DE10129338A1 - Verfahren zur Herstellung von C9-Aldehyden, C9-Alkoholen durch Divinylethersynthase - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von C9-Aldehyden, C9-Alkoholen durch DivinylethersynthaseInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von C¶9¶-Aldehyden, C¶9¶-Alkoholen sowie deren Estern, das auf der Umsetzung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit rekombinanter 9-Lipoxygenase (9-LOX) und 9-Divinylethersynthase (9-DES) basiert.
Description
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von C9-Aldehyden, C9-Alkoholen sowie deren Ester, das auf der Umsetzung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit rekombinanter 9-Lipoxygenase (9-LOX) und 9-Divinylethersynthase (9-DES) basiert.
- Der Abbau von mehrfach ungesättigten Fettsäuren beginnt mit der Oxygenierung des (1Z,4Z)-Pentadiensystems von mehrfach ungesättigten Fettsäuren. Diese Reaktion wird durch das Enzym Lipoxygenase (EC 1.13.11.12) katalysiert, das in Pflanzen, Tieren und Mikroorganismen vorkommt. Die oxygenierten Produkte, als Fettsäurehydroperoxide bezeichnet, sind Vorstufen für viele wichtige Hormone, beispielsweise Jasmonsäure, Traumatinsäure sowie Geschmacks- und Duftmoleküle in Pflanzen, beispielsweise Hexenale, (3Z)-Hexenol und Nonenale.
- Verbindungen wie Jasmonsäure werden aus Hydroperoxiden, wie 13- Hydroperoxylinolensäure, über einen Allenoxidsynthase- und eine Allenoxidcyclaseabhängigen Weg erzeugt. Jasmonsäure ist an Streß- und Krankheitsresistenz-Signalantworten über den Octadecanoid-Weg beteiligt. Alternativ kann 13-Hydroperoxylinolensäure durch Hydroperoxid-Lyase unter Bildung von flüchtigen Aldehyden und Traumatinsäure gespalten werden.
- Fettsäurehydroperoxid-Lyase (HPL) katalysiert die Spaltung von Kohlenstoff-Kohlenstoff- Bindungen in mehrfach ungesättigten Fettsäurehydroperoxiden unter Erzeugung von kurzkettigen C6- bzw. C9-Aldehyden und ω-Oxosäuren der Kettenlänge C12 bzw. C9 (Vick et al. (1976) Plant Physiol. 57: 780-788). Die kurzkettigen flüchtigen C6-Aldehyde liefern einen Beitrag zu den sogenannten "grünen Duftnoten" in einer Vielzahl von Pflanzenblättern, Gemüsen und Früchten. Diese Duftnoten werden häufig auch als "frisches Gras" bezeichnet. Andere kurzkettige flüchtige Aldehyde, wie beispielsweise (3Z,6Z)-Nonadienal, der gemäß dem Stand der Technik durch Spaltung von (9S,15Z,12Z,10E)-9-Hydroperoxy-15,12,10- Octadecatriensäure durch eine 9-Hydroperoxid-Lyase (9-HPL) erzeugt wird, liefern ein Melonen- oder Gurken-artiges Aroma und/oder einen entsprechenden Geschmacksbeitrag in Früchten und Gemüse. Derartige Merkmale sind für Duft- und Aromastoffe, insbesondere für die Lebensmittelindustrie, aber auch für die Kosmetik, pharmazeutische und chemische Industrie, von großer Bedeutung.
- Ferner wird angenommen, daß kurzkettige Aldehyde ebenfalls eine Rolle bei der Pathogenresistenz spielen. Beispielsweise haben kürzlich Croft et al. (1993) Plant Physiol. 101: 13-24, berichtet, daß der Gehalt an (3Z)-Hexenol und (2E)-Hexenal während einer hypersensitiven Antwort (HR) der Ackerbohne anstieg. Ferner wurde gezeigt, daß (2E)- Hexenal ein wirksames antibakterielles Mittel ist.
- Neben dem Hydroperoxid-Lyase-Reaktionsweg können die Fettsäurehydroperoxide durch Divinylethersynthasen (DES) zu konjugierten Etherfettsäuren umgesetzt werden, die ein Sauerstoffatom innerhalb der Kohlenwasserstoffkette enthalten. So werden in der Kartoffel aus Linolsäure bzw. Linolensäure durch sequentielle Wirkung von 9-Lipoxygenase und einer für 9-Hydroperoxide spezifischen Divinylethersynthase die Divinylether Colnelsäure bzw. Colnelensäure hergestellt. Die molekulare Klonierung einer Divinylethersynthase der Tomate ist von Itoh und Howe, J. Biol. Chem. (2001), 276: 3620-3627 beschrieben.
- Die Funktion derartiger Divinylether-Oxylipine in biologischen Systemen ist weitgehend unbekannt. Es bestehen jedoch Anzeichen dafür, daß Colnelsäure und Colnelensäure eine Rolle in der Pflanzenabwehr gegen den pathogenen Pilz Phytophthora investans spielen.
- Die Charakterisierung von an der Oxylipin-Biosynthese beteiligten Enzymen ist für die weitere Untersuchung des Pflanzenfettsäuremetabolismus und für die Entwicklung von transgenen Pflanzen mit erhöhten sensorischen Eigenschaften einschließlich des Aromas und des Geschmacks von großer Bedeutung. Die Untersuchungen der Pflanzenmechanismen können weitere Mittel bereitstellen, um die sensorischen Merkmale von Pflanzen, die für die Lebensmittelindustrie von Bedeutung sind, zu verstärken, zu steuern, zu modifizieren oder auf andere Art und Weise zu verändern. Ferner ist die Aufklärung der physiologischen Rollen von Enzymen der Oxylipin-Biosynthese und ihrer Produkte von Interesse für die weitere Untersuchung von Krankheitsresistenzen.
- Die Biosynthese von C6- und C9-Aldehyden und den dazu gehörenden C12- und C9-ω-Keto- Fettsäuren aus Linol- oder Linolensäure ist eine weitverbreitete Reaktion im Pflanzenreich (z. B. K. Matsui, Belgian J. Bot. (1998), 131: 50-62). Beide Substanzgruppen können in der Pflanze weiteren Umsetzungen unterliegen. So werden die Aldehyde durch Dehydrogenasen zu den entsprechenden Alkoholen und die Fettsäuren zu ω-Hydroxy-Fettsäuren reduziert.
- Die so erzeugten C9-Alkohole können ferner mit Säuren, insbesondere Essigsäure, zu den entsprechenden Estern, insbesondere Essigsäurestern umgesetzt werden, die ebenfalls von großer industrieller Bedeutung als Duft- und Aromastoffe sind.
- Die Synthese der C9-Aldehyde (3Z)-Nonenal bzw. (3Z,6Z)-Nonadienal beginnt mit der Umsetzung von Linol- bzw. α-Linolensäure mit 9-Lipoxygenase zu (9S)-Hydroperoxy- Derivaten. Diese können anschließend durch eine 9-Hydroperoxid-Lyase (9-HPL) in die C9- ω-Keto-Fettsäure und (3Z)-Nonenal bzw. (3Z,6Z)-Nonadienal gespalten werden. Die entstandenen Aldehyde können dann enzymatisch bzw. chemisch zu den (2E)-Derivaten umgesetzt werden und/oder zu den C9-Alkoholen (3Z)-Nonenol bzw. (3Z,6Z)-Nonadienol reduziert werden.
- N. J. Bate et al., Plant Physiology (1998), 117: 1393-1400, beschreiben die molekulare Charakterisierung eines für eine 13-Hydroperoxid-Lyase kodierenden Gens aus Arabidopsis. Dabei wurde eine deutliche HPL-Aktivität beobachtet, wenn (13S,9Z,11E,15Z)-13- Hydroperoxy-9,11,15-Octadecatriensäure als Substrat verwendet wurde, während die Aktivität mit (13S,9Z,11E)-13-Hydroperoxy-9,11-Octadecadiensäure etwa um eine Größenordnung niedriger war. In A. Geerts et al. Plant Physiology 105: 269-277 (1994), ist die Expression von 9-Lipoxygenase in verwundeten Knollen der Kartoffel beschrieben.
- Die internationale Patentanmeldung WO 00/22145 beschreibt ein Hydroperoxid-Lyase-Gen aus Mais. Ferner sind dort Verfahren zur Verbesserung von Krankheitsresistenzen und zur Änderung des Gehaltes von Aromamolekülen in Pflanzen offenbart. Diese Verfahren umfassen die Expression von Hydroperoxid-Lyase-Genen in Pflanzen, Pflanzenzellen und Pflanzengeweben.
