく育った事象を得た。
2009、2010及び2011年に生育したバレイショ栽培品種E12事象及び対照の農業特徴の評価を、表4〜7に示す。結果を、可能な場合、統計学的方法によって分析した。データ全体は、Russet Burbank対照とE12 Russet Burbank事象との間に主要な相違はなかった。
黒色斑傷は、損傷した塊茎の有する変色であり、バレイショ産業における最も重要な品質問題の1つを表す。この条件は、損傷したプラスチドから細胞質へのポリフェノールオキシダーゼ(Ppo)の漏出の結果である。次いで、細胞質において、酵素オキシダーゼは、暗色の沈殿物を形成する。pSIM1278 DNA挿入物の2つのサイレンシングカセットのうちの1つは、ソラナム・ベルコサム由来の2コピーのPpo5遺伝子の断片を、調節エレメントの間に逆向き反復として含む。この逆向き反復の発現は、バレイショPpo5遺伝子のサイレンシングを引き起こし、黒色斑傷の出現を有意に低減する。
アスパラギンシンセターゼ遺伝子のサイレンシングは、バレイショ栽培品種E12における遊離のアスパラギンの74%の平均低下をもたらした。メイラード反応において還元糖と合わさってアクリルアミドを形成するアスパラギンのより低いレベルは、揚げ物におけるアクリルアミドの67%の低減をもたらす。Russet Burbank対照とバレイショE12との間のアスパラギン及びアクリルアミドにおける相違を、表9に示す。アクリルアミドについて試験する前に、対照及びE12を、フライドポテトにした。全ての結果を、収穫に近い時期に分析した塊茎からのものであった。
上述の有利な特徴を組み合わせるバレイショ変種をもたらす研究は、主に経験的である。この研究は、大きな調査時間、労力及び費用を必要とする。バレイショ栽培品種の開発は、しばしば、温室から商用利用までに、8年以上もの時間を費やす。繁殖は、最も重要な特徴を子孫に組み込むための、優れた親の注意深い選択によって始まる。全ての所望の形質は、通常、1つの交配によって現れることはないので、繁殖は、必ず累積的になる。
発現ベクターは、調節エレメント(例えば、プロモーター)に作動可能に連結した少なくとも1つの遺伝子マーカーを含み、これは、ネガティブ選択、すなわち、選択的マーカー遺伝子を含まない細胞の成長の阻害によって又はポジティブ選択、すなわち、遺伝子マーカーによってコードされる産物についてのスクリーニングによってのいずれかで、回収される。多くの、植物形質転換のために一般的に使用される選択可能マーカー遺伝子は、形質転換分野において周知であり、例えば、選択的化学薬剤、例えば抗生物質又は除草剤を代謝的に解毒する酵素をコードする遺伝子、又は阻害剤に非感受性である改変された標的をコードする遺伝子である。幾つかのポジティブ選択方法もまた、当該分野で公知である。
発現ベクター内含まれ得る遺伝子は、調節エレメント、例えばプロモーターを含むヌクレオチド配列によって駆動されなければならない。幾つかの種類のプロモーターが、単独で又はプロモーターと組み合わせて使用され得る他の調節エレメントと同じく、形質転換分野で周知である。
誘導型プロモーターは、バレイショにおける発現のために、遺伝子に作動可能に連結される。場合により、誘導型プロモーターは、バレイショにおける発現のための遺伝子に作動可能に連結されるシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に、作動可能に連結される。誘導型プロモーターにより、転写の速度が、誘導剤に応答して上昇する。
構成的プロモーターは、バレイショにおける発現のための遺伝子に作動可能に連結されるか、又は構成的プロモーターは、バレイショにおける発現のための遺伝子に作動可能に連結されるシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に、作動可能に連結される。
組織特異的プロモーターは、バレイショにおける発現のために、遺伝子に作動可能に連結される。場合により、組織特異的プロモーターは、バレイショにおける発現のための遺伝子に作動可能に連結されるシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に、作動可能に連結される。組織特異的プロモーターに作動可能に連結した目的の遺伝子によって形質転換された植物は、特異的組織において、トランスジーンのタンパク質産物を、独占的に又は優先的に産生する。
トランスジーンによって産生されたタンパク質の葉緑体、液胞、ペルオキシソーム、グリオキシソーム、細胞壁若しくはミトコンドリアなどの細胞内区画への輸送、又はアポプラストへの分泌のための輸送は、目的のタンパク質をコードする遺伝子の5’及び/又は3’領域への、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列の作動可能な連結によって達成される。構造遺伝子の5’及び/又は3’末端における配列の標的化は、タンパク質合成及びプロセシングの間に、コードされたタンパク質が最終的に区画化される場所を決定し得る。
