DE69230535T2

DE69230535T2 - Polyphenol oxidase gene

Info

Publication number: DE69230535T2
Application number: DE69230535T
Authority: DE
Inventors: Barry Dry; Piers Robinson
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Priority date: 1991-07-17
Filing date: 1992-07-16
Publication date: 2000-05-31
Anticipated expiration: 2012-07-17
Also published as: EP0599868B1; ATE188507T1; AU2331692A; CA2112998A1; JPH07501686A; ES2143475T3; DK0599868T3; GR3033104T3; CA2112998C; NZ243594A; US6936748B1; WO1993002195A1; DE69230535D1; EP0599868A4; EP0599868A1; AU655494B2; US6703542B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Modifikation von Polyphenoloxidase (PPO)-Aktivität in Obst und Gemüse und hierbei verwendbare DNA-Sequenzen.
Eine Braunfärbung von Pflanzengeweben erfolgt häufig infolge einer Verletzung oder Schädigung und dies führt im allgemeinen zum Schlechtwerden von Obst und Gemüse. Unerwünschterweise erfolgt ein Braunfärbung auch während der Verarbeitung an Pflanzenrohstoffen zur Herstellung von Lebensmitteln oder sonstigen Produkten. Während Transport, Lagerung und Verarbeitung werden Maßnahmen ergriffen, um diese Braunfärbungsreaktionen zu verhindern. Häufig umfaßt dies die Verwendung von Chemikalien, wie Schwefeldioxid, doch wird die Verwendung dieser Substanzen in Zukunft im Hinblick auf ihre Sicherheit und Verbraucherakzeptanz wahrscheinlich eingeschränkt. Beispielsweise verbot die US Food and Drug Administration 1986 die Verwendung von Sulfit für die meisten Frischobst- und -gemüsesorten. Die Erzeugung von Obst- und Gemüsesorten mit inhärent geringer Empfänglichkeit für eine Braunfärbung würde die Notwendigkeit dieser chemischen Behandlungen aufheben.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine oder mehr der mit dem Stand der Technik verbundenen Schwierigkeiten zu bewältigen oder zumindest zu verringern.
Bekanntlich wird die Braunfärbung in Pflanzen vorwiegend durch das Enzym PPO katalysiert. PPO befindet sich in den Plastiden von Pflanzenzellen, während die phenolischen Substrate des Enzyms in der Pflanzenzellvakuole gespeichert sind. Diese Kompartimentierung verhindert das Auftreten der Braunfärbungsreaktion, sofern die Pflanzenzellen nicht ge schädigt und das Enzym und seine Substrate vermischt werden. Wenn die Menge dieses Enzyms verringert werden könnte, würde die Empfänglichkeit des Gewebes für eine Braunfärbung reduziert werden.
Eine Information über die PPO-Sequenz kann zur Konstruktion synthetischer Gene verwendet werden, wobei diese Gene zur Verringerung der Expression des normalen PPO-Gens in Pflanzen transformiert werden können und dadurch die Synthese des Enzyms reduzieren.
Selbstverständlich sind in bestimmten Fällen die Braunfärbungsreaktionen in Pflanzen erwünscht, wie bei der Erzeugung von schwarzem Tee, Kakao, Kaffee, schwarzem Pfeffer, schwarzen Oliven und dgl. In diesen Fällen kann eine Erhöhung der Menge an PPO erwünscht sein, um günstige Braunfärbungsgrade oder Veränderungen der Geschmacksverbindungen hervorzurufen.
Die Rolle von PPO bei normalem Pflanzenwachstum und normaler Pflanzenentwicklung wird derzeit nicht verstanden. Es existiert eine Anzahl von Fällen, in denen erhöhte Konzentrationen dieses Enzyms mit erhöhter Beständigkeit gegenüber Pflanzenpathogenen korreliert sind. Folglich kann eine genetische Manipulation von Pflanzen zur Erhöhung des Grades der PPO-Aktivität eine günstige Beständigkeit gegenüber Pathogenen und Schädlingen verleihen.
Das Weinreben-PPO-Gen codiert für zusätzliche 103 Aminosäuren stromaufwärts des N-Terminus des reifen Proteins. Diese Region besitzt die Eigenschaften eines Chloroplasten-Transit-Peptids und ist sehr wahrscheinlich für die Zielrichtung des Proteins zu Import in den Chloroplasten und Prozessierung zur Erzeugung des reifen PPO-Proteins verantwortlich. Eine Transformation von Pflanzen mit diesem Gen kann daher zu einer richtigen Zielrichtung und Reifung der Weinreben- PPO in anderen Arten führen und zu einer Ansammlung von aktivem Weinreben-PPO-Enzym in den Plastiden dieser Gewebe führen.
Die hier verwendeten Ausdrücke "PPO-codierendes Gen", "Gen mit Codierung für PPO" oder "PPO-Gen" sollten sich selbstverständlich auf das PPO-Gen oder eine im wesentlichen hierzu homologe Sequenz beziehen.
In einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt ein isoliertes DNA-Molekül eine DNA-Sequenz mit Codierung für ein Polypeptid mit Pflanzenpolyphenoloxidase (PPO)-Aktivität oder ein Fragment derselben. Die Sequenz umfaßt DNA mit Codierung für eine Aminosäuresequenz, die einer Kupferbindungsstelle auf dem Polypeptid entspricht. Ein beliebiges Fragment des DNA-Moleküls kann die Expression von PPO in einem Pflanzengewebe modifizieren.
Die DNA-Sequenz kann eine Prä-Sequenz eines Pflanzen-PPO- Gens mit Codierung für ein Transit-Peptid umfassen.
Die DNA-Sequenz kann modifiziert werden. Die DNA-Sequenz kann eine Sequenz mit Codierung für Antisense-mRNA zu einem Pflanzen-PPO-Gen oder ein Fragment derselben umfassen. Die DNA-Sequenz kann eine katalytische Spaltungsstelle umfassen.
Alternativ kann die Prä-Sequenz durch andere Targeting-Sequenzen zum Dirigieren des Polypeptids mit Pflanzen-PPO- Aktivität zu anderen Zellkompartimenten ersetzt werden.
Die DNA-Sequenz kann eine vermutliche Chloroplasten-Transit- Sequenz und ein reifes Weinreben-PPO-Protein gemäß der Darstellung in Fig. 1 enthalten.
Die DNA-Sequenz kann ein Gen mit Codierung für ein Polypeptid mit einer Saubohnenblatt-PPO-Aktivität gemäß der Darstellung in Fig. 2 umfassen.
Die DNA-Sequenz kann ein Gen mit Codierung für ein Polypeptid mit Apfelfrucht-PPO-Aktivität gemäß der Darstellung in Fig. 3 umfassen.
Die DNA-Sequenz kann ein Gen mit Codierung für ein Polypeptid mit Kartoffelknollen-PPO-Aktivität gemäß der Darstellung in Fig. 4 umfassen.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt ein DNA-Molekül eine DNA-Sequenz mit Codierung für Antisense-mRNA zu einem Pflanzen-PPO-Gen oder ein Fragment derselben mit der Fähigkeit zum Modifizieren der Expression von PPO in einem Pflanzengewebe.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinante-DNA-Plasmids, das eine DNA-Sequenz gemäß der Definition im ersten Aspekt der Erfindung umfaßt, das Umsetzen eines DNA-Moleküls gemäß der Definition in dem ersten Aspekt mit einem Plasmidexpressionsvektor zum Einsetzen der DNA-Sequenz in den Plasmidexpressionsvektor.
Die DNA-Sequenz mit Codierung für PPO kann aus beispielsweise aus einer Pflanzenprobe isolierter polyadenylierter RNA gebildet werden. Die Pflanze kann aus Äpfeln, Kartoffeln, Trauben und Bohnen ausgewählt werden. Vorzugsweise wird die Pflanzenprobe aus Beeren von Sultanatrauben, Saubohnenblättern, Apfelschale oder -cortex oder Kartoffelknollen isoliert.
Zur Bereitstellung einer DNA-Sequenz mit Codierung für PPO kann in einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung das Verfahren der Herstellung eines rekombinante-DNA- Plasmids die Vorstufen