- Die im Stand der Technik beschriebenen Verfahren beschreiben somit die Spaltung von 13- Hydroperoxidfettsäuren durch 13-Hydroperoxid-Lyase bzw. 9-Hydroperoxidfettsäuren durch 9-Hydroperoxid-Lyase. D. h., die Herstellung eines C9-Aldehyds bzw. -Alkohols aus einer C18-Fettsäure erfordert gemäß dem Stand der Technik die sequentielle Umsetzung mit einer Lipoxygenase zur Erzeugung des entsprechenden Hydroperoxid-Fettsäurederivats sowie mit einer Hydroperoxid-Lyase zur Spaltung des Hydroperoxid-Fettsäurederivats.
- Zur Herstellung von Duft- und Aromastoffen ist es von wesentlicher Bedeutung, die jeweiligen Bestandteile in möglichst hoher Reinheit einzusetzen. Die aus der durch 9- Hydroperoxidlyase katalysierten Umsetzung von (9S)-Hydroperoxid-Derivaten der α- Linolensäure erzeugten (3Z)-Aldehyde weisen den Nachteil auf, daß die (3Z)-Doppelbindung säurelabil ist und somit Mischungen aus (3Z)-, (2E)- und (3E)-Isomeren entstehen können. Derartige Mischungen sind für die Weiterverarbeitung zu entsprechenden Alkoholen und Estern und insbesondere für die Verwendung der Aldehyde, Alkohole und Ester als Bestandteile von Duft- und Aromastoffen unerwünscht.
- Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es nun, ein neues, einfaches Verfahren zur Herstellung von C9-Aldehyden, C9-Alkoholen sowie Estern der C9-Alkohole bereitzustellen, bei dem die Aktivität einer 9-Hydroperoxid-Lyase nicht benötigt wird. Insbesondere ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von stabilen (2E)- Isomeren von C9-Aldehyden, C9-Alkoholen sowie Estern der C9-Alkohole bereitzustellen. Weitere Aufgaben der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung.
- Diese Aufgaben werden durch die Gegenstände der unabhängigen Ansprüche gelöst.
- Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den Unteransprüchen definiert.
- Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß bei der Herstellung eines C9-Aldehyds aus einer C18-Fettsäure nach der Umsetzung mit einer 9-Lipoxygenase im zweiten Reaktionsschritt eine 9-Divinylethersynthase (9-DES) eingesetzt werden kann und die so erzeugten Divinylether beispielsweise durch mildes Ansäuern in die entsprechenden (2E)-C9- Aldehyde zerfallen.
- Erfindungsgemäß wird somit ein Verfahren zur Herstellung von C9-Aldehyden bzw. C9- Alkoholen bzw. Estern der C9-Alkohole aus mehrfach ungesättigten Fettsäuren der Kettenlänge C18 bereitgestellt, wobei die mehrfach ungesättigten Fettsäuren zumindest an den Positionen Δ9 und Δ12 Doppelbindungen aufweisen. Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt die folgenden Schritte:
- a) die Bereitstellung eines Nukleinsäuremoleküls, welches für ein pflanzliches oder mikrobielles Protein mit der biologischen Aktivität von 9-Lipoxygenase kodiert;
- b) die Bereitstellung eines Nukleinsäuremoleküls, welches für ein pflanzliches oder mikrobielles Protein mit der biologischen Aktivität von 9-Divinylethersynthase kodiert;
- c) die Übertragung der Nukleinsäuremoleküle aus a) und b) auf eukaryontische oder prokaryontische Zellen, wobei die kodierende Sequenz unter Kontrolle geeigneter regulatorischer Sequenzen steht,
- d) die Expression der rekombinanten 9-Lipoxygenase und 9-Divinylethersynthase in den Zellen;
- e) die Umsetzung der mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit der rekombinanten 9- Lipoxygenase zu 9-Hydroperoxiden der Fettsäuren;
- f) die Umsetzung der 9-Hydroperoxide der Fettsäuren mit 9-Divinylethersynthase zu Divinylethern;
- g) die Umsetzung der Divinylether zu (2E)-C9-Aldehyden;
- h) gegebenenfalls die Reduktion der C9-Aldehyde zu C9-Alkoholen;
- i) gegebenenfalls die Umsetzung der C9-Alkohole aus Schritt h) mit einer Säure, insbesondere Essigsäure, zu einem entsprechenden Ester.
- Das vorstehend genannte erfindungsgemäße Verfahren bietet den Vorteil, daß durch die Umsetzung der 9-Hydroperoxide von Fettsäuren, die Doppelbindungen an den Positionen Δ9 und Δ12 aufweisen, mit 9-Divinylethersynthase und die anschließende Umsetzung der Divinylether ausschließlich das stabile (2E)-Isomer des gebildeten Aldehyds entsteht. Somit werden nachteilige Produktgemische vermieden, und die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren erzeugten Aldehyde können mit hoher Reinheit zu (2E)-C9-Alkoholen bzw. zu entsprechenden Estern weiterverarbeitet werden und als Bestandteile von Duft- und Aromastoffen verwendet werden.
- Falls in den eukaryontischen oder prokaryontischen Zellen bereits eine 9-LOX- bzw. 9-DES- Aktivität in angemessener Höhe vorhanden ist, kann gegebenenfalls auf die Übertragung der Nukleinsäuremoleküle aus Schritt a) oder b) des erfindungsgemäßen Verfahrens verzichtet werden.
- Vorzugsweise werden bei der vorliegenden Erfindung als mehrfach ungesättigte Fettsäuren C18-Fettsäuren eingesetzt. Dabei können alle C18-Fettsäuren mit einem (9Z,12Z)- Pentadiensystem umgesetzt werden. Beispiele für C18-Fettsäuren, die vorteilhaft bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind α-Linolensäure und Linolsäure.
- Für den Fall, daß die vorstehend genannten mehrfach ungesättigten Fettsäuren, insbesondere α-Linolensäure oder Linolsäure, in der Pflanzenzelle nicht in ausreichenden Konzentrationen vorliegen, umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren in einer weiteren Ausführungsform zusätzlich die Bereitstellung zusätzlicher Ausgangssubstrate in der Pflanzenzelle, z. B. durch exogene Zugabe der Ausgangssubstrate.
- Vorzugsweise werden im Anschluß an die Übertragung der Nukleinsäuremoleküle auf pflanzliche Zellen aus den transgenen Zellen vollständige Pflanzen regeneriert, die als Produktionsstätte für Divinylether dienen, die anschließend insbesondere durch mildes Ansäuern bei der Aufarbeitung zu den entsprechenden (2E)-C9-Aldehyden bzw. C9- Alkoholen bzw. Estern der C9-Alkohole umgesetzt werden.
- Bei einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den transformierten Zellen um Bakterienzellen, Hefezellen oder Algenzellen. In diesem Fall erfolgt die Kultivierung der Zellen und die Herstellung der C9-Aldehyde bzw. C9-Alkohole bzw. Ester der C9-Alkohole in einem Reaktor. Selbstverständlich muß auch hier eine ausreichende Konzentration der Substrate, gegebenenfalls durch Bereitstellung zusätzlicher Ausgangssubstrate z. B. durch exogene Zugabe, sichergestellt werden.
- Bei einer weiteren Ausführungsform werden transgene Pflanzenzellen kultiviert (z. B. in Form von Suspensions- oder Kalluskulturen) und als Produktionsstätte für Divinylether genutzt, die anschließend wiederum wie vorstehend beschrieben zu den entsprechenden C9-Aldehyden bzw. C9-Alkoholen bzw. Estern der C9-Alkohole umgesetzt werden.
- Vorzugsweise kodiert das Nukleinsäuremolekül aus Schritt a) ein Protein mit der biologischen Aktivität von 9-Lipoxygenase aus der Kartoffel.
- Ferner kodiert das Nukleinsäuremolekül aus Schritt b) vorzugsweise eine 9-DES aus der Kartoffel oder alternativ aus Tomate.
- Vorzugsweise erfolgt die Umsetzung der Divinylether zu den entsprechenden C9-Aldehyden in Schritt g) durch mildes Ansäuern, beispielsweise mit 20%iger HCl.
- Je nach Wunsch kann der entstandene Aldehyd in Schritt h) des erfindungsgemäßen Verfahrens enzymatisch, vorzugsweise mit Alkoholdehydrogenase, oder chemisch, vorzugsweise mit Natriumborhydrid, zu einem C9-Alkohol reduziert werden.
