DE69528045T2

DE69528045T2 - Dna konstruktionen, zellen und die davon abgeleiteten pflanzen

Info

Publication number: DE69528045T2
Application number: DE69528045T
Authority: DE
Inventors: Bilal Camara; Marcel Kuntz
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 1994-03-01
Filing date: 1995-02-17
Publication date: 2003-05-22
Anticipated expiration: 2015-02-18
Also published as: WO1995023863A1; JPH09510608A; EP0746615A1; EP0746615B1; US5880332A; DE69528045D1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf neuartige DNA- Konstrukte, Pflanzenzellen, welche die Konstrukte enthalten und die davon herrührenden Pflanzen.
Insbesondere bezieht sie sich auf die Modifikation des Carotinoidmetabolismus in Pflanzen unter Verwendung von DNA-Konstrukten.
Die Modifikation der pflanzlichen Genexpression wurde durch verschiedene Verfahren erreicht. Der Molekularbiologe kann aus einer Anzahl von bekannten Verfahren auswählen, um die Genexpression zu senken oder zu erhöhen oder um die räumliche oder zeitliche Expression bestimmter Gene zu verändern. Zum Beispiel wurde die Expression von entweder spezifischer Antisense- RNA (Gegensinn-RNA) oder teilweise (verkürzter) Sense-RNA (Sinn-RNA) zur Reduktion der Expression verschiedener Zielgene in Pflanzen verwendet (wie von Bird und Ray, 1991, Biotechnology and Genetic Engineering, Reviews 9: 207-227 übersichsweise dargestellt). Diese Verfahren umfassen die Aufnahme eines synthetischen Gens in das Genom der Pflanze, welches so gestaltet ist, dass es entweder Antisense- oder Sense-RNA exprimiert. Diese Verfahren wurden erfolgreich genutzt, um die Expression einer Anzahl von einzelnen an der Entwicklung und Reifung von Tomatenfrüchten beteiligten Genen herunter zu regeln (Gray et al., 1992, Plant Molecular Biology, 19 : 69-87).
Verfahren zur Erhöhung der Expression eines Zielgens wurden ebenfalls entwickelt. Zum Beispiel können zusätzliche Gene, so gestaltet, dass sie RNA exprimieren, welche die vollständige codierende Region des Zielgens enthält, in das Genom der Pflanze aufgenommen werden, um das Genprodukt zu "über-exprimieren". Verschiedene andere Methoden zur Modifizierung der Genexpression sind bekannt; zum Beispiel die Verwendung von alternativen regelnden Sequenzen.
Der Carotinoid-Stoffwechselweg in Pflanzen produziert Carotine, Lutein, Xanthophylle und Pigmente wie etwa Lycopen. Eine frühere Patentanmeldung (veröffentlicht als EP-A-505405) beschreibt ein Verfahren zur Modifizierung (Hemmung oder Steigerung) der Synthese von derartigen Verbindungen in Pflanzen unter Verwendung von DNA-Konstrukten, mit einer DNA-Sequenz, welche bevorzugt ein Phytoensynthaseenzym codiert (welches insbesondere die Farbe von Pflanzenteilen, speziell der Frucht, modifiziert).
Die späten Schritte der Carotinoidbiosynthese in Pflanzen umfassen die Bildung von Xanthophyllen. Wenig ist über die Enzymologie dieser Schritte bekannt. Keine pflanzlichen Enzyme der Xanthophyll-Biosynthese wurden bisher kloniert. Chemical Abstracts Band 103, 1985 Nr. 50158y beschreibt die Charakterisierung von Phytoensynthetase, einem Enzym, welches bei der Biosynthese von Carotinoiden in Capsicum annuum vorhanden ist. Dieses Dokument erwähnt die Tatsache, dass Capsanthin und Capsorubin aus Antheraxanthin und Violaxanthin synthetisiert werden.
Bei der zur vorliegenden Erfindung führenden Arbeit haben wir ein Enzym der Xanthophyll-Biosynthese aus Chromoplasten von Capsicum annuum (spanischer Pfeffer) bis zur Homogenität gereinigt, welches die Umwandlung von ubiquitären 5,6-Epoxycarotinoiden, Antheraxanthin und Violaxanthin, in Capsanthin bzw. Capsorubin katalysiert. Aufgrund seiner Bifunktionalität wurde dieses neue Enzym als Capsanthin-Capsorubin-Synthase (CCS) bezeichnet.
Sowohl Capsanthin als auch Capsorubin sind rot und geben dem Pflanzengewebe Farbe. Zur Zeit werden beide Xanthophylle (extrahiert aus Paprika) als Lebensmittelfarbstoffe verwendet. Capsanthin und Capsorubin kommen nur in Capsicum-Früchten vor und CCS kann natürlicherweise nur in Arten dieses Genus (einschließlich Pfeffern, Chili und Paprika) exprimiert werden. Jedoch sind die unmittelbaren Vorläufer von Capsanthin und Capsorubin (Violaxanthin und Antheraxanthin) in allen grünen Geweben vorhanden.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine DNA- Sequenz enthaltend:
- die in Fig. 3 dargestellte Nucleotid-Sequenz, welche für eine Messenger-RNA (Boten-RNA, mRNA) codiert, wobei diese mRNA für ein in Fig. 3 dargestelltes, als Capsanthin-Capsorubin-Synthase (CCS) bezeichnetes Enzym des Xanthophyllmetabolismus codiert,
- jede Nucleotid-Sequenz, welche von der vorher erwähnten, in Fig. 3 dargestellten Sequenz abgeleitet ist, insbesondere durch Mutation und/oder Hinzufügen und/oder Austausch von einem oder mehreren Nucleotid(en), wobei diese abgeleitete Sequenz für eine mRNA codiert, die für ein in Fig. 3 dargestelltes Enzym oder ein von diesem Enzym abgeleitetes Protein codiert, und welches in Pflanzen die enzymatische Aktivität des Enzyms des Xanthophyllmetabolismus der Fig. 3 aufweist.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenfalls auf eine DNA-Sequenz, welche die zu der in Fig. 3 dargestellte komplementäre Nucleotid-Sequenz enthält, und wie vorher definiert ist, wobei diese komplementäre Sequenz für eine Antisense-mRNA codiert, die mit einer mRNA wie vorher definiert hybridisieren kann.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenfalls auf eine mRNA, codiert durch eine DNA-Sequenz wie vorher definiert, und insbesondere durch die in Fig. 3 dargestellte DNA-Sequenz codiert, wobei diese mRNA für ein in Fig. 3 dargestelltes Enzym des Xanthophyllmetabolismus oder ein von diesem abgeleitetes Protein codiert, und welches die enzymatische Aktivität dieses Enzyms in Pflanzen aufweist.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenfalls auf eine Antisense-mRNA, welche Nucleotide umfasst, welche komplementär zu den Nucleotiden sind, welche eine mRNA wie vorher definiert bilden und mit dieser mRNA hybridisieren können, welche durch die in Fig. 3 dargestellte DNA-Sequenz codiert wird, und wobei diese mRNA für das in Fig. 3 dargestellte Enzym des Xanthophyllmetabolismus bzw. ein von diesem Enzym abgeleitetes Protein codiert, und welches die enzymatische Aktivität dieses Enzyms in Pflanzen aufweist.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenfalls auf gereinigte CCS, isoliert aus Zellen von Capsicum annuum und wie in Fig. 3 dargestellt, oder jedes von dieser CCS abgeleitete Protein, insbesondere durch Hinzufügen und/oder Suppression und/oder Austausch von einer oder mehreren Aminosäuren, wobei dieses Protein die enzymatische Aktivität von CCS aufweist, oder jedes Fragment von der CCS oder der abgeleiteten Sequenz, wobei diese Fragmente und abgeleiteten Sequenzen die enzymatische Aktivität von CCS aufweisen.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenfalls auf einen gebildeten Komplex zwischen einer Antisense-mRNA, wie vorher definiert, und einer mRNA, wie vorher definiert, welche für eine CCS in Pflanzen codiert.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenfalls auf eine rekombinante DNA, dadurch gekennzeichnet,
- dass sie eine DNA-Sequenz wie vorher definiert umfasst, wobei diese wie vorher definierte Sequenz in eine heterologe Sequenz eingefügt wird und für eine CCS codierende mRNA codiert.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenfalls auf eine rekombinante DNA, dadurch gekennzeichnet,
- dass sie eine DNA umfasst, welche komplementär zu einer wie vorher definierten DNA-Sequenz ist, in eine heterologeiSequenz eingefügt wird, wobei diese komplementäre DNA-Sequenz für eine Antisense-mRNA codieren kann, welche mit der für eine CCS in Pflanzen codierende mRNA hybridisieren kann.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenfalls auf eine wie vorher definierte rekombinante DNA, dadurch gekennzeichnet, dass sie Elemente umfasst, die notwendig für die Steuerung der Expression der vorher definierten Nucleotidsequenz oder ihrer wie vorher definierten komplementären Sequenz sind, insbesondere einen Promotor und einen Terminator der Transkription dieser Sequenzen.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenfalls auf einen rekombinanten Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er eine wie vorher definierte rekombinante DNA umfasst, integriert in einen der Orte seines Genoms, welche für seine Replikation nicht wesentlich sind.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenfalls auf ein Verfahren zur Modifikation der Carotinoid-Produktion in Pflanzen, bezogen auf dem normalen Gehalt an durch die Pflanzen produziertem Carotinoid, entweder durch Steigerung der Carotinoid-Produktion, oder durch Senken oder Inhibition der Carotinoid-Produktion der Pflanzen, wobei dieses Verfahren die Transformation der Pflanzenzellen mit einem Vektor wie vorher definiert umfasst.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenfalls auf Pflanzen oder Pflanzenteile, insbesondere Früchte, Samen, Blätter, Blütenblätter oder Zellen, transformiert durch Aufnahme wenigstens einer der vorher definierten Nucleotid-Sequenzen in ihr Genom.
Erfindungsgemäß wird ein DNA-Konstrukt zur Verfügung gestellt, mit einer DNA-Sequenz homolog zu einer oder aller Sequenzen, die für ein Enzym des Xanthophyllmetabolismus codieren. Die DNA-Sequenz kann von cDNA oder von genomischer DNA abgeleitet sein oder kann ab initio synthetisiert werden. Das metabolische Enzym kann ein Enzym der Xanthophyll-Biosynthese oder ein Xanthophyll abbauendes Enzym sein. Bevorzugt codiert die DNA-Sequenz Capsänthin-Capsorubin-Synthase (CCS).
