JPH11505709A

JPH11505709A - レタスおよびバナナ由来のポリフェノール・オキシダーゼ遺伝子

Info

Publication number: JPH11505709A
Application number: JP8535213A
Authority: JP
Inventors: ロビンソン，サイモン・ピアーズ
Original assignee: コモンウェルス・サイエンティフィック・アンド・インダストリアル・リサーチ・オーガナイゼーション
Priority date: 1995-05-23
Filing date: 1996-05-22
Publication date: 1999-05-25
Also published as: CN1185177A; US20050191739A1; US7381810B2; MX9708943A; EP0832244A4; NZ307444A; CA2220552A1; EP0832244A1; WO1996037617A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ポリフェノールオキシダーゼ（PPO）をコードする核酸、およびその断片ならびに誘導体を調製する方法を提供するものである。本発明はまた、バナナまたはレタスPPO、あるいはバナナまたはレタスPPOに対するアンチセンス、ならびにその誘導体をコードする核酸を提供するものである。このような核酸を含むベクターおよびそのような核酸を用いる方法、ならびに形質転換植物体もまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】レタスおよびバナナ由来のポリフェノール・オキシダーゼ遺伝子本発明は植物由来のポリフェノール・オキシダーゼ(PPO)をコードする遺伝子の単離に関するものである。植物組織の褐色化は、傷害または損傷の後にしばしば起こり、これは一般に果実および野菜の腐敗を招く。望ましくない褐色化は、植物材料を処理して食物または他の産物を生産するときにも起こる。これらの褐色化反応を避けるための処置は、輸送、保存および処理時にとられる。しばしばこれは亜硫酸ガスなどの化学物質の使用を含むが、これらの物質の使用は、その安全性と消費者の許容度に関する心配から、将来的に制限されるように思われる。たとえば、米国食糧・薬品省（ＦＤＡ）は１９８６年に大部分の新鮮果物および野菜への亜硫酸塩の使用を禁止した。先天的に褐色化を受けにくい果物および野菜類が生産されることにより、これらの化学的処理の必要がなくなるだろう。植物における褐色化が、もっぱら酵素のPPOによって触媒されることは理解できるだろう。PPOは植物細胞の色素体内に局在し、一方、この酵素のフェノール性基質は、植物細胞の液胞内に蓄積される。この区画化により、植物細胞が損傷を受けて酵素とその基質が混合されない限り、褐色化反応が起こらないようになっている。先行技術文献としては、ブドウの蔓、そら豆の葉、リンゴ果実およびジャガイモ根茎からのPPO遺伝子のクローニングについて述べる本件の出願人によって出願された国際出願書PCT/AU92/00356が含まれる。この先行出願は、PPO遺伝子の発現を増加あるいは減少させることによって、植物におけるPPOレベルを操作できるかもしれないことを認識している。本明細書はまた、PPO遺伝子におけるCuA およびCuBと呼ばれる、２つの保存された銅結合部位を同定している。しかし、リンゴおよびジャガイモからPPO遺伝子をクローニングするために用いた、PCT/A U92/00356で述べられる方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のために、オリゴ dTリバースプライマーを使用することを含んでいる。いくつかの組織でこの方法は受け入れられるが、この方法では予想されるサイズの強いバンドが得られないか、またはPPO断片を分離することを難しくする多数の余計な産物を生ずる。したがって、先行技術に関連する一つまたはそれ以上の難点を克服、または少なくとも改善することが、本発明の目的である。本発明の第一の態様によれば、PPOをコードする核酸、断片およびその誘導体を調製するための方法が提供され、その方法は、 PPO活性をもつポリペプチドの材料および、 PPOの一番目の保存された領域に対応する配列をもつ、センス方向の第一プライマーおよび、 PPOの二番目の保存された領域に対応する配列をもつ、アンチセンス方向の第二プライマーを提供し； PPO活性を持つポリペプチドの材料からRNAを単離し、そのRNAを処理して複製DNA（cDNA）を作製し；そのようにして作製されたcDNAを、第一および第二プライマーを用いて増幅することを含む。出願人は、PPOに基づく第二プライマーの使用を含む本発明の方法は、他の（非PPO）遺伝子が増幅されてくる見込みが、ずっと低いことを意味することを発見した。さらに、本発明の方法は、大部分の場合に形成される正しい生成物の量を劇的に増加させる。それに加え、第二のPPOに基づくプライマーによって与えられる特異性は、一つのプライマーとオリゴdTを用いて、クローンを得ることが困難であった特定の植物から、より迅速なPPOのクローニングを可能にする。たとえば、レタスcDNAを用いた場合、出願人はGEN3/GEN8およびオリゴdTによって、広範にわたるわずかなスメア状の産物のみを観察したが、GEN3/GEN8およびREV 1を用いると、予想されるサイズの強いバンドを観察した。本明細書において使われる、「バナナ／レタスPPOをコードする核酸」および「バナナ／レタスPPO遺伝子」という用語は、バナナ／レタスPPO遺伝子、または実質的に相同な配列を示すと理解されるべきである。たとえば、これらの用語は、実施例で与えられた具体的な配列と異なるが、遺伝暗号の縮重のため、同じタンパク質をコードする配列を含む。出願人は、大部分の植物にPPO遺伝子族があることを見つけた。したがって、すでに単離されているものに加え、レタスおよびバナナに他のPPO遺伝子があると考えられる。