KR20160008183A - 감자 재배품종 f10 - Google Patents

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KR20160008183A
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plants
dna
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카이우스 로멘스
트로이 위크스
크레이그 리첼
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제이.알.심프롯캄패니
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Abstract

F10으로 표기되는 감자 재배품종이 개시된다. 본 발명은 감자 재배품종 F10의 괴경, 감자 재배품종 F10의 종자, 감자 재배품종 F10의 식물체 및 식물 부분, 감자 재배품종 F10으로부터 생성된 식품, 및 감자 재배품종 F10을 그 자신과 또는 다른 감자 변종과 교배함으로써 감자 식물체를 생성하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 트랜스제닉 감자 식물체의 생성 방법 및 이 방법에 의해 생성된 트랜스제닉 감자 식물체 및 일부에 관한 것이다. 또한 본 발명은 감자 재배품종 F10으로부터 유래된 감자 식물체 및 식물 부분, 감자 재배품종 F10으로부터 유래된 다른 감자 식물체 또는 식물 부분의 생성 방법 및 이 방법의 이용에 의해 유도된 감자 식물체 및 그 일부에 관한 것이다. 추가로 본 발명은 감자 재배품종 F10과 다른 감자 재배품종의 교배에 의해 생성된 잡종 감자 괴경, 종자, 식물체 및 식물 부분에 관한 것이다.

Description

감자 재배품종 F10{POTATO CULTIVAR F10}
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된, 2013년 5월 2일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/818,752호로부터의 우선권의 이익을 주장한다.
본 발명은 F10으로 명명된 신규한 감자 재배품종 및 이 감자 변종에 의해 생성된 괴경, 식물체, 식물 부분, 조직 배양물 및 종자에 관한 것이다. 또한 본 발명은 감자 재배품종 F10으로부터 생성된 식품, 예를 들어 프렌치 프라이(French fry), 감자 칩, 건조 감자 물질, 감자 플레이크 및 감자 과립에 관한 것이다. 본 출원에 인용된 모든 간행물은 본 명세서에 참고로 포함된다.
감자는 세계에서 네 번째의 가장 중요한 식용 작물이며, 단연코 가장 중요한 야채이다. 현재 감자는 미국의 거의 모든 주에서 상업적으로 재배된다. 연간 감자 생산량은 미국에서 1800만톤, 그리고 전 세계적으로 3억톤을 초과한다. 감자의 인기는 주로 그의 융통성 및 영양적 가치로부터 유래된다. 감자는 신선하게, 냉동되어 또는 건조되어 사용될 수 있거나 또는 가루, 전분 또는 알코올로 가공될 수 있다. 감자는 복합 탄수화물을 함유하며, 칼슘, 니아신 및 비타민 C가 풍부하다.
식품 산업에서 감자의 품질은 하기 2가지의 결정적인 요인에 의해 악영향을 받는다: (1) 감자는 튀김시에 또는 구울시에 발암성 생성물인 아크릴아미드를 형성하도록 빠르게 산화되는 비필수 자유 아미노산인 아스파라긴을 다량 함유함; 및 (2) 감자는 폴리페놀 옥시다아제가 멍든 감자의 손상된 색소체로부터 누출될 때 일어나는 바람직하지 않은 이벤트(event)인 효소적 갈변 및 변색에 고도로 민감함. 세포질에서, 상기 효소는 페놀을 산화시키며, 이는 그 후 빠르게 중합되어 짙은 색소를 생성한다. 괴경은 다량의 인산화된 전분을 함유하며, 이 중 일부는 저장 동안 분해되어 글루코스 및 프룩토스를 생성한다. 이러한 환원당은 아미노산과 반응하여, 120℃ 초과의 온도에서 가열될 때 아크릴아미드를 포함하는 마이야르(Maillard) 생성물을 형성한다. 전분 인산화에 연루된 두 효소로는 수 다이키나아제(water dikinase) R1 및 포스포릴라아제-L (R1 및 PhL)이 있다. 또한 갈변은 전분의 글루코스 및 프룩토스로의 부분 분해의 결과로서 비-효소적으로 트리거링된다(triggered).
지금까지, 저 아크릴아미드 함량, 증가된 흑점 멍 내성(black spot bruise tolerance) 및 감소된 노화 스위트닝(senescence sweetening)을 갖는 괴경을 생성하는 감자 식물 변종이 없었다. 따라서, 감소된 수준의 독성 화합물을 갖지만, 비공지 또는 외래 핵산을 사용하지 않는 감자 변종의 개발 필요성이 있다. 본 발명은 이러한 필요성을 충족시킨다.
관련 분야의 전술한 예 및 이에 관련된 제한은 예시적인 것으로 의도되며, 배타적인 것으로 의도되는 것은 아니다. 관련 분야의 다른 제한은 본 명세서를 읽을시에 당업자에게 명백해질 것이다.
예시적인 것을 의미하며 범주의 한정을 의미하는 것은 아닌 시스템, 도구 및 방법과 함께, 하기 실시 형태 및 이의 태양이 기재되어 있다. 다양한 실시 형태에서, 상기에 기재된 문제 중 하나 이상은 감소되거나 또는 제거된 반면, 다른 실시 형태는 다른 개선에 관한 것이다.
이것을 위하여, 본 발명은 감자 식물 게놈에 대하여 천연이고 외래 DNA, 아그로박테륨(Agrobacterium) DNA, 바이러스 마커 또는 벡터 골격 서열을 함유하지 않는 핵산 서열로 형질전환된 신규한 감자 변종 F10을 제공한다. 오히려, 감자 변종 F10의 게놈 내로 삽입되는 DNA는 감자에 대하여 천연이거나 또는 야생 감자, 성적으로 양립가능한 감자 식물체에 대하여 천연인 비-코딩 폴리뉴클레오티드인데, 이는 흑점 멍의 발현, 아스파라긴 축적 및 노화 스위트닝에 연루된 유전자를 침묵시킨다.
따라서, 일 실시 형태에서, 본 발명은 pSIM278로 칭해지는 식물 벡터를 제공하며, 이는 안티-센스 배향으로 아스파라긴 신테타아제-1 유전자 (fAsn1)의 단편 및 폴리페놀 옥시다아제-5 유전자의 3'-비번역 서열을 포함하는 DNA 절편의 2개의 카피(copy)를 포함하는 제1 침묵 카세트(silencing cassette); 및 안티-센스 배향으로 감자 포스포릴라아제-L (pPhL) 유전자의 단편 및 감자 R1 유전자의 단편을 포함하는 DNA 절편의 2개의 카피를 포함하는 제2 침묵 카세트를 포함한다. pSIM1278 벡터는 식물 형질전환 전 식물 DNA의 유지를 지지하고 식물 세포의 형질전환시에 식물 세포로 이전되지 않는 9,511 bp 골격 영역, 및 형질전환시에 식물 세포의 게놈 내로 안정하게 통합되는 천연 DNA를 포함하는 10,147 bp DNA 인서트(insert) 영역을 포함한다.
상이한 실시 형태에서, 본 발명은 본 발명의 식물 벡터로 형질전환된 식물 세포를 제공한다. 추가의 실시 형태에서, 본 발명은 본 발명의 벡터로 형질전환된 하나 이상의 세포를 포함하는 감자 식물 변종을 제공한다. 본 발명의 일 태양에서, 감자 식물 변종은 벡터의 2개의 침묵 카세트 중 적어도 하나를 발현하며, 침묵 카세트의 발현은 인트라제닉(intragenic) 식물체의 괴경에서의 아스파라긴 신테타아제-1 유전자 및 폴리페놀 옥시다아제-5 유전자의 하향조절로 이어진다. 본 발명의 바람직한 태양에서, 하나 이상의 침묵 카세트를 발현하는 감자 식물 변종의 괴경은 동일 변종의 비형질전환된 식물체의 괴경에는 존재하지 않는 2가지 이상의 바람직한 형질을 나타낸다. 본 발명의 가장 바람직한 태양에서, 상기 2가지 이상의 바람직한 형질은 낮은 아스파라긴 축적, 감소된 흑점 멍 및 감소된 열-유도 아크릴아미드 형성으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 상이한 태양에서, 감자 식물 변종은 식물 DNA 벡터의 둘 모두의 침묵 카세트를 발현하며, 상기 침묵 카세트의 발현은 감자 식물 변종의 괴경에서의 아스파라긴 신테타아제-1 유전자, 폴리페놀 옥시다아제-5 유전자, 포스포릴라아제-L 유전자 및 다이키나아제 R1 유전자의 하향조절로 이어진다. 본 발명의 바람직한 태양에서, 식물 DNA 벡터의 2가지 침묵 카세트를 발현하는 감자 식물 변종의 괴경은 동일 변종의 비형질전환된 식물체의 괴경에는 존재하지 않는 2가지 이상의 바람직한 형질을 나타낸다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 2가지 이상의 바람직한 형질은 낮은 아스파라긴 축적, 감소된 흑점 멍, 저장 동안의 환원당의 감소된 축적 및 감소된 열-유도 아크릴아미드 형성으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 일 태양에서, 식물 DNA 벡터의 2가지 침묵 카세트를 발현하는 감자 식물 변종은 레인저 러셋(Ranger Russet) F10 변종이다.
따라서, 본 발명에 따르면, F10으로 명명된 새로운 감자 재배품종의 속 및 종 솔라눔 투베로숨 엘.(Solanum tuberosum L.)이 제공된다. 따라서 본 발명은 감자 재배품종 F10, 감자 재배품종 F10의 괴경, 감자 재배품종 F10의 식물체, 감자 재배품종 F10의 종자, 감자 재배품종 F10으로부터 생산된 식품, 및 감자 재배품종 F10의 자식(selfing)에 의해 또는 감자 재배품종 F10과 다른 감자 재배품종의 교배에 의해 생산된 감자 식물체의 생산 방법, 및 감자 재배품종 F10의 돌연변이 유발 또는 형질전환에 의한 변종의 생성에 관한 것이다.
따라서, 재배품종 F10을 이용한 임의의 그러한 방법, 즉 자식, 역교배, 잡종 생산, 집단에의 교배 등이 본 발명의 실시 형태이다. 적어도 하나의 모(parent)로서 감자 재배품종 F10을 사용하여 생산된 모든 식물체는 본 발명의 범주 이내이다. 유리하게는, 본 감자 재배품종은 다른 상이한 감자 식물체와의 교배에 사용되어 탁월한 특성을 갖는 제1 세대(F1) 감자 잡종 괴경, 종자 및 식물체를 생성할 수 있다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 감자 재배품종 F10의 단일 또는 다수 유전자 전환 식물체를 제공한다. 일 실시 형태에서, 이전되는 유전자(들)는 우성 또는 열성 대립유전자(들)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 이전되는 유전자(들)는 제초제 내성, 곤충 내성, 박테리아성, 진균성 또는 바이러스성 질병에 대한 내성, 웅성 가임(male fertility), 웅성 불임(male sterility), 전분 및 기타 탄수화물의 농도의 증가 및 향상된 영양 품질, 균일성, 멍 경향의 감소 및 전분의 당으로의 전환률의 감소와 같은 형질을 부여할 것이다. 유전자(들)는 자연 발생 감자 유전자 또는 유전 공학 기술, 역교배 또는 돌연변이를 통하여 도입된 트랜스진(transgene)일 수 있다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 감자 재배품종 F10의 조직 배양에서 사용하기 위한 재생가능한 세포를 제공한다. 일 실시 형태에서, 조직 배양은 전술한 감자 식물체의 모든 생리학적 및 형태학적 특성을 갖는 식물체의 재생, 및 전술한 감자 식물체와 실질적으로 동일한 유전자형을 갖는 식물체의 재생이 가능할 것이다. 일부 실시 형태에서, 그러한 조직 배양 중 재생가능한 세포는 배아, 원형질체, 분열조직 세포, 캘러스(callus), 화분, 잎, 꽃밥, 암술, 자엽, 배축, 뿌리, 근단, 꽃, 종자, 잎자루, 괴경, 눈 또는 줄기일 것이다. 또한 추가로, 본 발명은 본 발명의 조직 배양물로부터 재생된 감자 식물체를 제공한다.
추가의 실시 형태에서, 본 발명은 감자 식물 변종 레인저 러셋 F10의 괴경으로 만들어진 식품을 제공한다. 바람직하게는, 식품은 열처리된 제품이다. 더욱 더 바람직하게는, 식품은 프렌치 프라이, 감자 칩, 건조 감자 물질, 감자 플레이크, 또는 감자 과립이다.
상기에 기재된 예시적인 태양 및 실시 형태에 더하여, 추가의 태양 및 실시 형태가 하기 설명의 연구에 의해 명백해질 것이다.
도 1은 pSIM1278 형질전환 벡터를 도시한다. 좌측의 벡터 골격 영역은 이것이 9,957 bp 위치에서 시작하여 19,468 bp 위치에서 끝나는 바와 같이 길이가 9,511 bp이다. 골격 DNA는 주로 박테리아 DNA로 이루어지는데, 이는 식물 형질전환 전 DNA 인서트의 지지 유지를 제공한다. 측면에 존재하는 경계 서열(Border sequence)을 포함하는 DNA 인서트 영역 (우측)은 길이가 10,147 bp이다 (19,469 bp 내지 19,660 bp 및 1 bp 내지 9,956bp). DNA 인서트는 천연 DNA만으로 이루어지며, 형질전환시에 감자 게놈 내로 안정하게 통합되었다.
도 2는 pSIM1278 형질전환 벡터에 삽입된 DNA 인서트에서의 침묵 카세트의 개략도를 제공한다. 각각의 침묵 카세트는 스페이서(spacer)에 의해 분리된 2개의 유전자 단편의 2개의 카피를 함유한다. 4가지의 표적화된 유전자, 즉 Asn-1, Ppo-5, Phl 및 R1의 단편을 포함하는 DNA 절편의 2개의 카피는 괴경에서 대부분 활성을 갖는 Pro로 표시되는 2개의 수렴성 프로모터(convergent promoter) 사이의 역반복체(inverted repeat)로서 삽입되었다. 생성된 침묵 카세트를 포함하는 식물체는 의도된 표적 유전자를 동력학적으로 그리고 격렬하게 침묵시키는 괴경 내의 RNA 분자의 다양한 그리고 비폴리아데닐화된 어레이(array)를 생성한다. 일반적으로 RNA 분자의 크기는 이용된 두 프로모터 사이의 거리보다 더 작았으며, 그 이유는 수렴성 전사가 충돌성 전사(collisional transcription)로 이어지기 때문이다.
도 3은 카테콜 분석의 결과를 나타낸다. 레인저 러셋 대조군은 좌측에 있으며, 변종 F10은 우측에 있다. 짙은 갈색은 흑점 멍 감소 형질이 존재하지 않음을 나타낸다. 도 3에 보이는 바와 같이, F10은 흑점 멍 감소 형질을 가지며, 반면에 대조군은 그렇지 않다.
하기의 설명 및 표에서 다수의 용어가 사용된다. 그러한 용어에 주어질 범주를 비롯하여, 본 명세서 및 청구범위의 명확하고 일관된 이해를 제공하기 위하여, 하기 정의가 제공된다:
대립유전자. 대립유전자는 하나의 형질 또는 특성에 관련된 임의의 하나 이상의 대안적인 형태의 유전자이다. 이배체 세포 또는 유기체에서, 주어진 유전자의 2가지 대립유전자는 상동 염색체 쌍 상의 상응하는 유전자좌를 점유한다.
아미노산 서열. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 이는 식물로부터 단리되거나, 식물에 대하여 천연이거나, 또는 식물에서 자연 발생성인, 또는 합성에 의해 제조되지만 내인성 상대의 핵산 서열을 포함하는 올리고펩티드, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 및 이들의 단편을 포함한다.
인공 조작. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "인공 조작된"은, 비조작된 자연 발생 상대와 비교하여 상이한 생물학적, 생화학적, 형태학적 또는 생리학적 표현형 및/또는 유전자형을 갖는 식물체 또는 식물 세포를 생성하도록, 수동으로 또는 기계적 수단 또는 재조합적 수단에 의해, 예를 들어 유전 공학 기술에 의해 식물체 또는 식물 세포를 이동시키거나, 배열하거나, 작동시키거나 또는 제어함을 의미한다.
무성 번식. 잎 절단체, 줄기 절단체, 뿌리 절단체, 괴경 눈, 포복지(stolon), 단일 식물 세포 원형질체, 캘러스 등으로부터 전체 식물체를 생성함에 의한 자손의 생성으로서, 이는 생식체(gamete)의 융합을 포함하지 않는다.
골격. 이전용으로 의도된 DNA 인서트 서열을 제외한 이원(binary) 벡터의 핵산 서열.
역교배. 역교배는 육종가가 반복적으로 잡종 자손을 부모 중 하나에 다시 교배시키는, 예를 들어, 제1 세대 잡종 F1을 F1 잡종의 모 유전자형 중 하나와 교배시키는 과정이다.
박테리아성 윤부병. 박테리아성 윤부병은 박테리아 클라비박터 미시가넨시스(Clavibacter michiganense) 아종에 의해 야기되는 질병이다. 박테리아성 윤부병은 괴경 내에서의 도관륜(vascular ring)의 특징적인 분해로부터 그 이름이 유래된다. 이러한 윤부는 흔히 미색-황색 내지 연한 갈색의 치즈 같은 썩음(cheesy rot)으로 나타난다. 감자의 외부 표면 상에서, 심하게 병든 괴경은 약간 함몰되고, 건성이고, 균열된 영역을 나타낼 수 있다. 감염된 괴경의 도관 조직에서의 박테리아성 윤부병의 증상은 상기에 기재된 것보다 덜 명확한 것일 수 있는데, 이는 단지 산발적으로 나타나는 짙은 파선으로서 또는 연속적인 누르스름한 변색으로서 나타난다.
흑점 멍. 멍든 괴경 조직에서 발견되는 흑점은 세포의 상해 후 생성되어 조직에게 갈색, 회색 또는 흑색 외관을 주는 멜라닌으로 칭해지는 색소의 결과이다. 멜라닌은 페놀 기질 및 적절한 효소가 세포 손상의 결과로서 서로와 접촉하게 될 때 형성된다. 손상은 파괴된 세포를 요구하는 것은 아니다. 그러나, 일반적으로 조직이 영향을 받을 때 기질과 효소의 혼합이 일어나야 한다. 흑점은 주로 도관륜 바로 아래의 주골수 조직(perimedullary tissue)에서 주로 나타나지만, 피질 조직의 일부분을 포함하기에 충분히 클 수 있다.
