CN115948456A

CN115948456A - 一种可提升广藿香醇合成量的融合基因及方法

Info

Publication number: CN115948456A
Application number: CN202211273337.0A
Authority: CN
Inventors: 徐海洋; 陈静; 王莹; 谭静
Original assignee: Chongqing University
Current assignee: Chongqing University
Priority date: 2022-10-18
Filing date: 2022-10-18
Publication date: 2023-04-11

Abstract

本发明公开了一种可提升广藿香醇合成量的融合基因及方法。该方法在MEP通路中构建了FPP合成通路，使MEP通路导向合成FPP，并异源表达广藿香醇合成酶，然后以FPP为底物合成广藿香醇。本发明以番茄果实为底盘，在其细胞质体的MEP通路中重构广藿香醇合成通路，并构建了融合基因，然后利用果实特异性启动子PG(聚半乳糖醛酸酶)驱动融合基因SPPTS和DXS‑FPPS的超表达，将MEP通路中的代谢流从类胡萝卜素(主要为番茄红素)的生物合成导向合成广藿香醇，可显著提升广藿香醇的合成量，使其鲜重合成量可达84.7μg/g。

Description

一种可提升广藿香醇合成量的融合基因及方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种可提升广藿香醇合成量的融合基因及方法。

背景技术

广藿香(Pogostemonis Herba)，属于唇形科的药用植物，主要应用价值是广藿香精油。广藿香精油具有杀虫、抗病原菌、抗真菌等作用，常用于制造肥皂、香水、沐浴露和清洁剂等。广藿香精油含有大量的次级代谢产物包括广藿香醇和广藿香酮，是其香气的主要来源。广藿香醇是一种天然的三环倍半萜，在我国是作为广藿香药材和广藿香精油质量评价的标志化合物。广藿香醇具有多种有益的药理特性，如免疫增强活性、抗炎活性、抗癌活性、抗氧化活性、抗病原微生物、抗菌活性、抗病毒活性、抗真菌活性、杀虫活性和镇静安神活性。广藿香醇的合成通路已被解析，通过细胞质的MVA通路合成，法尼基焦磷酸(FPP)是倍半萜类化合物(C15)的前体物质，由一分子DMAPP和两分子IPP通过法尼基焦磷酸酯合成酶(FPPS)缩合而成。倍半萜类化合物由倍半萜合成酶催化FPP生成。FPP在广藿香醇合成酶(PcPS；PTS,uniprot:Q49SP3)的催化下转化为广藿香醇。

目前广藿香醇的主要来源是从广藿香植物中提取，但提取过程复杂，成本高昂。尽管近年来以代谢工程为背景，在酿酒酵母、青苔门菌和青微藻衣原体等多个微生物宿主表达广藿香醇合成酶来合成广藿香醇，但存在一些问题，例如需要外加大量碳源和能源并难以大规模推广。因此发掘潜在的经济、环保、高效的代谢工程宿主底盘是解决以上问题的关键。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种可提升广藿香醇合成量的融合基因及方法，以番茄果实为底盘，在细胞质体中重组广藿香醇合成通路，构建融合基因，将代谢流从类胡萝卜素(主要为番茄红素)的生物合成导向广藿香醇的生物合成，建立了高量合成广藿香醇的方法，可有效的提升广藿香醇的合成。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种提升广藿香醇合成量的方法，在MEP通路中构建FPP合成通路，使MEP通路导向合成法尼尔基焦磷酸，并异源表达广藿香醇合成酶，然后以FPP为底物合成广藿香醇。

进一步地，以番茄果实为植物底盘，并在果实细胞质体的MEP通路中构建FPP合成通路。

进一步地，MEP通路中构建FPP合成通路的过程为：

将FPPS与果实质体MEP通路中的定位基因DXS融合，构建如SEQ ID NO.7所示的DXS-FPPS基因，通过该基因使FPP在果实质体中定位合成；FPPS的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。

进一步地，DXS基因去除终止密码子后，以SSSG作为连接肽与FPPS连接。

在MEP通路中合成FPP的过程还包括：

在FPPS的氨基端(N-端)连接水芹烯合酶PHS1的信号肽SP，在果实质体内构建如SEQ ID NO.5所示的SPFPPS融合基因，使其在细胞质体中超表达FPPS。

进一步地，广藿香醇合成酶PTS氨基端(N-端)连接有信号肽SP，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的SPPTS。