これらは本発明の方法を用いてクローン化することができる。したがって、「バナナ／レタスPPOをコードする核酸」および「バナナ／レタスPPO遺伝子」という用語は、すでに単離されたこれらの具体的遺伝子以外の、バナナ／レタスPPO遺伝子を含むと理解されるべきである。この用語はまた、成熟型PPOタンパク質をコードする配列と同様に、葉緑体移行配列などの前配列も含むことができる。本明細書で使われる「誘導体」という用語は、化学的に、あるいは修飾された、例えば突然変異を加えた、または標識した核酸、あるいは触媒切断部位を取り込んだ核酸を含む。「断片」という用語は、PPO活性をもつポリペプチド、またはペプチドをコードするPPO遺伝子の、機能的な活性を持つ断片を含む。 PPO活性を持つポリペプチドの原料は、バナナまたはレタスPPO活性をもつポリペプチドの原料であることが好ましい。バナナPPO活性を持つポリペプチドの原料はバナナ果実でもよく、好ましくは幼若なバナナ果実、より好ましくは幼若なバナナ果実の果肉部分である。レタスPPO活性を持つポリペプチドの原料はレタス葉でもよく、好ましくは幼若なレタス葉である。 RNAは、例えばCTABなどの界面活性剤と、本明細書に引用文献としてその開示文書が取り入れられている、PCT/AU92/00356で述べられたオリゴdTスパンカラムを用いるか、またはプロメガ社（Promega Corporation）のポリAトラクト1000システム（PolyATract 1000 system）などの、市販のキットを用いる抽出法を含む、適当な方法によって単離してもよい。本発明のこの態様によれば、cDNAを作製するためにRNAを処理する段階は、cDN Aを作製するためにRNAを逆転写酵素およびアダプター・プライマーで処理することを含むかもしれない。アダプター・プライマーは、次の配列：またはその一部を含むオリゴヌクレオチド・プライマーでもよい。第一プライマーは、PPOの一番目の保存された領域に対応する配列を持つ。第一プライマーは、少なくともPPOの最初の銅結合部位の一部、またはそのごく近傍に対応する配列であることが好ましい。第二プライマーは、PPOの二番目の保存された領域に対応した配列を持つ。第二プライマーは、少なくともPPOの二番目の銅結合部位の一部、またはそのごく近傍に対応する配列であることが好ましい。より好ましくは、第一プライマーは、少なくともPPOのCuAまたはCuB結合部位の一つの領域、またはそのごく近傍に対応する配列を持つことが好ましく、また第二プライマーは、PPOのCuAまたはCuB結合部位の一つの領域、またはそのごく近傍に対応する配列を持つことが好ましい。第一プライマーおよび第二プライマーは縮重していてもよい。第一プライマーは、次の配列：またはその一部を含んでもよい。第二プライマーは、次の配列：またはその一部を含んでもよい。 cDNAはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて増幅してもよい。当業者は、もし銅結合部位が内部にあれば、単離された核酸が、3'末端と5'末端を欠いたPPO遺伝子の断片であることを理解するだろう。しかし、PPO遺伝子の完全な塩基配列を決定し、そのようなPPOをコードする核酸、またはそうしたPPO に対するアンチセンスをコードする核酸を調製もしくは単離することが可能である。したがって、本発明の別の態様によれば、PPOの3'末端をコードする核酸を調製する方法が提供され、その方法は、 PPO活性を持つポリペプチドの原料および、センス方向のプライマー；およびアダプター・プライマー；を提供し、 PPO活性を持つポリペプチドの原料からRNAを単離し；それからcDNAを作製するためにRNAを処理し；またそのようにして作製されたcDNAを、プライマーを用いて増幅することを含むものである。本発明の更に別の態様によれば、PPOの5'末端をコードする核酸を調製する方法が提供され、その方法は、 PPO活性を持つポリペプチドの原料および、アンカー、およびアンチセンス方向のプライマー；およびアンカー・プライマー；を提供し、 PPO活性を持つポリペプチドの原料からRNAを単離し；それからcDNAを作製するためにRNAを処理し；またそのようにして作製されたcDNAの5'末端にアンカーを連結し；プライマーを用いてこのcDNAを増幅することを含むものである。 PPO活性を持つポリペプチドの原料は、バナナまたはレタスPPO活性をもつポリペプチドの原料であることが好ましい。バナナPPO活性を持つポリペプチドの原料はバナナ果実でもよく、好ましくは幼若なバナナ果実、より好ましくは幼若なバナナ果実の果肉部分である。レタスPPO活性を持つポリペプチドの原料はレタス葉でもよく、好ましくは幼若なレタス葉である。 RNAは、例えばCTABなどの界面活性剤と、本明細書の一部としてその開示文書を含むものとする、PCT/AU92/00356で述べられたオリゴdTスパンカラムを用いるか、またはプロメガ社のポリAトラクト1000システムなどの、市販のキットを用いる抽出法を含む、適当な方法によって単離してもよい。本発明のこの態様によれば、cDNAを作製するためにRNAを処理する段階は、cDN Aを作製するためにRNAを逆転写酵素およびアダプター・プライマーで処理することを含むかもしれない。アダプター・プライマーは、次の配列：またはその一部を含むオリゴヌクレオチド・プライマーでもよい。センス方向のプライマーはレタスPPO特異的プライマーでよい。センス方向のプライマーは次の配列：またはその一部を含んでもよい。センス方向のプライマーはバナナPPO特異的プライマーでよい。センス方向のプライマーは次の配列：またはその一部を含んでもよい。アダプター・プライマーは、次の配列：またはその一部を含んでもよい。アンチセンス方向のプライマーはレタスPPO特異的プライマーでよい。アンチセンス方向のプライマーは次の配列：またはその一部を含んでもよい。アンチセンス方向のプライマーはバナナPPO特異的プライマーでよい。