CN111197053B - 一种包括虾青素合成酶融合基因的重组质粒、重组菌及应用 - Google Patents

一种包括虾青素合成酶融合基因的重组质粒、重组菌及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种包括虾青素合成酶融合基因的重组质粒、重组菌及应用，属于基因工程育种技术领域。本发明将四个虾青素合成关键酶基因用2A短肽序列连接，并利用CaMV35S启动子控制表达，能够简化重组质粒(表达载体)的构建，并实现各基因的协同表达。将本发明的重组质粒导入亚麻荠植株，得到的亚麻荠转化植株的种子中合成并积累高含量类胡萝卜素，其中虾青素含量由0增加至15.23μg/gDW。同时该转化株系种子总抗氧化能力转化株系显著高于野生型。因此将本发明的重组质粒用于亚麻荠育种，并利用亚麻荠生产高品质的、兼具不饱和脂肪酸和类胡萝卜素的食用油具有极大的商业前景。

Description

一种包括虾青素合成酶融合基因的重组质粒、重组菌及应用
技术领域
本发明属于基因工程育种技术领域，尤其涉及一种包括虾青素合成酶融合基因的重组质粒、重组菌及应用。
背景技术
虾青素是一种分子结构独特的红色酯溶性酮式类胡萝卜素，具有极强的抗氧化活性以及抗辐射，抗衰老、抗肿瘤和预防心血管等疾病的功能。虾青素的生物合成只发生于少量细菌和绿藻中，且产量很低；植物中也只有夏侧金盏花(Adonis aestivalis)可以在其花瓣中合成微量的虾青素。由于虾青素的自然资源有限，科学家们都在通过基因工程方法寻求不同的植物来生产更高产量的天然虾青素，并在莴苣、马铃薯、小麦、油菜、烟草、番茄和水稻等植物中获得成功。目前，现有技术中还没有利用亚麻荠成功表达虾青素的记载和报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种包括虾青素合成酶融合基因的重组质粒、重组菌及应用，本发明的重组质粒能够用于培育高产虾青素的亚麻荠。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种包括虾青素合成酶融合基因的重组质粒，所述虾青素合成酶融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述重组质粒以CaMV35S启动子作为启动子。
优选的，所述重组质粒以pBI121作为原始质粒。
本发明提供了一种包括上述方案所述重组质粒的重组菌。
本发明提供了上述方案所述重组质粒或者所述重组菌在亚麻荠育种中的应用。
本发明提供了上述方案所述重组质粒或者所述重组菌在降低亚麻荠植株高度和/或增加亚麻荠植株分枝数中的应用。
本发明提供了上述方案所述重组质粒或者所述重组菌在提高亚麻荠种子中类胡萝卜素的含量中的应用。
优选的，所述类胡萝卜素包括虾青素。
本发明提供了上述方案所述重组质粒或者所述重组菌在提高亚麻荠种子总抗氧化能力中的应用。
优选的，所述应用包括以下步骤：
将所述重组质粒或者重组菌导入亚麻荠植株，培育，得到亚麻荠种子，从亚麻荠种子中选择颜色为红色的种子，得到目标亚麻荠种子。
优选的，所述导入的方法包括农杆菌花序浸染法。
本发明的有益效果：本发明提供了一种包括虾青素合成酶融合基因的重组质粒，所述虾青素合成酶融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述重组质粒以CaMV35S启动子作为启动子。本发明的虾青素合成酶融合基因包括将虾青素合成途径中的三个关键酶基因以及促进有色体分化与类胡萝卜素储藏的Orange(来自花椰菜)基因，其中三个关键酶基因分别是来自莱茵衣藻的β-胡萝卜素酮化酶(CrBKT)和来自雨生红球藻的羟化酶(HpBHY)基因、八氢番茄红素合成酶(CrtB)基因。本发明将四个关键酶基因用2A短肽序列连接，并利用CaMV35S启动子控制表达，能够简化重组质粒(表达载体)的构建，并实现各基因的协同表达。通过农杆菌花序浸染法将本发明的重组质粒导入亚麻荠植株，得到的亚麻荠转化植株，经检测，亚麻荠转化植株的种子中合成并积累高含量类胡萝卜素(886μg/gDW)，其中虾青素含量由0增加至15.23μg/gDW，亚麻荠种子的营养品质得到提升。同时该转化株系种子总抗氧化能力转化株系显著高于野生型。亚麻荠转化植株种子可以直接通过常规物理榨油方式获得亚麻荠籽油，比传统的通过超临界CO2临界萃取的方法简单快捷，且低成本高效率。因此，将本发明的重组质粒用于亚麻荠育种，并利用亚麻荠生产高品质的、兼具不饱和脂肪酸和类胡萝卜素的食用油具有极大的商业前景。
附图说明
图1为本发明重组质粒图谱；
图2为转化植株T0代种子与未转化植物T0代种子的颜色鉴定结果，其中a为未转化成功的种子实物图，b为转化成功的种子实物图；
图3为转基因植株和野生型植株的株高对比，其中e为野生型植株，f为转基因植株；
图4为转基因植株和野生型植株的分枝数对比，其中c为野生型植株花序，d为转基因植株花序；
图5为转化子S-BBBO与野生型光响应曲线比较分析结果；
图6为T1代株系种子的PCR扩增结果；
图7为种子的类胡萝卜素含量UHPLC色谱分析结果；
图8为种子总抗氧化能力分析结果。
具体实施方式
本发明提供了一种包括虾青素合成酶融合基因的重组质粒，所述虾青素合成酶融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体为：
