KR101837011B1 - 감자 종자 e12 - Google Patents

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트로이 위크스
크레이그 리첼
후아 얀
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Abstract

본 발명은 E12로 지정되는 감자종자를 개시한다. 본 발명은 감자종자 E12의 덩이줄기, 감자종자 E12의 씨앗, 감자종자 E12의 식물 및 식물 부분, 감자종자 E12로부터 생산되는 식품, 및 감자종자 E12를 자가교배하거나 또 다른 감자품종과 교배함으로써 감자식물을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 유전자이식 감자식물의 생산 방법, 및 이 방법에 의해 생산되는 유전자이식 감자식물 및 이의 일부에 관한 것이다.

Description

감자 종자 E12{POTATO CULTIVAR E12}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된, 2013년 5월 2일에 출원된 미국 가특허 출원 제61/818,752호를 우선권의 이익을 주장한다.
본 발명은 E12로 지정되는 신규 감자 종자, 및 해당 감자 품종에 의해 생성되는 덩이줄기, 식물, 식물 부분, 조직 배양물 및 씨앗에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 후렌치 후라이, 감자칩, 탈수된 감자 재료, 감자 플레이크 및 감자 과립과 같이, 감자 종자 E12로부터 제조되는 식품에 관한 것이다. 본 출원에서 인용되는 모든 공개문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
감자는 전세계적으로 4번째로 가장 중요한 식용 작물로서, 현재까지 가장 중요한 채소이다. 감자는 현재 미국의 거의 모든 주에서 상업적으로 재배되고 있다. 매년 감자 생산량은 미국에서만 1800만톤이 넘으며, 전세계적으로 3억톤이 넘는다. 감자의 인기는 주로 이의 다목적성 및 영양적 가치로 인한 것이다. 감자는 신선한 상태로, 동결된 상태로 또는 건조된 상태로 사용될 수 있거나, 가루, 전분 또는 알코올로 가공될 수 있다. 이들은 복합 탄수화물을 포함하며, 칼슘, 니아신 및 비타민 C가 풍부하다.
식품 산업에서 감자의 품질은 2가지 중요한 인자들에 의해 악영향을 받는다: (1) 감자는, 튀기거나 구울 때 신속하게 산화되어 발암성 생성물인 아크릴아미드를 형성하는 비필수 자유 아미노산인 아스파라긴을 다량으로 함유하고; (2) 감자는, 멍든 감자의 손상된 색소체로부터 폴리페놀 옥시다제가 누출되는 경우 발생하는 부작용인 효소적 갈변 및 변색에 매우 취약하다. 세포질에서, 효소는 페놀을 산화시키고, 그런 다음, 신속하게 중합되어 어두운 색소를 생성한다. 덩이줄기는 인산화된 전분을 다량으로 함유하며, 이 전분 중 일부는 저장 동안에 분해되어, 포도당 및 과당을 생성한다. 이들 환원당은 아미노산과 반응하여, 120℃를 초과하는 온도에서 가열 시, 아크릴아미드를 포함하는 마이야르 생성물을 형성한다. 전분 인산화에 관여하는 2가지 효소는 수(water) 다이키나제 R1 및 포스포릴라제-L (R1 및 PhL)이다. 갈변은 또한, 전분이 포도당 및 과당으로 부분적으로 분해된 결과, 비-효소적으로 유도된다.
지금까지, 낮은 아크릴아미드 함량, 증가된 흑점 멍 관용(black spot bruise tolerance) 및 감소된 노화 감미(노화 sweetening)를 가진 덩이줄기를 생성하는 감자 식물 품종은 존재하지 않는다. 따라서, 알려지지 않은 핵산 또는 외래 핵산을 사용하지 않으면서, 독성 화합물의 수준이 낮은 감자 품종을 개발하는 것이 요구되고 있다. 본 발명은 이러한 요구를 충족시킨다.
관련 기술의 상기 예들 및 이와 관련된 제한은 예시적일 뿐 배제적인 것으로 의도되지 않는다. 관련 기술의 다른 제한은 당업자가 명세서를 읽을 때, 명백해질 것이다.
하기의 구현예 및 이의 측면은, 예시적이며 범위를 제한하지 않는 것으로 의미되는 시스템, 툴 및 방법과 함께 기술된다. 다양한 구현예들에서, 상기 문제점들 중 하나 이상은 감소되거나 없어진 한편, 다른 구현예는 그외 개선에 관한 것이다.
이를 위해, 본 발명은, 감자식물 게놈에 고유하며 외래 DNA, 아그로박테리움(Agrobacterium) DNA, 바이러스 마커 또는 벡터 백본 서열을 함유하지 않는 핵산 서열로 형질전환된 신규 감자품종 E12를 제공한다. 그보다는, 감자품종 E12의 게놈 내로 삽입된 DNA는, 흑점 상처(black spot bruise)의 발현, 아스파라긴 축적 및 노화 감미에 관여하는 유전자를 침묵시키는, 감자에 고유하거나 야생 감자, 감자 생식적으로 융화성인(sexually-compatible) 식물에 고유한 비-코딩 폴리뉴클레오타이드이다.
따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 pSIM278로 지칭되는 식물 벡터를 포함하며, 이 벡터는, 아스파라긴 신서타제-1 유전자(fAsn1)의 단편 및 폴리페놀옥시다제-5 유전자의 3'-비번역 서열을 안티센스 배향으로 포함하는 DNA 분절의 복사체를 2개 함유하는 제1 침묵 카세트; 및 감자 포스포릴라제-L(pPhL) 유전자의 단편 및 감자 R1 유전자의 단편을 안티센스 배향으로 포함하는 DNA 분절의 복사체를 2개 함유하는 제2 침묵 카세트를 포함한다. pSIM1278 벡터는, 식물의 형질전환 전에는 식물 DNA의 유지를 지지하며 식물 세포의 형질전환 시에는 식물 세포 내로 전달되지 않는 9,511 bp의 백본 영역, 및 형질전환 시 식물 세포의 게놈 내로 안정하게 통합되는 고유한 DNA(native DNA)를 포함하는 10,147 bp의 DNA 삽입 영역을 포함한다.
상이한 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 식물 벡터로 형질전환된 식물 세포를 제공한다. 추가의 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 벡터로 형질전환된 하나 이상의 세포를 포함하는 감자식물 품종을 제공한다. 본 발명의 일 측면에서, 감자식물 품종은 벡터의 침묵 카세트 2개 중 적어도 하나를 발현하며, 침묵 카세트가 발현되면, 유전자내(intragenic) 식물의 덩이줄기에서 아스파라긴 신서타제-1 유전자 및 폴리페놀옥시다제-5 유전자가 하향조절된다. 본 발명의 바람직한 측면에서, 적어도 하나의 침묵 카세트를 발현하는 감자식물 품종의 덩이줄기는, 동일한 품종의 비형질전환된 식물의 덩이줄기에는 존재하지 않는 2가지 이상의 바람직한 형질을 나타낸다. 본 발명의 가장 바람직한 측면에서, 2가지 이상의 바람직한 형질은 낮은 아스파라긴 축적, 흑점 상처 감소 및 열-유도성 아크릴아미드 형성의 감소로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 상이한 측면에서, 감자식물 품종은 식물 DNA 벡터의 2개의 침묵 카세트를 모두 발현하며, 침묵 카세트가 발현되면, 감자식물 품종의 덩이줄기에서 아스파라긴 신서타제-1 유전자, 폴리페놀옥시다제-5 유전자, 포스포릴라제-L 유전자 및 다이키나제 R1 유전자가 하향조절된다. 본 발명의 바람직한 측면에서, 식물 DNA 벡터의 2개의 침묵 카세트를 발현하는 감자식물 품종의 덩이줄기는, 동일한 품종의 비형질전환된 식물의 덩이줄기에는 존재하지 않는 2가지 이상의 바람직한 형질을 나타낸다. 바람직한 구현예에서, 2가지 이상의 바람직한 형질은 낮은 아스파라긴 축적, 흑점 상처 감소, 저장 동안의 환원당 축적 감소 및 열-유도성 아크릴아미드 형성의 감소로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 일 측면에서, 식물 DNA 벡터의 2개의 침묵 카세트를 발현하는 감자식물 품종은 러셋 버뱅크(Russet Burbank) E12 품종이다.
따라서, 본 발명에 따라, E12로 지정된 솔라눔 투베로숨 L.(Solanum tuberosum L.) 종(species) 및 속(genus)의 새로운 감자종자를 제공한다. 따라서, 본 발명은 감자종자 E12, 감자종자 E12의 덩이줄기, 감자종자 E12의 식물, 감자종자 E12의 씨앗, 감자종자 E12로부터 생산되는 식품, 및 감자종자 E12를 자가교배하거나 감자종자 E12를 또 다른 감자종자와 교배함으로써 생산되는 감자식물의 생산 방법, 및 감자종자 E12의 돌연변이 또는 형질전환에 의한 변이체의 제조에 관한 것이다.
따라서, 자가교배, 역교배, 잡종 생산, 집단 교배 등과 같이 종자 E12를 사용하는 이러한 임의의 방법들은 본 발명의 구현예이다. 감자종자 E12를 적어도 하나의 부모로서 사용함으로써 생산되는 모든 식물들은 본 발명의 범위에 속한다. 유리하게는, 감자종자는, 우수한 특징을 가진 제1세대(F1) 감자 잡종 덩이줄기, 씨앗 및 식물을 생산하기 위해, 다른, 상이한 감자식물과의 교배에 사용될 수 있었다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 감자종자 E12의 단일 또는 다중 유전자 변환된 식물을 제공한다. 일 구현예에서, 전달되는(transferred) 유전자(들)는 우성 대립 유전자(들) 또는 열성 대립 유전자(들)일 수 있다. 일부 구현예에서, 전달되는 유전자(들)는, 제초제저항성(herbicide resistance), 내충성(insect resistance), 박테리아 질병, 진균 질병 또는 바이러스 질병에 대한 내성, 웅성 수정능(male fertility), 웅성 불임(male sterility), 영양 품질 증강, 균일성, 전분 및 기타 탄수화물의 농도 증가, 상처 취약성(tendency to bruise) 감소, 및 전분에서 당으로의 변환율 감소와 같은 형질을 부여할 것이다. 유전자(들)는 자연적으로 존재하는 감자 유전자이거나, 유전자 조작 기술, 역교배 또는 돌연변이를 통해 도입되는 이식유전자(transgene)일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 감자종자 E12의 조직 배양에 사용하기 위한 재생성 세포를 제공한다. 일 구현예에서, 조직 배양은, 상기 감자식물의 생리학적 특징 및 형태학적 특징을 모두 가지는 식물을 재생시킬 수 있으며, 상기 감자식물과 실질적으로 동일한 유전자형을 가지는 식물을 재생시킬 수 있을 것이다. 일부 구현예에서, 이러한 조직 배양물 내의 재생성 세포는 배(embryo), 원형질체, 분열조직 세포, 캘러스, 화분, 잎, 꽃밥(anther), 암술, 떡잎, 배축(hypocotyl), 뿌리, 근단(root tip), 꽃, 씨앗, 잎꼭지(petiole), 덩이줄기, 눈(eye) 또는 줄기일 것이다. 더욱 나아가, 본 발명은 본 발명의 조직 배양으로부터 재생되는 감자식물을 제공한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 감자식물 품종인 러셋 버뱅크 E12의 덩이줄기로부터 제조되는 식품을 제공한다. 바람직하게는, 식품은 열처리된 제품이다. 보다 더 바람직하게는, 식품은 후렌치후라이, 감자침, 탈수된 감자 재료, 감자 플레이크 또는 감자 과립이다.
상기 기술된 예시적인 측면 및 구현예 외에도, 추가적인 측면 및 구현예는 하기의 상세한 설명을 연구함으로써 명백해질 것이다.
도 1은 pSIM1278 형질전환 벡터를 도시한 것이다. 좌측의 벡터 백본 영역은 길이가 9,511 bp로서, 9,957 bp 위치에서 시작하여 19,468 bp 위치에서 종결된다. 백본 DNA는 주로, 식물 형질전환 전에 DNA 삽입의 유지를 지지 제공하는 박테리아 DNA로 구성된다. DNA 삽입 영역(우측)은 길이가 10,147 bp(19,469 bp부터 19,660 bp, 및 1 bp부터 9,956bp)이다. DNA 삽입은 고유한 DNA로만 구성되며, 형질전환 시 감자 게놈 내로 안정하게 통합되었다.
도 2는 pSIM1278 형질전환 벡터에 삽입된 DNA 삽입체에서 침묵 카세트의 도식도를 제공한다. 각각의 침묵 카세트는, 스페이서에 의해 분리된 2개의 유전자 단편의 복사체를 2개씩 함유한다. 4개의 표적화된 유전자인 Asn-1, Ppo-5, Phl 및 R1의 단편들을 포함하는 DNA 분절의 복사체 2개는, 덩이줄기에서 주로 활성이며 Pro로서 표시된 2개의 수렴 프로모터(convergent promoter) 사이에 역반복체(inverted repeat)로서 삽입되었다. 생성되는 침묵 카세트를 함유하는 식물은, 의도한 표적 유전자를 동적이며 역동적으로 침묵시키는, 다양하고 비폴리아데닐화된(unpolyadenylated) RNA 분자 어레이를 덩이줄기에서 생성한다. RNA 분자의 크기는 일반적으로, 수렴 전사가 충돌 전사(collisional transcription)를 유도하기 때문에, 적용되는 2개의 프로모터들 간의 거리보다 더 작았다.
도 3은 카테콜 분석법 결과를 도시한 것이다. 러셋 버뱅크 대조군은 좌측에 있으며, 품종 E12는 우측에 있다. 진갈색은, 흑점 상처 감소의 형질이 존재하지 않음을 가리킨다. 도 3에 도시된 바와 같이, E12는 흑점 상처 감소의 형질을 가지는 반면, 대조군은 그렇지 않다.
하기의 상세한 설명 및 표에서, 다수의 용어들이 사용된다. 이러한 용어들이 주어지는 범위를 비롯하여 명세서 및 청구항에 대한 명쾌하면서 일관된 이해를 제공하기 위해, 하기의 정의가 제공된다:
대립 유전자. 대립 유전자는 하나의 형질 또는 특징에 관한, 하나 이상의 다른 형태의 유전자 중 임의의 유전자이다. 이배체 세포 또는 유기체에서, 주어진 유전자의 2개의 대립 유전자들은 한 쌍의 상동 염색체상에서 상응하는 유전자 좌를 차지한다.
아미노산 서열. 본원에서 사용되는 바와 같이, 식물로부터 단리되거나, 식물에 고유하거나, 식물에 자연적으로 존재하거나, 또는 합성에 의해 제조되지만 내인성 대응물의 핵산 서열을 포함하는, 올리고펩타이드, 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질 및 이들의 단편을 포함한다.
인공적으로 조작됨. 본원에서 사용되는 바와 같이, "인공적으로 조작됨"은, 조작되지 않는, 자연적으로 존재하는 대응물과 비교해, 상이한 생물학적, 생화학적, 형태학적 또는 생리학적 표현형 및/또는 유전자형을 가지는 식물 또는 식물 세포를 생산하기 위해, 식물 또는 식물 세포를, 수동적으로 또는 기계적 수단이나 재조합 수단, 예컨대 유전자 조작 기술에 의해 이동시키거나, 배열하거나, 작동시키거나 또는 조절하는 것을 의미한다.
무성 번식. 배우자(gamete)의 융합을 수반하지 않는, 잎 절단부, 줄기 절단부, 뿌리 절단부, 덩이줄기 눈, 포복지(stolon), 단일 식물 세포 원형질체, 캘러스 등으로부터 전체 식물을 발생시킴으로써 자손을 생산하는 것이다.
백본. 전달용으로 의도되는 DNA 삽입 서열을 배제한, 2성분(binary) 벡터의 핵산 서열이다.
역교배. 역교배는, 재배자가 잡종 자손을 부모 중 하나로 다시 반복하여 교배시키는 과정으로서, 예를 들어, 제1세대 잡종 F1을 F1 잡종의 부모 유전자형 중 하나와 교배시키는 것이다.
박테리아성 둘레 썩음병(Bacterial Ring Rot). 박테리아성 둘레 썩음병은 클라비박터 미시가넨세 아종(Clavibacter michiganense ssp) 박테리아에 의해 유발되는 질병이다. 박테리아성 둘레 썩음병이란 명칭은, 덩이줄기 내에서 관다발 둘레(vascular ring)의 특징적인 절단으로부터 유래된다. 이 둘레는 종종 크림빛의 황색 내지 담갈색의 치즈 같은 부패로서 나타난다. 감자의 외부 표면상에서, 심각하게 병에 걸린 덩이줄기는 약간 패여 있으며, 건조하고 균열이 생긴 영역을 나타낼 수 있다. 감염된 덩이줄기의 관다발 조직에서 박테리아성 둘레 썩음병의 증상은 전술한 것보다 덜 명확할 수 있으며, 단지 부서지고, 산발적으로 나타나는 짙은 선으로 보이거나 연속적인 황색의 변색으로 보이기도 한다.
흑점 상처. 상처가 난 덩이줄기 조직에서 확인되는 흑점은, 세포 손상 후 생성되며 조직에 갈색, 회색 또는 흑색의 외양을 제공하는 멜라닌이라는 색소의 결과이다. 멜라닌은, 세포 손상의 결과, 페놀 기질과 적절한 효소가 서로 접촉하게 될 때 형성된다. 손상은 세포 분해(broken cell)을 필요로 하지 않는다. 그러나, 통상적으로 조직이 충격을 받을 때, 기질과 효소의 혼합이 발생해야 한다. 흑점은 주로 관다발 둘레 바로 아래에 위치하는 메듈라주변(perimedullary) 조직에서 발생하지만, 피층(cortical) 조직의 일부를 포함하기에 충분할 정도로 클 수 있다.