アンチセンス方向のプライマーは次の配列：またはその一部を含んでもよい。アンカーは、適したタイプのものであれば、いずれのものでもよい。アンカーは、たとえばT4RNAリガーゼを用い、ライゲーション反応で連結してもよい。アンカー・プライマーは、アンカーとハイブリダイズできるべきである。 cDNAはPCRを用いて増幅してもよい。当業者は、本発明の方法を用いることによって、関心のあるPPO遺伝子の完全な核酸配列を決定できる、あるいはそのようなPPOをコードする核酸、またはそうしたPPOに対するアンチセンスをコードする核酸を、調製もしくは単離できることを理解するだろう。本発明の更に別の態様によれば、バナナPPOまたはバナナPPOのアンチセンスをコードする核酸、およびその断片ならびに誘導体が提供される。その核酸は、第２図または第３図に示される配列、およびその断片ならびに誘導体、および実質的に相同な配列を持つことが好ましい。本発明の更に別の態様によれば、レタスPPOまたはレタスPPOのアンチセンスをコードする核酸、およびその断片ならびに誘導体が提供される。その核酸は、第１図に示される配列、およびその断片ならびに誘導体、および実質的に相同な配列を持つことが好ましい。この核酸は、本明細書において前述された方法によって調製してもよい。この核酸は、たとえば触媒切断部位を含むことによって修飾してもよい。本発明の別の態様よれば、バナナPPOまたはバナナPPOのアンチセンスをコードする核酸、およびその断片ならびに誘導体を含む組換え体を調製する方法が提供され、その方法は、バナナPPOまたはバナナPPOのアンチセンスをコードする核酸、およびその断片ならびに誘導体；およびベクターを提供し；また核酸をベクター内に組み込むために、核酸とベクターを反応させることを含む。本発明の更に別の態様によれば、レタスPPOまたはレタスPPOのアンチセンスをコードする核酸、およびその断片ならびに誘導体を含む組換え体を調製する方法が提供され、その方法は、レタスPPOまたはレタスPPOのアンチセンスをコードする核酸、およびその断片ならびに誘導体；およびベクターを提供し；また核酸をベクター内に組み込むために、核酸とベクターを反応させることを含む。この核酸は、本明細書において前述された方法によって調製してもよい。この核酸は、たとえば触媒切断部位を含むことによって修飾してもよい。ベクターはプラスミド発現ベクターでもよい。たとえば、ブルースクリプトSK ＋（Bluescript SK+）は好適であることが分かっている。それに代わるものとしては、ベクターはバイナリー・ベクターでもよい。組換え体ベクターは、核酸の上流にプロモーターを含んでもよく、さらには構成的プロモーターであることが好ましい。クローニング法は、好適な形であればどのようなものでもよい。好ましい方法は、 cDNAを、たとえばカラムはたはゲルによって分画し、予想されるサイズの断片を、たとえばカラムまたはゲルによって単離することを含み；また、該断片をベクターの適当な制限酵素部位、たとえばブルースクリプトSK+ベクターのEcoRV部位にライゲーションすることからなる。このようにして作製されたクローンをテストするために、適当な微生物をベクターで形質転換し、微生物を培養し、それによってコードされるポリペプチドを発現してもよい。微生物は大腸菌（Escherichia coli）、たとえば大腸菌DH5が好適であることが分かっている。それに代わるものとして、植物を形質転換するために適当なベクターを用いてもよい。本発明の更に別の態様によれば、バナナPPOまたはバナナPPOのアンチセンスをコードする核酸、およびその断片ならびに誘導体を含む組換え体ベクターが提供され、そのベクターは単細胞生物内、あるいはそれに代わるものとしては植物体内で複製、転写および翻訳され得るベクターである。本発明の更に別の態様によれば、レタスPPOまたはレタスPPOのアンチセンスをコードする核酸、およびその断片ならびに誘導体を含む組換え体ベクターが提供され、そのベクターは単細胞生物内、あるいはそれに代わるものとしては植物体内で複製、転写および翻訳され得るベクターである。この核酸は、本明細書において前述された方法によって調製してもよい。この核酸は、たとえば触媒切断部位を含むことによって修飾してもよい。ベクターはプラスミド発現ベクターでもよい。たとえば、ブルースクリプトSK ＋（Bluescript SK+）は好適であることが分かっている。それに代わるものとしては、ベクターはバイナリー・ベクターでもよい。組換え体ベクターは、バナナ PPOまたはバナナPPOに対するアンチセンスをコードする核酸、断片およびその誘導体の上流にプロモーターを含んでもよく、さらには構成的プロモーターであることが好ましい。微生物は大腸菌、たとえば大腸菌DH5が好適であることが分かっている。本発明の更に別の態様によれば、植物組織におけるPPO活性のレベルを低下させる方法が提供され、この方法は、バナナPPOをコードする核酸、またはバナナPPOをコードする修飾された核酸、あるいはバナナPPOに対するアンチセンスをコードする核酸、断片およびその誘導体；および植物試料を提供し；また形質転換植物体を産生するために、該植物試料へ核酸を導入することからなる。本発明の更に別の態様によれば、植物組織におけるPPO活性のレベルを低下させる方法が提供され、この方法は、レタスPPOをコードする核酸、またはレタスPPOをコードする修飾された核酸、あるいはレタスPPOに対するアンチセンスをコードする核酸、断片およびその誘導体；および植物試料を提供し；また形質転換植物体を作出するために、該植物試料へ核酸を導入することからなる。 PPO活性は、センスコンストラクトを使うことによっても低下させることができる（コサプレッション（cosuppression））。それに代わるものとして、核酸はバナナまたはレタスPPO、あるいは機能的に活性のあるそれらの断片に対する、アンチセンスmRNAをコードする配列を含んでもよい。