本発明に従うトランスジェニック植物により、外来性タンパク質が、商用品質で産生され得る。従って、形質転換植物の選択及び増殖のための、当該分野で周知の技術は、複数のトランスジェニック植物を生じ、これは、従来様式で収穫され、次いで、外来性タンパク質が、目的の組織又は全体のバイオマスから抽出される。植物バイオマスからのタンパク質抽出は、例えば、以下によって議論される公知の方法によって達成され得る:Heney and Orr,Anal.Biochem.114:92〜6(1981)。
A.植物の病気に耐性の遺伝子植物防御は、多くの場合、病気耐性遺伝子の産物(R)と病原体における対応する非病原性(Avr)遺伝子の産物との間の特異的相互作用によって活性化される。植物変種は、クローニングされた耐性遺伝子によって形質転換されて、特定の病原体株に対して抵抗性であるように植物を操作し得る。例えば、Jones et al.,Science 266:789(1994)(cloning of the tomato Cf−9 gene for resistance to Cladosporium fulvum);Martin et al.,Science 262:1432(1993)(tomato Pto gene for resistance to Pseudomonas syringae pv.tomato encodes a protein kinase);Mindrinos et al.Cell 78:1089(1994)(Arabidopsis RSP2 gene for resistance to Pseudomonas syringae)を参照されたい。
B.有害生物、例えばダイズシストセンチュウに対する抵抗性を付与する遺伝子例えば、PCT出願WO 96/30517;PCT出願WO 93/19181を参照されたい。
C.バチルス・スリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)タンパク質、その誘導体又はその上にモデリングした合成ポリヌクレオチド例えば、Bt δ−内毒素遺伝子のクローニング及びヌクレオチド配列を開示するGeiser et al.,Gene 48:109(1986)を参照されたい。さらに、δ−内毒素遺伝子をコードするDNA分子が、American Type Culture Collection,Manassas,Virginiaから、例えば、ATCC登録番号40098、67136、31995及び31998の下で購入可能である。
D.レシチン例えば、Van Damme et al.,Plant Molec.Biol.24:25(1994)を参照されたい。これは、幾つかのクリビア・ミニアータ(Clivia miniata)マンノース結合レシチン遺伝子のヌクレオチド配列を開示する。
E.アビジンなどのビタミン結合タンパク質PCT出願US 93/06487を参照されたい。これは、昆虫有害生物に対する殺幼虫剤としての、アビジン及びアビジンホモログの使用を教示する。
F.酵素インヒビター、例えば、プロテアーゼインヒビター若しくはプロテイナーゼインヒビター又はアミラーゼインヒビター。例えば、Abe et al.,J.Biol.Chem.262:16793(1987)(コメシステインプロテイナーゼインヒビターのヌクレオチド配列)、Huub et al.,Plant Molec.Biol.21:985(1993)(タバコプロテイナーゼインヒビターIをコードするcDNAのヌクレオチド配列)、Sumitani et al.,Biosci.Biotech.Biochem.57:1243(1993)(ストレプトマイセス・ニトロスポレウス(Streptomyces nitrosporeus)α−アミラーゼインヒビターのヌクレオチド配列)及び米国特許5,494,813(Hepher and Atkinson,issued February 27,1996)を参照されたい。
G.エクジステロイド又は幼若ホルモンなどの昆虫特異的ホルモン、それらのバリアント、それらに基づく模倣物、又はそのアンタゴニスト若しくはアゴニスト例えば、Hammock et al.,Nature 344:458(1990)による、クローニングした幼若ホルモンエステラーゼ(幼若ホルモンの不活性化剤)のバキュロウイルス発現の開示を参照されたい。
H.発現の際に罹患した有害生物の生理学を破壊する、昆虫特異的ペプチド又はニューロペプチド例えば、Regan,J.Biol.Chem.269:9(1994)(発現クローニングが昆虫利尿ホルモンレセプターをコードするDNAを生じる)、及びPratt et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.163:1243(1989)(アロスタチンは、ジプロテラ・プンタータ(Diploptera puntata)において同定される)の開示を参照されたい。また、Tomalskiらに対する米国特許5,266,317も参照されたい。これは、昆虫特異的な麻痺性ニューロトキシンをコードする遺伝子を開示する。