경계-유사 서열. "경계-유사" 서열은 변형될 선택된 식물 종으로부터, 또는 변형될 식물 종과 성적으로 양립가능한 식물체로부터 단리되며, 아그로박테륨의 경계 서열과 유사한 기능을 한다. 즉, 본 발명의 경계-유사 서열은 이것이 연결된 폴리뉴클레오티의 통합을 촉진 및 조장한다. 본 발명의 DNA 인서트는 바람직하게는 경계-유사 서열을 함유한다. DNA 인서트의 경계-유사 서열은 길이가 5 내지 100 bp, 길이가 10 내지 80 bp, 길이가 15 내지 75 bp, 길이가 15 내지 60 bp, 길이가 15 내지 50 bp, 길이가 15 내지 40 bp, 길이가 15 내지 30 bp, 길이가 16 내지 30 bp, 길이가 20 내지 30 bp, 길이가 21 내지 30 bp, 길이가 22 내지 30 bp, 길이가 23 내지 30 bp, 길이가 24 내지 30 bp, 길이가 25 내지 30 bp, 또는 길이가 26 내지 30 bp이다. DNA 인서트 좌측 및 우측 경계 서열은 변형될 식물체의 게놈으로부터 단리되고/되거나 상기 게놈에 대하여 천연이다. DNA 인서트 경계-유사 서열은 뉴클레오티드 서열이 임의의 공지된 아그로박테륨-유래된 T-DNA 경계 서열과 동일하지 않다. 따라서, DNA 인서트 경계-유사 서열은 아그로박테륨 종, 예를 들어 아그로박테륨 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 또는 아그로박테륨 리조게네스(Agrobacterium rhizogenes)로부터의 T-DNA 경계 서열과는 상이한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 이보다 더 많은 뉴클레오티드를 보유할 수 있다. 즉, 본 발명의 DNA 인서트 경계, 또는 경계-유사 서열은 아그로박테륨 종, 예를 들어 아그로박테륨 투메파시엔스 또는 아그로박테륨 리조게네스로부터의 T-DNA 경계 서열과의 서열 동일성이 95% 이상, 90% 이상, 80% 이상, 75% 이상, 70% 이상, 60% 이상 또는 50% 이상이지만, 서열 동일성이 100%인 것은 아니다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 서술 용어 "DNA 인서트 경계" 및 "DNA 인서트 경계-유사"는 교환가능하다. 경계-유사 서열은 식물 게놈으로부터 단리되고, 이것이 소정 뉴클레오티드 서열을 다른 뉴클레오티드 서열 내에 통합시킬 수 있는 효율을 변화시키도록 변형되거나 또는 돌연변이될 수 있다. 다른 폴리뉴클레오티드 서열이 본 발명의 경계-유사 서열에 부가되거나 또는 상기 경계-유사 서열 내에 혼입될 수 있다. 따라서, DNA 인서트 좌측 경계 또는 DNA 인서트 우측 경계는 5'- 및 3'-다중 클로닝 부위 또는 추가의 제한효소 부위를 보유하도록 변형될 수 있다. DNA 인서트 경계 서열은 수반되는 벡터로부터의 골격 DNA가 식물 게놈 내로 통합되지 않는 가능성을 증가시키도록 변형될 수 있다.
본질적으로 이루어짐. 소정 요소로 "본질적으로 이루어진" 조성물은 그 요소와, 본 발명의 조성물의 기본적인 그리고 신규한 특성에 실질적으로 영향을 주지 않는 요소를 포함하는 것에 한정된다. 따라서, 조성물이 본 발명의 기본적인 그리고 신규한 특성에 영향을 주지 않는다면, 즉, 선택된 식물 종 또는 선택된 식물 종과 성적으로 양립가능한 식물체로부터 유래된 것이 아닌 외래 DNA를 함유하지 않는다면, 그 조성물은 "본질적으로 이루어진"이라는 어구를 특징으로 하는 본 발명의 조성물의 성분으로 간주될 수 있다.
자엽. 자엽은 소정 유형의 떡잎이다. 자엽은 종자의 식품 저장 조직을 함유한다.
축퇴성 프라이머(degenerate primer). "축퇴성 프라이머"는 유사한 그러나 정확한 것은 아닌 상동성의 서열에 혼성화될 때 염기 미스매치를 수용할 수 있기에 충분한 뉴클레오티드 변동을 함유하는 올리고뉴클레오티드이다.
쌍자엽 ( 쌍떡잎). 배아가 2개의 떡잎 또는 자엽을 갖는 꽃식물. 쌍떡잎 식물의 예에는 담배, 토마토, 감자, 고구마, 카사바(cassava), 알팔파 및 대두를 포함하는 콩과 식물, 당근, 딸기, 상추, 오크, 단풍나무, 호두나무, 장미, 민트, 호박, 데이지 및 선인장이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
DNA 인서트. 본 발명에 따르면, 식물체의 게놈 내에 삽입될 DNA 인서트는 그 식물체에 대하여 천연인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나 또는 그 식물체에 대하여 천연인 유전 요소를 갖는다. 일 실시예에에서, 예를 들어, 본 발명의 감자 변종 F10의 DNA 인서트는 감자 또는 야생 감자, 성적으로 양립가능한 감자 식물체에 대하여 천연인 10,147 bp 비-코딩 폴리뉴클레오티드인데, 이는 형질전환시에 식물 세포의 게놈 내로 안정하게 통합되고 흑점 멍의 발현, 아스파라긴 축적 및 노화 스위트닝에 연루된 유전자를 침묵시킨다. DNA 인서트는 바람직하게는 2개의 발현 카세트를 포함하며, pSIM1278 형질전환 벡터로 칭해지는 형질전환 벡터 내에 삽입된다. 제1 카세트는 아스파라긴 신테타아제-1 유전자 (Asn1) 및 폴리페놀 옥시다아제-5 유전자 (Ppo5) 둘 모두의 단편을 포함하는데, 이는 ADP 글루코스 파이로포스포릴라아제 유전자 (Agp)의 Agp 프로모터와 과립-결합 신타아제 유전자 (Gbss)의 Gbss 프로모터 사이에 역반복체로서 배열된다. 이러한 프로모터는 대부분 괴경에서 활성을 갖는다. 제2 카세트의 기능은 전분 연관된 유전자 다이키나아제-R1 (R1) 및 포스포릴라아제-L 유전자 (PhL)의 프로모터를 침묵시키는 것이다. 이 카세트는 제1 카세트와 동일한 Agp 및 Gbss 프로모터에 작동가능하게 연결된, 전분 연관된 유전자 다이키나아제-R1 (R1) 및 포스포릴라아제-L 유전자 (PhL)의 프로모터의 단편으로 이루어진다. 이러한 발현 카세트는 외래 DNA를 함유하지 않으며, 단지 선택된 식물 종으로부터 또는 선택된 식물 종과 성적으로 양립가능한 식물체로부터 유래된 DNA로 이루어진다.
배아. 배아는 성숙 종자 내에 함유된 미성숙 식물체이다.
외래. 핵산과 관련하여 "외래"는 그 핵산이 비-식물 유기체로부터 유래되거나 또는 형질전환될 식물체와 동일한 종이 아닌 식물체로부터 유래되거나 또는 형질전환될 식물체와 교배될 수 없는 식물체로부터 유래되지 않고 표적 식물체의 종에 속하지 않음을 의미한다. 본 발명에 따르면, 외래 DNA 또는 RNA는 진균류, 박테리아, 바이러스, 포유류, 어류 또는 조류의 유전자 메이크업(makeup)에서 자연 발생성이지만 형질전환될 식물에서는 자연 발생성이 아닌 핵산을 나타낸다. 따라서, 외래 핵산은 예를 들어 형질전환된 식물체에 의해서는 자연적으로 생성되지 않는 폴리펩티드를 코딩하는 것이다. 외래 핵산은 단백질 생성물을 코딩할 필요는 없다. 본 발명에 따르면, 원하는 인트라제닉 식물체는 그 게놈 내로 통합된 어떠한 외래 핵산도 함유하지 않는 것이다.
유전자. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "유전자"는 코딩 영역을 말하며, 그 영역에 대하여 5'- 또는 3'-에 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는다. 기능성 유전자는 프로모터 또는 터미네이터(terminator)에 작동가능하게 연결된 코딩 영역이다. 유전자는 형질전환 또는 다양한 육종 방법을 이용하여, 상이한 종으로부터 유래되든지 동일한 종으로부터 유래되든지 간에 소정 종의 게놈 내로 도입될 수 있다.
유전자 변환 ( 변환). 유전자 변환된 (변환) 식물체는 역교배로 칭해지는 식물 육종 기술에 의해 개발된 식물체를 말하며, 여기서, 역교배 기술을 통하여, 유전 공학을 통하여 또는 돌연변이를 통하여 그 변종 내로 이전될 하나 이상의 유전자에 더하여, 변종의 실질적으로 모든 원하는 형태학적 및 생리학적 특성이 회복된다. 하나 이상의 유전자좌가 또한 이전될 수 있다.
유전자 재배열. 이는 시험관 내에서 뿐만 아니라 생체 내에서도 자발적으로 일어날 수 있는 유전 요소의 재회합을 말하는데, 이는 유전 물질의 새로운 편제(organization)를 도입한다. 예를 들어, 상이한 염색체 유전자좌에서의 폴리뉴클레오티드가 함께 스플라이싱되는 것은 식물 발생 및 성적 재조합 둘 모두 동안 생체 내에서 자발적으로 일어날 수 있다. 따라서, 시험관 내에서의 비-천연적 유전자 변형 기술에 의한 유전 요소의 재조합은 생체 내에서 성적 재조합을 통하여 또한 일어날 수 있는 재조합 이벤트와 유사하다.
시스토 선충(golden nematode). 일반적으로 시스토 선충으로도 공지된 글로보데라 로스토키엔시스(Globodera rostochiensis)는 감자 식물체의 뿌리 및 괴경에 영향을 주는 식물 기생 선충이다. 증상은 불량한 식물 성장, 시들음, 수분 스트레스(water stress) 및 영양 결핍을 포함한다.
배축. 배축은 자엽과 뿌리 사이의 유묘 또는 배아의 일부이다. 따라서, 이것은 싹과 뿌리 사이의 전이 구역(transition zone)으로 간주될 수 있다.
인 프레임(in frame). 뉴클레오티드 트리플릿(triplet) (코돈)은 식물 세포에서 원하는 재조합 단백질의 발생기(nascent) 아미노산 서열로 번역된다. 구체적으로, 본 발명은 제2 핵산에 대하여 판독 프레임으로 연결된 제1 핵산을 고려하며, 여기서, 제1 뉴클레오티드 서열은 유전자이고, 제2 뉴클레오티드는 프로모터 또는 유사 조절 요소이다.
통합. 이는 선택된 식물 종으로부터의, 또는 선택된 식물체와 동일한 종으로부터 유래된 식물체로부터의, 또는 선택된 식물 종과 성적으로 양립가능한 식물체로부터의 핵산 서열을 선택된 식물 종의 세포의 게놈 내에 삽입하는 것을 말한다. "통합"은 식물 세포 게놈 내로의 단지 천연 유전 요소의 혼입을 말한다. 천연 유전 요소의 통합, 예를 들어 상동 재조합에 의한 통합을 위하여, 본 발명은 그러한 공정에서의 단계로서 비-천연 DNA를 "이용"할 수 있다. 따라서, 본 발명은 특정 DNA 분자의 "이용"과 특정 DNA 분자의 식물 세포 게놈 내로의 "통합"을 구별한다.
도입. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 이는 감염, 형질감염, 형질전환 또는 형질도입을 포함하는 방법에 의한 핵산 서열의 세포 내로의 삽입을 말한다.
단리. "단리된"은 임의의 핵산 또는 화합물이 그의 정상적인 천연 환경으로부터 물리적으로 분리된 것을 말한다. 단리된 물질은 예를 들어 용매, 완충제, 이온 또는 다른 성분을 함유하는 적합한 용액 중에 유지될 수 있으며, 정제된 형태 또는 비정제된 형태로 존재할 수 있다.
리더. 유전자에 선행하는 (또는 유전자에 대하여 5'인), 전사되지만 번역되지 않는 서열.
유전자좌. 유전자좌는 예를 들어 웅성 불임, 제초제 내성, 곤충 내성, 질병 내성, 찰전분, 변경된 지방산 대사, 변경된 피트산 대사, 변경된 탄수화물 대사 및 변경된 단백질 대사와 같은 하나 이상의 형질을 부여한다. 형질은 예를 들어 역교배, 자연 돌연변이 또는 유도된 돌연변이, 또는 유전자 형질전환 기술을 통하여 도입된 트랜스진에 의해 변종의 게놈 내로 도입된 자연 발생 유전자에 의해 부여될 수 있다. 유전자좌는 단일 염색체 위치에서 통합된 하나 이상의 대립유전자를 포함할 수 있다.
상품 수량(Marketable Yield). 상품 수량은 직경이 2 내지 4 인치인, 수확된 모든 괴경의 중량이다. 상품 수량은 cwt (100 웨이트(hundred weight)) 단위로 측정되며, 여기서, cwt=100 파운드이다.
단자엽 ( 외떡잎). 배아가 하나의 자엽 또는 떡잎을 갖는 꽃식물. 단자엽 식물의 예에는 터프그래스(turf grass), 마이즈(maize), 벼, 귀리, 밀, 보리, 수수, 난초, 아이리스, 백합, 양파 및 팜(palm)이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
천연. "천연" 유전 요소는 형질전환될 식물체의 게놈에 자연적으로 존재하거나, 상기 게놈으로부터 기원하거나 또는 상기 게놈에 속하는 핵산을 말한다. 따라서, 형질전환될 식물체 또는 식물 종의 게놈으로부터 단리되거나 또는 형질전환될 식물 종과 성적으로 양립가능하거나 또는 교배할 수 있는 식물체 또는 종으로부터 단리된 임의의 핵산, 유전자, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, mRNA, 또는 cDNA 분자는 그 식물 종에 대하여 "천연"이며, 즉, 그 식물 종에 고유하다. 달리 말하면, 천연 유전 요소는 고전적인 식물 육종을 통한 식물체의 개선에 있어서 식물 육종가가 접근가능한 모든 유전 물질을 나타낸다. 천연 핵산의 임의의 변이체가 또한 본 발명에 따라 "천연"으로 간주된다. 이와 관련하여, "천연" 핵산은 또한 식물체 또는 이의 성적으로 양립가능한 종으로부터 단리될 수 있고, 생성된 변이체가 식물체로부터 단리된 비변형된 천연 핵산에 대하여 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, 또는 60% 이상의 뉴클레오티드 서열 유사성을 갖도록 변형되거나 또는 돌연변이될 수 있다. 천연 핵산 변이체는 또한 뉴클레오티드 서열 유사성이 약 60% 미만, 약 55% 미만, 또는 약 50% 미만일 수 있다. 식물체로부터 단리된 "천연" 핵산은 그 핵산으로부터 전사되고 번역된 자연 발생 단백질 생성물의 변이체를 또한 코딩할 수 있다. 따라서, 천연 핵산은 그 핵산이 단리된 식물체에서 발현되는 비변형된 천연 단백질과의 아미노산 서열 유사성이 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, 또는 60% 이상인 단백질을 코딩할 수 있다.
천연 유전 요소. "천연 유전 요소"는 본 발명에 따른 선택된 식물 종 게놈 내로 혼입 및 통합될 수 있다. 천연 유전 요소는 선택된 식물 종에 속하는 식물체로부터 또는 선택된 식물 종과 성적으로 양립가능한 식물체로부터 단리된다. 예를 들어, 재배 감자 (솔라눔 투베로숨) 내에 혼입되는 천연 DNA는 에스. 투베로숨의 임의의 유전자형 또는 에스. 투베로숨과 성적으로 양립가능한 야생 감자 종 (예를 들어, 에스. 데미숨(S. demissum))의 임의의 유전자형으로부터 유래될 수 있다.
자연 발생 핵산. 자연 발생 핵산은 선택된 식물 종의 게놈 내에서 발견되며, DNA 분자 또는 RNA 분자일 수 있다. 식물 종의 게놈에 보통 존재하는 제한효소 부위의 서열은, 그 제한효소 부위가 그 게놈으로부터 물리적으로 단리되지 않았더라도, 벡터 또는 올리고뉴클레오티드와 같은 외인성 DNA 분자 내로 엔지니어링될(engineered) 수 있다. 따라서, 본 발명은 제한 효소 인식 서열과 같은 뉴클레오티드 서열의 합성적 생성을 가능케 하며, 이는 그 서열이 선택된 식물 종의 게놈에서 또는 형질전환될 선택된 식물 종과 성적으로 양립가능한 식물체에서 자연 발생성이기만 하다면 그러하다.
작동가능하게 연결. 2가지 이상의 분자가 조합되어 식물 세포에서 적당하게 기능을 하는 그러한 방식으로 2가지 이상의 분자를 조합하는 것. 예를 들어, 프로모터는 프로모터가 구조 유전자의 전사를 제어할 때 구조 유전자에 작동가능하게 연결된 것이다.
식물체. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "식물체는 속씨 식물체 및 겉씨 식물체, 예를 들어 감자, 토마토, 담배, 알팔파, 상추, 당근, 딸기, 사탕무, 카사바, 고구마, 대두, 마이즈, 터프그래스, 밀, 벼, 보리, 수수, 귀리, 오크, 유칼립투스, 호두나무 및 팜을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 따라서, 식물은 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물일 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "식물체"는 성적으로 생성되든지 또는 무성적으로 생성되든지 간에 식물 세포, 종자, 식물 자손, 번식체와, 이들 중 임의의 것의 후손, 예를 들어 절단체 또는 종자를 또한 포함한다. 식물 세포는 현탁 배양물, 캘러스, 배아, 분열조직 영역, 캘러스 조직, 잎, 뿌리, 싹, 배우체, 포자체, 화분, 종자 및 소포자를 포함한다. 식물체는 다양한 단계의 성숙도로 존재할 수 있으며, 액체 또는 고체 배양에서, 또는 화분, 온실 또는 야외에서 토양 또는 적합한 매체에서 재배될 수 있다. 식물체에서의 도입된 리더, 트레일러(trailer), 또는 유전자 서열의 발현은 일시적이거나 또는 영구적일 수 있다. "선택된 식물 종"은 이러한 "식물체" 중 어느 하나의 종일 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
식물 부분. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "식물 부분" (또는 감자 식물체, 또는 이의 부분)은 원형질체, 잎, 줄기, 뿌리, 근단, 꽃밥, 암술, 종자, 배아, 화분, 배주, 자엽, 배축, 꽃, 괴경, 눈, 조직, 잎자루, 세포, 분열조직 세포 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
식물 종. 적어도 약간의 성적 양립가능성을 나타내는 다양한 공식적으로 명명된 식물 종에 속하는 식물 군.
식물 형질전환 및 세포 배양. 이는 대체로, 식물 세포가 유전자 변형되고, 유지, 추가의 성장 및/또는 추가의 발달에 적절한 식물 배양 배지로 이전되는 공정을 말한다.
