JPH07503376A - Ｄｎａ構築物並びにそれから誘導される細胞及び植物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＤＮＡ構築物並びにそれから誘導される細胞及び植物発明の分野 本発明は、新規なりＮＡ構築物、該構築物を含む植物細胞、該植物細胞に由来す る植物、及び該植物から生じる種子に関する。本発明は特に、アンチセンス核酸 技術を用いて植物中での遺伝子の発現を抑制することからなる。組織特異的プロ モーターを用いて、植物の特定組織で遺伝子の発現を抑制することができる。本 発明は更に、破壊組織の酵素的褐変を示さない植物を得る方法に関する。

序論 褐変や変色は、広範囲の果物や野菜の生鮮加工品を実質的に損なう。ンヤガイモ の場合、黒斑とも呼ばれる内部の押し傷は組織圧縮に対するジャガイモ塊茎の生 理学的反応であり、これはジャガイモ産業の最も重要な問題のひとつである。毎 年、生産される多量のジャガイモが、塊茎の褐変のために直接の消費又は加工に 不適格になっている。

哺乳動物及び細菌モデル系での褐変の生化学は比較的良く知られている。しかし ながら、植物の場合、褐変の生化学プロセスについてはほとんど知られておらず 、多様な果・　物や野菜の変色経路は解明されていない。ジャガイモの場合、褐 変、即ち黒斑は、機械による取り入れや輸送中に塊茎が受けたわずかな物理的衝 撃によって生じる。押し傷内の少数の細胞で変色反応が生じ、その細胞は実際に は溶解する。高重合フェノール系化合物であるメラニンの酵素的形成によって、 押し傷は灰色／黒色に変色する。酵素のポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ） 、オキシゲナーゼはプロセスの最初の２つの酸化反応を触媒して、モノフェノー ル（例えばチロシン）及びオルトージフ二ノール（例えばカテコール）をオルト −キノン（例えばジヒドロキシフェニルアラニン−キノン）に転化する。自己触 媒化学酸化反応は、数種の反応性キノン中間体を介してオルト−キノンをメラニ ンに転化する。植物ポリフェノールオキシダーゼの機能は解明されていないが、 この酵素には幾つかの役割が考えられると仮定されてきた。これらの役割には、 光合成における電子伝達への関与及び昆虫の攻撃又は感染に対する植物の防衛機 構への関与が含まれる。ＰＰＯは健全細胞中でのフェノール系化合物の合成には 関与しないと考えられる。植物ＰＰＯ酵素はプラスミド膜に局在する核コード化 銅金属タンパク質である。ジャガイモ塊茎では、ＰＰＯはアミノブラストの痕跡 チラコイド膜に局在している。

細胞下（５ｕｂ−ｃｅｌｌｕｌａｒ）に位置すれば、酵素は、主に細胞小胞で見 出される基質から分離される。しかしながら、破壌した細胞では、酵素は基質と 混合する結果、フェノール系化合物はＰＰＯ酵素で酸化される。

押し傷は長年ジャガイモ産業で重大な問題であったが、分子技術によるジャガイ モ塊茎内への黒斑形成の予防法に今日まで進展は見られなかった。以下で使用す る耐押し優性（ｂｒｕｉｓｉｎｇ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）という用語は、植物 細胞の破壊による褐変及び変色に対する耐性を意味する。

メラニン形成の生合成経路への干渉を通じて、アンチセンスＰＰＯ遺伝子を発現 することによって耐押し優性を得ることができることが判明した。具体的には、 アンチセンスＰＰＯ遺伝子の組織特異的発現によって特定組織内でポリフェノー ルオキシダーゼの生成を抑制することができる。

アンチセンスＰＰＯの発現は、仮定した１つ以上のＰＰ０機能をかき乱し得るの で、特に植物の空気に触れる部分では、適切な塊茎特異的プロモーターを作用さ せて塊茎への発現を制限することが好ましい。更には、ポリフェノールオキシダ ーゼが少なくとも５つの要素（Ｉｌｅｍｂｅｒｓ）からなる遺伝子ファミリーに よってコードされることが判明した。