I.天然において蛇、スズメバチなどによって産生される昆虫特異的毒。例えば、Pang et al.,Gene 116:165(1992)を、サソリ殺昆虫性ペプチドをコードする遺伝子の植物における異種発現の開示について参照されたい。
J.モノテルペン、セスキテルペン、ステロイド、ヒドロキサム酸、フェニルプロパノイド誘導体又は殺昆虫活性を有する別の非タンパク質分子の過剰蓄積に対する酵素応答。
K.生物学的活性分枝の翻訳後改変を含む改変に関与する酵素、例えば、解糖酵素、タンパク分解酵素、脂肪分解酵素、ヌクレアーゼ、シクラーゼ、トランスアミナーゼ、エステラーゼ、ヒドロラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、ホスホリラーゼ、ポリメラーゼ、エラスターゼ、キチナーゼ及びグルカナーゼであり、天然又は合成のいずれかである。PCT出願WO 93/02197(Scott et al.)を参照されたい。これは、カラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を開示する。キチナーゼコード配列を含むDNA分子が、例えば、ATCCから、登録番号39637及び67152の下で得られ得る。また、Kramer et al.,Insect Biochem.Molec.Biol.23:691(1993)をも参照されたい。これはタバコイモムシキチナーゼをコードするヌクレオチド配列を教示する。並びに、Kawalleck et al.,Plant Molec.Biol.21:673(1993)も参照されたい。これは、パセリubi4−2ポリユビキチン遺伝子のヌクレオチド配列を提供する。
L.シグナル伝達を刺激する分子例えば、Botella et al.,Plant Molec.Biol.24:757(1994)による、リョクトウカルモジリンcDNAクローンのヌクレオチド配列の開示、及びGriess et al.,Plant Physiol.104:1467(1994)(ダイズカルモジリンcDNAクローンのヌクレオチド配列を提供する)を参照されたい。
M.疎水性モーメントペプチド以下を参照されたい:PCT出願WO 95/16776、これは、真菌植物病原体を阻害するタキプレシンのペプチド誘導体を開示する。並びに、PCT出願WO 95/18855は、病気耐性を付与する、合成抗微生物ペプチドを教示する。
N.A膜パーミアーゼ、チャネルフォーマー又はチャネルブロッカー。例えば、Jaynes et al.,Plant Sci 89:43(1993)の、トランスジェニックタバコ植物にシュードモナス・ソラナセアラム(Pseudomonas solanacearum)に対する耐性を付与する、セクロピン−β溶解性ペプチドの異種発現の開示を参照されたい。
O.ウイルス侵襲性タンパク質又はそれに由来する複合毒素例えば、形質転換植物細胞におけるウイルスコートタンパク質の蓄積は、このコードタンパク質が由来するウイルス及び関連のウイルスの感染及び/又はウイルスによってかかる病気発症に対する耐性を付与する。Beachy et al.,Ann.Rev.Phytopathol.28:451(1990)を参照されたい。コートタンパク質媒介型耐性は、アルファルファモザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス及びタバコモザイクウイルスに対する形質転換植物に付与されている。
P.昆虫特異的抗体又はそれに由来するイムノトキシン従って、昆虫の腸における重要な代謝機能に対し標的化された抗体は、影響を受けた酵素を不活化させ、昆虫を殺傷する。Taylor et al.,Abstract #497,Seventh Int’l Symposium on Molecular Plant−Microbe Interactions(Edinburgh,Scotland)(1994)(トランスジェニックタバコにおける一本鎖抗体断片の産生を介した酵素不活性化)を参照されたい。
Q.ウイルス特異的抗体例えば、Tavladoraki et al.,Nature 366:469(1993)を参照されたい。これは、組換え抗体遺伝子を発現するトランスジェニック植物が、ウイルス攻撃から保護されることを示す。