정확한 육종. 이는 선택된 식물 종으로부터, 또는 선택된 식물과 동일한 종 내의 다른 식물로부터, 또는 선택된 식물 종과 성적으로 양립가능한 종으로부터 단리된 천연 유전자 및 조절 요소와 같은 핵산의, 개별 식물 세포 내로의 안정한 도입, 및 이러한 유전자 변형 식물 세포의 전 식물체로의 후속적인 재생에 의한 식물체의 개선을 말한다. 비공지 또는 외래 핵산은 식물 게놈 내로 영구적으로 혼입되지 않기 때문에, 본 발명의 기술은 종래의 식물 육종을 통하여 또한 접근가능한 상기 유전 물질을 활용한다.
자손. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 이는 하나 이상의 식물체가 감자 재배품종 F10을 포함하고 자손은 반복친 라인과의 후속적인 F2, F3, F4, F5, F6, F7, F8, F9, 및 F10 세대 교배를 추가로 포함하지만, 이에 한정되지 않는, 두 감자 식물체의 교배로부터 생성된 F1 감자 식물체를 포함한다.
정량적 형질 유전자좌 (Quantitative Trait Loci; QTL). 정량적 형질 유전자좌(QTL)는 일반적으로 연속적으로 분포되는, 어느 정도까지 수치로 나타낼 수 있는 형질을 제어하는 유전자좌를 말한다.
재조합. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 이는 대체로 유전자를 클로닝할 수 있고, DNA를 서열결정할 수 있고, 단백질 생성물을 생성할 수 있는 다양한 기술을 설명한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 상기 용어는 또한, 식물 숙주 시스템의 세포 내로 유전자를 이전한 후 생성된 단백질을 설명한다.
재생. 재생은 조직 배양물로부터의 식물체의 발달을 말한다.
조절 서열. 이는 표준이고 당업자에게 공지된, 식물 시스템에서 관심대상의 유전자의 전사 또는 생성된 RNA의 번역을 증가시키고/시키거나 최대화하기 위하여 발현 벡터 내에 포함될 수 있는 서열을 말한다. 이는 프로모터, 펩티드 엑스포트 시그널(export signal) 서열, 인트론, 폴리아데닐화, 및 전사 종결 부위를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 식물체에서 발현 수준이 증가되도록 핵산 제작물을 변형시키는 방법이 본 기술 분야에 또한 일반적으로 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌[Rogers et al., 260 J. Biol. Chem. 3731-38, 1985]; 문헌[Cornejo et al., 23 Plant Mol. Biol. 567: 81,1993] 참조). 단백질 전사 속도에 영향을 주도록 식물 시스템을 엔지니어링함에 있어서, 조절 서열, 예를 들어 긍정적으로 또는 부정적으로 작용하는 서열, 인핸서 및 사일런서(silencer)와, 염색질 구조를 비롯한, 본 기술 분야에 공지된 다양한 요인이 영향을 줄 수 있다. 본 발명은 이러한 요인 중 적어도 하나를 식물체의 엔지니어링에서 이용하여 관심대상의 단백질을 발현시킬 수 있다는 것을 제공한다. 본 발명의 조절 서열은 천연 유전 요소이며, 즉, 변형될 선택된 식물 종으로부터 단리된다.
선발가능 마커. 전형적으로 "선발가능 마커"는 항생제, 제초제 또는 독성 화합물에 대한 일부 종류의 내성을 부여하는 단백질을 코딩하는 유전자이며, 이를 이용하여 형질전환 이벤트를 확인한다. 선발가능 마커의 예에는 스트렙토마이신 내성을 코딩하는 스트렙토마이신 포스포트랜스퍼라아제 (spt) 유전자, 만노스-6-포스페이트를 프룩토스-6 포스페이트로 전환시키는 포스포만노스 아이소머라아제 (pmi) 유전자; 카나마이신 및 제네티신 내성을 코딩하는 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (nptII) 유전자, 하이그로마이신에 대한 내성을 코딩하는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 (hpt 또는 aphiv) 유전자, 설포닐우레아계 제초제에 대한 내성을 코딩하는 아세토락테이트 신타아제 (als) 유전자, 포스피노트리신 또는 바스타와 같은 글루타민 신타아제의 작용을 저해하는 작용을 하는 제초제에 대한 내성을 코딩하는 유전자 (예를 들어, bar 유전자), 또는 본 기술 분야에 공지된 다른 유사한 유전자가 포함된다.
센스 억제. 트랜스제닉(transgenic) 식물체에서 전부의 또는 일부의 내인성 유전자의 하나 이상의 추가 카피의 발현에 의한 내인성 유전자의 발현의 감소.
비중. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "비중"은 밀도를 표현한 것으로서, 감자 품질의 척도이다. 괴경의 비중과, 건조 물질 또는 전체 고형물의 전분 함량 및 백분율 사이에는 높은 상관성이 있다. 더 높은 비중은 더 높은 회수율 및 더 우수한 가공 제품 품질에 기여한다.
T-DNA- 유사. "T-DNA-유사" 서열은 선택된 식물 종으로부터, 또는 선택된 식물 종과 성적으로 양립가능한 식물로부터 단리되고, 아그로박테륨 종 T-DNA와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의, 그러나 100%는 아닌 서열 동일성을 공유하는 핵산이다. T-DNA-유사 서열은 각각이 뉴클레오티드 서열을 다른 폴리뉴클레오티드 내에 통합시킬 수 있는 하나 이상의 경계 서열 또는 경계-유사 서열을 함유할 수 있다.
총 수율. 총 수율은 모든 수확된 괴경의 총 중량을 말한다.
트레일러. 유전자 이후의 (또는 유전자에 대하여 3'인), 전사되지만 번역되지 않는 서열.
전사된 DNA. 유전자와, 이 유전자와 연관된 비번역 리더 및 트레일러 서열 둘 모두를 포함하는 DNA로서, 이는 선행하는 프로모터의 작용에 의해 단일 mRNA로 전사됨.
식물 세포의 형질전환. 식물 세포의 게놈 내로 DNA가 안정하게 통합되는 과정. "안정하게"는 세포 게놈 내에서의 그리고 세포 게놈에 의한 영구적이거나 또는 비-일시적인 폴리뉴클레오티드의 보유 및/또는 발현을 말한다. 따라서, 안정하게 통합된 폴리뉴클레오티드는 형질전환된 세포 게놈 내에서의 고정물인 것으로서 이는 세포 또는 생성된 형질전환된 식물체의 연속 자손을 통하여 복제되고 번식될 수 있다. 형질전환은 본 기술 분야에 잘 알려진 다양한 방법을 이용하여 자연적 또는 인공적 조건 하에서 일어날 수 있다. 형질전환은 아그로박테륨-매개된 형질전환 프로토콜, 바이러스 감염, 휘스커(whisker), 전기천공, 열충격, 리포펙션(lipofection), 폴리에틸렌 글리콜 처리, 미세주입법(micro-injection), 및 입자 분사법(particle bombardment)을 비롯하여 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로 핵산 서열을 삽입하는 임의의 공지된 방법에 의존할 수 있다.
트랜스진. 단백질 코딩 영역을 포함하는, 숙주 게놈 내로 삽입될 유전자. 본 발명의 맥락에서, 트랜스진을 포함하는 요소는 숙주 게놈으로부터 단리된다.
트랜스제닉 식물체. 하나 이상의 트랜스진을 함유하는 유전자 변형 식물체.
변이체. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "변이체"는 특정 유전자 또는 단백질의 표준의, 또는 주어진 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열로부터 벗어나는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 의미하는 것으로 이해된다. 용어 "아이소형", "아이소타입" 및 "유사체"는 또한 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 "변이체" 형태를 말한다. 하나 이상의 아미노산의 부가, 제거 또는 치환에 의해 또는 뉴클레오티드 서열의 변화에 의해 변경되는 아미노산 서열은 "변이형" 서열로 간주될 수 있다. 변이체는 "보존적" 변화를 가질 수 있으며, 여기서, 치환 아미노산은 유사한 구조적 또는 화학적 특성을 가지며, 예를 들어, 류신을 아이소류신으로 대체한 것을 갖는다. 변이체는 "비보존적 변화", 예를 들어 글라이신을 트립토판으로 대체한 것을 가질 수 있다. 유사한 적은 변동은 아미노산 결실 또는 삽입, 또는 이들 둘 모두를 또한 포함할 수 있다. 어느 아미노산 잔기가 치환되거나, 삽입되거나 또는 결실될 수 있는지를 결정하는 가이던스(guidance)는 본 기술 분야에 잘 알려진 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 벡터 엔티아이 스위트(Vector NTI Suite) (미국 메릴랜드주 소재의 인포맥스(InforMax)) 소프트웨어를 사용하여 발견될 수 있다.
덩굴 성숙도. 덩굴 성숙도는 식물체가 계속하여 탄수화물을 이용하고 광합성하는 능력을 말한다. 덩굴 성숙도는 1 내지 5의 척도로 스코어링되며, 여기서, 1 = 죽은 덩굴이고, 5 = 녹색이며 여전히 개화 상태인 덩굴이다.
감자 식물체의 게놈 내로의 바람직한 형질의 삽입은 특별한 어려움을 제시하며, 그 이유는 감자가 사배체이며, 고도로 이형접합성이고, 자식 약세(in-breeding depression)에 대하여 민감하기 때문이다. 따라서, 종래의 육종법을 이용하여 프로세싱하는 동안 N-니트로소-N-(3-케토-1,2-부탄다이올)-3'-니트로티라민 (문헌[Wang et al., Arch Toxicol 70: 10-5, 1995]), 5-하이드록시메틸-2-푸르푸릴 (문헌[Janzowski et al., Food Chem Toxicol 38: 801-9, 2000]), 및 기타 마이야르 반응 생성물 - 돌연변이원성 특성을 가짐 - (문헌[Shibamoto, Prog Clin Biol Res 304: 359-76, 1989])을 비롯하여 더 적은 아크릴아미드 및 덜 유해한 마이야르 반응 생성물을 생성하는 트랜스제닉 감자 식물체를 효율적으로 개발하는 것은 매우 어렵다.
공정 변화, 덱스트로스의 감소, 및 첨가제, 예를 들어 아스파라기나아제, 시트레이트, 및 경쟁 아미노산을 통하여 아크릴아미드를 감소시키기 위하여 몇몇 방법이 시험되었으며, 연구가 계속 진행 중이다. 감자 산업 전체에 걸친 공정 변화의 구현에 요구되는 자본 경비는 수 백만 달러일 것이다. 상기 경비에 더하여, 이러한 공정 변화는 아스파라기나아제 또는 시트레이트와 같은 첨가제와 연관된 잠재적으로 부정적인 풍미를 비롯하여 상당한 결점을 갖는다. 전형적으로, 프라이 제조업자는 프렌치 프라이의 가공 동안 덱스트로스를 첨가하여 원하는 황갈색을 발색시키지만, 덱스트로스는 마이야르 반응을 통한 아크릴아미드의 형성을 또한 증가시킨다. 아크릴아미드의 유의한 감소는 단순히 덱스트로스를 상기 공정으로부터 제외함으로써 일어나지만; 그 후에 대표적인 황갈색은 (아나토(annatto)와 같은 착색제(color)의 첨가를 통한 것과 같은) 다른 방법으로 발색되어야 한다. 다른 착색제의 사용은 상기 갈변 반응을 통하여 발생되는 전형적인 풍미의 부재로 이어진다. 아스파라긴과 같은 반응물을 감소시키기 위한 첨가제의 사용에서의 다른 난제는 냉동 저장 동안 일어나는 수분 이동이며, 이때, 그 결과로 아스파라긴이 표면으로 되돌아가고 아크릴아미드가 증가한다. 마지막으로, 감자가 멍든 후 일어나는 흑변은 프렌치 프라이 및 칩의 가공에 있어서 품질 및 회생에 영향을 준다. 손상된 그리고 멍든 감자는 가공 전에 다듬어져야 하거나 또는 거절되어야 하며, 이는 품질 문제 또는 경제적 손실로 이어진다.
본 발명의 "천연 기술(native technology)" 전략은 흑점 멍에 책임이 있는 폴리페놀 옥시다아제-5 (PPO-5)의 발현, 아크릴아미드 형성에 있어서의 전구체인 아스파라긴의 축적에 책임이 있는 아스파라긴 신테타아제-1 (Asn-1)의 발현, 및/또는 보통 아스파라긴과 같은 아미노산과 반응하여 아크릴아미드를 포함하는 독성 마이야르 생성물을 형성하는 환원당의 축적과 연관된 효소인 포스포릴라아제-L 및 키나아제-R1의 발현을 감소시킴으로써 감자의 작물학적 특성 및 영양적 가치를 감자 산업이 개선시킬 필요성에 대처한다. 괴경에서의 이러한 유전자의 부분적인 또는 완전한 침묵은 아크릴아미드를 생성하는 잠재력을 감소시킨다. 본 발명의 천연 기술의 이용은 상업적으로 가치있는 감자 식물 변종의 게놈 내로 바람직한 형질을 혼입시키는 것을 허용하는데, 이는 상기 감자를 단지 "천연" 유전 물질로 형질전환시킴에 의한 것으로서, 상기 천연 유전 물질은 감자 식물체 또는 감자 식물체와 성적으로 양립가능한 식물체로부터 수득되는 유전 물질이며, 이는 단지 비-코딩 조절 영역을 함유하며, 임의의 외래 유전 물질의 상기 식물체의 게놈 내로의 통합은 없다. 바람직한 형질은 충격-유도된 흑점 멍에 대한 높은 내성, 아크릴아미드 전구체인 아스파라긴의 형성의 감소 및 환원당의 축적의 감소, 결과적으로 아크릴아미드를 비롯한 독성 마이야르 생성물의 축적의 감소, 개선된 품질 및 식품 색상 제어를 포함한다. 이러한 바람직한 형질의 기존의 감자 변종 내로의 혼입은 전통적인 육종을 통해서는 달성이 불가능하며, 그 이유는 감자가 사배체이며, 고도로 이형접합성이고, 자식 약세에 대하여 민감하기 때문이다.
본 발명에서 사용되는 비-코딩 감자 식물 DNA 인서트 서열은 감자 식물 게놈에 대하여 천연이며, 어떠한 아그로박테륨 DNA도 함유하지 않는다. DNA 인서트는 바람직하게는 2개의 발현 카세트를 포함하며, pSIM1278 형질전환 벡터로 칭해지는 형질전환 벡터 내에 삽입된다. 제1 카세트는 아스파라긴 신테타아제-1 유전자 (Asn1) 및 폴리페놀 옥시다아제-5 유전자 (Ppo5) 둘 모두의 단편을 포함하는데, 이는 ADP 글루코스 파이로포스포릴라아제 유전자 (Agp)의 Agp 프로모터와 과립-결합 신타아제 유전자 (Gbss)의 Gbss 프로모터 사이에 역반복체로서 배열된다. 이러한 프로모터는 대부분 괴경에서 활성을 갖는다. 제2 카세트의 기능은 전분 연관된 유전자 다이키나아제-R1 (R1) 및 포스포릴라아제-L 유전자 (PhL)의 프로모터를 침묵시키는 것이다. 이 카세트는 제1 카세트와 동일한 Agp 및 Gbss 프로모터에 작동가능하게 연결된, 전분 연관된 유전자 다이키나아제-R1 (R1) 및 포스포릴라아제-L 유전자 (PhL)의 프로모터의 단편으로 이루어진다. 이러한 발현 카세트는 외래 DNA를 함유하지 않으며, 단지 선택된 식물 종으로부터 또는 선택된 식물 종과 성적으로 양립가능한 식물체로부터 유래된 DNA로 이루어진다.
본 발명에서 사용되는 상업적으로 가치있는 감자 식물 변종으로는 레인저 러셋이 있다. 이러한 전 계절 변종은 1991년에 출시되었다. 레인저 러셋은 베르티실리움(Verticillium) 위조병, 바이러스, 잎말이병 및 망형 괴사, 및 푸사륨(Fusarium) 건부병에 대하여 러셋 버뱅크(Russet Burbank)보다 더 큰 내성을 가지며, 공동병에 대하여 고도의 내성을 갖는다. 레인저 러셋의 식물체는 크고 똑바로 확산되며, 줄기는 두껍고, 녹색인데, 이는 충분한 일광에서 담갈색 내지 담자색일 수 있다. 잎은 크고, 넓으며, 중간 녹색이다. 꽃은 풍부하며, 생존가능한 화분을 생성한다. 싹은 녹색이고, 이때 기부(base) 및 꽃자루는 자주색이고 짧은 연모의 양은 중간 정도이다. 화관은 중대형이고, 자주색이고, 꽃밥은 밝은 황색이다. 레인저 러셋은 고 수율의 우수한 품질, 높은 비중의 괴경을 생성하는데, 이는 길고 약간 편평하며, 굽기 및 프렌치 프라이로의 가공에 적합하다. 괴경은 더뎅이병 및 흑점 멍에 걸리기 쉽다. 레인저 러셋은 러셋 버뱅크보다 더 일찍 성숙하며, 중간 길이 저장 변종으로 간주될 것이다. 이 변종은 임성이며 주로 미국 북서부에서 재배되고, 이는 특히 프렌치 프라이의 생성을 위한 것이다.
본 발명은 마커라기보다는 오히려 폴리머라아제 연쇄 반응을 이용하여 확인되는, 형질전환 벡터 pSIM1278로 형질전환된, 그리고 성공적으로 번식된, 상당한 시장 가치의 감자 변종 - 즉, 레인저 러셋 - 을 제공한다. 본 발명의 감자 식물 변종 F10의 괴경으로 제조된 식품이 또한 제공된다. 감자 재배품종 F10은 경제 협력 개발 기구(Organization for Economic Cooperation and Development; OECD)에 의해 하기의 독특한 식물 변종 식별자를 갖는다: SPS-ØØF10-7.
천연 DNA를 이용한 표적화된 유전자 침묵은 감자 식물 변종 F10의 괴경에서의 표적하된 유전자의 RNA 전사체의 수준을 감소시킨다. Asn1 및 Ppo5 유전자 침묵은 전분 연관된 유전자인 키나아제-R1 (R1) 및 포스포릴라아제-L (PhL)을 추가로 저해하지 않고서도 아크릴아미드 형성을 2 내지 4배만큼 유의하게 감소시키기에 충분하다. 따라서, 본 발명의 인트라제닉 감자 식물 변종 F10의 괴경은 튀길시에 또는 구울시에 아크릴아미드 형성의 감소와 연관된, 자유 아미드 아미노산 아스파라긴 및 글루타민의 비의 감소를 비롯한, 고도로 바람직한 형질을 포함한다. 구체적으로, 본 발명의 감자 변종 F10은 자유 아스파라긴 함량의 2 내지 4배 초과의 감소, 및 흑점 멍과 연관된 변색의 감소를 특징으로 한다. 더욱이, 본 발명의 감자 변종 F10은 저장 동안 전분이 환원당인 글루코스 및 프룩토스로 분해되는 것의 지연을 나타낸다. 전분의 당으로의 전환의 기능장애는 추가로 노화 스위트닝 및 아크릴아미드 형성을 감소시키고, 열-유도된 갈변을 제한한다.
