KR20050043036A

KR20050043036A - α-토코페롤 고 함유 들깨를 생산하는 방법 및 이 방법에의해 생산된 들깨

Info

Publication number: KR20050043036A
Application number: KR1020030077776A
Authority: KR
Inventors: 이병규; 김경환; 이장용; 유승희; 김선림; 김율호; 안병옥; 허한순
Original assignee: 대한민국(관리부서:농촌진흥청)
Priority date: 2003-11-04
Filing date: 2003-11-04
Publication date: 2005-05-11
Also published as: KR100614517B1

Abstract

본 발명은 α-토코페롤 고 함유 들깨의 생산 방법 및 이 방법에 의해 생산된 α-토코페롤 고 함유 들깨에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 들깨 종실내에 다량 함유되어 있는 γ-토코페롤이 비타민 E 활성이 훨씬 큰 α-토코페롤로 전환되어 들깨내의 α-토코페롤의 함량이 증진될 수 있도록 한 아그로박테리움을 이용한 들깨의 형질전환 방법 및 이 방법에 의해 제공되는 들깨에 관한 것이다.

Description

α-토코페롤 고 함유 들깨를 생산하는 방법 및 이 방법에 의해 생산된 들깨{Agrobacterium tumefaciens mediated transformation method for high α-tocopherol perilla and perilla produced by transformation}

들깨는 한국, 중국, 일본 등 아시아 여러 나라에서 재배되고 있는 일년생 초본 식물로서, 여러 가지 유용한 성분이 함유되어 있어 의약작물, 유지작물 및 잎채소로 사용되고 있다. 즉, 들깨의 종실에는 오메가-3 계열의 지방산인 리놀렌산이 다량 함유되어 있어 고혈압, 알레르기성 질환 등의 성인병을 일으키는 에이코사노이드 합성을 억제하고, 학습능력 향상 및 수명 연장 효과 등의 생체 조절 기능이 있는 것으로 알려져 있어 종실자체는 통깨로서 들깨차나 제과용으로 이용되고 있고, 종실로부터 추출한 오일은 식용이나 약제 첨가용, 공업용으로 이용되고 있다. 들깨 잎에는 식물성 정유로서 독특한 향기를 가진 페릴라 알데히드, 리모넨, 페릴라 케톤 등이 함유되어 있어 돼지고기나 생선회를 먹을 때 느끼한 맛이나 비린내를 없애주고 그 독특한 향은 입맛을 돋우어 줄 수 있어 신선 잎채소로 이용되고 있고, 들깨잎의 추출물은 화장품 색소나 향료로 이용되고 있다.

더구나, 최근에는 토코페롤이 심장혈관계 질환 및 암을 예방하고, 면역기능을 보조하며, 노화와 관련된 퇴행성 질환을 예방 및 완화시킬 수 있다고 알려지면서, 이러한 토코페롤의 최대 천연 공급원 중의 하나인 들깨에 대한 수요가 점점 증대되고 있다.

그러나, α-, β-, γ- 및 δ- 토코페롤로 분류되는 토코페롤 중 가장 높은 활성을 나타내는 토코페롤은 α-토코페롤로서 α-토코페롤의 함량에 따라 그 이용성이 결정된다고 할 수 있는데, 대부분의 종유(oilseeds)는 α-토코페롤의 전구체인 γ-토코페롤을 α-토코페롤보다 다량 함유하고 있으며, 들깨도 역시 γ-토코페롤을 α-토코페롤보다 다량 함유하고 있다.

따라서, 들깨에서 α-토코페롤의 함량을 증진시킬 수 있는 방법에 대한 연구가 필요한 실정이지만, 현재 들깨에 대한 연구는 들깨의 생산성을 향상시키는 것에 만 집중되어 있는 것이 현실이며, 아직까지 들깨에서 α-토코페롤의 함량을 증진시키는 방법에 대한 연구보고는 없다.