경계-유사 서열(border-like sequence). "경계-유사" 서열은, 변형되어야 하는 선별된 식물종으로부터 단리되거나, 변형되어야 하는 식물종과 생식적으로 융화성이 있는 식물로부터 단리되며, 아그로박테리움의 경계 서열과 유사하게 작용한다. 즉, 본 발명의 경계-유사 서열은, 이것이 연결되는 폴리뉴클레오타이드의 통합을 촉진하고 용이하게 한다. 경계-유사 서열은, 길이가 5 bp 내지 100 bp, 길이가 10 bp 내지 80 bp, 길이가 15 bp 내지 75 bp, 길이가 15 bp 내지 60 bp, 길이가 15 bp 내지 50 bp, 길이가 15 bp 내지 40 bp, 길이가 15 bp 내지 30 bp, 길이가 16 bp 내지 30 bp, 길이가 20 bp 내지 30 bp, 길이가 21 bp 내지 30 bp, 길이가 22 bp 내지 30 bp, 길이가 23 bp 내지 30 bp, 길이가 24 bp 내지 30 bp, 길이가 25 bp 내지 30 bp, 또는 길이가 26 bp 내지 30 bp이다. 좌측 경계 서열 및 우측 경계 서열은 변형되어야 하는 식물의 게놈으로부터 단리되고/되거나 게놈에 고유하다. 경계-유사 서열은, 뉴클레오타이드 서열 면에서, 임의의 공지된 아그로박테리움-유래 T-DNA 경계 서열과 동일하지 않다. 따라서, 경계-유사 서열은 아그로박테리움 종, 예컨대 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 또는 아그로박테리움 리조게네스(Agrobacterium rhizogenes) 유래의 T-DNA 경계 서열과 상이한 뉴클레오타이드를 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 그 이상 가질 수 있다. 즉, 본 발명의 경계 서열 또는 경계-유사 서열은 아그로박테리움 종, 예컨대 아그로박테리움 투메파시엔스 또는 아그로박테리움 리조게네스 유래의 T-DNA 경계 서열과 95% 이상, 90% 이상, 80% 이상, 75% 이상, 70% 이상, 60% 이상 또는 50% 이상의 서열 동일성을 가지나, 100%의 서열 동일성을 가지진 않는다. 경계-유사 서열은 식물 게놈으로부터 단리되며, 뉴클레오타이드 서열을 또 다른 뉴클레오타이드 서열 내로 통합시킬 수 있는 효율을 변화시키기 위해 변형 또는 돌연변이화될 수 있다. 다른 폴리뉴클레오타이드 서열이 본 발명의 경계-유사 서열에 첨가되거나 경계-유사 서열 내에 혼입될 수 있다. 따라서, 좌측 경계 또는 우측 경계는, 5'- 및 3'- 다중 클로닝 부위, 또는 부가적인 제한 부위를 가지도록 변형될 수 있다. 경계 서열은, 동반(accompanying) 벡터 유래의 백본 DNA가 식물 게놈 내로 통합되지 않는 가능성을 높이기 위해 변형될 수 있다.
~로 본질적으로 구성됨. 소정의 요소들"로 본질적으로 구성되는" 조성물은, 이들 요소의 포함뿐만 아니라 본 발명의 조성물의 기본적이며 신규한 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 요소들의 포함으로 제한된다. 따라서, 조성물이 본 발명의 기본적이며 신규한 특징에 영향을 미치지 않는 한, 즉, 선별된 식물종 또는 선별된 식물종과 생식적으로 융화성인 식물로부터 유래되지 않는 외래 DNA를 포함하지 않는 한, 해당 조성물은 "~로 본질적으로 구성되는"이란 용어로 특징지어지는 본 발명의 조성물의 성분인 것으로 간주될 수 있다.
떡잎. 떡잎은 자엽(seed leaf)의 일 유형이다. 떡잎은 씨앗의 양분 저장 조직을 함유한다.
퇴화 프라이머(degenerate primer). "퇴화 프라이머"는, 정확하진 않지만 유사한 상동성을 가진 서열에 혼성화되는 경우, 염기 미스매치를 수용할 수 있기에 충분한 뉴클레오타이드 변이를 함유하는 올리고뉴클레오타이드이다.
쌍떡잎(dicotyledon)(쌍자엽(dicot)). 배가 2개의 자엽 또는 떡잎을 가지는 꽃식물이다. 쌍자엽의 예로는, 담배, 토마토, 감자, 고구마, 카사바, 알팔파(alfalfa) 및 대두를 비롯한 콩과식물(legume), 당근, 딸기, 상추, 오크(oak), 단풍나무, 호두나무, 장미, 민트, 호박(squash), 데이지 및 선인장을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
DNA 삽입체. 본 발명에 따르면, 식물의 게놈에 삽입되어야 하는 DNA 삽입체는 해당 식물에 고유한 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 해당 식물에 고유한 유전적 요소를 가진다. 일례에서, 예를 들어, 본 발명의 감자품종 E12의 DNA 삽입체는, 형질전환 시 식물 세포의 게놈에 안정적으로 통합되며, 흑점 상처의 발현, 아스파라긴 축적 및 노화 감미에 관여하는 유전자를 침묵시키는, 감자에 고유하거나 야생 감자, 감자 생식적으로 융화성인 식물에 고유한 10,147 bp의 비-코딩 폴리뉴클레오타이드이다. DNA 삽입체는 바람직하게는 2개의 발현 카세트를 포함하며, pSIM1278 형질전환 벡터로 지칭되는 형질전환 벡터 내로 삽입된다. 제1 카세트는, ADP 글루코스 파이로포스포릴라제 유전자(Agp)의 Agp 프로모터와 과립-결합 신타제 유전자(Gbss)의 Gbss 프로모터 사이에서 역반복체로서 배열되는, 아스파라긴 신서타제-1 유전자(Asn1) 및 폴리페놀옥시다제-5 유전자(Ppo5)의 단편을 둘 다 포함한다. 이들 프로모터는 덩이줄기에서 주로 활성이다. 제2 카세트의 기능은, 전분-연관 유전자 다이키나제-R1(R1) 및 포스포릴라제-L 유전자(PhL)의 프로모터를 침묵시키는 것이다. 이 카세트는, 제1 카세트와 동일한 Agp 프로모터 및 Gbss 프로모터에 작동적으로 연결된, 전분-연관 유전자 다이키나제-R1(R1) 및 포스포릴라제-L 유전자(PhL)의 프로모터들의 단편으로 구성된다. 이들 발현 카세트는 외래 DNA를 함유하지 않으며, 선별된 식물종 유래의 DNA 또는 선별된 식물종과 생식적으로 융화성인 식물 유래의 DNA로만 구성된다.
배. 배는 성숙 씨앗 내에 함유된 미성숙 식물이다.
외래. 핵산과 관련하여 "외래"는, 해당 핵산이 비-식물 유기체로부터 유래되거나, 형질전환되어야 하는 식물과 동일한 종인 아닌 식물로부터 유래되거나, 형질전환되어야 하는 식물과 교배할 수 없는 식물로부터 유래되지 않으며, 표적 식물의 종에 속하지 않음을 의미한다. 본 발명에 따르면, 외래 DNA 또는 RNA는, 균류, 박테리아, 바이러스, 포유류, 어류 또는 조류의 유전적 구성(genetic makeup)에 자연적으로 존재하나, 형질전환되어야 하는 식물에는 자연적으로 존재하지 않는 핵산을 나타낸다. 따라서, 외래 핵산은 예를 들어, 형질전환된 식물에 의해 자연적으로 생성되지 않는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산이다. 외래 핵산은 단백질 생성물을 인코딩해야 할 필요는 없다. 본 발명에 따르면, 원하는 유전자내 식물은, 이의 게놈 내에 통합되는 임의의 외래 핵산을 포함하지 않는 식물이다.
유전자. 본원에서 사용되는 바와 같이, "유전자"는 코딩 영역을 지칭하며, 해당 영역에 대해 5'- 또는 3'-인 뉴클레오타이드 서열은 포함하지 않는다. 기능성 유전자는 프로모터 또는 종결자에 작동적으로 연결되는 코딩 영역이다. 유전자는, 상이한 종 유래이든지 또는 동일한 종 유래이든지 간에, 형질전환 또는 다양한 육종 방법을 이용하여, 종의 게놈 내로 도입될 수 있다.
변환된 유전자(변환). 유전자 변환된(변환) 식물은, 역교배로 일컬어지는 식물 육종 기술에 의해 개발되는 식물을 지칭하며, 여기서, 역교배 기술, 유전자 조작 또는 돌연변이를 통해 품종 내로 전달되는 하나 이상의 유전자 외에도, 품종의 원하는 형태학적 특징 및 생리학적 특징들은 실질적으로 모두 복귀된다. 하나 이상의 유전자 좌 또한, 전달될 수 있다.
유전자 재배열. 생체 내에서뿐만 아니라 시험관 내에서 자발적으로 발생할 수 있는, 유전적 요소의 재연관(re-association)을 지칭하며, 이는 유전적 물질의 새로운 조직화(organization)를 도입한다. 예를 들어, 상이한 염색체의 유전자 좌에서 폴리뉴클레오타이드를 함께 스플라이싱하는 것은, 식물 발달 및 생식적 재조합(sexual recombination) 동안에 생체 내에서 자발적으로 일어날 수 있다. 이에, 시험관 내에서 비-자연적인 유전적 변형 기술에 의한 유전적 요소의 재조합은, 마찬가지로 생체 내에서 생식적 재조합을 통해 일어날 수 있는 재조합 사건과 흡사하다. DNA 삽입체의 예를 들어, 식물 게놈 내로의 삽입은 유전자 재배열 또는 게놈 재배열의 일례이다.
시스토 선충(golden nematode). 흔히 시스토 선충으로 공지되어 있는 글로보데라 로스토키엔시스(Globodera rostochiensis)는 감자식물의 뿌리 및 덩이줄기에 영향을 미치는 식물 기생 선충이다. 증상으로는, 불량한 식물 생장, 시들음(wilting), 수분 스트레스(water stress) 및 양분 결핍이 포함된다.
배축. 배축은 떡잎과 뿌리 사이의 배 또는 묘목의 부분이다. 따라서, 배축은 순(shoot)과 뿌리 사이의 전이 구역으로서 간주될 수 있다.
틀 내에서(in frame). 뉴클레오타이드 트리플릿(triplet)(코돈)은 식물 세포에서 원하는 재조합 단백질의 초기(nascent) 아미노산 서열로 번역된다. 구체적으로, 본 발명은 해독틀 내에서 제2 핵산에 연결된 제1 핵산을 고려하며, 여기서, 제1 뉴클레오타이드 서열은 유전자이며, 제2 뉴클레오타이드는 프로모터 또는 유사한 조절 요소이다.
통합하다. 선별된 식물종 유래의 핵산 서열, 선별된 식물과 동일한 종 유래의 식물 유래의 핵산 서열, 또는 선별된 식물종과 교배 가능한 식물 유래의 핵산 서열을, 선별된 식물종의 세포 게놈 내로의 삽입을 지칭한다. "통합"은, 고유한 유전적 요소만을 식물 세포 게놈 내로 혼입하는 것을 지칭한다. 고유한 유전적 요소를 예컨대 상동성 재조합에 의해 통합하기 위해, 본 발명은, 이러한 과정에서 하나의 단계로서 고유한 것이 아닌 DNA를 "사용"할 수 있다. 따라서, 본 발명은 특정한 DNA 분자의 "사용"과, 특정한 DNA 분자의 식물 세포 게놈 내로의 "통합"을 구별한다.
도입. 본원에서 사용되는 바와 같이, 감염, 형질감염, 형질전환 또는 형질도입을 비롯한 방법에 의해, 핵산 서열을 세포 내로 삽입하는 것을 지칭한다.
단리된. "단리된"은, 임의의 핵산 또는 화합물이 이의 정상적이며 고유한 환경으로부터 물리적으로 분리되는 것을 지칭한다. 단리된 물질은 예를 들어, 용매, 완충제, 이온 또는 그 외의 성분을 함유하는 적합한 용액에서 유지될 수 있으며, 정제된 형태 또는 비정제된 형태로 존재할 수 있다.
리더. 유전자의 앞쪽에 있으며(또는 5') 전사는 되지만 번역은 되지 않는 서열이다.
유전자 좌. 유전자 좌는 하나 이상의 형질, 예를 들어, 웅성 불임, 제초제 저항력, 내충성, 내병성(disease resistance), 찰녹말(waxy starch), 지방산 대사 변형, 피틴산 대사 변형, 탄수화물 대사 변형 및 단백질 대사 변형을 부여한다. 형질은 예를 들어, 역교배, 자연 돌연변이 또는 유도 돌연변이, 또는 유전적 형질전환 기술을 통해 도입되는 이식유전자에 의해 품종의 게놈 내로 도입되는, 자연적으로 존재하는 유전자에 의해 부여될 수 있다. 유전자 좌는 단일 염색체 위치에서 통합되는 하나 이상의 대립 유전자를 포함할 수 있다.
상품 수율(marketable yield). 상품 수율은, 직경이 2인치 내지 4인치인, 수확되는 모든 덩이줄기의 중량이다. 상품 수율은 cwt(100웨이트(hundred weight))로 측정되며, 여기서, cwt는 100파운드이다.
외떡잎(monocotyledon)(단자엽(monocot)). 배가 떡잎 또는 자엽을 하나 가지는 꽃식물이다. 단자엽의 예로는, 잔디풀, 옥수수, 쌀, 귀리, 밀, 보리, 수수, 난초, 붓꽃, 백합, 양파 및 야자나무(palm)를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
고유한. "고유한" 유전적 요소는, 형질전환되어야 하는 식물의 게놈에 자연적으로 존재하거나, 게놈으로부터 기원하거나, 게놈에 속하는 핵산을 지칭한다. 따라서, 형질전환되어야 하는 식물 또는 식물종의 게놈으로부터 단리되거나, 형질전환되어야 하는 식물종과 생식적으로 융화성이거나 교배가능한(interfertile) 식물 또는 종으로부터 단리되는, 임의의 핵산, 유전자, 폴리뉴클레오타이드, DNA, RNA, mRNA 또는 cDNA 분자는 식물종에 "고유한", 즉, 토종(indigenous)이다. 즉, 고유한 유전적 요소는, 전형적인 식물 육종을 통한 식물의 개량을 위해 식물 재배자가 접근할 수 있는 모든 유전적 물질을 나타낸다. 고유한 핵산의 임의의 변이체 또한, 본 발명에 따르면 "고유한" 것으로 간주된다. 이러한 면에서, "고유한" 핵산은 또한, 식물 또는 이의 생식적으로 융화성인 종으로부터 단리되고, 변형 또는 돌연변이화되어, 생성되는 변이체는 식물로부터 단리되는 비변형된 고유한 핵산과 뉴클레오타이드 서열이 99% 이상, 98% 이상, 97% 이상, 96% 이상, 95% 이상, 94% 이상, 93% 이상, 92% 이상, 91% 이상, 90% 이상, 89% 이상, 88% 이상, 87% 이상, 86% 이상, 85% 이상, 84% 이상, 83% 이상, 82% 이상, 81% 이상, 80% 이상, 79% 이상, 78% 이상, 77% 이상, 76% 이상, 75% 이상, 74% 이상, 73% 이상, 72% 이상, 71% 이상, 70% 이상, 69% 이상, 68% 이상, 67% 이상, 66% 이상, 65% 이상, 64% 이상, 63% 이상, 62% 이상, 61% 이상 또는 60% 이상 유사할 수 있다. 고유한 핵산 변이체는 또한, 뉴클레오타이드 서열이 약 60% 미만, 약 55% 미만 또는 약 50% 미만 유사할 수 있다. 식물로부터 단리된 "고유한" 핵산은 또한, 해당 핵산으로부터 전사 및 번역되는 자연적으로 존재하는 단백질 생성물의 변이체를 인코딩할 수 있다. 따라서, 고유한 핵산은, 핵산이 단리되었던 식물에서 발현되는 비변형된 고유한 단백질과 아미노산 서열이 99% 이상, 98% 이상, 97% 이상, 96% 이상, 95% 이상, 94% 이상, 93% 이상, 92% 이상, 91% 이상, 90% 이상, 89% 이상, 88% 이상, 87% 이상, 86% 이상, 85% 이상, 84% 이상, 83% 이상, 82% 이상, 81% 이상, 80% 이상, 79% 이상, 78% 이상, 77% 이상, 76% 이상, 75% 이상, 74% 이상, 73% 이상, 72% 이상, 71% 이상, 70% 이상, 69% 이상, 68% 이상, 67% 이상, 66% 이상, 65% 이상, 64% 이상, 63% 이상, 62% 이상, 61% 이상 또는 60% 이상 유사한 단백질을 인코딩할 수 있다.
고유한 유전적 요소. "고유한 유전적 요소"는 본 발명에 따른 선별된 식물종 게놈 내로 혼입 및 통합될 수 있다. 고유한 유전적 요소는, 선별된 식물종에 속하는 식물, 또는 선별된 식물종과 생식적으로 융화성인 식물로부터 단리된다. 예를 들어, 재배되는 감자(솔라눔 투베로숨) 내로 혼입되는 고유한 DNA는 S. 투베로숨의 임의의 유전자형, 또는 S. 투베로숨과 생식적으로 융화성인 야생 감자종(예., 데미쑴(S. demissum))의 임의의 유전자형으로부터 유래될 수 있다.
자연적으로 존재하는 핵산. 자연적으로 존재하는 핵산은 선별된 식물종의 게놈 내에서 확인되며, DNA 분자 또는 RNA 분자일 수 있다. 식물종의 게놈에 통상적으로 존재하는 제한 부위의 서열은, 해당 제한 부위가 해당 게놈으로부터 물리적으로 단리되지 않았더라도, 벡터 또는 올리고뉴클레오타이드와 같은 외인성 DNA 분자 내로 조작될 수 있다. 따라서, 본 발명은, 해당 서열이, 선별된 식물종, 또는 형질전환되어야 하는 선별된 식물종과 생식적으로 융화성인 식물의 게놈에 자연적으로 존재하는 한, 제한 효소 인지 서열과 같은 뉴클레오타이드 서열을 합성 제조할 수 있게 한다.
작동적으로 연결됨. 조합된 상태에서 2개 이상의 분자들이 식물 세포에서 적절하게 작용하는 방식으로, 이들 분자를 조합하는 것이다. 예를 들어, 프로모터는, 프로모터가 구조 유전자의 전사를 조절하는 경우, 구조 유전자에 작동적으로 연결된다.
식물. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "식물"로는, 속씨식물 및 겉씨식물, 예컨대 감자, 토마토, 담배, 알팔파, 상추, 당근, 딸기, 사탕무, 카사바, 고구마, 대두, 옥수수, 잔디풀, 밀, 쌀, 보리, 수수, 귀리, 오크, 유칼립투스, 호두나무 및 야자나무를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 따라서, 식물은 단자엽 또는 쌍자엽일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 단어 "식물"은 또한, 식물 세포, 씨앗, 식물 자손, 유성 생식 또는 무성 생식으로 발생되든지 간에 주아(propagule), 및 이들 중 임의의 자손, 예컨대 절단부 또는 씨앗을 포함한다. 식물 세포로는, 현탁 배양물, 캘러스, 배, 분열조직 영역, 캘러스 조직, 잎, 뿌리, 순, 배우체(gametophyte), 포자체(sporophyte), 화분, 씨앗 및 소포자(microspore)를 포함한다. 식물은 다양한 성숙 단계들에 있을 수 있으며, 액체 배양물이나 고체 배양물, 또는 포트(pot), 온실 또는 필드 내의 토양 또는 적합한 매질에서 생장할 수 있다. 식물에서, 도입된 리더, 트레일러(trailer) 또는 유전자 서열의 발현은 일시적이거나 영구적일 수 있다. "선별된 식물종"은 이들 "식물" 중 임의의 하나의 종일 수 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
식물 부분. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "식물 부분"(또는 감자식물 또는 이의 일부)으로는, 원형질체, 잎, 줄기, 뿌리, 근단, 꽃밥, 암술, 씨앗, 배, 화분, 밑씨(ovule), 떡잎, 배축, 꽃, 덩이줄기, 눈, 조직, 잎꼭지, 세포, 분열조직 세포 등을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
식물종. 생식적인 친화성을 적어도 일부 나타내는 공식적으로 명명되는 식물종에 속하는 식물군이다.
