CN113061614A

CN113061614A - 番茄SlWRKY35基因在提高番茄类胡萝卜素类化合物或/和叶绿素含量中的应用

Info

Publication number: CN113061614A
Application number: CN202110342002.9A
Authority: CN
Inventors: 张阳; 袁勇; 任思彦; 吴钰
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2021-03-30
Filing date: 2021-03-30
Publication date: 2021-07-02
Anticipated expiration: 2041-03-30
Also published as: CN113061614B

Abstract

本发明公开了番茄SlWRKY35基因在提高番茄类胡萝卜素类化合物或/和叶绿素含量中的应用，通过在番茄中，以组成型启动子35S驱动的SlWRKY35转录因子基因过量表达，提高了番茄叶片中叶绿素的含量；以果实特异性启动子E8驱动的SlWRKY35转录因子基因过量表达，提高了番茄果实中类胡萝卜素类化合物的含量；本发明还将SlWRKY35基因过量表达株系与SlLCYE基因过量表达株系互为亲本进行杂交，能够进一步提高番茄果实中叶黄素化合物的含量。因此，番茄SlWRKY35转录因子基因可应用于番茄类胡萝卜素类化合物的合成生物学研究和遗传育种品质改良。

Description

番茄SlWRKY35基因在提高番茄类胡萝卜素类化合物或/和叶绿素含量中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及番茄SlWRKY35转录因子的应用，还涉及提高番茄类胡萝卜素、叶绿素或叶黄素的方法。

背景技术

类胡萝卜素类化合物以及叶绿素都隶属于植物重要的次生代谢产物家族—萜类。萜类代谢途径是植物中最重要的次生代谢途径之一，对植物的生长发育、抗病抗逆、以及果实品质等各个方面都具有重要影响。异戊二烯焦磷酸是(Isopetenyl pyrophosphate,IPP)是许多类固醇化合物和萜类化合物的前体物质，主要由两条途径产生：一条是以乙酰辅酶A为原料，在胞质中进行的甲羟戊酸途径(Mevalonate pathway,MVA)；另一条是以丙酮酸和3-磷酸甘油醛为原料，在质体中进行的2-甲基赤藓糖醇-4-磷酸途径(2-MethylErythritol-4-Phosphate pathway, MEP)。IPP经过一系列连续的酶催化反应，生成类胡萝卜素类化合物的关键中间体——牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(Geranylgeranylpyrophosphate,GGPP)，参与植物的生长发育和次生代谢等重要过程。

类胡萝卜素(Carotenoids)是由质体中进行的MEP途径合成的重要的脂溶性抗氧化剂之一，是一个庞大的类异戊二烯家族，大部分都是由八氢番茄红素衍生而来的C₄₀四萜类化合物。自然界中的类胡萝卜素有超过700多种，构成了许多蔬菜、水果、和花卉特有的颜色，并且是许多鱼类、甲壳类、和鸟类等动物色素沉着组织的膳食来源。同时，某些特定的类胡萝卜素是哺乳动物合成维生素A的前体物质，人体和动物不能直接合成，只能从食物中摄取，而由维生素A缺乏引起的健康问题仍然是全球关注的焦点。

类胡萝卜素是一类对动物和植物的生长发育都必不可少的天然色素。番茄中的类胡萝卜素合成同时受到1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphatesynthase， DXS1)和八氢番茄红素合成酶(Phytoene synthase,PSY)的共同影响，DXS1是MEP途径的第一个关键酶，主要控制质体中类异戊二烯前体化合物的合成。PSY1是类胡萝卜素合成途径的第一个关键酶，将2分子GGPP催化聚合生成八氢番茄红素(Phytoene)，八氢番茄红素进一步在八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase,PDS)和ζ-胡萝卜素脱氢酶(ζ-carotene desaturase,ZDS)的作用下生成15-cis-番茄红素异构体，类胡萝卜素顺反异构酶(carotene isomerase，CRTISO)则将15-cis-番茄红素异构化生成番茄红素(Lycopene)。番茄红素具有两条代谢支路：一条支路是首先在β-环化酶(LCYB)的催化下生成γ-胡萝卜素和β-胡萝卜素，再经过玉米黄质和新黄质等中间体，最后参与ABA代谢合成，与植物的生长发育和抗逆有关。而另一条支路则是在ε-环化酶(ε-carotene cyclase,LCYE)的催化下首先生成δ-胡萝卜素，随后再经过β-环化酶(β-carotene cyclase,LCYB)的作用生成α-胡萝卜素，再依次通过β- 环羟化酶(β-ring hydroxylase,HYDB)和ε-环羟化酶(ε-ring hydroxylase,HYDE)的作用，经过两步连续的羟化反应，最后生成叶黄素。