cccgggacaaagagtaaagaagaacaatggcatcttctatgctgtcttctgcgactatggttgcgtctccggctcaggctactatggtggcaccgttcaacggtctgaagtcctccgcggctttcccggctactcgtaaagcgaacaacgacattaccagcattacctctaacggtggtcgtgtgaactgcatgaacaacccgtctctgctgaaccatgcggtggaaaccatggcggtgggttccaaatccttcgcgaccgcgtctaagctgttcgatgcaaagacccgtcgttctgtgctgatgctgtatgcatggtgccgccattgtgacgacgttatcgacgaccagactctgggcttccaggcacgtcagccggcgctgcagactccggaacagcgtctgatgcagctggagatgaagactcgccaggcttatgcaggctctcagatgcacgaaccggcgttcgctgctttccaggaagttgcgatggcgcatgatatcgctccggcatacgcgtttgatcatctggaaggcttcgctatggacgtgcgcgaggcgcagtactcccagctggacgataccctgcgctactgctaccacgttgctggtgttgtgggcctgatgatggcacagatcatgggtgttcgtgataacgcgaccctggatcgcgcatgtgacctgggtctggcattccagctgactaacattgcgcgtgacattgttgacgatgcgcacgcaggccgttgttatctgccggcgtcttggctggaacacgaaggcctgaacaaagaaaactacgctgcaccggaaaaccgtcaggcactgtctcgcatcgctcgccgcctggtgcaggaagcagagccgtactatctgagcgcgactgcgggcctggctggcctgccgctgcgtagcgcttgggcgattgctaccgctaagcaggtgtaccgcaaaatcggtgtgaaggttgagcaggcaggtcagcaggcgtgggatcagcgtcagtccaccactaccccggaaaaactgaccctgctgctggcagctagcggccaggcgctgacttctcgtatgcgtgcacatccgccgcgtccggcacacctgtggcagcgtccgctgtctagacagctgctgaactttgatctgctgaaactggctggtgacgtggagtctaaccctggtccgatggcgtcctctatgctgtcttctgctactatggtggcatctccggctcaggcaactatggtggcaccgtttaacggtctgaagtcttccgcagctttcccggcaactcgcaaggcaaacaacgatattactagcattacttccaacggtggccgtgttaactgcatgctgagcaagctgcagtctattagcgttaaggctcgccgtgtggagctggctcgtgacattacccgtccgaaagtttgtctgcacgcgcagcgttgtagcctggtgcgtctgcgtgtggcggctccgcagactgaagaggcactgggtaccgttcaggctgcaggtgcgggcgacgaacactccgctgatgtggctctgcagcagctggatcgtgcgattgcagaacgtcgtgcgcgtcgcaaacgcgaacagctgagctatcaggcagcggctatcgctgcttctattggtgtgtccggtattgcgatcttcgcgacctatctgcgtttcgctatgcacatgactgtgggtggtgcggttccgtggggcgaagttgcgggtactctgctgctggttgttggtggcgctctgggcatggagatgtatgcgcgttatgcgcacaaagcgatctggcacgagtccccgctgggttggctgctgcacaaaagccatcacaccccgcgtaccggtccgttcgaggctaacgatctgtttgcaatcatcaacggcctgccggcgatgctgctgtgcaccttcggcttctggctgccgaacgtgctgggcgcggcttgtttcggcgcaggtctgggtatcactctgtacggcatggcgtacatgttcgtgcatgatggtctggttcatcgtcgtttcccgactggcccgatcgcgggtctgccgtatatgaaacgcctgactgttgctcatcagctgcatcattctggcaaatatggcggtgcgccgtggggtatgttcctgggtccgcaggaactgcagcatattccgggtgcggctgaggaagtggaacgtctggtgctggaactggactggtccaaacgtcagctgctgaacttcgatctgctgaaactggcgggtgacgtggaatctaaccctggtccgatggctagctctatgctgtcctccgctaccatggttgcgtccccggcacaggcgactatggtggctccgttcaacggcctgaaatctagcgctgcatttccggcgactcgtaaggcgaacaacgacatcacttctatcaccagcaacggcggtcgcgttaactgtatgggtccgggtatccagccgaccagcgcgcgtccgtgttctcgtactaaacactctcgttttgcactgctggcggcagcactgaccgctcgtcgtgtgaaacagttcaccaagcagtttcgttctcgccgcatggcagaggacattctgaagctgtggcagcgtcagtatcatctgccgcgtgaagattctgacaagcgtaccctgcgtgagcgcgttcatctgtatcgtccgccgcgtagcgacctgggcggcatcgcggttgcggttaccgttattgctctgtgggcaaccctgtttgtttatggcctgtggttcgttaagctgccgtgggcgctgaaagttggtgagaccgctacttcttgggcgaccatcgcagcggttttcttctctctggaattcctgtacactggtctgttcatcaccactcacgatgcgatgcacggtactatcgcactgcgtaaccgtcgtctgaacgattttctgggtcagctggcaatttccctgtacgcgtggtttgactattctgtgctgcaccgtaaacattgggaacatcataaccataccggcgaaccgcgtgttgacccggacttccatcgtggcaacccgaacctggcagtgtggttcgcgcagtttatggtgagctacatgactctgtcccagtttctgaagatcgcggtttggtccaacctgctgctgctggcgggtgcgccgctggcaaaccagctgctgtttatgaccgcagcaccgatcctgtctgcgttccgcctgttctattacggcacttatgttccgcaccatccggagaagggccatactggcgcgatgccgtggcaggtttcccgcacttcttccgcatcccgcctgcagtcctttctgacttgctatcatttcgacctgcactgggagcatcatcgttggccgtatgctccgtggtgggagctgccgaaatgccgtcagatcgcacgtggcgcagctctggctcagctgctgaacttcgatctgctgaagctggcaggcgacgttgaatccaaccctgggcccatggcttcttctgcatttgcttttccttcttacataataaccaaaggaggactttcaactgattcttgtaaatcaacttctttgtcttcttctagatctttggttacagatcttccatcaccatgtctgaaacccaacaacaattcccattcaaacagaagagcaaaagtgtgtgcttcacttgcagagaagggtgaatattattcaaacagaccaccaactccattacttgacactattaactacccaatccacatgaaaaatctttctgtcaaggaactgaaacaactttctgatgagctgagatcagacgtgatctttaatgtgtcgaaaaccggtggacatttggggtcaagtcttggtgttgtggagcttactgtggctcttcattacattttcaatactccacaagacaagattctttgggatgttggtcatcagtcttatcctcataagattcttactgggagaagaggaaagatgcctacaatgaggcaaaccaatggtctctctggtttcaccaaacgaggagagagtgaacatgattgctttggtactggacacagctcaaccacaatatctgctggtttaggaatggcggtaggaagggatttgaaggggaagaacaacaatgtggttgctgtgattggtgatggtgcgatgacggcaggacaggcttatgaagccatgaacaacgccggatatctagactctgatatgattgtgattcttaatgacaacaagcaagtctcattacctacagctactttggatggaccaagtccacctgttggtgcattgagcagtgctcttagtcggttacagtctaacccggctctcagagagttgagagaagtcgcaaagggtatgacaaagcaaataggcggaccaatgcatcagttggcggctaaggtagatgtgtatgctcgaggaatgataagcggtactggatcgtcactgtttgaagaactcggtctttactatattggtccagttgatgggcacaacatagatgatttggtagccattcttaaagaagttaagagtaccagaaccacaggacctgtacttattcatgtggtgacggagaaaggtcgtggttatccttacgcggagagagctgatgacaaataccatggtgttgtgaaatttgatccagcaacgggtagacagttcaaaactactaatgagactcaatcttacacaacttactttgcggaggcattagtcgcagaagcagaggtagacaaagatgtggttgcgattcatgcagccatgggaggtggaaccgggttaaatctctttcaacgtcgcttcccaacaagatgtttcgatgtaggaatagcggaacaacacgcagttacttttgctgcgggtttagcctgtgaaggccttaaacccttctgtgcaatctattcgtctttcatgcagcgtgcttatgaccaggttgtccatgatgttgatttgcaaaaattaccggtgagatttgcaatggatagagctggactcgttggagctgatggtccgacacattgtggagctttcgatgtgacatttatggcttgtcttcctaacatgatagtgatggctccatcagatgaagcagatctctttaacatggttgcaactgctgttgcgattgatgatcgtccttcttgtttccgttaccctagaggtaacggtattggagttgcattacctcccggaaacaaaggtgttccaattgagattgggaaaggtagaattttaaaggaaggagagagagttgcgttgttgggttatggctcagcagttcagagctgtttaggagcggctgtaatgctcgaagaacgcggattaaacgtaactgtagcggatgcacggttttgcaagccattggaccgtgctctcattcgcagcttagctaagtcgcacgaggttctgatcacggttgaagaaggttccattggaggttttggctcgcacgttgttcagtttcttgctctcgatggtcttcttgatggcaaactcaagtggagaccaatggtactgcctgatcgatacattgatcacggtgcaccagctgatcaactagctgaagctggactcatgccatctcacatcgcagcaaccgcacttaacttaatcggtgcaccaagggaagctctgttttgagagctc；所述重组质粒以CaMV35S启动子作为启动子，控制融合基因表达。