进一步地，启动子为PG(聚半乳糖醛酸酶)启动子。

一种以番茄果实为植物底盘提升广藿香醇合成量的方法，包括以下步骤：

(1)分别获得含有如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的番茄转基因植株；

(2)将含有SEQ ID NO.7所示序列的番茄转基因植株分别与含有如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5所示序列的番茄转基因植株杂交，种植T0代种子，然后筛选获得阳性植株即可。

本发明的有益效果：

1、本发明以番茄果实为底盘，在其细胞质体的MEP通路中重构广藿香醇合成通路，并构建了融合基因DXS-FPPS，然后利用果实特异性启动子PG(聚半乳糖醛酸酶)，驱动融合基因SPPTS和DXS-FPPS的超表达，将MEP通路中的代谢流从类胡萝卜素(主要为番茄红素)的生物合成导向合成广藿香醇，可显著提升广藿香醇的合成量，使其鲜重合成量可达84.7μg/g，是目前已报道的以高等植物为底盘合成倍半萜化合物广藿香醇的最高产量。

2、本发明选择番茄果实作为底盘，在果实成熟的启动子控制下，通过本申请在MEP通路中重构的广藿香醇合成通路，可将代谢流从类胡萝卜素的生物合成导向广藿香醇的生物合成，且不会对植物正常的营养生长及光合作用产生影响。此外，番茄果实的收割体系及相关化合物的提取工艺都比较成熟。因此，番茄果实是一种经济、环保、高效的合成植物萜类及其衍生物的植物底盘。

附图说明

图1为FPPS、PTS、SPFPPS、SPPTS和DXS-FPPS基因的亚细胞定位；

图2为PTS、FPPS和DXS基因在不同转基因番茄中的表达量；

图3为GC-MS检测AC和SPPTS转基因番茄果实中倍半萜化合物的色谱图；

图4为RT-PCR分析FPPS、PTS和DXS在不同转基因植物和野生型番茄果实中的表达量；

图5为AC和不同转基因番茄成熟果实的照片及番茄红素的含量；

图6为GC-MS分析不同转基因番茄果实中FPP的含量；

图7为GC-MS分析不同转基因植物和野生型番茄成熟果实中倍半萜的色谱图及广藿香醇含量。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

本发明所用的原生质体亚细胞定位载体是pTF486，GFP蛋白位于碳端(C-端)实验室保存。pBIN19-PG是文献报道的果实成熟特异性表达载体，本实验室保存，使用的野生型番茄品种为“Solanum lycopersicon Mill.cv.Ailsa Craig”，是实验室保留品种。

实施例1融合基因的亚细胞定位

一、拟南芥原生质体亚细胞定位载体构建

需要构建的载体包括：PTF-SP、PTF-DXS、PTF-FPPS、PTF-PTS、PTF-SPPTS、PTF-SPFPPS和PTF-DXS-FPPS。

本申请中使用到的序列如下：

PTS广藿香醇合成酶序列已公布，如SEQ ID NO.1所示。

SP是水芹烯合成酶PHS1信号肽的缩写，如SEQ ID NO.2所示。

DXS是1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶序列如SEQ ID NO.6所示。

FPPS法尼尔基焦磷酸合成酶核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

SPPTS(SEQ ID NO.3)是由广藿香醇合成酶PTS和水芹烯合成酶PHS1的信号肽SP(SEQ ID NO.2)组成的融合基因。

SPFPPS(SEQ ID NO.5)是由162个碱基的信号肽SP(SEQ ID NO.2)和法尼尔基焦磷酸合成酶FPPS(SEQ ID NO.4)构成的融合基因。

DXS-FPPS(SEQ ID NO.7)融合基因是由1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶DXS(SEQID NO.6)去除终止密码子后，以SSSG为Linker融合FPPS基因(SEQ ID NO.4)形成。具体步骤如下：

载体PTF-SP、PTF-DXS、PTF-FPPS、PTF-PTS、PTF-SPPTS、PTF-SPFPPS和PTF-DXS-FPPS

1、引物设计

构建载体PTF-SP，扩增SP基因的引物是：

PTF-SP-F:

PTF-SP-R:

构建PTF-DXS载体，扩增DXS基因的引物是：

PTF-DXS-F:

PTF-DXS-R:

构建PTF-FPPS载体，扩增FPPS基因的引物是：

PTF-FPPS-F:

PTF-FPPS-R:

构建载体PTF-PTS，扩增PTS基因的引物是：

PTF-PTS-F:

PTF-PTS-R:

构建载体PTF-SPPTS，扩增SPPTS基因的引物是：

PTF-SPPTS-F:

PTF-SPPTS-R:

构建载体PTF-SPFPPS，扩增SPFPPS基因的引物是：

PTF-SPFPPS-F:

PTF-SPFPPS-R:

载体PTF-DXS-FPPS，扩增基因DXS-FPPS的引物是：

PTF-DXS-FPPS-F:

PTF-DXS-FPPS-R:

2、PCR扩增目的基因片段

PCR扩增的反应体系：总反应体积50μL，其中Takara prime start Max Premix酶25μL，正向引物(10μM)2μL，反向引物(10μM)2μL，DNA模板1μL，ddH₂O补足至50μL。

PCR扩增程序是：98℃预变性2分钟，98℃变性10秒，55℃退火10秒，72℃延伸20秒，12℃保持10分钟，共35个循环。

3、将获得的PCR产物片段分别进行切胶回收，然后用

HiFi DNAAssembly Cloning Kit试剂盒进行同源重组，胶回收产物分别与SalI和BamHI双酶切载体PTF连接。

4、将连接产物转化大肠杆菌感受态JM109，吸100μL菌液涂在含有50μg/mL的氨苄霉素的板上，37℃的培养箱过夜培养。

5、挑单菌落于无菌水中，进行菌落PCR检测，引物为：

PTF-F:AAGATGCCTCTGCCGACAGT

PTF-R:GTGGTGCAGATGAACTTCAG

6、将鉴定为阳性的菌株，于20mL的LB含50μg/mL的Amp抗生素，在37℃转速为200rpm的摇床上振荡培养过夜，吸菌液送测序，测序正确即获得阳性菌株。

7、扩摇阳性菌株，收集菌体使用中提质粒试剂盒(QIAGEN)按说明书步骤提取质粒，质粒浓度在1000-1500ng/μL备用转拟南芥原生质体。

二、拟南芥原生质体制备

1、选取4周左右健壮的拟南芥莲座叶5-8片，用透明胶轻轻的将叶片的下表皮粘下来，裸露出下表皮叶肉细胞。

2、将露出叶肉细胞的叶片放置在含有15mL酶裂解液(0.6M的甘露醇、1.5％纤维素酶、0.75％离析酶、0.1％ BSA、1mM CaCl₂、20mM KCl和10mM MES-KOH)的锥形瓶中，22℃40rpm暗培养3小时。

3、在酶解液中加入等体积的W5溶液(154mM NaCl、125mM CaCl₂、5mM KCl和2mMMES)，终止酶解反应。

4、用尼龙网将溶液过滤至圆底离心管中，100g离心5min(离心机加减速均设为1)，尽可能除去上清。

5、加入3mL的W5溶液，轻轻混匀，冰上放置30min，原生质体在重力的作用下沉至管底，尽可能除去W5溶液，加入1mL的MMG溶液(0.6M甘露醇、20mM KCl和4mM的MES)。

6、在2mL离心管中加入10μL质粒，加入100μL的原生质体溶液，轻轻混匀。

7、逐滴加入100μL的PEG溶液(40％的PEG、0.4M的甘露醇、1M的CaCl₂，用KOH调pH至7.5-8.0)，轻弹管底至完全混匀，室温放置20分钟。

8、加入400μL的W5溶液混匀终止转化过程，100g离心2分钟，去上清。

9、加入1mL的W5溶液重悬原生质体，将原生质体转移至细胞培养板中，室温培养16-20小时。

10、离心机100g离心2分钟收集原生质体，用于共聚焦显微镜荧光观察。

结果如图1所示，不同基因的亚细胞定位，空载PTF表达的GFP蛋白没有特有的细胞器定位，FPPS-GFP和PTS-GFP荧光蛋白均在原生质体的细胞质中表达。信号肽SP-GFP定位在质体，当信号肽SP与基因FPPS融合，SPFPPS-GFP只在质体中检测到绿色荧光信号，融合基因SPPTS在质体中表达荧光蛋白，表明SP分别将细胞质定位的FPPS和PTS成功定位到质体表达活性蛋白。基因DXS是质体定位，与FPPS融合形成DXS-FPPS在质体表达蛋白。图1结果表明信号肽融合基因的方式将基因SPFPPS、SPPTS和DXS-FPPS定位在质体。

实施例2

含有重组质粒PG-PTS、PG-SPPTS、PG-SPFPPS和PG-DXS-FPPS转基因番茄的获得

一、PG-PTS、PG-SPPTS、PG-SPFPPS和PG-DXS-FPPS重组载体的构建

1、引物设计

(1)构建PG-PTS载体，扩增基因PTS的引物：

PG-PTS-F:

PG-PTS-R:

(2)融合基因SPPTS需要两对特异性引物，分别扩增SP和PTS进行多片段同源重组，具体如下：

扩增基因SP的引物：

PG-SP-F:

PG-SP-R:GCTGCTCAATGTCGTAGTGAGAGG

扩增基因PTS的引物：

PG-SPPTS-F:ATGATAGTTGGCTATAGAAGCACAATC

PG-SPPTS-R:

(3)融合基因SPFPPS是在基因FPPS的氮端(N-端)连有信号肽SP，扩增基因FPPS的引物：

PG-FPPS-F:ATGATAGTTGGCTATAGAAGCACAATC

PG-FPPS-R:

(4)融合基因DXS-FPPS需要两对特异性引物分别扩增DXS和FPPS，具体如下：

扩增基因DXS的引物：

PG-DXS-F:

PG-DXS-R:TGTCATGACCTCTAGAGCCTCTCTG

扩增基因FPPS的引物

PG-DFPP-F:

PG-DFPP-R:

2、PCR体系和反应程序

方法同上，与实施案例1使用相同的PCR扩增体系及反应程序。

3、同源重组的方式将以上基因胶回收片段分别与SpeI和BamHI双酶切的pBIN19-PG空载连接，其中，PG-PTS是PTS和pBIN19-PG重组，PG-SPPTS是PTS、SP和pBIN19-PG重组，PG-SPFPPS是SP、FPPS和pBIN19-PG重组，PG-DXS-FPPS是DXS、FPPS和pBIN19-PG同源重组。

上述重组过程涉及两个片段和多片段的重组连接，片段的使用浓度及连接体系以表1所示。

表1连接体系

4、上述连接片段在PCR仪55℃连接一个小时，将连接产物转化至JM109感受态中，菌液涂在含有50μg/mL的卡那霉素的板上，放在37℃的恒温培养箱培养过夜；

5、挑选单菌落进行PCR鉴定，将扩增出目的片段的菌株，摇菌，送测序，测序正确即为阳性菌株；

6、阳性菌株扩摇，提质粒即为重组表达载体PG-PTS、PG-SPPTS、PG-SPFPPS和PG-DXS-FPPS，分别转化农杆菌GV3101在含有50μg/mL卡纳霉素和100μg/mL利福平的平板上，在28℃培养箱倒置培养两天，挑选单克隆进行菌落PCR验证，正确的菌株即为所述重组表达载体的工程菌，挑选正确菌株于20mL的LB含有50μg/mL卡纳霉素和100μg/mL利福平，28℃180rpm摇床，振荡培养两天，60％甘油和工程菌按体积比1:1的比例于2mL管中混匀并长期保存于-80℃冰箱备用。

二、PTS、SPPTS、SPFPPS和DXS-FPPS转基因番茄的培育

用含有重组质粒PG-PTS、PG-SPPTS、PG-SPFPPS和PG-DXS-FPPS的农杆菌通过叶盘法转化番茄外植体，具体步骤如下：

1、种子消毒

该发明使用的番茄品种是Ailsa Craig，选择适量的种子于无菌瓶中，用75％的无水乙醇消毒30秒，倒掉乙醇，加入适量的5％的次氯酸钠溶液，在100rpm摇床放置15分钟，然后用无菌水清洗3-5次，最后加入少量无菌水，摇床摇2-3天。将发芽的种子播种到1/2MS(1L的1/2MS培养基需要4.4g MS+8g琼脂，pH＝5.9)培养基，放置于光照培养箱，在26±2℃、光周期16h/d、光照强度3000-5000lx条件下培养10天左右。

2、外植体预培养

当番茄的子叶舒展，真叶即将长出时，在无菌的滤纸上，用镊子和手术刀将子叶和下胚轴切段，小心将它们移到KCMS固体培养基即质量分数为2％的蔗糖、0.8％的琼脂粉、0.9mg/L的VB1、0.4mM的AS，0.2mg/L的2,4-D和0.1mg/L的KT，pH为5.8的MS固体培养基中预培养一天。

3、农杆菌侵染外植体

从超低温冰箱取出工程菌的甘油菌50μL，加入到20mL的LB(含有50mg/L卡那霉素和100mg/L的利福平)28℃，250rpm培养过夜。吸取1mL菌液于20mL的无抗生素的LB培养基中，在28℃摇床振荡培养4-6小时，直到OD₆₀₀约1.0吸取1mL菌液，5000rpm离心5min，弃上清，用KCMS液体培养基洗涤两次，再用KCMS液体培养基将菌液稀释至OD₆₀₀约为0.1。在外植体的两端伤口处滴加10μL稀释好的农杆菌，在光照培养箱中暗培养2天。