叶黄素(3,3’-二羟基-α-胡萝卜素)是α-胡萝卜素的衍生物，具有维生素A活性，人体和动物不能直接合成，只能从膳食摄取。叶黄素被称为天然抗氧化剂，不仅能够淬灭单线态氧、捕获氧自由基从而防止生物膜损伤，还能作为光捕获复合物的关键成分参与光合系统，对光保护、光形态发生、脂质过氧化反应、非光化学淬灭等过程具有重要作用。同时，叶黄素还是人眼黄斑区域中仅有的2种类胡萝卜素之一，具有蓝光过滤和抗氧化损伤的功能，从而对视网膜具有保护作用。进一步的医学研究表明，叶黄素还具有预防癌症和心血管疾病、预防老年性黄斑区病变、免疫调节等功能，其相关制品已广泛应用于医药、食品、保健品、化妆品和饲料等领域。

叶绿素是一类存在于植物类囊体膜上的含脂的色素家族，不溶于水，易溶于有机溶剂。高等植物中的叶绿素主要包括叶绿素a和叶绿素b两种。叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，它们通过吸收光能和驱动电子转移促进光合作用的发生，将吸收的CO₂转化成化学能储存在植物体内并释放出O₂，从而对植物的生长发育和维持生态平衡具有重要作用。植物体内叶绿素的合成主要来源于糖酵解途径的3-磷酸-甘油酸，作为MEP途径的旁路，植物体内叶绿素的含量同时受到MEP途径相关基因表达和相关前体化合物代谢调控的影响。

综上所述，以番茄为植物底盘的合成生物学应用研究，具有生长周期短、稳定高产、不受地域和气候限制、温室种植节约土地等优点。以现代生物技术手段提高番茄中类胡萝卜素/ 叶黄素的含量，具有广泛的市场价值和应用前景。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供过表达番茄SlWRKY35基因在提高番茄类胡萝卜素类化合物或/和叶绿素含量中的应用；本发明的目的之二在于提供在番茄植株中过表达 SlWRKY35基因在提高番茄叶片叶绿素含量的方法；本发明的目的之三在于提供同时过表达番茄SlWRKY35基因和番茄SlLCYE基因在提高番茄果实中叶黄素含量的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、过表达番茄SlWRKY35基因在提高番茄类胡萝卜素类化合物或/和叶绿素含量中的应用，所述番茄SlWRKY35基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

优选的，所述番茄SlWRKY35基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

优选的，所述类胡萝卜素类化合物为八氢番茄红素(Phytoene)、番茄红素(Lycopene)、α-胡萝卜素(α-Carotene)、β-胡萝卜素(β-Carotene)、γ-胡萝卜素(γ-Carotene)、叶黄素(Lutein)、玉米黄质(Zeaxanthin)、α-隐黄质(α-Cryptoxanthin)、β-隐黄质(β-Cryptoxanthin)、新黄质 (Neoxanthin)、紫黄质(Violaxanthin)或花药黄质(Antheraxanthin)。

优选的，所述过表达SlWRKY35基因的启动子为E8果实特异型启动子。

2、在番茄植株中过表达SlWRKY35基因在提高番茄叶片叶绿素含量的方法，所述番茄 SlWRKY35基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

优选的，所述番茄SlWRKY35基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

优选的，所述叶绿素为叶绿素a或叶绿素b。

优选的，所述过表达SlWRKY35基因的启动子为35S组成型启动子。

3、同时过表达番茄SlWRKY35基因和番茄SlLCYE基因在提高番茄果实中叶黄素含量的应用，所述番茄SlWRKY35基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述番茄SlLCYE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

优选的，所述同时过表达番茄SlWRKY35基因和番茄SlLCYE基因的方法是将过表达SlWRKY35基因的番茄品系和过表达SlLCYE基因的番茄品系分别作为亲本进行杂交，收集F₀代杂交种子继续播种，经过一代自交后采集F₂代纯合株系的番茄果实进行叶黄素含量测定。

优选的，所述过表达番茄SlWRKY35基因的品系由以下方法：构建过量表达SlWRKY35 基因的植物表达载体，通过农杆菌EHA105介导转化番茄，筛选阳性再生植株，获得过表达番茄SlWRKY35基因的品系。