本发明所述虾青素合成酶融合基因包括将虾青素合成途径中的三个关键酶基因以及促进有色体分化与类胡萝卜素储藏的Orange(来自花椰菜)基因，其中三个关键酶基因分别是来自莱茵衣藻的β-胡萝卜素酮化酶(CrBKT)和来自雨生红球藻的羟化酶(HpBHY)基因、八氢番茄红素合成酶(CrtB)基因。本发明将四个关键酶基因用2A短肽序列连接，并利用CaMV35S启动子控制表达，能够简化重组质粒(表达载体)的构建，并实现各基因的协同表达。
本发明利用CaMV35S启动子控制表达是由于CaMV35S启动子不是组织器官特异的，能够在植物任何细胞组织都可以表达，将重组质粒导入受体植株获得的转基因株系整个植株(包括叶片、花、果荚、种子)均能够积累类胡萝卜素。
本发明中，所述重组质粒优选的以pBI121作为原始质粒。
本发明中，所述虾青素合成酶融合基因包括用于启动三个与虾青素等类胡萝卜素合成相关(CrtB，CrBKT，HpBHY，简称BBB)和一个促进有色体的分化和类胡萝卜素的储藏(Orange)的基因。BBB的三个基因的5’端ATG前均融合有拟南芥RBCS2的叶绿体导肽(TP)序列，各基因间通过2A序列链接使四个基因的表达在同一阅读框但翻译时形成各自编码的肽。重组质粒图谱参见图1。本发明对所述重组质粒的构建方法没有特殊限制，采用本领域常规方法即可。本发明具体实施过程中，虾青素合成酶融合基因通过全合成后克隆于pBI121，利用CaMV35S启动子控制表达形成重组质粒。
本发明提供了一种包括上述方案所述重组质粒的重组菌；所述重组菌的原始菌优选的包括农杆菌。
本发明提供了上述方案所述重组质粒或者所述重组菌在亚麻荠育种中的应用。
本发明提供了上述方案所述重组质粒或者所述重组菌在降低亚麻荠植株高度和/或增加亚麻荠植株分枝数中的应用。
本发明提供了上述方案所述重组质粒或者所述重组菌在提高亚麻荠种子中类胡萝卜素的含量中的应用；所述类胡萝卜素优选的包括虾青素；更优选的，所述类胡萝卜素还包括酮式叶黄素、叶黄素、隐黄质、海胆酮、番茄红素、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素。
本发明提供了上述方案所述重组质粒或者所述重组菌在提高亚麻荠种子总抗氧化能力中的应用。
本发明中，所述应用优选的包括以下步骤：将所述重组质粒或者重组菌导入亚麻荠植株，培育，得到亚麻荠种子，从亚麻荠种子中选择颜色为红色的种子，得到目标亚麻荠种子；所述导入的方法优选的包括农杆菌花序浸染法；所述红色优选为暗红色；由于类胡萝卜素为红色、黄色、橘红色色素，它在植物器官中合成后会改变植物器官的颜色，收获的T0代种子能够通过肉眼观察颜色鉴别转化成功种子。转化成功的种子由于类胡萝卜素的积累而呈现暗红色，未转化成功的种子为淡黄色，两者颜色相差较大，可以通过肉眼直接鉴定转化是否成功，简单快捷。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一、材料和方法
1、材料
亚麻荠(Camelina sativa(L.))种质材料SC-N16，(参见【苑丽霞，郝敬云，赵奎，等.2EMS诱变亚麻荠获得2S贮藏蛋白缺失突变体.华北农学报，2016，31(3):11-17】)，由山西农业大学作物遗传育种重点实验室提供。将亚麻荠种子播种于直径9cm的育苗盆中，1粒/盆；盆中基质为腐殖质：泥炭土：珍珠岩＝5：4：1(体积比)；温室温度为16～22℃，光源为自然光，相对湿度为60％。待植株生长至10cm时进行摘心处理，以促进侧枝的生长和发育。植株生长约70d时进入花期准备转化，转化前一天将植株浇透水。共对20株(盆)植株进行处理，5株(盆)不处理作为对照。
2、方法
2.1构建载体
重组质粒pBI121-35S-BBBO包含有CaMV35S启动子，用于启动三个与虾青素等类胡萝卜素合成相关(CrtB，CrBKT，HpBHY，简称BBB)和一个促进类胡萝卜素合成(Orange)的基因。BBB的三个基因的5’端ATG前均融合有拟南芥RBCS2的叶绿体导胎序列，各基因间通过2A序列链接使四个基因的表达在同一阅读框但翻译时形成各自编码的胎。重组质粒图谱(见图1)通过全合成后克隆于pBI121的35S启动子后形成目的质粒(简称S-BBBO)。
2.2农杆菌Floral Dip转化亚麻荠
取-70℃保存的含有重组质粒S-BBBO的农杆菌，在含有50mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素的LB固体培养上划线，28℃下培养36h。从平板上挑取单菌落接种于3ml含有上述抗生素的LB液体培养基中，28℃条件下，220rpm/min振荡培养过夜。吸取2ml农杆菌菌液加入250ml含有上述相应抗生素的LB液体培养基中，28℃条件下，220rpm/min振荡培养至OD600为0.8-1.0，5000rpm/min离心10min收集菌体，用等体积渗透培养基(1/2MS，5％蔗糖，0.05％Silwet L-77，PH＝5.7)悬浮菌体。转化时将种植亚麻荠植株的盆用保鲜膜包裹，植株倒立于真空桶中，花序部分浸入渗透培养基中。盖上真空桶盖，抽真空于80Kpa时开始计时，5min后将植株取出平放于铺了保鲜膜的地面并盖上黑色塑料袋。24h后将植株放置于温室培养，一星期后按照以上方法重复浸染一次后将植株置于温室常规培养直至果荚成熟，收取成熟种子标记为T0代，用于后续实验。
3、转基因植株的鉴定
3.1T0代种子颜色鉴定
由于类胡萝卜素为红色、黄色、橘红色色素，它在植物器官中合成后会改变植物器官的颜色，收获的T0代种子通过肉眼观察颜色鉴别转化成功种子，同时计算转化率。
3.2T1代植株表型分析
为了分析在35S启动子控制下转入4个基因对植株生长状况的影响，萌发收获的T0红色种子，种植于温室并收获T1代种子，选取3个株系的种子进行种子萌发实验，并对植株株高、分支数、单株产量等指标进行测定并与野生型做比较。
3.3光合特性分析