이에 본 발명자들은 들깨에서 α-토코페롤의 함량을 증진시킬 수 있는 방법을 개발하기 위하여 연구를 하게 되었고, 그 결과 유전자 조합 기술(Genetically Modified Organism)에 의해 α-토코페롤 고함유 들깨를 제조할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 α-토코페롤 고함유 들깨의 제조를 위한 재조합 운반체 pBK I를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 α-토코페롤 고함유 들깨의 제조를 위해 상기 재조합 운반체 pBK I으로 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔　EHA105를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 아그로박데리움 투메파시엔 EHA105를 이용하여 α-토코페롤 고함유 들깨를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 제조방법에 의한 α-토코페롤 고함유 들깨를 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 α-토코페롤 고함유 들깨의 제조방법은 (a)형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔 EHA105와 들깨 식물체의 조직절편을 공동배양하는 단계; (b) 상기 공동배양된 들깨 식물체의 조직절편을 재분화배지에 치상하여 형질전환 슈트의 분화를 유도하는 단계; (c)상기 유도된 형질전환 슈트를 2차 선발배지에 치상한 후, 신장시킨 다음, 뿌리유기배지에서 배양하는 단계; 및 (d) 뿌리가 발단된 들깨 식물체를 자연환경에 이식하여 순화시키는 순화단계를 포함하고, 상기 (b)단계의 재분화배지는 MS 기본 배지에 약 1㎎/ℓ의 6-벤질아미노퓨린, 약 0.1㎎/ℓ의 α-나프탈렌아세트산, 약 3%의 슈크로스, 1~2㎎/ℓ의 포스피노스리신(PPT;phosphinothricin)를 첨가한 것임을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명은 들깨에 다량 함유되어 있는 γ-토코페롤이 α-토코페롤의 생합성 전구체로서, γ-토코페롤 메틸트랜스퍼라제(γ-tochpherol methyltranserase; 이하, 'γ-TMT'라 함)에 의해 γ-토코페롤로 전환될 수 있다는 사실(도 1 참조)에 착안하여, γ-TMT 유전자가 들깨에서 발현되어 들깨의 α-토코페롤의 함량이 증진될 수 있도록 들깨의 형질전환 방법을 개발하고, 아울러, 형질전환을 위한 효과적인 배지의 조성을 선정하는 것에 관한 것이다.

본 발명에 따른 α-토코페롤의 함량이 증진된 들깨의 제조방법은 아그로박테리움법을 이용하여 들깨를 형질전환시키는 것으로, 먼저 형질전환용 재조합 운반체를 제작한다.

재조합 운반체는 아그로박테리움과 함께 들깨 식물체에 도입될 것이므로, 아그로박테리움에서 복제, 발현 및 선발이 가능하고, 들깨 식물체에서 발현 및 선발이 가능하도록 구성된 어떠한 운반체도 사용 가능하다. 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터로 조절되는 bar 유전자를 포함하는 pCAMBIA 3300을 기본벡터로 하여 비실린 프로모터(Vic P; Vicillin promoter), γ-TMT 및 옥토핀 합성효소(OCS; octopine systhase) 유전자를 포함하는 재조합 운반체 pBK I(도 2 참조)을 제작하여 사용할 수 있다.

그 다음, 재조합 운반체 pBK I를 아그로박테리움에 통상의 방법으로 도입한 후, 운반체 pBK I이 도입된 아그로박테리움을 선발하는 것에 의해 아그로박테리움을 형질전환시킨다. 여기서 사용된 아그로박테리움 균주는 당분야에서 통상적으로 사용되고 있는 것을 적의 선정하여 사용할 수 있으나, 본 발명에서는 식물시료에 침투하여 외래 유전자를 전달하는데 필요한 병원성이 크다고 알려진 아그로박테리움 투메파시엔 EHA105(Agrobacterium tumefaciens EHA105)를 사용한다.

아그로박테리움 투메파시엔 EHA105의 형질전환이 완료되면, 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔 EHA105를 들깨 식물체에 도입하여 들깨를 형질전환시킨다. 들깨 식물체의 형질전환 방법은 (a)형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔 EHA105와 들깨 식물체의 조직절편을 공동배양하는 단계; (b) 상기 공동배양된 들깨 식물체의 조직절편을 재분화배지에 치상하여 형질전환 슈트의 분화를 유도하는 단계; (c)상기 유도된 형질전환 슈트를 2차 선발배지에 치상한 후, 신장시킨 다음, 뿌리유기배지에서 배양하는 단계; 및 (d) 뿌리가 발단된 들깨 식물체를 자연환경에 이식하여 순화시키는 순화단계로 이루어진다.