优选的，所述植物表达载体中SlWRKY35基因由组成型启动子35S或果实特异性启动子 E8驱动表达。

本发明的有益效果在于：本发明公开了番茄SlWRKY35基因在提高番茄类胡萝卜素类化合物或叶绿素含量的方法，以及番茄SlWRKY35基因在进一步提高番茄果实中叶黄素含量的应用。研究发现SlWRKY35转录因子基因能够激活类胡萝卜素类化合物合成途径相关基因，从而显著提高下游途径类胡萝卜素类化合物的含量。在番茄果实中过量表达SlWRKY35基因，能够显著提高番茄果实中类胡萝卜素类化合物的含量；在番茄植株中过量表达SlWRKY35基因，能够显著提高番茄叶片中叶绿素的含量；利用过量表达SlWRKY35转录因子基因的番茄株系与过量表达SlLCYE基因的番茄株系进行杂交，能够进一步提高番茄果实中叶黄素的含量。所述SlWRKY35转录因子对于合成生物学应用研究和遗传育种品质改良具有重要的指导意义，对于番茄类胡萝卜素类化合物的合成生物学研究和遗传育种品质改良具有重要的指导意义和广阔的市场前景。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为本发明通过实时荧光定量PCR检测番茄植物中SlWRKY35基因和DXS1基因的表达情况(A：叶片；B：果实；WT：MicroTom；pBin19-35S-SlWRKY35：表示由35S启动子驱动的SlWRKY35基因过量表达番茄品系；pBin19-E8-SlWRKY35：表示由E8启动子驱动的SlWRKY35基因过量表达番茄品系)。

图2为本发明通过透射电镜(TEM)观察的番茄叶片和果皮细胞中的质体表型(A：叶片；B：果实；WT：MicroTom；pBin19-35S-SlWRKY35-leaf：表示由35S启动子驱动的 SlWRKY35基因过量表达番茄叶片；pBin19-E8-SlWRKY35-fruit：表示由E8启动子驱动的 SlWRKY35基因过量表达番茄果皮)。

图3为本发明测定的SlWRKY35转录因子基因过量表达株系番茄叶片中的叶绿素化合物含量(A：番茄叶片叶绿素提取；B：叶绿素含量统计；WT：MicroTom；pBin19-35S-SlWRKY35：表示由35S启动子驱动的SlWRKY35基因过量表达番茄品系)。

图4为本发明通过LC-MS/MS测定的SlWRKY35转录因子基因过量表达株系番茄果实中的类胡萝卜素类化合物含量(A：Br+10时期的番茄果实；B：类胡萝卜素类化合物含量统计；WT：MicroTom；pBin19-E8-SlWRKY35：表示由果实特异型启动子E8驱动的SlWRKY35 基因过量表达番茄品系)。

图5为本发明获得的类胡萝卜素/叶黄素含量丰富的番茄新品系(A：不同品系Br+10时期的番茄果实；B：叶黄素含量统计；MicroTom：野生型番茄；E8-WRKY35：表示E8启动子驱动的SlWRKY35基因过量表达番茄品系；E8-SlLCYE：表示E8启动子驱动的SlLCYE 基因过量表达番茄品系；F1-E8-WRKY35 x E8-SlLCYE：表示以E8-WRKY35为母本，以 E8-SlLCYE为父本的杂交番茄新品系；F1-E8-SlLCYE x E8-SlWRKY35：表示以E8-SlLCYE 为母本，以E8-SlWRKY35为父本的杂交番茄新品系)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1、番茄SlWRKY35基因克隆

参考植物RNA提取试剂盒v1.5(BIOFIT)的方法，提取番茄果实的总RNA，随后进行琼脂糖凝胶电泳检测，以确保RNA质量，然后通过NanoDrop 2,000测定RNA浓度。

进一步，参考反转录试剂盒(PrimeScriptTM RT regent kit,TaKaRa)描述的方法，将番茄果实总RNA(1μg)反转录成第一链cDNA。根据SlWRKY35基因序列设计PCR扩增引物，引物序列见表1。

表1、番茄SlWRKY35基因克隆引物

引物名称	引物序列(5’-3’)
		SlWRKY35-F	atggagaataataattatcaaggtgat(SEQ ID NO.1)
SlWRKY35-R	ttataatgtgtcggtcttgttgttgctg(SEQ ID NO.2)

以获得的cDNA为模板进行PCR扩增，程序为：95℃预变性3min；95℃变性20s，52℃退火20s，72℃延伸30s，重复32个循环；72℃终延伸5min；保温16℃。将PCR扩增产物进行胶回收纯化并测序，获得番茄SlWRKY35转录因子基因。测序结果显示，获得的 SlWRKY35转录因子基因全长1,146bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述获得的 SlWRKY35转录因子基因编码381个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