Isolieren von polyadenylierter RNA mit Codierung für ein Polypeptid mit Pflanzen-PPO-Aktivität aus einer Quelle des Polypeptids; und
Behandeln der polyadenylierten RNA zur Konstruktion von copy-DNA (cDNA)
umfassen.
Die Isolierung der polyadenylierten RNA kann unter Verwendung einer oligo-dT-ausgesponnenen Säule durchgeführt werden.
Die Stufe der Behandlung der polyadenylierten RNA zur Konstruktion von cDNA gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung kann
Behandeln der polyadenylierten RNA mit reverser Transkriptase und einem Adaptorprimer zur Bildung einer ErststrangcDNA; und
Amplifikation der so gebildeten cDNA unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR)
umfassen.
In der Stufe der Umsetzung der polyadenylierten RNA mit reverser Transkriptase kann ein Oligonucleotid-Adaptorprimer mit der Sequenz
verwendet werden.
In der Stufe der Amplifikation der cDNA können ein Adaptorprimer mit der Sequenz
und ein 5'-Ende-Primer verwendet werden.
Der 5'-Ende-Primer kann die Sequenz
aufweisen, wenn er für die Amplifikation von Trauben-cDNA verwendet wird.
Der 5'-Ende-Primer kann die Sequenz
aufweisen, wenn er für die Amplifikation von Bohnen-cDNA verwendet wird.
Der 5'-Ende-Primer kann die Sequenz
aufweisen, wenn er für die Amplifikation von Apfel-cDNA verwendet wird.
Der 5'-Ende-Primer kann die Sequenzen
aufweisen, wenn er für die Amplifikation von Kartoffel-cDNA verwendet wird.
Alternativ kann die Stufe der Behandlung der polyadenylierten RNA zur Konstruktion von cDNA gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung
Behandeln der polyadenylierten RNA mit reverser Transkriptase und einem PPO-spezifischen Primer zur Bildung eines cDNA- Erststrangs;
Behandeln der so gebildeten cDNA mit terminaler d-Transferase zum Anheften einer Polyadenosinschwanz-Sequenz am 3'-Ende der cDNA; und
Amplifikation der so gebildeten polyadenylierten cDNA durch PCR
umfassen.
In der Stufe der Behandlung der polyadenylierten RNA mit reverser Transkriptase kann ein PPO-spezifischer Oligonucleotidprimer mit der Sequenz
für Trauben-PPO verwendet werden oder es handelt es sich bei dem PPO-spezifischen Primer um einen Oligonucleotidprimer mit der Sequenz
für Kartoffelknollen-PPO.
In der Stufe der Amplifikation der cDNA können ein Oligonucleotidadaptorprimer mit der Sequenz
und ein PPO-spezifischer Oligonucleotidprimer mit der Sequenz
für Trauben-PPO oder die Sequenz
für Kartoffelknollen-PPO verwendet werden.
Der Plasmidexpressionsvektor zur Klonierung der doppelsträngigen cDNA kann von beliebiger geeigneter Art sein. Der Plasmidvektor Bluescript SK+ erwies sich als geeignet.
Die Klonierungsstufe kann in einer beliebigen geeigneten Form erfolgen. Eine bevorzugte Form umfaßt Glätten der Enden der cDNA, beispielsweise mit Klenow-Fragment;
Fraktionieren der so gebildeten cDNA, beispielsweise auf einem Agarosegel;
Isolieren eines Fragments der erwarteten Größe, beispielsweise aus dem Gel; und
Ligation des Fragments in eine geeignete Restriktionsenzymstelle, beispielsweise die HindIII- oder EcoRI-Stelle eines Bluescript-SK&spplus;-Vektors.
Zum Testen der so gebildeten Klone kann ein geeigneter Mikroorganismus mit dem Plasmidexpressionsvektor transformiert, der Mikroorganismus kultiviert und das darin codierte Polypeptid exprimiert werden. Der Mikroorganismus Escherichia coli DH5 erwies sich als geeignet.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein rekombinante-DNA-Plasmid, das eine DNA-Sequenz gemäß der Definition im ersten Aspekt der Erfindung umfaßt, bereitgestellt, wobei das Plasmid in einem einzelligen Organismus repliziert, transkribiert und translatiert werden kann.
Der Plasmidexpressionsvektor kann von einer beliebigen geeigneten Art sein. Das rekombinante Plasmid kann ein konstitutives Promotorelement stromaufwärts der DNA-Sequenz mit Codierung für ein Polypeptid mit PPO-Aktivität enthalten.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit im Vergleich zu einer nichttransformierten Pflanze verringerter PPO-Aktivität das Einführen eines DNA-Konstrukts, umfassend eine Sequenz mit Codierung für Antisense-mRNA zu einem Pflanzen-PPO-Gen oder ein Fragment derselben mit der Fähigkeit zur Verringerung der Expression von PPO in einem Pflanzengewebe, in eine Pflanzenprobe.
Die Pflanze kann von einer beliebigen geeigneten Art sein. In einem bevorzugten Aspekt kann die Pflanze aus Weinreben, Kartoffeln, Äpfeln und Bohnen ausgewählt sein.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit im Vergleich zu einer nichttransformierten Pflanze verringerter Pflanzen-PPO-Aktivität das Einführen eines DNA-Konstrukts, umfassend ein Gen mit Codierung für ein Polypeptid mit Pflanzen-PPO-Aktivität oder ein Fragment desselben mit der Fähigkeit zur Verringerung der Expression von PPO in einem Pflanzengewebe, wobei optional eine katalytische Spaltungsstelle eingebaut wird, in eine Pflanzenprobe.
Die Pflanze kann von einer beliebigen geeigneten Art sein. In einem bevorzugten Aspekt kann die Pflanze aus Tabak, Saubohne, Tomate, Tee, Kaffee und Kakao ausgewählt sein.
Die Prä-Sequenz mit Codierung für das Transit-Peptid kann durch andere Targeting-Sequenzen zum Dirigieren des PPO-Proteins zu anderen Zellkompartimenten ersetzt werden. Es sind bereits Sequenzen bekannt, die Fremdgene in die Vakuole, den Mitochondrien- oder interzellulären Raum von Pflanzenzellen dirigieren. Außerdem könnte die Transit-Sequenz für Weinreben-PPO zur Zielrichtung anderer Proteine in die Plastide verwendet werden.
Das DNA-Konstrukt kann einen konstitutiven Promotor, der zu einer Expression der eingeführten Gene durchgängig in der Pflanze führen würde, umfassen.
Bekanntlich wird PPO in vielen Pflanzengeweben in bestimmten Gewebearten hoch exprimiert. Beispielsweise ist die PPO-Aktivität in der Haut von Weintrauben viel höher als im Fruchtfleisch, und die Schale von Kartoffelknollen besitzt eine höhere Aktivität als der Cortex.
Es kann erwünscht sein, die Höhe der PPO-Aktivität lediglich in bestimmten Pflanzengeweben oder in bestimmten Stadien der Pflanzenentwicklung zu verändern, was durch die Verwendung spezifischer Promotorelemente erreicht werden kann. Beispielsweise ändert die Verwendung des Patatinpromotors die PPO-Konzentrationen lediglich im Knollengewebe von Kartoffelpflanzen. Dies verringert die PPO-Aktivität in der Knolle und reduziert eine Braunfärbung, läßt jedoch die PPO-Aktivität in sonstigen Teilen der Kartoffelpflanze unverändert.
Das DNA-Konstrukt kann demgemäß einen für die Schale oder Haut von Obst und Gemüse spezifischen Promotor zur Zielrichtung von Fremdproteinen spezifisch auf die äußeren Gewebeschichten umfassen.
Auf diese Weise können Eigenschaften der Haut oder Schale, beispielsweise Farbe, Geschmack, Widerstandsfähigkeit gegen Pathogene und dgl., unabhängig von den inneren Teilen von Obst oder Gemüse, die konsumiert werden, manipuliert werden.
In einem bevorzugten Aspekt kann das DNA-Konstrukt einen binären Vektor, in den eine DNA-Sequenz mit Codierung für PPO oder ein Fragment derselben eingeführt wurde, umfassen.