ポリフェノールオキシダーゼをコードする遺伝子の部分配列若しくは全体配列に 対応するか又は相同である単一のアンチセンスＰＰＯ遺伝子の同等発現（ｃｏｏ ｒｄｉｎａｔｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）によって塊茎て発現する遺伝子、特に 全ての遺伝子の発現を抑制することができた。更には、押し傷発生に対する感受 性が小さい耐押し偏性植物、特に塊茎が押し傷発生に対して小さい感受性を示す ジャガイモ植物を生産することができた。

本発明は、アンチセンス核酸技術の適用に基づく。アンチセンス機構は解明され ていないが、ターゲット遺伝子の発現は、アンチセンスＲＮＡと相補的内在性Ｒ ＮＡとの複合体を形成して翻訳を妨げるか、又はＤＮＡ配列を含む複合体構造を 形成して転写を妨げることによって阻害されると考えられる。

本発明は、低減されたＰＰＯ酵素活性を示し、更には圃場で褐変度がかなり小さ い表現型を有することが判明した耐押し偏性植物の生産方法を提供する。

褐変は、損傷を受けた植物組織内又は組織周辺でのＰＰＯ酵素活性の結果である が、本発明を使用すれば、塊茎、野菜又は果物の組織の破壊による押し傷の発生 を抑制することができる。葉物野菜（即ちレタス、チコリ）又は果物のような他 の植物でもＰＰＯをコードする遺伝子の発現によって褐変するため、本発明はジ ャガイモに限定されるのではなく、他の植物の物理的組織破壊にょる褐変を抑制 するために使用することもできる。

発明の詳細な説明 本発明は、ｉ）植物中で機能的なプロモーターと、ｉｉ）アンチセンスポリフェ ノールオキシダーゼ遺伝子若しくはその遺伝子部分に対応するＤＮＡ配列、又は これと相同のＤＮＡ配列と、ｉ　ｉ　ｉ）植物中で機能的なターミネータ−とか らなるＤＮＡ構築物を提供する。

アンチセンスポリフェノールオキシダーゼという用語は、ＰＰＯをコードする内 在性遺伝子又はその遺伝子部分に対応するか又は相同であるが、ＰＰＯ遺伝子と は逆の配向を有する二重鎖ＤＮＡを意味する。アンチセンスＤＮＡ配列では、コ ーディングストランドは鋳型ストランドに、鋳型ストランドはコーディングスト ランドになる。

相同配列という用語は、ヌクレオチド配列が隣接する遺伝子と平均で少なくとも ６５％相同である配列を意味する。

ＤＮＡ配列という用語は、植物中で機能的なブロモータ−の発現制御下にあって も植物細胞中で発現することができ、また植物中で機能的なターミネータ−を有 する二重鎖ＤＮＡ配列を意味する。

本明細書で使用するプロモーターという用語は、隣接するコード配列の転写に必 要な調節配列を含むコード配列の上流の転写調節領域を意味し、５゛非翻訳領域 、即ちいわゆるｍＲＮＡのリーダー配列を含んでいる。本発明のＤＮＡ構築物で 使用するプロモーターは植物細胞中において機能的でなければならない。

本発明の他の態様は、プロモーターが組織特異的プロモーターであるＤＮＡ構築 物を包含する。組織特異的プロモーターは植物の特異的組織での隣接配列の転写 を指示する。

本発明のＤＮＡ構築物で使用するのに適したプロモーターにはカリフラワーモザ イクウィルス３５Ｓ　（ＣａＭＶ　３５Ｓ）プロモーター又はジャガイモ塊茎特 異的プロモーター（例えばクラスＩ　Ｐａｔａｔｉｎ遺伝子若しくは好ましくは 顆粒結合澱粉シンターゼ遺伝子のプロモーター）が含まれるが、これらに限定さ れるものではない。

ターミネータ−という用語は、転写終結を指示するコード篤配列下流の領域を意 味し、３゛非翻訳領域とも呼ばれ、ポリアデニル化シグナルを含んでいる。植物 中で機能的なターミネータ−配列は良く知られ、文献に記載されている。

本発明のＤＮＡ配列は少なくとも２５個のヌクレオチドを含んでいる。一般に、 ＤＮＡ配列の適切な長さは、１００〜１０００個、２０００個までのヌクレオチ ドからなる。

本発明の好ましい実施態様では、ＤＮＡ配列は内在性ＰＰＯ遺伝子の全コード配 列又はこの遺伝子と相同の配列を逆向きに含んでいる。

本発明のＤＮＡ配列は、ＰＰＯをコードするゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡに由来し 得る。本発明のＤＮＡ構築物の作製を以下で更に詳しく説明する。本発明は更に 、本発明のＤＮＡ構築物を含むベクターを提供する。