- Alternativ zu der vorstehend beschriebenen Expression der rekombinanten 9-Lipoxygenase bzw. 9-Divinylethersynthase in Zellen können die C9-Aldehyde bzw. C9-Alkohole bzw. Ester der C9-Alkohole auch in vitro in einem Reaktionsgemisch hergestellt werden, das als Komponenten eine mehrfach ungesättigte Fettsäure mit Doppelbindungen zumindest an den Positionen Δ9 und Δ12, insbesondere eine C18-Fettsäure, besonderes bevorzugt α- Linolensäure oder Linolsäure; 9-Lipoxygenase und 9-Divinylethersynthase (als Rohextrakt oder in reiner Form); sowie, falls die Herstellung eines Alkohols erwünscht ist, ein Reduktionsmittel; sowie, falls die Herstellung eines Esters erwünscht ist, eine Säure, insbesondere Essigsäure; umfaßt.
- Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Verfahren zur Veränderung des Gehalts an für die Herstellung von C9-Aldehyden bzw. C9-Alkoholen bzw. Estern der C9- Alkohole als Vorstufe einsetzbaren Divinylether in einer Wirtszelle. Im allgemeinen umfassen die Verfahren das Erhöhen des Gehalts an Divinylethern in einer Wirtszelle. Das Verfahren umfaßt die Verwendung von Expressionskonstrukten zur Durchführung der Expression von DNA-Sequenzen, die ein Protein mit der biologischen Aktivität einer 9-Divinylethersynthase kodieren, in einer Wirtszelle. Insbesondere bevorzugt ist die Verwendung von Expressionskonstrukten zur Veränderung des Gehaltes an Divinylethern als Vorstufe für C9-Aldehyde bzw. C9-Alkohole bzw. Ester der C9-Alkohole in einer Pflanzenzelle bzw. Pflanze. Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Veränderung des Gehaltes an Divinylethern in Pflanzenteilen einschließlich Blätter, Wurzeln, Stämme, Blüten, Früchte, Samen und Saatölen, die aus Pflanzensamen erhalten werden, verwendet.
- Besonders bevorzugt werden die 9-Divinylethersynthase kodierenden DNA-Sequenzen zur Erzeugung von transgenen Pflanzen verwendet, die eine erhöhte Produktion an Divinylethern in Pflanzenfrüchten und -geweben aufweisen. Diese Divinylether können wiederum beispielsweise durch mildes Ansäuern bei der Aufarbeitung in C9-Aldehyde bzw. C9- Alkohole bzw. Ester der C9-Alkohole umgesetzt werden. Derartige Aldehyde sind wichtige Bestandteile charakteristischer Aromata von Früchten, Gemüse und grünen Blättern. Somit kann eine 9-Divinylethersynthase erfindungsgemäß auch zur Herstellung von Produkten aus transgenen Pflanzen mit verbesserten Aromamerkmalen verwendet werden.
- Um die Lipidperoxidation in einem Pflanzengewebe zu erhöhen, schließt die vorliegende Erfindung auch die Coexpression einer pflanzlichen oder anderen 9-Divinylethersynthase in einem Pflanzengewebe mit einem zweiten Gen ein, das bei der Lipidperoxidation eine Rolle spielt. Beispielsweise kann die Coexpression einer 9-Divinylethersynthase in einem Pflanzengewebe mit einer DNA-Sequenz, die für eine Lipoxygenase, insbesondere eine 9- Lipoxygenase kodiert, die Lipidperoxidation erhöhen und somit den Gehalt an Divinylethern, die in dem Pflanzengewebe erzeugt werden, steigern. Eine derartige Erhöhung des Gehalts an Divinylethern, die anschließend in C9-Aldehyde umgesetzt werden, kann das "Melonen"- bzw. "Gurken"-Aroma in einem pflanzlichen Produkt erhöhen.
- Ferner können die Pflanzenzellen, die eine DNA-Sequenz enthalten, die für eine Divinylethersynthase kodiert, ebenfalls als Quelle für Divinylether in Reaktionen für die Erzeugung von C9-Aldehyden bzw. C9-Alkoholen für die Verwendung in Aromastoffen verwendet werden. Derartige Verfahren sind im Stand der Technik bekannt und sind beispielsweise in der US-Patentschrift 5,695,973 und in der internationalen Patentanmeldung WO 95/26413 beschrieben. Im allgemeinen wird eine Mischung aus Aldehyden und Alkoholen durch derartige Verfahren erhalten. Die Verfahren werden üblicherweise in einem Reaktionsgemisch durchgeführt, das mindestens eine mehrfach ungesättigte Fettsäure, ein Pflanzenmaterial mit einem relativ hohen Gehalt an Enzymaktivität von Lipoxygenase und Divinylethersynthase und eine Alkoholdehydrogenase enthält.
- Die mehrfach ungesättigte Fettsäure kann variieren und umfaßt eine einzelne ungesättigte Fettsäureart sowie Mischungen von verschiedenen ungesättigten Fettsäuren. Die Fettsäuren sind im allgemeinen C18-Fettsäuren, aber nicht beschränkt auf diese. Bevorzugte Beispiele schließen α-Linolensäure und Linolsäure ein.
- Quellen für eine für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignete Alkoholdehydrogenase sind vorzugsweise Hefen. Die Alkoholdehydrogenase katalysiert die Umwandlung eines Aldehyds in einen Alkohol. Hefe stellt ferner eine Quelle für Nicotinadenindinucleotid (NADH) als Reduktionsmittel bereit.
- Die DNA-Sequenz, die ein Protein mit der biologischen Aktivität einer 9-LOX bzw. einer 9- DES kodiert, kann aus natürlichen Quellen isoliert oder nach herkömmlichen Verfahren synthetisiert werden.
- Neben der bekannten für eine 9-DES kodierenden DNA-Sequenz aus der Tomate wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung erstmals eine DNA-Sequenz bereitgestellt, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer 9-Divinylethersynthase aus Solanum tuberosum kodiert.
- Vorzugsweise wird die erfindungsgemäße DNA-Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
- a) DNA-Sequenzen, die eine Nukleinsäuresequenz umfassen, die die in SEQ ID NO: 2 angegebene Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren;
- b) DNA-Sequenzen, die die in SEQ ID NO: 1 angegebene Nukleinsäuresequenz oder Teile davon umfassen;
- c) DNA-Sequenzen, die ein Derivat, Analog oder Fragment einer Nukleinsäuresequenz von a) oder b) darstellen.
- Bei einem weiteren Gegenstand der vorliegenden Erfindung werden rekombinante Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer 9-Divinylethersynthase aus Solanum tuberosum bereitgestellt. Vorzugsweise weisen die erfindungsgemäßen Proteine die in SEQ ID NO: 2 angegebene Aminosäuresequenz auf.
- Mittels gängiger molekularbiologischer Techniken (siehe beispielsweise Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) ist es möglich, gewünschte Konstrukte für die Transformation von Pflanzenzellen vorzubereiten bzw. herzustellen: Die für die gentechnische Manipulation in prokaryontischen Zellen üblicherweise eingesetzten Klonierungs-, Mutagenisierungs-, Sequenzanalyse-, Restriktionsanalyse- und weitere biochemisch-molekularbiologischen Methoden sind dem Durchschnittsfachmann wohl bekannt. So können nicht nur geeignete chimäre Genkonstrukte mit der gewünschten Fusion von Promotor und 9-LOX- bzw. 9-DES-DNA-Sequenz und ggf. weiteren Regulations- und/oder Signalsequenzen hergestellt werden, vielmehr kann der Fachmann, falls erwünscht, zusätzlich mittels Routinetechniken, verschiedenartige Mutationen in die die 9-LOX- bzw. 9-DES kodierende DNA-Sequenz einführen, wodurch es zur Synthese von Proteinen mit eventuell veränderten biologischen Eigenschaften kommt. Hierbei ist zum einen die Erzeugung von Deletionsmutanten möglich, bei denen durch fortschreitende Deletion vom 5'- oder vom 3'-Ende der kodierenden DNA-Sequenz die Synthese entsprechend verkürzter Proteine erreicht werden kann. Ferner ist es möglich, gezielt Enzyme herzustellen, die durch Addition entsprechender Signalsequenzen in bestimmten Kompartimenten der Pflanzenzelle lokalisiert sind. Derartige Sequenzen sind in der Literatur beschrieben und dem Durchschnittsfachmann wohl bekannt (siehe z. B. Braun et al. (1992) EMBO J. 11: 3219-3227; Wolter F. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 846-850; Sonnewald U. et al. (1991) Plant J. 1: 95-106). Weiterhin ist auch die Einführung von Punktmutationen an Positionen denkbar, bei denen eine Veränderung der Aminosäuresequenz einen Einfluss beispielsweise auf die Enzymaktivität oder die Regulierung des Enzyms hat. Auf diese Weise können z. B. Mutanten hergestellt werden, die nicht mehr den normalerweise in der Zelle herrschenden Regulationsmechanismen über allosterische Regulation oder kovalente Modifizierung unterliegen. Des weiteren können Mutanten hergestellt werden, die eine veränderte Substrat- oder Produktspezifität aufweisen (Hornung et al. (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 4192-4197). Weiterhin können Mutanten hergestellt werden, die ein verändertes Aktivitäts-, Temperatur- und/oder pH-Profil aufweisen.