상기 형질전환 방법의 각각의 단계 중 (b)단계에서 사용된 재분화배지는 MS 기본 배지에 BA(6-벤질아미노퓨린) 약 1㎎/ℓ, NAA(α-나프탈렌아세트산) 약 0.1㎎/ℓ 및 약 3%의 슈크로스를 첨가한 배지를 사용하는 것이 재분화 효율이 가장 좋다. 또한, 재분화배지는 비형질전환체의 발생억제를 위해 선발제제로서 포스피노스리신(PPT;phosphinothricin)을 1~2㎎/ℓ의 양으로 함유하는 것이 바람직하다.

(c) 단계의 2차 선발배지로는 약 1㎎/ℓ의 PPT 및 약 500㎎/ℓ의 카르베니실린을 함유하는 MS배지를 사용하고, (d)단계의 뿌리유기 배지로는 약 3%의 슈크로스를 함유하는 MS 배지를 사용한다.

형질전환이 완료되면 들깨 식물체의 형질전환 여부는 PCR 증폭, 노던 블럿 분석법 등으로 확인한다. 또한, 본 발명에서는 바스타(basta) 제초제 내성 유전자인 bar 유전자를 선발표지로 사용하였기 때문에, 제초제 생물 검정 방법에 의해서도 들깨 식물체의 형질전환 여부를 확인할 수 있다.

이상의 방법에 의해 형질 전환된 들깨 식물체의 토코페롤, 지방산 및 지방의 함량 및 조성을 조사한 결과, 토코페롤의 경우에는 기존의 들깨 식물체와 비교하여 α-토코페롤의 함량이 월등히 증가하였으나, 지방산 및 지방의 경우에는 조성 및 함량에 있어서 기존의 들깨 식물체와 큰 차이가 없었다.

따라서, 본 발명에서 제공되는 α-토코페롤 고함유 들깨 식물체는 기존의 섭취량과 동량의 들깨 식물체의 섭취를 통하여 영양학적인 면뿐만 아니라 여러 질병에 대한 치료적인 효과를 나타내는 양의 α-토코페롤의 흡수를 가능하게 할 수 있다.

아울러, 본 발명의 제조방법에서는 형질전환체의 선발표지로 항생제 대신에 PPT만을 사용하기 때문에, 들깨의 소비자들의 항생제에 대한 거부감을 줄일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 들깨 식물체는 제초제에 내성을 나타내기 때문에 들깨 재배시 적용 제초제가 없었던 문제점도 해결할 수 있다.

이하 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명하지만, 본 발명이 이들예로만 한정되는 것은 아니다.

[참조예 1] 시료준비

들깨(엽실) 종자를 70% 에탄올에 1분간 침지하고 멸균수로 3회 세척한 후 2 % 차아염소산나트륨액(50% 유한락스)에 20분 동안 침지한 다음, 멸균수로 3회 세척하였다. 멸균된 여과지를 이용하여 수분을 제거한 후, MS 고체 배지에 파종한 다음, 7~9일 후에 배축을 0.7㎜ 정도의 크기로 절단하여 하기 실험에 사용하였다.

[실시예 1] 들깨의 형질전환을 위한 적정 선발 배지의 선정

(1-1) 호르몬 조성

식물 호르몬의 최적의 조성 및 농도를 결정하기 위하여, 3%의 슈크로스를 함유하는 MS 기본배지에 하기 표 1에서와 같은 조성으로 BA와 NAA를 첨가한 후, 상기 참조예 1에서 준비한 배축을 3주 동안 2차 배양한 다음, 재분화율을 분석하여 그 결과를 표 1에 나타내었다. 한편, 재분화율은 처음 배지에 들개의 배축을 치상한 후, 8주 동안 조사하였으며, 하기 수학식 1에 따라 계산하여 Duncan의 다중검정법에 의해 통계 처리하였다.

조 직	BA와 NAA (mg/ℓ)의 첨가량		재분화율 (%)
조 직	BA	NAA	비정상 슈트	정상 슈트
하배축	1	-	54.3^c	46.6^bc
	1	0.1	66.3^b	57.5^a
	1	3	71.9^a	33.3^d
	3	-	63.5^c	40.7^c
	3	0.1	64.4^b	48.8^b

상기 표 1로부터, 들깨 슈트의 재분화를 위한 가장 바람직한 식물 호르몬의 조성은 1㎎/ℓ의 BA와 0.1㎎/ℓ의 NAA를 함유하는 배지임을 알 수 있다.