식물 형질전환 및 세포 배양. 광범위하게는, 식물 세포가 유전적으로 변형되고, 유지, 추가적인 생장 및/또는 추가적인 발달에 적절한 식물배양 배지로 전달되는 과정을 지칭한다.
정확한 육종(precise breeding). 선별된 식물종, 선별된 식물과 동일한 종의 또 다른 식물, 또는 선별된 식물종과 생식적으로 융화성인 종으로부터 단리된 핵산, 예컨대 고유한 유전자 및 조절 요소를 개별 식물 세포 내로 안정하게 도입한 다음, 이들 유전적으로 변형된 식물 세포를 식물 전초(whole plant) 내로 재생시킴으로써 식물을 개량하는 것을 지칭한다. 알려지지 않은 핵산 또는 외래 핵산이 식물 게놈 내로 영구적으로 혼입되기 때문에, 본 기술은 종래의 식물 육종을 통해서도 접근가능한 동일한 유전적 물질을 이용한다.
자손. 본원에서 사용되는 바와 같이, 2개의 감자식물의 교배로부터 생산되는 F1 감자식물을 포함하며, 여기서, 적어도 하나의 식물은 감자종자 E12를 포함하며, 자손으로는 추가로, 재현성 부모 라인(recurrent parental line)과의 F2, F3, F4, F5, F6, F7, F8, F9, 및 F10 세대간 교배(generational cross)를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
양적 형질 유전자 좌(Quantitative Trait Loci; QTL). 양적 형질 유전자 좌(QTL)는, 통상 계속해서 분포되는 수적으로 대표적인 형질을 어느 정도 조절하는 유전자 좌를 지칭한다.
재조합. 본원에서 사용되는 바와 같이, 유전자가 클로닝될 수 있으며, DNA가 서열화될 수 있고, 단백질 생성물이 생성될 수 있는 다양한 기술들을 광범위하게 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 이 용어는 또한, 유전자가 식물 숙주 시스템의 세포 내로 전달된 후 생성된 단백질을 지칭한다.
재생. 재생은 조직 배양으로부터의 식물의 발달을 지칭한다.
조절 서열. 식물 시스템에서 관심 유전자의 전사 또는 생성되는 RNA의 번역을 증가시키고/거나 최대화하기 위해 발현 벡터에 포함될 수 있는, 당해 기술분야에서 표준이며 공지되어 있는 서열을 지칭한다. 이들로는, 프로모터, 펩타이드 이출(export) 신호 서열, 인트론, 폴리아데닐화 및 전사 종결 부위를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 식물에서 발현 수준을 증가시키기 위해 핵산 구축물을 변형시키는 방법 또한, 일반적으로 당해 기술분야에 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Rogers et al., 260 J. Biol. Chem. 3731-38, 1985]; 문헌[Cornejo et al., 23 Plant Mol. Biol. 567: 81,1993] 참조). 단백질의 전사율에 영향을 미치기 위해 식물 시스템을 조작하는 경우, 양성 작동 서열 또는 음성 작동 서열, 인핸서 및 사일런서와 같은 조절 서열뿐만 아니라 염색질 구조를 비롯하여 당해 기술분야에 공지된 다양한 인자들이 영향을 미칠 수 있다. 본 발명은, 이들 인자 중 적어도 하나가 관심 단백질을 발현시키기 위해 식물을 조작하는 데 이용될 수 있음을 제공한다. 본 발명의 조절 서열은 고유한 유전적 요소로서, 즉, 변형되어야 하는 선별된 식물종으로부터 단리된다.
선별성 마커. "선별성 마커"는 전형적으로, 항생제, 제초제 또는 독성 화합물에 대한 일부 종류의 내성을 부여하는 단백질을 코딩하는 유전자이며, 형질전환 사건을 확인하는 데 사용된다. 선별성 마커의 예로는, 스트렙토마이신 내성을 인코딩하는 스트렙토마이신 포스포트랜스퍼라제(spt) 유전자, 만노스-6-포스페이트를 프룩토스-6 포스페이트로 변환시키는 포스포만노스 이소머라제(pmi) 유전자, 카나마이신 및 게네티신 내성을 인코딩하는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(nptII) 유전자, 하이그로마이신에 대한 내성을 인코딩하는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (hpt 또는 aphiv) 유전자, 설포닐우레아-유형 제초제에 대한 내성을 인코딩하는 아세토락테이트 신타제(als) 유전자, 포스피노트리신 또는 바스타(basta)와 같이 글루타민 신타제의 작용을 저해하는 제초제에 대한 내성을 코딩하는 유전자(예, 바르(bar) 유전자), 또는 당해 기술분야에 공지되어 있는 다른 유사한 유전자를 포함한다.
센스 억제. 유전자이식 식물에서 해당 유전자의 모두 또는 일부의 하나 이상의 부가적인 복사체의 발현에 의해 내인성 유전자의 발현을 감소시키는 것이다.
비중. 본원에서 사용되는 바와 같이, "비중"은 밀도의 표현으로서, 감자 품질의 측정값이다. 덩이줄기의 비중 및 전분 함량 및 건조 물질 또는 총 고체의 백분율 간에는 높은 상관관계가 있다. 비중이 높을수록, 회수율이 높아지고, 가공 제품의 품질이 양호해진다.
T-DNA-유사. "T-DNA-유사" 서열은 선별된 식물종, 또는 선별된 식물종과 생식적으로 융화성인 식물로부터 단리되며, 아그로박테리움 종 T-DNA와 100%는 아니지만 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상의 서열 동일성을 공유하는 핵산이다. T-DNA-유사 서열은, 각각이 뉴클레오타이드 서열을 또 다른 폴리뉴클레오타이드 내로 통합시킬 수 있는 하나 이상의 경계 서열 또는 경계-유사 서열을 함유할 수 있다.
총 수율. 총 수율은 수확된 모든 덩이줄기들의 총 중량을 지칭한다.
트레일러. 유전자 뒤에 있으면서(또는 유전자에 3') 전사는 되지만 번역은 되지 않는 서열을 지칭한다.
전사되는 DNA. 유전자, 및 해당 유전자와 연관있는 비번역 리더와 트레일러 서열 둘 다를 포함하며, 선행 프로모터의 작동에 의해 단일 mRNA로서 전사되는 DNA를 지칭한다.
식물 세포의 형질전환. DNA가 식물 세포의 게놈 내로 안정하게 통합되는 과정을 지칭한다. "안정하게"란, 세포 게놈에서 세포 게놈에 의한 폴리뉴클레오타이드의 영구적이거나 비-일시적인 체류 및/또는 발현을 지칭한다. 따라서, 안정하게 통합되는 폴리뉴클레오타이드는, 형질전환된 세포 게놈 내에서 고정체(fixture)이며, 세포 또는 생성되는 형질전환 식물의 잇따른 자손을 통해 복제 및 번식될 수 있는 것이다. 형질전환은 당해 기술분야에 잘 공지되어 있는 다양한 방법들을 이용하여 자연적이거나 인공적인 조건하에 이루어질 수 있다. 형질전환은, 아그로박 테리움-매개 형질전환 프로토콜, 바이러스 감염, 위스커(whisker), 전기천공, 열 쇼크, 리포펙션(lipofection), 폴리에틸렌 글리콜 처리, 현미주사(micro-injection) 및 유전자 총(particle bombardment)을 비롯하여, 핵산 서열을 원핵 숙주 세포 또는 진핵 숙주 세포 내로 삽입하는 임의의 공지된 방법에 의존할 수 있다.
이식유전자. 단백질 코딩 영역을 포함하는, 숙주 게놈 내로 삽입될 유전자를 지칭한다. 본 발명의 맥락에서, 이식유전자를 포함하는 요소는 숙주 게놈으로부터 단리된다.
유전자이식 식물. 적어도 하나의 이식유전자를 함유하는, 유전적으로 변형된 식물을 지칭한다.
변이체. 본원에서 사용되는 바와 같이, "변이체"는, 특정 유전자 또는 단백질의 표준 또는 주어진 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열로부터 벗어나는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열을 의미하는 것으로 이해된다. 용어, "이소폼", "이소타입" 및 "유사체" 또한, 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 "변이체" 형태를 지칭한다. 하나 이상의 아미노산의 첨가, 제거 또는 치환, 또는 뉴클레오타이드 서열의 변화에 의해 변경되는 아미노산 서열은 "변이체" 서열인 것으로 간주될 수 있다. 변이체는 "보존적" 변화를 가질 수 있으며, 여기서, 치환된 아미노산은 유사한 구조적 또는 화학적 특성을 가지며, 예를 들어, 루신이 이소루신으로 대체되는 것이다. 변이체는 "비보존적" 변화를 가질 수 있으며, 예를 들어, 글리신이 트립토판으로 대체되는 것이다. 유사한 최소 변이는 또한, 아미노산 결실 또는 삽입, 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 어떤 아미노산 잔기가 치환, 삽입 또는 결실될 수 있는지 결정하는 가이던스(guidance)는 벡터 NTI Suite(InforMax, MD) 소프트웨어와 같이 당해 기술분야에 잘 공지되어 있는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 찾을 수 있다.
덩굴식물 성숙도(vine maturity). 덩굴식물 성숙도는, 식물이 탄수화물을 이용하여 광합성을 계속하는 능력을 지칭한다. 덩굴식물 성숙도는 1 내지 5의 척도로 점수가 매겨지며, 여기서, 1은 죽은 덩굴식물이고, 5는 여전히 꽃을 피우고 있는 녹색 덩굴식물이다.
감자는 사배체이며, 매우 이형접합성(heterozygous)이고, 근교약세(inbreeding depression)에 민감하기 때문에, 바람직한 형질을 감자식물의 게놈 내로 삽입하는 것은 특히 어려운 것으로 제시된다. 따라서, 종래의 육종을 이용한 가공 동안에, 아크릴아미드를 더 적게 생성하고, N-니트로소-N-(3-케토-1,2-부탄다이올)-3'-니트로티라민(문헌[Wang et al., Arch Toxicol 70: 10-5, 1995]), 5-하이드록시메틸-2-푸르푸랄(문헌[Janzowski et al., Food Chem Toxicol 38: 801-9, 2000]), 및 돌연변이유발 특성을 가진 다른 마이야르 반응 생성물(문헌[Shibamoto, Prog Clin Biol Res 304: 359-76, 1989])을 비롯하여 유해한 마이야르 반응 생성물을 더 적게 생성하는 유전자이식 감자식물을 효율적으로 개발하는 것이 매우 어렵다.
공정 변화, 덱스트로스 감소, 및 아스파라기나제, 시트레이트 및 경쟁적 아미노산과 같은 첨가제를 통해 아크릴아미드를 감소시키는 몇몇 방법들이 시험된 바 있으며, 연구가 계속 진행중이다. 감자 산업 전반에 걸쳐 공정 변화를 시행하는 데 드는 자본 비용은 수백만 달러에 이를 것이다. 비용 외에도, 이들 공정 변화는, 아스파라기나제 또는 시트레이트와 같은 첨가제와 관련된 잠재적으로 부정적인 향을 비롯하여 상당한 단점들을 가진다. 전형적으로, 후라이 제조업체는, 원하는 금갈색을 발색시키기 위해 후렌치후라이 공정 시 덱스트로스를 첨가하지만, 덱스트로스 또한, 마이야르 반응을 통해 아크릴아미드의 형성을 증가시킨다. 단지 덱스트로스를 공정에서 생략함으로써 아크릴아미드가 상당히 감소되지만; 그렇게 되면, 시그너처인 금갈색은 일부 다른 방식으로(예, 아나토(annatto)와 같은 색상의 첨가를 통해) 발색되어야 한다. 다른 색상을 사용하는 경우, 이들 갈변 반응을 통해 발생되는 전형적인 향이 존재하지 않게 된다. 아스파라긴과 같은 반응물을 감소시키기 위해 첨가제를 사용할 경우의 또 다른 문제점은, 동결 저장 동안에 발생하는 수분 이동으로서, 아스파라긴이 표면으로 되돌아가고 아크릴아미드가 증가된다. 마지막으로, 감자에 상처가 난 후 발생하는 흑화(blackening)는 후렌치후라이 및 칩 가공 시 품질 및 회수율에 영향을 미친다. 손상되고 상처가 난 감자는 가공 전에 트리밍(trimming)되거나 배제(reject)되어야 하므로 품질 문제 또는 경제적 손실을 야기한다.
본 발명의 "고유한 기술" 전략은, 흑점 상처에 관여하는 폴리페놀옥시다제-5(PPO-5)의 발현, 아크릴아미드 형성의 전구체인 아스파라긴 축적에 관여하는 아스파라긴 신서타제-1(Asn-1)의 발현, 및/또는 아크릴아미드와 같은 독성 마이야르 생성물을 형성하고, 아스파라긴과 같은 아미노산과 정상적으로 반응하는 환원당의 축적과 연관된 효소인 포스포릴라제-L 및 키나제-R1의 발현을 감소시킴으로써, 감자의 작물 특성 및 영양가를 개선하기 위한 감자 산업의 필요성을 해결한다. 덩이줄기에서 이들 유전자의 부분적인 침묵 또는 완전한 침묵은 아크릴아미드를 생성하는 잠재성을 낮춘다. 본 발명의 고유한 기술을 사용하면, 감자를, 식물의 게놈 내로 임의의 외래 유전적 물질을 통합시키지 않으면서 오로지 비-코딩 조절 영역만 함유하는, 감자식물로부터 수득되는 유전적 물질 또는 감자식물과 생식적으로 융화성인 식물로부터 수득되는 유전적 물질인 "고유한" 유전적 물질로만 형질전환시킴으로써, 바람직한 형질을 상업적으로 가치있는 감자식물 품종의 게놈 내로 혼입시킬 수 있다. 바람직한 형질로는, 충격-유도성 흑점 상처에 대한 높은 저항력, 아크릴아미드 전구체인 아스파라긴의 형성 감소, 및 환원당의 축적 감소와 더불어, 결과적으로, 아크릴아미드를 비롯한 독성 마이야르 생성물의 축적 저하, 개량된 품질 및 식품 색 조절을 포함한다. 감자는 사배체이며, 매우 이형접합성이고, 근교약세에 민감하기 때문에, 이들 바람직한 형질을 기존의 감자 품종 내로 혼입하는 것은 전통적인 육종을 통해서 달성하기란 불가능하다.
본 발명에 사용되는 비-코딩 감자식물 DNA 삽입체 서열은 감자식물 게놈에 고유하며, 임의의 아그로박테리움 DNA를 함유하지 않는다. DNA 삽입체는 바람직하게는 2개의 발현 카세트를 포함하며, pSIM1278 형질전환 벡터로 지칭되는 형질전환 벡터 내로 삽입된다. 제1 카세트는, ADP 글루코스 파이로포스포릴라제 유전자(Agp)의 Agp 프로모터와 과립-결합 신타제 유전자(Gbss)의 Gbss 프로모터 사이에서 역반복체로서 배열되는, 아스파라긴 신서타제-1 유전자(Asn1) 및 폴리페놀옥시다제-5 유전자(Ppo5)의 단편을 둘 다 포함한다. 이들 프로모터는 덩이줄기에서 주로 활성이다. 제2 카세트의 기능은, 전분-연관 유전자 다이키나제-R1(R1) 및 포스포릴라제-L 유전자(PhL)의 프로모터를 침묵시키는 것이다. 이 카세트는, 제1 카세트와 동일한 Agp 프로모터 및 Gbss 프로모터에 작동적으로 연결된, 전분-연관 유전자 다이키나제-R1(R1) 및 포스포릴라제-L 유전자(PhL)의 프로모터들의 단편으로 구성된다. 이들 발현 카세트는 외래 DNA를 함유하지 않으며, 선별된 식물종 유래의 DNA 또는 선별된 식물종과 생식적으로 융화성인 식물 유래의 DNA로만 구성된다.
본 발명에 사용되는 상업적으로 가치있는 감자식물 품종은 러셋 버뱅크이다. 루터 버뱅크(Luther Burbank)가 1870년대 초에 이 품종을 개발하였다. 식물은 활력적이며, 무한 유형의 생장을 가진다. 줄기는 두껍고, 주로 각이 져 있으며, 미세하게 얼룩이 져 있다. 잎은 폭이 중간 내지 길며, 색상은 옅은 녹색 내지 중간 녹색이다. 꽃은 몇 개 되지 않으며, 백색이고, 생식력이 없다. 종자는 더뎅이병(common scab)에는 관용적이지만, 위조병(Fusariumwilts)과 청고병(Verticillium wilts), 잎말이병(leafroll)과 망형 괴사(net necrosis), 및 바이러스에 취약하다. 식물이 혹(knob), 뾰족단(pointed end) 및 덤벨(dumbbell)이 없는 덩이줄기를 생산하기 위해서는, 높고 균일한 토양 수분 및 조절된 질소 비옥도(nitrogen fertility)의 조건이 요구된다. 식물이 스트레스를 받을 경우, 덩이줄기에서 젤리-말단(jelly-end) 및 당-말단(sugar-end)이 발달한다. 생산되는 덩이줄기는 큰 갈색 표면과 백색의 엽육을 가지며, 양호한 장기 저장 특징을 나타내고, 우수한 베이킹 및 가공 품질에 대한 표준을 나타낸다. 러셋 버뱅크 품종은 흑점 상처를 발병하는 높은 취약성을 가지며, 자유 아스파라긴 함량이 높고, 노화 감미 잠재성 또한 높다(문헌[Am. J. Potato Res (1966) 43: 305-314]). 품종은 불임성이며, 특히 후렌치후라이 생산을 위해 북서부 및 중서부에서 광범위하게 재배된다.