- Für die gentechnische Manipulation in prokaryontischen Zellen können die erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäuremoleküle oder Teile davon in Plasmide eingebracht werden, die eine Mutagenese oder eine Sequenzveränderung durch Rekombination von DNA- Sequenzen erlauben. Mit Hilfe von Standardverfahren (siehe z. B. Sambrook et al. (1989), vide supra) können Basenaustausche vorgenommen oder natürliche oder synthetische Sequenzen hinzugefügt werden. Für die Verbindung der DNA-Fragmente untereinander können an die Fragmente, wo erforderlich, Adapter oder Linker angefügt werden. Ferner können mittels enzymatischer und anderer Manipulationen passende Restriktionsschnittstellen zur Verfügung gestellt oder überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfernt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen in Frage kommen, können in vitro- Mutagenese, "primer repair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Als Analysemethoden werden im allgemeinen Sequenzanalyse, Restriktionsanalyse und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden durchgeführt.
- Für die Expression der in den rekombinanten Nukleinsäuremolekülen enthaltenen DNA- Sequenzen in pflanzlichen Zellen kommt grundsätzlich jeder in pflanzlichen Zellen aktive Promotor in Frage. So können die 9-LOX- bzw. 9-DES-DNA-Sequenzen beispielsweise unter Kontrolle konstitutiver, aber auch induzierbarer oder gewebe- bzw. entwicklungsspezifischer Regulationselemente, insbesondere Promotoren, in Pflanzenzellen exprimiert werden. Während beispielsweise die Verwendung eines induzierbaren Promotors die gezielt ausgelöste Expression der 9-LOX- bzw. 9-DES-DNA-Sequenzen in Pflanzenzellen ermöglicht, bietet beispielsweise der Einsatz von gewebespezifischen, beispielsweise blatt- oder samenspezifischen, Promotoren die Möglichkeit, den Gehalt an Divinylethern in bestimmtem Gewebe, z. B. in Blatt- bzw. Samengewebe, zu verändern. Andere geeignete Promotoren vermitteln z. B. Lichtinduzierte Genexpression in transgenen Pflanzen. In Bezug auf die zu transformierende Pflanzen kann der Promotor homolog oder heterolog sein.
- Geeignete Promotoren sind z. B. der 35S RNA-Promotor des Cauliflower Mosaic Virus und der Ubiquitin-Promotor aus Mais für eine konstitutive Expression. Als samenspezifische Promotoren bieten sich bspw. der USP- (Bäumlein et al. (1991), Mol. Gen. Genet. 225: 459-467) oder dem Hordein-Promotor (Brandt et al. (1985), Carlsberg Res. Commun. 50: 333-345).
- Konstitutive, keimungsspezifische, fruchtspezifische und samenspezifische Promotoren werden im Rahmen dieser Erfindung bevorzugt, da sie sich besonders für die gezielte Erhöhung des Gehalts an Divinylethern als Vorstufe für C9-Aldehyde bzw. C9-Alkohole bzw. Ester der C9-Alkohole in transgenen Samen eignen, u. a. auch im Zusammenhang mit der Antisense- oder Cosuppressions-Technik.
- In jedem Fall kann der Fachmann geeignete Promotoren der Literatur entnehmen oder mittels Routineverfahren selbst aus beliebigen Pflanzen isolieren.
- Ferner sind Transkriptions- bzw. Terminationssequenz vorhanden, die der korrekten Beendigung der Transkription dient, sowie der Addition eines polyA-Schwanzes an das Transkript dienen kann, dem eine Funktion bei der Stabilisierung der Transkripte beigemessen wird. Derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben (z. B. Gielen (1989) EMBO J. 8: 23-29) und beliebig austauschbar, z. B. der Terminator des Octopinsynthasegens aus Agrobacterium tumefaciens.
- In einer bevorzugten Ausführungsform sind die in den Vektoren enthaltenen Nukleinsäuremoleküle mit regulatorischen Elementen verknüpft, die die Transkription und ggf. Translation in prokaryontischen und eukaryontischen Zellen gewährleisten.
- Gegegebenfalls können die Nukleinsäuresequenzen durch Enhancer-Sequenzen oder andere regulatorische Sequenzen ergänzt sein. Diese regulatorischen Sequenzen beinhalten beispielsweise auch Signalsequenzen, die für den Transport des Genprodukts zu einem bestimmten Kompartiment sorgen.
- Es ist ebenso eine Aufgabe der Erfindung, neue transgene Pflanzen, Pflanzenzellen, Pflanzenteile, transgenes Vermehrungsmaterial und transgene Ernteprodukte bereitzustellen, die sich durch eine gegenüber Wildtyppflanzen bzw. -zellen veränderten Gehalt an Divinylethern als Vorstufe für C9-Aldehyde bzw. C9-Alkohole bzw. Ester der C9-Alkohole auszeichnen.
- Diese Aufgabe wird durch die Übertragung der Nukleinsäuremoleküle, welche für ein pflanzliches oder mikrobielles Protein mit der biologischen Aktivität einer 9-DES kodieren, und ihre Expression in Pflanzen gelöst. Durch die Übertragung der vorstehend genannten Nukleinsäuremoleküle besteht nun die Möglichkeit, pflanzliche Zellen mittels gentechnischer Methoden dahingehend zu verändern, daß sie im Vergleich zu Wildtypzellen eine neue oder veränderte 9-DES-Aktivität aufweisen und es als Folge davon zu einer Veränderung des Gehalts an Divinylethern als Vorstufe von C9-Aldehyden bzw. C9-Alkoholen bzw. Estern der C9-Alkohole in der Pflanze kommt.
- So betrifft die Erfindung in einer Ausführungsform Pflanzen bzw. deren Zellen und Teile, in denen der Gehalt an Divinylethern als Vorstufe für C9-Aldehyde bzw. C9-Alkohole bzw. Ester der C9-Alkohole aufgrund der Gegenwart und Expression der vorstehend genannten Nukleinsäuremoleküle gegenüber Wildtyppflanzen erhöht ist und die somit eine erhöhte Resistenz gegen Bakterien oder Pilze aufweisen.
- Die Erfindung betrifft aber auch solche Pflanzen, in denen die Übertragung der vorstehend genannten Nukleinsäuremoleküle zu einer Verringerung des Gehalts an Divinylethern führt. Eine derartige Reduktion kann beispielsweise durch den Transfer von Antisense-Konstrukten oder durch andere Suppressionsmechanismen, wie beispielsweise Cosuppressionen, erreicht werden.
- Gegenstand der Erfindung sind weiterhin transgene Pflanzenzellen bzw. solche Pflanzenzellen umfassende Pflanzen und deren Teile und Produkte, in denen die vorstehend genannten, für 9-DES kodierenden Nukleinsäuremoleküle integriert in das pflanzliche Genom vorliegen. Ebenfalls Gegenstand der Erfindung sind Pflanzen, in deren Zellen das vorstehend genannte Nukleinsäuremolekül in selbstreplizierender Form vorliegt, d. h. die Pflanzenzelle enthält die fremde DNA auf einem eigenständigen Nukleinsäuremolekül (transiente Expression).
- Bei den Pflanzen, die mit den vorstehend genannten Nukleinsäuremolekülen transformiert sind und in denen aufgrund der Einführung eines solchen Moleküls eine veränderte Menge Divinylethern als Vorstufe von C9-Aldehyden bzw. C9-Alkoholen bzw. Estern der C9- Alkohole synthetisiert wird, kann es sich im Prinzip um jede beliebige Pflanze handeln. Vorzugsweise ist es eine monokotyle oder dikotyle Nutzpflanze.