また、それに代わるものとして、核酸はバナナまたはレタスPPO、あるいは機能的に活性のあるそれらの断片をコードし、触媒切断部位を取り込んだもの（リボザイム（ribozyme））でも良い。この核酸は、本明細書で前述した組換え体ベクターに含まれてもよい。より好ましい態様では、核酸はバイナリー・ベクターに含まれてもよい。さらに好ましい態様では、植物へのバイナリー・ベクターの導入は、このバイナリー・ベクターを含むアグロバクテリウム（Agrobacterium）を用いた、植物の感染、あるいは核酸でコートした微小弾丸を用いた爆撃法で行ってもよい。アグロバクテリウムによるバナナの形質転換法は当業者に知られており、たとえば本明細書においてその開示物の全てが引用文献として取り入れられているメイ（May）ら、B io/technology（1995）13: 486-492で述べられている。DNAでコートした微小弾丸を用いた、爆撃法によるバナナの形質転換法は、当業者に知られており、たとえば本明細書においてその開示物の全てが引用文献として取り入れられているサギ（Sagi）ら、Bio/technology（1995）13: 481-485で述べられている。アグロバクテリウムによるレタスの形質転換法は当業者に知られており、たとえば本明細書においてその開示物の全てが引用文献として取り入れられているミッチェルモア（Michelmore）ら、Plant Cell Reports（1987）6: 439-442、およびカーティス（Curtis）ら、Journal of Experimental Botany（1994）45: 1141-1149で述べられている。本発明の更に別の態様によれば、植物組織におけるPPO活性のレベルを増加させる方法が提供され、この方法は、バナナPPOをコードする核酸、またはその断片；および植物試料を提供し；また形質転換植物体を作出するために、該植物試料へ核酸を導入することからなる。本発明の更に別の態様によれば、植物組織におけるPPO活性のレベルを増加させる方法が提供され、この方法は、レタスPPOをコードする核酸、またはその断片；および植物試料を提供し；また形質転換植物体を作出するために、該植物試料へ核酸を導入することからなる。この核酸は、本明細書で前述した組換え体ベクターに含まれてもよい。より好ましい態様では、核酸はバイナリー・ベクターに含まれてもよい。さらに好ましい態様では、植物へのバイナリー・ベクターの導入は、このバイナリー・ベクターを含むアグロバクテリウムを用いた、植物の感染、あるいは核酸でコートした微小弾丸を用いた爆撃法で行ってもよい。植物は好適なタイプであればどのようなものでもよい。しかし、本方法は特にバナナまたはレタスに適用できる。本発明の更に別の態様によれば、形質転換植物が提供され、この植物は正常なバナナPPO遺伝子の発現を修飾できる核酸を含むものである。植物は好適なタイプであればどのようなものでもよい。好ましくは、この植物はバナナである。本発明の別の態様によれば、形質転換植物が提供され、この植物は正常なレタスPPO遺伝子の発現を修飾できる核酸を含むものである。植物は好適なタイプであればどのようなものでもよい。好ましくは、この植物はレタスである。核酸は、本明細書で前述されたようなものでよい。本発明の更に別の態様によれば、バナナPPOをコードする核酸またはバナナPPO に対するアンチセンスをコードする核酸、断片およびその誘導体を含む植物ワクチンが提供される。本発明の別の態様によれば、レタスPPOをコードする核酸またはレタスPPOに対するアンチセンスをコードする核酸、断片およびその誘導体を含む植物ワクチンが提供される。これより、本発明について、随伴する実施例に関してより完全に述べられるだろう。しかし、以下の記述は単に説明的なものであり、いかようにしても上述の発明の一般性を制限するものとして受け取られるべきではないことは、理解されるべきである。図面の簡単な説明：第１図：推定される葉緑体移行配列および成熟型レタスPPOタンパク質の両方をコードする、複合型LPO1 cDNAヌクレオチド配列、ならびにそれに由来するタンパク質配列。第２図：推定される葉緑体移行配列および成熟型バナナPPOタンパク質の両方をコードする、BANPPO1 cDNAヌクレオチド配列、ならびにそれに由来するタンパク質配列。第３図：バナナPPOタンパク質の一部をコードする、BANPO01 cDNAヌクレオチド配列、ならびにそれに由来するタンパク質配列。実施例１レタスPPO遺伝子のクローニングメッセンジャーRNA（mRNA）は、プロメガ社のポリAトラクト1000システムを用いてレタスの幼若葉から直接単離した。第一鎖cDNAは、本明細書においてその開示物の全てが引用文献として取り入れられている、「PCRプロトコル：方法と応用ガイド」（MA イニス（MA Innis）、DH ゲルフラント（DH Gelfrand）、JJ スニンスキー（JJ Sninsky）およびTJ ホワイト（TJ White）編）、アカデミック・プレス（Academic Press）、ニューヨーク（New York）、pp28-38において、フローマン（Frohman）,MA（1990）が述べるように、オリゴdTプライマー・アダプター：を用い、ファルマシア・バイオテク社（Pharmacia Biotech）のタイムセーバーc DNA合成キット（Timesaver cDNA Synthesis Kit）によって、逆転写酵素により合成された。オリゴヌクレオチドプライマーは、本明細書においてその開示物の全てが引用文献として取り入れられている、ドライ，IB（Dry，IB）、およびロビンソン，S P（Robinson，SP）（1994）「ブドウの蔓ポリフェノール・オキシダーゼの分子クローニングおよびその性格付け」、Plant Molecular Biology 26: 495-502で述べられている、銅結合部位CuAおよびCuBをコードする遺伝子の保存された領域にある、既知の植物PPO DNA配列に基づいてデザインした。