Das gereinigte CCS-Enzym ist ein Monomer mit einer Molekülmasse von 50 kDa. Gegen dieses Enzym gerichtete Antikörper ermöglichten die Isolierung eines vollständigen cDNA-Klons, welcher einen Vorläufer der Capsanthin-Capsorubin-Synthase mit hohem Molekulargewicht codiert. Die cDNA-Sequenz ist in Fig. 3 gezeigt. Die ermittelte primäre Struktur ergab das Vorhandensein einer Gonsensus-Nucleotidbindungsstelle. Das Capsanthin- Capsorubin-Synthase-Gen wird spezifisch während der Chromoplasten-Entwicklung in Ketocarotenoide akkumulierenden Früchten exprimiert, jedoch nicht in Mutanten, welche in diesem Biosyntheseschritt beeinträchtigt sind.
cDNA-Klone, welche CCS oder andere Enzyme des Xanthophyllmetabolismus codieren, können von cDNA- Bibliotheken unter Verwendung von Standardverfahren erhalten werden. Folglich können Sequenzen, welche für die gesamte oder im Wesentlichen die gesamte mRNA codieren, hergestellt durch das entsprechende Gen, erhalten werden. Die so erhaltene cDNA kann gemäß bekannter Verfahren sequenziert werden.
Eine alternative Quelle für die DNA-Sequenz ist ein geeignetes Gen, welches das entsprechende Enzym des Xanthophyllmetabolismus codiert. Dieses Gen kann von der korrespondierenden cDNA darin abweichen, dass Introns vorhanden sein können. Die Introns werden nicht in mRNA transkribiert (oder wenn sie so transkribiert werden, werden sie nachfolgend ausgeschnitten).
Oligonucleotidsonden oder der cDNA-Klon können verwendet werden, um das/die tatsächlichen Enzymgen(e) des Xanthophyllmetabolismus durch Screening genomischer DNA- Bibliotheken zu isolieren. Derartige genomische Klone können Kontrollsequenzen enthalten, welche im Pflanzengenom wirksam sind. Folglich ist es ebenfalls möglich, Promotorsequenzen zu isolieren, welche zur Steuerung der Expression der Enzyme oder jedes anderen Proteins verwendet werden können. Diese Promotoren können insbesondere auf bestimmte Entwicklungsvorgänge und Umweltlaedingungen ansprechen. Genpromotoren der Enzyme des Xanthophyllmetabolismus können zur Steuerung der Expression jedes Zielgens verwendet werden.
Ein weiterer Weg für den Erhalt einer DNA-Sequenz eines Enzyms des Xanthophyllmetabolismus ist, es sie ab initio mit den geeigneten Basen zu synthetisieren, zum Beispiel unter Verwendung der entsprechenden cDNA-Sequenz als Vorlage (zum Beispiel Fig. 3 für CCS).
Es ist klar, dass für Enzyme des Xanthophyllmetabolismus codierende Sequenzen nicht nur von Capsicum-Arten isoliert werden können, sondern von jeder geeigneten Pflanzenart. Alternative Quellen für geeignete Gene enthalten Bakterien, Hefe, niedere und höhere Eukaryoten.
Die für die Enzyme des Xanthophyllmetabolismus codierenden Sequenzen können in für die Pflanzentransformation geeignete DNA-Konstrukte aufgenommen werden. Diese DNA-Konstrukte können dann zur Modifizierung der Genexpression in Pflanzen verwendet werden. "Antisense-" oder "Partial Sense-" oder andere Verfahren können verwendet werden, um die Expression der Enzyme des Xanthophyllmetabolismus im Pflanzengewebe zu reduzieren. Die Niveaus der Enzyme des Xanthophyllmetabolismus können ebenfalls angehoben werden; zum Beispiel durch Aufnahme zusätzlicher Enzymgene. Die zusätzlichen Gene können so gestaltet sein, dass sie entweder die gleichen oder unterschiedliche räumliche und zeitliche Muster der Expression in den Pflanzen ergeben.
Das Gesamtniveau der Enzymaktivität des Xanthophyllmetabolismus und die relativen Aktivitäten der einzelnen Enzyme beeinflussen die Entwicklung und endgültige Form des Carotinoidgehalts in der Pflanze und können folglich bestimmte Eigenschaften der Pflanzenteile bestimmen. Die Modifikation der Enzymaktivität des Xanthophyllmetabolismus kann deshalb verwendet werden, um verschiedene Gesichtspunkte der Pflanzen-(einschließlich der Frucht-)qualität zu modifizieren. Die Aktivitätsniveaus der Enzyme des Xanthophyllmetabolismus können während der Entwicklung entweder reduziert oder erhöht sein, abhängig von den erwünschten Eigenschaften für die modifizierten Pflanze. Verstärkte Expression der biosynthetischen Enzyme wird die Produktion des bestimmten Xanthophyllprodukts erhöhen und eine Hemmung der Expression wird die Produktion vermindern. Verstärkte Expression eines abbauenden Enzyms wird die Niveaus des abgebauten Xanthophyll senken, während die Inhibierung der Expression das Niveau des Xanthophylls erhöhen wird.
Zum Beispiel wird die Herunterregelung der biosynthetischen Enzymaktivität von CCS in Pfeffern (zum Beispiel unter Verwendung von Antisense- oder Sense- Konstrukten) die Capsorubin und/oder Capsanthin- Produktion hemmen, um die Fruchtfarbe zu ändern. Eine derartige Herrunterregelung kann in einer Akkumulation des unmittelbaren Vorläufers dieser roten Pigmente, Antheraxanthin und Violaxanthin, resultieren, welche orange/gelb sind. Ahs ein weiteres Beispiel kann die Überexpression von CCS in Capsicum-Arten verwendet werden, um die Fruchtfarbe zu verstärken.
CCS kann ebenfalls in Zellen, Geweben und Organismen exprimiert werden, welche normalerweise kein Capsorubin oder Capsanthin produzieren. Ein DNA-Sense-Konstrukt, welches das funktionelle CCS-Enzym codiert und exprimiert, kann in jede geeignete eukaryotische oder prokaryotische Zelle (Pflanze, Pilz, Alge, Bakterium, Tier usw.) transformiert werden. Da die unmittelbaren Vorläufer für Capsanthin und Capsorubin in allen grünen Pflanzengeweben vorhanden sind, führt die Expression des CCS-Enzyms in derartigen Geweben zu Capsanthin- und Capsorubin-Synthese. In anderen Fällen kann die Einführung zusätzlicher Gene der Carotinoidbiosynthese notwendig sein, um eine Zufuhr des Vorläufers sicher zu stellen.
CCS könnte verwendet werden, um Capsorubin und/oder Capsanthin in einer höheren Pflanze (einschließlich Capsicum-Arten, Tomaten, Möhren, Kohl usw.) zu produzieren, da die unmittelbaren Vorläufer ubiquitär sind. Dies kann hilfreich sein, um die Farbe der Pflanze oder des Organs in Abhängigkeit vom zur Steuerung der CCS verwendeten Promotors zu ändern oder zu verstärken. Es ist insbesondere hilfreich zur Modifizierung der Frucht- und Pflanzenfarbe, kann aber ebenfalls für Blätter und andere Organe verwendet werden.
Durch einen ein CCS-codierendes DNA-Konstrukt exprimierenden eukaryotischen oder prokaryotischen Organismus produziertes Capsorubin oder Capsanthin, kann zur Verwendung als ein Lebensmittelfarbstoff extrahiert werden.
Als ein weiterer Gesichtspunkt der Erfinduhg wird ein Verfahren für die Produktion von Capsorubin oder Capsanthin zur Verfügung gestellt, welcher die Transformation einer eukaryotischen oder prokaryotischen Zelle mit einem DNA-Konstrukt umfasst, welches ein Protein mit CCS-Enzymaktivität codiert und exprimiert. Es kann notwendig sein die Zelle mit zusätzlichen Konstrukten zu transformieren, welche Enzyme exprimieren, die zur Produktion der notwendigen Vorläufer benötigt werden.
Ferner wird ein Verfahren zur Produktion von Violaxanthin oder Antheraxanthin zur Verfügung gestellt, welches die Transformation einer eukaryotischen oder prokaryotischen Zelle mit einem DNA-Konstrukt umfasst, welches wenigstens einen Teil eines Proteins mit CCS- Enzymaktivität codiert, so dass die Produktion von Capsorubin oder Capsanthin inhibiert wird.
Die Aktivität des Enzyms des Xanthophyllmetabolismus kann entweder individuell oder in Kombination mit der Modifikation der Aktivität eines weiteren ähnlichen oder eines Enzyms ohne Beziehung dazu modifiziert werden. Zum Beispiel kann die Aktivität des CCS-Enzyms in Kombination mit der Modifikation der Aktivität eines an der Fruchtreifung beteiligten Zellwandenzyms modifiziert werden.
Die Verwendung der neuartigen Konstrukte von Enzymen des Xanthophyllmetabolismus stellt ein Verfahren zur Modifikation von Pflanzeneigenschaften zur Verfügung, welches die Modifikation der Aktivität der Enzyme des Xanthophyllmetabolismus umfasst.
Ferner wird erfindungsgemäß ein DNA-Konstrukt zur Verfügung gestellt, mit einer DNA-Sequenz homolog zu einigen oder allen Sequenzen, welche für ein Enzym des Xanthophyllmetabolismus unter der Steuerung einer in Pflanzen wirksamen Transkriptionsinitiationsregion codieren, so dass das Konstrukt RNA in Pflanzenzellen erzeugen kann.
Die Eigenschaften von Pflanzenteilen (insbesondere der Frucht) kann durch Transformation mit einem erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt modifiziert werden. Die Erfindung stellt ebenfalls derartige Konstrukte enthaltende Pflanzenzellen zur Verfügung; davon herrührende Pflanzen, welche modifizierte Fruchteigenschaften zeigen; und Samen derartiger Pflanzen.
Ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt kann ein "Antisense"-Konstrukt, welches "Antisense-RNA" erzeugt, oder ein "Sense"-Konstrukt (welches wenigstens einen Teil des funktionellen Enzyms codiert) sein, welches "Sense- RNA" erzeugt. "Antisense-RNA" ist eine RNA-Sequenz, welche komplementär zu der Basensequenz in der korrespondierenden mRNA ist: Komplementär in dem Sinne, dass jede Base (oder die Mehrheit der Basen) in der Antisense-Sequenz (gelesen in dem 3' zu 5'-Sinne) sich mit der korrespondierenden Base (G mit C, A mit U) in der im 5' zu 3'-Sinn gelesenen mRNA-Sequenz paaren kann. Derartige Antisense-RNA kann in der Zelle durch Transformation mit einem geeigneten DNA-Konstrukt produziert werden, welches so angeordnet ist, dass es ein Transkript mit wenigstens einem Teil seiner Sequenz erzeugt, welches zu wenigstens einem Teil des codierenden Stranges des relevanten Genes (oder einer DNA-Sequenz mit wesentlicher Homologie dazu) komplementär ist. "Sense- RNA" ist eine RNA-Sequenz, welche im Wesentlichen homolog zu wenigstens einem Teil der korrespondierenden mRNA- Sequenz ist. Derartige Sense-RNA kann in der Zelle durch Transformation mit einem geeigneten DNA-Konstrukt, ange ordnet in der normalen Orientierung, erzeugt werden, um so ein Transkript mit einer Sequenz identisch zu wenigstens einem Teil des codierenden Stranges des relevanten Genes (oder einer DNA-Sequenz mit wesentlicher Homologie dazu) zu erzeugen. Geeignete Sense-Konstrukte können zur Inhibierung der Genexpression (wie in der Internationalen Patentveröffentlichung WO 91/08299 beschrieben) oder zur Überexpression des Enzyms verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Konstrukte können in Pflanzen eingefügt werden, um die Produktion von Enzymen des Xanthophyllmetabolismus zu regeln. Die Konstrukte können in jede zweikeimblättrige oder einkeimblättrige Pflanze transformiert werden. In Abhängigkeit von der Art des Konstrukts kann die Produktion des Enzyms erhöht oder reduziert werden, entweder während des gesamten oder in bestimmten Stadien des Lebens der Pflanze. Im Allgemeinen, wie erwartet werden würde, wird die Enzymproduktion nur durch Konstrukte erhöht, welche RNA homolog zu dem im Wesentlichen kompletten endogenen Enzym-mRNAs exprimieren. Vollständige Sense-Konstrukte können ebenfalls die Enzymexpression hemmen. Konstrukte, welche eine unvollständige DNA-Sequenz, kürzer als die dem gesamten Gen entsprechende enthalten, hemmen im Allgemeinen die Expression des Gens und die Produktion der Enzyme, auch wenn sie so angeordnet sind, um Sense- oder Antisense-RNA zu exprimieren.