实施例2、番茄SlWRKY35基因植物表达载体构建

为进一步研究番茄SlWRKY35转录因子基因在类胡萝卜素类化合物代谢调控中的功能，本发明通过

Technology技术分别构建了以组成型启动子35S驱动的pBin19-35S-GW 载体和果实特异性启动子E8驱动的pBin19-E8-GW载体(SY Ying,M Su,etal.Trichome regulator SlMIXTA-like directly manipulates primary metabolism intomato fruit,[J].Plant Biotechnology Journal(2019),pp.1–10.)。载体构建中，首先以含有SlWRKY35转录因子基因的载体为模板，以含有attB同源臂序列的引物进行PCR扩增(引物序列见表2)，将PCR产物进行胶回收纯化后再通过BP反应导入pDONR207载体并测序，最后通过LR反应分别导入pBin19-35S-GW和pBin19-E8-GW植物表达载体。

表2.pDONR207-SlWRKY35载体构建引物

进一步，获得的含有番茄SlWRKY35转录因子基因的pBin19-35S-GW和pBin19-E8-GW 植物表达载体可以进行番茄稳定遗传转化，SlWRKY35转录因子基因能够激活MEP途径第一个关键酶基因DXS1，促进底物代谢能量流，从而提高番茄叶片中叶绿素含量和番茄果实中类胡萝卜素类化合物含量。

实施例3、根癌农杆菌介导的番茄稳定遗传转化

将所述获得的含有SlWRKY35的pBin19-35S-GW和pBin19-E8-GW植物表达载体分别导入根癌农杆菌EHA105，用于浸染番茄。具体步骤如下：

a.培养无菌苗：挑选成熟饱满的MicroTom番茄种子用灭菌ddH₂O浸泡大约3～4h，倒掉水加入75％酒精消毒45s；加入10％NaClO消毒15min(注意避光)；消毒结束用无菌水洗5～6次，并用移液器吸出残留水分；用镊子将种子小心均匀平铺至1/2MS萌发培养基上，放置光照组培箱养中培养12～15天，待番茄幼苗两片子叶完全展开(未长出真叶)，即为最佳的切苗时期；

b.切苗：将番茄无菌苗平铺至含有切苗液的MS液体培养基中，用眼科剪将番茄子叶切成大约0.5cm的小段，然后平铺至MS预培养固体培养基中，避光培养1天；

c.浸染：将含有SlWRKY35转录因子基因的植物表达载体通过电转化的方法分别导入根癌农杆菌EHA105，挑取阳性菌落先小摇2天，然后在YEB液体培养基中扩大培养至 OD₆₀₀＝0.6～0.8，4,500rpm，4℃离心5min收集菌体，然后用含有200μM AS的MS液体培养基重悬菌体，于28℃复苏2h后将番茄子叶放入浸染液中浸染15min。随后将浸染过的番茄子叶均匀平铺在MS共培养基中，于25℃光照培养箱中共培养2天(弱光)；

d.愈伤组织诱导：将共培养之后的番茄叶片转移至含有农杆菌抑制剂特美汀和相应抗性筛选压的MS固体培养基中，在光照培养箱中正常培养，每隔两周换一次培养基，诱导愈伤组织；

e.不定芽再生：待愈伤组织将长出约1cm左右的不定芽时，转移至培养瓶中继续培养 (保证充足的生长空间)，直至长出丛生芽；

f.生根：待丛生芽长成完整植株，从茎端底部小心切除多余的愈伤组织，转入含有IAA (1mg/L)的MS生根培养基进行培养，直至生根；

g.炼苗及移栽：待番茄幼苗完成生根，用镊子夹住轻轻取出，小心洗去根部残留的培养基，在1/3开口的组培瓶中炼苗1天，用ddH₂O覆盖幼苗根部防止失水，随后移栽至营养土中正常培养(注意封保鲜膜)，待植物长势健壮之后，揭开保鲜膜按温室条件正常培养。

最后，通过PCR鉴定T₀代阳性植物(鉴定引物见表3)，并继续自交一代获得T₁代阳性植物，用于后续实验和相关化合物含量测定。

表3、PCR鉴定引物

引物名称	引物序列(5’-3’)
		pE8-Seq-F	caacctccatgccacttgtccaattg(SEQ ID NO.7)
p35S-Seq-F	gagcatcgtggaaaaagaagacgttc(SEQ ID NO.8)
		SlWRKY35-Seq-R	gtttgctggtgctgctgctggtatac(SEQ ID NO.9)

然后通过荧光定量PCR番茄植物中SlWRKY35基因表达情况，检测引物如表4。

表4、qPCR鉴定引物

引物名称	引物序列(5’-3’)
		qPCR-SlWRKY35-F	tcctcaatcacaaaccgataca(SEQ ID NO.10)
qPCR-SlWRKY35-R	tcagccacctcttcttttactt(SEQ ID NO.11)
		qPCR-DXS1-F	gaaggctctataggaggatttg(SEQ ID NO.12)
qPCR-DXS1-R	gcttgctcgatatagttgtcag(SEQ ID NO.13)