本発明は更に、本発明のＤＮＡ構築物を含む植物細胞、該細胞に由来する植物、 及びこのような植物の種子に関する。標準的な形質転換技術（例えばＴｉプラス ミド媒介形質転換法、粒子衝撃のような直接形質転換法等）を用いて、形質転換 した植物を得ることができる。使用すべき好ましい形質転換技術は植物組織によ って異なり、当業者には公知である。

耐押し偏性ジャガイモの構築を例にとって、以下で本発明の実施態様を説明する 。本発明に基づく同様のアプローチを用いて、他の耐押し偏性穀物を得ることが できる。

部間移植片を用い、標準的なプロトコルに従って、ジャ養して形質転換すれば、 物理的損傷によるジャガイモ塊茎の褐変を抑制することができる。形質転換した 植物では、構築物にアンチセンスの向きに挿入した配列が全長配列であれ、部分 配列であれ、塊茎で低いＰＰＯ活性レベルが測定された。本発明のＤＮＡ配列に 先行する塊茎特異的プロモーターを使用すると、塊茎でのＰＰＯ発現が減少する が、この植物の他の組織でのＰＰＯ遺伝子の発現にはそれほど作用しない。

ＰＰＯ遺伝子の塊茎発現を特異的に標的とする本発明のＤＮＡ構築物を作製する ために、塊茎ｃＤＮＡクローンバンクを作成した。葉ＰＰＯ遺伝子の配列（Ｓｈ ａｈａｒＴ、、Ｈｅｎｉｎｇ　Ｎ、、等、Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ、　４ ．　１３５　１４７）又はその一部分に対応するプローブでこのバンクをスクリ ーニングして、数種の異なる塊茎特異的ＰＰＯ遺伝子を単離した。少なくとも５ 個の異なる遺伝子がジャガイモ塊茎で発現される。

更に、単離した異なる遺伝子の配列を分析すると、これらの遺伝子のヌクレオチ ドが少なくとも７１．７％相同であることが判明した。塊茎で発現したＰＰＯ遺 伝子と、葉で発現したＰＰＯ遺伝子との配列を比較すると、配列が互いに異なっ ていることが分かった。池の生物（例えば細菌種、真菌種又は動物種）で発現し たＰＰＯ遺伝子との相同性の分析では、それほど相同性を認めることができなか った。Ｃｕ結合部位と相同の保存領域のみを同定することができた。これらの観 察から、ジャガイモのＰＰＯ遺伝子、特にジャガイモ塊茎で発現したＰＰＯ遺伝 子は他の種で同定されたＰＰＯ遺伝子とは異なると結論付けることができる。

耐押し偏性を得るには、塊茎で発現される全てのＰＰＯ遺伝子の発現を実質的に 抑制すべきである。使用するジャガイモ栽培変種によって、発現を５分の１〜５ ０分の１に抑制すべきである。本発明者らは、以下で説明するような検出プロト コルではＰＰＯ酵素活性を測定することができない本発明の塊茎を得ることがで きた。このことは、これの発現が阻害されたことを示している。非形質転換の対 照植物の塊茎の活性に比べてＰＰＯ活性が低い塊茎も得られた。これらの塊茎は 、本発明のアンチセンス構築物で形質転換した植物に由来した。従って、本発明 は、少な（とも全ＰＰＯ遺伝子ファミリーの発現を抑制するＤＮＡ構築物を提供 する。この多遺伝子阻害は、ＰＰＯをコードする任意のＤＮＡ配列と相同のアン チセンス配列を用いて行うことができる。本発明者らは、アンチセンスＰＰＯ構 築物の構築に使用した遺伝子が塊茎遺伝子であっても、葉遺伝子であっても、少 なくともＰＰＯ発現を抑制できることを証明した。本発明者らは更に、アンチセ ンス配列がコード配列の全長に対応する必要がないことだけでなく、５゛末端か ら始まり、８００ヌクレオチドのコード配列を含む長さが約１２００ヌクレオチ ドの部分配列がアンチセンスな向きにあれば、塊茎でのＰＰＯ遺伝子の発現が抑 制されることを証明した。更には、小さいＰＰＯ活性を示す塊茎は押し傷を受け にくい。褐変度を測定するために、標準化された押し傷発生テストを実施するこ とができる。このテストでは、押し傷に対する感受性を褐変指数として表す。例 えば以下の実施例では一つのテストを実施する。