(1-2) 슈크로스의 농도

슈크로스는 조직배양에서 주요한 탄소원이고, 삼투압 조절제이다. 따라서, 들깨의 재분화 배지에서 최적의 슈크로스 함량을 결정하기 위하여, 1㎎/ℓ의 BA와 0.1㎎/ℓ의 NAA를 함유하는 MS 배지에 슈크로스를 각각 0, 1%, 3%, 5%（w/v)의 양으로 첨가한 후, 상기 (1-1)에서와 동일한 방법으로 재분화율을 조사하였다.

그 결과, 슈크로스를 함유하지 않는 배지에서는 슈트가 분화되지 않았고, 1% 또는 5%의 슈크로스 첨가배지에서는 슈트의 분화가 억제되었으므로, 약 3%의 슈크로스를 첨가하는 것이 재분화율에서 바람직하다.

[실시예 2] 들깨의 형질전환

(2-1) 재조합 운반체의 제작

기본 벡터인 pCAMBIA 3300(CAMBIA, Centers for the Application of Molecular Biology to International Agriculture)의 폴리 클로닝 부위를 제한효소 Xba I(Bioneer)로 절단한 다음, 비실린 프로모터, γ-토코페롤 메틸트랜스퍼라제 및 옥토핀 합성효소로 이루어진 γ-TMT 카세트(농업생명공학연구원으로부터 입수)를 클로닝 부위에 삽입하여 재조합 운반체 pBK I를 제작하였다. 재조합 운반체 pBK I의 모식도는 도 2에 나타내었다.

(2-2) 아그로박테리움 투멘파시엔 EHA105의 재조합 운반체 pBK I으로의 형질전환

형질전환용 균주로 아그로박테리움 투멘파시엔(Agrobacterium tumefaciens) EHA105(Hellens and Mullineaux P. 2000. Trends in Plant Science 5; 446-450)를 선택하여, 스트렙토마이신을 함유하는 YEP(An, 1987) 배지 5㎖에 상기 균주를 스트리킹 (streaking)하여 28℃에서 하룻밤동안 배양한 다음, 3㎖를 취하여 스트렙토마이신을 함유하는 YEP 액체배지 50mL에 접종하고 28℃에서 250rpm으로 OD₆₀₀이 0.5~1.0이 되도록 진탕 배양하였다. 배양배지를 냉각한 다음, 세포 현탁액을 4℃에서 5분 동안 4,000rpm으로 원심분리하였다. 세포 펠릿을 차가운 20mM의 CaCl₂용액 1㎖에 재현탁시켰다. 현탁액 0.1㎖를 미리 냉각된 에펜도르프 튜브에 넣고, 1㎍의 재조합 운반체 pBK I를 첨가한 다음, 액화질소로 75초 동안 냉각시켰다. 그 다음, 튜브를 37℃의 물수조에서 5분 동안 보관하는 것으로 해동시켰다. 신선한 YEP 배지 1㎖를 상기 튜브에 넣고, 28℃에서 2~4시간 동안 가볍게 진탕 배양하였다.

튜브를 에펜도르프 원심분리기에서 5분 동안 원심 분리하였다. 원심분리 후, 상등액은 버리고, 세포를 0.1㎖의 YEP 액체 배지에 재현탁 시켰다. 세포를 3~5㎍/㎖의 테트라사이클린 및 10~25㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 YEP 한천 플레이트에 치상한 다음, 28℃에서 2~3일 동안 배양하여, 아그로박테리움 투멘파시엔 EHA105의 재조합 벡터 pBK I으로의 형질전환을 완료하였다.

한편, 아그로박테리움 투멘파시엔 EHA105의 형질전환을 확인하기 위하여, 상기 형질전환이 완료된 세포에서 재조합 운반체를 추출한 다음, 제한 효소 XbaI으로 5시간 동안 처리하고, 0.1%의 EtBr을 함유하는 1%의 아가로스 겔에서 전기영동시켰다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3으로부터 형질전환 아그로박테리움 투멘파시엔 EHA105에 pBK I이 형질전환되었음을 알 수 있었다.