检测结果如图1所示。结果显示，在转基因株系番茄叶片和果实中SlWRKY35基因表达量显著增加，表明超量表达构建成功，并且番茄叶片和果实中DXS1基因的表达量也显著上调，说明SlWRKY35转录因子基因能够激活DXS1基因的表达。

实施例4、透射电镜(TEM)观察质体表型

分别采集pBin19-35S-SlWRKY35转基因系的叶片和pBin19-E8-SlWRKY35绿熟期果实的外果皮为研究材料，以相应野生型MicroTom材料为对照，通过透射电镜(TEM)观察质体表型。样品前处理操作过程简单描述如下：

进一步，将采集好的样品首先用含有3％戊二醛的0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.2)固定4h，随后用0.1M磷酸盐缓冲液洗三次，每次15min。样品继续用含有1％OsO₄(四氧化锇)的0.1M磷酸盐缓冲液再固定，用丙酮逐级脱水，脱水剂浓度梯度为30％→50％→70％→80％→ 90％→95％→100％(在100％浓度中换3次)。将脱完水的样品先后经过脱水剂和环氧树脂渗透液，比例分别为3:1、1:1、1:3，每步30～60min。将渗透好的样品放到适当模具中，灌上包埋液包埋，再经过加温聚合形成一种固体基质(包埋块)。采用超薄切片机制备约50nm厚的超薄切片后，漂浮于刀槽液面上，再捞至碳膜铜网。切片先用醋酸铀染色10～15min，再用柠檬酸铅染色1～2min，上述操作均在室温下进行。最后通过JEM-1400PLUS透射电镜观察质体形态，结果如图2所示。结果显示，在过量表达SlWRKY35基因的番茄叶片和果皮中，质体的体积和形态发生明显变化，并且质体的数量显著增加。

实施例5、番茄叶片叶绿素化合物提取与检测

分别采取pBin19-35S-SlWRKY35转基因系和McroTom野生型番茄花苞期幼苗第5片真叶约10mg于2mL EP管中，加入1mL 80％丙酮于4℃过夜提取，实验过程中分别设置3 个生物学重复和3个技术重复。各取100μL提取液于96孔板中，通过多功能酶标仪测定A663 和A645的最大光吸收值，并根据以下公式分别计算不同样品中叶绿素a、叶绿素b以及总叶绿素的含量：

Chlorophyll a＝12.7(A663)-2.69(A645)

Chlorophyll b＝22.9(A645)-4.48(A663)

Chlorophyll＝Chlorophyll a+Chlorophyll b

结果如图3所示。结果显示，以组成型启动子35S驱动的SlWRKY35转录因子基因过量表达，显著提高了番茄叶片中叶绿素的含量。

实施例6、通过LC-MS/MS测定番茄果实类胡萝卜素类化合物含量

类胡萝卜素类化合物在植物体中属于次级代谢物，液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)能够满足类胡萝卜素类化合物准确定性和定量的要求。类胡萝卜素类化合物为脂溶性化合物，见光易分解，提取过程中应注意严格的避光操作，其分析流程简单描述如下：

(1)类胡萝卜素类化合物提取

a.取出于-80℃低温保存的冻干样品，用球磨仪研磨(50Hz,1min)至粉末状；

b.每个样品称取50mg，加入适量内标，用含0.01％BHT(g/mL)的正己烷/丙酮/乙醇(1:1:2，v/v/v)混合溶液进行提取；

c.在室温条件下，用涡旋振荡器涡旋20min，离心取上清，重复提取三次；

d.将上清提取液用浓缩仪浓缩，然后用甲醇/甲基叔丁基醚(3:1,v/v)混合溶液复溶，过 0.22μm有机滤膜后于棕色瓶中保存，用于LC-MS/MS分析。

(2)色谱质谱采集条件

类胡萝卜素类化合物检测与数据采集系统主要包括：超高效液相色谱(UltraPerformance Liquid Chromatography,UPLC)(ExionLC^TM AD,https://sciex.com.cn/)和串联质谱(Tandem Mass Spectrometry,MS/MS)(

6500+,https://sciex.com.cn/)。

液相色谱主要条件包括：

a.色谱柱：YMC(3μm,100mm×2.0mm i.d.)；

b.流动相：A相，乙腈/甲醇(3:1,v/v)混合溶液中加入0.01％BHT和0.1％甲酸；B相，甲基叔丁基醚加入0.01％BHT；

c.梯度洗脱程序：0min A/B为100:0(v/v)，3min A/B为100:0(v/v)，5min A/B为30:70 (v/v)，9min A/B为5:95(v/v),10min A/B为100:0(v/v)，11min A/B为100:0(v/v)；

d.流速0.8mL/min；柱温28℃；进样量2μL。

质谱主要条件包括：

大气压化学离子源(Atmospheric Pressure Chemical Iosziaa-lion,APCI)温度350℃，气帘气(Curtain Gas,CUR)25psi。在Q-Trap 6500+中，每个离子对是根据优化的去簇电压 (Declustering Potential,DP)和碰撞能(Collision Energy,CE)进行扫描检测。