Vollständige Antisense-Konstrukte hemmen ebenfalls die Genexpression.
In einem erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt kann die Transkriptionsinitiationsregion von jedem in Pflanzen wirksamen Promotor gesteuert werden. Die Transkriptionsinitiationsregion kann für die Transkription einer DNA-Sequenz, welche RNA codiert, die komplementär zu einer wesentlichen Basenabfolge in einer das Enzym des Xanthophyllmetabolismus codierenden mRNA ist, angeordnet sein (Erzeugen des DNA-Konstrukts als ein vollständiges oder teilweises Antisense-Konstrukt).
Erfindungsgemäße DNA-Konstrukte können eine Basensequenz mit einer Länge von wenigstens 10 Basen (bevorzugt wenigstens 35 Basen) für die Transkription in RNA umfassen. Es gibt keine theoretische obere Grenze für die Basensequenz - sie kann solange wie die durch die Zellen produzierte relevante mRNA sein - aber für die Bedarfsgerechtigkeit wird im Allgemeinen als geeignet festgestellt werden, eine Sequenz mit einer Länge zwischen 100 und 1000 Basen zu verwenden. Die Herstellung eines solchen Konstrukts wird im Folgenden mit mehr Einzelheiten beschrieben.
Als eine Quelle für die DNA-Basensequenz zur Transkription kann eine geeignete cDNA oder genomische DNA oder synthetische Polynucleotide verwendet werden. Die Isolierung einer geeigneten Sequenz, welche für ein biosynthetisches Enzym des Xanthophyllmetabolismus codiert, wird vorher beschrieben. Sequenzen, welche für das gesamte, oder im Wesentlichen das gesamte entsprechende Enzyms codieren, könneü folglich erhalten werden. Geeignete Längen dieser DNA-Sequenzen können für die Verwendung mittels Restriktionsenzymen ausgeschnitten werden. Falls genomische DNA als die Quelle einer teilweisen Basensequenz zur Transkription verwendet wird, ist es möglich, entweder Intron- oder Exonregionen oder eine Kombination von beiden zu verwenden.
Um geeignete Konstrukte zur Expression der entsprechenden Sequenz des Enzyms für den Xanthophyllmetabolismus in Pflanzenzellen zu erhalten, kann die cDNA-Sequenz wie in der cDNA des Enzyms oder die Gensequenz wie in dem Chromosom der Pflanze vorgefunden, verwendet werden. Rekombinante DNA-Konstrukte können unter Verwendung von Standardverfahren erzeugt werden. Zum Beispiel kann die DNA-Sequenz für die Transkription durch die Behandlung eines Vektors, welcher die Sequenz enthält, mit Restriktionsenzymen zum Ausschneiden des entsprechenden Segments erhalten werden. Die DNA-Sequenz für die Transkription kann ebenfalls durch Hybridisierung und Ligation synthetischer Oligonucleotide oder durch Verwendung synthetischer Oligonucleotide in einer Polymerasekettenreaktion (PCR) erzeugt werden, um geeignete Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme an jeder Seite zu erzeugen. Die DNA-Sequenz wird dann in einen Vektor, welcher stromaufwärts Promotorsequenzen und stromabwärts Terminatorsequenzen enthält, kloniert. Wenn Antisense-DNA erforderlich ist, wird das Klonieren so durchgeführt, dass die geschnittene DNA-Sequenz, in Bezug auf die Orientierung in dem Strang von dem sie ausgeschnitten wurde, umgedreht wird.
In einem Konstrukt, welches Antisense-RNA exprimiert, wird der Strang der vorher der Matrizenstrang war, der codierende Strang und umgedreht. Das Konstrukt wird folglich RNA in einer Basensequenz codieren, welche komplementär zu einem Teil oder zu der Gesamtsequenz der Enzym-mRNA ist. Folglich sind die zwei RNA-Stränge nicht nur in ihrer Basensequenz komplementär sondern auch in ihrer Orientierung (5' zu 3').
In einem Sense-RNA exprimierenden Konstrukt behalten der Matrizenstrang und der codierende Strang die Aufgabe und Orientierung des ursprünglichen Pflanzengens. Konstrukte, welche Sense-RNA exprimieren, codieren RNA mit einer Basensequenz, welche homolog zu einem Teil oder zu der Gesamtsequenz der mRNA ist. Bei Konstrukten, welche das funktionelle Enzym exprimieren, ist die gesamte codierende Region des Gens mit Transkriptionssteuerungssequenzen verbunden, welche zur Expression in Pflanzen in der Lage sind.
Zum Beispiel können erfindungsgemäße Konstrukte wie folgt erzeugt werden. Ein geeigneter Vektor, welcher die erwünschte Basensequenz zur Transkription enthält (wie etwa ein CCS-cDNA-Klon) wird mit Restriktionsenzymen behandelt, um die Sequenz auszuschneiden. Der so erhaltene DNA-Strang wird in einen zweiten Vektor kloniert (wenn erwünscht in umgedrehter Orientierung), welcher die erwünschte Promotorsequenz und die erwünschte Terminatorsequenz enthält. Geeignete Promotoren enthalten den Promot or des 35S Cauliflowermosaicvirus und die Promotorsequenz des Polygalacturonasegens der Tomate (Bird et al., 1988, Plant Molecular Biology, 11: 651-662) oder andere entwicklungsabhängig regulierte Fruchtpromotoren. Geeignete Terminatorsequenzen enthalten die des Agrobacterium tumefaciens Nopalinsynthasegens (das nos 3'-Ende).
Die in Pflanzen wirksame Transkriptionsinitiationsregion (oder der Promotor) kann ein konstitutiver Promotor (wie etwa der Promotor des 35S Cauliflowermosaicvirus) oder ein induzierbarer oder entwicklungsabhängig regulierter Promotor (wie etwa ein fruchtspezifischer Promotor) sein, wie es die Umstände erfordern. Zum Beispiel kann es erwünscht sein, die Enzymaktivität nur während der Fruchtentwicklung und/oder Reifung zu modifizieren. Die Verwendung eines konstitutiven Promotors kann dazu führen, dass die Enzymniveaus und Funktionen in allen Pflanzenteilen beeinträchtigt werden, während die Verwendung eines gewebsspezifischen Promotors eine gezieltere Steuerung der Genexpression und der beeinflussten Funktionen (zum Beispiel Fruchtfärbung) erlaubt. Folglich wird für die Anwendung der Erfindung (zum Beispiel an Pfeffer) es als günstig angesehen werden, einen Promotor zu verwenden, welcher eine Expression während der Fruchtentwicklung und/oder Reifung ergibt. Folglich wird die Antisense- oder Sense-RNA nur in den Organen produziert, in der ihre Wirkung erforderlich ist. Fruchtentwicklungs- und/oder reifungsspezifische Promotoren, die verwendet werden können, enthalten den Reifung verstärkenden Polygalacturonasepromotor (Internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 92/08798), den E8-Promotor (Diekman & Fischer, 1988, EMBO, 7: 3315-3320) und den Frucht-spezifischen 2A11-Promotor (Pear et al., 1989, Plant Molecular Biology, 13: 639-651).
Der Carotinoid-(insbesondere Xanthophyll-)Gehalt (und folglich die Pflanzeneigenschaften) können zu einem stärkeren oder geringeren Mäße durch Steuerung des Grades der Sense- oder Antisense-mRNA-Produktion des entsprechenden Enzyms des Xanthophyllmetabolismus in der Pflanzenzelle gesteuert werden. Dies kann durch geeignete Auswahl der Promotorsequenzen oder durch Wahl der Kopienanzahl oder des Einfügungsstelle der DNA-Sequenzen, die in das Pflanzengenom eingeführt werden, erfolgen. Zum Beispiel kann das DNA-Konstrukt mehr als eine für das Enzym des Xanthophyllmetabolismus codierende DNA-Sequenz enthalten oder mehr als ein rekombinantes Konstrukt kann in jede Pflanzenzelle transformiert werden.
Die Aktivität eines ersten Enzyms des Xanthophyllmetabolismus kann getrennt durch Transformation mit einem geeigneten DNA-Konstrukts mit einer DNA-Sequenz, welche für das erste Enzym codiert, modifiziert werden. Die Aktivität eines zweiten Enzyms für den Xanthophyllmetabolismus kann getrennt durch Transformation mit einem DNA-Konstrukt, mit einer DNA- Sequenz, welche für das zweite Enzym codiert, modifiziert werden. Zusätzlich kann die Aktivität sowohl des ersten als auch des zweiten Enzyms gleichzeitig durch Transformation einer Zelle mit zwei unterschiedlichen Konstrukten modifiziert werden: das erste umfasst eine erste Enzym-codierende Sequenz und das zweite umfasst eine zweite Enzym-codierende Sequenz. Alternativ kann eine Pflanzenzelle mit einem einzelnen DNA-Konstrukt transformiert werden, welches sowohl eine erste Enzymcodierende Sequenz als auch eine zweite Enzym-codierende Sequenz umfasst.
Es ist ebenfalls möglich, die Aktivität der Enzyme des Xanthophyllmetabolismus zu modifizieren, während ebenfalls die Aktivität von einem oder mehreren anderen Enzymen modifiziert wird. Zum Beispiel können die anderen Enzyme am Zellmetabolismus oder an der Fruchtentwicklung und -reifung beteiligt sein. Andere Enzyme des Zellwandmetabolismus, die in Kombination mit den Enzymen des Xanthophyllmetabolismus modifiziert werden können, enthalten, aber sind nicht darauf beschränkt:
Pektinesterase, Polygalacturonase, β-Galactanase, β- Glucanase. Andere an der Fruchtentwicklung und Reifung beteiligte Enzyme, die in Kombination mit den Enzymen des Xanthophyllmetabolismus modifiziert werden können, enthalten aber sind nicht darauf beschränkt: Enzyme der Ethylenbiosynthese, andere Enzyme Carotinoidbiosynthese, einschließlich Phytoensynthase, Enzyme des Kohlenhydratmetabolismus, einschließlich Invertase.