본 발명은, 형질전환 벡터 pSIM1278로 형질전환되며, 마커보다는 폴리머라제 연쇄 반응을 이용하여 확인되고, 성공적으로 번식되는, 상당한 시장 가치를 가진 감자품종 - 즉, 러셋 버뱅크 - 을 제공한다. 본 발명은 또한, 본 발명의 감자식물 품종 E12의 덩이줄기로부터 제조되는 식품을 제공한다. 감자종자 E12는 경제 협력 개발 기구(OECD)에 따라 하기의 독특한 식물품종 식별자: SPS-ØØE12-8을 가진다.
고유한 DNA를 이용한 표적화된 유전자 침묵은 감자식물 품종 E12의 덩이줄기에서 표적화된 유전자의 RNA 전사체의 수준을 감소시킨다. Asn1 유전자 및 Ppo5 유전자 침묵은, 전분-연관 유전자 키나제-R1 (R1) 및 포스포릴라제-L (PhL)을 추가로 저해하지 않고도 아크릴아미드 형성을 2배 내지 4배 정도 상당히 감소시키기에 충분하다. 따라서, 본 발명의 유전자내 감자식물 품종 E12의 덩이줄기는, 후라이 또는 베이킹 시 아크릴아미드 형성 감소와 연관된, 자유 아미드 아미노산인 아스파라긴 및 글루타민의 비율 감소를 비롯하여 매우 바람직한 형질을 혼입한다. 구체적으로, 본 발명의 감자품종 E12는, 자유 아스파라긴 함량의 2배 내지 4배 이상의 감소, 및 흑점 상처와 연관된 변색 감소를 특징으로 한다. 더욱이, 본 발명의 감자품종 E12는 저장 동안에, 전분이 환원당인 글루코스 및 프룩토스로 분해되는 것을 지연시킨다. 전분-대-당 변환의 감손(impairment)은 노화 감미 및 아크릴아미드 형성을 추가로 감소시키고, 열-유도성 갈변을 제한한다.
따라서, 본 발명의 감자품종 E12는, 이의 덩이줄기가 열 가공 시 아크릴아미드를 상당히 적은 양으로 생성하고 임의의 잠재적으로 유해한 외래 유전자를 운반하지 않기 때문에, 감자 산업 및 식품 시장에 매우 가치가 있다.
실시예
본 발명은, 새로운 유전자내 감자식물 품종을 개발하기 위해, 고유한 비-코딩 DNA를 선별된 감자식물 품종의 게놈 내로 통합하는 고유한 기술을 이용한다. 이 방법은, 형질 확인, 벡터 설계, 벡터의 아그로박테리움 내로의 혼입, 수여자 감자품종의 선별, 식물 형질전환, 개방 해독틀 부재의 증명(evidence), 및 새로운 감자식물 품종이 고유한 DNA만을 함유한다는 것의 확인을 포함한다. 본 발명의 감자종자 E12는, 아크릴아미드 형성 잠재성이 저하되어 있으며, 수크로스를 보다 소량으로 가지고, 흑점 상처에 대해 이의 비형질전환된 대응물보다 더 내성이다.
실시예 1. pSIM1278 형질전환 벡터
본 발명에서 사용되는 형질전환 벡터 pSIM1278은, 0.4-kb 감자식물 DNA 단편(GenBank 등록 번호 AY566555로서 기탁됨)을, 플라스미드 pVS1 및 pBR322 유래의 박테리아 복제 기원, 및 카나마이신에 대한 박테리아 내성에 대한 nptIII 유전자를 운반하는 pCAMBIA1301(호주, 캔버라의 CAMBIA)의 5.9-kb SacII-SphI 단편과 연결함으로써 제작한 pSIM106으로부터 유래되었다. Ubi-3 프로모터(Garbarino and Belknap, 1994) 뒤에 아그로박테리움 ipt 유전자를 포함하고 그 뒤에 Ubi-3 종결자를 포함하는 발현 카세트를 2.6-kb SacII 단편으로서 벡터 백본 내로 도입하였다(Rommens et al., 2004). 2개의 침묵 카세트를 운반하는 고유한 10-kb DNA 분절을 pSIM106의 DNA 삽입체 내로 삽입하여, pSIM1278을 수득하였다. 이 벡터들 모든 형질전환들에 사용하였다. pSIM1278 벡터 지도는 도 1에 도시되어 있다. 벡터 백본 영역은, 9,957 bp 위치에서 시작하고 19,468 bp 위치에서 종결하기 때문에, 9,511 bp이다. 백본 DNA는 주로 박테리아 DNA로 구성되며, 식물의 형질전환 전에 DNA 삽입체의 유지를 지지 제공한다. 백본 부분은 식물 세포 내로 전달되지 않는다. 백본의 다양한 요소들은 표 1에 기술되어 있다.
[표 1]
Figure 112015109521176-pct00001
실시예 2. 식물 DNA 삽입체 및 개방 해독틀 ( ORF )
pSIM1278에 사용되는 DNA 삽입 영역은 19,469 bp에서 19,660 bp 및 1 bp에서 9,956 bp로, 길이가 10,147 bp이다. DNA 삽입체는 고유한 DNA로만 구성되며, 감자 게놈 내로 안정하게 통합된다. DNA 삽입체 또는 이의 기능성 부분은, 본 발명의 감자식물 품종에서 통합되는 벡터 pSIM1278의 유일한 유전적 물질이다. DNA 삽입체는 도 2 및 하기의 표 2에 기술되어 있다.
[표 2]
Figure 112015109521176-pct00002
Figure 112015109521176-pct00003
본 발명의 감자 라인 E12를 생산하는 데 사용된 표 2에 기술된 DNA 삽입체는 인접한 유전자를 활성화시키지 않으며, 감자식물 품종 E12의 표현형에 악영향을 미치지 않는다. 또한, 본 발명의 감자식물 품종 E12는, DNA 삽입체에 의해 인코딩되는 개방 해독틀과 연관된 신규 단백질을 생성하지 않는다.
실시예 3. 아그로박테리움 균주 및 형질감염
C58-유래의 아그로박테리움균주 AGL1은, 매우 유해한(hyper-virulent) 플라스미드 pTiBo542의 전달 DNA(transfer DNA)를 정확하게 결실시킴으로써 개발하였다(Lazo et al., 1991). 일반적인 재조합 유전자(recA)에서 트랜스포존 삽입은 pSIM1278과 같은 재조합 플라스미드 벡터를 안정화시킨다(도 1). AGL1은 카르베니실린 및 리팜피신에 대한 내성을 나타내며, 티멘틴을 사용하여 형질전환된 감자조직으로부터 제거된다.
러셋 버뱅크 품종의 모주(stock plant)는, 3% 수크로스 및 2 g/l 겔라이트(gelrite)를 함유하는 40 ml 하프-스트렝스(half-strength) M516 배지(번식 배지)와 함께 마젠타 박스(magenta box)에서 유지시켰다. 4주령의 식물로부터 4 mm 내지 6 mm의 감자 절간 분절(internode segment)로 절단하고, pSIM1278을 운반하는 아그로박테리움 AGL1 균주로 감염시키고, 3% 수크로스 및 6 g/l 아가(agar)를 함유하는 조직 배양 배지(공동-배양 배지)로 전달하였다. 2일 후, 감염된 외식체(explant)를 3% 수크로스, 6 g/l 아가 및 150 mg/l 티멘틴을 함유하는 M404 배지로 전달하여, 아그로박테리움을 제거하였다(호르몬-무함유 배지). 방법에 대한 상세한 사항은 Richael et al. (2008)에 기술되어 있다.
1달 후, 감염된 외식체를 임의의 합성 호르몬을 함유하지 않는 신선한 배지로 전달하고, 24℃에서 16시간 광주기 하에 퍼시칼 생장 챔버(Percival growth chamber)에서 인큐베이션하였으며, 여기에서 외식체는 순을 형성하기 시작하였다. 다수의 순들이 ipt 유전자를 발현하였으며, 사이토키닌(cytokinin) 과잉생산 표현형을 나타내었고; 이들 순은 추가적인 분석용으로는 고려되지 않았다. PCR 유전형 분석에서, 잔여 순들 중 약 0.3% 내지 1.5%는 ipt 유전자가 결여되어 있지만 P-DNA의 적어도 일부를 함유한 것으로 나타났다. 따라서, 형질전환된 식물을 선별하기 위해 마커를 사용하지 않았다. ipt--기재의 마커-무함유 식물 형질전환에 대한 상세한 사항은 Richael et al.(2008)에 의해 공개되었다.
아그로박테리움의 제거 공정은 외식체 감염 후 2일째에 시작되었다. 이를 위해, 조직이 살아있는 아그로박테리움을 포함하지 않는 것으로 입증될 때까지, 조직을 항생제 티멘틴(150 mg/L)으로 처리하였다. 형질전환된 사건의 줄기 단편을 영양액-효모 추출물(nutrient broth-yeast extract; NBY 배지)에서 28℃에서 2주 동안 인큐베이션함(2회 반복)으로써 증거를 수득하였다. 97 CFR 파트 340에 따라, 살아있는 아그로박테리움이 존재하지 않는 경우에만, 형질전환된 식물을 수송하고 필드에 심었다.
감자식물 품종 E12를 DNA 겔 블롯 분석에 의해 분석하여, 통합된 DNA 삽입체 서열의 구조 및 복사 수(copy number)를 측정하고, 벡터 백본 서열의 부재를 확인하였다. 또한, DNA 삽입체의 측면에 있는 연접부(junction)의 서열을 측정하고, 삽입된 DNA의 안정성을 보여주기 위해, 분자적 특징화를 이용하였다. 연접부의 서열 정보는 유전자내 감자식물 품종 E12에 대한 특이적인 PCR 시험을 개발하는 토대를 제공하였다. 감자종자 E12는, 다양한 DNA 분해물들이 AGP, ASN, PHL 및 GBS 분자적 프로브와 혼성화되었을 때의 혼성화 결과로부터 추론되는 바와 같이, DNA 삽입체의 단일 완전 복사(single complete copy)를 함유하는 것으로 확인되었다.
실시예 4. 벡터 백본 DNA의 부재에 대한 증명
다수의 상업적인 유전자이식 작물과는 달리, 본 발명의 감자종자 E12는, 3가지 상이한 방법에 의해, 벡터 백본 DNA과 같이 형질전환에 사용되는 아그로박테리움-유래의 DNA 서열을 포함하지 않는 것으로 확인되었다: 1) 우선 아그로박테리움 유래의 ipt 유전자 발현 카세트를 포함하는 백본 DNA가 식물 세포에 우연적으로 전달되면, ipt 유전자 발현이 야기될 것이며 결과적으로 사이토키닌-유형 호르몬 이소펜테닐아데노신이 형성될 것이기 때문에, 벡터 백본에서 음성 선별성 이소펜테닐 이소머라제(ipt) 마커 유전자의 존재 또는 부재를 측정하였으며, 2) 그런 다음, 서던 블롯 혼성화를, 제1 스크리닝 방법을 통과한 형질전환 감자식물 상에서 사용하여, 백본 DNA의 부재를 확인하였으며, 3) 그런 다음, 경계 영역과 측면(flanking) 백본 DNA, 또는 DNA 삽입체의 측면에 있는 백본 DNA 내의 영역 사이의 연접부를 가리키는 단편을 증폭시키기 위해, PCR을 설계하였다. 이 방법의 효능은 pSIM1278 DNA를 양성 대조군으로서 사용함으로써 확인하였다. 본 발명의 감자종자 E12는 벡터 백본 DNA의 존재를 가리키는 PCR 밴드를 생성하지 않았다.
실시예 5. 삽입된 DNA의 안정성
DNA 삽입체의 안정성은 DNA 겔 블롯 혼성화 및 형질 평가 둘 다를 이용하여, 본래의 형질전환체에서 평가한 다음, 번식된 식물 물질에서 다시 평가하였다. 이들 연구는, 유전자내 사건이 혼입된 형질을 일관되며 신뢰할만한 방식으로 발현하는지 보장하기 위해 수행하였다. 불안정성은 희귀한 재조합 사건에 의해 유발되거나, 메틸화에 의해 야기될 수 있었다. 감자는 통상 클론적으로 번식되기 때문에, 생식적으로 번식되는 작물에 대한 표준 평가는 직접적으로 적용가능하지 않았으며, 씨앗보다는 덩이줄기를 사용하여 후속 세대를 정의하였다. DNA 블롯 혼성화의 결과는, 일관된 밴드가 복수의 세대들에 존재하였음을 나타내며, 따라서, 안정성을 가리킨다. 나아가, 안정성에 관한 증명은, 제1세대 및 제2세대 덩이줄기 씨앗에서 형질 효능을 확인함으로써 수득하였다.
DNA 삽입체 안정성은, 시험관 내에서 번식되었지만 토양에 심겨진 적은 없는 식물의 잎에서 DNA를 추출하고 평가함으로써, 본래-형질전환된 물질(G0)에서 나타내었다. 제1세대(G1) 분석을 위해, 각각의 유전자내 품종 유래의 2개의 번식된 식물, 및 각각의 대조군 유래의 하나의 식물을 온실에 심고; 각각의 식물로부터 수확한 덩이줄기 중 하나를 심어서, G1 식물로부터 잎을 수득하고, 이 잎을 사용하여, DNA를 단리하고 G1 세대를 평가하였다. 이 세대 유래의 덩이줄기를 다시 심은 다음, 생성되는 G2 식물의 잎을 해당 세대의 특징화에 사용하였다.
본 발명의 러셋 버뱅크 감자종자 E12로부터 단리한 DNA를 GBS 프로브와 혼성화하면, 2개의 공통 밴드(7.2-kb 및 8.0-kb)가 나타났으며, AGP 프로브와 혼성화하면 모든 레인에서 3개의 밴드(1.4-kb, 4.2-kb 및 4.9-kb)가 나타났다. 이들 밴드는 비변형된 게놈의 DNA 단편을 가리키는 것이다. 모든 유전자내 물질로부터 단리된 DNA에서 2개의 부가적인 밴드의 존재는, 본래의 형질전환체(G0)의 삽입체는 제1 및 제2 식물 생장(vegetative) 세대 G1 및 G2 내로 안정하게 잔존하였음을 가리켰으며, 2개의 부가적인 밴드 중 하나는 2.2-kb 밴드로서 내부의 DNA 삽입체 단편을 가리키며, 나머지 다른 하나는 DNA 삽입체 연접 단편(E12와 GBS의 경우 4.4-kb, E12와 AGP의 경우 2.15-kb)을 나타낸다.
Ppo 활성에 대한 카테콜 분석법은, 모든 E12 덩이줄기들이 변색되지 않은 채 유지되었으므로(도 3), E12 품종에서 DNA 삽입체 안정성에 대한 부가적인 증거를 제공한 반면, 비형질전환된 대조군 물질은 염색되었다. 이는, 필드 시험 2년 후, 품종 E12가 G2 덩이줄기에서 Ppo5 유전자를 침묵시키는 능력을 유지했었음을 나타내었다. 필드 시험 물질의 제조는, 삽입되는 유전적 물질의 안정성에 영향을 미치지 않으면서, 반복된 조직 배양 및 식물 생장 세대를 수반하였다.
실시예 6. 연접부 분석 및 품종-특이적인 검출
적어도 하나의 DNA 삽입체/측면 식물 DNA 연접부를, 어댑터 연결-매개 PCR(Adapter Ligation-Mediated PCR) 또는 서멀 비대칭 인터레이스드 PCR(Thermal Asymmetric Interlaced PCR)을 이용하여 서열화하였다. 연접부 서열을 사용하여 감자종자 E12에 대한 프라이머를 설계하였으며, 이들 프라이머를 품종-특이적인 PCR-기재의 검출 방법에 적용하였다. 덩이줄기 또는 가공 식품에 유전자내 물질이 부재하는지 확인하고 유기 씨앗의 순도를 보장하기 위해, 개발된 방법을 이용하여 필드 및 저장에서 식물 및 덩이줄기를 모니터링하였다.
실시예 7. 유전자 침묵의 효능 및 조직-특이성
유전자 침묵 방법을 적용하여 Asn1, Ppo5, PhL 및 R1 고유한 단백질의 활성을 저하시키고, 단백질의 양보다는 전사체 수준을 평가하여 새로운 표현형 형질과 분자 수준에서의 변화를 연결하였다.
잎과 줄기에서 ASN(아스파라긴) 형성에 관여하는 Asn1 유전자의 강한 침묵은 생장에 악영향을 미칠 것이기 때문에, 덩이줄기-특이적인 프로모터 및 포복지-특이적인 프로모터이면서, 광합성적으로 활성인 조직 및 뿌리에서는 훨씬 낮은 활성을 가진 Agp 프로모터 및 Gbss 프로모터를 사용하여, 덩이줄기 및 포복지에서 유전자 침묵을 유도하였다. 식물품종 E12 및 이의 비형질전환된 대응물의 다양한 조직들에서 4개의 표적 유전자의 전사체 수준을 노던 블롯 분석에 의해 측정하였다.
비형질전환된 대조군의 덩이줄기에서, 전사체 수준은, Asn1, PhL, 및 R1 유전자의 경우 "높았으며"(노던 블롯 혼성화에 의해 쉽게 검출가능함), Ppo5 유전자의 경우 "낮았다". 노던 블롯의 비교는, Asn1, Ppo5, 및 PhL이 온실의 덩이줄기와 필드의 덩이줄기에서 유사한 수준으로 발현되었음을 가리켰다. 대조적으로, R1 유전자는 필드의 덩이줄기보다 온실-생장 대조군 덩이줄기에서 약간 더 효과적으로 침묵화되었다.
품종 E12의 덩이줄기에서 Asn1 및 Ppo5 유전자에 대한 전사체 수준의 강한 감소는 낮은-아크릴아미드 잠재성, 및 흑점 상처와 연관된 변색의 감소와 연관있었다.
PhL 유전자의 전사체 수준은 E12 라인의 덩이줄기에서 부분적으로 감소되었다. 이러한 변화는 글루코스 및 프룩토스 양의 감소와 연결되었다. R1 전사체는 E12의 덩이줄기에서 부분적으로 감소되어("위스퍼드(whispered)"), 전분의 당으로의 분해를 제한하는 데 일조하였다.
Asn1, Ppo5 및 R1 유전자는 비형질전환된 식물의 포복지에서 낮은 수준으로 발현되었다. 대조적으로, 대조군에서의 높은 전사체 수준은 PhL 유전자와 연관있었다.
Asn1 및 Ppo5 유전자에 대한 전사체 수준은 대조군 포복지에서보다 러셋 버뱅크 E12 온실-생장 식물 유래의 포복지에서 훨씬 더 낮았다. 이러한 변형은 예상되었으며, 임의의 원하지 않거나 예상되지 않은 새로운 표현형에 연결되지 않는다. PhL 유전자의 발현은 또한, 유전자내 품종 E12의 포복지에서 하향조절되었다.