CuA部位周辺でデザインされた２種類の順方向プライマー（GEN3およびGEN8）、およびCuB部位付近でデザインされた１種類の逆方向プライマー（REV1）が合成された：プライマーは銅結合部位領域にあるが、その一つ（GEN8）は、この酵素の銅結合部位として従来受け入れられてきた領域のすぐ外側にある。第一鎖cDNAは、それぞれ1uMの終濃度のGEN3とREV1またはGEN8とREV1プライマーを用い、基本的にはフローマンの方法にしたがって、ポリメラーゼ連鎖反応（ PCR）によって増幅された（ドライ等）。増幅反応は94℃で１分間変性、37℃で２分間アニーリング、緩やかな上昇速度で72℃まで２分間、72℃で３分間伸長反応という、最初のプログラムを２サイクル行い、続いて94℃で１分間変成し、55 ℃で１分間アニーリング、72℃で３分間伸長反応を２５サイクル行うことからなる。増幅されたDNA試料を、PCR産物のサイズを決めるためにアガロースゲル電気泳動にかけ、臭化エチジウムを用いて染色し、またその残りをPCRウィザード・プレップ（PCR Wizard Prep）カラム（プロメガ社）を用いて精製・濃縮した。精製したDNAを、Taqポリメラーゼを用いてT-末端化を施した、EcoRV切断したB luescript SK+ベクター（ストラタジーン）にクローン化し、そしてライゲーションしたDNAを電気穿孔法によって大腸菌DH5α株に導入した。予想されるサイズの挿入物をもつ、組換え体クローンを選択し、そしてそれらのDNA配列を自動シーケンス装置で決定した。３つの推定されるレタスPPOクローン（LPO316，LPO81 2およびLPO813）が、既知の植物PPO遺伝子との相同性に基づいて同定された。この配列情報を用いて、ひとつの特異的な順方向プライマー（LET3P）と２つの逆方向プライマー（LET5P1またはLET5P2）が合成された：レタスPPO遺伝子の3'-末端を得るために、1uMのLET3Pプライマーおよび100nM のアダプタープライマーを用いた、同様なPCR法によって、上述の第一鎖cDNAを増幅した：増幅されたcDNAを上述のようにして精製し、２％ニューシーブGTG（Nusieve G TG）（FMCバイオプロダクツ）アガロースゲルにかけた。アガロースゲルから100 0塩基対の断片を切り出し、このDNAをT-末端化を施した、EcoRV切断したBluescr ipt SK+ベクターにクローン化して3'-末端クローンLPO9およびLPO10を得、これについて配列を決定した。レタスPPO遺伝子の5'-末端は、5'-アンプリファインダー・RACEキット（5'-Am pliFINDER RACE kit）（クロンテック・ラボラトリーズ）を用いた、フローマンによって最初に述べられた、5'-RACE法の修飾法によってクローン化した。第一鎖cDNAは、LET5P2プライマーを用いた逆転写酵素によって、mRNAから合成し、そしてアンプリファインダーアンカーをこのcDNAの5'-末端にライゲーションした。このcDNAを、LET5P1プライマーとアンプリファインダー・アンカー・プライマーを用いた、PCRによって増幅した。増幅されたcDNAは上述のようにして精製し、そして２％ニューシーブGTG（FMCバイオプロダクツ）アガロースゲルにかけた。850塩基対の断片をゲルから切り出し、このDNAをT-末端化を施した、EcoRV切断したBluescript SK+ベクターにクローン化し、5'-末端クローンLPO4、LPO5、LPO6およびLPO7を得て、これらの配列を決めた。 5'-および3'-クローンは、もとのクローンに対して推定された重複配列を持つことが分かり、レタスPPO（LPO1）の完全な配列は、さまざまなクローンの配列の組み合わせに由来したものである（第１図）。実施例２バナナPPO遺伝子のクローニング全RNAは、バナナの幼若な果実から単離された。果実組織（3g）を凍結し液体窒素中でコーヒーグラインダーを用いて細粉化し、次いで、65℃に保った20mlの抽出緩衝液（２％ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB）、２％ポリビニルピロリドン、100mM Tris-HCl，pH8.0、25mM EDTA、2M NaCl、0.05% スペルミジン、2% β-メルカプトエタノール）を加えた。この抽出液を20mlのクロロホルム／IAAと混合し、次に5,000 RPMで２０分間遠心し、そして水層を再びクロロホルム／IAAで抽出した。この水層をミラクロスでろ過し、0.25容の10M L iClを加え、次にこの試料を４℃で一夜インキュベーションし、その後8,000 RPM で２０分間遠心した。上清を除き、ペレットを0.5mlの1M NaCl、0.5% SDS、10mM Tris，pH8.0および1mM EDTAに再懸濁した。このRNAを等量のクロロホルム／IAA で一回抽出し、２容のエタノールを加えた。-70℃で４０分間インキュベーションした後、この溶液を10,000 RPMで１５分間遠心した。上清を除き、ペレットを 80%エタノールでリンスし、それを捨て、乾かした。このペレットは50ulの滅菌液に再懸濁した。第一鎖cDNAは、本明細書においてその開示物の全てが引用文献として取り入れられている、ドライ，IB、およびロビンソン，SP（1994）「ブドウの蔓ポリフェノール・オキシダーゼの分子クローニングおよびその性格付け」、Plant Molecu lar Biology 26: 495-502で述べられている逆転写酵素を用い、本明細書においてその開示物の全てが引用文献として取り入れられている、「PCRプロトコル：方法と応用ガイド」（MA イニス（MA Innis）、DH ゲルフラント（DH Gelfrand ）、JJ スニンスキー（JJ Sninsky）およびTJ ホワイト（TJ White）編）、アカデミック・プレス（Academic Press）、ニューヨーク（New York）、pp28-38において、フローマン（Frohman）,MA（1990）が述べるように、オリゴdTプライマー・アダプター：を用い、10ugの全RNAから合成された。