利用便携式气体交换系统测定不同光强度下的光合作用速率获得光响应曲线。在0～1800μmol·m-2s-1的范围内设置12个光梯度(1800、1500、1200、1000、800、600、400、300、200、100、50和0μmol·m-2s-1)。测定时，叶室内叶温维持在25℃，CO2浓度为400μmol·mol-1，相对湿度60％，平衡2～3min记录读数，每个处理重复三次，制作光合响应曲线。
3.3PCR鉴定
为了进一步验证，将初期筛选到的红色T1代种子进行萌发，种植于温室，采集植株叶片并提取DNA，用CRBKT引物进行扩增。
3.4类胡萝卜素提取及测定
3.4.1提取方法
准确称量T1亚麻荠种子(0.2～0.3g)于2.0mg EP管中，每个样品设置3个重复，加入2mm钢珠2颗，200μl丙酮溶液，置于快速研磨仪中(频率65Hz，99s)研磨5次，再加500μl丙酮溶液，放置于超声波清洗器超声洗脱30min。高速离心(14800rmp/min，10min)取上清，用0.22μm滤器过滤后上样测定。
3.4.2检测方法
仪器：Agilent Technologies 1290Infinity；色谱柱：ZORBAX Eclipse(3.0×50mm 1.8-Micron，Agilent，USA)；流速：1ml/min；进样量：5μl；流动相程序：0-1.0min：水：20％，乙腈：60％，异丙醇：5％，甲醇：15％；1.0-2.0min：水：0％，乙腈：80％，异丙醇：5％，甲醇：15％；2.0～8.0min：水：0％，乙腈：80％，异丙醇：5％，甲醇：15％；得到的色谱图通过与标准品出峰时间及色谱峰图来确定每个峰的成分，通过标准曲线确定不同成分的含量。
3.5种子总抗氧化能力测定
用苏州格锐思生物科技有限公司总抗氧化能力试剂盒进行种子总抗氧化能力的测定。
二、结果与分析
1、转基因植株的鉴定
1)T0代种子颜色鉴定
转化植株T0代种子与未转化植物T0代种子的颜色鉴定结果参见图2，a为未转化成功的种子，b为转化成功的种子。类胡萝卜素在亚麻荠种子中积累，转化植株T0代种子与未转化植物T0代种子在颜色上有明显差异，转化成功的种子呈现明显的暗红色，而未转化成功的种子呈现淡黄色。20株(盆)共收获种子3520粒，其中红色种子(转化成功)21粒，转化率为5/1000。
2)T1代植株表型分析比较
结果参见表1、图3和图4，其中图3为转基因植株和野生型植株的株高对比，e为野生型植株，f为转基因植株；图4为转基因植株和野生型植株的分枝数对比，c为野生型植株花序，d为转基因植株花序。由表1可以看出转基因组与对照种子萌发率均大于90％；在植株株高方面，转基因组株高82.1±5.2cm，野生型为112.2±12.5cm，且转基因组植株分支(16±2支)明显高于野生型(10±1支)，转化组植株表现出明显的矮化和分支数增加的性状。
表1：转基因亚麻荠与野生型形态学指标、产量的比较
Figure BDA0002364536730000101
**表示在p<0.05水平上的显著性差异，数据表示为平均值±标准误，n＝3。
2、光合特性比较
通过对转化子S-BBBO与野生型光响应曲线比较分析发现(图5)，转化子S-BBBO与野生型没有明显差异，表明外源基因的转入对植物光合作用没有影响。虽然植株在株型上有一定差异，但并没有影响植株生长及单株产量。
1)PCR鉴定
为了进一步验证，将初期筛选到的红色T0代种子进行萌发，种植于温室并收获T1代种子，分别提取5个株系种子的DNA，用CRBKT引物进行扩增。
正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，具体为：5'-GAACCTGGCAGTGTGGTTC-3'；
反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，具体为：5'-AAAGGACTGCAGGCGGGATG-3'。
PCR扩增结果见图6。由图6可知，CRBKT基因在转化子中表达。
2)类胡萝卜素含量分析
种子UHPLC色谱图参见图7，其中1.虾青素；2、4、5.酮式叶黄素；3.叶黄素；6.隐黄质；7.海胆酮；8、9.番茄红素；10.α-胡萝卜素；11.β-胡萝卜素。总类胡萝卜素含量表参见表2。
由图7和表2可以看出，野生型种子中仅含有叶黄素，含量为13.21μg/gDW，而转化子S-BBBO种子中含有8种已确定类胡萝卜素，包含酮式叶黄素(ketolutein)、(Astaxanthin)、叶黄素(lutein)、隐黄质(β-Cryptoxanthin)、海胆酮(Echinenone)、番茄红素(lycopene)、α-胡萝卜素(α-carotene)、β-胡萝卜素(β-carotene)，总类胡萝卜素含量为886μg/gDW，是野生型的67倍，虾青素含量也由0增加至15.23μg/gDW。
3)种子总抗氧化能力分析
种子总抗氧化能力分析结果参见图8。S-BBBO转化子种子总抗氧化能力为7.85μmol/g，野生型为3.02μmol/g，转化子种子总抗氧化能力明显高于野生型。高含量的总类胡萝卜素，尤其是虾青素的积累明显提高了种子总抗氧化能力。
由上述内容可知，本发明将虾青素合成途径中的三个关键酶基因，来自莱茵衣藻的β-胡萝卜素酮化酶(CrBKT)和来自雨生红球藻的羟化酶(HpBHY)基因、八氢番茄红素合成酶(CrtB)基因，以及促进有色体分化与类胡萝卜素储藏的Orange(来自花椰菜)基因在经济植物亚麻荠中表达。同时为了简化表达载体的构建和实现各基因在亚麻荠种子中的协同表达将四个关键酶基因用手足口病2A自切割肽段连接，在CaMV35S控制下通过农杆菌花序浸染法导入油料作物亚麻荠。转化成功的种子由于类胡萝卜素的积累而呈现暗红色，未转化成功的种子为淡黄色，两者颜色相差较大，可以通过肉眼直接鉴定转化是否成功，简单快捷。20株(盆)共收获种子3520粒，其中红色种子(转化成功)21粒，转化率为5/1000。用促进合成、降低产物降解等策略获得了能在亚麻荠种子中合成并积累高含量类胡萝卜素(886μg/g干重)的高品质亚麻荠株系，更为重要的是虾青素含量由0增加至15.23μg/g，进一步提高了亚麻荠种子的营养品质，是国内首例在亚麻荠种子中合成高价值虾青素的株系。同时该转化株系种子总抗氧化能力转化株系显著高于野生型。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国科学院昆明植物研究所