R.病原体又は寄生生物により天然で産生される発生停止タンパク質従って、真菌エンド−α−1,4−D−ポリガラクツロナーゼは、植物細胞壁可溶性ホモ−α−1,4−D−ガラクツロナーゼにより、真菌の定着及び植物栄養放出を容易にする。Lamb et al.,Bio/Technology 10:1436(1992)を参照されたい。マメエンドポリガラクツロナーゼ阻害タンパク質をコードする遺伝子のクローニング及び性質決定は、Toubart et al.,Plant J.2:367(1992)によって記載される。
S.植物により天然で産生される発生停止タンパク質例えば、Logemann et al.,Bio/Technology 10:305(1992)は、オオムギリボソーム不活性化遺伝子を発現するトランスジェニック植物が、真菌の病気に対し上昇した抵抗性を有することを示している。
T.全身獲得抵抗性(SAR)応答に関与する遺伝子及び/又は病因関連遺伝子Briggs,S.Current Biology,5(2)(1995)。
U.抗真菌遺伝子Cornelissen and Melchers,Plant Physiol.,101:709〜712(1993);Parijs et al.,Planta 183:258〜264(1991)及びBushnell et al.,Can.J.of Plant Path.20(2):137〜149(1998)を参照されたい。
V.フィトフトラ・ブライト(Phytophthora blight)に対する耐性を付与する遺伝子、例えば、R1、R2、R3、R4及び他の耐性遺伝子Naess,S.K.,et.al.,(2000)Resistance to late blight in Solanum bulbocastanum is mapped to chromosome 8.Theor.Appl.Genet.101:697〜704及びLi,X.,et.al.,(1998)Autotetraploids and genetic mapping using common AFLP markers:the R2 allele conferring resistance to Phytophthora infestans mapped on potato chromosome 4.Theor.Appl.Genet.96:1121〜1128を参照されたい。
A.成長点又は分裂組織を阻害する除草剤、例えば、イミダゾリノン又はスルホニルウレアこのカテゴリーにおける遺伝子の例は、例えば、それぞれ以下に記載されるように、突然変異体ALS及びAHAS酵素をコードする:Lee et al.,EMBO J.7:1241(1988)及びMiki et al.,Theor.Appl.Genet.80:449(1990)。
B.グリホセート(それぞれ突然変異体5−エノールピルビルシキメート−3−ホスフェートシンターゼ(EPSP)及びaroA遺伝子によって、耐性が損なわれる)、並びにグルホシネート(ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ(PAT)及びストレプトマイセス・ヒグロスコピカス(Streptomyces hygroscopicus)PATバー遺伝子)及びピリジンオキシ又はフェノキシプロピオン酸及びシクロヘキサンなど(ACCアーゼインヒビターコード遺伝子)の他のホスホノ化合物例えば、グリホセート耐性を付与するEPSPの形態のヌクレオチド配列を開示する、Shah,et al.に対する米国特許4,940,835を参照されたい。aroA遺伝子をコードするDNA分子は、ATCC登録番号39256の下で得られ、突然変異体遺伝子のヌクレオチド配列は、Comaiに対する米国特許4,769,061に開示される。Kumada et al.に対する欧州特許出願0 333 033、及びGoodman et al.に対する米国特許4,975,374は、L−ホスフィノトリシンなどの除草剤に対する耐性を付与するグルタミンシンターゼ遺伝子のヌクレオチド配列を開示する。PAT遺伝子のヌクレオチド配列は、Leemans et al.に対する欧州出願0 242 246において提供される。DeGreef et al.,Bio/Technology 7:61(1989)は、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ活性についてコードするキメラバー遺伝子を発現する、トランスジェニック植物の産生を記載する。フェノキシプロピオン酸及びシクロヘキサン、例えばセトキシジム及びハロキシホップに対する耐性を付与する例示的な遺伝子は、以下に記載されるAcc1−S1、Acc1−S2及びAcc2−S3遺伝子である:Marshall et al.,Theor.Appl.Genet.83:435(1992)。