- Beispiele für monokotyle Pflanzen sind die Pflanzen, die zu den Gattungen Avena (Hafer), Triticum (Weizen), Secale (Roggen), Hordeum (Gerste), Oryza (Reis), Panicum, Pennisetum, Setaria, Sorghum (Hirse), Zea (Mais) gehören. Bei den dikotylen Nutzpflanzen sind u. a. zu nennen Leguminosen, wie Hülsenfrüchte und insbesondere Alfalfa, Sojabohne, Tomate, Zuckerrübe, Kartoffel, Zierpflanzen oder Bäume und insbesondere Ölsaaten wie Lein, Sonnenblume und Raps. Weitere Nutzpflanzen können beispielsweise Obst (insbesondere Äpfel, Birnen, Kirschen, Weintrauben, Citrus, Ananas und Bananen), Ölpalmen, Tee-, Kakao- und Kaffeesträucher, Tabak, Sisal, Baumwolle sowie Heilpflanzen und Weidegräser sowie Futterpflanzen sein. Besonders bevorzugt sind die Getreide Weizen, Roggen, Hafer, Gerste, Reis, Mais und Hirse, Futtergetreide, Zuckerrübe, Soja, Sonnenblume, Lein, Tomate, Kartoffel, Süßgräser, Futtergräser und Klee. Es ergibt sich von selbst, daß die Erfindung insbesondere übliche Nahrungs- bzw. Futterpflanzen betrifft. Hier sind neben den bereits erwähnten Pflanzen zusätzlich Erdnuß, Linse, Ackerbohne, Runkelrübe, Buchweizen, Möhre, Sonnenblume, Topinambur, Rübsen, Weißer Senf, Kohlrübe und Stoppelrübe zu nennen.
- Besonders bevorzugt werden Ölsaaten.
- Gegenstand der Erfindung sind ferner Vermehrungsmaterial und Ernteprodukte von erfindungsgemäßen Pflanzen, beispielsweise Samen, Früchte, Stecklinge, Knollen, Wurzelstöcke usw., sowie Teile dieser Pflanzen, wie Protoplasten, Pflanzenzellen und Kalli.
- In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Wirtszellen, insbesondere prokaryontische und eukaryontische Zellen, die mit einem oben beschriebenen Nukleinsäuremolekül oder einem Vektor transformiert bzw. infiziert wurden, sowie Zellen, die von derartigen Wirtszellen abstammen und die beschriebenen Nukleinsäuremoleküle oder Vektoren enthalten. Die Wirtszellen können Bakterien, Viren, Algen, Hefe- und Pilzzellen sowie pflanzliche oder tierische Zellen sein.
- Gegenstand der Erfindung sind auch solche Wirtszellen, die neben den für LOX und DES kodierenden Nukleinsäuremolekülen ein oder mehrere, auf gentechnologischem oder natürlichem Weg übertragene Nukleinsäuremoleküle enthalten, die die genetische Information für am LOX-abhängigen Katabolismus von mehrfach ungesättigten Fettsäuren in Pflanzen beteiligte Enzyme tragen.
- Der vorliegenden Erfindung liegt außerdem die Aufgabe zugrunde, Verfahren zur Herstellung von Pflanzenzellen und Pflanzen, die sich durch einen veränderten Gehalt an Divinylethern als Vorstufe von C9-Aldehyden bzw. C9-Alkoholen bzw. Estern der C9-Alkohole auszeichnen, bereitzustellen.
- Diese Aufgabe wird durch Verfahren gelöst, mit deren Hilfe die Erzeugung neuer Pflanzenzellen und Pflanzen, die aufgrund der Übertragung der vorstehend genannten, für 9- DES kodierenden Nukleinsäuremolekülen einen veränderten Gehalt an Divinylethern aufweisen, möglich ist. Zur Erzeugung solcher neuer Pflanzenzellen und Pflanzen bieten sich verschiedene Methoden an. Zum einen können Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit Hilfe herkömmlicher gentechnologischer Transformationsmethoden derart verändert werden, daß die neuen Nukleinsäuremoleküle in das pflanzliche Genom integriert werden, d. h., es werden stabile Transformanten erzeugt. Zum anderen kann ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül, dessen Anwesenheit und ggf. Expression in der Pflanzenzelle eine veränderte Biosyntheseleistung bewirkt, in der Pflanzenzelle bzw. der Pflanze als selbstreplizierendes System enthalten sein. So können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle beispielsweise in einem Virus enthalten sein, mit dem die Pflanze bzw. Pflanzenzelle in Kontakt kommt.
- Erfindungsgemäß werden Pflanzenzellen und Pflanzen mit erhöhter Resistenz gegen Bakterien oder Pilze, die aufgrund der Expression einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz einen veränderten, insbesondere erhöhten Gehalt an Divinylethern als Vorstufe von C9-Aldehyden bzw. C9-Alkoholen bzw. Estern der C9-Alkohole aufweisen, durch ein Verfahren hergestellt, das folgende Schritte umfaßt:
- a) Herstellung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, umfassend die folgenden
Bestandteilen in 5' → 3'-Orientierung:
- - regulatorische Sequenzen eines in Pflanzenzellen aktiven Promotors,
- - operativ daran gebunden eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein mit der biologischen Aktivität einer 9-DES kodiert, und
- - ggf. operativ daran gebunden Sequenzen, die als Transkriptions-, Termination- und/oder Polyadenylierungssignale in Pflanzenzellen dienen können.
- b) Übertragung des Nukleinsäuremoleküls aus a) auf pflanzliche Zellen.
- Alternativ können eine oder mehrere erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen als selbstreplizierendes System in die Pflanzenzelle bzw. die Pflanze eingebracht werden.
- Als weitere Alternative kann Schritt a) des obigen Verfahrens dahingehend abgewandelt werden, daß die Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein mit der biologischen Aktivität einer 9-DES kodiert, in Antisense-Orientierung an das 3'-Ende des Promotors gekoppelt ist.
- Bei einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung können ein oder mehrere zusätzliche Nukleinsäuremoleküle eingeführt werden, die für Proteine kodieren, die die Oxygenierung von Fettsäuren zu 9-Hydroperoxid-Fettsäuren katalysieren (Lipoxygenasen).
- Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen bzw. deren Zellen stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E.coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw. Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird dann für die Transformation von E.coli-Zellen verwendet. Transformierte E.coli-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet und anschließend geerntet und lysiert, und das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysenmethode zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid-DNA gespalten und gewonnene DNA-Fragmente mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft werden.
- Voraussetzung für die Einführung der rekombinanten Nukleinsäuremoleküle und Vektoren in Pflanzenzellen ist die Verfügbarkeit geeigneter Transformationssysteme. Hier wurde während der letzten zwei Jahrzehnte ein breites Spektrum an Transformationsmethoden entwickelt und etabliert. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, Diffusion von Protoplasten, den direkten Gentransfer isolierter DNA in Protoplasten, die Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methoden sowie weitere Möglichkeiten, wobei der Fachmann die jeweils geeignete Methode problemlos ermitteln kann. Sämtliche Transformationsverfahren sind seit vielen Jahren gut etabliert und gehören zweifelsohne zum Standardrepertoire des Fachmanns in der pflanzlichen Molekularbiologie, Pflanzenbiotechnologie und Zell- und Gewebekultur.
- Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden per se keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Ähnliches gilt für den direkten Gentransfer. Es können einfache Plasmide, wie z. B. pUC-Derivate, verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens empfehlenswert. Dem Fachmann sind die gängigen Selektionsmarker bekannt, und es stellt für ihn kein Problem dar, einen geeigneten Marker auszuwählen.
- Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA- Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muss mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der im Ti- bzw. Ri-Plasmid enthaltenen T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden. Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muss die einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären oder in einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E.coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA-Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden. Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet. Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in allseits bekannten Übersichtsartikeln und Handbüchern zur Pflanzentransformation beschrieben worden.
- Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden.
- Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin, Methotrexat, Glyphosat, Streptomycin, Sulfonylharnstoff, Gentamycin oder Phosphinotricin u. a. vermittelt. Der individuell gewählte Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten. Hierzu sind auch alternative Marker geeignet, wie nutritive Marker, Screeningmarker (wie GFP, green fluorescent protein). Selbstverständlich kann auch vollkommen auf Selektionsmarker verzichtet werden, was allerdings mit einem ziemlich hohen Screeningbedarf einhergeht. Falls der eingesetzte Selektionsmarker nach erfolgter Transformation und Identifizierung erfolgreich transformierter Zellen bzw. Pflanzen wieder entfernt werden soll, stehen dem Fachmann hierfür verschiedene Strategien zur Verfügung. So können z. B. sequenzspezifische Rekombinasen verwendet werden, z. B. in Form der Retransformation einer Rekombinase-exprimierenden Ausgangslinie und Auskreuzung der Rekombinase nach erfolgter Entfernung des Selektionsmarkers (siehe z. B. Reiss et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 3094-3098; Bayley et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 353-361; Lloyd et al. (1994) Mol. Gen. Genet. 242: 653-657; Mäser et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 230: 170-176; Onouchi et al. (1991) Nucl. Acids Res. 19: 6373-6378). Der Selektionsmarker kann auch durch Cotransformation mit anschließender Auskreuzung entfernt werden.