Verschiedene Verfahren für die Modifikation der Aktivität von Enzymen des Xanthophyllmetabolismus in Kombination mit anderen Enzymen sind verfügbar. Zum Beispiel kann eine erste Pflanze einzeln mit einem CCS- Konstrukt transformiert und dann mit einer zweiten Pflanze, welche einzeln mit einem ein anderes Enzym codierenden Konstrukts transformiert wurde, gekreuzt werden. Als ein weiteres Beispiel können Pflanzen mit CCS-Konstrukten und mit geeigneten Konstrukten zur Modifikation der Aktivität anderer Enzyme entweder nacheinander oder kotransformiert werden. Ein alternatives Beispiel ist die Pflanzentransformation mit einem CCS-Konstrukt, welches ein zusätzliches Gen zur Modifikation des/der anderen Enzyme(s) enthält. Die Konstrukte des biosynthetischen Enzyms des Xanthophyllmetabolismus können DNA-Sequenzen zur Steuerung der Expression eines oder mehrerer anderer Enzyme, angeordnet in der Nähe der Sequenzen des Xanthophyll-Enzyms, enthalten. Diese zusätzlichen Sequenzen können entweder in Sense- oder Antisense- Orientierung sein, wie in der internationalen Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer WO 93/23551 beschrieben (einzelnes Konstrukt mit abgegrenzten DNA- Regionen, homolog zu verschiedenen Zielgenen). Bei Verwendung derartiger Verfahren können die Vorzüge der Modifizierung der Aktivität der Enzyme des Xanthophyllmetabolismus mit den Vorzügen der Modifikation der Aktivität anderer Enzyme kombiniert werden.
Ein DNA-Konstrukt der Erfindung wird in eine Zielpflanzenzelle transformiert. Die Zielpflanzenzelle kann ein Teil einer Gesamtpflanze oder kann eine isolierte Zelle oder Teil eines Gewebes sein, welche(s) in eine Gesamtpflanze regeneriert werden kann. Die Zielpflanzenzelle kann von jeder einkeimblättrigen oder zweikeimblättrigen Pflanzenart ausgewählt sein. Geeignete Pflanzen enthalten jede fruchttragende Pflanze (wie etwa Tomaten, Mangos, Pfirsiche, Äpfel, Birnen, Erdbeeren, Bananen, Melonen, Pfeffer, Chilis, Paprika). Für jede bestimmte Pflanzenzelle kann die in dem Transformationskonstrukt verwendete Sequenz des Enzyms für den Xanthophyllmetabolismus, aus der gleichen Pflanzenart abgeleitet sein, oder sie kann von jeder anderen Pflanzenart abgeleitet sein (ausreichende Sequenzähnlichkeit, um die Modifikation der damit verbundenen Enzymgenexpression zu ermöglichen).
Erfindungsgemäße Konstrukte können zur Transformation jeder Pflanze unter Verwendung jeder geeigneten Transformationstechnik verwendet werden, um erfindungsgemäße Pflanzen zu erzeugen. Sowohl einkeimblättrige als auch zwelkeimblättrige Pflanzenzellen können auf verschiedene dem Stand der Technik bekannte Wege transformiert werden. In vielen Fällen können derartige Pflanzenzellen (insbesondere falls die Zellen von zweikeimblättrigen Pflanzen sind) kultiviert werden, um Gesamtpflanzen zu regenerieren, welche sich nachfolgend fortpflanzen, um nachfolgende Generationen von genetisch modifizierten Pflanzen zu ergeben. Jedes geeignete Verfahren zur Pflanzentransformation kann verwendet werden. Zum Beispiel können zweikeimblättrige Pflanzen wie etwa Tomate und Melone durch das Agrobacterium Ti- Plasmidverfahren, wie etwa beschrieben von Bevan (1984, Nucleic Acid Research, 12: 8711-8721) oder Fillatti et al. (Biotechnology, Juli 1987, 5: 726-730), transformiert werden. Derartig transformierte Pflanzen können sexuell oder durch Zell- oder Gewebekultur vermehrt werden.
Ferner wird ein Verfahren zur Verfügung gestellt zur Modifikation der Produktion von Carotinoiden in Pflanzen durch Transformation derartiger Pflanzen mit DNA, welche daran angepasst ist die Carotinoid-Biosynthese zu modifizieren, und Wachstum derartiger transformierter Pflanzen und ihrer Abkömmlinge, um Pflanzenteile zu produzieren (zum Beispiel Blätter, Blütenblätter oder Früchte) mit modifizierten Carotinoidgehalt. Geeignete DNA umfasst unter anderem erfindungsgemäße Konstrukte, aber andere ähnliche Konstrukte, welche andere Teile des Carotinoid-Stoffwechselweges beeinflussen, können ebenfalls verwendet werden. Derartige Konstrukte können daran angepasst sein, die Produktion von Carotinoiden (zum Beispiel Xanthophyllen) zu verstärken, oder eine solche Produktion durch die Pflanzen zu inhibieren.
Neben der Farbproduktion können andere wichtige Funktionen durch das Verfahren der Erfindung modifiziert werden. So sind β-Carotin (ein Vorläufer von Vitamin A) und andere Carotinoide wichtig für die menschliche Gesundheit, und werden dafür beansprucht, einen Schutzeffekt gegen bestimmte Krankheiten zu haben. Nahrungspflanzen können durch die Transformation mit den erfindungsgemäßen Erfindung modifiziert werden, so dass sie einen höheren Gehalt an derartigen Verbindungen haben: oder andere Pflanzen können so modifiziert werden, so dass sie als eine Quelle dienen können, von der solche Verbindungen extrahiert werden können. Von Carotinoiden wird ebenfalls angenommen, dass sie eine Rolle beim Schutz der Pflanzen gegen Beschädigungen durch hohe Lichtintensität haben, so dass Pflanzen mit einem höheren Gehalt an solchen Verbindungen wertvoll im Kampf gegen die Wirkungen jedes weltweiten Klimawechsels sein können.
Auf diese Weise können Pflanzen erzeugt werden, welche eine modifizierte Farbe aufgrund der Förderung oder Inhibierung des Stoffwechselwegs der Carotinoid- Biosynthese haben. Insbesondere können CCS-Konstrukte verwendet werden, um die Produktion der mit Capsorubin oder Capsanthin assoziierten Farbe zu fördern oder zu inhibieren. Zum Beispiel kann die Inhibierung dieser roten Farbe in Pfeffer (zum Beispiel durch Transformation mit Antisense- oder Sense-Konstrukten) der Frucht einen attraktiven Orange- oder Gelbton geben. Ähnliche orange/gelbe Pfeffer sind bekannt, aber die vorliegende Erfindung stellt Mittel zur Verfügung zur Übertragung des Merkmals in Hochleistungslinien, ohne ein langwieriges Zuchtprogramm, welches zur gleichen Zeit leicht andere Merkmale ändert. Die Förderung der Capsorubin- oder Capsanthin-Produktion (zum Beispiel durch Sense- Überexpressionskonstrukte) kann Pfeffer mit einer stärkeren roten Farbe produzieren, welcher dem Konsumenten appetitanregender erscheinen kann.
Die Erfindung kann ebenfalls verwendet werden, um eine rote Farbe in andere Teile der Pflanze als die Frucht einzuführen. Zum Beispiel kann die Förderung von Capsorubin oder Capsanthin durch Einfügen einer oder mehrerer funktioneller Kopien der cDNA des Genes oder des vollständigen Genes unter Steuerung eines in Pflanzen funktionellen Promotors erfolgen. Wenn Capsorubin oder Capsanthin natürlicherweise in der Pflanze exprimiert werden, kann der Promotor so gewählt werden, dass er einen höheren Expressionsgrad als den durch den natürlichen Promotor gegebenen ergibt.
Beispiele für erfindungsgemäß genetisch modifizierte Pflanzen schließen fruchttragende Pflanzen ein. Die Früchte derartiger Pflanzen können attraktiver (oder wenigstens interessanter) durch Induktion oder Intensivierung einer roten Farbe darin gemacht werden. Andere Pflanzen können durch das erfindungsgemäße Verfahren modifiziert werden, einschließlich von Knollenfrüchten wie etwa Rettich, Rüben, und Kartoffeln als auch von Kornfrüchten wie etwa Mais (Korn), Weizen, Gerste und Reis. Blumen mit modifizierter Farbe und Ziergräser entweder rot oder rötlich überall oder mit roten Fruchtköpfen, können produziert werden.
Wie bereits diskutiert, können durch das erfindungsgemäße Verfahren produzierte Pflanzen ebenfalls andere rekombinante Konstrukte enthalten, zum Beispiel Konstrukte mit anderen Wirkungen auf die Fruchtreifung. Zum Beispiel können Früchte mit erfindungsgemäß verstärkter Farbe ebenfalls Konstrukte zur Inhibierung der Produktion von Enzymen wie etwa Polygalacturonase und Pektinesterase oder mit der Ethylenproduktion interferierende Enzyme enthalten. Früchte, welche beide Arten von rekombinanten Konstrukten enthalten, können entweder durch aufeinander folgende Transformation oder durch Kreuzung von zwei Varietäten, die jeweils ein Konstrukt enthalten, und Selektion innerhalb der Nachkommenschaft auf jene die beide enthalten, erzeugt werden.
Die Erfindung wird nun mit Bezug auf die Zeichnungen nur beispielhaft erläutert, in welchen:
Die Fig. 1 ein Diagramm der vorgeschlagenen Reaktion und des Mechanismus für die Biosynthese von Capsanthin und Capsorubin ist; [Umwandlung von Antheraxanthin und Violaxanthin in Capsanthin und Capsorubin; die Reaktion erfolgt während eines kationischen Angriffs und das resultierende Carbokation wird durch Ausstoß eines Protons stabilisiert];
Die Fig. 2 eine graphische Darstellung der HPLC- Analyse der Umwandlung von Antheraxanthin in Capsanthin durch achlorophylle Chromoplastenmembranen ist; [Das HPLC-Profil der achlorophyllen Membranpigmente erhalten nach Inkubation und Zugabe von unmarkierter Trägersubstanz Antheraxanthin und Capsanthin, gefolgt durch die Verteilung von eingebauter Radioaktivität unter Verwendung von (b) gekochten, gereinigten Membranen (25 ug) und (c) ungekochten isolierten Membranen (25 ug), getrennt inkubiert mit (¹&sup4;C) Antheraxanthin wie in Beispiel 1 angegeben. Nach einer h bei 28ºC wurde der Lipidextrakt einer HPLC-Analyse unterzogen. Die Position der verschiedenen Xanthophylle ist angegeben: (1) Neoxanthin; (2) Capsorubin; (3) Violaxanthin; (4) Capsanthin; (5) Antheraxanthin].
Die Fig. 3 zeigt die Nucleotide und die abgeleitete Aminosäuresequenz von C. annuum Capsanthin-Capsorubin- cDNA; [Eine mögliche die NucTeotid-Bindungsstelle (G*G**G***A******G) ist unterstrichen. Die Nummerierung ist am rechten Rand für die Aminosäuren und oberhalb für die Nucleotidsequenz angegeben].