<120> 一种包括虾青素合成酶融合基因的重组质粒、重组菌及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5657
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cccgggacaa agagtaaaga agaacaatgg catcttctat gctgtcttct gcgactatgg 60
ttgcgtctcc ggctcaggct actatggtgg caccgttcaa cggtctgaag tcctccgcgg 120
ctttcccggc tactcgtaaa gcgaacaacg acattaccag cattacctct aacggtggtc 180
gtgtgaactg catgaacaac ccgtctctgc tgaaccatgc ggtggaaacc atggcggtgg 240
gttccaaatc cttcgcgacc gcgtctaagc tgttcgatgc aaagacccgt cgttctgtgc 300
tgatgctgta tgcatggtgc cgccattgtg acgacgttat cgacgaccag actctgggct 360
tccaggcacg tcagccggcg ctgcagactc cggaacagcg tctgatgcag ctggagatga 420
agactcgcca ggcttatgca ggctctcaga tgcacgaacc ggcgttcgct gctttccagg 480
aagttgcgat ggcgcatgat atcgctccgg catacgcgtt tgatcatctg gaaggcttcg 540
ctatggacgt gcgcgaggcg cagtactccc agctggacga taccctgcgc tactgctacc 600
acgttgctgg tgttgtgggc ctgatgatgg cacagatcat gggtgttcgt gataacgcga 660
ccctggatcg cgcatgtgac ctgggtctgg cattccagct gactaacatt gcgcgtgaca 720
ttgttgacga tgcgcacgca ggccgttgtt atctgccggc gtcttggctg gaacacgaag 780
gcctgaacaa agaaaactac gctgcaccgg aaaaccgtca ggcactgtct cgcatcgctc 840
gccgcctggt gcaggaagca gagccgtact atctgagcgc gactgcgggc ctggctggcc 900
tgccgctgcg tagcgcttgg gcgattgcta ccgctaagca ggtgtaccgc aaaatcggtg 960
tgaaggttga gcaggcaggt cagcaggcgt gggatcagcg tcagtccacc actaccccgg 1020
aaaaactgac cctgctgctg gcagctagcg gccaggcgct gacttctcgt atgcgtgcac 1080
atccgccgcg tccggcacac ctgtggcagc gtccgctgtc tagacagctg ctgaactttg 1140
atctgctgaa actggctggt gacgtggagt ctaaccctgg tccgatggcg tcctctatgc 1200
tgtcttctgc tactatggtg gcatctccgg ctcaggcaac tatggtggca ccgtttaacg 1260
gtctgaagtc ttccgcagct ttcccggcaa ctcgcaaggc aaacaacgat attactagca 1320
ttacttccaa cggtggccgt gttaactgca tgctgagcaa gctgcagtct attagcgtta 1380
aggctcgccg tgtggagctg gctcgtgaca ttacccgtcc gaaagtttgt ctgcacgcgc 1440
agcgttgtag cctggtgcgt ctgcgtgtgg cggctccgca gactgaagag gcactgggta 1500
ccgttcaggc tgcaggtgcg ggcgacgaac actccgctga tgtggctctg cagcagctgg 1560
atcgtgcgat tgcagaacgt cgtgcgcgtc gcaaacgcga acagctgagc tatcaggcag 1620
cggctatcgc tgcttctatt ggtgtgtccg gtattgcgat cttcgcgacc tatctgcgtt 1680
tcgctatgca catgactgtg ggtggtgcgg ttccgtgggg cgaagttgcg ggtactctgc 1740
tgctggttgt tggtggcgct ctgggcatgg agatgtatgc gcgttatgcg cacaaagcga 1800
tctggcacga gtccccgctg ggttggctgc tgcacaaaag ccatcacacc ccgcgtaccg 1860
gtccgttcga ggctaacgat ctgtttgcaa tcatcaacgg cctgccggcg atgctgctgt 1920
gcaccttcgg cttctggctg ccgaacgtgc tgggcgcggc ttgtttcggc gcaggtctgg 1980
gtatcactct gtacggcatg gcgtacatgt tcgtgcatga tggtctggtt catcgtcgtt 2040