4、组培苗的培养

将暗培养两天的外植体，转移至初筛2Z培养基上(质量分数为3％的蔗糖、0.8％的琼脂、100mg/L的Aug、100mg/L的Tm、100mg/L的Kan和200mg/L的ZR、pH为5.8的MS固体培养基)，每2周更换一次2Z培养基。待有分化的芽冒出时，将外植体转移至1Z培养基(与2Z培养基相比仅ZR减半其它均一样)，每2周更换一次培养基。当分化的愈伤组织长出具有独立主茎的芽体后，切下并插入生根培养基ENR(质量分数为1％的蔗糖、0.8％的琼脂、100mg/L的Aug、100mg/L的Tm、50mg/L的KOH调pH为5.8的MS固体培养基)中待生根，将组培苗移栽进行土培。

5、转基因阳性植株的鉴定

PCR阳性鉴定：

(1)PTS基因检测的前引物如下：

PTS-Ce-F：ATGGAGTTGTATGCCCAAAGTGTTG；

后引物是在PG-Terminator序列的尾端设计，具体如下：

PG-Ce-R:CAACAAGAAATACCAAAGGGATATATACATC。

(2)SPPTS基因的3’端信号肽上设计一段前引物

SP-Ce-F:ATGATAGTTGGCTATAGAAGCAC

SPPTS基因检测的后引物同步骤(1)中的后引物。

SPFPPS基因与SPPTS基因使用相同的检测引物，因为基因的氮端连有相同的信号肽SP，即信号肽上的前引物和载体上的后引物。DXS-FPPS转基因植物的前引物为：DXS-Ce-F:GACCATGGATCTCCTGTTGATC，检测后引物同样使用PG-Ce-R。

以幼苗的基因组DNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳，片段大小与预期一致时暂定为转基因阳性植株。已鉴定的阳性植株在植物培养室培养生长，保持光照14h/d，温度25℃；黑暗10h/d，温度20℃；光照强度250μmol·m^-2·s^-1；相对湿度80％的环境。

6、qRT-PCR检测转基因植株的表达量，具体过程如下：

(1)以破色+2时期的番茄果实为样本，三个生物学重复，去除种子和果浆，以果皮为组织样品，液氮研磨，称取100mg植物组织提RNA备用。

(2)提果实的总RNA，使用TIANGEN的多糖多酚植物总RNA提取试剂盒，果实RNA的浓度在200-300ng/μL备用。

(3)cDNA逆转录试剂盒(Thermo Fisher Scientific)根据说明书将RNA反转为cDNA作为RT-PCR的定量模板。

(4)使用Power SYBR Green PCR master mix(Takara)进行实时定量PCR分析，以SlActin作为内参基因对数据进行评估，检测结果如图2所示。

Real-time PCR反应体系：25μL总体系中包含12.5μL SYBR PCR master mix，2μLcDNA模板，1μL浓度为10μM的正向引物，1μL浓度为10μM的反向引物，超纯水补足至25μL。

SlActin基因的定量引物

Actin-RT-F：GTCCTCTTCCAGCCATCCATG

Actin-RT-R：CCACTGAGCACAATGTTACCG

PTS基因的定量引物

PTS-RT-F:CGCCTTCTCAGACAACATGG

PTS-RT-R:GATGCGTGGCTTCGAAGAAT

FPPS基因的定量引物

FPPS-RT-F:GCTGGTGCATTGAATGGCTT

FPPS-RT-R:TGGTTGCGAAGAAGAATGCC

检测DXS基因的定量引物

DXS-RT-F:GGATTGGCTTGTGAAGGCAT

DXS-RT-R:AACAAGACCTGCTCTGTCCA

如图2所示，PTS的两个转基因株系中PTS-32株系的PTS表达量明显高于PTS-36。四株SPPTS转基因株系中SPPTS-13的PTS表达量显著高于其它三个株系，被用作后续杂交实验。基因FPPS在SPFPPS-15转基因株系的转录水平显著高于其它三个株系。DXS-FPPS融合基因的转基因番茄有四株，分别检测它们的DXS和FPPS的转录水平，DXS-FPPS-17株系的DXS和FPPS的表达量均显著高于其它三个株系。