C.光合成を阻害する除草剤、例えばトリアジン(psbA及びgs+遺伝子)又はベンゾニトリル(ニトリラーゼ遺伝子)Przibila et al.,Plant Cell 3:169(1991)は、突然変異体psbAをコードするプラスミドによる、クラミドモナスの形質転換を記載する。ニトリラーゼ遺伝子についてのヌクレオチド配列は、Stalkerに対する米国特許4,810,648にいて開示され、これらの遺伝子を含むDNA分子は、ATCC登録番号53435、67441及び67442の下で利用可能である。グルタチオンS−トランスフェラーゼをコードするDNAのクローニング及び発現は、以下に記載される:Hayes et al.,Biochem.J.285:173(1992)。
D.多数の型の除草剤に耐性である酵素を発現する植物を作製することが見出されているアセトヒドロキシ酸シンターゼが、種々の植物内に導入されている。Hattori et al.,Mol.Gen.Genet.246:419,1995を参照されたい。除草剤に対する耐性を付与する他の遺伝子としては、ラット染色体P4507A1と酵母NADPH−シトクロムP450オキシドレダクターゼとのキメラタンパク質をコードする遺伝子(Shiota et al.,Plant Physiol.,106:17,1994)、グルタチオンレダクターゼ及びスーパーオキシドジスムターゼについての遺伝子(Aono et al.,Plant Cell Physiol.36:1687,1995)、並びに種々のホスホトランスフェラーゼについての遺伝子(Datta et al.,Plant Mol.Biol.20:619,1992)が挙げられる。
E.プロトポルフィリノゲンオキシダーゼ(protox)が、全ての植物の生存のために必要な葉緑素の産生のために必須であるprotox酵素は、種々の除草剤化合物についての標的として寄与する。これらの除草剤はまた、存在する全ての異なる種の植物の成長も阻害し、全体的破壊をもたらす。これらの除草剤に対して耐性である改変されたprotox活性を有する植物の開発は以下に記載される:米国特許6,288,306;6,282,837;5,767,373及び国際公開WO 01/12825。
A.改変された脂肪酸代謝。例えば、ステアリル−ACPデサチュラーゼのアンチセンス遺伝子による、植物のステアリン酸含量を増大するような植物の形質転換によるもの。Knultzon et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:2625(1992)を参照されたい。
B.低下したフィテート含量−1)フィターゼをコードする遺伝子の導入は、フィテートの分解を増大し、形質転換植物に、より多くの遊離のホスフェートを追加する。例えば、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)フィターゼ遺伝子のヌクレオチド配列の開示については、Van Hartingsveldt et al.,Gene 127:87(1993)を参照されたい。2)遺伝子は、低下したフィターゼ含量を誘導されることもできた。トウモロコシにおいて、例えば、これは、低レベルのフィチン酸によって特徴づけられるトウモロコシ突然変異を担う1つの対立遺伝子に関連するDNAをクローニングし、次いで再導入することによって、達成され得た。Raboy et al.,Maydica 35:383(1990)を参照されたい。
C.改変された炭水化物組成。例えば、デンプンの分枝パターンを改変する酵素をコードする遺伝子で植物を形質転換することによる。Shiroza et al.,J.Bacteriol.170:810(1988)(ストレプトコッカス(Streptococcus)突然変異フラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列)、Steinmetz et al.,Mol.Gen.Genet.20:220(1985)(バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)レバンスクラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列)、Pen et al.,Bio/Technology 10:292(1992)(バチルス・リケニホニス(Bacillus lichenifonnis)α−アミラーゼを発現するトランスジェニック植物の産生)、Elliot et al.,Plant Molec.Biol.21:515(1993)(トマトインベルターゼ遺伝子のヌクレオチド配列)、Sogaard et al.,J.Biol.Chem.268:22480(1993)(オオムギα−アミラーゼ遺伝子の部位特異的突然変異誘発)及びFisher et al.,Plant Physiol.102:1045(1993)(トウモロコシ胚乳デンプン分枝酵素II)を参照されたい。
D.FAD−2遺伝子改変を介したオレイン酸の上昇及び/又はFAD−3遺伝子改変を介したリノレン酸の上昇米国特許6,063,947;6,323,392;及び国際公開WO 93/11245を参照されたい。