(2-3) 형질전환 식물의 확인을 위한 선발제제의 선정 및 농도

형질전환된 식물의 확인을 위한 선발제제로서 카나마이신, 하이그로마이신 과 같은 항생제 및 포스피노스리신(phosphinotricin; PPT)과 같은 물질이 통상적으로 사용되고 있다. 본 발명에서는 선발제제로서 PPT를 사용하였다.

한편, 재분화배지에서 형질전환되지 않는 슈트를 제거하기 위한 PPT의 최적의 농도를 결정하기 위해서, PPT를 하기 표 2의 농도로 0.1㎎/ℓ의 NAA, 1㎎/ℓ의 BA 및 3%의 슈크로스를 함유하는 MS 배지에 첨가한 다음, 자엽, 하배축 및 잎을 25℃의 18시간 광주기 조건하에서 3주 동안 배양하여 유도된 캘러스의 수를 계수하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.

PPT(㎎/ℓ)	캘러스 형성률(%)
PPT(㎎/ℓ)	자엽	하배축	잎
0	100	100	100
0.5	0	13.3	0
1.0	0	0	0
2.0	0	0	0

상기 표 2로부터 재분화배지에서 형질전환되지 않은 슈트를 선발하기 위한 바람직한 PPT 농도는 1㎎/ℓ 이상이라는 것을 알 수 있다.

(2-4) 공동배양

상기 (2-1)의 형질전환된 아그로박테리움 투멘파시엔 EHA105를 3%의 슈크로스를 함유한 MS 액체배지(균주배양액의 1.5배)에 현탁시켰다. 현탁액에 참조예 1에서 준비한 배축을 30동안 침지 감염시킨 후, 멸균된 여과지를 이용하여 현탁액을 제거한 다음, 공동배양배지(3%의 슈크로스 및 0.65%의 한천을 함유하는 MS 배지)에서 3일 동안 25℃의 암상태하에서 공동배양하였다.

(2-5) 선발 및 형질전환 들깨의 재분화

공동배양 후에, 배양된 절편을 재분화 배지(MS 기본배지, 3%의 슈크로스, 1㎎/ℓ의 BA, 0.1㎎/ℓ의 NAA, 0.65%의 한천, 2㎎/ℓ의 PPT, 500㎎/ℓ의 카르베니실린, pH 5.6)에 치상하고, 25℃의 16시간 광주기 조건에서 배양하여 슈트의 분화를 유도하였다. 모든 절편은 3주마다 새로운 배지로 계대 배양하였고, 배양 2개월 후 재분화되는 조직에서 정상적인 형태를 갖춘 슈트만을 절단하여 2차 배지(MS 기본배지, 3%의 슈크로스, 1㎎/ℓ의 PPT, 500㎎/ℓ의 카르베니실린, pH 5.6)에 치상하여 약 3주 동안 배양하였다. 생존한 절편만을 뿌리 유기배지(3%의 슈크로스를 함유하는 MS 기본배지, pH 5.6)에서 4주 동안 배양하였다. 뿌리가 발달된 개체들을 선정한 후, 뿌리에 묻어있는 배지를 잘 세척한 다음, 멸균된 질석(vermiculite)이 담긴 플라스틱 상자(10*10㎝)에 이식하여 3주 동안 순화시킨 다음, 온실로 옮겨서 재배하였다. 각각의 단계별 상태를 도 4에 나타내었다.

(2-6) 형질 전환된 들깨의 확인

(2-6-1) PCR을 이용한 확인

본 발명에서 사용한 운반체 및 유전자가 형질전환 개체에 성공적으로 삽입되었는지 확인하기 위하여 상기 (2-5)의 들깨의 재분화체에서 게놈 DNA를 분리하고 PCR을 수행하였다.

게놈 DNA는 수정된 Sambrook의 방법(Sambrook et al. 1989, Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Press. 362-491)으로 분리하였다. 즉, 재분화체 1.5g을 액화질소로 냉동시킨 다음, 균질화하고, 50㎖의 팔콘 튜브에 넣었다. 그 다음, DNA 분리 완충액(1%(w/v)의 CTAB, 0.35M의 NaCl, 50mM의 Tris-HCl/pH 8.0, 20mM의 EDTA 및 1%의 α-머캡토에탄올)을 첨가하고, 65℃에서 1시간 동안 처리하였다. 페놀/클로로포름/이소아밀알코올(25/24/1) 10㎖를 첨가하고, 실온에서 10분 동안 완만하게 교반한 다음, 10분 동안 7,000rpm으로 원심분리하였다. 원심분리 후, 상등액을 회수한 다음, 동량의 클로로포름/이소아밀알코올(24/1)로 추출하는 과정을 2회 반복하였다.