根据图2的检测结果，从中选择目标基因表达量最高的株系进行后续的杂交实验。

实施例3GC-MS检测转基因番茄中萜类化合物

1、选择破色后十五天的成熟果实为材料，去除种子和果浆，液氮研磨果皮，每组至少3个生物学重复。

2、称取3g的果实粉末，加入3mL的MTBE含有0.5ng/μL正十四烷作为内标，振荡混匀，在室温50rpm的摇床上过夜提取。

3、最大转速离心10分钟，将2mL上清于新的玻璃瓶中，并吸取100μL于进样瓶中。

4、GC-MS进样，安捷伦GC-MS系统(Agilent 7890B-5977B)，色谱柱为RXi-5Sil MS柱(30m×0.25μm、256mm×0.25μm膜厚，RESTEK,USA)。柱箱温度程序如下：初始温度50℃，保持3min，然后以10℃/min的速率从50℃上升到320℃，并保持5min，进样体积为2μL。

如图3所示，GC-MS分析了AC和四株SPPTS转基因成熟番茄果实的萜类化合物，SPPTS是在PTS的氮端连有信号肽，将在细胞的质体中表达广藿香醇合酶催化合成倍半萜类化合物。SPPTS-1、SPPTS-13、SPPTS-15和SPPTS-40生成多种萜类化合物，通过与NIST库和标品比对，化合物分别是β-Patchoulene(β-广藿香烯)、trans-β-Caryophyllene(反式-β-石竹烯)、α-Guaiene(α-愈创木烯)、Seychellene(西车烯)、α-Patchoulene(α-广藿香烯)、γ-Patchoulenen(γ-广藿香烯)、Guai-4,11-diene(愈创木酚-4,11-二烯)、α-Bulnesene(α-布藜烯)和Patchoulol(广藿香醇)，这些化合物中广藿香醇含量相对较高，但以上化合物均未在野生型番茄AC果实中发现。

图3表明在番茄果实质体中成功构建了广藿香醇合成通路，SPPTS定位在细胞的质体，而质体的MEP通路不合成FPP，MVA代谢通路和MEP代谢通路之间存在化合物的穿梭作用，胞质中少量的FPP透过膜进入质体，从而在SPPTS转基因株系的番茄果实中有少量的广藿香醇生成。

实施例4在番茄果实中PTS酶以FPP为底物合成广藿香醇

具体过程如下：

1、选择花期的番茄，首先对开花前2-3天的花蕾去除雄蕊和花瓣作为母本，将开花当天的雄蕊取下作为父本，用镊子将雄蕊的花粉轻轻弹到母本的柱头，做好标记，母本和父本的选择是随机的。

2、杂交成功的果实，收种子并播种到土壤中，等长出幼苗，以基因组为模板进行PCR阳性鉴定，SPPTS×SPFPPS杂交成功的植株同时含有SPPTS和SPFPPS基因，SPPTS×DXS-FPPS植株应有SPPTS和DXS-FPPS两个融合基因的表达。

SPPTS基因的检测引物，

PTS-Ce-F：ATGGAGTTGTATGCCCAAAGTGTTG

PG-Ce-R:CAACAAGAAATACCAAAGGGATATATACATC

SPFPP基因的检测引物，

FPPS-Ce-F:ATGGCTGATCTGAAGAAGAAA

PG-Ce-R:CAACAAGAAATACCAAAGGGATATATACATC

DXS-FPP基因的检测引物，

DXS-Ce-F:GACCATGGATCTCCTGTTGATC

PG-Ce-R:CAACAAGAAATACCAAAGGGATATATACATC

3、在培养室种植杂交阳性植株，并采摘破色+2天的果实为材料，提RNA，反转cDNA，以此为模板进行RT-PCR，方法同实施案例2。

如图4所示，不同株系的番茄果实FPPS的转录水平不同，在SPFPPS-15番茄果实中转录最高，其次是杂交植株SPFPPS-15×SPPTS-13，DXS-FPPS-17和DXS-FPP-17×SPPTS-13两个株系的FPPS转录水平较低，在AC中的表达量最低。PTS在SPPTS-13转基因番茄果实中的转录水平最高，其次是杂交株系SPFPPS-15×SPPTS-13和DXS-FPP-17×SPPTS-13而且两株系的PTS转录水平差异不显著，PTS-32株系的PTS的转录水平较低，野生型番茄没有PTS的表达。我们还检测了DXS的转录水平，在AC中表达量较少，转基因植物DXS-FPPS-17番茄果实的DXS的转录水平显著提高，杂交株系DXS-FPPS-17×SPPTS-13的DXS的表达量与AC相比显著提高，但与母本DXS-FPPS-17相比有所减少。