따라서, 본 발명의 감자 변종 F10은 감자 산업 및 식품 시장에서 극도로 가치있으며, 그 이유는 그 괴경이 열 가공시에 유의하게 더 적은 아크릴아미드를 생성하고, 어떠한 잠재적으로 유해한 외래 유전자도 지니지 않기 때문이다.
실시예
본 발명은 천연 기술을 이용하여 천연 비-코딩 DNA를 선택된 감자 식물 변종의 게놈 내에 통합시켜서 새로운 인트라제닉 감자 식물 변종을 개발한다. 본 방법은 형질 확인, 벡터의 설계, 벡터의 아그로박테륨 내로의 혼입, 수용 감자 변종의 선택, 식물체 형질전환, 개방 판독 프레임(open reading frame)의 부재의 증거, 및 새로운 감자 식물 변종이 단지 천연 DNA를 함유한다는 확증을 포함한다. 본 발명의 감자 재배품종 F10은 그의 비형질전환 상대보다 흑점 멍에 대하여 더 큰 내성을 갖고, 더 적은 양의 수크로스를 가지며, 아크릴아미드를 형성하는 잠재력이 저하된다.
실시예 1. pSIM1278 형질전환 벡터
본 발명에서 사용한 형질전환 벡터 pSIM1278은 pSIM106으로부터 유래되었는데, 이는 0.4 kb 감자 식물 DNA 단편 (젠뱅크 등록 번호 AY566555로 기탁됨)을, 플라스미드 pVS1 및 pBR322로부터의 박테리아 복제 기점 및 박테리아의 카나마이신에 대한 내성을 위한 nptIII 유전자를 지닌 pCAMBIA1301 (오스트레일리아 캔버라 소재의 캄비아(CAMBIA))의 5.9 kb SacII-SphI 단편과 라이게이션시킴으로써 생성하였다. Ubi-3 프로모터 (문헌[Garbarino and Belknap, 1994])가 선행하고 Ubi-3 터미네이터가 뒤에 오는 아그로박테륨 ipt 유전자를 포함하는 발현 카세트를 2.6 kb SacII 단편으로서 상기 벡터 골격 (문헌[Rommens et al., 2004]) 내에 도입하였다. 2개의 침묵 카세트를 지닌 천연 10 kb DNA 절편을 pSIM106의 DNA 인서트 내로 삽입하여 pSIM1278을 생성하였다. 이 벡터를 모든 형질전환에 사용하였다. pSIM1278 벡터 지도를 도 1에 나타낸다. 벡터 골격 영역은 이것이 9,957 bp 위치에서 시작하여 19,468 bp 위치에서 끝나는 바와 같이 9,511 bp이다. 골격 DNA는 주로 박테리아 DNA로 이루어지며, 식물 형질전환 전 DNA 인서트의 지지 유지를 제공한다. 골격 부분은 식물 세포 내로 이전되지 않는다. 골격의 다양한 요소가 표 1에 기재되어 있다.
[표 1]
Figure pct00001
실시예 2. 식물 DNA 인서트 및 그의 개방 판독 프레임(ORF)
pSIM1278에서 사용되는, 측면에 존재하는 경계 서열을 포함하는 DNA 인서트 영역은 길이가 10,147 bp로서, 19,469 bp 내지 19,660 bp 및 1 bp 내지 9,956 bp이다. 상기 DNA 인서트는 천연 DNA만으로 이루어지며, 감자 게놈 내로 안정하게 통합된다. DNA 인서트 또는 이의 기능성 부분은 본 발명의 감자 식물 변종에 통합된 벡터 pSIM1278의 유일한 유전 물질이다. DNA 인서트는 도 2 및 하기 표 2에 설명되어 있다.
[표 2]
Figure pct00002
Figure pct00003
본 발명의 감자 라인 F10을 생성하는 데 사용한 표 2에 기재된 DNA 인서트는 인접 유전자를 활성화시키지 않으며 감자 식물 변종 F10의 표현형에 악영향을 주지 않는다. 게다가, 본 발명의 감자 식물 변종 F10은 DNA 인서트에 의해 코딩되는 개방 판독 프레임과 연관된 신규한 단백질을 생성하지 않는다.
실시예 3. 아그로박테륨 주 및 형질감염
C58-유래된 아그로박테륨 주 AGL1을 초독성(hyper-virulent) 플라스미드 pTiBo542의 트랜스퍼(transfer) DNA를 정확하게 결실시킴으로써 개발하였다 (문헌[Lazo et al., 1991]). 일반적인 재조합 유전자 (recA)에서의 트랜스포존(transposon) 삽입은 재조합 플라스미드 벡터, 예를 들어 pSIM1278 (도 1)을 안정화시킨다. AGL1은 카르베니실린 및 리팜피신에 대한 내성을 나타내며, 티멘틴을 이용하여 형질전환된 감자 조직으로부터 제거된다.
레인저 러셋 변종의 스톡(stock) 식물체를 3%의 수크로스 및 2 g/l의 젤라이트(gelrite)를 함유하는 40 ml의 절반-강도 M516 (육묘용 배지(propagation medium))을 포함하는 마젠타 박스(magenta box)에서 유지하였다. 4 내지 6 mm의 감자 절간 세그먼트를 4주령의 식물체로부터 절단하고, pSIM1278을 지닌 아그로박테륨 AGL1 주로 감염시키고, 3%의 수크로스 및 6 g/l의 한천을 함유하는 조직 배양 배지 (동시 배양 배지)로 옮겼다. 2일 후, 감염된 외식체를 3%의 수크로스, 6 g/l의 한천 및 150 mg/l의 티멘틴을 함유하는 M404 배지로 옮겨서 아그로박테륨을 제거하였다 (호르몬-무함유 배지). 이 방법의 상세 사항은 문헌[Richael et al. (2008)]에 기재되어 있다.
1개월 후, 감염된 외식체를 임의의 합성 호르몬이 결여된 신선 배지로 옮기고, 24℃에서 16시간의 광주기 하에서 퍼시벌(Percival) 성장 챔버에서 인큐베이션하였는데, 여기서 상기 외식체는 싹을 형성하기 시작하였다. 많은 싹이 ipt 유전자를 발현하였으며 사이토키닌 과다생성 표현형을 나타냈고, 이러한 싹은 추가의 분석에 고려하지 않았다. PCR 유전자형 결정은, 나머지 싹의 약 0.3 내지 1.5%가 P-DNA의 적어도 일부를 함유하는 한편 ipt 유전자는 결여됨을 입증하였다. 따라서, 어떠한 마커도 형질전환된 식물체를 선발하는 데 사용하지 않았다. ipt-기반의 마커-무함유 식물체 형질전환에 대한 상세 사항은 문헌[Richael et al. (2008)]에 공개되었다.
아그로박테륨의 제거 공정을 외식체 감염 2일 후에 시작하였다. 이 목적을 위하여, 살아있는 아그로박테륨이 부재한다고 입증될 때까지 조직에 티멘틴 항생제 (150 mg/L)를 가하였다. 형질전환된 이벤트의 줄기 단편을 영양 브로쓰(nutrient broth)-효모 추출물(NBY 배지)에서 28℃에서 2주 동안 인큐베이션함으로써 (2회 반복) 증거를 수득하였다. 97 CFR 파트(Part) 340에 따르면, 단지 살아있는 아그로박테륨이 부재할 때에만 형질전환된 식물체를 수송하여 야외에 식재하였다.
감자 식물 변종 F10을 DNA 겔 블롯(blot) 분석에 의해 분석하여 통합된 DNA 인서트 서열의 구조 및 카피수를 결정하고 벡터 골격 서열의 부재를 확증하였다. 게다가, 분자적 특성 확인을 이용하여 DNA 인서트 측면에 존재하는 접합부의 서열을 결정하고 삽입된 DNA의 안정성을 보여 주었다. 접합부의 서열결정 정보는 인트라제닉 감자 식물 변종 F10에 있어서의 특이적 PCR 시험을 개발하기 위한 근거를 제공하였다. 감자 재배품종 F10은, 다양한 DNA 절단물을 AGP, ASN, PHL 및 GBS 분자 프로브와 혼성화시켰을 때의 혼성화 결과로부터 추정되는 바와 같이 단일한 전 카피(complete copy)의 DNA 인서트를 함유하는 것으로 밝혀졌다.
실시예 4. 벡터 골격 DNA의 부재 증거
많은 상업적 트랜스제닉 작물과는 달리, 본 발명의 감자 재배품종 F10은 하기 3가지의 상이한 방법에 의하면, 벡터 골격 DNA와 같이 형질전환에 사용된 아그로박테륨-유래된 DNA 서열이 부재하는 것으로 확증되었다: 1) 먼저, 벡터 골격에서의 음성 선발가능 아이소펜테닐 아이소머라아제 (ipt) 마커 유전자의 존재 또는 부재를 결정하였으며, 그 이유는 아그로박테륨으로부터의 ipt 유전자 발현 카세트를 포함하는 골격 DNA의 식물 세포로의 우연한 이전이 ipt 유전자 발현, 그리고 그 결과, 사이토키닌계 호르몬 아이소펜테닐아데노신의 형성을 트리거링하기 때문임, 2) 그 후, 서던 블롯(Southern blot) 혼성화를 제1 스크리닝법을 통과한 형질전환된 감자 식물체에서 사용하여 골격 DNA의 부재를 확증함, 3) 그 후, DNA 인서트 경계 영역과 측면에 존재하는 골격 DNA 또는 DNA 인서트 측면에 존재하는 골격 DNA 내의 영역 사이의 접합부를 나타내는 단편을 증폭시키도록 PCR을 설계함. 이 방법의 효능을 양성 대조군으로서 pSIM1278 DNA를 사용하여 확증하였다. 본 발명의 감자 재배품종 F10은 벡터 골격 DNA의 존재를 나타내는 PCR 밴드를 생성하지 않았다.
실시예 5. 삽입된 DNA의 안정성
DNA 겔 블롯 혼성화 및 형질 평가 둘 모두를 이용하여 DNA 인서트의 안정성을 원래의 형질전환체에서, 그리고 또 번식된 식물 물질에서 평가하였다. 이러한 연구는 인트라제닉 이벤트가 혼입된 형질을 일관되고 신뢰가능한 방식으로 발현하였음을 보장하기 위하여 실시하였다. 불안정성은 희귀한 재조합 이벤트에 의해 트리거링될 수 있거나 또는 메틸화에 의해 또한 야기될 수 있다. 감자는 보통 클론에 의해 번식되기 때문에, 성적으로 번식된 작물에 대한 표준 평가는 직접적으로 적용가능하지 않았으며, 종자라기보다는 오히려 괴경을 이용하여 후속 세대를 규정하였다. DNA 블롯 혼성화의 결과는 일관된 밴드가 다수의 세대에서 존재하였으며 이에 따라 안정성을 나타낸다는 것을 입증한다. 안정성에 대한 추가의 증거는 제1 세대 및 제2 세대 괴경 종자에서의 형질의 효능을 확증함으로써 수득하였다.
시험관 내에서 번식시키고 토양에 결코 식재하지 않은 식물체의 잎으로부터 DNA를 추출하여 이 DNA를 평가함으로써 원래의 형질전환된 물질 (G0)에서 DNA 인서트 안정성을 입증하였다. 제1 세대 (G1) 분석에 있어서, 각각의 인트라제닉 변종으로부터의 2가지의 번식된 식물체와, 각각의 대조군으로부터의 하나의 식물체를 온실에서 식재하고; 각각의 식물체로부터 수확한 괴경 중 하나를 식재하여 G1 식물체로부터의 잎을 수득하고, 이를 이용하여 DNA를 단리하고 G1 세대를 평가하였다. 이 세대로부터의 괴경을 다시 식재하고, 생성된 G2 식물체의 잎에서 그 세대의 특성 확인을 허용하였다.
본 발명의 레인저 러셋 감자 재배품종 F10으로부터 단리한 DNA와 GBS 및 AGP 프로브의 혼성화는 각각의 실험에서 3개의 공통 밴드를 나타냈다 (GBS 프로브의 경우 7.4, 7.7, 9.4 kb 및 AGP 프로브의 경우 1.2, 4.9, 및 6.2 kb). 이러한 밴드는 비변형 게놈의 DNA 단편을 나타낸다. 모든 인트라제닉 물질로부터 단리한 DNA에서의 2개의 추가 밴드 - 하나는 내부 DNA 인서트 단편을 나타내는 2.2 kb 밴드이며, 다른 하나는 DNA 인서트 접합 단편 (GBS를 이용한 F10의 경우 7.3 kb, AGP를 이용한 F10의 경우 2.5 kb)을 나타냄 - 의 존재는 원래의 형질전환체 (G0)의 인서트가 제1 및 제2 식물생장 세대 G1 및 G2 내로 들어가 안정하게 남아 있음을 나타냈다.
Ppo 활성에 대한 카테콜 분석은 F10 변종에 있어서의 DNA 인서트 안정성에 대한 추가 증거를 제공하였으며, 그 이유는 모든 F10 괴경이 여전히 착색되지 않은 채로 있었기 때문이고 (도 3), 반면에, 비형질전환된 대조 물질은 염색되었다. 이는 변종 F10이 2년간의 야외 시용 후 G2 괴경에서 Ppo5 유전자를 침묵시키는 그의 능력을 유지하였음을 입증하였다. 야외 시용용 물질의 준비는 삽입된 유전 물질의 안정성에 영향을 주지 않고서 반복된 조직 배양 및 식물생장 세대를 포함하였다.
실시예 6. 접합부 분석 및 변종-특이적 검출
어댑터(Adapter) 라이게이션-매개된 PCR 또는 TAIL PCR(Thermal Asymmetric Interlaced PCR) 중 어느 하나를 이용하여 적어도 하나의 DNA 인서트/측면 식물 DNA 접합부를 서열결정하였다. 접합부 서열을 이용하여 감자 재배품종 F10을 위한 프라이머를 설계하고, 이 프라이머를 변종-특이적 PCR-기반 검출법용으로 적용하였다. 개발된 상기 방법을 이용하여 야외 및 저장에 있어서 식물체 및 괴경을 모니터링하여 괴경 또는 가공된 식품에서 인트라제닉 물질의 부재를 확증하고 유기 종자의 순도를 보장하였다.
실시예 7. 유전자 침묵의 효능 및 조직-특이성
유전자 침묵법을 이용하여 Asn1, Ppo5, PhL, 및 R1 천연 단백질의 활성을 저하시키고, 단백질의 양이라기보다는 오히려 전사체 수준을 평가하여 새로운 표현형 형질을 분자 수준에서의 변화에 연관시켰다.
잎 및 줄기에서의 ASN (아스파라긴) 형성에 연루된 Asn1 유전자의 강한 침묵은 성장에 악영향을 줄 수 있기 때문에, 괴경- 및 포복지-특이적 프로모터이고 광합성-활성 조직 및 뿌리에서 훨씬 덜한 활성을 갖는 Agp 프로모터 및 Gbss 프로모터를 사용하여 괴경 및 포복지에서 유전자 침묵을 구동시켰다. 식물 변종 F10 및 그의 비형질전환된 상대의 다양한 조직에서의 4가지의 표적화된 유전자의 전사체 수준을 노던 블롯(Northern blot) 분석에 의해 결정하였다.
비형질전환된 대조군의 괴경에서, 전사체 수준은 Asn1, PhL, 및 R1 유전자에 대해서는 "높고" (노던 블롯 혼성화에 의해 용이하게 검출가능함) Ppo5 유전자에 대해서는 "낮았다". 노던 블롯의 비교에 의하면, 온실 및 야외로부터의 괴경에서 Asn1, Ppo5, 및 PhL이 유사한 수준으로 발현되었음이 나타났다. 이와는 대조적으로, 야외로부터의 괴경에서보다 온실-재배된 대조 괴경에서 약간 더 효과적으로 R1 유전자가 침묵하였다.
변종 F10의 괴경에서의 Asn1 및 Ppo5 유전자에 있어서의 강하게 감소된 전사체 수준은 저-아크릴아미드 잠재력과 연관되며, 감소된 변색은 흑점 멍과 연관되었다.
PhL 유전자에 있어서의 전사체 수준은 라인 F10의 괴경에서 부분적으로 감소되었다. 이러한 변화는 감소된 양의 글루코스 및 프룩토스와 관련되었다. R1 전사체는 전분의 당으로의 분해의 제한을 돕도록 F10의 괴경에서 부분적으로 감소되었다 ("휘스퍼드(whispered)").
Asn1, Ppo5 및 R1 유전자는 비형질전환된 식물체의 포복지에서 낮은 수준으로 발현되었다. 이와는 대조적으로, 대조군에서의 높은 전사체 수준은 PhL 유전자와 연관되었다.
Asn1 및 Ppo5 유전자의 전사체 수준은 대조 포복지에서보다 레인저 러셋 F10 온실-재배 식물체로부터의 포복지에서 더욱 더 낮았다. 이러한 변경은 예상되었으며, 임의의 원하지 않거나 또는 예상하지 않은 새로운 표현형에 관련되지 않는다. PhL 유전자의 발현은 인트라제닉 변종 F10의 포복지에서 또한 하향조절되었다.
R1 유전자의 전사체의 양은 변종 F10의 포복지에서 약간 감소되었다 ("휘스퍼드"). 이러한 분자적 변화는 전분의 당으로의 제한된 분해에 기여하였다.
잎 조직에서, Asn1 유전자의 전사체 수준은 라인 F10에 있어서 그의 비형질전환된 상대보다 더 낮았다. Ppo5 유전자 발현에 있어서의 전사체 수준은 모든 경우에 검출가능하지 않았으며, 반면에, PhL 유전자의 수준은 원래의 변종 레인저 러셋 및 형질전환된 유도체 F10 사이에서 일관되게 높았다. R1 유전자의 전사체 수준은 변종 F10에서 그의 대조군과 비교할 때 변경되지 않았다.
줄기 조직에서, Asn1 유전자 전사체 수준은 F10 및 그의 대조군의 이벤트에 있어서 유사하였다. Ppo5 유전자의 전사체 수준은 본 발명의 변종 F10에서 감소되었다. PhL 유전자 발현은 라인 F10 및 그의 대조군에서 매우 유사하였으며, R1 유전자 발현은 감소되지 않았다.
뿌리 조직에서, Asn1 및 Ppo5 유전자 둘 모두의 전사체 수준은 변종 F10에서 감소되었다. 이러한 결과는, 침묵을 구동시키는 데 사용된 프로모터가 지하 조직에서 부분적으로 기능성임을 나타냈다.