- Die Regeneration der transgenen Pflanzen aus transgenen Pflanzenzellen erfolgt nach üblichen Regenerationsmethoden unter Verwendung üblicher Nährmedien und Phytohormone. Die so erhaltenen Pflanzen können dann, falls erwünscht, mittels üblicher Verfahren, einschließlich molekularbiologischer Methoden, wie PCR, Blot-Analysen, oder biochemischer Verfahren auf Anwesenheit der eingeführten DNA, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer 9-DES kodiert, bzw. auf Anwesenheit von 9-DES- Enzymaktivität untersucht werden.
- Unabhängig von den verwendeten regulatorischen Sequenzen, unter deren Kontrolle die Expression der 9-LOX- bzw. 9-DES-Sequenzen steht, steht dem Fachmann ein breites Spektrum an molekularbiologischen und/oder biochemischen Verfahren für die Analyse der transformierten Pflanzenzellen, transgenen Pflanzen, Pflanzenteile, Ernteprodukte und Vermehrungsmaterial zur Verfügung, z. B. PCR, Northern Blot-Analyse zum Nachweis von für 9-LOX- bzw. 9-DES spezifischer RNA bzw. zur Bestimmung der Höhe der Akkumulation von 9-LOX- bzw. 9-DES-spezifischer RNA, Southern Blot-Analyse zur Identifizierung von 9-LOX- bzw. 9-DES-kodierenden DNA-Sequenzen oder Western Blot-Analyse zum Nachweis des durch die Nukleinsäuremoleküle kodierten 9-LOX- bzw. 9-DES. Selbstverständlich kann der Nachweis der enzymatischen Aktivität der 9-LOX- bzw. 9-DES auch vom Fachmann mittels in der Literatur erhältlicher Protokolle bestimmt werden. Weiter kann man z. B. den durch Kreuzungen erhaltenen Samen auf Medium auslegen, das das zu dem zusammen mit der 9-LOX- bzw. 9-DES-DNA-Sequenz übertragenen Selektionsmarker passende Selektionsmittel enthält, und anhand der Keimfähigkeit und des Wachstums der Tochtergeneration(en) und des Segregationsmusters Rückschlüsse auf den Genotyp der jeweiligen Pflanze schließen.
- Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, Verwendungen der 9-DES aufzuzeigen.
- Diese Aufgabe wird durch die erfindungsgemäßen Verwendungen der 9-DES zur Herstellung von C9-Aldehyden bzw. C9-Alkoholen bzw. Estern der C9-Alkohole aus Divinylethern, die aus Pflanzenzellen bzw. Pflanzen stammen, die sich durch einen im Vergleich zu Wildtypzellen bzw. Wildtyppflanzen veränderten Gehalt an Divinylethern auszeichnen, gelöst.
- Die vorliegende Erfindung umfaßt ferner jede mögliche Form des Einsatzes des für 9-DES kodierenden Nukleinsäuremoleküls, dessen Gegenwart und ggf. Expression in Pflanzen eine Veränderung des Gehalts an Divinlyethern als Vorstufe von C9-Aldehyden bzw. C9- Alkoholen bzw. Estern der C9-Alkohole bewirkt.
- Die für 9-DES kodierenden Nukleinsäuremoleküle können somit erfindungsgemäß verwendet werden, um transgene Pflanzen zu erzeugen, in denen der Gehalt an 9-DES höher oder geringer ist als natürlicherweise, oder in Zelltypen oder Entwicklungsstufen vorliegt, bei denen die 9-DES normalerweise nicht gefunden werden. Dies bewirkt eine Änderung des Gehalts an Divinylethern in diesen Zellen, die wiederum zu C9-Aldehyden bzw. C9- Alkoholen bzw. Estern der C9-Alkohole umgetzt werden können.
- Die Akkumulierung von Divinylethern kann ein vorteilhafter Phenotyp in Pflanzen sein, die für Lebensmittel verwendet werden.
- Für manche Anwendungen kann es nützlich sein, die 9-DES in unterschiedliche zelluläre Kompartimente einzuführen oder deren Sekretion aus der Zelle zu erleichtern. Es ist somit möglich, daß die für 9-DES kodierenden Nukleinsäuremoleküle derart modifiziert sind, daß sie mit geeigneten intrazellulären Target-Sequenzen, wie Transit-Sequenzen (K. Keegstra (1989) Cell 56: 247-253), Signal-Sequenzen und dergleichen ergänzt werden.
- Für manche Anwendungen kann es auch erwünscht sein, die Expression von Nukleinsäuremolekülen zu vermindern oder zu eliminieren, die für 9-DES kodieren. Um dies zu erreichen, kann ein für die Cosuppression der 9-DES entwickeltes Nukleinsäuremolekül durch Verknüpfen eines Gens oder Genfragments, das eine 9-DES kodiert, mit Pflanzenpromotersequenzen, erzeugt werden. Alternativ kann ein Nukleinsäuremolekül, das für die Expression von Antisense-RNA für das gesamte oder einen Teil des vorstehend genannten Nukleinsäuremoleküls entwickelt ist, durch Verbinden des Gens oder Genfragments in reverser Orientierung zu Pflanzenpromotersequenzen erzeugt werden. Sowohl die Gene für die Cosuppression als auch die Antisense-Gene können mittels Transformation in die Pflanzen eingeführt werden, wodurch die Expression der entsprechenden endogenen Gene vermindert oder eliminiert ist.
- Die nachfolgenden Beispiele dienen der Beschreibung der vorliegenden Erfindung, ohne diese in irgendeiner Weise einzuschränken.
- Amplifizierte PCR-Fragmente von cDNA-Sequenzen, die für eine 9-Lipoxygenase aus Solanum tuberosoum kodieren, wurden in den Expressionsvektor QIAexpress pQE 30 (Qiagen, Hilden, Deutschland) hineinligiert und mit Transformation in XL1-Blue-Zellen unter Nutzung des pGEMR-T Easy Vector System II Kits (Promega, Madison, USA) vorkloniert. Anschließend erfolgte die Umklonierung in den Expressionsstamm E.coli SG13009[pREP4].
- Für die Expression der pflanzlichen Lipoxygenase wurde der E.coli-Stamm in LB-Medium bei 37°C bis zu einer optischen Dichte bei 600 nm von 0,6 angezogen. Dann wurde die Kultur auf Eis abgekühlt und die Expression durch Zugabe von 1 mM IPTG induziert. Die Expression erfolgte bei 10°C für 18 Stunden. Schließlich wurden die Bakterien bei 4000 × g abzentrifugiert.
- Von der in der TIGR-Datenbank als EST281141 von Tomate annotierten Sequenz, die als putative AOS annotiert war und mittlerweile als 9-DES kodierende Sequenz bekannt ist, wurden folgende Primer abgeleitet:
scrlesAOS1a (SEQ ID NO: 3):
5'-AAT CCG TCT GAT ACA GTT CTT GGC GC-3'
scrlesAOS1b (SEQ ID NO: 4):
5'-CGA TTT GAC CAA ACT CAT TTT GTT AAT CG-3' - Diese Primer wurden in einer PCR mit cDNA, die aus elicitierten Kartoffelzellkulturen isoliert wurde, eingesetzt. Diese Zellkulturen besaßen zu diesem Zeitpunkt eine erhöhte DES- Aktivität. Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: 2 min bei 94°C; 10 Zyklen 30 s bei 94°C, 45 s bei 51°C, 45 s bei 72°C; 20 Zyklen 30 s bei 94°C, 45 s bei 51°C, 45 s bei 72°C und eine Verlängerung der Inkubationszeit für 3 s/Zyklus; 10 min bei 72°C.
- Das erhaltene cDNA-Fragment aus der Kartoffel war 450 bp lang und wies eine Homologie von über 95% zu der Sequenz EST281141 aus der Tomate auf. Ausgehend von dieser Sequenz wurden folgende homologe Primer für die bzw. 3'RACE-PCR abgeleitet:
StAOS_3RACE (SEQ ID NO: 5):
5'-GCT TCA TCC AAT ATT GAC ACA GCG GAC-3' (5'RACE-PCR)
stAOS_3RACE2 (SEQ ID NO: 6):
5'-GTC CGC TGT GTC AAT ATT GGA TGA AGC-3' (3'RACE-PCR) - Als Matrize wurde eine 5'- bzw. 3'-RACE Ready-cDNA-Bank, hergestellt aus RNA von elicitierten Kartoffelzellkulturen mit Hilfe des SMART RACE-cDNA-Amplifikations-Kits (Clontech, Palo Alto, USA), verwendet. Die PCR-Bedingungen für die 3'-RACE waren wie folgt: 1 min bei 94°C; 10 Zyklen 30 s bei 94°C, 30 s bei 58°C, 2 min bei 72°C; 20 Zyklen 30 s bei 94°C, 30 s bei 55°C, 2 min bei 72°C; 3 min bei 72°C.