tcccgactgg cccgatcgcg ggtctgccgt atatgaaacg cctgactgtt gctcatcagc 2100
tgcatcattc tggcaaatat ggcggtgcgc cgtggggtat gttcctgggt ccgcaggaac 2160
tgcagcatat tccgggtgcg gctgaggaag tggaacgtct ggtgctggaa ctggactggt 2220
ccaaacgtca gctgctgaac ttcgatctgc tgaaactggc gggtgacgtg gaatctaacc 2280
ctggtccgat ggctagctct atgctgtcct ccgctaccat ggttgcgtcc ccggcacagg 2340
cgactatggt ggctccgttc aacggcctga aatctagcgc tgcatttccg gcgactcgta 2400
aggcgaacaa cgacatcact tctatcacca gcaacggcgg tcgcgttaac tgtatgggtc 2460
cgggtatcca gccgaccagc gcgcgtccgt gttctcgtac taaacactct cgttttgcac 2520
tgctggcggc agcactgacc gctcgtcgtg tgaaacagtt caccaagcag tttcgttctc 2580
gccgcatggc agaggacatt ctgaagctgt ggcagcgtca gtatcatctg ccgcgtgaag 2640
attctgacaa gcgtaccctg cgtgagcgcg ttcatctgta tcgtccgccg cgtagcgacc 2700
tgggcggcat cgcggttgcg gttaccgtta ttgctctgtg ggcaaccctg tttgtttatg 2760
gcctgtggtt cgttaagctg ccgtgggcgc tgaaagttgg tgagaccgct acttcttggg 2820
cgaccatcgc agcggttttc ttctctctgg aattcctgta cactggtctg ttcatcacca 2880
ctcacgatgc gatgcacggt actatcgcac tgcgtaaccg tcgtctgaac gattttctgg 2940
gtcagctggc aatttccctg tacgcgtggt ttgactattc tgtgctgcac cgtaaacatt 3000
gggaacatca taaccatacc ggcgaaccgc gtgttgaccc ggacttccat cgtggcaacc 3060
cgaacctggc agtgtggttc gcgcagttta tggtgagcta catgactctg tcccagtttc 3120
tgaagatcgc ggtttggtcc aacctgctgc tgctggcggg tgcgccgctg gcaaaccagc 3180
tgctgtttat gaccgcagca ccgatcctgt ctgcgttccg cctgttctat tacggcactt 3240
atgttccgca ccatccggag aagggccata ctggcgcgat gccgtggcag gtttcccgca 3300
cttcttccgc atcccgcctg cagtcctttc tgacttgcta tcatttcgac ctgcactggg 3360
agcatcatcg ttggccgtat gctccgtggt gggagctgcc gaaatgccgt cagatcgcac 3420
gtggcgcagc tctggctcag ctgctgaact tcgatctgct gaagctggca ggcgacgttg 3480
aatccaaccc tgggcccatg gcttcttctg catttgcttt tccttcttac ataataacca 3540
aaggaggact ttcaactgat tcttgtaaat caacttcttt gtcttcttct agatctttgg 3600
ttacagatct tccatcacca tgtctgaaac ccaacaacaa ttcccattca aacagaagag 3660
caaaagtgtg tgcttcactt gcagagaagg gtgaatatta ttcaaacaga ccaccaactc 3720
cattacttga cactattaac tacccaatcc acatgaaaaa tctttctgtc aaggaactga 3780
aacaactttc tgatgagctg agatcagacg tgatctttaa tgtgtcgaaa accggtggac 3840
atttggggtc aagtcttggt gttgtggagc ttactgtggc tcttcattac attttcaata 3900
ctccacaaga caagattctt tgggatgttg gtcatcagtc ttatcctcat aagattctta 3960
ctgggagaag aggaaagatg cctacaatga ggcaaaccaa tggtctctct ggtttcacca 4020
aacgaggaga gagtgaacat gattgctttg gtactggaca cagctcaacc acaatatctg 4080
ctggtttagg aatggcggta ggaagggatt tgaaggggaa gaacaacaat gtggttgctg 4140
tgattggtga tggtgcgatg acggcaggac aggcttatga agccatgaac aacgccggat 4200
atctagactc tgatatgatt gtgattctta atgacaacaa gcaagtctca ttacctacag 4260