为了利用质体的MEP通路的前体物质合成大量的广藿香醇，本发明重构质体的MEP通路，使其导向FPP的合成，融合基因SPFPPS即在FPPS的氮端连有质体定位的信号肽SP，在质体中合成FPP。为了进一步促进广藿香醇合成，我们将提高其合成前体FPP的含量，将MEP通路中的关键基因DXS与FPPS融合，使FPPS定位在质体的同时促进了底物DMAPP和IPP的积累，从而提高FPP的产量，为后续广藿香醇的合成提供原料。为了实现在质体中大量合成广藿香醇，采用杂交的方式，将SPPTS与SPFPPS杂交，SPPTS与DXS-FPPS杂交，分别在超表达SPFPPS和DXS-FPPS的番茄果实中过表达SPPTS。

实施例5不同转基因番茄果实中番茄红素含量的变化

番茄红素含量的测定的步骤如下：

1、破色后15天的番茄果实为实验材料，去除种子和果浆，液氮研磨果皮，称量0.5g的粉末于15mL管中。

2、番茄红素提取液，丙酮和正己烷体积比4:6，加10mL于管中，震荡混匀30秒，在4℃放置2小时，每间隔30分钟振荡混匀一次。

3、最大转速离心10min，取上清于新的离心管中。

4、吸2mL上清于石英比色皿中，用分光光度计分别测量在波长A₆₆₃、A₆₄₅、A₅₀₅和A₄₅₃的吸光值。

5、代入公式：

Lycopene(μg/g FW)＝0.0458*A₆₆₃+0.204*A₆₄₅+0.372*A₅₀₅-0.0806*A₄₅₃计算番茄红素的含量。

如图5A非转基因植物AC和不同转基因株系成熟果实的照片，它们的颜色有明显差异，AC、PTS-32和SPPTS-13的成熟果实正常变红，而转基因株系SPFPPS-15和DXS-FPPS-17成熟果实一直是黄色不能正常变红，杂交的两个株系SPFPPS-15×SPPTS-13和DXS-FPPS-17×SPPTS-13番茄果实的颜色与母本SPFPPS-15和DXS-FPPS-17相比颜色有所恢复呈现橙色，但并未完全变红。

番茄果实成熟过程中的颜色的变化主要由番茄红素的含量决定，番茄红素是由质体的MEP通路生成，PTS-32是利用细胞质中的FPP合成广藿香醇，SPPTS-13成功将广藿香醇合成酶定位在质体，并利用质体中少量的FPP合成广藿香醇，因为质体不能自主合成FPP，质体中少量的FPP来源于细胞质的穿梭，不影响MEP通路番茄红素的合成。

如图5B所示AC、PTS-32和SPPTS-13成熟果实的番茄红素含量较高，鲜重含量分别是83.9μg/g、76.7μg/g和79.0μg/g，它们之间的番茄红素含量差异不显著。而转基因植物SPFPPS-15和DXS-FPPS-17将FPPS定位到质体，FPP合成酶利用质体MEP通路中的IPP和DMAPP大量合成FPP，FPP的积累可能反馈抑制MEP通路，能被利用合成番茄红素的前体减少，导致番茄红素的含量急剧下降，SPFPPS转基因番茄果实番茄红素的鲜重含量是5.1μg/g，DXS-FPPS转基因番茄果实中番茄红素的含量最低只有2.9μg/g鲜重。而杂交株系SPFPPS-15×SPPTS-13和DXS-FPPS-17×SPPTS-13质体定位的SPPTS能利用质体中过剩的FPP生成广藿香醇，激活MEP通路合成番茄红素，番茄红素的鲜重含量分别是45.8μg/g和36.9μg/g。

实施例6不同转基因番茄果实的FPP库含量

由于番茄果实的FPP含量较低，游离的FPP不稳定易被水解，因此，采用碱性磷酸酶水解的方式将FPP水解生成FOH(法尼尔醇)，根据法尼尔醇的标准曲线，测定其水解产物FOH的含量，从而估算番茄果实FPP的浓度。具体步骤如下：

1、破色后15天的番茄果实为实验材料，去除种子和果浆，液氮研磨果皮，称量2g的粉末于2mL管中，室温放置15min。

2、最大转速离心5min，将上清转移至新的离心管中，酶促反应体系：20units牛肠碱性磷酸酶(Sigma-Aldrich)、20units的马铃薯三磷酸腺苷双磷酸酶(Sigma-Aldrich)和0.2M的Tris-HCl(pH 9.5)，轻轻混匀，放置28℃培养箱过夜。