최종 상등액을 2배 부피의 95% 에탄올로 침전시킨 다음, 게놈 DNA를 분리하여 1.5㎖ 튜브에 옮기고, 70% 에탄올로 세척한 후, 건조한 다음, 500㎕의 증류수에 재현탁하였다. 순수한 RNase(10㎍/㎖)를 상기 현탁액에 첨가한 다음, 65℃에서 30분 동안 처리하였다. DNA 용액을 500㎕의 페놀/클로로포름/이소아밀알코올 (25/24/1)로 반복 추출한 다음, 15,000rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수한 상등액을 2배 부피의 95% 에탄올로 침전시켰다. 시료를 15,000rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상등액은 버리고, 펠렛은 70% 에탄올로 세척한 다음, 건조하였다. 건조된 펠렛을 300㎕의 증류수에 재현탁시킨 다음, 사용전까지 -20℃에서 보관하였다.

PCR 반응 조건은 프라이머는 각각 1μM, 들깨 게놈 DNA는 100ng을 사용하였고, PCR 반응은 95℃에서 5분간 변성 반응시킨 후, 95℃에서 30초간 변성(denaturation), 60℃에서 30 초간 어닐링(annealing), 72℃에서 30초간 중합효소연쇄반응(extension)을 30회 반복하여 수행하였다. 사용한 효소는 Taq polymerase(바이오니아)이며, 사용한 기종은 Perkin Elmer사의 GeneAmp PCR system 9700 이었다.

한편, 상기 PCR 반응에 사용한 프라이머는 각각 다음과 같다.

(A) γ-TMT 유전자 확인용 프라이머(내재 유전자와 구분을 위하여 옥토핀 합성효소(OCS) 터미네이터 유전자 서열을 일부 포함)

Forward: 5'　- CATTACATGCCGAAAACCTGCATCTTAA- 3'(28 mer)

Reverse: 5'　- CACCGAGCGGCGAACTAATAACGTTCA- 3'(27 mer)

B) bar 유전자 확인용 프라이머

Forward : 5'-CTGAAGTCCAGCTGCCAGAAACCCA-3'(25 mer)

Reverse : 5'-TCTGCACCATCGTCAACCACTACAT-3'(25 mer)

PCR 증폭산물을 1% 아가로스-EtBr 겔에서 전기영동한 후, UV로 확인하여 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5도부터, 형질전환 들깨에서는 약 0.5kb 크기의 γ-TMT 해당유전자와 0.5 kbp 크기의 bar 해당 유전자가 발현됨이 확인되었다.

(2-6-2) 노던 블럿 분석을 이용한 확인

유전자의 형질 전환이 확인된 형질전환체에서 γ-TMT 유전자의 발현양상을 확인하기 위해서 노던 블럿 분석을 수행하였다.

즉, 상기 (2-5)의 형질전환 재분화체 및 엽실들깨 식물체의 잎과 화뢰 출현기의 꼬투리, 개화시의 꼬투리, 개화후 20일경 미숙배의 꼬투리로부터 전체 RNA를 분리하고, (α-³²P)dCTP로 표지된 PCR 증폭 γ-TMT 유전자를 이용하여 통상의 방법으로 노던 블럿 분석을 수행하고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6으로부터, 형질전환된 γ-TMT 유전자는 형질전환체의 미숙배 꼬투리에서만 강하게 발현이 되고 있음을 확인할 수 있었다. 따라서, 형질전환 γ-TMT 유전자는 형질전환 들깨의 종실에서 강하여 발현된다는 것을 알 수 있다.

(2-6-3) 생물학적 검정

본 발명의 재조합 운반체에 함유되어 있는 bar 유전자는 바스타 제초제에 내성을 갖는 유전자이므로, 형질전환체에 제초제를 살포하여, 제초제에 내성을 갖는지의 여부를 확인하는 것에 의해 들깨 식물체가 형질전환 되었는지를 확인하였다.