- Das erhaltene Fragment war etwa 800 bp lang, und diese Größe entsprach dem erwarteten kompletten 3'-Ende der cDNA des Enzyms. Die 5'-RACE hingegen blieb erfolglos. Aus der Sequenz des 3'-Endes wurde ein Primer für die Klonierung in pQE30 für die anschließende Expression des Enzyms abgeleitet. Dieser Primer StDES3'Hind3 enthielt eine Restriktionsschnittstelle für HindIII:
StDES3'Hind3 (SEQ ID NO: 7):
5'-CCC AAG CTT CTA TTT ACT TGC TTT GGT TAA CG-3' - Da das so isolierte 3'-Ende ebenfalls über 95% Homologie zu der bekannten cDNA der DES aus Tomate zeigte, wurde ein heterologer Primer, der aus der Sequenz von Tomate abgeleitet wurde, für das 5'-Ende mit einer Schnittstelle für BamHI benutzt:
StDES5'BamHI (SEQ ID NO. 8):
5'-GGA TCC ATG TCT TCT TAT TCA GAG CTA TCA AAT C-3' - Die PCR-Bedingungen für das vollständige cDNA-Fragment waren wie folgt: 2 min bei 94°C; 10 Zyklen 30 s bei 94°C, 30 s bei 61°C, 90 s bei 72°C; 20 Zyklen 30 s bei 94°C, 30 s bei 64°C, 90 s bei 72°C + eine Verlängerung der Inkubationszeit für 5 s/Zyklus; 2 min bei 72°C.
- Das erhaltene Fragment wurde in pGEM-T easy zwischenkloniert und aus diesem Vektor mit BamHI und HindIII herausgeschnitten. Das gereinigte Fragment wurde in den vorgeschnittenen Vektor pQE30 ligiert und in E.coli SG13009[pRep4] transformiert.
- Die vollständige cDNA-Sequenz ist in SEQ ID NO: 1 gezeigt, die durch diese DNA-Sequenz kodierte erfindungsgemäße 9-DES aus der Kartoffel ist in SEQ ID NO: 2 gezeigt.
- Zur Expression von pQEstDES in E.coli wurden 400 ml LB-Medium und Kanamycin (25 µg/ml) und Carbenicillin (100 µg/ml) mit 4 ml Übernachtkultur beimpft. Bei 37°C wuchsen die Zellen bis zu einer OD600 = 0,6-0,8 und wurden dann mit IPTG (1 mM Endkonzentration) induziert. Die Expression erfolgte bei 10°C für 24 h.
- Zum Ernten der Zellen wurde die Kultur 15 min zentrifugiert (4500 rpm, 4°C). Das Pellet wurde in 25 ml 50 mM Natriumphosphat, pH 8,0, aufgenommen und vollständig in Lösung gebracht.
- Der Aufschluß der Zellen erfolgte mit Ultraschall (5 × 1 min, mit 30 s Pause) auf Eis. Die Zelltrümmer wurden abzentrifugiert (4000 rpm, 15 min, 4°C) und der Überstand ultrazentrifugiert (37 000 rpm, 1 h, 4°C). Das entstandene Pellet wurde in 10 ml 50 mM Natriumphosphat, pH 8,0, 1 M NaCl, 0,1% Triton gelöst und 1 h auf Eis inkubiert. Nach der zweiten Ultrazentrifugation (30 000 rpm, 1 h, 4°C) wurde der Überstand mit 2 ml Talon (Clontech), einem Co-Affinitätschromatographiematerial (wurde vorher mit 50 mM Natriumphosphat, pH 8,0, 1 M NaCl equilibriert), versetzt und über Nacht bei 4°C geschüttelt.
- Am nächsten Tag wurde diese Lösung auf eine Bakerbond filtration column (T. J. Baker, Philipsburg, USA) gegeben und schrittweise mit 20 ml Natriumphosphat (50 mM, pH 8), 1 M NaCl; 7 ml Natriumphosphat (50 mM, pH 7), 1 M NaCl; 4 ml Natriumphosphat (50 mM, pH 6), 1 M NaCl; 2 ml Natriumphosphat (50 mM, pH 5), 1 M NaCl gewaschen.
- Das Protein wurde mit 2 ml Natriumphosphat (50 mM, pH 4), 1 M NaCl eluiert.
- Die Herstellung von 9-Hydroperoxiden aus Linol(en)säure erfolgte nach dem folgenden Protokoll:
- - Resuspendieren des Bakterienpellets von 2 l Kultur in 30 ml Lysispuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10% (v/v) Glycerin, 0,1% Tween 20, 0,5 M NaCl)
- - Aufschließen der Bakterien durch Ultraschallbehandlung
- - Zentrifugation bei 14 000 × g und Verwerfen des Sedimentes
- - Rühren von 10 ml geklärtem Bakterien-Homogenat mit 20 mg Fettsäure für 30 Minuten bei 4°C
- - Extraktion mit Diethylether
- - Trocknen des Extraktes unter Stickstoff und Aufnehmen in Diethylether : Hexan 93 : 7
- - Aufgeben auf eine Kieselgelsäule und Waschen mit Diethylether : Hexan 93 : 7
- - Elution der LOX-Produkte mit Diethylether : Hexan 80 : 20
- - Berechnung der Ausbeute aus der optischen Dichte bei 234 nm (eine Extinktion von 1 entspricht 12,4 µg Hydroperoxid bei 1 ml Meßvolumen und einer Schichtdicke von 10 mm).
- Die Umsetzung des 9-Hydroperoxids von Linol(en)säure mit rekombinanter DES von Solanum tuberosum zu Colnel(en)säure erfolgte nach dem folgenden Protokoll:
- - Endvolumen des Reaktionsansatzes von 0,5 ml:
0,1 M Na-Phosphat
1 µg gereinigte DES
5 µg des Hydroperoxids - - Reaktion bei Raumtemperatur für 30 Minuten unter Argon
- - Zugabe von 2 ml 1 M HCl
- - Schütteln für 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Argon
- - Extraktion mit Hexan.
- Folgender Reaktionsansatz wurde für Herstellung von C9-Aldehyden aus Colnel(en)säure verwendet:
10 µg Colnel(en)säure in 250 µl MeOH
+ 750 µl 20% HCl. - Zum Nachweis der Aldehyde können diese durch Zugabe von 1 ml Dinitrophenylhydrazin (DNPH) (1 mg in 1 ml 1 N HCl) in die entsprechenden Dinitrophenylhydrazone umgewandelt werden. Diese wurden nach 1 h Schütteln 3 × mit 1 ml Hexan extrahiert. Die vereinigten Hexan-Phasen wurden im Stickstoffstrom eingedampft und in 100 µl Laufmittel A aufgenommen.
Laufmittel A: Acetonitril: H2O (60 : 40, v/v)
Laufmittel B: Acetonitril: H2O (80 : 20, v/v)
Säule: Beckman ODS 250 mm × 2,0 mm
Flussrate: 0,3 ml/min
Injektionsvolumen: 60 µlGradient Zeit (min) % Laufmittel B 0 0 15 0 20 50 33,4 100 43 100 - Reaktionswege der Oxylipin-Biosynthese. Linolensäure und Linolsäure werden durch Lipoxygenase (LOX) in Hydroperoxide umgesetzt. Die Hydroperoxidprodukte werden anschließend durch Allenoxidsynthase (AOS), Hydroperoxidlyase (HPL) und Divinylethersynthase (DES) zu verschiedenen Oxylipin-Intermediaten oder Endprodukten metabolisiert.
- HPLC-Analyse mit Agilent 1000 mit DAD-Detektion bei 380 nm für die Umsetzung von Colnelsäure (siehe Beispiel 7). Der Nachweis erfolgt hier nach Umsetzung mit DNPH zu dem entsprechenden Hydrazon. SEQUENZPROTOKOLL
Claims (29)
1. DNA-Sequenz, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer 9-
Divinylethersynthase aus Solanum tuberosum kodiert.