检测结果如图4所示。结果显示，以果实特异性启动子E8驱动的SlWRKY35转录因子基因过量表达，显著提高了番茄果实中类胡萝卜素类化合物的含量。

实施例7、类胡萝卜素/叶黄素含量丰富的番茄新品系

在番茄中过量表达SlWRKY35转录因子基因，获得富含类胡萝卜素类化合物的番茄品系。另外的，在番茄中过量表达SlLCYE基因，获得富含叶黄素的番茄品系；所述核苷酸序列如 SEQ ID NO.14所示。所述由果实特异型启动子E8驱动的SlLCYE基因过量表达的植物表达载体和载体构建方法如实施例2所示，所述SlLCYE基因过量表达的转基因方法如实施例3 所示。

番茄SlWRKY35转录因子在提高叶黄素含量中的应用：具体是将富含类胡萝卜素类化合物的SlWRKY35基因过量表达品系和富含叶黄素的SlLCYE基因过量表达品系分别作为亲本进行杂交，进一步提高番茄中的叶黄素含量。

杂交的方法如下：以过量表达SlWRKY35转录因子基因的植株作为母本，待花苞期去除雄蕊，以过量表达SlLCYE基因的植株作为父本，采集盛花期的花粉人工授粉至柱头，每隔三天授粉一次，共授粉三次。同样的，以过量表达SlLCYE基因的植株作为母本，以过量表达SlWRKY35转录因子基因的植株作为父本，再次通过同样的方法进行杂交。将收集的F₀代杂交种子继续播种，经过一代自交后采集F₂代纯合株系番茄果实进行叶黄素含量测定。

结果如图5所示。结果显示，在番茄果实中同时过量表达SlWRKY35和SlLCYE基因能够进一步提高叶黄素的含量：只单独过量表达SlLCYE基因的番茄果实中，其叶黄素含量从MicroTom中约28.5μg/g(DW)提高到了约290.0μg/g(DW)，而在同时过量表达SlWRKY35 和SlLCYE基因的不同杂交系番茄果实中，其叶黄素含量分别提高到了约347.6μg/g(DW) 和422.6μg/g(DW)。

上述结果表明，SlWRKY35转录因子基因在番茄植株中的过量表达，能够直接激活质体中MEP途径第一个关键酶基因DXS1的表达，通过促进MEP途径萜类化合物底物代谢能量流，从而显著提高番茄叶片中的叶绿素以及果实中的类胡萝卜素类化合物的含量。进一步将 SlWRKY35转录因子基因应用于以番茄为底盘的叶黄素生物合成，获得了富含叶黄素的番茄新品系。SlWRKY35转录因子的功能研究，对于番茄类胡萝卜素类化合物的合成生物学研究和遗传育种品质改良具有重要的指导意义和广阔的市场前景。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 四川大学

<120> 番茄SlWRKY35基因在提高番茄类胡萝卜素类化合物或/和叶绿素含量中的应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggagaata ataattatca aggtgat 27

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttataatgtg tcggtcttgt tgttgctg 28