R1 유전자에 대한 전사체의 양은 품종 E12의 포복지에서 약간 감소("위스퍼드")하였다. 이러한 분자적 변화는 전분의 당으로의 제한된 분해에 기여하였다.
잎 조직에서, Asn1 유전자에 대한 전사체 수준은 E12 라인 및 이의 비형질전환된 대응물에서 유사하였다. Ppo5 유전자 발현에 대한 전사체 수준은 모든 경우들에서 검출 불가능한 수준인 반면, PhL 유전자에 대한 수준은 본래의 품종인 러셋 버뱅크 및 형질전환된 유도체 E12에서 일관되게 높았다. R1 유전자에 대한 전사체 수준은 대조군과 비교 시, 품종 E12에서 변경되지 않았다.
줄기 조직에서, Asn1 유전자 전사체 수준은 E12 및 이의 대조군에 대해 유사하였다. Ppo5 유전자에 대한 전사체 수준은 본 발명의 품종 E12에서 감소되었다. PhL 유전자 발현은 E12 라인 및 이의 대조군에서 매우 유사하였으며, R1 유전자 발현은 감소되지 않았다.
뿌리 조직에서, Asn1 및 Ppo5 유전자 둘 다에 대한 전사체 수준은 품종 E12에서 감소되었다. 이들 결과는, 침묵을 유도하는 데 사용된 프로모터가 땅밑(underground) 조직에서 부분적으로 기능성임을 가리켰다.
꽃 조직에서, Asn1 유전자 전사체 수준은 본래의 품종인 러셋 버뱅크에서보다 본 발명의 품종 E12에서 더 낮았다. Ppo5 유전자에 대한 전사체는 검출 불가능하였으며, PhL 유전자 및 R1 유전자의 발현 수준은 대조군과 유사하였다.
이들 결과는, Asn1 유전자 및 Ppo5 유전자의 발현 수준은 감자품종 E12의 덩이줄기 및 포복지에서 하향조절되었으며, R1 유전자 및 PhL 유전자는 품종 E12의 덩이줄기 및 포복지에서 적어도 부분적으로 침묵되었음을 나타내었다. 침묵은 덩이줄기 및 포복지에서 가장 효과적이었다.
선별된 감자품종 E12는 R1 유전자 및 PhL 유전자의 발현 수준보다 Asn1 유전자 및 Ppo5 유전자의 발현 수준에서 강하게 영향을 받았다. 이들 결과는, (1) Ppo 단백질 및 자유 ASN의 형성을 가능한 한 최대 범위로 방지하고, (2) 전분의 글루코스 및 프룩토스로의 변환을 단지 부분적으로 차단하려는 본 발명자의 의도와 일치하였다.
덩이줄기 및 포복지가 아닌 조직에서 전사체 수준의 우연한 변화는, 덩이줄기/포복지-특이적인 프로모터의 일부 누출(leakiness)을 나타내었다. 침묵 카세트의 발현을 통해 덩이줄기에서 생성되는 소(small) RNA가 다른 조직, 특히 뿌리 및 줄기 내로 이동하는 것이 또한 가능하다(Molnar et al., 2010). 덩이줄기 및 포복지가 아닌 조직에서 발현 수준이 변경되는 대부분의 경우들에서, 차이는 미미하였다. 유전자내 감자종자 E12의 특이적인 조직에서 하향조절된 전사체 수준에 관한 요약은 표 3에 나타나 있다. 표 3에서, A는 Asn1이며, P는 Ppo5이며, L은 PhL이고, R은 R1이다. 표 3에서 밑줄이 그어진 글자들은 강하게(2배 초과) 하향조절된 유전자 발현 수준을 가리키며; 그렇지 않다면, 발현 수준은 2배 미만 하향조절된다>.
[표 3]
Figure 112015109521176-pct00004
실시예 8. 필드 성능 및 덩이줄기 평가
2009년, 2010년 및 2011년 시험은 수확을 용이하게 하고, 유전자내 감자가 비변형된 물질로부터 분리된 채로 유지되었음을 보장하기 위해 기계적으로 심어졌다. 2009년도 평가의 경우, 각 사건 및 대조군 품종의 "핵 씨앗" 미니덩이줄기를 사용하여, 4개 또는 5개의 단일-열 플롯(20개 미니덩이줄기/플롯)을 심었으며, 이로써, 플롯은 필드에 걸친 블록 내에서 무작위로 분포되었다. 이러한 무작위의 완전 블록 설계(RCB)는 새로운 감자 품종 및 사건의 평가를 위해 전형적이다. 2010년 및 2011년에 취한 접근법은, 사건 당 3개의 무작위 플롯 및 사이트 당 대조군을 사용하는 것이었으며, 또한, 블록의 수와 동일한 수 또는 복제(사건 당 플롯)를 가진 RCB 설계를 이용하는 것이었다. 2010년도의 각각의 플롯은, 2009년도에 러셋 버뱅크의 경우, 미국 네브래스카 주의 체리 카운티에서 생산된 제1세대(G1) 덩이줄기로부터의 각각 20개 씨앗 피스의 3개 열로 구성되었다. 2011년도 시험의 러셋 버뱅크 씨앗은 2010년도에 미국 네브래스카 주의 체리 카운티에서 생산된 제2세대(G2)였다. 모든 시험들에서, 유전자내 라인의 씨앗을 이의 비변형된 대조군과 유사하게 취급하였다. 필드에서 생장된 덩이줄기는, 보다 높은 덩이줄기 수율 및 품질을 생산하는, 보다 활력이 있으며 균일한 식물을 발생시키기 때문에, 씨앗으로서 미니덩이줄기보다 바람직하다.
인공적으로 유도되지 않았지만 생장 시기 동안에 자발적으로 발생하게 될 곤충, 질병 및 환경적 스트레스에 대한 차별적인 반응에 대해, 일부 경우들에서는 표준화된 모니터링 척도를 이용하여, 각각의 플롯을 정성적으로 평가하였다. 중생(mid-season) 모니터링은 2009년, 2010년 및 2011년도에 조기 열 폐쇄(early row closure) 및 개화 직전 또는 도중(4월에 평가한 플로리다 시험을 제외하고는 대부분의 시험의 경우 6월 내지 7월)에 수행하여, 초세(plant vigor), 잎 색상, 잎 크기, 잎말이, 질병 증상(존재/부재) 및 곤충-연관 식물 손상을 평가하였다. 2011년도에, 생장 영역에 보편적인 특이적인 곤충, 질병 및 비생물 스트레스 요인(abiotic stressor)을 평가하였다. 질병 및 곤충 압력(insect pressure)은 일반적으로 중기와 후기 동안에 가장 높았으나, 식물은 7월에서 9월(플로리다 시험의 경우 3월에서 5월)에 병원체 및 곤충에 의해 유발되는 증상에 대해 모니터링하였다. 덩굴식물 성숙도 및 질병에 대한 후기 모니터링은, 덩이줄기 성숙 및 후기 껍질 세트(skin set)를 보장하고자 하는 과정인 덩굴식물 살해(vine killing) 전에 1번만 수행하였다. 덩굴식물 살해는 덩굴식물의 풀을 베거나 도리깨질을 함으로써, 또는 레글론(Reglone)과 같은 승인된 제초제를 제조업체(미국 미네소타주 로즈빌의 JR Johnson)의 권고사항에 따라 사용함으로써 유도된다. 이때, 식물을 또한, 질병 증상 및 곤충 손상에 대해 평가하였다. 질병 증상이 확인된 일부 경우, 새눈 시험(sprout test)을 수행하여, 결과를 확인하였다.
평균, 표준편차 및 90% 신뢰구간을 JMP 9.0.2를 사용하여 계산하였다. 종래의 품종 범위는, 실험에 포함된 모든 종래 품종들의 최소 평균값 및 최대 평균값(년*위치*엔트리)을 수득함으로써 생성하였다. 러셋 품종에 대한 모든 특징들을, 복수의 햇수 및 위치들로부터 수득한 데이터를 조합함으로써, JMP 9.0.2에서 분석하였다.
실시예 9. 감자종자 E12 특징화 요약
감자품종 E12는, 흑점 상처에 관여하는 효소의 발현을 감소시킴으로써 품질을 개량하고, 반응물, 즉 아스파라긴과 환원당의 농도를 저하함으로써 아크릴아미드를 감소시키고자 하는, 감자 산업에서의 요구를 해결한다. 감자품종 E12를, 감자식물 게놈에 고유하며 외래 DNA, 아그로박테리움 DNA, 바이러스 마커 또는 벡터 백본 서열을 함유하지 않는 핵산 서열로 형질전환하였다. 또한, 형질과 연관된 특징을 제외하고는 사건들이 종래의 대조군과 동일하게 생장하는 것을 보장하기 위해, 작물 연구를 수행하였다.
작물 특성
2009년, 2010년 및 2011년도에 생장시킨 감자품종 E12 사건 및 대조군의 작물 특성에 대한 평가는 표 4 내지 표 7에 나타나 있다. 결과는, 가능한 경우 통계학적 방법에 의해 분석하였다. 전반적으로, 데이터는, 러셋 버뱅크 대조군과 E12 러셋 버뱅크 사건 사이에 주요한 차이가 존재하지 않음을 제시한다.
표 4는 품종 E12에 대해 시험된 각각의 특징에 대한 사이트 햇수(number of site year)를 나타낸다. E12 및 버뱅크 대조군에 대한 작물 특성은 표 5에 나타나 있다. 7가지 작물 특성에 대해 E12와 대조군 사이에 통계학적으로 유의미한 차이는 검출되지 않았다. 덩굴식물 성숙도 등급화 데이터(rating data)는 통계학적으로 비교될 수 없었으며, E12에 대한 관찰값은 조합된 종래의 품종 범위(각각 3.65 대 3.00-3.50)를 벗어났다. 통계학적으로 유의미한 차이는 초세의 경우 E12와 대조군 사이에 검출되었으나(3.38 대 3.08); E12의 값은 종래의 품종 범위 내에 있었다. 표 5에서, 식물 당 줄기 데이터는 2011년도에서 만이며; 종래의 품종(ConV) 범위는 종래의 레인저, 버뱅크 및 대서양(Atlantic) 품종의 평균값의 범위와 동일하며; NA는 통계학적 비교가 가능하지 않았음을 의미한다.
E12 및 버뱅크 대조군의 수율 및 등급화 특징(grading characteristic)은 표 6에 나타나 있다. 총 수율, 비중, 고 당(high sugar) 또는 당 말단(sugar end)에 대해 통계학적으로 유의한 차이가 검출되지 않았다. 통계학적 분석은 총 내재 결함(total internal defect)에 대해서는 불가능하였으나, E12에 대한 값은 종래의 품종 범위 내에 있었다. 4-6 oz. 범주(25.3 대 21.5), 6-10 oz. 범주(33.1 대 30.3), 10-14 oz. 범주(12.6 대 16.2), 및 14 oz. 초과 범주(8.9 대 13.1)와 같이, E12와 대조군 간에 4가지 차이가 검출되었다. 이들 차이에 대한 E12의 모든 값들은 종래의 품종 범위 내에 있었다. 표 6에서, 비중 데이터는 2011년도에서 뿐이며; 종래의 품종(ConV) 범위는 종래의 레인저 및 버뱅크 품종의 평균값의 범위와 동일하며; NA는 통계학적 비교가 가능하지 않았음을 의미한다.
E12 및 버뱅크 대조군의 꽃 색상은 표 7에 나타나 있다. 보라색/혼합형 꽃 및 백색 꽃 둘 다 각각의 엔트리에 대한 상이한 플롯들에서 관찰되었다.
[표 4]
Figure 112015109521176-pct00005
[표 5]
Figure 112015109521176-pct00006
[표 6]
Figure 112015109521176-pct00007
[표 7]
Figure 112015109521176-pct00008
감자종자 E12에 대해 표 4 내지 표 7에서 제시된 데이터를 토대로, 비형질전환된 러셋 버뱅크 품종과 감자종자 E12 간에, 작물 특성, 꽃 색상, 수율 및 등급화 및 생태학적 상호작용에서 주요한 차이가 없는 것으로 결론지을 수 있다. 따라서, 복수-해 데이터를 토대로, 레인저 러셋 품종 E12는, 잡초화(weediness) 또는 식물 해충 잠재성의 결과로서 환경에서 지속될 상당한 위험성을 가지고 있지 않다.
흑점 상처 저항력
흑점 상처는, 감자 산업에서 가장 중요한 품질 이슈 중 하나를 나타내는, 상처가 난 덩이줄기에 영향을 미치는 변색이다. 병태는 폴리페놀옥시다제(Ppo)가 손상된 색소체로부터 세포질로 누수된 결과이다. 세포질에서, 이 효소는 폴리페놀을 산화한 다음, 어두운 침전물을 형성한다. pSIM1278 DNA 삽입체의 2개의 침묵 카세트 중 하나는, 조절 요소들 사이에 역반복체로서 위치하는, 솔라눔 베루코숨(Solanum verrucosum) 유래의 Ppo5 유전자의 단편의 복사체를 2개 함유한다. 이 역반복체의 발현은 감자 Ppo5 유전자의 침묵을 유발하며, 흑점 상처의 발생을 상당히 감소시킨다.
감자종자 E12, 및 흑점 상처에 취약한 대조군 러셋 버뱅크 품종의 필드-생장 덩이줄기를 흑점 상처 저항력에 대해 2가지 방식으로 분석하였다.
덩이줄기 변색은, 카테콜을 비롯한 페놀을 산화시킨 다음, 신속하게 중합하여 색소를 생성하는 화합물을 생성하는 폴리페놀옥시다제의 활성에 의해 야기된다. 흑점 상처 저항력을 시험하기 위한 간접적인 방법은, 1-ml 카테콜(50 mM MOPS 중 25 mM, pH6.5)을 덩이줄기의 절단면 상에 피펫팅하고, 진갈색 침전물의 Ppo-의존적인 발색을 모니터링하는 것으로 토대로 한다. 진갈색 침전물의 Ppo-의존적인 발색은 20분 후에 평가하였다. 러셋 버뱅크 대조군 및 품종 E12의 덩이줄기를, 2009년도에 미국 아이다호주 캐년 카운티에서 생장시킨 3가지 상이한 식물들로부터 수확하였다. 감자종자 E12에 대한 카테콜 분석법의 결과를 도 3에 도시한다. 도 3에서 도시된 바와 같이, 러셋 버뱅크 대조군은 진갈색으로 변하였으며, 이는 흑점 상처를 가리키는 반면, 감자종자 E12는 진갈색으로 변하지 않았고, 이는 E12가 비형질전환된 러셋 버뱅크 대조군보다 흑점 상처에 대해 보다 내성임을 가리킨다.
상처 저항력을 분석하는 제2 방법은, 2009년도에 미국 아이다호주 캐년 카운티에서 수확한 각각의 대조군 및 감자종자 E12의 9개의 덩이줄기를 상처 배럴(bruise barrel)(회전 드럼)에서 10 회전(revolution)시키고, 실온에서 3일 동안 인큐베이션한 다음, 기계적으로 박리하고, 흑점 상처 및 선파괴(lineshatter)(파괴 상처) 점의 수를 계수함으로써 수행하였다. 표 8은 그 결과를 나타낸 것이며, 3회의 실험의 결과의 평균으로서 제시되며, 도시된 오차 막대는 평균의 표준오차를 나타낸다. 유의성은 스튜던츠 투-테일드 t-테스트(Student's two-tailed t-test)(p <.05)를 이용하여 측정하였다.
[표 8]
Figure 112015109521176-pct00009
표 8에 도시된 바와 같이, 배럴 상처 시험은, 본 발명의 감자 E12에서 흑점 상처 수준이 검출 불가능한 정도였음을 가리켰다. 이들 결과는, 품종 E12의 덩이줄기가 비형질전환된 대조군 러셋 버뱅크 품종의 덩이줄기보다 흑점 상처에 대해 보다 내성이며, pSIM1278의 DNA 삽입체는 흑점 상처와 연관된 충격-유도성 변색을 감소시킴을 보여준다.
아스파라긴 및 아크릴아미드 수준
아스파라긴 신서타제 유전자를 침묵시키면, 감자품종 E12에서 자유 아스파라긴이 평균 74% 감소하였다. 아크릴아미드를 형성하는 마이야르 반응에서 환원당과 조합되는 아스파라긴의 수준이 낮아지면, 후라이에서 아크릴아미드가 평균 67% 감소한다. 러셋 버뱅크 대조군과 감자 E12에서 아스파라긴 및 아크릴아미드의 차이는 표 9에 나타나 있다. 아크릴아미드에 대해 시험하기 전에, 대조군 및 E12를 후렌치후라이로 제조하였다. 모든 결과들은, 수확 즈음에 분석된 덩이줄기로부터 유래된 것이었다.
[표 9]
Figure 112015109521176-pct00010
감자종자 E12는, 흑점 상처에 관여하는 효소의 발현이 감소되고 아크릴아미드 수준이 감소된, 개량된 품질을 가진 러셋 버뱅크 품종이다.
본 발명의 추가적인 구현예
상기에서 지칭되는 유리한 특징들을 조합하는 감자 품종을 도출하는 연구는 대체로 경험적이다. 이러한 연구는 시간, 노동 및 자본의 광범위한 투자를 필요로 한다. 감자종자의 개발은 종종, 온실에서 상업적인 이용까지 최대 8년 이상 걸릴 수 있다. 육종은, 가장 중요한 특징들을 자손에게 혼입하기 위해 우수한 부모를 신중하게 선별하는 데에서 시작된다. 원하는 모든 형질들이 통상적으로 단 1회의 교배로는 나타나지 않기 때문에, 육종은 누적되어야 한다.
현재의 육종 기술은 부모 클론의 조절된 수분(pollination)을 계속한다. 전형적으로, 화분은, 이후에 암컷 부모를 수분하는 데 사용하기 위해 젤라틴 캡슐에 수집된다. 잡종 씨앗은 온실에서 파종되고, 덩이줄기는 수천 개의 개별 묘목으로부터 수확 및 보유된다. 이듬해에, 각각의 생성되는 묘목으로부터 1개 내지 4개의 덩이줄기를 필드에 심고, 필드는 바이러스 및 질병의 확산을 방지하기 위해 극도의 주의를 기울이도록 한다. 이 첫해 묘목 작물로부터, 선별 과정에서 생존한 각각의 잡종 개체 유래의 몇몇 "씨앗" 덩이줄기를 이듬해의 식재(planting)를 위해 보유한다. 2년째가 지난 후, 상업적인 용도로서의 덩이줄기의 적합성을 결정하기 위해 밀도 측정 및 후라이 시험용으로 검체를 채취하였다. 그런 다음, 이때까지 선별 과정에서 생존한 식물을, 보다 포괄적인 일련의 후라이 시험 및 밀도 측정을 위해 3번째 해에 확장된 부피로 심었다. 4년째의 개발 단계에서, 상이한 생존 조건에 대한 이들의 적응성을 측정하기 위해, 몇몇 주에서 생존 선별을 필드 시험으로 수행하였다. 결국, 우수한 품질을 가진 품종이 다른 농장으로 전달되며, 씨앗은 상업적인 규모로 증가하였다. 일반적으로, 이때까지, 새로운 개량된 감자종자를 개발하기 위해서는 식재, 수확 및 시험까지 8년 이상이 투자되어 왔다.