Hintergrund der Erfindung

Um die molekularen Eigenschaften der einzelnen carotinogenen Enzyme zu untersuchen, haben wir Chromoplasten von Capsicum annuum als ein biologisches Modell verwendet (Camara and Moneger, 1982; Camara et al., 1989). Dieses System erlaubte die Charakterisierung und Klonierung von Geranylgeranylpyrophosphatsynthase (GGPPS) (Dogbo und Camara, 1987; Kuntz et al., 1992), Phytoensynthase (Dogbo et al., 1988; Römer et al., 1993) und Phytoen-Phytofluendesaturase (Hugueney et al., 1992). Über die letzten Schritte des pflanzlichen carotinogenen Stoffwechselweges, welcher die Synthese von Xanthophyllen beinhaltet, ist wenig bekannt. Verschiedene Hinweise (Cholnoky et al., 1955; Cholnoky et al. 1955; Davies et al., 19700; Neamtu und Bodea, 1969; Neamtu et al., 1969; Valadon und Mummery, 1977) schlugen vor, dass Epoxyxanthophylle an der enzymatischen Zwischenumwandlung von Carotinoiden beteiligte reaktive Intermediate (Costes et al., 1979; Camara, 1980a, b; Camara und Moneger, 1981) als Teil des Xanthophyll-Zyklus sind (Yamamoto, 1979; Yamamoto und Higashi, 1978) und selbst bei der Bildung von Abskisinsäure und verwandten Derivaten beteiligt sind (Rock und Zeevart, 1991; Li und Walton, 1990). Jedoch ist nichts über die Enzymologie der Xanthophyll-Biogenese bekannt.
In früheren Studien (Camara, 1980a, b; Camara und Moneger, 1980; Camara und Moneger, 1981) haben wir gezeigt, dass die ubiquitären 5,6-Epoxyxanthophylle Antheraxanthin und Violaxanthin die direkten Vorläufer von Capsanthin bzw. Capsorubin sind, gemäß dem in Fig. 1 dargestellten Schema. Die Eigenschaften dieser Ketoxanthophyllsynthasen sind weitestgehend unbekannt. Die weitere Entwicklung eines verfeinerten in vitro- Systems, d. h. Vermittlung dieser Aktivität, würde ein kritischer Schritt in Richtung der Definition der molekularen Eigenschaften dieser Enzyme der Xanthophyll- Biosynthese sein, und die Möglichkeit der Modifikation der späteren Schritte der pflanzlichen Carotinogenese anbieten. In Beispiel 1 beschreiben wir die Eigenschaften eines derartigen Systems, welches die Reinigung des monomeren und multifunktionellen Enzyms der Xanthophyll- Biosynthese Capsanthin-Capsorubin-Synthase (CCS) und die Klonierung seiner cDNA unter Verwendung von gegen dieses Enzym gerichteten Antikörpern erlaubte. Wir zeigen, dass das CCS-Gen spezifisch während der Differenzierung von Chloroplasten zu Chromoplasten reguliert wird.

BEISPIEL 1

Subplastidale Kompartimentierung der Capsanthin- Capsorubin-Synthase

In einem Endstadion der Differenzierung bestehen die Chromoplasten von C. annuum aus zwei dauerhaften Bestandteilen, der löslichen Fraktion (Stroma) und der Membranfraktion. Die letztere umfasst die Plastidhülle als auch eine Anzahl von neuen Membranen, einschließlich der achlorophyllen inneren Membranen und Fibrillen, welche beide nicht in Chloroplasten vorhanden sind (Spurr und Harris, 1968; Camara und Brangeon, 1981). Wir haben früher gezeigt, dass Isopentenylpyrophosphat zu Phytoen durch Stromalenzyme umgewandelt wird, während die letzteren Schritte, welche die Phytoendesaturierung, -zyklisierung und -oxidation umfassen, durch die membrangebundenen Enzyme katalysiert werden (Camara et al., 1982; Camara et al., 1985). Da die Plastidhüllenmembran in allen Arten von Plastiden vorhanden ist, während die inneren achlorophyllen Membranen und die Fibrillen spezifisch und verstärkt während der Differenzierung von Chloroplasten zu Chromoplasten gebildet werden, vermuteten wir, dass die an der aktiven Biogenese von Capsanthin und Capsorubin beteiligten Ketoxanthophyllsynthasen höchstwahrscheinlich mit den inneren achlorophyllen Membranen und/oder den Fibrillen assoziiert sind, welche als der Hauptort der Carotinoidanhäufung in Chromoplasten von C. annuum gezeigt wurden (Deruere et al., 1994). Daher haben wir uns entschieden, ein Verfahren für die Reinigung dieser zwei Chromoplast-Unterfraktionen, wie unter "experimentelle Verfahren" beschrieben, zu entwickeln. Elektronenmikroskopische Analysen zeigten klar an, dass diese gereinigten Fibrillen und Membranfraktionen vernachlässigenswerte Kreuzkontaminationen zeigten. Vorher haben wir gezeigt, dass 95% der Chromoplastcarotinoide in den Fibrillen kompartimentiert sind (Deruere et al., 1994). Die HPLC-Analyse der gereinigten achlorophyllen Membranen ergab, dass qualitativ deren Hauptcarotinoide Capsanthin und Capsorubin sind, während Epoxyxanthophylle Nebenbestandteile sind.
Um deren mögliche Ketoxanthophyllsynthase-Aktivität zu untersuchen, wurden beide Fraktionen mit markierten Antheraxanthin inkubiert. Die in Fig. 2 dargestellten Daten zeigen an, dass diese enzymatische Aktivität mit der gereinigten Membranfraktion assoziiert ist. Nur eine vernachlässigenswerte Aktivität (weniger als 2%) war in den Fibrillen vorhanden. Wir waren nicht in der Lage, diese intraplastidalen Membranen von den Plastidhüllmembranen zu trennen, um deren mögliche Aktivität einzuschätzen. Jedoch waren gemäß Douce und Joyard (1979) aus Fruchtchloroplasten präparierte Plastidhüllmembran oder Thylakoidmembranen nicht in der Lage, diese enzymatische Umwandlung durchzuführen (Ergebnisse nicht gezeigt).

Reinigung und Merkmale der Capsanthin-Capsorubin-Synthase

Im Vergleich mit den gesamten Plastidmembranen hatten die gereinigten Membranfraktionen ein weniger komplexes Proteinmuster. Basierend auf diesen Daten wählten wir die Chroinoplastenmembranfraktion als das Ausgangsmaterial für die Reinigung der Ketoxanthophyllsynthasen aus. Vorbereitende Experimente wurden durchgeführt, um die Ketoxanthophyllsynthasen aus C. annuum-Membranen zu lösen. Die Behandlung der Membranen mit 1% Triton X-100 oder 1% Octylglucosid löste einfach 90% der anfänglich in der Membranfraktion vorhandenen Ketoxanthophyllsynthase. Aufgrund seiner höheren kritischen Micellenkonzentration, wählten wir Octylglucosid für die nachfolgenden Reinigungsschritte aus.
Weitere Analysen der gereinigten Fraktion unter Nutzung der SDS-PAGE zeigte eine Bande mit einer ungefähren Molekülmasse von 50 kDa. Ebenfalls wurde nach einer zusätzlichen Chromatographie auf einer geeichten Sephacryl S-200-Säule eine native Molekülmasse von 60 kDa bestimmt. Daher schlossen wir, dass das aktive Enzym höchstwahrscheinlich ein Monomer ist. Die verschiedenen Reinigungsschritte sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
Das gereinigte Enzym zeigte eine blassgelbe Farbe und ergab eine intensive Fluoreszenz, die darauf hinwies, dass es ein Flavoprotein sein könnte. Jedoch waren weitere spektrale Analysen und Versuche zur Entfernung der prosthetischen Gruppe durch sauren pH unklar. Weitere Analysen sind erforderlich, um die Art der prosthetischen Gruppe zu bestimmen.
Es wurde vorher gezeigt, dass die zwei 5,6- Epoxyxanthophylle Antheraxanthin und Violaxanthin die Vorläufer von Capsanthin bzw. Capsorubin sind (Camara, 1980a, b; Camara und Moneger; 1980; Camara und Moneger, 1981). Daher verblieb eine wichtige Frage: Katalysiert das gleiche Enzym die Bildung beider Ketoxanthophylle? Um diese Frage zu lösen wurde das gereinigte Enzym mit (¹&sup4;C) Violaxanthin unter verschiedenen experimentellen Bedingungen, wie in Tabelle 2 angegeben, inkubiert. Die erhaltenen Daten zeigen an, dass die gereinigte Ketoxanthophyllsynthase in der Tat die Umwandlung von Violaxanthin in Capsorubin katalysiert. Parallele Untersuchungen mit dem Ziele der Identifizierung eines zusätzlichen, immunologisch von dieser Ketoxanthophyllsynthase unterschiedlichen Enzyms, welche nur die Umwandlung von Violaxanthin in Capsorubin katalysiert, schlugen fehl. Auf der Basis dieses Befundes schlugen wir den Namen Capsanthin-Capsorubin-Synthase (CCS) für diese Ketoxanthophyllsynthase vor, welche wie andere bisher von C. annuum charakterisierte carotinogene Enzyme, d. h. GGPPS (Dogbo und Camara, 1987), Phytoensynthase (Dogbo et al., 1988) und Phytoendesaturase (Hugueney et al., 1992) ein multifunktionelles Protein ist. Man könnte vermuten, dass diese Art der molekularen Organisation vermutlich in einer besseren Kanalisierung der Substrate resultiert, welche sich, ausgehend von den Prenylpyrophosphaten, vermutlich von einem Block der modifizierenden Enzyme zu einem anderen bis zum letzten Schritt des Stoffwechselweges bewegen.

Tmxnunologische Merkmale der Capsanthin-Capsorubin- Synthase

Gegen CCS gerichtete Antikörper zeigten ein einziges Polypeptid mit 50 koa, spezifisch lokalisiert in der Chromoplastenmembranfraktion. Kein Signal wurde bei Chloroplastenthylakoidmembranen oder Chloroplastenhüllmembranen erhalten. Nur vernachlässigenswerte Signale waren in Fibrillen zu beobachten.
Ein gelöster Plastidextrakt wurde mit Präimmun- oder Anti-CCS-Serum behandelt und die Immunkomplexe mit Protein-A-Sepharose, gemäß einem vorher beschriebenen Verfahren (Dogbo et al., 1987), präzipitiert. Die enzymatische Aktivität des flüssigen Überstandes wurde bestimmt. Nur Anti-CCS-Antikörper ergäben eine konzentrationsabhängige Inhibition (Ergebnisse nicht gezeigt), also ein zusätzliches Kriterium für die Spezifität. Schließlich ergab eine immunocytochemische Analyse, dass das CCS ausschließlich in dem Plastid kompartimentiert ist. Von diesen Daten wurde geschlossen, dass das Serum für Entwicklungsstudien und für ein Screening einer Pfefferfrucht cDNA-Bibliothek ausreichend spezifisch ist.