<210> 3

<211> 1146

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 3

atggagaata ataattatca aggtgattta gctgatatat tccgaggtgg aaataacaat 60

acaacttccg gtgaatcatc atcaactaat aatacgatta ttcctattcc tgacgggtgg 120

acgcagctcc cttattccgc tactgaagaa ccaacatgtg ttcaagattt tggagatccg 180

ttttgtaact tgagagatcc actctttcat gatcttgata tgttgcaggc cacacctact 240

gaagataata ataataatag tgttttcgga gattcgagaa aacgaggcaa taatatgttt 300

tcaaggatgc ttcagatctc tcctacaaac aagttggcta tgtcagtaca aaatcatgat 360

gctatgaatt catcaaaaac ttgctcaata caaaactctg ccttacagat ctcatctccg 420

cgaaatacgg gtatcaaaag aagaaagagt caggcgaaaa aagtggtgtg tataccagca 480

gcagcaccag caaacagccg gcaaggggga gaagttgttc catctgattt atgggcatgg 540

agaaagtatg gtcagaagcc aatcaaaggc tccccttacc caaggggtta ctataggtgc 600

agtagttcaa agggatgttc agcaaggaaa caagtggaaa ggagcaggac agatccaaac 660

atgttagtaa tcacctacac atcagaacat aaccatccat ggccaactca aagaaatgcc 720

cttgctggat caacaaggtc tcaacctaat aattccaaac acactatcat accaaataat 780

cctcaatcac aaaccgatac agacgatcaa caaaaagata atgctgtgag catttcaaaa 840

gtaaaagaag aggtggctga agaagaagct gttcataatc acaaactagt agaaatgcgc 900

gatgacgagg agttttctaa agatagttat cagccaataa tgttaccaga ttcatcaaac 960

cagtgtcatg aggatttctt tgcagattta gttgaactcg aagctgaccc tctaaacctt 1020

ttgtttgcca aaactctatc aggagatata aatgactcga gaccgaagga ggacatcgaa 1080

tcattcaaca tgtacgattg gagcaaagac ggtaacacca gcaacaacaa gaccgacaca 1140

ttataa 1146

<210> 4

<211> 381

<212> PRT

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 4

Met Glu Asn Asn Asn Tyr Gln Gly Asp Leu Ala Asp Ile Phe Arg Gly

1 5 10 15

Gly Asn Asn Asn Thr Thr Ser Gly Glu Ser Ser Ser Thr Asn Asn Thr

20 25 30

Ile Ile Pro Ile Pro Asp Gly Trp Thr Gln Leu Pro Tyr Ser Ala Thr

35 40 45

Glu Glu Pro Thr Cys Val Gln Asp Phe Gly Asp Pro Phe Cys Asn Leu

50 55 60

Arg Asp Pro Leu Phe His Asp Leu Asp Met Leu Gln Ala Thr Pro Thr

65 70 75 80

Glu Asp Asn Asn Asn Asn Ser Val Phe Gly Asp Ser Arg Lys Arg Gly

85 90 95

Asn Asn Met Phe Ser Arg Met Leu Gln Ile Ser Pro Thr Asn Lys Leu

100 105 110

Ala Met Ser Val Gln Asn His Asp Ala Met Asn Ser Ser Lys Thr Cys

115 120 125

Ser Ile Gln Asn Ser Ala Leu Gln Ile Ser Ser Pro Arg Asn Thr Gly

130 135 140

Ile Lys Arg Arg Lys Ser Gln Ala Lys Lys Val Val Cys Ile Pro Ala

145 150 155 160

Ala Ala Pro Ala Asn Ser Arg Gln Gly Gly Glu Val Val Pro Ser Asp

165 170 175

Leu Trp Ala Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Pro Ile Lys Gly Ser Pro

180 185 190

Tyr Pro Arg Gly Tyr Tyr Arg Cys Ser Ser Ser Lys Gly Cys Ser Ala

195 200 205

Arg Lys Gln Val Glu Arg Ser Arg Thr Asp Pro Asn Met Leu Val Ile

210 215 220

Thr Tyr Thr Ser Glu His Asn His Pro Trp Pro Thr Gln Arg Asn Ala

225 230 235 240

Leu Ala Gly Ser Thr Arg Ser Gln Pro Asn Asn Ser Lys His Thr Ile

245 250 255

Ile Pro Asn Asn Pro Gln Ser Gln Thr Asp Thr Asp Asp Gln Gln Lys

260 265 270

Asp Asn Ala Val Ser Ile Ser Lys Val Lys Glu Glu Val Ala Glu Glu

275 280 285

Glu Ala Val His Asn His Lys Leu Val Glu Met Arg Asp Asp Glu Glu

290 295 300

Phe Ser Lys Asp Ser Tyr Gln Pro Ile Met Leu Pro Asp Ser Ser Asn

305 310 315 320

Gln Cys His Glu Asp Phe Phe Ala Asp Leu Val Glu Leu Glu Ala Asp

325 330 335

Pro Leu Asn Leu Leu Phe Ala Lys Thr Leu Ser Gly Asp Ile Asn Asp

340 345 350

Ser Arg Pro Lys Glu Asp Ile Glu Ser Phe Asn Met Tyr Asp Trp Ser

355 360 365

Lys Asp Gly Asn Thr Ser Asn Asn Lys Thr Asp Thr Leu

370 375 380

<210> 5

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt aatggagaat aataattatc aaggtgat 58

<210> 6

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggta ttataatgtg tcggtcttgt tgttgctg 58

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caacctccat gccacttgtc caattg 26

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gagcatcgtg gaaaaagaag acgttc 26

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtttgctggt gctgctgctg gtatac 26

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcctcaatca caaaccgata ca 22

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tcagccacct cttcttttac tt 22

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gaaggctcta taggaggatt tg 22

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gcttgctcga tatagttgtc ag 22

<210> 14

<211> 1584

<212> DNA

<213> 番茄(Solanum lycopersicum)