In einem weiteren bevorzugten Aspekt kann die Einführung des DNA-Konstrukts in die Pflanze in der Infizierung der Pflanze mit einem das DNA-Konstrukt enthaltenden Agrobacterium bestehen.
In einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt wird eine DNA- Sonde mit einer DNA-Sequenz gemäß der Definition in dem ersten Aspekt oder einem Fragment derselben mit der Fähigkeit zur Modifikation der Expression von PPO in einem Pflanzengewebe bereitgestellt.
Die Sonde kann in einer beliebigen geeigneten Weise markiert sein. Es kann eine radioaktive oder nicht-radioaktive Markierung verwendet werden. Der Bequemlichkeit halber kann die Sonde in Form eines klonierten Inserts in einem geeigneten Plasmidvektor bereitgestellt werden.
Die Weinreben-PPO-Sequenz kann zur Planung bzw. Konstruktion von Allzweck-Oligonucleotidprimern zur Verwendung in der PCR zur Gewinnung dieses Gens aus anderen Arten verwendet werden. Pflanzen-PPO-Proteine enthalten bekanntlich Kupfer als prosthetische Gruppe und es wurden zwei Regionen der Traubenproteinsequenz, die Homologie zu Sequenzen von Hämocyanin- und Tyrosinaseproteinen aufweisen, die den Kupferbin dungsstellen auf diesen Proteinen entsprechen, identifiziert. Da diese Regionen zwischen sehr unterschiedlichen Organismen offensichtlich konserviert sind, eignen sie sich zur Konstruktion von Sonden und Primern zur Gewinnung der PPO-Gene sonstiger Pflanzen.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird demgemäß ein Verfahren zum Isolieren einer DNA-Sequenz gemäß der Definition im ersten Aspekt aus einer Pflanze, umfassend das Hybridisieren einer DNA-Sonde der obigen Definition mit einer cDNA- oder genomischen Bibliothek zur Identifizierung von die DNA-Sequenz enthaltenden Klonen, bereitgestellt. Die DNA-Sonde kann eine ein Fragment des Apfel-, Kartoffel-, Trauben- oder Bohnen-PPO-Gens umfassende DNA-Sequenz, die zwischen unterschiedlichen Arten hoch konserviert ist, umfassen.
Die DNA-Sonde kann nach einem Verfahren, umfassend Bereitstellen von Gesamt-cDNA aus einer Pflanzenart und von zwei oder mehr Oligonucleotidprimern, die spezifisch mit einem Gen mit Codierung für ein Polypeptid mit Pflanzen-PPO- Aktivität, das Sequenzen des Apfel-, Kartoffel-, Trauben- oder Bohnen-PPO-Gens, die zwischen unterschiedlichen Arten hoch konserviert sind, umfaßt, hybridisieren; und
Durchführen von PCR zur Amplifikation einer DNA-Sequenz, die ein Gen mit Codierung für ein Polypeptid mit Pflanzen-PPO- Aktivität oder ein Fragment derselben umfaßt, hergestellt werden.
Die Oligonucleotidprimer können DNA-Sequenzen umfassen, die den Kupferbindungsstellen auf dem Polypeptid mit Pflanzen- PPO-Aktivität entsprechen.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Isolierung einer DNA-Sequenz gemäß der Definition im ersten Aspekt aus einer Pflanzenart bereitgestellt, umfassend
Bereitstellen von aus der Pflanze isolierter mRNA, einem Poly-dT-Adaptorprimer und zwei oder mehr Oligonucleotidprimern;
Behandeln der mRNA mit reverser Transkriptase und einem Adaptorprimer zur Bildung eines cDNA-Erststrangs; und
Amplifikation der auf diese Weise gebildeten cDNA unter Verwendung der Oligonucleotidprimer und der Polymerasekettenreaktion.
In einem bevorzugten Aspekt können die Oligonucleotidprimer auf den Apfel-, Kartoffel-, Trauben- oder Bohnen-PPO-Gensequenzen basieren.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Isolierung einer DNA-Sequenz gemäß der Definition im ersten Aspekt aus einer Pflanzenart bereitgestellt, umfassend
Bereitstellen einer Expressionsbibliothek und eines polyklonalen Antikörpers, der gegen ein gereinigtes Polypeptid mit PPO-Aktivität gebildet wurde; und
Umsetzen des polyklonalen Antikörpers mit der Expressionsbibliothek zur Identifizierung von Klonen, die eine DNA-Sequenz, die ein Gen mit Codierung für ein Polypeptid mit PPO- Aktivität umfaßt, oder Fragmente derselben enthalten.
Ein Verfahren zur Reinigung des PPO-Proteins umfaßt Bereitstellen von einer Pflanzenprobe und einem Detergens und einer oder mehr Chromatographiesäulen;
Extrahieren der Pflanzenprobe mit dem Detergens;
Behandeln des auf diese Weise gebildeten Extrakts mit Ammoniumsulfat; und
Fraktionieren des auf diese Weise gebildeten Extrakts durch Überleiten über die Chromatographiesäulen.
Die Pflanzenprobe kann von einer beliebigen geeigneten Art sein. Die Pflanzenprobe kann aus den Beeren von Weinreben bestehen. Dieses Gewebe enthält hohe Konzentrationen von PPO und im Saft von reifen Weintrauben ist der größte Teil der PPO-Aktivität an die Feststoffe gebunden und läßt sich vom Saft durch Zentrifugation abtrennen und anschließend mit Detergentien in Lösung bringen. Die Pflanzenprobe kann aus Bohnenblättern bestehen.
Das Detergens kann kationisch sein. Das Detergens Hexadecyltrimethylammoniumbromid (CTAB) erwies sich als geeignet.
Die Chromatographiesäulen können Sepharose zur Basis haben. Es können drei Chromatographiesäulen verwendet werden. Q- Sepharose und anschließend Phenylsepharose und wiederum anschließend Hydroxylapatit erwiesen sich als geeignet.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein PPO-Protein in einer praktisch reinen Form mit der N- terminalen Aminosäuresequenz
bereitgestellt.
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden unter Bezug auf die beigefügten Beispiele und Zeichnungen genauer beschrieben. Selbstverständlich dient die folgende Beschreibung jedoch nur zur Erläuterung und sollte in keinster Weise als Einschränkung der allgemeinen Gültigkeit der im vorhergehenden beschriebenen Erfindung dienen.
In den Abbildungen:
Fig. 1:
Die zusammengesetzte GPO1-cDNA-Nucleotidsequenz in voller Länge und davon abgeleitete Proteinsequenz mit Codierung sowohl der vermutlichen Chloroplasten-Transit-Sequenz als auch des reifen Weinreben-PPO-Proteins.
Die Translationsstartstelle ist in Fettdruck angegeben und der N-Terminus des reifen PPO-Proteins ist mit einem Sternchen markiert. Die gestrichelte Linie zeigt die Position des N-terminalen Primers und die zwei durchgezogenen Linien geben die zur Konstruktion der beiden Antisense-Primer zur Klonierung der Transit-Peptidsequenz verwendeten Regionen an.
Fig. 2:
Nucleinsäure- und abgeleitete Proteinsequenz des BPO1-Klons von Saubohnenblatt-Polyphenoloxidase. Die durchgezogene Linie gibt die zur Amplifikation der cDNA durch die Polymerasekettenreaktion verwendete Region des B15-Primers an.
Fig. 3:
Nucleinsäure- und abgeleitete Proteinsequenzen der Klone pSR7 und pSR8 mit Codierung für Apfelfrucht-PPO. Die durchgezogene Linie gibt die zur Amplifikation der cDNA durch die Polymerasekettenreaktion verwendete Region des GEN4-Primers an.
Fig. 4:
Nucleinsäure- und abgeleitete Proteinsequenzen der Klone mit Codierung für Kartoffelknollen-PPO. Die durchgezogene Linie gibt die zur Amplifikation der cDNA durch die Polymerasekettenreaktion verwendete Region des GEN3-Primers an.