ctactttgga tggaccaagt ccacctgttg gtgcattgag cagtgctctt agtcggttac 4320
agtctaaccc ggctctcaga gagttgagag aagtcgcaaa gggtatgaca aagcaaatag 4380
gcggaccaat gcatcagttg gcggctaagg tagatgtgta tgctcgagga atgataagcg 4440
gtactggatc gtcactgttt gaagaactcg gtctttacta tattggtcca gttgatgggc 4500
acaacataga tgatttggta gccattctta aagaagttaa gagtaccaga accacaggac 4560
ctgtacttat tcatgtggtg acggagaaag gtcgtggtta tccttacgcg gagagagctg 4620
atgacaaata ccatggtgtt gtgaaatttg atccagcaac gggtagacag ttcaaaacta 4680
ctaatgagac tcaatcttac acaacttact ttgcggaggc attagtcgca gaagcagagg 4740
tagacaaaga tgtggttgcg attcatgcag ccatgggagg tggaaccggg ttaaatctct 4800
ttcaacgtcg cttcccaaca agatgtttcg atgtaggaat agcggaacaa cacgcagtta 4860
cttttgctgc gggtttagcc tgtgaaggcc ttaaaccctt ctgtgcaatc tattcgtctt 4920
tcatgcagcg tgcttatgac caggttgtcc atgatgttga tttgcaaaaa ttaccggtga 4980
gatttgcaat ggatagagct ggactcgttg gagctgatgg tccgacacat tgtggagctt 5040
tcgatgtgac atttatggct tgtcttccta acatgatagt gatggctcca tcagatgaag 5100
cagatctctt taacatggtt gcaactgctg ttgcgattga tgatcgtcct tcttgtttcc 5160
gttaccctag aggtaacggt attggagttg cattacctcc cggaaacaaa ggtgttccaa 5220
ttgagattgg gaaaggtaga attttaaagg aaggagagag agttgcgttg ttgggttatg 5280
gctcagcagt tcagagctgt ttaggagcgg ctgtaatgct cgaagaacgc ggattaaacg 5340
taactgtagc ggatgcacgg ttttgcaagc cattggaccg tgctctcatt cgcagcttag 5400
ctaagtcgca cgaggttctg atcacggttg aagaaggttc cattggaggt tttggctcgc 5460
acgttgttca gtttcttgct ctcgatggtc ttcttgatgg caaactcaag tggagaccaa 5520
tggtactgcc tgatcgatac attgatcacg gtgcaccagc tgatcaacta gctgaagctg 5580
gactcatgcc atctcacatc gcagcaaccg cacttaactt aatcggtgca ccaagggaag 5640
ctctgttttg agagctc 5657
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaacctggca gtgtggttc 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaaggactgc aggcgggatg 20

Claims (6)

1.一种包括虾青素合成酶融合基因、以CaMV35S启动子作为启动子的重组质粒或者包括所述重组质粒的重组菌在降低亚麻荠植株高度和/或增加亚麻荠植株分枝数中的应用；
所述虾青素合成酶融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述重组质粒以pBI121作为原始质粒。
2.一种包括虾青素合成酶融合基因、以CaMV35S启动子作为启动子的重组质粒或者包括所述重组质粒的重组菌在提高亚麻荠种子中类胡萝卜素的含量中的应用；
所述虾青素合成酶融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述重组质粒以pBI121作为原始质粒。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述类胡萝卜素包括虾青素。
4.一种包括虾青素合成酶融合基因、以CaMV35S启动子作为启动子的重组质粒或者包括所述重组质粒的重组菌在提高亚麻荠种子总抗氧化能力中的应用；
所述虾青素合成酶融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述重组质粒以pBI121作为原始质粒。
5.根据权利要求1~4任意一项所述应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：
将所述重组质粒或者重组菌导入亚麻荠植株，培育，得到亚麻荠种子，从亚麻荠种子中选择颜色为红色的种子，得到目标亚麻荠种子。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述导入的方法包括农杆菌花序浸染法。
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