本発明の好ましい実施態様では、ＤＮＡ配列は塊茎ＰＰＯ遺伝子、好ましくは塊 茎ｃＤＮＡクローンバンクから単離したＰＰＯクローンに由来する。この配列を 図１ａ及び図１ｂに示す。

本発明の他の好ましい実施態様では、前述した如き塊茎特異的転写開始領域が逆 向きのＤＮＡ配列に先行する。塊茎特異的発現を指示する好ましい塊茎特異的プ ロモーターの特定の選択基準は以下のようにまとめることができる。

即ちアンチセンス遺伝子の発現は一時的に内在性ＰＰＯ遺伝子の発現に先行する か又は少なくとも後者の発現と同時でなければならない。本発明の好ましい実施 態様では、アンチセンス遺伝子の発現は内在性遺伝子と同一の組織場所で行われ ねばならない。更には、発現レベルはアンチセンス効果を得るのに適したレベル でなければならない。

褐変は、細胞の損傷によって損傷を受けた植物組織内又は組織周辺でのＰＰＯ酵 素活性の結果であるが、本発明を使用すれば、塊茎、野菜又は果物の組織の破壊 による押し傷の発生を抑制することができる。葉物野菜（即ちレタス、チコリ） 又は果物のような他の植物でもＰＰＯをコードする遺伝子の発現によって褐変す るため、本発明はジャガイモに限定されるのではなく、他の植物の押し傷発生に よる褐変を抑制するために使用することもできる。

以下で、添付図面を参照して本発明の詳細な説明する。

図１ａは、ｐｐｏ塊茎遺伝子ｐｋＧ４５−８のヌクレオチド配列を示す。このヌ クレオチド配列は配列番号；１とする。

挿入部位・ −ヌクレオチド１のレベルに部位Ａ −ヌクレオチド１２１３のレベルに部位Ｂ−ヌクレオチド１８３３のレベルに部 位Ｃ図１ｂは他のＰＰＯ塊茎遺伝子ｐｋＧ５９−４のヌクレオチド配列を示す。

このヌクレオチド配列は配列番号：２とする。

挿入部位。

−ヌクレオチド１のレベルに部位Ａ −ヌクレオチド１１７３のレベルに部位Ｅ−ヌクレオチド１６４５のレベルに部 位Ｆ図２ａは異なる組換えベクトルの構築を示す図である。

図２ｂは、ジャガイモ品種の形質転換に使用する異なる組換えＤＮＡ構築物の構 築を示す図である。

図３は、アンチセンスＰＰＯ構築物で形質転換した全ての植物の酵素活性を形質 転換していない対照と比較して示す棒グラフである。１．２．３で示す変異体は それぞれ、ＣａＭＶ　３５Ｓプロモーター構築物を含む形質転換細胞、ＧＢＳＳ プロモーター構築物を含む形質転換細胞、形質転換していない対照である。

図４はアンチセンスＰＰＯ構築物で形質転換した選定植物の押し傷発生指数を形 質転換していない対照と比較して示す棒グラフである。１．２．３で示す変異体 はそれぞれ、ＣａＭＶ　３５Ｓプロモーター構築物を含む形質転換細胞、ＧＢＳ Ｓプロモーター構築物を含む形質転換細胞、形質転換していない対照である。

以下の実施例で本発明の態様を非制限的に説明する。

実施例 実施例１：塊茎特異的ｃＤＮＡライブラリーからのＰＰＯクローンの単離、特徴 付は及びクローン化塊茎でのＰＰＯ遺伝子の発現を特異的に阻害するアンチセン ス構築物を作製するために、ベクターλ　ＺＡＰＩＩ内で出発材料としての塊茎 ＲＮＡからｃＤＮＡクローンバンクを作製した（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃ１ｏ ｎｉｎｇｓｙｓｔｅｍｓ、　１１０９９　Ｎｏｒｔｈ　Ｔｏｒｒｅｙ　Ｐｉｎｅ ｓ　Ｒｄ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ９２０３７）。５Ｘ１０’個のプラーク からなるバンクを、葉ＰＰＯ遺伝子をコードするｓｔｐ標識クローンを用いてス クリーニングした（Ｓｈａｈａｒ等、１９９２年）。プラーク精製を３度繰り返 して、合計１６個の陽性反応プラークを取り出し、その後の分析用に選択した。