Isolierung einer Capsanthin-Capsorubin-Synthase cDNA

Das Immunoscreening einer C. annuum-cDNA-Bibliothek erlaubte die Isolierung von zwei positiven Klonen mit etwa 300 bzw. 1700 bp. Die Subklonierung und Sequenzierung dieser cDNAs ergab, dass die cDNA mit 300 bp ein Fragment der cDNA mit 1700 bp ist, und dass die gemeinsamen Sequenzen vollständig identisch sind. Die größere cDNA besaß einen offenen Leserahmen von 498 Godons (Fig. 3). Die Tatsache, dass dieser offene Leserahmen von einem Stopcodon im gleichen Leserahmen gefolgt wird, deutet an, dass diese cDNA die gesamte codierende Sequenz enthält.
Die abgeleitete Aminosäuresequenz entspricht einem Protein mit 57 kDa. Wie für ein Plastidzielprotein erwartet, weist der NH&sub2;-Terminus dieses Proteins ein typisches Transitpeptid auf, welches vermutlich vor der an sauren Aminosäuren reichen Region endet, welche bei Position 56 beginnt. Die Abspaltung dieses Transitpeptids ein paar Aminosäuren vor dieser Position, würde ein reifes Protein von etwa 50 kDa zurücklassen, in guter Übereinstimmung mit der durch SDS-PAGE bestimmten Größe der gereinigten CCS.
Eine Suche durch die Sequenzdatenbanken ergab keine signifikante Sequenzähnlichkeit zwischen der abgeleiteten CCS-Sequenz und anderen bekannten Sequenzen, außer für ein 17 Aminosäuremotiv nahe des NH&sub2;-Terminus des reifen Proteins, welches einer typischen Dinucleotidbindungsstelle ähnelt (Carothers et al., 1989). Ein derartiges Motiv wurde ebenfalls durch verschiedene Autoren in dem NH&sub2;-terminalen Abschnitt von pflanzlichen und bakteriellen Phytoendesaturasen beobachtet (Bartley et al., 1991; Hugueney et al., 1992; Misawa et al., 1990; Pecker et al., 1992). Weitere Untersuchungen der CCS-Sequenz ergab verschiedene kurze Motive, welche ebenfalls in bakteriellen Lycopencyclasen vorhanden sind (nicht gezeigt), zusätzlich zu dem Motiv FLYAXXPXXXXXXXLXE, welches in einer bakteriellen Zeaxanthinsynthase vorhanden ist (Misawa et al., 1990). Das letztere Motiv könnte aufgrund der Tatsache vorhanden sein, dass Zeaxanthinsynthase wie Capsanthin-Capsorubin- Synthase auf einen β-Cycloexenylring wirkt (Camara, 1980a).

Capsanthin-Capsorubin-Synthase wird spezifisch während der Chromoplastendifferenzierung synthetisiert

Western-Blot-Analysen während der Entwicklung von C. annuum zeigten, dass die Synthese von CCS-Synthase spezifisch und stark während der Chromoplastendifferenzierung induziert wird. Zusätzlich ergab eine RNA-Gelblotanalyse, unter Verwendung der CCScDNA als Sonde, dass das entsprechende Gen nicht in Blättern und grünen Früchten von C. annuum, sondern nur in reifen Früchten exprimiert wird. Während der Reifung scheint das Expressionsmuster des CCS-Gens ähnlich zu dem des GGPPS-Gens zu sein, nämlich eine starke Induktion im frühen Reifungsstadium, welche bis zum reifen Stadium erhalten wird. Um diese Beobachtung zu bestätigen, wurden verschiedene RNA-Proben (Kuntz et al., 1992), unabhängig geerntet von Früchten einer anderen Pflanze (bei einem grünen Reifungsstadium, einem Zwischenreifungsstadium und einem voll reifen Stadium) verwendet. Wieder wurde hier für sowohl das CCS als auch das GGPPS-Gen das gleiche Expressionsmuster gefunden (Daten nicht gezeigt), nämlich eine starke während der Reifung erhaltene Induktion und einem Abfall im stabilen Zustand des RNA-Niveaus in der völlig reifen Frucht. Diese Beobachtungen deuten an, dass diese Gene während der Fruchtreifung in C. annuum koexprimiert werden, obwohl das GGPPS-Gen, anders als das CCS-Gen, in geringem Maße in allen carotinogenen Geweben exprimiert wird (Kuntz et al., 1992).

Auftreten von Capsanthin-Capsorubin-Synthase in Fruchtfarbemutanten

Um die vorher erwähnten Daten zu erweitern, verwendeten wir verschiedene Fruchtfarbenmutanten von C. annuum. Insbesondere war es von Interesse zu sehen, ob CCS in den gelben Zuchtsorten Jaune de Pignerolle oder Golden Summer vorhanden ist, in welchen das Perikarp im abschließenden Reifungsstadium von grün zu gelb wechselt, in der Zuchtsorte Sweet Chocolate, in welcher das Perikarp während des Abschlussstadiums der Reifung braun wird, in der Zuchtsorte Alma, in welcher die rote Farbe die Differenzierung eines Proplastids in einen Chromoplasten umfasst, und in der Zuchtsorte Permagreen, welche im Schlussstadium der Reifung grün bleibt. Auf dem Weg zu diesem Ziel, haben wir zunächst den Xanthophyll- Gehalt durch HPLC analysiert. Die erhaltenen Chromatogramme zeigen die Abwesenheit von Capsanthin und Capsorubin in den grünen und gelben Fruchtmutanten an. Ähnliche Ergebnisse wurden für die Zuchtsorte Permagreen beim vollen Reifungsstadium erhalten. Im Gegensatz dazu, sind diese Ketoxanthophylle in den Schlussstadien der Reifung in der Mutante Sweet Chocolate und in den roten Früchten vorhanden.
Zusätzliche immunologische Analysen der grünen Früchte und der gelben Mutanten ergaben, dass CCS vollständig abwesend ist. Im Gegensatz dazu wird CCS in der Sweet Chocolate-Mutante und in allen roten reifen Früchten aktiv synthetisiert. Aus diesen Daten schlossen wir, dass die gelben Fruchtmutanten und die Zuchtsorte Permagreen spezifisch in der CCS beeinträchtigt sind.
RNA-Proben von reifen Früchten von verschiedenen C. annuum-Varietäten wurden ebenfalls auf die Anwesenheit des CCS-Transkripts untersucht. Wie in Fig. 10b und d gezeigt, konnte eine Expression des CCS-Gens in den Zuchtsorten mit gelber Frucht Jaune de Pignerolle und Golden Summer nicht nachgewiesen werden (selbst nach Überexposition der Autoradiographien). Im Gegensatz dazu wurde gefunden, dass das GGPPS-Gen in beiden Zuchtsotren exprimiert wird. Diese Daten sind in Übereinstimmung mit der Abwesenheit des CCS-Proteins in diesen Zuchtsorten.
Die dargestellten Daten zeigen an, dass CCS ein Chromoplasten-spezifisches Protein ist. Wir haben vorher einweiteres Chromoplasten-spezifisches Protein charakterisiert, das wir als Fibrillin bezeichneten und welches ein mit Chromoplasten-Fibrillen assoziiertes Hauptprotein ist (Deruere et al., 1994). In den Chromoplasten der fibrillären Sorte (zum Beispiel in C. annuum-Früchten oder Palisota barteri-Früchten, Knoth et al., 1986), sind Fibrillen Lipoproteinstrukt uren, in denen die meisten Carotinoide gespeichert sind. Im Gegensatz dazu wird CCS in verschiedenen Chromoplasten- Subkompartimenten gefunden, nämlich in Membranstrukturen und am häufigsten in den inneren achlorophyllen Membranen. Diese Beobachtungen deuten an, dass einmal synthetisierte Carotinoide in ihre Lagerstelle (Fibrillen) entladen werden. Ob an diesem Phänomen zusätzliche Proteine beteiligt sind, steht zur Debatte. Eine weitere Analyse der abgeleiteten Peptidsequenz von CCS ergab, dass die Sequenz EEKCVIT ähnlich zu der Neurofilamentconsensussequenz EEKVVVTK ist, welche wahrscheinlich in verschiedenen zellulären Interaktionen beteiligt ist (Hisanaga und Hirokawa, 1988; Shaw, 1992). Daher kann man annehmen, dass diese Domäne bei der Verbindung des Netzwerks der achlorophyllen Membranen hilft, angezeigt durch Silberproteinatnachfärbung, und/oder eine direkte Interaktion zwischen CCS und Fibrilliri vermitteln. Diese Daten erinnern an vorherige Ergebnisse zur Cholinesterase, und deuten an, dass ein Enzym eine strukturelle Rolle zusätzlich zu seiner katalytischen Aktivität haben kann (Krejci et al., 1991).
Chromoplasten-spezifische Proteine wurden ebenfalls durch andere Autoren beobachtet (Winkenbach et al., 1976; Hadjeb et al., 1988; Smirra et al., 1993). Eines von diesen, bezeichnet ChrA, hat eine Molekülmasse von 58 kDa und ist ein Carotinoid bindendes Protein (Cervantes- Cervantes et al., 1990). Wenn jedoch die komplette CCS- Aminosäuresequenz mit der teilweisen, von der veröffentlichten Sequenz des ChrA-Gens abgeleiteten Aminosäuresequenz (Oren-Shamir et al., 1993) verglichen wird, wurde die höchste Homologle nur über einen durchgängigen Bereich von 10 Aminosäuren erhalten. Ferner wurde keine signifikante Sequenzähnlichkeit zwischen der CCS-cDNA und dem ChrA-Gen festgestellt, was es unwahrscheinlich macht, dass CCS durch das veröffentlichte ChrA-Gen codiert wird. Es sollte ebenfalls erwähnt werden, dass kein dem ChrA entsprechendes Transkript in roten C. annuum-Früchten nachgewiesen werden konnte (Oren-Shamir et al., 1993).

Schlussfolgerung

Ein pflanzliches Enzym der Xanthophyll-Biosynthese wurde isoliert, welches die zwei späten Schritte des carotinogenen Stoffwechselweges katalysiert, nämlich die Synthese von Capsanthin und Capsorubin, und seine cDNA wurde kloniert. Nach unserem Wissen wurde vorher weder ein Enzym der Xanthophyll-Biosynthese detailliert beschrieben, noch seine cDNA kloniert. Die hier berichteten Daten stellen ein Werkzeug für die molekulare Analyse der Rolle von 5,6-Epoxyxanthophyllen zur Verfügung.
Genetische Studien (Atkins und Sherrard, 1915; Hurtado-Hernandez und Smith, 1985) haben vorher die rote Farbe von C. annuum-Früchten dem y-Ort zugeordnet. Die genetische Charakterisierung dieses Ortes ist zur Zeit am Fortschreiten, um zu bestimmen, ob y für CCS codiert oder pleiotrop zu dem CCS-Gen ist.

Experimentelle Verfahren

Substratherstellung

(¹&sup4;C) Antheraxanthin und (¹&sup4;C) Violaxanthin wurden unter Verwendung von Capsicum annuum Perikarpscheiben der gelben Zuchsorte Jaune de Pignerolle, inkubiert über Nacht mit (2-¹&sup4;C) Kalium-Mevalonat (60 mCi/mmol, Amersham, Frankreich) gemäß einem vorher beschriebenen Verfahren (Camara, 1980a) hergestellt.