オリゴヌクレオチドプライマーは、銅結合部位CuAおよびCuBをコードする遺伝子の保存された領域にある、既知の植物PPO DNA配列に基づいてデザインした（ドライら）。CuA部位周辺でデザインされた１種類の順方向プライマー（GEN3）および、CuB部位付近でデザインされた１種類の逆方向プライマー（REV1）が合成された：第一鎖cDNAは、それぞれ1uMの終濃度のGEN3とREV1プライマーを用い、基本的にはフローマンの方法にしたがって、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって増幅された（ドライら）。増幅反応は94℃で１分間変成し、37℃で２分間アニーリング、緩やかな上昇速度で72℃まで２分間、72℃で３分間伸長反応という、最初のプログラムを２サイクル行い、続いて94℃で１分間変成し、55℃で１分間アニーリング、72℃で３分間伸長反応を２５サイクル行うことからなる。増幅された DNA試料を、PCR産物のサイズを決めるためにアガロースゲル電気泳動にかけ、臭化エチジウムを用いて染色し、またその残りをPCRウィザード・プレップ（PCR W izard Prep）カラム（プロメガ社）を用いて精製・濃縮した。精製したDNAを、Taqポリメラーゼを用いてT-末端化を施した、EcoRV切断したB luescript SK+ベクター（ストラタジーン）にクローン化し、そしてライゲーションしたDNAを電気穿孔法によって大腸菌DH5α株に導入した。予想されるサイズの挿入物をもつ、組換え体クローンを選択し、そしてそれらのDNA配列を自動シーケンス装置で決定した。推定されるバナナPPOクローン（BPO3）は、既知の植物PPO遺伝子に対する相同性に基づいて同定された。この配列情報を用いて、ひとつの特異的な順方向プライマー（BAN1）と２つの逆方向プライマー（BAN2RまたはBAN3R）が合成された：バナナPPO遺伝子の3'-末端を得るために、1uMのBAN1プライマーおよび100nMのアダプタープライマーを用いた、同様なPCR法によって、上述の第一鎖cDNAを増幅した：このDNAは、94℃で１分間変成し、55℃で１分間アニーリング、72℃で３分間伸長反応を２５サイクル行って増幅した。増幅されたDNAをキアクイック・スピンPCR精製キット（QIAquick Spin PCR Purification Kit）（キアジェン）を用いて精製し、２％ニューシーブGTG（FMCバイオプロダクツ）アガロースゲルにかけた。アガロースゲルから1000塩基対の断片を切り出し、このDNAをT-末端化を施した、EcoRV切断したBluescript SK+ベクターにクローン化して3'-末端クローンBPO17を得、これについて配列を決定し、これがBPO3の3'-末端をコードすることを示した。 BPO3の5'-末端は、フローマンによって最初に述べられた、5'-RACE法の修飾法によってクローン化した。第一鎖cDNAは、バナナPPO特異的プライマーBAN2Rを用いることを除いて、上述と同様にしてバナナ果実RNAから合成された。このDNAは、フローマンにおいて述べられたように末端転移酵素で末端処理し、それぞれ1uMの終濃度のBAN3RとB26プライマーを用いたPCRで増幅した。このDNAは、94℃で１分間変性し、55℃で１分間アニーリング、72℃で３分間伸長反応を３０サイクル行って増幅した。増幅されたcDNAを1.8％ニューシーブGTG（FMCバイオプロダクツ）アガロースゲルにかけ、700塩基対の断片をゲルから切り出した。このDNAをキアクイック・ゲル・抽出キット（QIAquick Gel Extraction Kit）によって抽出し、T-末端化を施した、EcoRV切断したBluescript SK+ベクターにクローン化し、5'-末端クローンBPO2 6を得て、これらの配列を決め、これがBPO3の5'-末端をコードすることを示した。重複するクローンBPO3、BPO17およびBPO26を両方向から完全に配列決定し、バナナPPO遺伝子（BANPPO1）の配列は、これらの配列を組み合わせることによって得られた（第２図）。これらの実験の途中で、上述の方法を用い、B25プライマーと他の植物PPO遺伝子にある、保存された配列に基づく縮重プライマー：の一つを用いたPCR増幅法によって、バナナ果実cDNAから多数のクローンが得られた。これらのクローンの大部分はBANPPO1と同一のものであったが、BANPPO11 と呼ばれる一つのクローンは明瞭に異なることがわかり、その配列は第３図の示されている。最後に、本明細書で概説した意図から離れることなく、さまざまな他の修飾および／または改変が行われてもよいと理解されるべきである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年３月３日【補正内容】請求の範囲１．バナナまたはレタスのPPO活性をもつポリペプチドの材料、少なくともPPO の最初の銅（Cu）結合部位の一部、またはそのごく近傍に対応する配列をもつセンス方向の第一プライマー、少なくともPPOの二番目の銅結合部位の一部またはそのごく近傍に対応する配列をもつアンチセンス方向の第二プライマーを；およびアダプター・プライマーを提供し； PPO活性を持つポリペプチドの材料からRNAを単離し、そのRNAを処理して複製D NA（cDNA）を作製し；そのようにして作製されたcDNAを、第一および第二プライマーを用いて増幅する各工程を含む、PPOをコードする核酸、断片およびその誘導体を調製するための方法。２．第一プライマーが、次の配列：またはその一部を含む、請求の範囲第１項に記載の方法。３．第二プライマーが、次の配列：またはその一部を含むような、請求の範囲第２項に記載の方法。４． cDNAを作製するためにRNAを処理する段階が、cDNAを作製するためにRNAを逆転写酵素および次の配列：またはその一部を持つアダプター・プライマーで処理することを含む、請求の範囲第１項に記載の方法。５．