λ　ＺＡＰＩＩベクタークローニング部位の末端に特異的なＰＣＲプライマーを 用いて、１６個のクローンのインサートを増幅して、長さを分析し、制限部位に よって分類した。６個のインサートの長さはちょうど２ｋｂに及んでおり、ｐｐ ｏタンパク質の分子量が４５０００〜５９０００であると街摘する研究に基づい て、全長クローンの候補とした。

実施例２：ジャガイモ塊茎ＰＰＯｃＤＮＡクローンの配列分析及び詳細な特徴付 け ＰＰＯｃＤＮＡクローンの予備分析に基づいて、全長であると思われる２個の代 表的なｃＤＮＡクローンを選択し、標準的な配列決定プロトコルを用いて配列分 析した（ｐＫＧ４５−８及びｐＫＧ５９−４、図１参照）。λＺＡＰ　Ｉ　Ｉク ローン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に対する１ｎ　ｖｉｖｏ切り出しプロトコルを 用いて配列決定用の基質を調製した。残りのクローンは一部分を配列決定して、 塊茎で発現される個々の遺伝子の数に関してより多くの情報を得た。ヌクレオチ ド配列データから、２つのｃ　ＤＮＡクローンカテゴリーが判明した。これらの クローンは相同ではあるが、２つの異なるクラス二クラス■のクローン（ｐＫＧ ４５−８：表１）及びクラスＩＩのクローン（ｐＫＧ５９−４　：表１）に分類 された。表１に示すクローンの分類は配列相同性に基づく。おもしろいことに、 クラスＩＩのクローンは、単離したどのジャガイモｃＤＮＡクローンとも類似せ ず、従って塊茎で無類に発現されると推定された。

１６個のクローンの中で最も豊富な転写物が同一の遺伝子ファミリー（Ｂ　−Ｅ ）に属すことが判明した。この遺伝子ファミリーでは１０個の独立したｃＤＮＡ クローンが同定された。このグループの中では、Ｂ遺伝子の転写物が最も多いこ とが判明した（６個の独立したクローン）。他の全ての転写物（ＡｌＤ及びＥ） はより少ないレベルでｃＤＮＡバンクに存在した（表１参照）。

表１ 実施例３：構築的で、塊茎特異的発現用のＴｉ発現ベクターファミリーの構築 塊茎特異的発現を行うために、ＧＢＳＳ−Ｇ２８　（Ｒ。

ｈｄｅ等、１９９０．Ｊ、Ｇｅｎｅｔ、　ａｎｄ　Ｂｒｅｅｄ、　４４：３１１ −３１５）プロモーターを選択した。

使用するＧＢＳＳプロモーターは、ジャガイモ品種ＢｉｎｔｊｅのゲノムＤＮＡ から（ゲノムクローン０２８の配列データ（Ｒｏｈｄｅ、Ｗ、等、１９９０）か ら）単離した。

組織特異性のために必要な全ての配列を含むフラグメントを、ＰＣＲを用い、標 準的なプロトコルで単離した。Ｔｌベクター内でのクローニングを容易にするた めに制限部位をＰＣＲプライマーに含有させた。

使用したＧＢＳＳプロモーター（ゲノムクローンＧ２８に由来；Ｒｏｈｄｅ等、 １９９０）は−１１８４〜−８のＤＮＡを含んでいた。ＰＣＲプライマーに認識 部位を含有させて、Ｈｉｎｄ１１１部位（５゛）及びＢａｍＨＩ部位（３゛）を 末端に挿入した。フラグメント及びベクターをＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで 処理した後に、このフラグメントをゲル精製Ｔｉベクター（ｐｋＧｌｏｏｌ；以 下で説明）に挿入した。