꽃 조직에서, Asn1 유전자 전사체 수준은 원래의 변종 레인저 러셋에서보다 본 발명의 변종 F10에서 더 낮았다. 전사체는 Ppo5 유전자의 경우 검출가능하지 않았으며, R1 유전자의 발현 수준은 대조군과 유사하였다. 변종 F10은 대조군보다 더 많은 PhL 전사체를 생성하였다.
이러한 결과는 Asn1 및 Ppo5 유전자의 발현 수준이 감자 변종 F10에서 괴경 및 포복지에서 하향조절되고 R1 및 PhL 유전자는 변종 F10에서 괴경 및 포복지에서 적어도 부분적으로 침묵화됨을 입증하였다. 침묵은 괴경 및 포복지에서 가장 효과적이었다.
선택된 감자 변종 F10은 Asn1 및 Ppo5 유전자의 발현 수준에 있어서 R1 및 PhL 유전자의 것에서보다 더 강하게 영향을 받았다. 이러한 결과는 (1) Ppo 단백질 및 자유 ASN의 형성을 가능한 가장 큰 정도로 방지하고 (2) 전분의 글루코스 및 프룩토스로의 전환을 단지 부분적으로 차단하려는 본 발명자의 의도와 일치하였다.
괴경 및 포복지 이외의 조직에서의 전사체 수준의 가끔의 변화는 괴경/포복지-특이적 프로모터의 약간의 유출성(leakiness)을 입증하였다. 침묵 카세트의 발현을 통하여 괴경에서 생성된 작은 RNA는 다른 조직, 특히 뿌리 및 줄기 내로 이동하는 것이 또한 가능하다 (문헌[Molnar et al., 2010]). 괴경 및 포복지 이외의 조직에서의 변경된 발현 수준의 대부분의 경우에서, 차이는 적었다. 인트라제닉 감자 재배품종 F10의 특정 조직에서의 하향조절된 전사체 수준의 요약을 표 3에 나타낸다. 표 3에서, A = Asn1, P = Ppo5, L = PhL, 및 R = R1이다. 표 3에서 밑줄이 그어진 문자는 강하게 (>2배) 하향조절된 유전자 발현 수준을 나타내며, 발현 수준은 단지 2배 미만만큼 하향조절된다.
[표 3]
Figure pct00004
실시예 8. 현장 성능 및 괴경 평가
2009, 2010, 및 2011년 시용한 것을 기계적으로 식재하여 수확을 조장하고 인트라제닉 감자가 비변형된 물질과 별도로 유지되었음을 보장하였다. 2009년 평가에 있어서, 각각의 이벤트 및 대조 변종으로부터의 "핵 종자" 미니괴경을 이용하여 4 또는 5개의 단열(single-row) 부지(plot) (20개의 미니괴경/부지)에 식재하고, 이에 의해 상기 부지는 경작지 전체에 걸쳐 블록 내에 랜덤하게 분포되었다. 이러한 랜덤화된 완전 블록 설계(randomized complete block design; RCB)는 새로운 감자 변종 및 이벤트의 평가에 전형적이다. 2010년 및 2011년에 취해진 접근법은 3개의, 이벤트당 랜덤 부지 및 부위당 대조군을 이용하기 위한 것이었는데 이는 또한 블록의 수와 동일한 수 또는 반복 (이벤트당 부지)을 갖는 RCB 설계를 이용하였다. 2010년에 각각의 부지는 20개 종자 조각의 3개의 열로 이루어졌으며, 상기 조각 각각은 레인저 러셋에 있어서 2009년에 미국 네브래스카주 체리 카운티에서 생산된 제1 세대 (G1) 괴경으로부터의 것이었다. 2011년의 시용에 있어서의 레인저 러셋 종자는 2010년에 미국 네브래스카주 체리 카운티에서 생산된 제2 세대 (G2)였다. 모든 시용에서, 인트라제닉 라인의 종자를 그의 비변형된 대조군과 유사하게 취급하였다. 야외 재배된 괴경은 종자로서 미니괴경에 비하여 바람직하며, 그 이유는 야외 재배된 괴경이 더 높은 괴경 수율 및 품질을 생성하는 더활기차고 균일한 식물체를 생성하기 때문이다.
각각의 부지를, 일부의 경우에 표준 모니터링 척도를 이용하여, 인공적으로 유도되지 않지만 성장철 동안 자발적으로 일어날 수 있는 환경 스트레스, 질병 및 곤충에 대한 차등적 응답에 대하여 정성적으로 평가하였다. 2009년, 2010년 및 2011년에 빠른 열 폐쇄(early row closure) 및 개화 (4월에 평가한 플로리다에서의 시용을 제외하고는 대부분의 트레일(trail)에 있어서 6월-7월) 직전 또는 그 동안 중생(mid-season) 모니터링을 행하여 식물체의 생장력(vigor), 잎의 색, 잎의 크기, 잎말이, 질병 증상 (존재/부재), 및 곤충-연관된 식물 손상을 평가하였다. 2011년에, 성장부에 공통인 특정 곤충, 질병 및 비생물적 스트레스원(abiotic stressor)을 평가하였다. 질병 및 곤충 압박(insect pressure)은 일반적으로 중생 및 만생(late season) 동안 최고이지만, 식물체를 7월 내지 9월 (플로리다 시용의 경우 3월 내지 5월)의 병원체 및 곤충에 의해 야기되는 증상에 대하여 모니터링하였다. 괴경 성숙 및 만생 껍질 경화를 보장하도록 의도된 과정인 덩굴 죽이기 이전에 덩굴 성숙도 및 질병의 만생 모니터링을 1회 수행하였다. 덩굴을 베거나 또는 도리깨질함으로써 또는 제조업자의 권고에 따라 레글론(Reglone) (미국 미네소타주 로즈빌 소재의 제이알 존슨(JR Johnson))과 같은 승인된 제초제를 사용함으로써 덩굴 죽이기를 유도한다. 이때에, 식물체를 질병 증상 및 곤충에 의한 손상에 대하여 또한 평가하였다. 일부의 경우에, 질병 증상이 확인될 때, 발아 시험을 또한 행하여 상기 발견을 확증하였다.
평균, 표준 편차 및 90% 신뢰 구간을 JMP 9.0.2를 사용하여 계산하였다. 이 실험에 포함시킨 모든 종래의 변종의 최소 및 최대 평균 값 (연도*장소*엔트리)을 수득함으로써 종래의 변종 범위를 생성하였다. 레인저 러셋 변종에 있어서의 모든 특성을 다수의 연도 및 장소로부터의 데이터의 조합에 의해 JMP 9.0.2에서 분석하였다.
실시예 9. 감자 재배품종 F10의 특성확인의 요약
감자 변종 F10은 흑점 멍에 책임이 있는 효소의 발현을 감소시킴으로써 품질을 개선시키기 위한 그리고 반응물, 즉 아스파라긴 및 환원당의 농도의 저하를 통하여 아크릴아미드를 감소시키기 위한 감자 산업의 필요성에 대처한다. 감자 변종 F10을 감자 식물 게놈에 대하여 천연인 그리고 외래 DNA, 아그로박테륨 DNA, 바이러스 마커 또는 벡터 골격 서열을 함유하지 않는 핵산 서열로 형질전환시켰다. 게다가, 작물학적 연구를 행하여 상기 이벤트가, 형질과 연관된 특성을 제외하고서는 종래의 대조군과 동일하게 성장하였음을 보장하였다.
작물학적 특성
2009년, 2010년 및 2011년에 재배한 감자 변종 F10 이벤트 및 대조군의 작물학적 특성의 평가를 표 4 내지 표 7에 나타낸다. 가능할 경우 통계적 방법에 의해 결과를 분석하였다. 종합적으로, 상기 데이터는 레인저 러셋 대조군과 F10 레인저 러셋 이벤트 사이에는 주요한 차이점이 없음을 시사한다.
표 4는 변종 F10에 대하여 시험한 각각의 특성에 대한 위치 연도의 수를 나타낸다. F10 및 레인저 러셋 대조군의 작물학적 특성을 표 5에 나타낸다. 작물학적 특성 중 7가지에 대하여 F10과 대조군 사이에서 통계적으로 유의한 차이는 탐지되지 않았다. 덩굴 성숙도 등급 데이터를 통계적으로 비교할 수 없었으며, F10의 관찰된 값은 조합된 종래의 변종의 범위 밖이었다 (각각 2.65 대 3.00-3.50). 표 5에서, 식물체당 줄기 데이터는 단지 2011년도로부터의 것이며; 종래의 변종 (ConV) 범위는 종래의 레인저, 버뱅크 및 아틀란틱(Atlantic) 변종의 평균 값의 범위와 동일하며; NA는 통계적 비교가 가능하지 않았음을 의미한다.
F10 및 레인저 러셋 대조군의 수율 및 등급 특성을 표 6에 나타낸다. 총 수율, 비중, 높은 당, 또는 슈가 엔드(sugar end)에 대하여 통계적으로 유의한 차이는 탐지되지 않았다. 통계 분석은 전체 내부 결함에 대하여 가능하지 않았지만, F10에 있어서의 값은 통상적인 변종 범위 내에 있었다. F10과 대조군 사이에는 3가지의 통계적으로 유의한 차이가 총 수율 (각각 53.7 대 60.0), 4 내지 6 온스 카테고리 (23.9 대 18.4), 및 10 내지 14 온스 카테고리 (13.9 대 19.3)에 대하여 탐지되었지만, F10의 값은 통상적인 변종 범위 내에 있었다. 표 6에서, 비중 데이터는 단지 2011년도로부터의 것이며; 통상적인 변종 (ConV) 범위는 종래의 레인저 및 버뱅크 변종의 평균 값의 범위와 동일하며; NA는 통계적 비교가 가능하지 않았음을 의미한다.
F10 및 레인저 러셋 대조군의 꽃의 색을 표 7에 나타낸다. 자색/혼합 꽃 및 백색 꽃 둘 모두가 각각의 엔트리에 있어서 상이한 부지에서 관찰되었다.
[표 4]
Figure pct00005
[표 5]
Figure pct00006
[표 6]
Figure pct00007
[표 7]
Figure pct00008
감자 재배품종 F10에 대하여 표 4 내지 표 7에 제시된 데이터를 기반으로 하면, 비형질전환된 레인저 러셋 변종과 감자 재배품종 F10 사이에는 작물학적 특성, 꽃 색상, 수율 및 등급, 및 생태학적 상호작용에 있어서 주요한 차이점이 없다는 결론을 내릴 수 있다. 따라서, 다년간의 데이터를 기반으로 하면, 레인저 러셋 변종 F10은 잡초 우거짐 또는 식물 해충 잠재력의 결과로서 환경에서 지속될 상당한 위험성을 전혀 나타내지 않는다.
흑점 멍 내성
흑점 멍은 감자 산업에 있어서 가장 중요한 품질 쟁점 중 하나를 나타내는 멍든 괴경에 영향을 주는 변색이다. 상기 상태는 손상된 색소체로부터 세포질 내로의 폴리페놀 옥시다아제 (Ppo)의 누출의 결과이다. 세포질에서, 상기 효소는 폴리페놀을 산화시키고, 그 후 이것은 짙은 침전물을 형성한다. pSIM1278 DNA 인서트의 2개의 침묵 카세트 중 하나는 조절 요소들 사이의 역반복체로서 위치하는 솔라눔 베루코숨(Solanum verrucosum) 유래의 Ppo5 유전자의 단편의 2개의 카피를 함유한다. 이러한 역반복체의 발현은 감자 Ppo5 유전자의 침묵을 트리거링하며, 흑점 멍의 발생률을 유의하게 감소시킨다.
흑점 멍에 민감한 대조 레인저 러셋 변종 및 감자 재배품종 F10의 야외-재배된 괴경을 흑점 멍 내성에 대하여 2가지 방식으로 분석하였다.
괴경 변색은 폴리페놀 옥시다아제의 활성에 의해 야기되는데, 이는 카테콜을 포함하는 페놀을 산화시켜서, 색소를 생성하도록 빠르게 중합되는 화합물을 생성한다. 흑점 멍 내성에 대하여 시험하는 간접적인 방법은 1 ml의 카테콜 (50 mM MOPS 중 25 mM, pH6.5)을 괴경의 절단 표면 상에 피펫팅하는 것 및 짙은 갈색의 침전물의 Ppo-의존성 발색에 대하여 모니터링하는 것을 기반으로 한다. 짙은 갈색의 침전물의 Ppo-의존성 발색을 20분 후 평가하였다. 레인저 러셋 대조군 및 변종 F10의 괴경을 2009년에 미국 인디애나주 캐니언 카운티에서 재배한 3가지의 상이한 식물체로부터 수확하였다. 감자 재배품종 F10에 있어서의 카테콜 분석 결과를 도 3에 나타낸다. 도 3에서 보이는 바와 같이, 레인저 러셋 대조군은 흑점 멍을 나타내는 짙은 갈색으로 변하였으며, 반면에 감자 재배품종 F10은 짙은 갈색으로 변하지 않았으며, 이는 F10이 비형질전환 레인저 러셋 대조군보다 흑점 멍에 대하여 더 큰 내성을 가짐을 나타내는 것이었다.
멍 내성에 대한 제2 분석 방법은 2009년에 미국 인디애나주 캐니언 카운티로부터 수확한 각각의 대조군 및 감자 재배품종 F10의 9개의 괴경을 브루즈 배럴(bruise barrel) (회전 드럼)에서 10회 회전시키고, 실온에서 3일 동안 인큐베이션시키고, 이어서 기계적으로 껍질을 벗기고, 그 후 흑점 멍 및 라인섀터(lineshatter) (섀터 멍) 반점 둘 모두의 수를 계수함에 의한 것이었다. 표 8은 결과를 나타내며, 3회 실험의 결과의 평균으로서 제시되고, 나타낸 오차 막대(error bar)는 평균의 표준 오차를 나타낸다. 스튜던트 양측(Student's two-tailed) t-검정 (p <.05)을 이용하여 유의도를 결정하였다.
[표 8]
Figure pct00009
표 8에 나타낸 바와 같이, 배럴 멍 시험은 본 발명의 감자 F10에서 흑점 멍 수준의 대략 5배 감소를 나타냈다. 이러한 결과는 변종 F10의 괴경이 흑점 멍에 대하여 비형질전환된 대조 레인저 러셋 변종의 괴경보다 더 큰 내성을 갖고, pSIM1278의 DNA 인서트는 흑점 멍과 연관된 충격-유도된 변색의 감소로 이어짐을 나타낸다.
아스파라긴 및 아크릴아미드 수준
아스파라긴 신테타아제 유전자의 침묵은 감자 변종 F10에 있어서 자유 아스파라긴을 평균 76% 감소시켰다. 아크릴아미드를 형성하도록 마이야르 반응에서 환원당과 조합되는 아스파라긴의 더 낮은 수준은 튀김에서 아크릴아미드를 평균 60% 감소시킨다. 레인저 러셋 대조군과 감자 F10 사이의 아스파라긴 및 아크릴아미드의 차이를 표 9에 나타낸다. 아크릴아미드에 대한 시험 전, 대조군 및 F10을 프렌치 프라이로 만들었다. 모든 결과는 수확 시점에 가깝게 분석한 괴경으로부터의 것이었다.
[표 9]
Figure pct00010
감자 재배품종 F10은 흑점 멍에 책임이 있는 효소의 발현이 감소되고 아크릴아미드 수준이 감소된, 개선된 품질을 갖는 레인저 러셋 변종이다.
본 발명의 추가의 실시 형태
상기에 언급된 유리한 특성들이 조합된 감자 변종을 초래하는 연구는 대부분 실험적인 것이다. 이 연구는 시간, 노동 및 돈의 큰 투자를 요구한다. 감자 재배품종의 개발은 흔히 온실로부터 상업적 사용까지 최대 8년 또는 이보다 더 오랜 기간이 걸릴 수 있다. 육종은 가장 중요한 특성을 자손 내에 혼입시키도록 탁월한 부모를 조심스럽게 선택하는 것으로 시작된다. 모든 원하는 형질은 일반적으로 단지 1회의 교배에 의해 나타나지 않기 때문에, 육종은 누적성이어야 한다.
본 발명의 육종 기술은 모 클론의 제어된 수분에 의해 계속된다. 전형적으로, 교배모본(female parent)의 수분에서 이후에 사용하기 위하여 화분을 젤라틴 캡슐 내에 수집한다. 잡종 종자를 온실 내에 심고, 괴경을 수집하고, 수천 개의 개별 묘로부터 보유한다. 다음 해의, 각각의 생성된 묘로부터의 1 내지 4개의 괴경을 야외에 식재하였으며, 여기서, 극도의 주의를 기울여서 바이러스 및 질병의 확산을 회피한다. 이러한 첫 해 묘 작물로부터, 선발 공정에서 살아남은 각각의 잡종 개체로부터의 몇몇 "종자" 괴경을 다음 해의 식재용으로 보유한다. 두 번째 해 후, 샘플을 밀도 측정 및 튀김 시험을 위하여 취하여 상업적 용도에 있어서 괴경의 적합성을 결정한다. 그 후, 이 시점까지 선발 공정에서 살아남은 식물체를 더 종합적인 시리즈의 튀김 시험 및 밀도 결정을 위하여 세 번째 해에 확대된 볼륨으로 식재한다. 네 번째 해의 발달 단게에서, 몇몇 단계에서 야외 시용에 생존 선발을 가하여 상이한 재배 조건에 대한 그의 적응성을 결정한다. 결국, 탁월한 품질을 갖는 변종을 다른 농장으로 옮기고, 종자를 상업적 규모로 증가시킨다. 일반적으로, 이때까지, 8년 이상의 식재, 수확 및 시험을 새로운 그리고 개선된 감자 재배품종의 개발을 위하여 투자하였다.
특정 단백질 생성물을 코딩하는 유전자의 단리 및 특성 확인을 허용한 분자 생물학 기술의 도래에 의해, 식물 생물학 분야의 과학자는 특정한 방식으로 식물체의 형질을 변경하기 위하여 외래 유전자, 또는 추가의 또는 변형된 버전의 천연, 또는 내인성 유전자 (아마도 상이한 프로모터에 의해 구동됨)를 함유하고 발현하도록 식물체의 게놈을 엔지니어링하는 것에 대한 강한 관심을 발전시켰다. 그러한 외래의 추가 및/또는 변형 유전자는 본 명세서에서 "트랜스진"으로 총칭된다. 지난 15년 내지 20년에 걸쳐서, 트랜스제닉 식물체를 생성하는 몇몇 방법이 개발되었으며, 본 발명, 특히 실시 형태도 형질전환된 버전의 청구된 변종 또는 라인에 관한 것이다.