2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
a) DNA-Sequenzen, die eine Nukleinsäuresequenz umfassen, die die in SEQ ID NO: 2
angegebene Aminosäuresequenz oder Fragmente davon kodieren;
b) DNA-Sequenzen, die die in SEQ ID NO: 1 angegebene Nukleinsäuresequenz oder Teile
davon umfassen;
c) DNA-Sequenzen, die ein Derivat, Analog oder Fragment einer Nukleinsäuresequenz von a)
oder b) darstellen.
3. Rekombinantes Nukleinsäuremolekül, umfassend eine DNA-Sequenz nach
Anspruch 1 oder 2 sowie geeignete Regulations- und/oder Signalsequenzen.
4. Vektor, umfassend ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 3.
5. Mikroorganismus, enthaltend ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach
Anspruch 3 oder einen Vektor nach Anspruch 4.
6. Rekombinantes Protein mit der enzymatischen Aktivität einer 9-
Divinylethersynthase aus Solanum tuberosum.
7. Protein nach Anspruch 6 mit der in SEQ ID NO: 2 angegebenen
Aminosäuresequenz.
8. Verfahren zur Herstellung von C9-Aldehyden bzw. C9-Alkoholen bzw. Estern der
C9-Alkohole aus mehrfach ungesättigten Fettsäuren der Kettenlänge C18, die zumindest
Doppelbindungen an den Positionen Δ9 und Δ12 aufweisen, umfassend die folgenden
Schritte:
a) die Bereitstellung eines Nukleinsäuremoleküls, welches für ein pflanzliches oder
mikrobielles Protein mit der biologischen Aktivität von 9-Lipoxygenase kodiert;
b) die Bereitstellung eines Nukleinsäuremoleküls, welches für ein pflanzliches oder
mikrobielles Protein mit der biologischen Aktivität von 9-Divinylethersynthase
kodiert;
c) die Übertragung der Nukleinsäuremoleküle aus a) und b) auf eukaryontische oder
prokaryontische Zellen, wobei die kodierende Sequenz unter Kontrolle geeigneter
regulatorischer Sequenzen steht,
d) die Expression der rekombinanten 9-Lipoxygenase und 9-Divinylethersynthase in den
Zellen;
e) die Umsetzung der mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit der rekombinanten 9-
Lipoxygenase zu 9-Hydroperoxiden der Fettsäuren;
f) die Umsetzung der 9-Hydroperoxide der Fettsäuren mit 9-Divinylethersynthase zu
Divinylethern;
g) die Umsetzung der Divinylether zu (2E)-C9-Aldehyden;
h) gegebenenfalls die Reduktion der C9-Aldehyde zu C9-Alkoholen;
i) gegebenenfalls die Umsetzung der C9-Alkohole aus Schritt e) mit einer Säure,
insbesondere Essigsäure, zu einem entsprechenden Ester.
9. Verfahren nach Anspruch 8,
dadurch gekennzeichnet, daß die C18-Fettsäuren ausgewählt werden aus der Gruppe,
bestehend aus α-Linolensäure und Linolsäure.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9,
dadurch gekennzeichnet, daß im Anschluß an die Übertragung der Nukleinsäuresequenz auf
pflanzliche Zellen aus den transgenen Zellen vollständige Pflanzen regeneriert werden, die als
Produktionsstätte für Divinylether dienen.
11. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9,
dadurch gekennzeichnet, daß die transformierten Zellen Bakterienzellen, Hefezellen und
Algenzellen umfassen und die Kultivierung der Zellen und die Herstellung der C9-Aldehyde
bzw. C9-Alkohole bzw. Ester der C9-Alkohole in einem Reaktor erfolgt.
12. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9,
dadurch gekennzeichnet, daß transgene Pflanzenzellen kultiviert und als Produktionsstätte
für Divinylether genutzt werden.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12,
dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuresequenz für ein Protein mit der biologischen
Aktivität von 9-Lipoxygenase aus Solanum tuberosum kodiert.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 13,
dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuresequenz für ein Protein mit der biologischen
Aktivität von 9-Divinylethersynthase aus Solanum tuberosum kodiert.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 13,
dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuresequenz für ein Protein mit der biologischen
Aktivität einer 9-Divinylethersynthase aus der Tomate kodiert.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 15,
dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung der Divinylether zu Aldehyden in Schritt g)
durch mildes Ansäuern erfolgt.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 16,
dadurch gekennzeichnet, daß die Reduktion in Schritt h) von Anspruch 8 enzymatisch,
vorzugsweise mit Alkoholdehydrogenase erfolgt.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 16,
dadurch gekennzeichnet, daß die Reduktion in Schritt h) von Anspruch 8 chemisch,
vorzugsweise mit Natriumborhydrid erfolgt.
19. Verfahren zur Herstellung von C9-Aldehyden bzw. C9-Alkoholen bzw. Estern der
C9-Alkohole, umfassend die Umsetzung der folgenden Komponenten:
a) mindestens eine mehrfach ungesättigte C18-Fettsäure, die zumindest
Doppelbindungen an den Positionen Δ9 und Δ12 aufweist;
b) 9-Lipoxygenase;
c) 9-Divinylethersynthase;
d) gegebenenfalls ein Reduktionsmittel; sowie,
e) gegebenenfalls eine Säure, insbesondere Essigsäure.
20. Verfahren nach Anspruch 19,
dadurch gekennzeichnet, daß die C18-Fettsäuren ausgewählt werden aus der Gruppe,
bestehend aus α-Linolensäure und Linolsäure.
21. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20,
dadurch gekennzeichnet, daß eine rekombinante 9-Lipoxygenase aus Solanum tuberosum
verwendet wird.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21,
dadurch gekennzeichnet, daß eine rekombinante 9-Divinylethersynthase aus Solanum
tuberosum verwendet wird.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21,
dadurch gekennzeichnet, daß eine rekombinante 9-Divinylethersynthase aus der Tomate
verwendet wird.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 23,
dadurch gekennzeichnet, daß ein enzymatisches Reduktionsmittel, vorzugsweise eine
Alkoholdehydrogenase verwendet wird.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 23,
dadurch gekennzeichnet, daß ein chemisches Reduktionsmittel, vorzugsweise
Natriumborhydrid verwendet wird.
26. Verwendung von 9-Divinylethersynthase zur Herstellung von C9-Aldehyden
bzw. C9-Alkoholen bzw. Estern der C9-Alkohole.
27. Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzenzellen bzw. transgenen
Pflanzen mit erhöhter Resistenz gegen Bakterien oder Pilze, umfassend die folgenden
Schritte:
a) Herstellung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, das folgende Sequenzen
umfaßt:
- regulatorische Sequenzen eines in Pflanzenzellen aktiven Promotors;
- operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2; und
- optional operativ daran gebunden regulatorische Sequenzen, die als
Transkriptions-, Terminations- und/oder Polyadenylierungssignale in
Pflanzenzellen dienen können;
b) Übertragung des Nukleinsäuremoleküls aus a) auf pflanzliche Zellen; und
c) gegebenenfalls die Regeneration von Pflanzen aus den transformierten
Pflanzenzellen.
28. Transgene Pflanzenzellen, enthaltend ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül
nach Anspruch 3 oder einen Vektor nach Anspruch 4 oder hergestellt nach einem Verfahren
nach Anspruch 27.
29. Transgene Pflanzen, enthaltend eine Pflanzenzelle nach Anspruch 28 oder
hergestellt nach Anspruch 27, sowie Teile dieser Pflanzen, transgene Ernteprodukte und
transgenes Vermehrungsmaterial dieser Pflanzen, wie Protoplasten, Pflanzenzellen, Kalli,
Samen, Knollen, Stecklinge, sowie die transgenen Nachkommen dieser Pflanzen.
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|---|---|---|---|
| DE10129338A DE10129338A1 (de) | 2001-06-19 | 2001-06-19 | Verfahren zur Herstellung von C9-Aldehyden, C9-Alkoholen durch Divinylethersynthase |
| AU2002325247A AU2002325247A1 (en) | 2001-06-19 | 2002-06-18 | Method for producing c9-aldehydes, c9-alcohols by means of divinyl ether synthase |
| PCT/EP2002/006723 WO2002103023A2 (de) | 2001-06-19 | 2002-06-18 | Verfahren zur herstellung von c9-aldehyden, c9-alkoholen durch divinylethersynthase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| DE10129338A Ceased DE10129338A1 (de) | 2001-06-19 | 2001-06-19 | Verfahren zur Herstellung von C9-Aldehyden, C9-Alkoholen durch Divinylethersynthase |
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Non-Patent Citations (1)
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