Beispiel 1

Reinigung des PPO-Proteins

PPO wurde aus den Beeren von Weinreben gereinigt. Die Anfangsversuche zeigten, daß dieses Gewebe hohe Konzentrationen des Enzyms enthielt und daß lediglich eine Form des Enzyms nach der Bestimmung durch Elektrophorese in Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid (SDS-PAGE)-Gelen vorlag. Im Saft von reifen Weintrauben war der größte Teil der PPO-Aktivität an die Feststoffe gebunden und konnte vom Saft durch Zentrifugation abgetrennt und anschließend mit Detergentien in Lösung gebracht werden. Die Enzymaktivität während der Reinigung wurde als Sauerstoffaufnahme in Gegenwart des Substrats 4-Methylbrenzkatechin gemessen. Alle Stufen während der Reinigung wurden bei 4ºC durchgeführt.
30 kg Sultanatrauben wurden mit einer Kleinweinpresse zerquetscht und jeweils 900 ml Traubensaft wurden mit 100 ml einer Lösung von 100 mM Ascorbat plus 10 mM Dithiothreit versetzt. Der Saft wurde 10 min lang mit 10.000 x g zentrifugiert und der Überstand wurde verworfen. Der Pelletteil wurde in 25 mM Natriumphosphat eines pH-Werts von 7,2 plus 10 mM Ascorbat und 1 mM Dithiothreit bis zu einem Endvolumen von 1,75 l resuspendiert. Danach wurden 250 ml einer 4%igen (w/v)-Lösung des kationischen Detergens Hexadecyltrimethylammoniumbromid (CTAB) zugegeben. Nach 20-minütigem Inkubieren wurde der Extrakt 15 min lang mit 15.000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde mit festem Ammoniumsulfat bis auf 45% gesättigt und der pH-Wert wurde auf 7,0 eingestellt. Anschließend wurde 15 min lang mit 15.000 x g zentrifugiert. Dieser Überstand wurde mit festem Ammoniumsulfat bis zu 95% gesättigt und der pH-Wert wurde auf 7,0 eingestellt. Anschließend wurde 30 min lang mit 15.000 x g zentrifugiert. Das Pellet wurde in 20 mM Bis-trispropan eines pH-Werts von 7,5 plus 10 mM Ascorbat und 2 mM Dithiothreit (Puffer A) in einem Endvolumen von 100 ml resuspendiert. Der Extrakt wurde auf einer mit Puffer A mit einer Strömungsrate von 10 ml/min equilibrierten 4 · 40 cm-Säule mit Sephadex G25 entsalzt und die aktiven Fraktionen wurden gepoolt.
Der Extrakt wurde auf eine mit Puffer A mit einer Strömungsrate von 6 ml/min equilibrierte 2,5 · 10 cm-Säule von Q-Sepharose Fast Flow appliziert. Die Säule wurde anschließend mit 400 ml Puffer A gewaschen. Die PPO wurde mit einem Gradienten von 0-500 mM NaCl in Puffer A eluiert und die aktiven Fraktionen wurden gepoolt. Ammoniumsulfat wurde bis zu einer Endkonzentration von 1 M zugegeben und der pH-Wert wurde auf 7,0 eingestellt. Diese Fraktion wurde auf eine mit 50 mM Natriumphosphat, pH-Wert 7,0 plus 1 M Ammoniumsulfat, 1 M KCl und 1 mM Dithiothreit (Puffer B) mit einer Strömungsrate von 1,5 ml/min equilibrierte 1 · 35 cm-Säule von Phenylsepharose Fast Flow aufgegeben. Die Säule wurde mit 120 ml Puffer B gewaschen und die PPO wurde anschließend mit einem Gradienten von 100-0% Puffer B eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden gepoolt und über eine Amicon-PM10-Ultrafiltrationsmembran eingeengt und anschließend mit der gleichen Membran gegen dreimaligen Wechsel von 20 mM Kaliumphosphat, pH-Wert 7,0, plus 1 mM Dithiothreit (Puffer C) einer Diafiltration unterworfen. Diese Fraktion wurde auf eine mit Puffer C mit einer Strömungsrate von 1 ml/min equilibrierte 1 · 30 cm-Säule mit Hydroxylapatit appliziert. Die Säule wurde mit 50 ml Puffer C gewaschen und dann wurde PPO mit einem Gradienten von 0-500 mM Kaliumphosphat in Puffer C eluiert. Die gepoolten aktiven Fraktionen wurden auf 20% (v/v) in Glycerin eingestellt und bei -80ºC eingefroren.
Dieses Verfahren führte zu einer 180-fachen Reinigung von PPO und ergab 3,5 mg gereinigtes PPO-Protein. Die Reinigung wird im folgenden zusammengefaßt: Reinigung von Weinbeeren-PPO
* von 30 kg Trauben
Die Reinheit der Präparation wurde durch denaturierende SDS- PAGE geprüft. Eine einzige diffuse Bande eines Proteins mit scheinbarem Molekulargewicht von 40 kDa war in der Endpräparation vorhanden.