식물 형질전환은 식물 세포에서 기능을 할 발현 벡터의 제작을 포함한다. 그러한 벡터는 조절 요소 (예를 들어, 프로모터)의 제어 하의, 또는 상기 조절 요소에 작동적으로 연결된 유전자를 포함하는 DNA를 포함한다. 발현 벡터는 하나 이상의 그러한 작동가능하게 연결된 유전자/조절 요소 조합을 함유할 수 있다. 벡터(들)는 플라스미드의 형태로 존재할 수 있으며, 감자 식물체(들)의 유전 물질 내로 트랜스진을 혼입시키기 위하여 하기에 기재된 형질전환 방법을 이용하여 형질전환된 감자 식물체를 제공하도록 단독으로 또는 다른 플라스미드와 조합되어 사용될 수 있다.
전통적인 식물 육종은 전형적으로, 새로운 그리고 개선된 특성을 갖는 변종을 생성하기 위하여 식물 염색체의 랜덤 재조합에 의존한다. 표준의 잘 알려진 기술에 따르면, 유전자 및 조절 요소를 포함하는 유전자 "발현 카세트"를 아그로박테륨-단리된 트랜스퍼 DNA ("T-DNA")의 경계부 내에 삽입하고 식물 게놈 내로 통합시킨다. 아그로박테륨-매개된 T-DNA 물질의 이전은 전형적으로 하기 표준 절차를 포함한다: (1) 적어도 하나가 외래 기원의 것인 유전 요소의 시험관 내 재조합에 의해 형질전환의 선발을 위한 발현 카세트를 생성함, (2) 일반적으로 T-DNA 경계 서열이 측면에 존재하는 수백 개의 염기쌍의 아그로박테륨 DNA로 이루어진, 이원 벡터의 T-DNA 영역 내로의 이러한 발현 카세트의 삽입 - 흔히, 외래 DNA를 함유하는 하나 이상의 다른 발현 카세트와 함께임 -, (3) 아그로박테륨 유래의 추가의 이원 벡터 서열의 일부 또는 전부를 흔히 수반하는 T-DNA 경계부 사이에 위치하는 서열의 식물 세포로의 이전, 및 (4) 수율의 증가, 생장력의 개선, 질병 및 곤충에 대한 내성의 향상, 또는 스트레스 하에서의 더 큰 생존 능력과 같은 원하는 형질을 나타내는 안정하게 형질전환된 식물 세포의 선발.
따라서, 유전 공학적 방법은 새로운 형질의 발현에 연루되거나 또는 바이러스, 박테리아 및 식물체로부터의 형질전환체의 확인 및 선발을 위한 마커로서의 기능을 하는 유전자 및 프로모터 및 터미네이터와 같은 조절 요소를 포함하는, 외래의 비-토착 핵산의 도입에 의존한다. 전형적으로 마커 유전자는 박테리아 공급원으로부터 유래되며 항생제 또는 제초제 내성을 부여한다. 고전적인 육종법은 힘들고 시간이 많이 걸리며, 새로운 변종은 전형적으로 단지 상대적으로 보통 정도의 개선을 나타낸다.
"안티-센스" 기술에서, 천연 유전자의 서열을 역전시켜 트랜스제닉 식물체에서의 그 유전자의 발현을 침묵시킨다. 그러나, 역전된 DNA는 일반적으로, 식물 발달을 간섭하고/하거나 그 영양적 가치를 감소시키기 때문에 바람직하지 않을 수 있는 외래 아미노산 서열을 코딩하는, 프로모터와 터미네이터 사이에 삽입된 새로운 그리고 특성 확인되지 않은 개방 판독 프레임을 함유한다.
감자 형질전환용 발현 벡터: 마커 유전자
발현 벡터는 마커를 함유하는 형질전환된 세포가 음성 선발에 의해, 즉, 선발가능 마커 유전자를 함유하지 않는 세포의 성장의 저해에 의해 회수되게 하거나 또는 양성 선발에 의해, 즉 유전자 마커에 의해 코딩되는 생성물의 스크리닝에 의해 회수되게 하는, 조절 요소 (예를 들어, 프로모터)에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 유전자 마커를 포함한다. 식물 형질전환을 위하여 많은 일반적으로 사용되는 선발가능 마커 유전자는 형질전환 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 항생제 또는 제초제일 수 있는 선발용 화학 제제를 대사에 의해 해독시키는 효소를 코딩하는 유전자, 또는 저해제에 대하여 둔감한 변경된 표적을 코딩하는 유전자를 포함한다. 몇 가지 양성 선발법이 본 기술 분야에 또한 공지되어 있다.
식물 형질전환에 대한 하나의 일반적으로 사용되는 선발가능 마커 유전자로는 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 II (nptII) 유전자가 있으며, 이는 식물 조절 시그널의 제어 하에 있을 때 카나마이신에 대한 내성을 부여한다. 문헌[Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:4803 (1983)]. 다른 일반적으로 사용되는 선발가능 마커 유전자로는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자가 있으며, 이는 하이그로마이신 항생제에 대한 내성을 부여한다. 문헌[Vanden Elzen et al., Plant Mol. Biol., 5:299 (1985)].
항생제에 대한 내성을 부여하는 박테리아 기원의 추가의 선발가능 마커 유전자는 겐타마이신 아세틸 트랜스퍼라아제, 스트렙토마이신 포스포트랜스퍼라아제 및 아미노글리코시드-3'-아데닐 트랜스퍼라아제, 블레오마이신 내성 결정자를 포함한다. 문헌[Hayford et al., Plant Physiol. 86:1216 (1988)], 문헌[Jones et al., Mol. Gen. Genet., 210:86 (1987)], 문헌[Svab et al., Plant Mol. Biol. 14:197 (1990)], 문헌[Hille et al., Plant Mol. Biol. 7:171 (1986)]. 다른 선발가능 마커 유전자는 제초제, 예를 들어 글리포세이트, 글루포시네이트 또는 브로목시닐에 대한 내성을 부여한다. 문헌[Comai et al., Nature 317:741-744 (1985)], 문헌[Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2:603-618 (1990)] 및 문헌[Stalker et al., Science 242:419-423 (1988)].
박테리아 기원의 것이 아닌 식물 형질전환에 있어서의 선발가능 마커 유전자는 예를 들어 생쥐 다이하이드로폴레이트 리덕타아제, 식물 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 신타아제 및 식물 아세토락테이트 신타아제를 포함한다. 문헌[Eichholtz et al., Somatic Cell Mol. Genet. 13:67 (1987)], 문헌[Shah et al., Science 233:478 (1986)], 문헌[Charest et al., Plant Cell Rep. 8:643 (1990)].
식물 형질전환에 있어서의 다른 부류의 마커 유전자는 항생제와 같은 독성 물질에 대한 내성에 대한 형질전환된 세포의 직접적인 유전적 선발이라기보다는 오히려 추정상 형질전환된 식물 세포의 스크리닝을 요구한다. 이러한 유전자는 특정 조직에서의 유전자의 공간적 발현 패턴을 정량화하거나 또는 가시화하는 데 특히 유용하며, 이는 빈번하게는 리포터 유전자로 칭해지고, 그 이유는 이 유전자가 유전자 발현 연구를 위하여 유전자 또는 유전자 조절 서열에 융합될 수 있기 때문이다. 추정상 형질전환된 세포를 스크리닝하는 데 일반적으로 사용되는 유전자는 β-글루큐로니다아제 (GUS), β-갈락토시다아제, 루시퍼라아제 및 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제를 포함한다. 문헌[Jefferson, R.A., Plant Mol. Biol. Rep. 5:387 (1987)], 문헌[Teeri et al., EMBO J. 8:343 (1989)], 문헌[Koncz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:131 (1987)], 문헌[DeBlock et al., EMBO J. 3:1681 (1984)].
식물 조직의 파괴를 요구하지 않는 GUS 활성의 가시화를 위한 생체 내 방법이 이용가능하다. 문헌[Molecular Probes publication 2908, IMAGENE GREEN, p. 1-4 (1993)] 및 문헌[Naleway et al., J. Cell Biol. 115:151a (1991)]. 그러나, GUS 활성을 가시화하기 위한 이러한 생체 내 방법은 선발가능 마커로서 루시퍼라아제 유전자를 사용하는 것과 연관된 제한, 높은 형광 배경 및 낮은 민감성 때문에 형질전환된 세포의 회수에 유용하지 않은 것으로 입증되었다.
더 최근에는, 녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein; GFP)을 코딩하는 유전자가 원핵 및 진핵 세포에서의 유전자 발현에 대한 마커로서 이용되었다. 문헌[Chalfie et al., Science 263:802 (1994)]. GFP 및 GFP의 돌연변이체를 스크린가능 마커로서 사용할 수 있다.
감자 형질전환을 위한 발현 벡터: 프로모터
발현 벡터 내에 포함되는 유전자는 조절 요소, 예를 들어 프로모터를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 구동되어야 한다. 몇몇 유형의 프로모터가 형질전환 분야에 잘 알려져 있으며, 이는 단독으로 또는 프로모터와 조합되어 사용될 수 있는 다른 조절 요소가 그러한 바와 같다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "프로모터"는 전사의 시작으로부터 상류의 그리고 전사의 개시를 위한 RNA 폴리머라아제 및 다른 단백질의 인식 및 결합에 연루된 DNA의 영역의 언급을 포함한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. 발생적 제어 하의 프로모터의 예에는 소정의 조직, 예를 들어 잎, 뿌리, 종자, 섬유, 물관, 가도관, 또는 후막 조직에서 우선적으로 전사를 개시하는 프로모터가 포함된다. 그러한 프로모터는 "조직-선호형"으로 칭해진다. 단지 특정 조직에서 전사를 개시하는 프로모터는 "조직-특이적"인 것으로 칭해진다. "세포-유형" 특이적 프로모터는 주로, 하나 이상의 기관에서의 소정 세포 유형, 예를 들어 뿌리 또는 잎에서의 맥관 세포에서 발현을 구동시킨다. "유도성" 프로모터는 환경적 제어 하에 있는 프로모터이다. 유도성 프로모터에 의한 전사를 초래할 수 있는 환경 조건의 예에는 혐기성 조건 또는 광의 존재가 포함된다. 조직-특이적, 조직-선호형, 세포 유형 특이적 및 유도성 프로모터는 "비-구성적(non-constitutive)" 프로모터 부류를 구성한다. "구성적" 프로모터는 대부분의 환경 조건 하에서 활성을 갖는 프로모터이다.
A. 유도성 프로모터
유도성 프로모터를 감자에서의 발현을 위한 유전자에 작동가능하게 연결시킨다. 선택적으로, 유도성 프로모터를 감자에서의 발현을 위한 유전자에 작동가능하게 연결된 시그널 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결시킨다. 유도성 프로모터에 의해, 전사 속도가 유도제(inducing agent)에 응답하여 증가한다.
임의의 유도성 프로모터를 본 발명에서 사용할 수 있다. 문헌[Ward et al., Plant Mol. Biol. 22:361-366 (1993)]을 참조하라. 예시적인 유도성 프로모터에는 구리에 응답하는 ACEI 시스템으로부터의 것 (문헌[Mett et al., PNAS 90:4567-4571 (1993)]); 벤젠설폰아미드계 제초제 약해 경감제(herbicide safener)에 응답하는 마이즈로부터의 In2 유전자 (문헌[Hershey et al., Mol. Gen Genetics 227:229-237 (1991)] 및 문헌[Gatz et al., Mol. Gen. Genetics 243:32-38 (1994)]) 또는 Tn10으로부터의 Tet 리프레서 (문헌[Gatz et al., Mol. Gen. Genetics 227:229-237 (1991)])가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 특히 바람직한 유도성 프로모터는 식물체가 보통은 응답하지 않는 유도제에 응답하는 프로모터이다. 예시적인 유도성 프로모터로는 전사 활성이 글루코코르티코스테로이드 호르몬에 의해 유도되는 스테로이드 호르몬 유전자로부터의 유도성 프로모터가 있다. 문헌[Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:0421 (1991)].
B. 구성적 프로모터
구성적 프로모터를 감자에서 발현시키기 위한 유전자에 작동가능하게 연결시키거나 또는 구성적 프로모터를 감자에서 발현시키기 위한 유전자에 작동가능하게 연결된 시그널 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결시킨다.
많은 상이한 구성적 프로모터를 본 발명에서 이용할 수 있다. 예시적인 구성적 프로모터에는 식물 바이러스로부터의 프로모터, 예를 들어 CaMV로부터의 35S 프로모터 (문헌[Odell et al., Nature 313:810-812 (1985)]) 및 벼 액틴 (문헌[McElroy et al., Plant Cell 2: 163-171 (1990)]); 유비퀴틴 (문헌[Christensen et al., Plant Mol. Biol. 12:619-632 (1989)] 및 문헌[Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18:675-689 (1992)]); pEMU (문헌[Last et al., Theor. Appl. Genet. 81:581-588 (1991)]); MAS (문헌[Velten et al., EMBO J. 3:2723-2730 (1984)]) 및 마이즈 H3 히스톤 (문헌[Lepetit et al., Mol. Gen. Genetics 231:276-285 (1992)] 및 문헌[Atanassova et al., Plant Journal 2 (3): 291-300 (1992)])과 같은 그러한 유전자로부터의 프로모터가 포함되지만 이에 한정되지 않는다.
브라시카 나푸스(Brassica napus) ALS3 구조 유전자에 대하여 5'의 Xba1/Ncol 단편 (또는 상기 Xba1/Ncol 단편에 대한 뉴클레오티드 서열 유사성), ALS 프로모터가 특히 유용한 구성적 프로모터를 대표한다. 국제특허 공개 WO 96/30530호를 참조하라.
C. 조직 -특이적 또는 조직- 선호형 프로모터
조직-특이적 프로모터를 감자에서의 발현을 위한 유전자에 작동가능하게 연결시킨다. 선택적으로, 조직-특이적 프로모터를 감자에서의 발현을 위한 유전자에 작동가능하게 연결된 시그널 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결시킨다. 조직-특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심대상의 유전자로 형질전환시킨 식물체는 배타적으로 또는 우선적으로 특정 조직에서 트랜스진의 단백질 생성물을 생성한다.
임의의 조직-특이적 또는 조직-선호형 프로모터를 본 발명에서 이용할 수 있다. 예시적인 조직-특이적 또는 조직-선호형 프로모터에는 뿌리-선호형 프로모터 - 예를 들어 파세올린 유전자로부터의 것 (문헌[Murai et al., Science 23:476-482 (1983)] 및 문헌[Sengupta-Gopalan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3320-3324 (1985)]); 잎-특이적인 그리고 광-유도되는 프로모터, 예를 들어 캡(cab) 또는 루비스코(rubisco)로부터의 것 (문헌[Simpson et al., EMBO J. 4(11):2723-2729 (1985)] 및 문헌[Timko et al., Nature 318:579-582 (1985)]); 꽃밥-특이적 프로모터, 예를 들어 LAT52로부터의 것 (문헌[Twell et al., Mol. Gen. Genetics 217:240-245 (1989)]); 화분-특이적 프로모터, 예를 들어 Zm13으로부터의 것 (문헌[Guerrero et al., Mol. Gen. Genetics 244:161-168 (1993)]) 또는 소포자-선호형 프로모터, 예를 들어 apg로부터의 것 (문헌[Twell et al., Sex. Plant Reprod. 6:217-224 (1993)])이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
단백질을 세포내 구획으로 표적화하기 위한 시그널 서열
트랜스진에 의해 생성된 단백질을 세포내 구획, 예를 들어 엽록체, 액포, 페록시좀, 글리옥시좀, 세포벽 또는 미토콘드리온으로의 수송 또는 아포플라스트(apoplast) 내로의 분비를 위한 것은 관심대상의 단백질을 코딩하는 유전자의 5' 및/또는 3' 영역에 시그널 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 작동가능하게 연결함에 의해 성취된다. 구조 유전자의 5' 및/또는 3' 말단에서의 표적화 서열은 단백질 합성 및 프로세싱 동안 코딩된 단백질이 궁극적으로 구획화되는 장소를 결정할 수 있다.
시그널 서열의 존재는 폴리펩티드를 세포내 소기관 또는 세포내 구획 중 어느 하나로 인도하거나 또는 아포플라스트로의 분비를 위한 것이다. 많은 시그널 서열이 본 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Becker et al., Plant Mol. Biol. 20:49 (1992)]; 문헌[Close, P.S., Master's Thesis, Iowa State University (1993)]; 문헌[Knox, C., et al., Plant Mol. Biol. 9:3-17 (1987)]; 문헌[Lerner et al., Plant Physiol. 91:124-129 (1989)]; 문헌[Frontes et al., Plant Cell 3:483-496 (1991)]; 문헌[Matsuoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88:834 (1991)]; 문헌[Gould et al., J. Cell. Biol. 108:1657 (1989)]; 문헌[Creissen et al., Plant J. 2:129 (1991)]; 문헌[Kalderon, et al., Cell 39:499-509 (1984)]; 문헌[Steifel, et al., Plant Cell 2:785-793 (1990)]을 참조하라.
외래 단백질 유전자 및 작물학적 유전자
본 발명에 따른 트랜스제닉 식물체를 이용하여 외래 단백질을 상업적 양으로 생성할 수 있다. 따라서, 본 기술 분야에서 잘 이해되는 형질전환된 식물체의 선발 및 번식 기술은 통상적인 방식으로 수확되는 복수의 트랜스제닉 식물체를 생성하며, 그 후 외래 단백질을 관심대상의 조직으로부터 또는 전체 바이오매스(biomass)로부터 추출할 수 있다. 식물 바이오매스로부터의 단백질 추출은 예를 들어 문헌[Heney and Orr, Anal. Biochem. 114:92-6 (1981)]에 논의된 공지된 방법에 의해 성취될 수 있다.
바람직한 실시 형태에 따르면, 외래 단백질의 상업적 생성을 위하여 제공된 트랜스제닉 식물체는 감자 식물체이다. 다른 바람직한 실시 형태에서, 관심대상의 바이오매스는 종자 또는 괴경이다. 더 높은 수준의 발현을 나타내는 상대적으로 적은 수의 트랜스제닉 식물체에 있어서, 주로 통상적인 RFLP, PCR 및 SSR 분석을 통하여 유전자 지도를 생성할 수 있으며, 이는 통합된 DNA 분자의 대강의 염색체 위치를 확인해 준다. 이와 관련하여 예시적인 방법에 대해서는 문헌[Glick and Thompson, Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology CRC Press, Boca Raton 269:284 (1993)]을 참조하라. 염색체 위치에 관한 지도 정보는 당해 트랜스제닉 식물체의 독점적 보호에 유용하다. 비공인된 번식이 착수되고 교배가 다른 생식질과 이루어질 경우, 통합 영역의 지도를 의심 식물체에 대한 유사 지도와 비교하여 후자가 당해 식물체와 공통인 혈통을 갖는지를 결정할 수 있다. 지도 비교는 혼성화, RFLP, PCR, SSR 및 서열결정을 포함할 것이며, 이들 전부는 통상적인 기술이다.