<400> 14

atggagtgtg ttggagttca aaatgttgga gcaatggcag tttttacgcg tccgagattg 60

aaaccgttgg tcgggaggag agttatgcca agaaaaaagc aatctttttg gcgtatgagc 120

agtatgaaag taaaatgtaa tagcagtagt ggtagtgaca gttgtgtagt tgataaagaa 180

gattttgctg atgaagaaga ttatataaaa gccggtggtt cgcaacttgt atttgttcaa 240

atgcagcaga aaaaagatat ggatcagcag tctaagcttt ctgatgagtt acgacaaata 300

tctgctggac aaaccgtact ggatttagtg gtaatcggct gtggtcctgc tggtcttgct 360

cttgccgcgg agtcagctaa attggggttg aacgtggggc tcgttgggcc tgatcttcct 420

ttcacaaaca actatggtgt atgggaggac gagttcaaag atcttggtct tcaagcctgc 480

attgaacatg tttggcggga taccattgta tatcttgatg atgatgaacc tattcttatt 540

ggccgtgcct atggaagagt tagtcgccat tttctgcacg aggagttact caaaaggtgt 600

gtggaggcag gtgttttgta tctaaactcg aaagtggata ggattgttga ggccacaaat 660

ggccagagtc ttgtagagtg cgagggtgat gttgtgattc cctgcaggtt tgtgactgtt 720

gcatcggggg cagcctcggg gaaattcttg cagtatgagt tgggaggtcc tagagtttct 780

gttcaaacag cttatggagt ggaagttgag gttgataaca atccatttga cccgagcctg 840

atggttttca tggattatag agattatgtc agacacgacg ctcaatcttt agaagctaaa 900

tatccaacat ttctttatgc catgcccatg tctccaacac gagtcttttt cgaggaaact 960

tgtttggctt caaaagatgc aatgccattc gatctgttaa agaaaaaact gatgctacga 1020

ttgaacaccc ttggtgtaag aattaaagaa atttacgagg aggaatggtc ttacataccg 1080

gttggtggat ctttgccaaa tacagaacaa aaaacacttg catttggtgc tgctgctagc 1140

atggttcatc cagccacagg ttattcagtc gtcagatcac tttctgaagc tccaaaatgc 1200

gcctctgtac ttgcaaatat attacgacaa cattatagca agaacatgct taccagttca 1260

agtatcccga gtatatcaac tcaagcttgg aacactcttt ggccacaaga acgaaaacga 1320

caaagatcgt ttttcctatt tggactggct ctgatattgc agctggatat tgaggggata 1380

aggtcatttt tccgcgcatt cttccgtgtg ccaaaatgga tgtggcaggg atttcttggt 1440

tcaagtcttt cttcagcaga cctcatgtta tttgccttct acatgtttat tattgcacca 1500

aatgacatga gaaaaggctt gatcagacat cttttatctg atcctactgg tgcaacattg 1560

ataagaactt atcttacatt ttag 1584

Claims

1.过表达番茄SlWRKY35基因在提高番茄类胡萝卜素类化合物或/和叶绿素含量中的应用，其特征在于：所述番茄SlWRKY35基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述番茄SlWRKY35基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述类胡萝卜素类化合物为八氢番茄红素、番茄红素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质、α-隐黄质、β-隐黄质、新黄质、紫黄质或花药黄质。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述叶绿素为叶绿素a或叶绿素b。

5.提高番茄类胡萝卜素类化合物或/和叶绿素含量的方法，其特征在于：在番茄中过表达番茄SlWRKY35基因，所述番茄SlWRKY35基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

6.同时过表达番茄SlWRKY35基因和番茄SlLCYE基因在提高番茄果实叶黄素含量中的应用，其特征在于：所述番茄SlWRKY35基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述番茄SlLCYE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述同时过表达番茄SlWRKY35基因和番茄SlLCYE基因的方法是将过表达番茄SlWRKY35基因的品系和过表达番茄SlLCYE基因的品系分别作为亲本进行杂交，收集F₀代杂交种子继续播种，经过一代自交后选择F₂代纯合株系的番茄果实进行叶黄素化合物含量测定。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述过表达番茄SlWRKY35基因的品系由以下方法：构建过量表达SlWRKY35基因的植物表达载体，通过农杆菌介导转化番茄，筛选阳性再生植株，获得过表达番茄SlWRKY35基因的品系。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述植物表达载体中SlWRKY35基因由组成型启动子35S或果实特异性启动子E8驱动表达。

10.提高番茄果实叶黄素含量的方法，其特征在于：在番茄中过表达番茄SlWRKY35基因和番茄SlLCYE基因，所述番茄SlWRKY35基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述番茄SlLCYE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。