Beispiel 2

Aminosäuresequenzierung

Etwa 1 mg gereinigtes PPO-Protein wurde auf einer mit 20 mM Ammoniumbicarbonat, pH-Wert 7,6, mit einer Strömungsrate von 5 ml/min equilibrierten 2,5 · 20 cm-Säule von Sephadex G25 entsalzt. Der Proteinpeak wurde gesammelt und unter Stickstoff getrocknet. Das getrocknete Protein wurde carboxymethyliert und die N-terminale Aminosäuresequenz wurde mit einem Aminosäuresequenzierungsautomaten durch Edman-Abbau bestimmt. Die folgende Sequenz wurde erhalten:

Beispiel 3

Klonierung des Trauben-PPO-Gens

Die Gesamt-RNA wurde aus den Beeren von Sultanatrauben gemäß dem Verfahren von Rezaian und Krake (1) isoliert. Eine poly(A)&spplus;-angereicherte RNA-Fraktion wurde durch Überleiten der Gesamt-RNA über eine oligo-dT-ausgesponnene Säule (Pharmacia LKB Biotechnology) erhalten.
Erststrang-cDNA wurde in einem Reaktionsgemisch aus 50 mM Tris-HCl eines pH-Werts von 8,3, 25 mM KCl, 10 mM MgCl&sub2;, 4 mM DTT, 1 mM NaPPi, 1 mM dNTPs, 1 U Ribonucleaseinhibitor, 1,4 ug poly(A)&spplus;-angereicherter Weinbeeren-RNA, 21 U AMV-reverse-Transkriptase (Promega Corp.) und 0,5 ug Hybrid-dT17- Adaporprimer
bei 42ºC 1 h lang synthetisiert. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf 800 ul mit TE (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 1 mM EDTA) verdünnt und bei -20ºC gelagert.
Ein 32-merer Oligonucleotidprimer
wurde für die N-terminale Proteinsequenz (Aminosäuren 2-12) von gereinigtem Trauben-PPO konstruiert. Inosin wurde an Positionen, an denen mehr als zwei Basen ausgewählt werden konnten, auf der Basis von Codon-Verwendungstabellen verwendet. Dieser und alle sonstigen beschriebenen Oligonucleotidprimer wurden auf einem Applied Biosystems DNA- Synthesegerät synthetisiert.
cDNA wurde durch Polymerasekettenreaktion (PCR) praktisch gemäß dem Verfahren von Frohman (2) in einem 50-ul-Reaktionsgemisch aus 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 9,0 bei 25ºC), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,2 mM dNTPs, 0,01% Gelatine (w/v), 0,1% Triton X-100, 5 ul verdünntem Erststrang-cDNA-Reaktionsgemisch, 1,25 U Taq-DNA-Polymerase (Promega Corp.), 100 nM Adaptorprimer
und 1 uM N-terminalem Primer (der obigen Beschreibung) amplifiziert. Die Amplifikation umfaßte ein Anfangsprogramm aus 5 Zyklen mit 1 min Denaturieren bei 94ºC, 1 min Renaturieren bei 55ºC, einem langsamen Anstieg auf 72ºC über 2 min und einer Verlängerung bei 72ºC über 3 min und anschließend 25 Zyklen mit 94ºC während 1 min. 55ºC während 1 min und 72ºC während 3 min. Die amplifizierte DNA wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt und in TE resuspendiert. Die DNA wurde mit dem Klenow-Fragment glattendig gemacht und auf einem 2% Nusieve-GTG-Agarose (FMC Bioproducts)-Gel fraktioniert. Ein 1700-bp-Fragment wurde aus dem Gel isoliert und in die HincII-Stelle eines Bluescript-SK&spplus;-Vektors (Stratagene Cloning Systems) ligiert. Die ligierte DNA wurde in E. coli DH5 eingeführt. Positive Klone (mit der Bezeichnung GPO) wurden isoliert und nach dem Didesoxysequenzierungsverfahren (3) sequenziert.
Dies bestätigte das Vorliegen des N-terminalen Primers und der Vergleich der abgeleiteten Proteinsequenz stromabwärts des Primers mit der für das obige gereinigte Trauben-PPO-Enzym erhaltenen N-terminalen Proteinsequenz bestätigte, daß dieser Klon für Trauben-PPO codierte.

Beispiel 4

Klonierung der Transit-Peptid-Sequenz

Northern-Blots von Trauben-mRNA mit dem im vorhergehenden beschriebenen 1700-bp-Klon als Sonde identifizierten ein Transkript mit 2200 bp, das mit dem Klon hybridisierte. Dies legte nahe, daß eine weitere Sequenz stromaufwärts des pri mären 5'-Endes des Klons vorlag, auch wenn der Klon für den N-Terminus des reifen PPO-Proteins codierte. Ein cDNA-Klon, der das 5'-Ende von GPO1-mRNA (mit Codierung für das vermutliche Transit-Peptid) enthielt, wurde aus Weinbeeren-RNA praktisch gemäß der Beschreibung in (2), jedoch mit eingenisteten Antisense-Primern amplifiziert. Erststrang-cDNA wurde aus poly(A+)-angereicherter Weinbeeren-RNA gemäß der obigen Beschreibung synthetisiert, wobei jedoch der Hybrid-dT17- Adaptorprimer durch den zu einer 44 Basen stromabwärts der N-terminalen Primerregion gelegenen Region (d. h. 416-435 nt; Fig. 1) komplementären GPO1-spezifischen Primer 1
ersetzt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde mit 0,1 x TE auf 2 ml verdünnt und durch ein Centricon-30-Spinfilter (Amicon Corp.) bei 4000 g 20 min lang zentrifugiert, um überschüssigen Primer zu entfernen. Diese Stufe wurde wiederholt und die verbleibende Flüssigkeit wurde unter Verwendung von Speed-Vac-Zentrifugation auf 20 ul eingeengt. Eine poly(dA)- Schwanz-Sequenz wurde an das 3'-Ende des cDNA-Strangs mit Terminal-d-Transferase (Promega Corp.) angeheftet, wobei ein 20-ul-Reaktionsgemisch aus 11,5 ul cDNA, 4 ul 5 · Tailing- Buffer (Promega Corp.), 4 ul ATP (1 mM) und 10 U Terminal-d- Transferase 5 min lang bei 37ºC, anschließend 5 min lang bei 65ºC inkubiert und anschließend mit TE auf 500 ul verdünnt wurde. Die PCR-Amplifikation der poly(dA)-Schwanz-cDNA wurde in einem Reaktionsgemisch aus 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 9,0 bei 25ºC), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,2 mM dNTPs, 0,01% Gelatine (w/v), 0,1% Triton X-100, 5 ul verdünntem Erststrang-cDNA-Reaktionsgemisch, 1,25 U Taq-DNA-Polymerase (Promega Corp.), 200 nM Hybrid-dT17-Adaptorprimer und 900 nM GPO1-spezifischem Primer 2
der zu einer unmittelbar stromabwärts der N-terminalen Primerbindungsregion gelegenen Region (374-393 nt; Fig. 1) komplementär ist, durchgeführt. Die Amplifikation umfaßte 25 Zyklen mit 94ºC während 1 min. 55ºC während 1 min und 72ºC während 3 min. Das hierbei erhaltene 430-bp-Fragment wurde in den Bluescript-SK&spplus;-Vektor kloniert und gemäß der obigen Beschreibung sequenziert. Es zeigte sich, daß er die vorhergesagte Region einer überlappenden Sequenz mit dem GPO1-Klon enthielt, und es wurde bestätigt, daß dieser cDNA-Klon das 5'-Ende der GPO1-mRNA enthielt.