이와 마찬가지로, 본 발명에 의해, 작물학적 유전자를 형질전환된 식물체에서 발현시킬 수 있다. 더 구체적으로, 식물체를 유전자 엔지니어링하여 관심대상의 작물의 다양한 표현형을 발현시킬 수 있다. 이와 관련하여 연루된 예시적인 유전자에는 하기에 분류된 것이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다:
1. 해충 또는 질병에 대한 내성을 부여하고 하기를 코딩하는 유전자:
A. 식물 질병 내성 유전자. 식물 방어는 흔히 식물체 내의 질병 내성 유전자 (R)의 생성물과 병원체 내의 상응하는 비병원성 (Avr) 유전자의 생성물 사이의 특정 상호작용에 의해 활성화된다. 식물 변종은 특정 병원체 주에 대하여 내성인 식물체를 엔지니어링하도록 클로닝된 내성 유전자(들)로 형질전환될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Jones et al., Science 266:789 (1994) (cloning of the tomato Cf-9 gene for resistance to Cladosporium fulvum); 문헌[Martin et al., Science 262:1432 (1993) (tomato Pto gene for resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato encodes a protein kinase)]; 문헌[Mindrinos et al. Cell 78:1089 (1994) (Arabidopsis RSP2 gene for resistance to Pseudomonas syringae)]을 참조하라.
B. 대두 시스트 선충(cyst nematode)과 같은 해충에 대한 내성을 부여하는 유전자. 예를 들어 국제특허 공개 WO 96/30517호; 국제특허 공개 WO 93/19181호를 참조하라.
C. 바실러스 튜린기엔시스 단백질, 이의 유도체 또는 이것에서 모델링된 합성 폴리펩티드. 예를 들어, 문헌[Geiser et al., Gene 48:109 (1986)]을 참조하는데, 이는 Bt δ-내독소 유전자의 클로닝 및 뉴클레오티드 서열을 개시한다. 게다가, δ-내독소 유전자를 코딩하는 DNA 분자를 미국 버지니아주 매너서스 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)으로부터 ATCC 등록 번호 40098, 67136, 31995 및 31998로 구매할 수 있다.
D. 렉틴. 예를 들어, 문헌[Van Damme et al., Plant Molec. Biol. 24:25 (1994)]을 참조하는데, 이는 몇몇 클리비아 미니아타(Clivia miniata) 만노스-결합 렉틴 유전자의 뉴클레오티드 서열을 개시한다.
E. 아비딘과 같은 비타민-결합 단백질. 국제특허 출원 US 93/06487호를 참조하는데, 이는 곤충 해충에 대한 유충구충제(larvicide)로서의 아비딘 및 아비딘 동족체의 용도를 교시한다.
F. 효소 저해제, 예를 들어 프로테아제 또는 프로테이나아제 저해제 또는 아밀라아제 저해제. 예를 들어, 문헌[Abe et al., J. Biol. Chem. 262:16793 (1987) (nucleotide sequence of rice cysteine proteinase inhibitor)], 문헌[Huub et al., Plant Molec. Biol. 21:985 (1993) (nucleotide sequence of cDNA encoding tobacco proteinase inhibitor I)], 문헌[Sumitani et al., Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243 (1993) (nucleotide sequence of Streptomyces nitrosporeus α-amylase inhibitor)] 및 미국 특허 제5,494,813호 (헤퍼(Hepher) 및 아킨슨(Atkinson), 1996년 2월 27일자로 허여됨)를 참조하라.
G. 곤충-특이적 호르몬 또는 페로몬, 예를 들어 엑디스테로이드 또는 유약 호르몬(juvenile hormone), 이의 변이체, 이를 기반으로 하는 모방체, 또는 이들의 길항제 또는 작동제. 예를 들어, 유약 호르몬의 불활성화제인 클로닝된 유약 호르몬 에스테라아제의 배큘로바이러스(baculovirus) 발현에 대한 문헌[Hammock et al., Nature 344:458 (1990)]의 개시 내용을 참조하라.
H. 발현시에, 영향을 받은 해충의 생리학적 특성을 파괴하는 곤충-특이적 펩티드 또는 신경펩티드. 예를 들어, 문헌[Regan, J. Biol. Chem. 269:9 (1994) (expression cloning yields DNA coding for insect diuretic hormone receptor)], 및 문헌[Pratt et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 163:1243 (1989) (an allostatin is identified in Diploptera puntata)]의 개시 내용을 참조하라. 또한 토말스키(Tomalski) 등의 미국 특허 제5,266,317호를 참조하는데, 이는 곤충-특이적, 마비성 신경독소를 코딩하는 유전자를 개시한다.
I. 뱀, 말벌 등에 의해 자연에서 생성되는 곤충-특이적 독. 예를 들어, 전갈 곤충독성 펩티드를 코딩하는 유전자의 식물체에서의 이종성 발현의 개시 내용에 대하여 문헌[Pang et al., Gene 116:165 (1992)]을 참조하라.
J. 살곤충 활성을 갖는 모노테르펜, 세스퀴테르펜, 스테로이드, 하이드록삼산, 페닐프로파노이드 유도체 또는 다른 비-단백질 분자의 과축적에 책임이 있는 효소.
K. 생물학적 활성 분자의 번역 후 변형을 비롯한 변형에 연루된 효소; 예를 들어, 천연이든지 합성이든지 간에, 당분해 효소, 단백질 분해 효소, 지방 분해 효소, 뉴클레아제, 사이클라아제, 트랜스아미나아제, 에스테라아제, 하이드롤라아제, 포스파타아제, 키나아제, 포스포릴라아제, 폴리머라아제, 엘라스타아제, 키티나아제 및 글루카나아제. 국제특허 공개 WO 93/02197호 (스코트(Scott) 등)를 참조하는데, 이는 칼라아제 유전자의 뉴클레오티드 서열을 개시한다. 키티나아제-코딩 서열을 함유하는 DNA 분자를 예를 들어, ATCC로부터 등록 번호 39637 및 67152로 획득할 수 있다. 또한 담배 박각시나방 키티나아제를 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열이 교시된 문헌[Kramer et al., Insect Biochem. Molec. Biol. 23:691 (1993)], 및 파슬리 유비4-2 폴리유비퀴틴 유전자의 뉴클레오티드 서열을 제공하는 문헌[Kawalleck et al., Plant Molec. Biol. 21:673 (1993)]을 참조하라.
L. 신호 전달을 촉진하는 분자. 예를 들어, 녹두 칼모듈린 cDNA 클론의 뉴클레오티드 서열에 대한 문헌[Botella et al., Plant Molec. Biol. 24:757 (1994)]의 개시 내용, 및 마이즈 칼모듈린 cDNA 클론의 뉴클레오티드 서열을 제공하는 문헌[Griess et al., Plant Physiol. 104:1467 (1994)]을 참조하라.
M. 소수성 모멘트(moment) 펩티드. 진균류 식물 병원체를 저해하는 타키플레신(Tachyplesin)의 펩티드 유도체를 개시하는 국제특허 공개 WO 95/16776호 및 질병 내성을 부여하는 합성 항미생물 펩티드를 교시하는 국제특허 공개 WO 95/18855호를 참조하라.
N. 막 퍼미아제, 채널 형성자 또는 채널 차단자. 예를 들어, 트랜스제닉 담배 식물체가 슈도모나스 솔라나세아룸(Pseudomonas solanacearum)에 대하여 내성이 되게 하기 위한 세크로핀-β 분해 펩티드 유사체의 이종성 발현에 대한 문헌[Jaynes et al., Plant Sci 89:43 (1993)]의 개시 내용을 참조하라.
O. 바이러스-침습성 단백질 또는 이로부터 유도된 복합 독소. 예를 들어, 형질전환된 식물 세포에서의 바이러스 코트(coat) 단백질의 축적은 코트 단백질 유전자가 유래되는 바이러스와 관련 바이러스에 의해 야기되는 바이러스 감염 및/또는 발병에 대한 내성을 부여한다. 문헌[Beachy et al., Ann. Rev. Phytopathol. 28:451 (1990)]을 참조하라. 코트 단백질-매개된 내성은 알팔파 모자이크 바이러스, 오이 모자이크 바이러스 및 담배 모자이크 바이러스에 대하여 형질전환된 식물체에 부여되었다.
P. 곤충-특이적 항체 또는 이로부터 유도된 면역독소. 따라서, 곤충 소화기관에서의 결정적인 대사 기능에 표적화된 항체는 영향을 받은 효소를 불활성화시켜 곤충을 죽일 것이다. 문헌[Taylor et al., Abstract #497, Seventh Int'l Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions (Edinburgh, Scotland) (1994) (enzymatic inactivation in transgenic tobacco via production of single-chain antibody fragments)]을 참조하라.
Q. 바이러스-특이적 항체. 예를 들어, 문헌[Tavladoraki et al., Nature 366:469 (1993)]을 참조하는데, 이는 재조합 항체 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물체가 바이러스 공격으로부터 보호됨을 보여준다.
R. 병원체 또는 기생충에 의해 자연에서 생성되는 발달-정지 단백질. 따라서, 진균류 엔도-α-1, 4-D-폴리갈락튜로나아제는 진균류 콜로니화(colonization) 및 식물 세포벽 호모-α-1, 4-D-갈락튜로나아제의 가용화에 의한 식물 영양소 방출을 조장한다. 문헌[Lamb et al., Bio/Technology 10:1436 (1992)]을 참조하라. 콩 엔도폴리갈락튜로나아제-저해 단백질을 코딩하는 유전자의 클로닝 및 특성 확인이 문헌[Toubart et al., Plant J. 2:367 (1992)]에 기재되어 있다.
S. 식물체에 의해 자연에서 생성되는 발달-정지 단백질. 예를 들어, 문헌[Logemann et al., Bio/Technology 10:305 (1992)]은 보리 리보좀-불활성화 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물체가 진균류 질병에 대한 증가된 내성을 가짐을 보여 주었다.
T. 전신 획득 저항성(Systemic Acquired Resistance; SAR) 반응에 연루된 유전자 및/또는 병인-관련 유전자. 문헌[Briggs, S. Current Biology, 5(2) (1995)].
U. 항진균 유전자. 문헌[Cornelissen and Melchers, Plant Physiol., 101:709-712 (1993)]; 문헌[Parijs et al., Planta 183:258-264 (1991)] 및 문헌[Bushnell et al., Can. J. of Plant Path. 20(2):137-149 (1998)]을 참조하라.
V. 역병(Phytophthora blight)에 대한 내성을 부여하는 유전자, 예를 들어 R1, R2, R3, R4 및 기타 내성 유전자. 문헌[Naess, S.K., et. al., (2000) Resistance to late blight in Solanum bulbocastanum is mapped to chromosome 8. Theor. Appl. Genet. 101: 697-704] 및 문헌[Li, X., et. al., (1998) Autotetraploids and Genetic mapping using common AFLP markers: the R2 allele conferring resistance to Phytophthora infestans mapped on potato chromosome 4. Theor. Appl. Genet. 96: 1121-1128]을 참조하라.
2. 예를 들어 하기의 제초제에 대한 내성을 부여하는 유전자:
A. 생장점 또는 분열 조직을 저해하는 제초제, 예를 들어 이미다졸리논 또는 설포닐우레아. 이러한 카테고리 내의 예시적인 유전자는 예를 들어 각각 문헌[Lee et al., EMBO J. 7:1241 (1988)] 및 문헌[Miki et al., Theor. Appl. Genet. 80:449 (1990)]에 기재된 바와 같이 돌연변이 ALS 및 AHAS를 코딩한다.
B. 글리포세이트 (각각 돌연변이 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 신타아제 (EPSP) 및 aroA 유전자에 의해 내성이 손상됨) 및 기타 포스포노 화합물, 예를 들어 글루포시네이트 (포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라아제 (PAT) 및 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus) PAT bar 유전자), 및 피리디녹시 또는 페녹시 프로프리온산 및 사이클로헥손 (ACCase 저해자-코딩 유전자). 예를 들어, 샤(Shah) 등의 미국 특허 제4,940,835호를 참조하는데, 이는 글리포세이트 내성을 부여할 수 있는 EPSP의 형태의 뉴클레오티드 서열을 개시한다. 돌연변이 aroA 유전자를 코딩하는 DNA 분자를 ATCC 등록 번호 39256으로 획득할 수 있으며, 돌연변이 유전자의 뉴클레오티드 서열은 코마이(Comai)의 미국 특허 제4,769,061호에 개시되어 있다. 쿠마다(Kumada) 등의 유럽 특허 출원 제0 333 033호 및 굿맨(Goodman) 등의 미국 특허 제4,975,374호에는 L-포스피노트리신과 같은 제초제에 대한 내성을 부여하는 글루타민 신테타아제 유전자의 뉴클레오티드 서열이 개시되어 있다. PAT 유전자의 뉴클레오티드 서열은 리만스(Leemans) 등의 유럽 특허 출원 제0 242 246호에 제공되어 있다. 문헌[DeGreef et al., Bio/Technology 7:61 (1989)]에는 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라아제 활성을 코딩하는 키메라 bar 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물체의 생성이 기재되어 있다. 페녹시 프로프리온산 및 사이클로헥손, 예를 들어 세톡시딤 및 할록시포프에 대한 내성을 부여하는 유전자의 예로는 Acc1-S1, Acc1-S2, 및 Acc2-S3 유전자가 있으며, 이는 문헌[Marshall et al., Theor. Appl. Genet. 83:435 (1992)]에 기재되어 있다.
C. 광합성을 저해하는 제초제, 예를 들어 트라이아진 (psbA 및 gs+ 유전자) 또는 벤조니트릴 (니트릴라아제 유전자). 문헌[Przibila et al., Plant Cell 3:169 (1991)]에는 돌연변이 psbA 유전자를 코딩하는 플라스미드를 이용한 클라미도모나스(Chlamydomonas)의 형질전환이 기재되어 있다. 니트릴라아제 유전자의 뉴클레오티드 서열은 스토커(Stalker)의 미국 특허 제4,810,648호에 개시되어 있으며, 이러한 유전자를 함유하는 DNA 분자는 ATCC 등록 번호 53435, 67441 및 67442로 입수가능하다. 글루타티온 S-트랜스퍼라아제를 코딩하는 DNA의 클로닝 및 발현이 문헌[Hayes et al., Biochem. J. 285:173 (1992)]에 기재되어 있다.
D. 아세토하이드록시산 신타아제를 발현하는 식물체가 다수의 유형의 제초제에 대하여 내성이 되게 하는 것으로 밝혀진 아세토하이드록시산 신타아제를 다양한 식물체 내로 도입하였다. 문헌[Hattori et al., Mol. Gen. Genet. 246:419, 1995]을 참조하라. 제초제에 대한 내성을 부여하는 다른 유전자는 쥐 사이토크롬 P4507A1 및 효모 NADPH-사이토크롬 P450 옥시도리덕타아제의 키메라 단백질을 코딩하는 유전자 (문헌[Shiota et al., Plant Physiol., 106:17, 1994]), 글루타티온 리덕타아제 및 수퍼옥사이드 디스뮤타아제의 유전자 (문헌[Aono et al., Plant Cell Physiol. 36:1687, 1995]), 및 다양한 포스포트랜스퍼라아제의 유전자 (문헌[Datta et al., Plant Mol. Biol. 20:619, 1992])를 포함한다.
E. 프로토포르피리노겐 옥시다아제 (protox)는 모든 식물 생존에 필요한 엽록소의 생성에 필요하다. protox 효소는 다양한 제초제 화합물의 표적으로서의 역할을 한다. 이러한 제초제는 존재하는 모든 상이한 종의 식물체의 성장을 또한 저해하여 그의 완전한 파괴를 야기한다. 이러한 제초제에 대하여 내성을 갖는, 변경된 protox 활성을 포함하는 식물체의 개발이 미국 특허 제6,288, 306호; 미국 특허 제6,282,837호; 미국 특허 제5,767,373호; 및 국제특허 공개 WO 01/12825호에 기재되어 있다.
3. 하기와 같은 가치-부가된 형질을 부여하거나 상기 형질에 기여하는 유전자:
A. 예를 들어 식물체의 스테아르산 함량을 증가시키도록 스테아릴-ACP 데새츄라아제의 안티센스 유전자로 식물체를 형질전환시킴에 의한 변경된 지방산 대사. 문헌[Knultzon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2625 (1992)]을 참조하라.
B. 감소된 피테이트 함량 - 1) 피타아제-코딩 유전자의 도입은 피테이트의 분해를 향상시켜서 더 많은 자유 포스페이트를 형질전환된 식물체에 부가한다. 예를 들어, 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) 피타아제 유전자의 뉴클레오티드 서열의 개시에 대해서는 문헌[Van Hartingsveldt et al., Gene 127:87 (1993)]을 참조하라. 2) 피테이트 함량을 감소시키는 유전자를 도입할 수 있다. 마이즈에서, 예를 들어, 이것은 저 수준의 피트산을 특징으로 하는 마이즈 돌연변이체에 책임이 있는 단일 대립유전자와 연관된 DNA를 클로닝하고 그 후 재도입함으로써 성취될 수 있다. 문헌[Raboy et al., Maydica 35:383 (1990)]을 참조하라.
C. 예를 들어, 전분의 분지화 패턴을 변경시키는 효소를 코딩하는 유전자로 식물체를 형질전환시킴으로써 초래된 변형 탄수화물 조성물. 문헌[Shiroza et al., J. Bacteriol . 170:810 (1988) (nucleotide sequence of Streptococcus mutants fructosyltransferase gene)], 문헌[Steinmetz et al., Mol . Gen. Genet. 20:220 (1985) (nucleotide sequence of Bacillus subtilis levansucrase gene)], 문헌[Pen et al., Bio/Technology 10:292 (1992) (production of transgenic plants that express Bacillus lichenifonnis α-amylase)], 문헌[Elliot et al., Plant Molec. Biol. 21:515 (1993) (nucleotide sequences of tomato invertase genes)], 문헌[SØgaard et al., J. Biol . Chem . 268:22480 (1993) (site-directed mutagenesis of barley α-amylase gene)], 및 문헌[Fisher et al., Plant Physiol. 102:1045 (1993) (maize endosperm starch branching enzyme II)]을 참조하라.
D. FAD-2 유전자 변형을 통한 올레산의 상승 및/또는 FAD-3 유전자 변형을 통한 리놀렌산의 감소. 미국 특허 제6,063,947호; 미국 특허 제6,323,392호; 및 국제특허 공개 WO 93/11245호를 참조하라.