バナナまたはレタスのPPO活性を持つポリペプチドの原料、アンカー、アンチセンス・プライマー、およびアンカー・プライマーを提供し；バナナまたはレタスのPPO活性を持つポリペプチドの原料からRNAを単離し； cDNAを作製するためにRNAを処理し；そのようにして作製されたcDNAの5'末端にアンカーを連結し；そしてプライマーを用いてこのcDNAを増幅してPPOの5'末端をコードする核酸を調製する、各工程をさらに含む、請求の範囲第４項に記載の方法。６．核酸がレタスPPOをコードし、センス方向のプライマーが次の配列：またはその一部を含み、アンチセンス方向のプライマーが次の配列：またはその一部を含む、請求の範囲第５項に記載の方法。７．核酸がバナナPPOをコードし、センス方向のプライマーが次の配列：またはその一部を含み、アンチセンス方向のプライマーが次の配列：またはその一部を含む、請求の範囲第５項に記載の方法。８．アダプター・プライマーが次の配列：またはその一部を含む、請求の範囲第５項に記載の方法。９．バナナPPOまたはバナナPPOに対するアンチセンス、およびその断片ならびに誘導体をコードする核酸。１０．触媒切断部位を含む、請求の範囲第９項に記載の核酸。１１．第２図または第３図に示された配列、その断片および誘導体、および実質的に相同な配列をもつ、請求の範囲第９項に記載の核酸。１２．レタスPPOまたはレタスPPOに対するアンチセンス、およびその断片ならびに誘導体をコードする核酸。１３．触媒切断部位を含む、請求の範囲第１２項に記載の核酸。１４．第１図に示した配列、およびその断片ならびに誘導体、および実質的に相同な配列をもつ、請求の範囲第１２項に記載の核酸。１５．ベクターが単細胞生物または、それに代るものとしては植物において複製、転写および翻訳され得る、請求の範囲第９項に記載の組換え体ベクター。１６．ベクターが単細胞生物または、それに代るものとしては植物において複製、転写および翻訳され得る、請求の範囲第１２項に記載の組換え体ベクター。１７．請求の範囲第９項に記載の核酸；及び植物試料を提供し；該核酸を該植物試料に導入して、形質転換バナナ植物を作製する各工程を含む、バナナ植物組織においてPPO活性レベルを低下させる方法。１８．請求の範囲第１２項に記載の核酸；および植物試料を提供し；該核酸を該植物試料に導入して形質転換レタス植物を作製する各工程を含む、レタス植物組織においてPPO活性レベルを低下させる方法。１９．正常なバナナPPO遺伝子の発現を修飾できる核酸を含む、形質転換バナナ植物。２０．正常なレタスPPO遺伝子の発現を修飾できる核酸を含む、形質転換レタス#植物。【手続補正書】【提出日】１９９７年１１月２５日【補正内容】（１）明細書第１７頁下から第３行と第２行との間に、下記の記載を挿入する。『実施例３バナナ果皮PPO遺伝子のクローニング全RNAは、幼若なバナナ果実の果皮から単離された。果実組織（3g）を凍結し液体窒素中でコーヒーグラインダーを用いて細粉化し、次いで、65℃に保った20 mlの抽出緩衝液（２％ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB）、２％ポリビニルピロリドン、100mM Tris-HCl，pH8.0、25mM EDTA、2M NaCl、0.0 5% スペルミジン、2% β-メルカプトエタノール）を加えた。この抽出液を20ml のクロロホルム／IAAと混合し、次に5,000 RPMで２０分間遠心し、そして水層を再びクロロホルム／IAAで抽出した。この水層をミラクロスでろ過し、0.25容の1 0M LiClを加え、次にこの試料を４℃で一夜インキュベーションし、その後8,000 RPMで２０分間遠心した。上清を除き、ペレットを0.5mlの1M NaCl、0.5% SDS、 10mM Tris，pH8.0および1mM EDTAに再懸濁した。このRNAを等量のクロロホルム／IAAで一回抽出し、２容のエタノールを加えた。-70℃で４０分間インキュベーションした後、この溶液を10,000 RPMで１５分間遠心した。上清を除き、ペレットを80%エタノールでリンスし、それを捨て、乾かした。このペレットは50ulの滅菌液に再懸濁した。第一鎖cDNAは、参考文献２が述べるように、オリゴdTプライマー・アダプター（参考文献１）：を用い、10ugの全RNAから合成された。オリゴヌクレオチドプライマーは、既知の植物PPO DNA配列に基づいてデザインされた。広範な異なる植物由来の、多数のPPO配列を比較することによって、大部分が２ヵ所の銅結合部位CuAおよびCuB(2)をコードする領域内あるいはその近傍に、この遺伝子の保存された領域があることを同定することができた。CuA 部位周辺でデザインされた順方向プライマー（GEN，GEN9およびGEN10）、および、CuB部位付近でデザインされた逆方向プライマー（REV1およびREV2）が合成された：第一鎖cDNAは、それぞれ1uMの終濃度のGENとREVプライマーを用い、基本的にはフローマンの方法(1)にしたがって、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって増幅された(2)。増幅反応は94℃で１分間変性、37℃で２分間アニーリング、緩やかな上昇速度で72℃まで２分間、72℃で３分間伸長反応という、最初のプログラムを２サイクル行い、続いて94℃で１分間変性、55℃で１分間アニーリング、72 ℃で３分間伸長反応を２５サイクル行うことからなる。増幅されたDNA試料を、P CR産物のサイズを決めるためにアガロースゲル電気泳動にかけ、臭化エチジウムを用いて染色した。その残りを低融点アガロースにかけ、必要なバンドを切り出した。DNAは、キアキックPCR精製キット（キアジェン）によってアガロースから精製した。精製したDNAを、Taqポリメラーゼを用いてT-末端化を施した、EcoRV切断したB luescript SK+ベクター（ストラタジーン）にクローン化し、そしてライゲーションしたDNAを電気穿孔法によって大腸菌DH5α株に導入した。