3、加入2mL含有0.5ng/μL正十四碳烷为内标的MTBE，振荡混匀，最大转速离心15min，吸0.5mL的MTBE于进样瓶。

4、GC-MS进样方法同上，实施案例3。

如图6所示，AC、SPFPPS-15、PTS-32、SPPTS-13和SPFPPS-15×SPPTS-13的番茄果实中未检测到FPP的合成，而转基因株系DXS-FPPS-17成熟果实中FPP的含量最高，鲜重FPP含量为7.0nM/g，杂交番茄DXS-FPPS-17×SPPTS-13的成熟果实中FPP含量是0.7nM/g鲜重。说明在番茄果实中超表达DXS-FPPS显著提高了FPP库含量。

实施例7不同转基因植物广藿香醇的含量

具体步骤如下：

1、GC-MS检测不同株系的萜类化合物的方法同实施例3所述方法一致。

2、用不同广藿香醇浓度0.01mM、0.02mM、0.05mM、0.1mM、0.2mM和0.5mM建立标准曲线，用于后续广藿香醇含量的计算。

如图7A所示，GC-MS检测不同转基因番茄萜类化合物，Tetradecane是正十四烷作为内标，通过与NIST库和标品比对我们发现SPFPPS-15×SPPTS-13和DXS-FPPS-17×SPPTS-13番茄果实中有trans-β-Caryophyllene(反式-β-石竹烯)、α-Guaiene(α-愈创木烯)、Seychellene(西车烯)、α-Patchoulene(α-广藿香烯)、γ-Patchoulenen(γ-广藿香烯)、Guai-4,11-diene(愈创木烯-4,11-二烯)、α-Bulnesene(α-布藜烯)和Patchoulol(广藿香醇)化合物。

如图7B为广藿香醇在不同株系中的含量，AC、SPFPPS-15和DXS-FPPS-17未生成广藿香醇，PTS-32和SPPTS-13含有少量的广藿香醇，鲜重广藿香醇含量分别是9.9μg/g和1.6μg/g，杂交株系DXS-FPPS-17×SPPTS-13和SPFPPS-15×SPPTS-13提高了广藿香醇合成的前体FPP的积累，进而促进广藿香醇的生成，广藿香醇的含量分别是84.7μg/g和43.5μg/g鲜重，DXS-FPPS-17×SPPTS-13株系番茄果实的广藿香醇含量是SPFPPS-15×SPPTS-13的二倍，是SPPTS转基因番茄果实的53倍。可见，DXS-FPPS融合基因超表达成功将FPPS高表达的同时，也高量表达DXS基因，激活MEP通路合成高量的原材料FPP，在超表达DXS-FPPS番茄果实中过表达SPPTS显著提高广藿香醇的合成，高达84.7μg/g鲜重，是目前已报道的以高等植物为底盘合成倍半萜化合物广藿香醇的最高产量。表明采用本申请所构建的技术方案能够促进广藿香醇大量的合成。

Claims

1.一种提升广藿香醇合成量的方法，其特征在于，在MEP通路中构建FPP合成通路，使MEP通路导向合成FPP，并异源表达广藿香醇合成酶，然后以FPP为底物合成广藿香醇。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以番茄果实为植物底盘，在果实细胞质体的MEP通路中构建FPP合成通路。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述MEP通路中构建FPP合成通路的过程为：

将FPPS与MEP通路中的关键基因DXS融合，构建如SEQ ID NO.7所示的DXS-FPPS基因，通过该融合基因使FPP在果实质体中定位合成；所述FPPS的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述DXS基因去除终止密码子后，以SSSG作为连接肽与FPPS连接。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在MEP通路中合成FPP的过程还包括：

在FPPS的氨基端连接水芹烯合酶PHS1的质体定位信号肽SP，在果实质体内构建如SEQID NO.5所示的SPFPPS，使其在质体中超表达FPPS。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述广藿香醇合成酶PTS氨基端连接有水芹烯合酶PHS1的信号肽SP，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示SPPTS。

7.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，驱动广藿香醇合成酶的启动子为PG启动子。

8.一种以番茄果实为植物底盘提升广藿香醇合成量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)将含有SEQ ID NO.3所示序列的番茄转基因植株分别与含有如SEQ ID NO.5和SEQID NO.7所示序列的番茄转基因植株杂交，种植T0代种子，然后筛选获得阳性植株即可。

9.一种可提升广藿香醇合成量的融合基因，其特征在于，所述融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。