Pflanzenmaterial

Paprikapflanzen (Capsicum annuum cv. Yolo Wonder) wurden unter kontrollierten Gewächshausbedingungen bis zur Fruchtreifung, wie durch die rote Farbe angezeigt, wachsen gelassen. Verschiedene andere Fruchtfarbenmutanten wurden ebenfalls unter den gleichen Bedingungen wachsen gelassen. Dies schließt die Zuchtsorte Sweet Chocolate ein, welche sich in eine Schokoladenfarbe aufgrund der Anwesenheit eines Chlorophyll zurückhaltenden Genes färbt, die Zuchtsorte Alma, in welcher die rote Farbe die Differenzierung des Proplastids zum Chromoplasten umfasst, gelbe Zuchtsotren, in welchen die grüne Frucht in ein tiefes gelb (cv. Jaune de Pignerolle) oder helles gelb (cv. Golden Summer) ändert und die Zuchtsorte Permagreen, welche zum Schlussstadium der Reifung grün verbleibt.

Plastidsubfräktionierung und Enzympräparation

C. annuum Chromoplasten, präpariert aus 1 kg roter Früchte gemäß eines vorher beschriebenen Verfahrens (Camara, 1993) wurden osmotisch durch direkte Resuspension in 100 ml eines 50 mM Tris-HCl-Puffers pH 7,6 mit 1 mM DTT lysiert, gefolgt durch Homogenisierung unter Verwendung eines Potter-Homogenisators. Zwanzig ml des resultierenden Homogenats wurden auf einen diskontinuierlichen Saccharosegradienten geschichtet (identische Volumen von 0,5 und 0,9 M Saccharose) in dem gleichen Puffer ergänzt mit 1 mM EDTA. Nach einer Stunde Zentrifugation mit 70000 g bei 4ºC unter Verwendung eines SW27-Rotors (Beckman), wurde die gesamte Fraktion oberhalb der 0,9 M-Schicht wieder gewonnen und auf einen 0 bis 1 M-linearen Saccharosegradienten im gleichen Puffer geladen und in einem SW27-Rotor zentrifugiert. Nach Zentrifugation mit 70000 g für 12 h bei 4ºC bildeten die Chromoplastenfibrillen bei einer Dichte von 1,07 g/ml eine Bande, während die gereinigte Membranfraktion bei einer Dichte entsprechend zu 1,10 g/ml wieder gefunden wurde. Der typische Gehalt an gereinigten Membranen schwankte von 400 bis 500 ug pro kg des Fruchtperikarps. Zu 2,8 mg der gereinigten Chromoplastenmembran, hergestellt wie vorher beschrieben und in 5 ml 50 mM Tris-HCl pH 8 (Puffer A) resuspendiert, wurde ein gleiches Volumen von 2% Triton X-100 oder 2% Octylglucosid gelöst im gleichen Puffer hinzugegeben, um die membrangebundenen Enzyme zu lösen. Die Mischung wurde bei 5ºC für 30 min vor der Zentrifugation bei 100 000 g für eine Stunde gerührt. Der Überstand enthielt das gelöste Enzym und wurde für die weitere Verwendung gewonnen.

Enzymatischer Assay

Die Assay-Mischung enthielt in einem Gesamtvolumen von 0,25 ml: eine definierte Menge des Enzymextrakts (¹&sup4;C) Antheraxanthin oder (¹&sup4;C) Violaxanthin (100 000 cpm pro umole) gelöst in 10 ul Ethanol, 250 ug Stromalextrakt (Hugueney et al., 1992), 0,2 mM NADP&spplus;, 0,2 mM NADPH, 1 mM ATP, gepuffert mit 50 mM Tris HCl pH 7,6. Nach Inkubation bei 28ºC für 30 min., wurden unmarkierte Xanthophyll- Standards vor Extraktion und Analyse der Reaktionsprodukte durch HPLC (Camara, 1985) und Bestimmung der eingebauten Radioaktivität durch Flüssigscintillation hinzugegeben.

Enzymreinigung

Q-Sepharosechromatographie: Das wie vorher beschrieben erhaltene Solubilisat wurde absatzweise auf Q-Sepharose (Pharmacia) adsorbiert, mit Puffer A, welcher 0,5% Octylglucosid enthält equilibriert(Puffer B). Nach Waschen mit Puffer B mit 25 mM NaCl, wurden die aktiven Fraktionen mit Puffer B mit 0,3 M NaCl im Hauptteil eluiert. Nach zehnfacher Verdünnung wurden die aktiven Fraktionen dann auf eine Q-Sepharose-Säule (2 · 20 cm), equilibriert mit Puffer B mit 50 mM NaCl, adsorbiert. Die aktiven Fraktionen wurden dann mit einem linearen Salzgradienten (0 bis 0,3 M NaCl) in Puffer B eluiert. Fünf ml Fraktionen wurden für die Bestimmung der enzymatischen Aktivität und des Proteingehalts unter Verwendung des Farbstoffbindungsverfahrens (Bio-Rad Protein Assay Kit) gesammelt.
Affigel 501-Chromatographie: Die vereinten aktiven Fraktionen von der Q-Sepharose-Säule wurden auf eine Affigel 501 Säule (1 · 10 cm, Bio-Rad), welche vorher mit Puffer B equilibriert wurde, geladen. Die Durchfluss- Fraktionen wurden verworfen und nach dem Waschen der Säule mit zehn Volumia des Puffers B, wurden die aktiven Fraktionen in Hauptteil durch Zugabe von 10 mM DTT in Puffer B eluiert.
Mono P-Chromatographie: Die aktiven Fraktionen von der Affigel 501 Säule wurden auf eine Mono P-Säule (HR 5/20, Pharmacia) equilibriert mit Puffer A, gegeben. Die aktiven Fraktionen wurden mit 12,5% Polypuffer 96 (pH 5) eluiert. Es wurden Fraktionen von 1 ml für den enzymatischen Assay und die Proteinbestimmung gesammelt.
Gel-Filtration: Die aktiven Fraktionen nach den chromatofokussierenden Schritten wurden durch Ultrafiltration konzentriert und auf eine Sephacryl S- 200-Säule (1,5 · 90 cm, Pharmacia), welche vorher mit Puffer B mit 0,1 M NaCl equilibriert wurde, gegeben. Für den enzymatischen Assay und die Proteinbestimmung wurden Fraktionen von 2,5 ml gesammelt. Die gleiche Säule wurde für die Molekülmassenbestimmung unter Verwendung verschiedener geeichter Molekülmassenstandards verwendet.

Immunoscreening, RNA- und DNA-Verfahren

Die Konstruktion einer λgt11 cDNA-Bibliothek von aus einer C. annuum-Frucht isolierten RNA zu einem frühen Reifungsstadium wurde vorher beschrieben (Kuntz et al., 1992). Vorher beschriebene Verfahren wurden zum Screening und bei der Arbeit mit RNA und DNA verwendet (siehe Kuntz et al., 1992). Die Hybridisierung erfolgte unter Verwendung von Standardverfahren bei 65ºC in 2xSSC. Die Membranen wurden dann bei 65ºC in 0,5 · SSC gewaschen.

Mikroskopie und Immunhistochemie

Perikarpgewebe oder Plastidsubfraktionen wurden wie vorher beschrieben behandelt (Camara, 1993; Deruere et al., 1994).

Analytische Verfahren

Der Lipidextrakt wurde verseift und die nach der Filtration durch eine Silicakartusche erhaltene Xanthophyll-Fraktion wurde für die HPLC verwendet. Die Pigmente wurden, wie vorher beschrieben (Camara, 1985), unter Verwendung von Methanol/Aceton/Wasser (90 : 17 : 3) isokratisch eluiert. Die Radioaktivität Wurde durch Flüssigscintillationszählung bestimmt.
Die SDS-PAGE und das Immunoblotten wurde wie vorher beschrieben gemäß Standardverfahren unter Verwendung von gegen das gereinigte Enzym gerichteter Antikörper durchgeführt (Kuntz et al., 1992). Die Proteinbestimmung erfolgte unter Verwendung eines Bio-Rad Protein Assay Kit. Tabelle 1 Reinigung von Ketoxanthophyllsynthase von C. annuum-Chromoplastenmembranen Tabelle 2 Enzymatische Umwandlung von Violaxanthin in Capsorubin
Gereinigte Chromoplastenmembranen (25 ug) wurden mit der angegebenen Menge von (¹&sup4;C) Violaxanthin wie unter experimentelle Verfahren angegeben, vor der Analyse der in Capsorubin eingebauten Radioaktivität inkubiert. Eine gekochte Membranpräparation wurde als eine Kontrolle verwendet.
Die CCS-cDNA oder ein verwandtes DNA-Fragment, wie in der vorliegenden Erfindung definiert, kann als eine molekulare Markierung verwendet werden, um Pflanzenzüchtungsprogramme zu erleichtern. Zum Beispiel kann die Isolation von genomischer DNA von während Pflanzenzüchtungsprogrammen produzierter Sämlinge (nach sexueller oder somatischer Kreuzung zwischen der gleichen Art oder verschiedenen Arten) und molekularer Hybridisierung der CCS-cDNA (oder eines verwandten DNA- Fragments) mit dieser genomischen DNA, die Sämlinge identifizieren, welche das CCS-Gen besitzen. Dies erlaubt die Vorhersage des Phänotyps dieser Pflanzen (bezüglich der Fruchtfarbe), ohne auf die Fruchtbildung und Reifung zu warten.

BEISPIEL 2

Konstruktion von Antisense-RNA-Vektoren mit dem CaMV 35S- Promotor

Ein Vektor wird unter Verwendung von Sequenzen, welche zu einem Fragment der Einfügung einer CCS-cDNA korrespondiert (isoliert wie in Beispiel 1 gezeigt), konstruiert. Dieses Fragment wird durch die Polymerasekettenreaktion unter Verwendung von synthetischen Primern synthetisiert. Die Enden des Fragments werden mit T4-Polymerase glatt gemacht und in den Vektor pJRl kloniert, welcher vorher mit SmaI geschnitten wurde. pJR1 (Smith et al., 1988, Nature, 334: 724-726) ist ein auf Bin19 (Bevan, 1984, Nucleic Acids Research, 12: 8711-8721) basierender Vektor, welcher die Expression von Antisense-RNA unter Kontrolle des CaMV 35S Promotors erlaubt. Dieser Vektor enthält eine Nopalinsynthase (nos)3'-Endterminationssequenz.
Alternativ wird ein Vektor unter Verwendung eines von einer CCS-cDNA erhaltenen Restriktionsfragments konstruiert und in den Vektor GA643 (An et al., 1988, Plant Molecular Biology Manual A3: 1-19) oder pDH51 (Pietrzak et al., 1986, Nucleic Acids Research, 14: 5875-5869), welcher vorher mit einem kompatiblen Restriktionsenzym geschnitten wurde, kloniert. Ein Restriktionsfragment aus dem CCS/pDH51-Klon, welches den Promotor, das CCS-Fragment und eine andere pDH51-Sequenz enthält, wird in SLJ44026B oder SLJ44024B (Jones et al., 1990, Transgenic Research, 1) oder Bin19 (Bevan, 1984, Nucleic Acids Research, 12: 8711 bis 8721) kloniert, welche die Expression von Antisense-RNA unter Kontrolle des CaMV 35S-Promotors erlauben.
Nach der Synthese des Vektors, wird die Struktur und Orientierung der Sequenzen durch DNA-Sequenzanalyse überprüft.