4. 웅성 불임을 제어하는 유전자
A. 융단층(tapetum)-특이적 프로모터의 제어 하의, 그리고 화학물질 N-Ac-PPT의 적용에 의한, 데아세틸라아제 유전자의 도입. 국제특허 공개 WO 01/29237호를 참조하라.
B. 다양한 수술-특이적 프로모터의 도입. 국제특허 공개 WO 92/13956호 및 국제특허 공개 WO 92/13957호를 참조하라.
C. 바나아제(barnase) 및 바스타(barstar) 유전자의 도입. 문헌[Paul et al., Plant Mol. Biol. 19:611-622, 1992]을 참조하라.
감자 형질전환 방법
식물체 형질전환을 위한 다수의 방법이 개발되었으며, 이는 생물학적 및 물리적 식물체 형질전환 프로토콜을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Miki et al., "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants", Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B.R. and Thompson, J.E. Eds. (CRC Press, Inc. Boca Raton, 1993) pages 67-88]을 참조하라. 게다가, 식물 세포 또는 조직의 형질전환 및 식물체의 재생을 위한 발현 벡터 및 시험관 내 배양 방법이 이용가능하다. 예를 들어, 문헌[Gruber et al., "Vectors for Plant Transformation", Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B.R. and Thompson, J.E. Eds. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993) pages 89-119]을 참조하라.
A. 아그로박테륨-매개된 형질전환 - 발현 벡터를 식물체 내로 도입하는 하나의 방법은 아그로박테륨의 천연 형질전환 시스템을 기반으로 한다. 예를 들어, 문헌[Horsch et al., Science 227:1229 (1985)]을 참조하라. 에이. 투메파시엔스 및 에이. 리조게네스는 식물 세포를 유전적으로 형질전환시키는 식물 병원성 토양 박테리아이다. 각각 에이. 투메파시엔스 및 에이. 리조게네스의 Ti 및 Ri 플라스미드는 식물체의 유전자 형질전환에 책임이 있는 유전자를 지닌다. 예를 들어, 문헌[Kado, C.I., Crit. Rev. Plant Sci. 10:1 (1991)]을 참조하라. 아그로박테륨 벡터 시스템의 설명 및 아그로박테륨-매개된 유전자 전달 방법이 그루버(Gruber) 등의 상기 문헌, 미키(Miki) 등의 상기 문헌 및 문헌[Moloney et al., Plant Cell Reports 8:238 (1989)]에 제공되어 있다. 또한 1996년 10월 8일자로 허여된 미국 특허 제5,563,055호 (타운센드(Townsend) 및 토마스(Thomas))를 참조하라.
B. 직접적 유전자 전달 - 직접적 유전자 전달로 총칭되는 몇몇 식물체 형질전환 방법이 아그로박테륨-매개된 형질전환에 대한 대안으로서 개발되었다. 1 내지 4 μm로 측정되는 미세투사물(microprojectile)의 식물 표면의 일반적 적용가능 방법. 식물 세포 벽 및 막을 투과하기에 충분한 300 내지 600 m/s의 속도로 미세투사물을 가속화하는 바이오리스틱(biolistic) 장치를 이용하여 발현 벡터를 식물 조직 내로 도입한다. 문헌[Sanford et al., Part. Sci . Technol . 5:27 (1987)]; 문헌[Sanford, J.C., Trends Biotech. 6:299 (1988)]; 문헌[Klein et al., Bio/Tech. 6:559-563 (1988)]; 문헌[Sanford, J.C. Physiol Plant 7:206 (1990)]; 문헌[Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992)]. 또한, 1991년 5월 14일자로 허여된 미국 특허 제5,015,580호 (크리스토우(Christou) 등), 및 1994년 6월 21일자로 허여된 미국 특허 제5,322,783호 (토메스(Tomes) 등)를 참조하라.
식물체로의 DNA의 물리적 전달을 위한 다른 방법으로는 표적 세포의 초음파 처리가 있다. 문헌[Zhang et al., Bio/Technology 9:996 (1991)]. 대안적으로, 리포좀 및 스피로플라스트(spheroplast) 융합을 이용하여 발현 벡터를 식물체 내로 도입하였다. 문헌[Deshayes et al., EMBO J., 4:2731 (1985)]; 문헌[Christou et al., Proc Natl . Acad . Sci . USA 84:3962 (1987)]. CaCl2 침전, 폴리비닐 알코올 또는 폴리-L-오르니틴을 이용한 원형질체 내로의 DNA의 직접적인 흡수가 또한 보고되었다. 문헌[Hain et al., Mol. Gen. Genet. 199:161 (1985)] 및 문헌[Draper et al., Plant Cell Physiol . 23:451 (1982)]. 원형질체와 전체 세포 및 조직의 전기천공이 또한 기재되었다. 문헌[Donn et al., In Abstracts of VIIth International Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC, A2-38, p 53 (1990)]; 문헌[D'Halluin et al., Plant Cell 4:1495-1505 (1992)] 및 문헌[Spencer et al., Plant Mol. Biol. 24:51-61 (1994)].
감자 표적 조직의 형질전환 후, 상기에 기재된 선발가능 마커 유전자의 발현은 본 기술 분야에 잘 알려진 재생 및 선발 방법을 이용하여 형질전환된 세포, 조직 및/또는 식물체를 우선적으로 선발하는 것을 허용한다.
전술한 형질전환 방법을 전형적으로 트랜스제닉 변종의 생성에 사용할 것이다. 그 후, 트랜스제닉 변종을 새로운 트랜스제닉 변종의 생성을 위하여 다른 (비형질전환되거나 또는 형질전환된) 변종과 교배시킬 수 있다. 대안적으로, 전술한 형질전환 기술을 이용하여 특정 감자 라인 내로 엔지니어링된 유전 형질을 식물 육종 분야에 잘 알려진 전통적인 역교배 기술을 이용하여 다른 라인 내로 이동시킬 수 있다. 예를 들어, 역교배 접근법을 이용하여 엔지니어링된 형질을 공공의 비-엘리트 변종으로부터 엘리트 변종 내로 또는 그 게놈 내에 외래 유전자를 함유하는 변종으로부터 그 유전자를 함유하지 않는 변종(들) 내로 이동시킬 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "교배"는 그 맥락에 따라 단순한 X x Y 교배 또는 역교배 과정을 말할 수 있다.
당업자라면, 본 발명의 맥락에서 감자 식물체라는 용어가 사용될 때 이것이 F10의 필수 구별 특성을 보유하는 유도체형 변종으로서 예를 들어 내부에 혼입된 하나 이상의 가치-부가된 유전자 (예를 들어, 제초제 또는 해충 내성)를 갖는 그 변종 또는 트랜스제닉 유도체의 유전자 변환된 식물체와 같은 것을 또한 포함함을 인식할 것이다. 역교배 방법을 본 발명에서 이용하여 특성을 개선시키거나 또는 특성을 변종 내로 도입할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "역교배"라는 용어는 잡종 자손을 반복친과 다시 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9회 또는 이보다 더 많이 반복 교배시키는 것을 말한다. 하나 이상의 원하는 특성을 위하여 유전자(들)가 기여한 모 감자 식물체는 비반복친 또는 공여친(donor parent)으로 칭해진다. 이러한 용어는 비반복친을 역교배 프로토콜에서 1회 사용하고 따라서 이는 반복되지 않는다는 사실을 말한다. 비반복친으로부터의 유전자(들)가 이전되는 모 감자 식물체는 반복친으로서 공지되며 그 이유는 이것이 역교배 프로토콜에서 수 라운드(round)에 사용되기 때문이다. 전형적인 역교배 프로토콜에서, 관심대상의 원래 변종 (반복친)을 이전시킬 관심대상의 유전자(들)를 지니는 제2 변종 (비반복친)과 교배시킨다. 그 후, 이러한 교배로부터의 생성된 자손을 다시 반복친과 교배시키고, 비반복친으로부터 이전된 하나 이상의 유전자에 더하여 변환된 식물체에서 반복친의 본질적으로 모든 원하는 형태학적 및 생리학적 특성이 회복된 감자 식물체가 수득될 때까지 이 공정을 반복한다.
적합한 반복친의 선택은 성공적인 역교배 절차에 있어서 중요한 단계이다. 역교배 프로토콜의 목적은 원래의 변종에서 하나 이상의 형질 또는 특성을 변경시키거나 또는 치환하는 것이다. 이를 성취하기 위하여, 반복 변종의 하나 이상의 유전자를 비반복친으로부터의 원하는 유전자(들)로 변경시키거나, 치환하거나 또는 보충하면서 원래의 변종의 본질적으로 모든 나머지의 원하는 유전자, 그리고 그에 따라 원하는 생리학적 및 형태학적 구조를 유지한다. 특정 비반복친의 선택은 역교배의 목적에 따라 달라질 것이다. 주요 목적 중 하나는 일부의 상업적으로 바람직한, 작물학적으로 중요한 형질을 식물체에 부가하는 것이다. 정확한 역교배 프로토콜은 적절한 시험 프로토콜을 결정하기 위하여 변경되거나 또는 부가될 특성 또는 형질에 의존할 것이다. 역교배 방법은 이전될 특성이 우성 대립유전자일 때 단순화되지만, 열성 대립유전자가 또한 이전될 수 있다. 이 경우, 자손의 시험을 도입하여 원하는 특성이 성공적으로 이전되었는지를 결정하는 것이 필요할 수 있다.
이와 마찬가지로, 트랜스진은 하기와 같은 당업자에게 잘 알려진 다양한 확립된 재조합 방법 중 임의의 것을 이용하여 식물체 내로 도입할 수 있다: 문헌[Gressel, 1985, Biotechnologically Conferring Herbicide Resistance in Crops: The Present Realities, In Molecular Form and Function of the Plant Genome, L. van Vloten-Doting, (ed.), Plenum Press, New York]; 문헌[Huttner, S.L., et al., 1992, Revising Oversight of Genetically Modified Plants, Bio/Technology]; 문헌[Klee, H., et al., 1989, Plant Gene Vectors and Genetic Transformation: Plant Transformation Systems Based on the use of Agrobacterium tumefaciens, Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants]; 문헌[Koncz, C., et al.,1986, The Promoter of TL-DNA Gene 5 Controls the Tissue-Specific Expression of Chimeric Genes Carried by a Novel Type of Agrobacterium Binary Vector; Molecular and General Genetics]; 문헌[Lawson, C., et al., 1990, Engineering Resistance to Mixed Virus Infection in a Commercial Potato Cultivar: Resistance to Potato Virus X and Potato Virus Y in Transgenic Russet Burbank, Bio/Technology]; 문헌[Mitsky, T.A., et al., 1996, Plants Resistant to Infection by PLRV.], 미국 특허 제5,510,253호; 문헌[Newell, C.A., et al.,1991, Agrobacterium-Mediated Transformation of Solanum tuberosum L. Cv. Russet Burbank, Plant Cell Reports]; 문헌[Perlak, F.J., et al., 1993, Genetically Improved Potatoes: Protection from Damage by Colorado Potato Beetles, Plant Molecular Biology] - 이들 전부는 이러한 목적을 위하여 본 명세서에 참고로 포함됨 -.
새로운 변종의 개발에 있어서 규칙적으로 선발되지 않지만 역교배 및 유전 공학 기술에 의해 개선될 수 있는 많은 형질이 확인되었다. 이러한 형질은 트랜스제닉일 수 있거나 또는 트랜스제닉이 아닐 수 있으며; 이러한 형질의 예에는 제초제 내성; 박테리아성, 진균성 또는 바이러스성 질병에 대한 내성; 곤충 내성; 전분 및 기타 탄수화물의 농도의 균일성 또는 증가; 향상된 영양 품질; 괴경이 멍드는 경향의 감소; 및 전분의 당으로의 전환률의 감소가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 이러한 유전자는 일반적으로 핵을 통하여 유전된다. 이러한 형질 중 몇몇은 미국 특허 제5,500,365호, 미국 특허 제5,387,756호, 미국 특허 제5,789,657호, 미국 특허 제5,503,999호, 미국 특허 제5,589,612호, 미국 특허 제5,510,253호, 미국 특허 제5,304,730호, 미국 특허 제5,382,429호, 미국 특허 제5,503,999호, 미국 특허 제5,648,249호, 미국 특허 제5,312,912호, 미국 특허 제5,498,533호, 미국 특허 제5,276,268호, 미국 특허 제4,900,676호, 미국 특허 제5,633,434호 및 미국 특허 제4,970,168호에 기재되어 있다.
기탁 정보
상기에 개시되고 첨부된 청구범위에 인용된 제이.알. 심플롯 컴퍼니(J.R. Simplot Company) 독점적 감자 재배품종 F10의 괴경 기탁을 미국 20110 버지니아주 매너서스 유니버시티 불러바드 10801 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)에 하였다. 기탁일은 2013년 5월 23일이었다. 미세괴경의 25개 바이알의 기탁물을 본 출원의 출원일 이전 이래로 제이.알. 심플롯 컴퍼니에 의해 유지된 동일 기탁물로부터 취하였다. 모든 제한은 특허 허여시에 변경할 수 없게 제거될 것이며, 기탁은 37 C.F.R. §§ 1.801-1.809의 모든 요건을 충족시키는 것으로 의도된다. ATCC 등록 번호는 PTA-120373이다. 기탁은 30년의 기간 동안, 또는 마지막 요청 후 5년 동안 또는 특허의 시행가능한 기간 동안, 어느 것이든 더 긴 기간 동안 수탁 기관에서 유지될 것이며, 그 기간 동안 필요할 경우 대체될 것이다.
다수의 예시적인 태양 및 실시 형태가 상기에 논의되었지만, 당업자라면 소정의 변경, 치환, 부가 및 이의 하위 조합을 인식할 것이다. 따라서, 하기의 첨부된 청구범위 및 이하에 소개된 청구항은 모든 그러한 변경, 치환, 부가 및 하위 조합을 포함하는 것으로 해석하고자 하며, 이는 그의 실제 사상 및 범주 내에 있는 바와 같다.
기탁기관명 : The American Type Culture Collection
수탁번호 : PTA-120373
수탁일자 : 20130523

Claims (23)

  1. 괴경의 대표적인 샘플이 ATCC 등록 번호 PTA -120373으로 기탁된, 감자 재배품종 F10의 감자 괴경 또는 괴경의 일부.
  2. 제1항의 괴경 또는 괴경의 일부의 재배에 의해 생성된, 감자 식물체 또는 이의 일부.
  3. 제2항의 식물체의 생리학적 특성 및 형태학적 특성 전부를 갖는, 감자 식물체.
  4. 조직 배양물의 세포가 잎, 화분, 배아, 자엽, 배축, 분열조직 세포, 뿌리, 근단, 암술, 꽃밥, 꽃, 줄기 및 괴경으로 이루어진 군으로부터 선택되는 식물 부분으로부터 생성된, 제2항의 식물체로부터 생성된 세포의 조직 배양물.
  5. 감자 재배품종 F10의 생리학적 특성 및 형태학적 특성 전부를 갖는, 제4항의 조직 배양물로부터 재생된 감자 식물체.
  6. 제1항의 감자 괴경 또는 괴경의 일부의 재배에 의해 생성된, 감자 종자.
  7. 제6항의 종자의 재배에 의해 생성된, 감자 식물체 또는 이의 일부.
  8. 감자 재배품종 F10의 생리학적 특성 및 형태학적 특성 전부를 갖는, 제7항의 감자 식물체의 조직 배양물로부터 재생된 감자 식물체.
  9. 두 감자 식물체를 교배시키는 단계 및 생성된 감자 종자를 수확하는 단계를 포함하며, 하나 이상의 감자 식물체는 제2항의 감자 식물체인, 감자 종자의 생성 방법.
  10. 두 감자 식물체를 교배시키는 단계 및 생성된 감자 종자를 수확하는 단계를 포함하며, 하나 이상의 감자 식물체는 제7항의 감자 식물체인, 감자 종자의 생성 방법.
  11. 제10항의 방법에 의해 생성된, 감자 종자.
  12. 제11항의 상기 감자 종자의 재배에 의해 생성된, 감자 식물체 또는 이의 일부.
  13. 제12항의 식물체로부터 생성된, 감자 종자.
  14. 제9항에 있어서, 상기 감자 식물체 중 하나는 트랜스제닉(transgenic)이며, 다른 하나는 감자 재배품종 F10인, 방법.
  15. 제10항에 있어서, 상기 감자 식물체 중 하나는 트랜스제닉이며, 다른 하나는 감자 재배품종 F10인, 방법.
  16. 제14항의 방법에 의해 생성된, 감자 식물체 또는 이의 일부.
  17. (a) 괴경의 대표적인 샘플이 ATCC 등록 번호 PTA-120373으로 기탁된 F10 식물체를 원하는 형질을 포함하는 다른 감자 재배품종의 식물체와 교배하여 자손 식물체를 생성하는 단계 - 여기서, 원하는 형질은 웅성 불임, 제초제 내성, 곤충 내성, 변경된 지방산 대사, 변경된 탄수화물 대사 및 박테리아성 질병, 진균성 질병 또는 바이러스성 질병에 대한 내성으로 이루어진 군으로부터 선택됨 -;
    (b) 원하는 형질을 갖는 하나 이상의 자손 식물체를 선발하는 단계;
    (c) 선발된 자손 식물체를 F10 식물체와 역교배하여 역교배 자손 식물체를 생성하는 단계;
    (d) 원하는 형질을 갖는 역교배 자손 식물체를 선발하는 단계; 및
    (e) 단계 (c) 및 단계 (d)를 연속으로 2회 이상 반복하여 원하는 형질을 포함하는 선발된 제3의 또는 그보다 더 고도한 역교배 자손 식물체를 생성하는 단계를 포함하는, 감자 재배품종 F10 내로의 원하는 형질의 도입 방법.
  18. 원하는 형질 및 감자 재배품종 F10의 생리학적 특성 및 형태학적 특성 전부를 갖는, 제17항의 방법에 의해 생성된 감자 식물체.
  19. 제18항에 있어서, 원하는 형질은 제초제 내성이며, 이미다졸리논, 설포닐우레아, 글리포세이트, 글루포시네이트, L-포스피노트리신, 트라이아진 및 벤조니트릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 제초제에 대한 내성이 부여된, 감자 식물체.
  20. 제18항에 있어서, 원하는 형질은 곤충 내성이며, 바실러스 튜린기엔시스(Bacillus thuringiensis) 내독소를 코딩하는 트랜스진에 의해 곤충 내성이 부여된, 감자 식물체.
  21. 제18항에 있어서, 원하는 형질은 변경된 지방산 대사 또는 변경된 탄수화물 대사이며, 상기 원하는 형질은 프룩토실트랜스퍼라아제, 레반수크라아제, α-아밀라아제, 인버타아제 및 전분 분지화 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 코딩하는 핵산 또는 스테아릴-ACP 데새츄라아제의 안티센스를 코딩하는 DNA에 의해 부여된, 감자 식물체.
  22. 제2항의 식물체 또는 이의 일부를 수득하는 단계 및 상기 식물체 또는 이의 식물 부분으로부터 상품용 식물체 생성물을 생성하는 단계를 포함하며, 상기 상품용 식물체 생성물은 프렌치 프라이(French fry), 감자 칩, 건조 감자 물질, 감자 플레이크 및 감자 과립으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 상품용 식물체 생성물의 생성 방법.
  23. 제22항의 방법에 의해 생성된 상품용 식물체 생성물.
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