특이적인 단백질 생성물을 인코딩하는 유전자의 단리 및 특징화를 가능하게 하는 분자 생물학적 기술의 출현으로, 식물 생물학 분야의 과학자들은, 식물의 형질을 특이적인 방식으로 변경시키기 위해, 외래 유전자, 또는 고유한 또는 내인성 유전자의 부가적인 또는 변형된 버전(아마도 상이한 프로모터들에 의해 유도됨)을 포함하고 발현하도록 식물의 게놈을 조작하는데 큰 관심을 나타내었다. 이러한 외래의 부가적인 및/또는 변형된 유전자는 본원에서 종합적으로 "이식유전자"로서 지칭된다. 지난 15년 내지 20년 동안, 유전자이식 식물을 생산하는 몇몇 방법들이 개발되어 왔으며, 본 발명, 특히 구현예는 또한, 청구되는 품종 또는 라인의 형질전환된 버전에 관한 것이기도 하다.
식물 형질전환은, 식물 세포에서 작용할 발현 벡터의 구축을 수반한다. 이러한 벡터는, 조절 요소(예를 들어, 프로모터)의 조절하의 또는 조절 요소에 작동적으로 연결되는 유전자를 포함하는 DNA를 포함한다. 발현 벡터는 이러한 작동적으로 연결되는 유전자/조절 요소 조합을 하나 이상 함유할 수 있다. 벡터(들)는 플라스미드 형태로 있을 수 있으며, 이식유전자를 감자식물(들)의 유전적 물질 내로 혼입하기 위해 후술되는 바와 같이 형질전환 방법을 이용하여 형질전환된 감자식물을 생산하기 위해, 단독으로 또는 다른 플라스미드와 조합되어 사용될 수 있다.
전통적인 식물 육종은 전형적으로, 새롭고 개량된 특징을 가진 품종을 제조하기 위해, 식물 염색체의 무작위 재조합에 의존한다. 표준의 잘 공지된 기술에 따르면, 유전자 및 조절 요소를 포함하는 유전적 "발현 카세트"는 아그로박테리움-단리된 전달 DNA("T-DNA")의 경계 내에 삽입되고, 식물 게놈 내로 통합된다. T-DNA 물질의 아그로박테리움-매개 전달은 전형적으로 하기의 표준 절차를 포함한다: (1) 적어도 하나는 외래 기원의 것인 유전적 요소의 시험관 내 재조합에 의해, 형질전환 선별용 발현 카세트를 제조하는 단계, (2) 이 발현 카세트를, 종종 외래 DNA를 함유하는 적어도 하나의 다른 발현 카세트와 함께, 통상 T-DNA 경계 서열의 측면에 존재하는 아그로박테리움 DNA의 염기쌍 수백 개로 구성되는 2성분 벡터의 T-DNA 영역 내로 삽입하는 단계, (3) 종종 아그로박테리움 유래의 부가적인 2성분 벡터 서열의 일부 또는 모두와 수반되는, T-DNA 경계들 사이에 위치하는 서열을 식물 세포로 전달하는 단계, 및 (4) 수율 증가, 개량된 활력, 질병 및 곤충에 대한 내성 증강, 또는 스트레스 하에서의 생존능 증가와 같은 원하는 형질을 나타내는, 안정하게 형질전환된 식물 세포를 선별하는 단계.
따라서, 유전자 조작 방법은, 프로모터 및 종결자와 같은 조절 요소, 및 새로운 형질의 발현에 관여하거나 또는 형질전환체의 확인 및 선별을 위한 마커로서 작용하는 유전자를 포함하는, 바이러스, 박테리아 및 식물로부터의 외래의 비-토종 핵산의 도입에 의존한다. 마커 유전자는 전형적으로, 박테리아 소스로부터 유래되며, 항생제내성 또는 제초제저항성을 부여한다. 전형적인 육종 방법은 힘들며 시간 소모적이고, 새로운 품종은 전형적으로 단지 상대적으로 중간 정도의 개량을 나타낼 뿐이다.
"안티센스" 기술에서, 유전자이식 식물에서 유전자의 발현을 침묵시키기 위해 고유한 유전자의 서열은 도치(invert)된다. 그러나, 도치된 DNA는 통상, 식물 발달을 방해하고/하거나 이들의 영양가를 감소시키기 때문에 바람직하지 않을 수 있는 외래 아미노산 서열을 인코딩하는, 프로모터와 종결자 사이에 삽입되는, 새로운 비특징화된 개방 해독틀을 함유한다.
감자 형질전환용 발현 벡터: 마커 유전자
발현 벡터는, 마커를 함유하는 형질전환된 세포가 음성 선별, 즉, 선별성 마커 유전자를 함유하지 않는 세포의 성장을 저해함으로써 회수되거나, 양성 선별, 즉, 유전적 마커에 의해 인코딩되는 생성물을 스크리닝함으로써 회수될 있도록 하는 조절 요소(프로모터, 예를 들어)에 작동적으로 연결된 적어도 하나의 유전적 마커를 포함한다. 식물 형질전환에 보편적으로 사용되는 다수의 선별성 마커 유전자는 형질전환 분야에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어, 항생제 또는 제초제일 수 있는 선별성 화학제를 대사적으로 해독시키는 효소를 코딩하는 유전자, 또는 저해제에 둔감한 변경된 표적을 인코딩하는 유전자를 포함한다. 소수의 양성 선별 방법 또한, 당해 기술분야에 공지되어 있다.
식물 형질전환에 보편적으로 사용되는 하나의 선별성 마커 유전자는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II(nptII) 유전자로서, 식물 조절 신호의 조절하에서 카나마이신에 대한 내성을 부여한다. Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:4803 (1983). 보편적으로 사용되는 또 다른 선별성 마커 유전자는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자로서, 항생제 하이그로마이신에 대한 내성을 부여한다. Vanden Elzen et al., Plant Mol. Biol., 5:299 (1985).
항생제에 대한 내성을 부여하는, 박테리아 기원의 부가적인 선별성 마커 유전자로는, 겐타마이신 아세틸 트랜스퍼라제, 스트렙토마이신 포스포트랜스퍼라제 및 아미노글리코사이드-3'-아데닐 트랜스퍼라제, 블레오마이신 내성 결정인자를 포함한다. Hayford et al., Plant Physiol. 86:1216 (1988), Jones et al., Mol. Gen. Genet., 210:86 (1987), Svab et al., Plant Mol. Biol. 14:197 (1990) Hille et al., Plant Mol. Biol. 7:171 (1986). 다른 선별성 마커 유전자는 글리포세이트, 글루포시네이트 또는 브로목시닐(bromoxynil)과 같은 제초제에 대한 내성을 부여한다. Comai et al., Nature 317:741-744 (1985), Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2:603-618 (1990) and Stalker et al., Science 242:419-423 (1988).
박테리아 기원은 아니지만 식물 형질전환용의 선별성 마커 유전자로는, 예를 들어, 마우스 다이하이드로폴레이트 리덕타제, 식물 5-에놀피루빌쉬키메이트(enolpyruvylshikimate)-3-포스페이트 신타제 및 식물 아세토락테이트 신타제를 포함한다. Eichholtz et al., Somatic Cell Mol. Genet. 13:67 (1987), Shah et al., Science 233:478 (1986), Charest et al., Plant Cell Rep. 8:643 (1990).
식물 형질전환용의 또 다른 부류의 마커 유전자는, 형질전환된 세포를 항생제와 같은 독성 성분에 대한 내성에 대해 직접적으로 유전적 선별을 하기보다는, 추정상 형질전환된 식물 세포를 스크리닝하는 것을 필요로 한다. 이들 유전자는 특히, 특이적인 조직에서 유전자 발현의 공간적인 패턴을 정량화하거나 시각화하는 데 유용하며, 유전자 발현의 조사를 위해 유전자 또는 유전자 조절 서열에 융합될 수 있기 때문에 종종 리포터 유전자로서 지칭된다. 추정적으로 형질전환된 세포의 스크리닝에 보편적으로 사용되는 유전자는 β-글루쿠로니다제(GUS), β-갈락토시다제, 루시퍼라제 및 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제를 포함한다. Jefferson, R.A., Plant Mol. Biol. Rep. 5:387 (1987), Teeri et al., EMBO J. 8:343 (1989), Koncz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:131 (1987), DeBlock et al., EMBO J. 3:1681 (1984).
식물조직의 파괴를 필요로 하지 않는 GUS 활성을 생체 내에서 시각화하는 방법이 이용가능하다. Molecular Probes publication 2908, IMAGENE GREEN, p. 1-4 (1993) 및 Naleway et al., J. Cell Biol. 115:151a (1991). 그러나, 이들 GUS 활성의 생체 내 시각화 방법은, 낮은 민감도, 높은 형광 백그라운드 및 루시퍼라제 유전자를 선별성 마커로서 사용하는 것과 연관된 제한점들로 인해, 형질전환된 세포의 회수에 유용한 것으로 입증되지 않았다.
보다 최근, 녹색 형광 단백질(GFP)을 인코딩하는 유전자는 원핵 세포 및 진핵 세포에서 유전자 발현용 마커로서 이용되어 왔다. Chalfie et al., Science 263:802 (1994). GFP, 및 GFP의 돌연변이체는 스크리닝가능한 마커(screenable marker)로서 사용될 수 있다.
감자 형질전환용 발현 벡터: 프로모터
발현 벡터에 포함된 유전자는 프로모터와 같은 조절 요소를 포함하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 구동되어야 한다. 몇몇 유형의 프로모터들은, 단독으로 또는 프로모터와 조합되어 사용될 수 있는 다른 조절 요소들과 마찬가지로, 형질전환 분야에 잘 알려져 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "프로모터"는, 전사의 시작부로부터 업스트림에 있으면서, 전사를 개시하기 위해 RNA 폴리머라제 및 다른 단백질의 인지 및 결합에 관여하는 DNA 영역에 대한 참조를 포함한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. 발달 조절하에서 프로모터의 예로는, 잎, 뿌리, 씨앗, 섬유, 물관(xylem vessel), 헛물관(tracheid) 또는 후막조직(sclerenchyma)과 같은 소정의 조직에서 전사를 우선적으로 개시하는 프로모터를 포함한다. 이러한 프로모터는 "조직-우선적인" 것으로 지칭된다. 소정의 조직에서만 전사를 개시하는 프로모터는 "조직-특이적인" 것으로 지칭된다. "세포-유형" 특이적인 프로모터는 주로, 하나 이상의 기관에 존재하는 소정의 유형의 세포, 예를 들어, 뿌리 또는 잎의 관다발 세포에서 발현을 유도한다. "유도성" 프로모터는 환경적인 조절하에 존재하는 프로모터이다. 유도성 프로모터에 의한 전사에 영향을 미칠 수 있는 환경적인 조건의 예로는, 혐기성 조건 또는 광(light)의 존재를 포함한다. 조직-특이적인 프로모터, 조직-우선적인 프로모터, 세포 유형 특이적인 프로모터 및 유도성 프로모터는 "비-구성적" 프로모터의 부류를 구성한다. "구성적" 프로모터는 대부분의 환경적 조건하에 활성인 프로모터이다.
A. 유도성 프로모터
유도성 프로모터는 감자에서 발현될 유전자에 작동적으로 연결된다. 선택적으로, 유도성 프로모터는, 감자에서 발현될 유전자에 작동적으로 연결되는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된다. 유도성 프로모터를 이용하여, 전사율은 유도제에 반응하여 증가한다.
임의의 유도성 프로모터가 본 발명에 사용될 수 있다. Ward et al., Plant Mol. Biol. 22:361-366 (1993)을 참조한다. 예시적인 유도성 프로모터로는, 구리에 반응하는 ACEI 시스템(Mett et al., PNAS 90:4567-4571 (1993)); 벤젠설폰아미드 제초제 약해 경감제에 반응하는, 옥수수 유래의 In2 유전자(Hershey et al., Mol. Gen Genetics 227:229-237 (1991) 및 Gatz et al., Mol. Gen. Genetics 243:32-38 (1994)) 또는 Tn10 유래의 Tet 억제제(Gatz et al., Mol. Gen. Genetics 227:229-237 (1991))를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 특히 바람직한 유도성 프로모터는, 식물이 정상적으로 반응하지 않는 유도제에 반응하는 프로모터이다. 예시적인 유도성 프로모터는 스테로이드 호르몬 유전자 유래의 유도성 프로모터로서, 이의 전사 활성은 글루코코티코스테로이드 호르몬에 의해 유도된다. Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:0421 (1991).
B. 구성적 프로모터
구성적 프로모터는 감자에서 발현될 유전자에 작동적으로 연결되거나, 구성적 프로모터는 감자에서 발현될 유전자에 작동적으로 연결되는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된다.
다수의 상이한 구성적 프로모터들이 본 발명에 이용될 수 있다. 예시적인 구성적 프로모터로는, 식물 바이러스 유래의 프로모터, 예컨대 CaMV 유래의 35S 프로모터(Odell et al., Nature 313:810-812 (1985)) 및 쌀 액틴(McElroy et al., Plant Cell 2: 163-171 (1990)); 유비퀴틴(Christensen et al., Plant Mol. Biol. 12:619-632 (1989) 및 Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18:675-689 (1992)); pEMU(Last et al., Theor. Appl. Genet. 81:581-588 (1991)); MAS(Velten et al., EMBO J. 3:2723-2730 (1984)) 및 옥수수 H3 히스톤(Lepetit et al., Mol. Gen. Genetics 231:276-285 (1992) 및 Atanassova et al., Plant Journal 2 (3): 291-300 (1992))과 같은 유전자 유래의 프로모터를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
브라씨카 나푸스(Brassica napus) ALS3 구조 유전자(또는 상기 Xba1/Ncol 단편과의 뉴클레오타이드 서열 유사성)에 대해 5' Xba1/Ncol 단편인 ALS 프로모터는 특히 유용한 구성적 프로모터를 나타낸다. PCT 출원 WO 96/30530을 참조한다.
C. 조직-특이적 또는 조직- 선호적 프로모터
조직-특이적 프로모터는 감자에서 발현용 유전자에 작동적으로 연결된다. 선택적으로, 조직-특이적인 프로모터는, 감자에서 발현용 유전자에 작동적으로 연결되는 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된다. 조직-특이적인 프로모터에 작동적으로 연결된 관심 유전자로 형질전환된 식물은 이식유전자의 단백질 생성물을 특이적인 조직에서 배제적으로 또는 우선적으로 생성한다.
임의의 조직-특이적인 프로모터 또는 조직-우선적인 프로모터가 본 발명에 이용될 수 있다. 예시적인 조직-특이적인 프로모터 또는 조직-우선적인 프로모터로는, 파세올린(phaseolin) 유전자 유래의 것과 같은 뿌리-선호적인 프로모터(Murai et al., Science 23:476-482 (1983) 및 Sengupta-Gopalan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3320-3324 (1985)); cab 또는 루비스코(rubisco) 유래의 것과 같은 잎-특이적인 프로모터 및 광-유도성 프로모터(Simpson et al., EMBO J. 4(11):2723-2729 (1985) 및 Timko et al., Nature 318:579-582 (1985)); LAT52 유래의 것과 같은 꽃밥-특이적인 프로모터(Twell et al., Mol. Gen. Genetics 217:240-245 (1989)); Zm13 유래의 것과 같은 화분-특이적인 프로모터(Guerrero et al., Mol. Gen. Genetics 244:161-168 (1993)) 또는 apg 유래의 것과 같은 소포자-선호적인 프로모터 (Twell et al., Sex. Plant Reprod. 6:217-224 (1993))를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
단백질을 하위세포(subcellular) 구획으로 표적화하기 위한 신호 서열
이식유전자에 의해 생성되는 단백질을 엽록체, 액포, 퍼옥시좀, 글리옥시좀, 세포벽 또는 미토콘드리아와 같은 하위세포 구획으로 수송하거나, 아포플라스트(apoplast) 내로 분비하는 것은, 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을, 관심 단백질을 인코딩하는 유전자의 5' 및/또는 3' 영역에 작동적으로 연결함으로써 달성된다. 구조 유전자의 5' 및/또는 3' 말단에 있는 서열을 표적화하는 것은, 단백질 합성 및 가공 동안에, 인코딩된 단백질이 궁극적으로 구획화되는 곳을 결정할 수 있다.
신호 서열의 존재는, 폴리펩타이드를 세포내 소기관 또는 하위세포 구획으로 인도하거나 아포플라스트로 분비되게 한다. 다수의 신호 서열들이 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Becker et al., Plant Mol. Biol. 20:49 (1992); Close, P.S., Master's Thesis, Iowa State University (1993); Knox, C., et al., Plant Mol. Biol. 9:3-17 (1987); Lerner et al., Plant Physiol. 91:124-129 (1989); Frontes et al., Plant Cell 3:483-496 (1991); Matsuoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88:834 (1991); Gould et al., J. Cell. Biol. 108:1657 (1989); Creissen et al., Plant J. 2:129 (1991); Kalderon, et al., Cell 39:499-509 (1984); Steifel, et al., Plant Cell 2:785-793 (1990)을 참조한다.
외래 단백질 유전자 및 작물 유전자
본 발명에 따른 유전자이식 식물을 이용하여, 외래 단백질은 상업적인 양으로 생성될 수 있다. 따라서, 당해 기술분야에서 양호하게 이해되는 형질전환된 식물의 선별 및 번식 기술은, 통상적인 방식으로 수확되는 복수의 유전자이식 식물을 제공하며, 그런 다음, 외래 단백질은 관심 조직 또는 총 바이오매스로부터 추출될 수 있다. 식물 바이오매스로부터의 단백질 추출은, 예를 들어, Heney and Orr, Anal. Biochem.114:92-6 (1981)에서 논의된 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다.