A.タペータム特異的プロモーターの制御下のデアセチラーゼ遺伝子の導入及び化学的N−Ac−PPTの添加。国際公開WO 01/29237を参照されたい。
B.種々の雄ずい特異的プロモーターの導入。国際公開WO 92/13956及びWO 92/13957を参照されたい。
C.バルナーゼ及びバルスター遺伝子の導入Paul et al.,Plant Mol.Biol.19:611〜622,1992を参照されたい。
植物形質転換のための多くの方法が開発されており、生物学的及び物理的植物形質転換プロトコールが挙げられる。例えば、Miki et al.,「Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants」in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,Glick,B.R.and Thompson,J.E.Eds.(CRC Press,Inc.Boca Raton,1993)pages 67〜88を参照されたい。加えて、植物細胞についてのベクターの発現及びインビトロ培養方法又は組織形質転換及び植物の再生が、利用可能である。例えば、Gruber et al.,「Vectors for Plant Transformation」in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,Glick,B.R.and Thompson,J.E.Eds.(CRC Press,Inc.,Boca Raton,1993)pages 89〜119を参照されたい。
J.R.Simplot Company所有の、上で開示し添付の特許請求の範囲で挙げたバレイショ栽培品種E12の塊茎寄託は、American Type Culture Collection(ATCC),10801 University Boulevard,Manassas,Virginia 20110によって行った。寄託日は、2013年5月23日であった。マイクロチューブの25のバイアルの寄託物を、J.R.Simplot Companyによって維持された同じ寄託物から、本出願の提出日の前に受け取った。全ての制限は、特許の付与の際に不可逆的に取り除かれ、この寄託は、37 C.F.R.§§ 1.801〜1.809の全ての要件を満たすことを意図する。ATCC登録番号は、PTA−120372である。寄託物は、30年間の期間にわたって、又は最後の要求から5年間にわたって、又は、より長い場合には特許の権利光子可能期間にわたって、寄託当局によって維持され、必要に応じて、その期間の間、取り換えられる。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
(項目1)
バレイショ栽培品種E12のバレイショ塊茎又は塊茎の部分であって、前記塊茎の代表的サンプルは、ATCC登録番号PTA−120372の下で寄託されている、バレイショ塊茎又は塊茎の部分。
(項目2)
項目1に記載の前記塊茎又は前記塊茎の部分を成長させることによって産生された、バレイショ植物またはその部分。
(項目3)
項目2に記載の前記植物の生理学的特徴及び形態学的特徴の全てを有する、バレイショ植物。
(項目4)
項目2に記載の前記植物から産生される細胞の組織培養物であって、前記組織培養物の前記細胞は、葉、花粉、胚、子葉、胚軸、分裂組織細胞、根、根冠、雌ずい、葯、花、幹及び塊茎から成る群より選択される植物部分から産生される、組織培養物。
(項目5)
項目4に記載の前記組織培養物から再生されたバレイショ植物であって、前記植物は、バレイショ栽培品種E12の生理学的特徴及び形態学的特徴の全てを有する、バレイショ植物。
(項目6)
項目1に記載の前記バレイショ塊茎又は前記塊茎の部分を成長させることによって産生された、バレイショ種子。
(項目7)
項目6に記載の前記種子を成長させることによって産生された、バレイショ植物またはその部分。
(項目8)
項目7に記載の前記バレイショ植物の組織培養物から再生されたバレイショ植物であって、前記植物は、バレイショ栽培品種E12の生理学的特徴及び形態学的特徴の全てを有する、バレイショ植物。
(項目9)
バレイショ種子を産生するための方法であって、少なくとも1種のバレイショ植物が項目2に記載の前記バレイショ植物である2種のバレイショ植物を交配すること、及び生じたバレイショ種子を収穫することを含む、方法。
(項目10)
バレイショ種子を産生するための方法であって、少なくとも1種のバレイショ植物が項目7に記載のバレイショ植物である2種のバレイショ植物を交配すること、及び生じたバレイショ種子を収穫することを含む、方法。
(項目11)
項目10に記載の前記方法によって産生された、バレイショ種子。
(項目12)
項目11に記載の前記バレイショ種子を成長させることによって産生された、バレイショ植物またはその部分。