Beispiel 5

Clonierung des Bohnenblatt-PPO-Gens

Die Gesamt-RNA wurde aus den Blättern von Saubohnen gemäß dem Verfahren von Rezaian und Krake (1) isoliert. Eine poly(A)&spplus;-angereicherte RNA-Fraktion wurde durch Überleiten der Gesamt-RNA über eine oligo-dT-ausgesponnene Säule (Pharmacia LKB Biotechnology) erhalten.
Erststrang-cDNA wurde in einem Reaktionsgemisch aus 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,3, 25 mM KCl, 10 mM MgCl&sub2;, 4 mM DTT, 1 mM NaPPi, 1 mM d.NTPs, 1 U Ribonucleaseinhibitor, 3,1 ug poly(A)+-angereicherter Saubohnen-RNA, 21 U AMV-reverse- Transkriptase (Promega Corp.) und 0,81 ug Hybrid-dT17-Adaptorprimer:
bei 42ºC 1 h lang synthetisiert. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend mit TE (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 1 mM EDTA) auf 840 ul verdünnt und bei -20ºC gelagert.
Ein 25-merer Oligonucleotidprimer (B15):
wurde auf der Grundlage der Sequenz von Trauben-PPO konstruiert.
cDNA wurde durch Polymerasekettenreaktion (PCR) im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Frohman (2) in einem 100-ul- Reaktionsgemisch aus 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 9,0 bei 25ºC), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,2 mM dNTPs, 0,01% Gelatine (w/v), 0,1% Triton X-100, 20 ul verdünntem Erststrang-cDNA-Reaktionsgemisch, 2,5 U Taq-DNA-Polymerase (Promega Corp.), 100 nM Adaptorprimer (5'-GACTCGAGTCGACATCG) und 1 uM B15-Primer (der obigen Beschreibung) amplifiziert.
Die Amplifikation umfaßte ein Anfangsprogramm von 3 Zyklen mit Denaturieren bei 94ºC während 1 min. Renaturieren bei 37ºC während 2 min. einem langsamen Anstieg auf 72ºC über 2 min und einer Verlängerung bei 72ºC während 3 min und anschließend 25 Zyklen mit 94ºC während 1 min. 55ºC während 1 min und 72ºC während 3 min. Die amplifizierte DNA wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt und in TE resuspendiert. Die DNA wurde mit dem Klenow-Fragment glattendig gemacht und auf einem 2% Nusieve-GTG-Agarose (FMC Bioproducts)-Gel fraktioniert. Ein 700-bp-Fragment wurde aus dem Gel isoliert und in die EcoRV-Stelle eines Bluescript- SK&spplus;-Vektors (Stratagene Cloning Systems) ligiert. Die ligierte DNA wurde in E. coli DH5 eingeführt. Rekombinante Klone wurde unter Verwendung eines radioaktiv markierten Fragments des Trauben-PPO-Klons (GPO1) durchmustert und es wurde ein positiver Klon (mit der Bezeichnung BPO1) isoliert und nach dem Didesoxysequenzierungsverfahren (3) sequenziert.

Beispiel 6

Klonierung von Apfel-PPO-Genen

Die Gesamt-RNA wurde aus unreifen Äpfeln gemäß dem Verfahren von Rezaian und Krake (1) isoliert. Eine poly(A)&spplus;-angerei cherte RNA-Fraktion wurde unter Verwendung eines PolyATtract-mRNA-Kits (Promega Corporation) erhalten.
Erststrang-cDNA wurde in einem 25-ul-Reaktionsgemisch aus 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,3, 25 mM KCl, 10 mM MgCl&sub2;, 4 nM DTT, 1 mM NaPPi, 1 mM dNTPs, 40 U Ribonucleaseinhibitor, 1 ug poly(A)&spplus;-angereicherter Apfel-RNA, 24 U AMV-reverse-Transkriptase (Promega Corp.) und 0,54 ug Hybrid-dT17-Adaptorprimer:
bei 42ºC 1 h lang synthetisiert. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend mit TE (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 1 mM EDTA) auf 525 ul verdünnt und bei -20ºC gelagert.
Ein 28-merer Oligonucleotidprimer (GEN4):
wurde auf der Grundlage der Sequenz von Trauben-PPO konstruiert.
cDNA wurde durch Polymerasekettenreaktion (PCR) im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Frohman (2) in einem 100-ul- Reaktionsgemisch aus 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 9,0 bei 25ºC), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,2 mM dNTPs, 0,01% Gelatine (w/v), 0,1% Triton X-100, 20 ul verdünntem Erststrang-cDNA-Reaktionsgemisch, 2,5 U Taq-DNA-Polymerase (Promega Corp.), 100 nM Adaptorprimer
und 1 uM GEN4-Primer (der obigen Beschreibung) amplifiziert.
Die Amplifikation umfaßte ein Anfangsprogramm von 3 Zyklen mit Denaturieren bei 94ºC während 1 min. Renaturieren bei 37ºC während 2 min. einem langsamen Anstieg auf 72ºC über 2 min und einer Verlängerung bei 72ºC während 3 min und anschließend 25 Zyklen mit 94ºC während 1 min. 55ºC während 1 min und 72ºC während 3 min. Die amplifizierte DNA wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt und in TE resuspendiert. Die DNA wurde mit dem Klenow-Fragment glattendig gemacht und auf einem 2% Nusieve-GTG-Agarose (FMC Bioproducts)-Gel fraktioniert. Ein Fragment mit 1050 bp wurde aus dem Gel isoliert und in die EcoRV-Stelle eines Bluescript-SK&spplus;-Vektors (Stratagene Cloning Systems) ligiert. Die ligierte DNA wurde in E. coli DH5 eingeführt. Rekombinante Klone wurde unter Verwendung eines radioaktiv markierten Fragments des Trauben-PPO-Klons (GPO1) durchmustert und es wurden zwei positive Klone (mit der Bezeichnung pSR7 und pSR8) isoliert und nach dem Didesoxysequenzierungsverfahren (3) sequenziert.