바람직한 구현예에 따르면, 외래 단백질의 상업적인 생성을 위해 제공되는 유전자이식 식물은 감자식물이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 관심 바이오매스는 씨앗 또는 덩이줄기이다. 보다 높은 발현 수준을 나타내는 상대적으로 소수의 유전자이식 식물의 경우, 유전자 지도는, 통합된 DNA 분자의 거의 정확한 염색체 위치를 확인하는 종래의 RFLP, PCR 및 SSR 분석을 통해 주로 제작될 수 있다. 이러한 면에서, 예시적인 방법에 대해서는, Glick and Thompson, Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology CRC Press, Boca Raton 269:284 (1993)를 참조한다. 염색체 위치에 관한 지도 정보는 대상(subject) 유전자이식 식물의 소유권 보호(proprietary protection)에 유용하다. 승인되지 않은 번식이 수행되고 다른 생식질(germplasm)과 교배 제조되는 경우, 통합 영역의 지도는 의심(suspect) 식물에 대한 유사한 지도와 비교되어, 의심 식물이 대상 식물과 공통적인 혈통(parentage)을 가지는지 결정할 수 있다. 지도 비교는 혼성화, RFLP, PCR, SSR 및 서열화를 수반할 것이며, 이들 모두는 종래 기술이다.
마찬가지로, 본 발명에 의해, 작물 유전자는 형질전환된 식물에서 발현될 수 있다. 보다 특히, 식물은 대상 작물의 다양한 표현형들을 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 이러한 면에서 연루되는 예시적인 유전자로는, 하기에서 범주화되는 것들을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다:
1. 해충 또는 질병에 대한 내성을 부여하며 인코딩하는 유전자:
A. 식물 내병성 유전자. 식물 방어는 종종, 식물 내의 내병성 유전자(R)의 생성물과 병원체 내의 상응하는 비병원성(avirulence; Avr) 유전자의 생성물 간의 특이적인 상호작용에 의해 활성화된다. 식물품종은, 특이적인 병원체 균주에 내성인 식물을 조작하기 위해, 클로닝된 내성 유전자(들)로 형질전환될 수 있다. 예를 들어 Jones et al., Science 266:789 (1994)(클라드로스포리움 풀붐(Cladosporium fulvum)에 내성인 토마토 Cf-9 유전자의 클로닝); Martin et al., Science 262:1432 (1993)(슈도모나스 사이린개 pv.(Pseudomonas syringae pv.) 토마토에 내성인 토마토 Pto 유전자는 단백질 키나제를 인코딩함); Mindrinos et al. Cell 78:1089 (1994)(슈도모나스 사이린개에 대한 내성을 위한 아라비돕시스(Arabidopsis) RSP2 유전자)를 참조한다.
B. 대두 포낭 선충병(cyst nematode)과 같은 해충에 대한 내성을 부여하는 유전자. 예를 들어, PCT 출원 WO96/30517; PCT 출원 WO93/19181을 참조한다.
C. 바실러스 투린지엔시스 단백질, 이의 유도체 또는 이를 토대로 모델링된 합성 폴리펩타이드. 예를 들어, Btδ-내독소 유전자의 뉴클레오타이드 서열 및 클로닝을 개시하는 Geiser et al., Gene 48:109 (1986)을 참조한다. 더욱이, δ-내독소 유전자를 인코딩하는 DNA 분자는 예를 들어, ATCC 등록 번호 40098, 67136, 31995 및 31998 하에 미국 버지니아주 머내서스의 American Type Culture Collection로부터 구매할 수 있다.
D. 렉틴. 예를 들어, 몇몇 클리바 미니아타(Clivia miniata) 만노스-결합 렉틴 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 개시하는 Van Damme et al., Plant Molec. Biol. 24:25 (1994)을 참조한다.
E. 아비딘과 같은 비타민-결합 단백질. 아비딘 및 아비딘 호모로그를 해충에 대한 유충제로서 사용하는 것을 교시하는 PCT 출원 US 93/06487을 참조한다.
F. 효소 저해제, 예를 들어, 프로테아제 또는 프로티나제(proteinase) 저해제 또는 아밀라제 저해제. 예를 들어, Abe et al., J. Biol. Chem. 262:16793 (1987)(쌀 시스테인 프로티나제 저해제의 뉴클레오타이드 서열), Huub et al., Plant Molec. Biol. 21:985 (1993)(담배 프로티나제 저해제 I을 인코딩하는 cDNA의 뉴클레오타이드 서열), Sumitani et al., Biosci.Biotech.Biochem.57:1243 (1993)(스트렙토마이세스 니트로스포레우스(Streptomyces nitrosporeus) α-아밀라제 저해제의 뉴클레오타이드 서열) 및 미국 특허 5,494,813(Hepher 및 Atkinson, 1996년 2월 27일에 발행됨)을 참조한다.
G. 곤충-특이적인 호르몬 또는 페로몬, 예컨대 엑디스테로이드 또는 유충 호르몬, 이의 변이체, 이를 기재로 하는 모방체(mimetic), 또는 이의 길항제 또는 작용제. 예를 들어, 유충 호르몬의 불활성화제인, 클로닝된 유충 호르몬 에스터라제의 바큘로바이러스 발현에 대한 개시내용인 Hammock et al., Nature 344:458 (1990)을 참조한다.
H. 발현 시, 병에 걸린 해충의 생리작용을 방해하는 곤충-특이적인 펩타이드 또는 신경펩타이드. 예를 들어, Regan, J. Biol. Chem. 269:9 (1994)(발현 클로닝은 곤충 이뇨 호르몬 수용체에 대한 DNA 코딩을 제공함), 및 Pratt et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 163:1243 (1989)(알로스타틴(allostatin)은 디플롭테라 푼타타(Diploptera puntata)에서 확인됨)의 개시내용을 참조한다. 또한, 곤충-특이적인 기생충 신경독소를 인코딩하는 유전자를 개시하는 Tomalski 등의 미국 특허 5,266,317을 참조한다.
I. 뱀, 말벌 등에 의해 자연상에서 생성되는 곤충-특이적인 독. 예를 들어, 전갈 곤충독성 펩타이드를 코딩하는 유전자의 식물에서의 이종성 발현에 대한 개시내용은 Pang et al., Gene 116:165 (1992)을 참조한다.
J. 모노테르펜, 세스퀴테르펜, 스테로이드, 하이드록삼산(hydroxamic acid), 페닐프로파노이드 유도체, 또는 살충 활성을 가진 또 다른 비-단백질 분자의 과잉축적에 관여하는 효소.
K. 생물학적 활성 분자의 번역후 변형을 비롯한 변형에 관여하는 효소; 예를 들어, 천연 또는 합성이든지 간에, 당분해 효소, 단백질분해 효소, 지질분해 효소, 뉴클레아제, 사이클라제, 트랜스아미나제, 에스터라제, 하이드롤라제, 포스파타제, 키나제, 포스포릴라제, 폴리머라제, 엘라스타제, 키티나제 및 글루카나제. 칼라제(callase) 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 개시하는 PCT 출원 WO 93/02197(Scott 등)을 참조한다. 키티나제-인코딩 서열을 함유하는 DNA 분자는 예를 들어, 등록 번호 39637 및 67152 하에 ATCC로부터 수득될 수 있다. 또한, 담배 박각시나방 키티나제를 인코딩하는 cDNA의 뉴클레오타이드 서열을 교시하는 Kramer et al., Insect Biochem. Molec. Biol. 23:691 (1993), 및 파슬리 ubi4-2 폴리유비퀴틴 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 제공하는 Kawalleck et al., Plant Molec.Biol. 21:673 (1993)을 참조한다.
L. 신호 형질도입을 자극하는 분자. 예를 들어, 녹두 칼모듈린 cDNA 클론에 대한 뉴클레오타이드 서열에 대한 Botella et al., Plant Molec. Biol. 24:757 (1994)의 개시내용, 및 옥수수 칼모듈린 cDNA 클론의 뉴클레오타이드 서열을 제공하는 Griess et al., Plant Physiol. 104:1467 (1994)의 개시내용을 참조한다.
M. 소수성 모멘트 펩타이드. 진균 식물 병원체를 저해하는 타카이플레신(Tachyplesin)의 펩타이드 유도체를 개시하는 PCT 출원 WO95/16776, 및 내병성을 부여하는 합성 항균 펩타이드를 교시하는 PCT 출원 WO95/18855를 참조한다.
N. 막 투과효소, 채널 형성제 또는 채널 차단제. 예를 들어, 슈도모나스 솔라나세아룸(Pseudomonas solanacearum)에 내성인 유전자이식 담배 식물이 되게 하는, 세크로핀-β 분해성 펩타이드 유사체의 이종성 발현에 대한 Jaynes et al., Plant Sci 89:43 (1993)의 개시내용을 참조한다.
O. 바이러스-침습성 단백질 또는 이로부터 유래되는 복합체 독소. 예를 들어, 형질전환된 식물 세포에서 바이러스 코트 단백질의 축적은, 코트 단백질 유전자가 유래되는 바이러스뿐만 아니라 관련 바이러스에 의해 영향을 받는 바이러스 감염 및/또는 질병 발병에 대한 내성을 제공한다. Beachy et al., Ann. Rev. Phytopathol. 28:451 (1990)을 참조한다. 코트 단백질-매개의 내성은, 알팔파 모자이크 바이러스, 오이 모자이크 바이러스 및 담배 모자이크 바이러스에 대한 형질전환된 식물에서 부여되었다.
P. 곤충-특이적인 항체 또는 이로부터 유래되는 면역독소. 따라서, 곤충의 장(insect gut)에서 중요한 대사 작용을 표적으로 하는 항체는 영향을 받는 효소를 불활성화시켜, 곤충을 살해할 것이다. Taylor et al., Abstract #497, Seventh Int'l Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions (Edinburgh, Scotland) (1994)(단일-사슬 항체 단편의 생성을 통한, 유전자이식 식물 담배에서 효소적 불활성화)을 참조한다.
Q. 바이러스-특이적인 항체. 예를 들어, 재조합 항체 유전자를 발현하는 유전자이식 식물이 바이러스 공격으로부터 보호된다는 것을 보여주는, Tavladoraki et al., Nature 366:469 (1993)를 참조한다.
R. 병원체 또는 기생충에 의해 자연상에서 생성되는 발달-억제성 단백질. 따라서, 균류의 엔도-α-1,4-D-폴리갈라투로나제는, 식물 세포벽 호모-α-1,4-D-갈락투로나제를 용해함으로써 식물 영양분 방출 및 균류의 콜로니화를 용이하게 한다. Lamb et al., Bio/Technology 10:1436 (1992)을 참조한다 콩 엔도폴리갈락투로나제-저해 단백질을 인코딩하는 유전자의 클로닝 및 특징화는 Toubart et al., Plant J. 2:367 (1992)에 의해 기술되어 있다.
S. 자연상에서 식물에 의해 생성되는 발달-억제성 단백질. 예를 들어, Logemann et al., Bio/Techonology 10:305 (1992)는, 보리 리보좀-불활성화 유전자를 발현하는 유전자이식 식물은 진균 질병에 대한 증가된 내성을 가짐을 보여주었다.
T. 전신성 획득 저항성(Systemic Acquired Resistance; SAR) 반응에 관여하는 유전자 및/또는 발병-관련 유전자. Briggs, S. Current Biology, 5(2) (1995).
U. 항진균 유전자. Cornelissen and Melchers, Plant Physiol., 101:709-712 (1993); Parijs et al., Planta 183:258-264 (1991) 및 Bushnell et al., Can. J. of Plant Path. 20(2):137-149 (1998)를 참조한다.
V. 역병(Phytophthora blight)에 대한 내성을 부여하는 유전자, 예컨대 R1, R2, R3, R4 및 다른 내성 유전자.Naess, S.K., et. al., (2000) Resistance to late blight in Solanum bulbocastanum is mapped to chromosome 8. Theor. Appl. Genet. 101: 697-704 및 Li, X., et. al., (1998) Autotetraploids and genetic mapping using common AFLP markers: the R2 allele conferring resistance to Phytophthora infestans mapped on potato chromosome 4. Theor. Appl. Genet. 96: 1121-1128을 참조한다.
2. 제초제에 대한 내성을 부여하는 유전자, 예를 들어:
A. 이미다졸리논(imidazolinone) 또는 설포닐우레아와 같이 생장점 또는 분열조직을 저해하는 제초제. 이 범주의 예시적인 유전자는 예를 들어, 각각 Lee et al., EMBO J. 7:1241 (1988), 및 Miki et al., Theor. Appl. Genet. 80:449 (1990)에 기술된 바와 같이 돌연변이체 ALS 및 AHAS 효소를 코딩한다.
B. 글리포세이트(glyphosate)(돌연변이체 5-에놀피루블쉬키메이트-3-포스페이트 신타제(EPSP) 및 aroA 유전자 각각에 의해 손상된 내성) 및 다른 포스포노 화합물, 예컨대 글루포시네이트(glufosinate)(포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제(PAT) 및 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus) PAT 바르(bar) 유전자), 및 피리디녹시 또는 페녹시 프로피온산 및 사이클로헥손(ACCase 저해제-인코딩 유전자). 예를 들어, 글리포세이트 내성을 부여할 수 있는 EPSP 형태의 뉴클레오타이드 서열을 개시하는 Shah 등의 미국 특허 4,940,835를 참조한다. 돌연변이체 aroA 유전자를 인코딩하는 DNA 분자는 ATCC 등록 번호 39256 하에 수득될 수 있으며, 돌연변이체 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 Comai의 미국 특허 4,769,061에 개시되어 있다. Kumada 등의 유럽 특허 출원 0 333 033 및 Goodman 등의 미국 특허 4,975,374는 L-포스피노트리신과 같은 제초제에 대한 내성을 부여하는 글루타민 신서타제 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 개시한다. PAT 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 Leemans 등의 유럽 특허 출원 0 242 246에 제공된다. DeGreef et al., Bio/Techonology 7:61 (1989)은 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 활성을 코딩하는 키메라 바르 유전자를 발현하는 유전자이식 식물의 제조를 기술하고 있다. 세톡시딤(sethoxydim) 및 할록시폽(haloxyfop)과 같이 페녹시 프로피온산 및 사이클로헥손에 대한 내성을 부여하는 유전자의 예는, Marshall et al., Theor. Appl. Genet. 83:435 (1992)에 의해 기술된 Acc1-S1, Acc1-S2 및 Acc2-S3 유전자이다.
C. 트리아진(psbA 및 gs+ 유전자) 또는 벤조니트릴(니트릴라제 유전자)과 같이 광합성을 저해하는 제초제. Przibila et al., Plant Cell 3:169 (1991)는, 클라마이도모나스(Chlamydomonas)를 돌연변이체 psbA 유전자를 인코딩하는 플라스미드로 형질전환하는 것을 기술한다. 니트릴라제 유전자에 대한 뉴클레오타이드 서열은 Stalker의 미국 특허 4,810,648에 개시되어 있으며, 이들 유전자를 함유하는 DNA 분자는 ATCC 등록 번호 53435, 67441 및 67442 하에 입수가능하다. 글루타티온 S-트랜스퍼라제를 코딩하는 DNA의 클로닝 및 발현은 Hayes et al., Biochem. J. 285:173 (1992)에 의해 기술되어 있다.
D. 다양한 유형의 제초제들에 내성인 이 효소를 발현하는 식물을 제조하기 위해 확인되었으며, 식물의 품종 내로 도입된, 아세토하이드록시산 신타제.Hattori et al., Mol. Gen. Genet. 246:419, 1995를 참조한다. 제초제에 대한 저항력을 부여하는 다른 유전자로는, 래트(rat) 시토크롬 P4507A1 및 효모 NADPH-시토크롬 P450 옥시도리덕타제의 키메라 단백질을 인코딩하는 유전자(Shiota et al., Plant Physiol., 106:17, 1994), 글루타티온 리덕타제 및 슈퍼옥사이드 디스뮤타제에 대한 유전자(Aono et al., Plant Cell Physiol. 36:1687, 1995) 및 다양한 포스포트랜스퍼라제들에 대한 유전자(Datta et al., Plant Mol. Biol. 20:619, 1992)를 포함한다.
E. 프로토포르피리노겐 옥시다제(프로톡스(protox))는 모든 식물 생존에 필수적인 엽록소의 생성에 필수적이다. 프로톡스 효소는 제초제 화합물의 품종에 대한 표적으로서 작용한다. 이들 제초제는 또한, 존재하는 모든 상이한 종의 식물들의 생장을 저해하여, 이들의 총 파괴를 유발한다. 이들 제초제에 내성인, 변경된 프로톡스 활성을 가진 식물의 개발은 미국 특허 6,288,306; 6,282,837; 5,767,373; 및 국제 공개 WO 01/12825에 기술되어 있다.
3. 부가 가치 형질을 부여하거나 이에 기여하는 유전자, 예컨대:
A. 예를 들어, 식물을 스테아릴-ACP 데사투라제(desaturase)의 안티센스 유전자로 형질전환시킴으로써, 식물의 스테아르산 함량을 증가시키는, 지방산 대사 변형.Knultzon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2625 (1992)를 참조한다.
B. 감소된 파이테이트 함량 - 1) 파이타제-인코딩 유전자의 도입은 보다 많은 유리 포스페이트를 형질전환된 식물에 첨가하여, 파이테이트의 절단을 증강시킬 것이다. 예를 들어, 아스퍼길러스 니거(Aspergillus niger) 파이타제 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 대한 개시내용은 Van Hartingsveldt et al., Gene 127:87 (1993)을 참조한다. 2) 파이테이트 함량을 감소시킨 유전자가 도입될 수 있었다. 예를 들어, 옥수수에서, 이는 낮은 수준의 피틴산을 특징으로 하는 옥수수 돌연변이체에 관여하는 단일 대립 유전자와 연관된 DNA를 클로닝한 다음 이를 재도입함으로써 달성될 수 있었다. Raboy et al., Maydica 35:383 (1990)을 참조한다.
C. 예를 들어, 식물을, 전분의 분지화 패턴을 변경시키는 효소를 코딩하는 유전자로 형질전환함으로써 영향을 받는, 변형된 탄수화물 조성물. Shiroza et al., J. Bacteriol . 170:810 (1988)(스트렙토코커스 (Streptococcus) 돌연변이체 프룩토실트랜스퍼라제 유전자의 뉴클레오타이드 서열), Steinmetz et al., Mol . Gen. Genet. 20:220 (1985)(바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 레반수크라제 유전자의 뉴클레오타이드 서열), Pen et al., Bio/Technology 10:292 (1992)(바실러스 리케니폰니스(Bacillus lichenifonnis) α-아밀라제를 발현하는 유전자이식 식물의 생산), Elliot et al., Plant Molec. Biol. 21:515 (1993)(토마토 인버타제 유전자의 뉴클레오타이드 서열), Sㆈgaard et al., J. Biol. Chem. 268:22480 (1993)(보리 α-아밀라제 유전자의 부위-특이적인 돌연변이생성) 및 Fisher et al., Plant Physiol. 102:1045 (1993)(옥수수 배젖(endosperm) 전분 분지화 효소 II)를 참조한다.