즉, 상기 (2-5)의 형질전환 들깨 식물체 및 엽실 들깨에 0.3%의 바스타를 살포한 다음, 일 주일후, 다시 0.3%의 바스타를 살포하였다. 그 결과, 형질전환 식물체는 바스타에 내성을 갖는 것으로 확인되었다(도 7 참조)

[실시예 3] 형질전환 들깨 종실의 분석

(3-1) 토코페롤 분석

엽실들깨의 종자, 형질전환 T₀ 세대 1주에서 수확한 종자(To-3)의 토코페롤 함량을 수정된 Gimeno 등의 방법(Gimeno et al., 2000, Rapid determination of Vitamin E in vegatable oils by reversed-phase high performance liquid chromatography, J. Chromotogr., 881, 251~254) 및 Kamal-Eldin 등의 방법(Kamal-Eldin et al., 2000, Normal-phase high performance liquid chromatography of tocopherols and tocotrienols., J. Chromotogr., 881, 217-227)으로 분석하였다. 즉, 들깨 종자 2g를 시험관에 넣고, 헥산 5㎖를 첨가한 다음, 혼합한 후, 3시간 동안 방치하였다. 헥산 추출액을 Sep-Pak NH₂ 카트리지를 사용하여 여과한 다음, 60℃에서 30분 동안 건조하였다. 건조한 헥산 추출액을 다시 헥산 2㎖로 희석한 후, 희석액 20㎕를 HPLC에 직접 주입하여 HPLC 분석을 수행하였다. 표준 시료는 시그마사로부터 구입하여 사용하였다. 이동상은 헥산과 에틸아세테이트(70:30)의 혼합물을 사용하였고, 유속은 10㎖/min으로 하였으며, 292nm에서 모니터링하였다. 그 결과를 표 3 및 도 8에 나타내었다.

시료	토코페롤(㎎/100g)			α/γ 비율
시료	α	γ	α+γ	α/γ 비율
엽실들깨 종자(대조구)	9.85(4.52)*	207.88(95.48)	217.73	0.05
T₀-3	192.49(83.86)	37.06(16.14)	229.55	5.19
()*: (α- 또는 γ- 토코페롤 함량/α+γ 토코페롤 함량)×100

표 3 및 도 8로부터, T₀-3 세대의 종자에서는 α-토코페롤의 함량이 엽실들깨보다 매우 향상되었다는 것을 알 수 있었다.

(3-2) 지방산 및 지방의 분석

들깨 종자의 지방산은 라파엘 등의 방법(Rafael et al., 1993, One-step lipid extraction and fatty acid metyl ester preparation from fresh plant tissue, Anal. Biochem. 211, 139-143)에 따라 분석하였고, 지방은 Soxtherm automatic system(Gerhardt, Germany)으로 분석하였다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.

시료	지방산(%)					전체지방(%)
시료	팔미틴산	스테아린산	올레인산	리놀산	리놀렌산	전체지방(%)
엽실들깨	7.2	2.6	13.2	12.2	64.7	47.65
T₀-3	8.3	3.0	11.6	15.2	62.0	48.13

상기 표 4로부터 지방산 및 지방의 조성 및 함량에 있어서는 기존의 엽실들깨와 형질전환 들깨사이에 큰 차이가 없다는 것을 알 수 있었다.

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 들깨의 형질전환 체계가 확인되었기 때문에, γ-TMT 유전자 이외의 새로운 유전자를 도입한 들깨의 형질전환체의 개발이 가능하다.

또한, 본 발명의 방법에서는 형질전환시 선발표지로 제초제 내성을 갖는 bar 유전자를 이용하여 종래 적용 제초제가 별로 없어 들깨 재배시 문제가 되었던 제초의 생력화를 가능하게 한다.

또한, 본 발명에 따른 들깨는 비타민 E 활성이 높은 α-토코페롤의 함량이 기존의 들깨와 비교하였을 때 매우 높으므로, 그 이용성이 크게 증대될 뿐만 아니라 그 부가가치도 높아질 것이며, 이러한 들깨를 이용한 새로운 제품을 개발할 때에도 그 부가가치를 높일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 α-토코페롤 고 함유 들깨 식물체는 다른 품종에 이러한 형질을 도입하는데 육종 모본으로도 이용될 수 있을 것이다.