(項目13)
項目12に記載の前記植物から産生された、バレイショ種子。
(項目14)
前記バレイショ植物のうちの1種は、トランスジェニックであり、他方は、バレイショ栽培品種E12である、項目9に記載の方法。
(項目15)
前記バレイショ植物のうちの1種は、トランスジェニックであり、他方は、バレイショ栽培品種E12である、項目10に記載の方法。
(項目16)
項目14に記載の前記方法によって産生された、バレイショ植物またはその部分。
(項目17)
バレイショ栽培品種E12に所望の形質を導入する方法であって、前記方法は、
(a)塊茎の代表的サンプルがATCC登録番号PTA−120372の下で寄託されているE12植物を、所望の形質を含む別のバレイショ栽培品種と交配することにより、子孫植物を産生することであって、前記所望の形質は、雄性不稔、除草剤耐性、昆虫耐性、改変された脂肪酸代謝、改変された炭水化物代謝及び細菌性の病気、真菌性の病気又はウイルス性の病気に対する耐性からなる群より選択されること;
(b)前記所望の形質を有する1種以上の子孫植物を選択すること;
(c)選択された子孫植物を、E12植物と戻し交配し、戻し交配子孫植物を産生すること;
(d)前記所望の形質を有する戻し交配子孫植物を選択すること;並びに
(e)工程(c)及び(d)を2回以上連続して繰り返し、前記所望の形質を含む選択された第3又はそれ以上の戻し交配子孫植物を産生すること、を含む方法。
(項目18)
項目17に記載の前記方法によって産生されたバレイショ植物であって、前記植物は、前記所望の形質を有し、バレイショ栽培品種E12の生理学的特徴及び形態学的特徴の全てを有する、バレイショ植物。
(項目19)
前記所望の形質は、除草剤耐性であり、前記耐性は、イミダゾリノン、スルホニルウレア、グルホシネート、L−ホスフィノトリシン、トリアジン及びベンゾニトリルから成る群より選択される除草剤に対して付与される、項目18に記載のバレイショ植物。
(項目20)
前記所望の形質は、昆虫耐性であり、前記昆虫耐性は、バチルス・スリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)内毒素をコードする導入遺伝子によって付与される、項目18に記載のバレイショ植物。
(項目21)
前記所望の形質は、改変された脂肪酸代謝又は改変された炭水化物代謝であり、前記所望の形質は、フルクトシルトランスフェラーゼ、レバンスクラーゼ、α−アミラーゼ、インベルターゼ及びデンプン分枝酵素から成る群より選択されるタンパク質をコードする核酸、又はステアリル−ACPデサチュラーゼのアンチセンスをコードするDNAによって付与される、項目18に記載のバレイショ植物。
(項目22)
商用植物製品を産生する方法であって、項目2の前記植物又はその部分を得ること、及び、前記植物又はその植物部分から商用植物製品を産生することを含み、前記商用植物製品は、フライドポテト、ポテトチップス、脱水バレイショ材料、ポテトフレーク及びポテト顆粒から成る群より選択される、方法。
(項目23)
項目22に記載の前記方法によって産生された、商用植物製品。
Claims (23)
- バレイショ栽培品種E12のバレイショ塊茎又は塊茎の部分であって、前記塊茎のサンプルは、ATCC登録番号PTA−120372の下で寄託されている、バレイショ塊茎又は塊茎の部分。
- 請求項1に記載の前記塊茎又は前記塊茎の部分を成長させることによって産生された、バレイショ植物またはその部分。
- 請求項2に記載の前記植物の生理学的特徴及び形態学的特徴の1つ以上を有する、バレイショ植物であって、栽培品種E12に存在するpSIM1278の挿入領域を含み、該挿入領域は、ホスホリラーゼ−LおよびジキナーゼR1遺伝子の内因性バレイショプロモーター逆方向反復に加えて、内因性アスパラギンシンセターゼ−1遺伝子および内因性ポリフェノールオキシダーゼ−5遺伝子の発現の阻害に有効なバレイショDNAの逆方向反復を含む、バレイショ植物。
- 請求項2に記載の前記植物から産生される細胞の組織培養物であって、前記組織培養物の前記細胞は、葉、花粉、胚、子葉、胚軸、分裂組織細胞、根、根冠、雌ずい、葯、花、幹及び塊茎から成る群より選択される植物部分から産生される、組織培養物。
- 請求項4に記載の前記組織培養物から再生されたバレイショ植物であって、前記植物は、バレイショ栽培品種E12の生理学的特徴及び形態学的特徴の1つ以上を有し、栽培品種E12に存在するpSIM1278の挿入領域を含み、該挿入領域は、ホスホリラーゼ−LおよびジキナーゼR1遺伝子の内因性バレイショプロモーター逆方向反復に加えて、内因性アスパラギンシンセターゼ−1遺伝子および内因性ポリフェノールオキシダーゼ−5遺伝子の発現の阻害に有効なバレイショDNAの逆方向反復を含む、バレイショ植物。
- 請求項1に記載の前記バレイショ塊茎又は前記塊茎の部分を成長させることによって産生された、バレイショ種子。