D. FAD-2 유전자 변형을 통한 올레산 상승 및/또는 FAD-3 유전자 변형을 통한 리놀레산 저하. 미국 특허 6,063,947; 6,323,392; 및 국제 공개 WO 93/11245를 참조한다.
4. 웅성 불임을 조절하는 유전자
A. 융단층(tapetum)-특이적인 프로모터의 조절하에서 화학적 N-Ac-PPT의 적용을 수반하는 데아세틸라제 유전자의 도입. 국제 공개 WO 01/29237을 참조한다.
B. 다양한 수술(stamen)-특이적인 프로모터들의 도입. 국제 공개 WO 92/13956 및 WO 92/13957을 참조한다.
C. 바르나제(barnase) 유전자 및 바르스타(barstar) 유전자의 도입. Paul et al., Plant Mol. Biol. 19:611-622, 1992)를 참조한다.
감자 형질전환 방법
생물학적 및 물리적 식물 형질전환 프로토콜을 비롯하여 수많은 식물 형질전환 방법이 개발되어 왔다. 예를 들어, Miki et al., "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants" in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B.R. and Thompson, J.E. Eds. (CRC Press, Inc. Boca Raton, 1993) 페이지 67-88을 참조한다. 또한, 식물 세포 또는 조직의 형질전환 및 식물의 재생을 위한 발현 벡터 및 시험관 내 배양 방법이 이용가능하다. 예를 들어, Gruber et al., "Vectors for Plant Transformation" in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B.R. and Thompson, J.E. Eds. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993) 페이지 89-119를 참조한다.
A. 아그로박테리움-매개의 형질전환 - 발현 벡터를 식물 내로 도입하는 한가지 방법은 아그로박테리움의 자연적인 형질전환 시스템을 토대로 한다. 예를 들어, Horsch et al., Science 227:1229 (1985)를 참조한다. A. 투메파시엔스 및 A. 리조게네스는 식물 세포를 유전적으로 형질전환하는 식물 병원성 토양 박테리아이다. A. 투메파시엔스 및 A. 리조게네스의 Ti 플라스미드 및 Ri 플라스미드는 각각 식물의 유전적인 형질전환에 관여하는 유전자를 운반한다. 예를 들어, Kado, C.I., Crit . Rev. Plant Sci . 10:1 (1991)을 참조한다. 아그로박테리움 벡터 시스템 및 아그로박테리움-매개의 유전자 전달 방법에 관한 설명은 상기 Gruber 등, 상기 Miki 등 및 Moloney et al., Plant Cell Reports 8:238 (1989)에 의해 제공된다. 또한, 1996년 10월 8일에 발행된 미국 특허 5,563,055(Townsend 및 Thomas)를 참조한다.
B. 직접적인 유전자 전달 - 아그로박테리움-매개의 형질전환에 대한 대안으로서 개발된 직접적인 유전자 전달로서 종합적으로 지칭되는 몇몇의 식물 형질전환 방법. 미세투사물(microprojectile)의 식물 표면의 일반적으로 이용가능한 방법은 1 ㎛ 내지 4 ㎛를 측정한다. 발현 벡터는, 식물 세포벽 및 세포막을 침투하기에 충분한 300 m/s 내지 600 m/s의 속도로 미세투사물을 가속화하는 바이오리스틱 장치(biolistic device)를 사용하여 식물조직 내로 도입된다. Sanford et al., Part. Sci. Technol. 5:27 (1987); Sanford, J.C., Trends Biotech. 6:299 (1988); Klein et al., Bio/Tech. 6:559-563 (1988); Sanford, J.C. Physiol Plant 7:206 (1990); Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992). 또한, 1991년 5월 14일에 발행된 미국 특허 5,015,580(Christou 등) 및 1994년 6월 21일에 발행된 미국 특허 5,322,783(Tomes 등)을 참조한다.
DNA를 식물에 물리적으로 전달하는 또 다른 방법은 표적 세포의 소니케이션이다. Zhang et al., Bio/Technology 9:996 (1991)을 참조한다. 다른 예로, 리포좀 및 스페로플라스트(spheroplast) 융합은 발현 벡터를 식물 내로 도입하는 데 사용되어 왔다. Deshayes et al., EMBO J., 4:2731 (1985); Christou et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 84:3962 (1987). CaCl2 침전, 폴리비닐 알코올 또는 폴리-L-오르니틴을 사용하여 DNA를 원형질체 내로 직접 흡수시키는 것이 또한 보고된 바 있다. Hain et al., Mol. Gen. Genet. 199:161 (1985) 및 Draper et al., Plant Cell Physiol. 23:451 (1982). 원형질체 및 전체 세포와 조직의 전기천공 또한, 기술된 바 있다. Donn et al., In Abstracts of VIIth International Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC, A2-38, p 53 (1990); D'Halluin et al., Plant Cell 4:1495-1505 (1992) 및 Spencer et al., Plant Mol. Biol. 24:51-61 (1994).
감자 표적 조직의 형질전환 후, 상기 선별성 마커 유전자의 발현은, 당해 기술분야에 잘 공지되어 있는 재생 및 선별 방법을 이용하여, 형질전환된 세포, 조직 및/또는 식물을 우선적으로 선별할 수 있게 한다.
상기 형질전환 방법은 전형적으로 유전자이식 식물 품종을 생산하는 데 사용될 것이다. 그런 다음, 새로운 유전자이식 식물 품종을 생산하기 위해, 유전자이식 식물 품종은 또 다른(비-형질전환된 또는 형질전환된) 품종과 교배될 수 있었다. 다른 예로, 상기 형질전환 기술을 이용하여 특정한 감자 라인 내로 조작된 유전적 형질은 식물 육종 분야에 잘 알려져 있는 전통적인 역교배 기술을 이용하여 또 다른 라인 내로 이동될 수 있다. 예를 들어, 역교배 접근법은, 공개적인 비-엘리트 품종 유래의 조작된 형질을 엘리트 품종으로 이동시키거나, 이의 게놈에 외래 유전자를 함유하는 품종 유래의 조작된 형질을, 해당 유전자를 함유하지 않는 품종 또는 품종들 내로 이동시키는 데 사용될 수 있었다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "교배"는 문맥에 따라 단순한 X × Y 교배 또는 역교배 과정을 지칭할 수 있다.
당업자는, 용어 감자식물이 본 발명의 맥락에서 사용되는 경우, 이는 또한 E12의 필수적인 구별 특징을 보유하는 유도체 품종, 예컨대 해당 품종의 유전자 변환된 식물, 또는 하나 이상의 부가 가치(예, 제초제저항성 또는 내해충성) 유전자가 혼입되어 있는 유전자이식 식물 유도체를 포함함을 인지할 것이다. 역교배 방법은 특징을 품종 내로 개량하거나 도입하기 위해 본 발명과 함께 이용될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "역교배"는, 잡종 자손을 재현성(recurrent) 부모로 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회 이상 반복해서 교배하는 것을 지칭한다. 하나 이상의 원하는 특징에 대한 유전자(들)에 기여하는 부모 감자식물은 비재현성 부모 또는 공여자 부모로 지칭된다. 이 용어는, 비재현성 부모는 역교배 프로토콜에서 1회 사용되며, 따라서, 반복되지 않는다는 사실을 지칭한다. 비재현성 부모 유래의 유전자 또는 유전자들이 전달되는 부모 감자식물은, 역교배 프로토콜에서 수차례 사용되므로, 재현성 부모로서 공지되어 있다. 전형적인 역교배 프로토콜에서, 본래의 관심 품종(재현성 부모)는 전달되어야 하는 관심 유전자(들)를 운반하는 제2 품종(비재현성 부모)에 교배된다. 그런 다음, 이 교배로 인해 생성되는 자손은 재현성 부모에 다시 교배되고, 이 과정은 감자식물이 수득될 때까지 반복되며, 여기서, 비재현성 부모로부터 전달되는 하나 이상의 유전자 외에도, 재현성 부모의 본질적으로 모든 원하는 형태학적 특징 및 생리학적 특징들은 변환된 식물에서 회수된다.
적합한 재현성 부모의 선별은 성공적인 역교배 절차의 중요한 단계이다. 역교배 프로토콜의 목적은, 하나 이상의 형질 또는 특징을 본래의 품종에서 변경 또는 치환하는 것이다. 이를 달성하기 위해, 재현성 품종의 하나 이상의 유전자는 비재현성 부모 유래의 원하는 유전자(들)를 사용하여 변형, 치환 또는 보충되는 한편, 원하는 유전자 중 본질적으로 모두 또는 나머지를 보유하며, 따라서, 본래의 품종의 원하는 생리학적 및 형태학적 구성을 보유한다. 특정한 비재현성 부모의 선택은 역교배의 목적에 따라 다를 것이다. 주요한 목적들 중 하나는, 일부 상업적으로 바람직하며 작물적으로 중요한 형질을 식물에 부가하는 것이다. 정확한 역교배 프로토콜은, 적절한 시험 프로토콜을 결정하기 위해 변경 또는 첨가되는 특징 또는 형질에 따라 다를 것이다. 전달되는 특징이 우성 대립 유전자인 경우 역교배 방법이 간략화되긴 하지만, 열성 대립 유전자 또한, 전달될 수 있다. 이 경우, 원하는 특징이 성공적으로 전달되었는지 결정하기 위해, 자손의 시험을 도입하는 것이 필요할 수 있다.
마찬가지로, 이식유전자는 당업자에게 잘 알려져 있는 구축된 재조합 방법의 품종들 중 임의의 품종을 사용하여 식물 내로 도입될 수 있다. 예컨대: Gressel, 1985, Biotechnologically Conferring Herbicide Resistance in Crops: The Present Realities, In Molecular Form and Function of the Plant Genome, L. van Vloten-Doting, (ed.), Plenum Press, New York; Huttner, S.L., et al., 1992, Revising Oversight of Genetically Modified Plants, Bio/Technology; Klee, H., et al., 1989, Plant Gene Vectors and Genetic Transformation: Plant Transformation Systems Based on the use of Agrobacterium tumefaciens, Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants; Koncz, C., et al.,1986, The Promoter of TL-DNA Gene 5 Controls the Tissue-Specific Expression of Chimeric Genes Carried by a Novel Type of Agrobacterium Binary Vector; Molecular and General Genetics; Lawson, C., et al., 1990, Engineering Resistance to Mixed Virus Infection in a Commercial Potato Cultivar: Resistance to Potato Virus X and Potato Virus Y in Transgenic Russet Burbank, Bio/Technology; Mitsky, T.A., et al., 1996, Plants Resistant to Infection by PLRV. 미국 특허 5,510,253; Newell, C.A., et al.,1991, Agrobacterium-Mediated Transformation of Solanum tuberosum L. Cv. Russet Burbank, Plant Cell Reports; Perlak, F.J., et al., 1993, Genetically Improved Potatoes: Protection from Damage by Colorado Potato Beetles, Plant Molecular Biology이며, 이들 모두는 이 목적을 위해 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
새로운 품종의 개발에서 규칙적으로 선별되지 않으나 역교배 및 유전자 조작 기술에 의해 개량될 수 있는 다수의 형질들이 확인되었다. 이들 형질은 유전자이식 식물일 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있으며; 이들 형질의 예로는, 제초제저항성; 박테리아, 균류 또는 바이러스 질병에 대한 내성; 내충성; 전분 및 다른 탄수화물 농도의 균일성 또는 증가; 증강된 영양 품질; 덩이줄기에 상처가 생길 가능성의 감소; 및 전분의 당으로의 변환율의 감소를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 이들 유전자는 일반적으로 핵을 통해 유전된다. 이들 형질 중 몇몇은 미국 특허 5,500,365, 미국 특허 5,387,756, 미국 특허 5,789,657, 미국 특허 5,503,999, 미국 특허 5,589,612, 미국 특허 5,510,253, 미국 특허 5,304,730, 미국 특허 5,382,429, 미국 특허 5,503,999, 미국 특허 5,648,249, 미국 특허 5,312,912, 미국 특허 5,498,533, 미국 특허 5,276,268, 미국 특허 4,900,676, 미국 특허 5,633,434 및 미국 특허 4,970,168에 기술되어 있다.
기탁 정보
상기 개시되며 첨부된 청구항에서 언급되는 J.R. Simplot Company 소유의 감자종자 E12의 덩이줄기 기탁은 미국 20110 버지니아주 머내서스, 10801 유니버시티 블러바드(University Boulevard)의 American Type Culture Collection(ATCC)에서 이루어졌다. 기탁 일자는 2013년 5월 23일이었다. 미세덩이줄기의 25개 바이얼의 기탁은 본 출원의 출원일 전부터 J.R. Simplot Company에 의해 유지된 동일한 기탁으로부터 취하였다. 특허 등록 시 모든 구속들은 돌이킬 수 없게 제거될 것이며, 기탁은 37 C.F.R. §§ 1.801-1.809의 필요조건들을 모두 충족시키고자 한다. ATCC 등록 번호는 PTA-120372이다. 기탁은 30년 동안 또는 마지막 요청 후 5년 동안, 또는 기간이 얼마나 길든지 간에 특허의 시행 기간(enforceable life) 동안 기탁소에서 유지될 것이며, 해당 기간 동안 필요에 따라 대체될 것이다.
다수의 예시적인 측면 및 구현예는 상기에 논의되어 있긴 하지만, 당업자는 이의 소정의 변형, 치환, 첨가 및 하위조합을 인지할 것이다. 따라서, 하기의 첨부되는 청구항 및 이후에 도입되는 청구항은, 이들의 참 사상 및 범주 내에 속하는 바와 같이, 이러한 모든 변형, 치환, 첨가 및 하위조합을포함하는 것으로 해석되어야 한다.
기탁기관명 : The American Type Culture Collection
수탁번호 : PTA-120372
수탁일자 : 20130523

Claims (23)

  1. 감자종자 E12의 감자 덩이줄기, 또는 감자 덩이줄기의 일부로서, 상기 덩이줄기의 대표적인 검체는 ATCC 등록 번호 PTA -120372 하에 기탁되어 있는, 감자종자 E12의 감자 덩이줄기, 또는 감자 덩이줄기의 일부.
  2. 제1항의 덩이줄기 또는 덩이줄기의 일부를 재배함으로써 생산되는, 감자식물 또는 이의 일부.
  3. 제2항의 식물의 생리학적 특징 및 형태학적 특징을 모두 가지는, 감자식물.
  4. 제2항의 식물로부터 생산되는 세포의 조직 배양물로서, 조직 배양물의 상기 세포는 잎, 화분, 배(embryo), 떡잎, 배축(hypocotyl), 분열조직 세포, 뿌리, 근단(root tip), 암술, 꽃밥(anther), 꽃, 줄기 및 덩이줄기로 이루어진 군으로부터 선택되는 식물 부분으로부터 생산되는, 조직 배양물.
  5. 제4항의 조직 배양물로부터 재생되는 감자식물로서, 상기 식물은 감자종자 E12의 생리학적 특징 및 형태학적 특징을 모두 가지는, 감자식물.
  6. 제1항의 감자 덩이줄기, 또는 감자 덩이줄기의 일부를 재배함으로써 생산되는 감자씨앗.
  7. 제6항의 씨앗을 재배함으로써 생산되는, 감자식물 또는 이의 일부.
  8. 제7항의 감자식물의 조직 배양물로부터 재생되는 감자식물로서, 상기 식물은 감자종자 E12의 생리학적 특징 및 형태학적 특징을 모두 가지는, 감자식물.
  9. 감자씨앗의 생산 방법으로서, 상기 방법은 2종의 감자식물을 교배하는 단계, 및 생성되는 감자씨앗을 수확(harvest)하는 단계를 포함하며, 적어도 하나의 감자식물은 제2항의 감자식물인, 방법.
  10. 감자씨앗의 생산 방법으로서, 상기 방법은 2종의 감자식물을 교배하는 단계, 및 생성되는 감자씨앗을 수확하는 단계를 포함하며, 적어도 하나의 감자식물은 제7항의 감자식물인, 방법.
  11. 제10항의 방법에 의해 생산되는 감자씨앗.
  12. 제11항의 상기 감자씨앗을 재배함으로써 생산되는, 감자식물 또는 이의 일부.
  13. 제12항의 식물로부터 생산되는 감자씨앗.
  14. 제9항에 있어서, 상기 감자식물 중 하나는 유전자이식 식물이며, 다른 하나는 감자종자 E12인, 방법.
  15. 제10항에 있어서, 상기 감자식물 중 하나는 유전자이식 식물이며, 다른 하나는 감자종자 E12인, 방법.
  16. 제14항의 방법에 의해 생산되는, 감자식물 또는 이의 일부.
  17. 원하는 형질을 감자종자 E12 내로 도입하는 방법으로서,
    (a) E12 식물을, 원하는 형질을 포함하는 또 다른 감자종자 식물과 교배하여, 자손 식물을 생산하는 단계로서, 덩이줄기의 대표적인 검체는 ATCC 등록 번호 PTA-120372 하에 기탁되었으며, 원하는 형질은 웅성 불임(male sterility), 제초제저항성, 내충성, 지방산 대사 변형, 탄수화물 대사 변형, 및 박테리아 질병, 진균 질병 또는 바이러스 질병에 대한 내성으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단계;
    (b) 원하는 형질을 가지는 하나 이상의 자손 식물을 선별하는 단계;
    (c) 선별된 자손 식물을 E12식물과 역교배하여, 역교배 자손 식물을 생산하는 단계;
    (d) 원하는 형질을 가지는 역교배 자손 식물을 선별하는 단계; 및
    (e) 단계 (c) 및 (d)를 연속해서 2회 이상 반복하여, 원하는 형질을 포함하는, 선별된 제3 이상의 역교배 자손 식물을 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
  18. 제17항의 방법에 의해 생산되는 감자식물로서, 식물은 원하는 형질, 및 감자종자 E12의 생리학적 특징 및 형태학적 특징을 모두 가지는, 감자식물.
  19. 제18항에 있어서, 원하는 형질은 제초제저항성이며, 이 저항성은, 이미다졸리논(imidazolinone), 설포닐우레아, 글리포세이트(glyphosate), 글루포시네이트(glufosinate), L-포스피노트리신(L-phosphinothricin), 트리아진 및 벤조니트릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 제초제에 부여되는, 감자식물.
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 원자재(commodity) 식물 제품의 생산 방법으로서, 제2항의 식물 또는 이의 일부를 수득하는 단계, 상기 식물 또는 이의 식물 부분으로부터 원자재 식물 제품을 생산하는 단계를 포함하며, 상기 원자재 식물 제품은 후렌치후라이, 감자칩, 탈수된 감자 재료, 감자 플레이크 및 감자 과립으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  23. 제22항의 방법에 의해 생산되는, 원자재 식물 제품.
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