Beispiel 7

Klonierung von Kartoffel-PPO-Genen

Die Gesamt-RNA wurde aus unreifen Kartoffelknollen gemäß dem Verfahren von Logemann et al. (4) isoliert. Eine poly(A)&spplus;- angereicherte RNA-Fraktion wurde unter Verwendung eines polyATtract-mRNA-Kits (Promega Corporation) erhalten.
Erststrang-cDNA wurde in einem 25-ul-Reaktionsgemisch aus 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,3, 25 mM KCl, 10 mM MgCl&sub2;, 4 mM DTT, 1 mM NaPPi, 1 mM dNTPs, 40 U Ribonucleaseinhibitor, 1,8 ug poly(A)&spplus;-angereicherter Kartoffel-RNA, 24 U AMV-reverse- Transkriptase (Promega Corp.) und 0,54 ug Hybrid-dT17-Adaptorprimer:
bei 42ºC während 1 h synthetisiert. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend mit TE (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 1 mM EDTA) auf 525 ul verdünnt und bei -20ºC gelagert.
Zwei Oligonucleotidprimer wurden aus Regionen innerhalb der Sequenzen von Trauben- und Apfel-PPO konstruiert:
cDNA wurde durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) im wesentlichen gemäß dem Verfahren von Frohman (2) in einem 100- ul-Reaktionsgemisch aus 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 9,0 bei 25ºC), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,2 mM dNTPs, 0,01% Gelatine (w/v), 0,1% Triton X-100, 20 ul verdünntem Erststrang-cDNA- Reaktionsgemisch, 2,5 U Taq-DNA-Polymerase (Promega Corp.), 100 nM Adaptorprimer
und 1 uM GEN-Primer (der obigen Beschreibung) amplifiziert. Die Amplifikation umfaßte ein Anfangsprogramm von 3 Zyklen mit Denaturieren bei 94ºC während 1 min. Renaturieren bei 37ºC während 2 min. einem langsamen Anstieg auf 72ºC über 2 min und einer Verlängerung bei 72ºC während 3 min und anschließend 25 Zyklen mit 94ºC während 1 min. 55ºC während 1 min und 72ºC während 3 min. Die amplifizierte DNA wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt und in TE resuspendiert. Die DNA wurde mit dem Klenow-Fragment glattendig gemacht und auf einem 2% Nusieve-GTG-Agarose (FMC Bioproducts)-Gel fraktioniert. Fragmente mit 1500 bp und 1000 bp wurden aus dem Gel isoliert und in die EcoRV-Stelle eines Bluescript-SK&spplus;-Vektors (Stratagene Cloning Systems) ligiert. Die ligierte DNA wurde in E. coli DH5 eingeführt. Rekombinante Klone wurde selektiert und es wurden drei Klone (mit der Bezeichnung pSRP32, pSRP33 und pSRP72) isoliert und nach dem Didesoxysequenzierungsverfahren (3) sequenziert.
cDNA-Klone, die das 5'-Ende von Kartoffelknollen-PPO-mRNA enthielten, wurden aus Kartoffelknollen-RNA im wesentlichen gemäß der Beschreibung in (2), jedoch mit eingenisteten Antisense-Primern amplifiziert. Erststrang-cDNA wurde aus poly(A)&spplus;-angereicherter Kartoffelknollen-RNA gemäß der obigen Beschreibung synthetisiert, wobei jedoch der HybriddT17-Adaptorprimer durch den zu einer 257-278 Basen stromabwärts des 5'-Endes von pSRP32 und pSRP33 gelegenen Region komplementären Kartoffelknollen-PPO-spezifischen Primer 1:
ersetzt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde mit 0,1 · TE auf 2 ml verdünnt und durch ein Centricon-30-Spinfilter (Amicon Corp.) bei 4000 g 20 min lang zentrifugiert, um überschüssigen Primer zu entfernen. Diese Stufe wurde wiederholt und die verbleibende Flüssigkeit wurde auf 12 ul unter Einsatz von Speed-Vac-Zentrifugation eingeengt. Eine poly(dA)- Schwanz-Sequenz wurde an das 3'-Ende des cDNA-Strangs mit Terminal-d-Transferase (Promega Corp.) angeheftet, wobei ein 20-ul-Reaktionsgemisch aus 11,5 ul cDNA, 4 ul 5 · Tailing Buffer (Promega Corp.), 4 ul ATP (1 mM) und 10 U Terminal-d- Transferase bei 37ºC 5 min lang und anschließend bei 65ºC 5 min lang inkubiert und anschließend mit TE auf 500 ul verdünnt wurde. Die PCR-Amplifikation von poly(dA)-Schwanz-cDNA wurde in einem Reaktionsgemisch aus 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 9,0 bei 25ºC), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,2 mM dNTPs, 0,01% Gelatine (w/v), 0,1% Triton X-100, 5 ul verdünntem Erststrang-cDNA-Reaktionsgemisch, 1,25 U Taq-DNA-Polymerase (Promega Corp.), 200 nM Hybrid-dT17-Adaptorprimer und 900 nM Kartoffelknollen-PPO-spezifischem Primer 2
der zu einer 233-254 Basen stromabwärts des 5-Endes von pSRP32 und pSRP33 gelegenen Region komplementär ist, durchgeführt. Die Amplifikation umfaßte 25 Zyklen mit 94ºC während 1 min. 50ºC während 1 min und 72ºC während 3 min. Das hierbei erhaltene Fragment wurde in den Bluescript-SK&spplus;- Vektor kloniert und gemäß der obigen Beschreibung sequenziert. Es zeigte sich, daß es die vorhergesagte Region einer überlappenden Sequenz mit dem pSRP32-Klon enthielt, und es wurde bestätigt, daß dieser cDNA-Klon das 5'-Ende der Kartoffelknollen-mRNA enthielt.

Literaturangaben

1. M. A. Rezaian, L. R. Krake (1987). Nucleic acid extraction and vine detection in grapevine. J. Vir. Methods 17: 277-285.
2. M. A. Frohman (1990) in PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Hrsg. M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, T. J. White), Academic Press, New York, S. 28-38.
3. F. Sanger, S. Nicklen, A. R. Coulson (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467.
4. J. Logemann, J. Schell, L. Willmitzer (1987). Improved method for the isolation of RNA from plant tissues. Analytical Biochemistry 163: 16-20.

Claims

1. Isoliertes DNA-Molekül einschließlich einer DNA-Sequenz mit Codierung für ein Polypeptid mit Pflanzenpolyphenoloxidase (PPO)-Aktivität, wobei die Sequenz eine DNA mit Codierung für eine Aminosäuresequenz entsprechend einer Kupferbindungsstelle auf dem Polypeptid enthält, oder ein Fragment des DNA-Moleküls mit der Fähigkeit zum Modifizieren der Expression von PPO in einem Pflanzengewebe.

2. DNA-Molekül nach Anspruch 1, zusätzlich enthaltend eine Prä-Sequenz eines Pflanzen-PPO-Gens mit Codierung für ein Transit-Peptid.

3. DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei die in Anspruch 2 definierte Prä-Sequenz durch eine das Polypeptid zu einem zellulären Kompartiment dirigierende Targeting-Sequenz ersetzt ist.

4. DNA-Molekül nach Anspruch 1, zusätzlich enthaltend eine Sequenz mit Codierung für gegenüber einem Pflanzen-PPO-Gen Antisense-mRNA.

5. DNA-Molekül, enthaltend eine Sequenz mit Codierung für gegenüber einem Pflanzen-PPO-Gen Antisense-mRNA, oder ein Fragment desselben mit der Fähigkeit zum Modifizieren der Expression von PPO in einem Pflanzengewebe.

6. DNA-Molekül nach Anspruch 1 mit eingebauter katalytischer Spaltungsstelle.

7. DNA-Molekül nach Anspruch 2, enthaltend eine Sequenz mit Codierung für eine Chloroplasten-Transit-Peptidsequenz und ein reifes Weinstock-PPO-Polypeptid entsprechend der Darstellung in Fig. 1.

8. DNA-Molekül nach Anspruch 1, enthaltend ein Gen mit Codierung für ein Polypeptid mit Saubohnenblatt-PPO-Aktivität entsprechend der Darstellung in Fig. 2.

9. DNA-Molekül nach Anspruch 1, enthaltend ein Gen mit Codierung für ein Polypeptid mit Apfelfrucht-PPO-Aktivität entsprechend der Darstellung in Fig. 3.

10. DNA-Molekül nach Anspruch 1, enthaltend ein Gen mit Codierung für ein Polypeptid mit Kartoffelknollen-PPO-Aktivität entsprechend der Darstellung in Fig. 4.

11. Verfahren zur Herstellung eines rekombinante-DNA-Plasmids einschließlich einer DNA-Sequenz entsprechend der Definition nach Anspruch 1 durch Umsetzen eines DNA-Moleküls entsprechend der Definition von Anspruch 1 mit einem Plasmidexpressionsvektor, um die DNA- Sequenz innerhalb des Plasmidexpressionsvektors einzusetzen.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das DNA-Molekül aus einer aus einer Pflanzenprobe isolierten polyadenylierten RNA gebildet ist.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Pflanzenprobe aus Äpfeln, Kartoffeln, Trauben und Bohnen ausgewählt ist.

14. Verfahren nach Anspruch 12, bei welchem in Vorstufen polyadenylierte RNA mit Codierung für ein Polypeptid mit Pflanzen-PPO-Aktivität aus einer Quelle für das Polypeptid isoliert und die polyadenylierte RNA zur Konstruktion von copy-DNA (cDNA) behandelt wird.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei in der Behandlungsstufe für die polyadenylierte RNA die polyadenylierte RNA mit reverser Transkriptase und einem Adaptorprimer zur Bildung eines ersten cDNA-Strangs behandelt und die dabei gebildete cDNA unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert wird.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei es sich bei dem Adaptorprimer um einen Oligonucleotidadaptor der Sequenz:

handelt.