- 請求項6に記載の前記種子を成長させることによって産生された、バレイショ植物またはその部分。
- 請求項7に記載の前記バレイショ植物の組織培養物から再生されたバレイショ植物であって、前記植物は、バレイショ栽培品種E12の生理学的特徴及び形態学的特徴の1つ以上を有し、栽培品種E12に存在するpSIM1278の挿入領域を含み、該挿入領域は、ホスホリラーゼ−LおよびジキナーゼR1遺伝子の内因性バレイショプロモーター逆方向反復に加えて、内因性アスパラギンシンセターゼ−1遺伝子および内因性ポリフェノールオキシダーゼ−5遺伝子の発現の阻害に有効なバレイショDNAの逆方向反復を含む、バレイショ植物。
- バレイショ種子を産生するための方法であって、少なくとも1種のバレイショ植物が請求項2に記載の前記バレイショ植物である2種のバレイショ植物を交配すること、及び生じたバレイショ種子を収穫することを含む、方法。
- バレイショ種子を産生するための方法であって、少なくとも1種のバレイショ植物が請求項7に記載のバレイショ植物である2種のバレイショ植物を交配すること、及び生じたバレイショ種子を収穫することを含む、方法。
- 請求項10に記載の前記方法によって産生された、バレイショ種子。
- 請求項11に記載の前記バレイショ種子を成長させることによって産生された、バレイショ植物またはその部分。
- 請求項12に記載の前記植物から産生された、バレイショ種子。
- 前記バレイショ植物のうちの1種は、トランスジェニックであり、他方は、バレイショ栽培品種E12である、請求項9に記載の方法。
- 前記バレイショ植物のうちの1種は、トランスジェニックであり、他方は、バレイショ栽培品種E12である、請求項10に記載の方法。
- 請求項14に記載の前記方法によって産生された、バレイショ植物またはその部分。
- バレイショ栽培品種E12に所望の形質を導入する方法であって、前記方法は、
(a)塊茎のサンプルがATCC登録番号PTA−120372の下で寄託されているE12植物を、所望の形質を含む別のバレイショ栽培品種と交配することにより、子孫植物を産生することであって、前記所望の形質は、雄性不稔、除草剤耐性、昆虫耐性、改変された脂肪酸代謝、改変された炭水化物代謝及び細菌性の病気、真菌性の病気又はウイルス性の病気に対する耐性からなる群より選択されること;
(b)前記所望の形質を有する1種以上の子孫植物を選択すること;
(c)選択された子孫植物を、E12植物と戻し交配し、戻し交配子孫植物を産生すること;
(d)前記所望の形質を有する戻し交配子孫植物を選択すること;並びに
(e)工程(c)及び(d)を2回以上連続して繰り返し、前記所望の形質を含む選択された第3又はそれ以上の戻し交配子孫植物を産生すること、を含む方法。 - 請求項17に記載の前記方法によって産生されたバレイショ植物であって、前記植物は、前記所望の形質を有し、バレイショ栽培品種E12の生理学的特徴及び形態学的特徴の1つ以上を有し、栽培品種E12に存在するpSIM1278の挿入領域を含み、該挿入領域は、ホスホリラーゼ−LおよびジキナーゼR1遺伝子の内因性バレイショプロモーターの逆方向反復に加えて、内因性アスパラギンシンセターゼ−1遺伝子および内因性ポリフェノールオキシダーゼ−5遺伝子の発現の阻害に有効なバレイショDNAの逆方向反復を含む、バレイショ植物。
- 前記所望の形質は、除草剤耐性であり、前記耐性は、イミダゾリノン、スルホニルウレア、グルホシネート、L−ホスフィノトリシン、トリアジン及びベンゾニトリルから成る群より選択される除草剤に対して付与される、請求項18に記載のバレイショ植物。
- 前記所望の形質は、昆虫耐性であり、前記昆虫耐性は、バチルス・スリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)内毒素をコードする導入遺伝子によって付与される、請求項18に記載のバレイショ植物。
- 前記所望の形質は、改変された脂肪酸代謝又は改変された炭水化物代謝であり、前記所望の形質は、フルクトシルトランスフェラーゼ、レバンスクラーゼ、α−アミラーゼ、インベルターゼ及びデンプン分枝酵素から成る群より選択されるタンパク質をコードする核酸、又はステアリル−ACPデサチュラーゼのアンチセンスをコードするDNAによって付与される、請求項18に記載のバレイショ植物。
- 商用植物製品を産生する方法であって、請求項2の前記植物又はその部分を得ること、及び、前記植物又はその植物部分から商用植物製品を産生することを含み、前記商用植物製品は、フライドポテト、ポテトチップス、脱水バレイショ材料、ポテトフレーク及びポテト顆粒から成る群より選択される、方法。
- 請求項22に記載の前記方法によって産生された、商用植物製品。
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