BEISPIEL 3

Konstruktion eines Antisense-RNA-Vektors mit einem fruchtverstärkten Promotor

Das in Beispiel 2 beschriebene Fragment der CCS-cDNA wird ebenfalls in den Vektor pJR3 kloniert. pJR3 ist ein auf Bin19 basierender Vektor, welcher die Expression von Antisense-RNA unter der Kontrolle des Polygalcturonase (PG) Promotors der Tomate ermöglicht. Dieser Vektor enthält etwa 5 kb Promotorsequenz und 1,8 kb einer 3'- Sequenz vom PG-Promotor, getrennt durch eine Mehrfachklonierungsstelle.
Nach der Synthese werden Vektoren mit der richtigen Orientierung der CCS-Sequenz durch DNA-Sequenzanalyse identifiziert.
Alternative fruchtverstärkte Promotoren (wie etwa E8 oder 2A11) substituieren den Polygalactugonase-Promotor in pJR3, um ein alternatives Expressionsmuster zu ergeben.

BEISPIEL 4

Konstruktion eines verkürzten Sense-RNA-Vektors mit dem CaMV 35S-Promotor

Das in Beispiel 2 beschriebene Fragment der CCS-cDNA wird ebenfalls in die in Beispiel 2 beschriebenen Vektoren in der Sense-Orientierung kloniert.
Nach der Synthese werden die Vektoren mit der Sense- Orientierung der CCS-Sequenz durch DNA-Sequenzanalyse identifiziert.

BEISPIEL 5

Konstruktion von verkürzten Sense-RNA-Vektoren mit fruchtverstärkten Promotoren

Das in Beispiel 2 beschriebene Fragment der CCS-cDNA wird ebenfalls in den Vektor pJR3 in der Sense-Orientierung kloniert.
Nach der Synthese werden Vektoren mit der Sense- Orientierung der CCS-Sequenz durch DNA-Sequenzanalyse identifiziert.
Alternative fruchtverstärkte Promotoren (zum Beispiel E8 oder 2A11) substituieren den Polygalacturonasepromotor in pJR3, um alternative Expressionsmuster zu ergeben.

BELSPIEL 6

Konstruktion eines CCS-Überexpressionsvektors unter Verwendung des CaMV 35S-Promötörs

Die vollständige Sequenz einer CCS-cDNA mit einem vollständigen offenen Leserahmen wird in die in Beispiel 2 beschriebenen Vektoren eingefügt.

BEISPIEL 7

Konstruktion eines CCS-Überexpressionsvektors unter Verwendung eines fruchtverstärkten Promotors

Die vollständige Sequenz einer CCS-cDNA mit einem vollständigen offenen Leserahmen wird in pJR3 oder Alternativen mit verschiedenen Promotoren eingefügt.

BEISPIEL 8

Erzeugung transformierter Pflanzen

Die Vektoren werden in Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (einen vielfältig für Pflanzenbiotechnologen erhältlichen Mikroorganismus) transferiert und für die Transformation von Tomatenpflanzen verwendet. Die Transformation von Stängelabschnitten der Tomate folgte Standardprotokollen (z. B. Bird et al., 1988, Plant Molecular Biology, 11: 651 bis 662). Transformierte Pflanzen werden durch ihre Fähigkeit im Wachstum auf einem Medium mit dem Antibiotikum Kanamycin identifiziert. Die Pflanzen werden regeneriert und bis zur Reife wachsen gelassen. Die reifenden Früchte werden auf Modifikationen ihrer Reifungsmerkmale hin untersucht.

BEISPIEL 9

Es ist festzustellen, dass die CCS-cDNA oder Restriktionsfragmente der CCS-cDNA, oder von der CCS-cDNA abgeleitete DNA-Fragmente oder Oligonucleotide gestaltet nach der CCS-Nucleotidsequenz, oder Oligonucleotide gestaltet nach der CCS-Aminosäuresequenz für die Isolierung anderer cDNAs oder genomischer DNA-Sequenzen verwendet werden können. Diese cDNAs oder genomischen DNAs können direkt aus cDNA oder genomischen Bibliotheken unter Verwendung der vorher erwähnten DNA-Moleküle als Hybridisationssonden isoliert werden. Alternativ kann eine Kombination der vorher erwähnten Oligonucleotide verwendet werden, um DNA-Fragmente durch Polymerasekettenreaktion (PCR) zu erzeugen.
Die isolierten DNAs codieren für Enzyme oder Abschnitte von Enzymen, welche chemische Reaktionen ähnlich zu der in Fig. 1 gezeigten katalysieren. Beispiele für derartige Enzyme sind Cyclasen (wie etwa diese, welche die Synthese von α-Carotin oder β-Carotin katalysieren), Oxidasen (Einführung von Hydroxylgruppen, Ketogruppen, Aldehydgruppen, Epoxidgruppen) und Deepoxidasen.

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EMBL Data Library Accession number X76165 (capsanthin-capsorubin synthase, Capsicum annuum).

SEQUENZPROTOKOLL

(I) Allgemeine Informationen:
(1) Anmelder:
(A) Name: Centre National de la Recherche Scientifique
(B) Straße: 3, rue Michel-Ange
(C) Stadt: Paris
(E) Land: Frankreich
(F) Postleitzahl: F-75016
(ii) Titel der Erfindung: DNA-KONSTRUKTE, ZELLEN UND DAVON HERRÜHRENDE PFLANZEN
(iii) Anzahl der Sequenzen: 2
(iv) Maschinenlesbare Form:
(A) Datenträgerart: Floppy Disk
(B) Computer: IBM PC kompatibel
(C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
(D) Software: Patentln Release #1,0, Version #1,25 (EPA)
(V) Daten der vorliegenden Anmeldung:
Anmeldungsnummer: EP 94400626.1
(2) Angaben zur SEQ ID NO: 1:
(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 1756 Basenpaare
(B) Art: Nucleinsäure
(C) Strängigkeit: doppel
(D) Topologie: linear
(ii) Molekülart: cDNA zu mRNA
(ix) Merkmal:
(A) Name/Schlüssel: CDS
(B) Ort: 67..1560
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 1:
(2) Angaben zur SEQ ID NO: 2:
(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 498 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Molekülart: Protein
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 2:

Claims

1. DNA-Sequenz enthaltend:

- die in Fig. 3 dargestellte Nucleotidsequenz, welche für eine Messenger-RNA (mRNA) codiert, wobei diese mRNA für ein als Capsanthin-Capsorubin-Synthase (CCS) bezeichnetes Enzym des Xanthophyllmetabolismus codiert.

- jede Nucleotidsequenz, welche von der vorher erwähnten, in Fig. 3 dargestellten Sequenz abgeleitet ist, insbesondere durch Mutation und/oder Hinzufügen und/oder Austausch von einem oder mehreren Nucleotiden, wobei diese abgeleitete Sequenz für eine mRNA codiert, die für ein in Fig. 3 dargestelltes Enzym oder ein von diesem Enzym abgeleitetes Protein codiert, und welches in Pflanzen die enzymatische Aktivität des Enzyms des Xanthophyllmetabolismus der Fig. 3 aufweist.

2. DNA-Sequenz, welche die zu der in Fig. 3 dargestellte komplementäre Nucleotidsequenz enthält, und wie in Anspruch 1 definiert ist, wobei diese komplementäre Sequenz für eine Antisense-mRNA codiert, die mit einer mRNA nach Anspruch 1 hybridisieren kann.

3. mRNA, kodiert durch eine DNA-Sequenz nach Anspruch 1, und insbesondere durch die in Fig. 3 dargestellte DNA-Sequenz kodiert, wobei diese mRNA für ein in Fig. 3 dargestelltes Enzym des Xanthophyllmetabolismus oder ein von diesem Enzym abgeleitetes Protein codiert, und welches die enzymatische Aktivität dieses Enzyms in Pflanzen aufweist.

4. Antisense-mRNA, welche Nucleotide umfasst, welche komplementär zu den Nucleotiden sind, welche eine mRNA nach Anspruch 3 bilden und mit dieser mRNA hybridisieren können, welche durch die in Fig. 3 dargestellte DNA-Sequenz codiert wird, und wobei diese mRNA für das in Fig. 3 dargestellte Enzym des Xanthophyllmetabolismus bzw. ein von diesem Enzym abgeleitetes Protein codiert, und welches die enzymatische Aktivität dieses Enzyms in Pflanzen aufweist.

5. Gereinigte CCS, isoliert aus Zellen von Capsicum annuum und wie in Fig. 3 dargestellt, oder jedes von dieser CCS abgeleitete Protein, insbesondere durch Hinzufügen und/oder Suppression und/oder Austausch von einer oder mehrerer Aminosäuren, wobei dieses Protein die enzymatische Aktivität von CCS aufweist, oder jedes Fragment von der CCS oder der abgeleiteten Sequenzen, wobei diese Fragmente und abgeleiteten Sequenzen die enzymatische Aktivität von CCS aufweisen.

6. Komplex, gebildet zwischen einer Antisense- mRNA nach Anspruch 4 und einer mRNA nach Anspruch 1, welche für eine CCS in Pflanzen codiert.

7. Rekombinante DNA, dadurch gekennzeichnet,

- dass sie eine DNA-Sequenz nach Anspruch 1 umfasst, wobei diese Sequenz nach Anspruch 1 in eine heterologe Sequenz eingefügt wird und für eine CCS codierende mRNA codiert, oder

- dass sie eine DNA-Sequenz umfasst, welche komplementär zu einer DNA-Sequenz nach Anspruch 1 ist,

wobei diese komplementäre DNA für eine Antisense-mRNA codieren kann, welche mit der für eine CCS in Pflanzen codierende mRNA hybridisieren kann.

8. Rekombinante DNA nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie Elemente umfasst, die notwendig für die Steuerung der Expression der Nucleotidsequenz nach Anspruch 1 oder ihrer komplementären Sequenz nach Ansprüch 2 sind, insbesondere ein Promotor und ein Terminator der Transkription dieser Sequenzen.

9. Rekombinanter Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er eine rekombinante DNA nach Anspruch 6 oder 7 umfasst, integriert in einen der Orte seines Genoms, welche für seine Replikation nicht wesentlich sind.

10. Verfahren zur Modifikation der Carotinoidproduktion in Pflanzen, bezogen auf den normalen Gehalt an durch die Pflanzen produziertem Carotinoid, entweder durch Steigerung der Carotinoidproduktion, oder durch Senken oder Inhibition der Carotinoidproduktion der Pflanzen, wobei dieses Verfahren die Transformation der Pflanzenzellen mit einem Vektor nach Anspruch 8 umfasst.

11. Pflanzen oder Pflanzenteile, insbesondere Früchte, Samen, Blätter, Blütenblätter oder Zellen, transformiert durch Aufnahme wenigstens einer der Nucleotidsequenzen nach Anspruch 1 oder 2 in ihr Genom.