予想されるサイズの挿入物をもつ、組換え体クローンを選択し、そしてそれらのDNA配列を自動シーケンス装置で決定した。推定されるバナナPPOクローン（BPPO3およびBPPO8）は、既知の植物PPO遺伝子に対する相同性に基づいて同定された。参考文献１．フローマン，MA(1990)、「PCRプロトコル：方法と応用ガイド」（MA イニス（MA Innis）、DH ゲルフラント（DH Gelfrand）、JJ スニンスキー（JJ Snin sky）およびTJ ホワイト（TJ White）編）、アカデミック・プレス（Academic P ress）、ニューヨーク（New York）、pp28-38 ２．ドライ，IB（Dry，IB）、およびロビンソン，SP（Robinson，SP）（1994）「ブドウの蔓ポリフェノール・オキシダーゼの分子クローニングおよびその性格付け」、Plant Molecular Biology 26: 495-502』（２）明細書第１２頁第１行と２行との間に、下記の記載を挿入する。『第４図：バナナPPOタンパク質の一部をコードする、BPPO2 cDNAヌクレオチド配列およびそれに由来するタンパク質配列。第５図：バナナPPOタンパク質の一部をコードする、BPPO8 cDNAヌクレオチド配列およびそれに由来するタンパク質配列。』（３）添付の第４図及び第５図を追加する。【図４】【図５】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１． PPO活性をもつポリペプチドの材料、PPOの一番目の保存された領域に対応する配列をもつセンス方向の第一プライマー、およびPPOの二番目の保存された領域に対応する配列をもつアンチセンス方向の第二プライマーを提供し； PPO活性を持つポリペプチドの材料からRNAを単離し、そのRNAを処理して複製DNA（cDNA）を作製し；そのようにして作製されたcDNAを、第一および第二プライマーを用いて増幅する各工程を含む、PPOをコードする核酸、及びその断片および誘導体を調製するための方法。２．第一プライマーが、少なくともPPOの最初の銅（Cu）結合部位の一部、またはそのごく近傍に対応する配列であり、第二プライマーが、少なくともPPOの二番目の銅結合部位の一部、またはそのごく近傍に対応する配列である、請求の範囲第１項に記載の方法。３．核酸がバナナあるいはレタスPPOをコードし、PPO活性を持つポリペプチドの原料が、それぞれバナナまたはレタスのPPO活性を持つポリペプチドの原料である、請求の範囲第２項に記載の方法。４．第一プライマーが、次の配列：またはその一部を含むような、請求の範囲第３項に記載の方法。５．第二プライマーが、次の配列：またはその一部を含むような、請求の範囲第４項に記載の方法。６． cDNAを作製するためにRNAを処理する段階が、cDNAを作製するためにRNAを逆転写酵素および次の配列：またはその一部を持つアダプター・プライマーで処理することを含む、請求の範囲第３項に記載の方法。７． PPO活性を持つポリペプチドの原料、センスプライマー、およびアダプター・プライマーを提供し； PPO活性を持つポリペプチドの原料からＲＮＡを単離し；それからcDNAを作製するためにRNAを処理し；更に、そのようにして作製されたcDNAを、PPOの3'末端をコードする核酸を調製するために、プライマーを用いて増幅する各工程をさらに含む、請求の範囲第２項に記載の方法。８． PPO活性を持つポリペプチドの原料、アンカー、アンチセンスプライマー、およびアンカー・プライマーを提供し； PPO活性を持つポリペプチドの原料からRNAを単離し；ｃＤＮＡを作製するためにＲＮＡを処理し；そのようにして作製されたcDNAの5'末端にアンカーを連結し；そしてプライマーを用いてこのcDNAを増幅して、PPOの5'末端をコードして核酸を調製する各工程をさらに含む、請求の範囲第７項に記載の方法。９．核酸カルタスPPOをコードし、センス方向のプライマーが次の配列：またはその一部を含み、アンチセンス方向のプライマーが次の配列：またはその一部を含むような、請求の範囲第８項に記載の方法。１０．核酸がバナナPPOをコードし、センス方向のプライマーが次の配列：またはその一部を含み、アンチセンス方向のプライマーが次の配列：またはその一部を含むような、請求の範囲第８項に記載の方法。１１．アダプター・プライマーが次の配列：またはその一部を含む、請求の範囲第８項に記載の方法。１２．バナナPPOまたはバナナPPOに対するアンチセンス、およびその断片ならびに誘導体をコードする核酸。１３．触媒切断部位を含む、請求の範囲第１２項にしたがう核酸。１４．第２図または第３図に示された配列、その断片および誘導体、および実質的に相同な配列をもつ、請求の範囲第１２項に記載の核酸。１５．レタスPPOまたはレタスPPOに対するアンチセンス、およびその断片ならびに誘導体をコードする核酸。１６．触媒切断部位を含む、請求の範囲第１５項に記載の核酸。１７．第１図に示した配列、およびその断片ならびに誘導体、および実質的に相同な配列をもつ、請求の範囲第１５項に記載の核酸。１８．ベクターが単細胞生物または、それに代るものとしては植物において複製、転写および翻訳され得る、請求の範囲第１２項に記載の組換え体ベクター。１９．ベクターが単細胞生物または、それに代るものとしては植物において複製、転写および翻訳され得る、請求の範囲第１５項に記載の組換え体ベクター。２０．請求の範囲第１２項に記載の核酸；および植物試料を提供し；そして該核酸を該植物試料に導入して、形質転換バナナ植物を作製すること含む、バナナ植物組織においてPPO活性レベルを低下させる方法。２１．請求の範囲第１５項に記載の核酸；および植物試料を提供し；該核酸を該植物試料に導入して、形質転換レタス植物を作製することを含む、レタス植物組織においてPPO活性レベルを低下させる方法。２２．正常なバナナPPO遺伝子の発現を修飾できる核酸を含む、形質転換バナナ植物。２３．正常なレタスPPO遺伝子の発現を修飾できる核酸を含む、形質転換レタス植物。