도 1은 γ-토코페롤 메틸트랜스퍼라제(γ-tocopherol metyltransferase; γ-TMT) 효소의 기능을 나타내는 도면이다.

도 2는 γ-TMT 유전자의 형질전환을 위한 재조합 운반체 pBK I의 모식도이다.

도 3은 아그로박테리움 투메파시엔 EHA105 균주에서 pBK I의 존재를 확인하기 위한 전기영동 사진이다.

도 4는 본 발명에 따른 방법의 각각의 단계를 나타내는 사진이다.

<도면 부호에 대한 간단한 설명>

A: 공동배양 B: 재분화체 발생(3주)

C: 재분화체 발생(4주) D: 재분화체 발생(5~6주)

E: 재분화체 생장(7~9주)

F: 2차 배지에서 재분화체의 신장생장(8~10주)

G: 뿌리 발육(9~12주)

H: 순화처리(13~15주) I: 온실생육 (16주 이상)

도 5는 본 발명에 따른 형질전환 들깨의 PCR 증폭 결과를 나타내는 사진이다.

<도면 부호에 대한 간단한 설명>

L1: 1kb 마커 L2: pBK I 플라스미드

L3: 비형질전환체(엽실들깨) L4~L10: 형질전환체

도 6은 형질전환 γ-TMT 유전자의 발현 양상을 확인하기 위하여 노던 블럿 분석을 수행한 결과로, 상부는 EtBr로 염색된 RNA이고, 하부는 노던 블럿 분석 결과이다.

<도면 부호에 대한 간단한 설명>

L1: 형질전환체의 미숙배의 꼬투리

L2: 형질전환체의 꽃을 형성한 꼬투리

L3: 형질전환체의 화뢰 출현기의 꼬투리

L4: 형질전환체의 잎

L5: 비형질전환체의 미숙배의 꼬투리

L6: 비형질전환체의 꽃을 형성한 꼬투리

L7: 비형질전환체의 화뢰출현기의 꼬투리

L8: 비형질전환체의 잎

도 7은 본 발명의 형질전환체가 제초제에 내성을 갖는지의 여부를 검정한 결과이다.

도 8은 본 발명의 형질전환 들깨의 종자와 비형질전환 들깨(엽실들깨)의 종자의 토코페롤 함량의 HPLC 분석결과이다.

Claims

비실린 프로모터(Vic P; Vicillin promoter)로 조절되는 γ-TMT 유전자를 포함하는 재조합 운반체 pBK I.
청구항 1의 재조합 운반체 pBK I으로 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔(Agrobacterium tumefaciens) EHA105.
(a) 청구항 2의 아그로박테리움 투메파시엔 EHA105와 들깨 식물체의 조직절편을 공동배양하는 단계;

(b) 상기 공동배양된 들깨 식물체의 조직절편을 재분화배지에 치상하여 형질전환 슈트의 분화를 유도하는 단계;

(c) 상기 유도된 형질전환 슈트를 2차 선발배지에 치상한 후, 신장시킨 다음, 뿌리유기배지에서 배양하는 단계; 및

(d) 뿌리가 발단된 들깨 식물체를 자연환경에 이식하여 순화시키는 순화단계 를 포함하고,

상기 (b)단계의 재분화배지는 MS 기본 배지에 약 1㎎/ℓ의 6-벤질아미노퓨린, 약 0.1㎎/ℓ의 α-나프탈렌아세트산, 약 3%의 슈크로스, 1~2㎎/ℓ의 포스피노스리신(PPT;phosphinothricin)를 첨가한 것임을 특징으로 하는 α-토코페롤 고함유 들깨의 제조방법.
제 3항에 있어서,

상기 (c) 단계의 2차 선발배지는 약 1㎎/ℓ의 PPT 및 약 500㎎/ℓ의 카르베니실린을 함유하는 MS배지임을 특징으로 하는 α-토코페롤 고 함유 들깨의 제조방법.
제 3항에 있어서,

상기 (d)단계의 뿌리유기 배지는 약 3%의 슈크로스를 함유하는 MS 배지임을 특징으로 하는 α-토코페롤 고함유 들깨의 제조 방법.
제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 α-토코페롤 고함유 들깨 식물체 또는 종자.