ベクターｐＢ１１２１からＣａＭＶ　３５Ｓ発現ベクターを構築した（Ｊｅｆｆ ｅｒｓｏｎ等、１９８７．ＥＭＢＯＪ、　６：３９０１−３９０７）。改変は、 ｐＢ１１２１内の突然変異体ＮＰＴＩＩ遺伝子の置換と、ＧＵＳコード領域の欠 失とからなる。得られたベクター（ｐＫＧ１００１；図２ａ参照）は以下で説明 する他の発現ベクターの基体でもあった。塊茎特異的プロモーターをｐＫＧｌｏ ｏｌに挿入して、ＧＢＳＳプロモーターを含むｐＫＧ１００１／ＧＢＳＳを得た 。図２ａは、アンチセンス構築物を作製するのに使用するＴｉ発現ベクターの構 築を示す図である。

実施例４：ＣａＭＶ　３５Ｓプロモーター及び塊茎特異的発現Ｔｉベクターを使 用してのアンチセンス塊茎ＰＰｏ構築物のクローニング （ｐＫＧ４５−１及びｐ　Ｋ　Ｇ　５９−４に由来する）各全長ＰＰＯ遺伝子を 用いてアンチセンス構築物を作製した。

翻訳開始部位周辺のより短い領域を用いて他の組の構築物を作製した（図１参照 ）。

Ｔｉベクター内でのＰＰＯ遺伝子のクローニングの一般的な方法として、ＰＰＯ ｃＤＮＡの必要部位に対する配列特異的ＰＣＲプライマーを設計した（部位の正 確な位置については図１の配列を参照）。クローニングに使用すべき制限酵素の 認識部位はこれらのプライマーに組み込まれた（Ｉ３ａｍＨＩ及び１３ｇ１ＩＩ はそれぞれ５°末端及び３′末端）。

ｐＫＧ５９−４及びｐＫＧ４５−８由来の塊茎ＰＰＯ切片を前述の発現ベクター （ｐＫＧｌｏｏｌ及びｐＫＧ１００１／ＧＢＳＳ）に挿入した。これらの実験で は、５°セグメント及び、２つのｃＤＮＡに由来の全長切片を使用した（部位の 正確な位置については図１の配列を参照）。図４ｂはアンチセンスＰＰＯ構築物 の構築を示す図である。

得られた１２個のアンチセンスＰＰＯクローンの名称及び詳細を表２に示す。以 下の表では、使用したプロモーター及び挿入したアンチセンス遺伝子を記載する 。５′は対応ｃＤＮＡクローンの最初の約１２００個のヌクレオチドの使用を示 す。

表２ 実施例５：ジャガイモ植物内でのアンチセンスＰＰｏ構築物の形質転換 全てのジャガイモＰＰＯ構築物を電気穿孔法（ｅｌｅｔｒｏｐ。

ｒａｔｉｏｎ）によってＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ 株ＧＶ３１０１に導入し、制限酵素分析で構築物の組込み度を再検査した。その 後、部間移植片を用いた同時培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）によって、 前述の構築物を２種のジャガイモ系統（Ｖａｎ　Ｇｏｇｈ及びＤｉａｍａｎｔ） に導入した。これらの手法では標準的なプロトコルを使用した。選択培地で、構 築物及び栽培変種あたり約５０個の再生体（ｒｅｇｅｎｅｒａｎｔｓ）が生長し 、これらを分析した。

実施例６．形質転換した塊茎内のＰＰＯ酵素活性の分析合計１５００個の再生体 から８８２個が増殖し、これらを使用して、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ微小塊茎を製造し た。各系統（１ｉｎｅ）の微小塊茎的５ｇから粗タンパク質抽出物を生成し、こ の抽出物でＰＰＯ酵素アッセイを実施した（Ｆｌｕｒｋｅｙ、Ｗ、１９８６　Ｐ ｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ。

８１：６１４−６１．８の方法のｌ＆）、１ｍｌの抽出物容量中に、アッセイ用 基質として５０ｍＭカテコールを用いて、トランスジェニック系統で２回のアッ セイを実施した。

酵素活性は、５２０ｎｍ、２５℃（勾配）で１分間のｏＤの変化率として表す。

各系統で２つの独立した測定を繰り返し、分析のために結果の平均値を出した。

Ｄｉａｍａｎｔ及びＶａｎ　Ｇｏｇｈのアンチセンス形質転換細胞のそれぞれ平 均７４％及び７２％が、対照よりも低いＰｒｏ酵素活性を示した。アンチセンス ＰＰｏ構築物を含む３２系統には、この基質を用いて検出可能なＰＰＯ活性がな いことが判明した。Ｄｉａｍａｎｔでは、３５Ｓ　ＣａＭＶプロモーター構築物 を含む７系統が、ＧＢＳＳプロモーター構築物を含む１０系統がＰＰＯ活性を全 （示さなかった。