17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei in der Amplifizierungsstufe für die cDNA ein Adaptorprimer der Sequenz

und ein 5'-Ende-Primer verwendet werden.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei es sich bei dem 5'- Ende-Primer bei Verwendung zur Amplifikation von Trauben-cDNA um einen solchen der Sequenz

bei Verwendung zur Amplifikation von Bohnen-cDNA um einen solchen der Sequenz

bei Verwendung zur Amplifikation von Apfel-cDNA um einen solchen der Sequenz

und bei Verwendung zur Amplifikation von Kartoffel-cDNA um solche der Sequenzen:

handelt.

19. Verfahren nach Anspruch 14, wobei in der Behandlungsstufe für die polyadenylierte RNA die poyladenylierte RNA mit reverser Transkriptase und einem PPO-spezifischen Primer zur Bildung eines ersten cDNA-Strangs behandelt;

die dabei gebildete cDNA mit terminaler d-Transferase zur Befestigung einer Polyadenosinschwanzsequenz am 3'-Ende der cDNA behandelt und

die dabei gebildete polyadenylierte cDNA unter Ausnutzung der PCR amplifiziert wird.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei es sich bei dem PPO- spezifischen Primer für Trauben-PPO um einen Oligonucleotidprimer der Sequenz

oder für Kartoffelknollen-PPO um einen Oligonucleotidprimer der Sequenz

handelt.

21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei in der Amplifikationsstufe für die cDNA ein Oligonucleotidadaptorprimer entsprechend der Definition von Anspruch 16 und für Trauben- PPO ein PPO-spezifischer Oligonucleotidprimer der Sequenz:

bzw. für Kartoffelknollen-PPO ein PPO-spezifischer Oligonucleotidprimer der Sequenz:

benutzt werden.

22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei es sich bei dem Plasmidexpressionsvektor um den Plasmidvektcr Bluescript SKt und bei der DNA-Sequenz um eine cDNA-Sequenz handelt.

23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei in der Einsetzungsstufe für die DNA-Sequenz innerhalb des Plasmidexpressionsvektors

die cDNA mit einem glatten Ende versehen,

die dabei gebildete glattendige cDNA fraktioniert,

ein Fragment der erwarteten Größe isoliert Lind

das Fragment in eine geeignete Restriktionsenzymstelle des Bluescript SK&spplus;-Vektors ligiert wird.

24. Rekombinante-DNA-Plasmid einschließlich einer DNA- Sequenz entsprechend der Definition von Anspruch 1, wobei das Plasmid die Fähigkeit besitzt, in einem einzelligen Organismus repliziert, transkribiert und translatiert zu werden.

25. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 24, enthaltend ein konstitutives Promotorelement stromaufwärts der DNA-Sequenz.

26. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 25, wobei die DNA- Sequenz für ein Polypeptid mit Trauben-, Bohnen-, Apfel- oder Kartoffelknollen-PPO-Aktivität kodiert.

27. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit im Vergleich zu einer nichttransformierten Pflanze verminderter PPO-Aktivität durch Einführen eines DNA-Konstrukts einschließlich einer Sequenz mit Codierung für gegenüber einem Pflanzen-PPO-Gen Antisense-mRNA oder eines Fragments hiervon mit der Fähigkeit zur Verminderung der Expression von PPO in einem Pflanzengewebe in eine Pflanzenprobe.

28. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit im Vergleich zu einer nichttransformierten Pflanze verminderter Pflanzen-PPO-Aktivität durch Einführen eines DNA-Konstrukts einschließlich eines Gens mit Codierung für ein Polypeptid mit Pflanzen-PPO-Aktivität oder eines Fragments hiervon mit der Fähigkeit zur Verminderung der Expression von PPO in einem Pflanzengewebe in eine Pflanzenprobe sowie ggf. Einbau einer Katalysatorspaltungsstelle.

29. Verfahren nach Anspruch 27 oder 28, wobei die Pflanzenprobe aus einer Pflanze, ausgewählt aus Trauben, Kartoffeln, Äpfeln und Bohnen, entnommen wird.

30. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit im Vergleich zu einer nichttransformierten Pflanze erhöhter Pflanzen-PPO-Aktivität durch Einführen eines DNA-Konstrukts einschließlich einer DNA-Sequenz gemäß der Definition nach einem der Ansprüche 1 bis 3 in eine Pflanzenprobe.

31. Verfahren nach Anspruch 30, wobei die Pflanzenprobe aus einer Pflanze, ausgewählt aus Tabak, Saubohnen, Tomaten, Tee, Kaffee und Kakao, entnommen wird.

32. Verfahren nach einem der Ansprüche 27, 28 und 30, wobei das DNA-Konstrukt einen binären Vektor, in welchen die DNA- Sequenz eingeführt wurde, und einen für die Haut oder die Schale einer Frucht oder eines Gemüses spezifischen Promotor enthält.

33. DNA-Sonde einschließlich einer DNA-Sequenz gemäß der Definition von Anspruch 1 oder eines Fragments hiervon mit der Fähigkeit zur Modifizierung der Expression von PPO in einem Pflanzengewebe.

34. Verfahren zum Isolieren der DNA-Sequenz gemäß der Definition von Anspruch 1 aus einer Pflanzenspezies durch Hybridisieren einer DNA-Sonde nach Anspruch 33 mit einer cDNA- oder Genombibliothek zur Identifizierung von Klonen mit der betreffenden DNA-Sequenz.

35. Verfahren nach Anspruch 34, wobei die DNA-Sonde eine DNA-Sequenz mit einem funktionell aktiven Fragment des Apfel- Kartoffel-, Trauben- oder Bohnen-PPO-Gens, welches zwischen unterschiedlichen Spezies hoch konserviert ist, enthält.

36. Verfahren nach Anspruch 34, wobei die DNA-Sonde durch Durchführen einer PCR an der Gesamt-cDNA aus einer Pflanzenspezies zur Amplifizierung eines DNA-Moleküls nach Anspruch 1 mit zwei oder mehreren Oligonucleotidprimern, die spezifisch mit einer DNA-Sequenz gemäß der Definition von Anspruch 1 hybridisieren, hergestellt wird, wobei die Primer Sequenzen des Apfel-, Kartoffel-, Trauben- oder Bohnen-PPO- Gens, die zwischen den unterschiedlichen Spezies hoch konserviert sind, enthalten.

37. Verfahren nach Anspruch 36, wobei die aligonucleotidprimer DNA-Sequenzen mit Codierung für Aminosäuresequenzen entsprechend den Kupferbindungsstellen auf dem Polypeptid mit Pflanzen-PPO-Aktivität enthalten.

38. Verfahren zum Isolieren einer DNA-Sequenz gemäß der Definition nach Anspruch 1 aus einer Pflanzenspezies durch Isolieren von mRNA aus der Pflanze, Behandeln der mRNA mit reverser Transkriptase und einem Poly-dT-Primer zur Bildung eines ersten cDNA-Strangs und Amplifizieren der dabei gebildeten cDNA unter Benutzung von zwei oder mehreren Oligonucleotidprimern und PCR.

39. Verfahren zur Isolation einer DNA-Sequenz gemäß der Definition von Anspruch 1 aus einer Pflanzenspezies durch Umsetzen einer Expressionsbibliothek mit einem polyklonalen Antikörper, der gegen ein gereinigtes Polypeptid mit Pflanzen-PPO-Aktivität gezüchtet wurde, zur Identifizierung von Klonen mit der DNA-Sequenz gemäß der Definition von Anspruch 1.

40. Polypeptid mit Pflanzen-PPO-Aktivität in praktisch reiner Form mit der N-terminalen Aminosäuresequenz