Ｖａｎ　Ｇｏｇｈでは、３５Ｓ　ＣａＭＶプロモーター構築物を含む１０系統と 、ＧＢＳＳプロモーター構築物を含む５系統でＰＰＯ活性レベルが検出できない ほどであった。

異なるアンチセンスＰＰＯ遺伝子（クラス！及びＩＩ）の間でも、構築物で使用 したＰＰＯ遺伝子切片の寸法に関しても、統計的に大きな差は認められなかった 。

図３に示す如（、使用した両方のヤガイモ品種で、３５Ｓ　ＣａＭＶプロモータ ー又はＧＢＳＳプロモーターを使用する全ての場合で、酵素活性の平均値が下が った。ＣａＭＶ　３５Ｓプロモーター制御下の構築物で形質変換した系統で、Ｐ ＰＯ活性の平均値が最も下がった。

実施例７：形質転換細胞の分子分析 ＰＰＯ活性の低いジャガイモ系統２００個を更に分子レベルで分析した。サザン ハイブリッド形成技術を用いると、すべてが予期される寸法のＴ−ＤＮＡインサ ートを含んでいることが分かった。挿入体コピー数は１〜１０であり、そのうち ５０％のコピー数は３未満であった。ＰＰＯｍＲＮΔレベルが非形質転換の対照 に比べて低下することも分かった。ＰＣＲプロトコルを使用してＰＰＯｍＲＮＡ についてアッセイを実施した。

実施例８：形質転換細胞の耐押し偏性の分析酵素活性のデータに基づいて、各品 種に由来する５ｏ系統（アンチセンスＰＰＯ構築の全ての変異体を含む）を圃場 試験用に選択した。選択した系統はＰＰＯ酵素活性が最小の植物を示す。

従来の育成方法で標準化テストを実施して、育種系統由来の塊茎の褐変度を測定 した。押し偶感受性の指数は、塊茎に標準化した機械的損傷を与えた後の塊茎の 褐変レベル及びテスト中での塊茎の比重を考慮して計算される。得られた褐変指 数（Ｂ　Ｉ）は０〜５０である。

選択した系統に由来する圃場で生長させた塊茎のＢｌを図４に示す。いずれの品 種の場合もＣａＭＶ　３５Ｓプロモーター系及びＧＢＳＳプロモーター系が対照 の平均値と比較してかなり異なることが統計テストから分かる。

これらの試験のデータは、本発明の構築物の発現によって、圃場条件下で押し傷 発生の表現型がかなり改善されることを明白に示している。

材料及び方法 ３０ｇ／Ｉのスクロースを加えたＭＳ培地（Ｍｕ　ｒ　ｉ　ｓｈｉｇｅ、　Ｔ、 　ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ、　Ｆ、　１９６２、　Ｐｈｙｓｉｏｉ、　Ｐｌａｎｔ　 １５：４７３−４９７）で、ジャガイモ植物（Ｓｏｌａｎｕｍ　Ｔｕｂｅｒ本質 的には前述のプロトコルに基づく同時培養法（Ｏ。

ｍｓ、Ｇ、　１９８９．等、Ｔｈｅｏｒ、Ａｐｐ！。

Ｇｅｎｅｔ　７３ニア４４−７５０）を用いて、アンチ１；ｖａｎ　Ｌａｒｅｂ ｅｋｅ、Ｎ、等、１９７４．Ｎａｔｕｒｅ　２５２：１６９−１７０）でジャガ イモ部間移植片を形質転換した。

分子生物学的方法（例えばサザン、ノーザン及びウェスタン分析、ＰＣＲ並びに 他のＤＮＡ操作）はＭａｎｉａｔｉｓが論じた方法であった（Ｍａｎｉａｔｉｓ 等、１９８２、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂ。

ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｂｏｒ　ＮＹ、）　。

シンク（５ｉｎｋ）の塊茎ｃＤＮＡから単離したλ　ＺＡＰ製した。

押し傷発生テスト（ｂｒｕｉｓｉｎｇ　ｔｅｓｔ）及び褐変指数（Ｂｒ。

ｖｎｉｎｇ　Ｉｎｄｅｘ）の測定を以主の如〈実施した。各系統から採取し、別 々のプロットで生長させたジャガイモに標準的な条件下で押し傷を与えた。壁に 詰め物をした木製箱からなる振動装置に２〜３ｋｇのジャガイモを入れた。箱を ２分間機械で振動させる。押し傷発生工程後に塊茎を１０℃（±１℃）で４日間 貯蔵する。その後、機械でジャガイモの皮をむき、皮を８０％除去して、褐変度 （変色した表面積のパーセント）を記録する。パーセンテージを４つのクラスに 分け、各クラスでの塊茎の数及び塊茎の比重を以下の式に導入して、Ｂｌを計算 する。

５Ｇｘ（ＣＩ＋１）ｘ（ＣＩＩ＋２）ｘ（ＣＩＩＩ＋３）ｘ（ＣＩＶ＋４）ＢＩ 　＝　Ｘ　１００ ６Ｘ（ＣＩ＋ＣＩＩ＋ＣＩＩＩ＋ＣＩＶ）式中、ＳＧはサンプル全体の比重であ り、Ｃ１〜ＣＩＶは所与のクラスに分類された塊茎の数である。

Ｖａｎ　Ｇｏｇｈ

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．ｉ）植物中で機能的なプロモーターと、ｉｉ）アンチセンスポリフェノール オキシダーゼ遺伝子若しくはその遺伝子部分に対応するＤＮＡ配列、又はこれと 相同のＤＮＡ配列と、ｉｉｉ）植物中で機能的なターミネーターとからなるＤＮ Ａ構築物。
2. ２．植物中で機能的な前記プロモーターが組織特異的プロモーターである請求項 １に記載のＤＮＡ構築物。
3. ３．前記組織特異的プロモーターが塊茎特異的プロモーターである請求項２に記 載のＤＮＡ構築物。
4. ４．前記塊茎特異的プロモーターが顆粒結合澱粉シンターゼ遺伝子のプロモータ ーに対応する請求項３に記載のＤＮＡ構築物。
5. ５．前記ＤＮＡ配列が少なくとも２５個のヌクレオチドを含んでいる請求項１か ら４のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
6. ６．前記ＤＮＡ配列が、ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子の全長コード配列を アンチセンスの向きに含んでいる請求項１から５のいずれか一項に記載のＤＮＡ 構築物。
7. ７．前記ＤＮＡ配列が、ジャガイモ植物細胞に内在するアンチセンスポリフェノ ールオキシダーゼ遺伝子若しくはその遺伝子部分、又はこれと相同のＤＮＡ配列 に対応する請求項１から６のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
8. ８．前記ＤＮＡ配列が、ジャガイモ塊茎細胞に内在するアンチセンスポリフェノ ールオキシダーゼ遺伝子若しくはその遺伝子部分、又はこれと相同のＤＮＡ配列 に対応する請求項７に記載のＤＮＡ構築物。
9. ９．ＤＮＡ配列が、植物細胞に内在するポリフェノールォキシダーゼヘの発現を コードする遺伝子に由来する請求項１から８のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築 物。
10. １０．ＤＮＡ配列が、ジャガイモ塊茎細胞に内在するポリフェノールオキシダー ゼヘの発現をコードする遺伝子に対応するｃＤＮＡに由来する請求項９に記載の ＤＮＡ構築物。
11. １１．ＤＮＡ配列が図１ａ又は図１ｂに示す如き配列に由来する請求項１０に記 載のＤＮＡ構築物。
12. １２．請求項１から１１のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含むベクター。
13. １３．請求項１０に記載のベクターを含む細菌細胞。
14. １４．請求項１から１１のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含む植物ゲノム 。
15. １５．請求項１から１１のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含む植物細胞。
16. １６．請求項１５に記載の植物細胞を含む植物。
17. １７．植物がジャガイモである請求項１６に記載の植物。
18. １８．請求項１から１１のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含む種子。
19. １９．請求項１から１１のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含むジャガイモ 塊茎。
20. ２０．１）請求項１から１１のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含む植物細 胞のゲノム内に挿入して、２）形質転換した植物細胞を形成し、３）形質転換し た植物細胞から遺伝学的に形質転換した植物を再生する段階からなるポリフェノ ールオキシダーゼ活性の低い植物を得る方法。