CN111500606A - 一个参与桃芳樟醇生物合成的基因及其应用 - Google Patents

一个参与桃芳樟醇生物合成的基因及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一个参与桃芳樟醇生物合成的基因及其应用，所述基因为PpTPS3。桃果实的PpTPS3基因表达与芳樟醇含量呈正相关关系。体外功能验证表明，重组蛋白PpTPS3能够以GPP为底物催化合成芳樟醇。在桃果实中过量表达PpTPS3，显著促进了芳樟醇含量的增加。在番茄果实中采用遗传转化技术过量表达PpTPS3也显著提升了芳樟醇的积累。由此表明，所述PpTPS3可显著促进芳樟醇生物合成，是利用基因工程和育种技术改善桃果实芳香品质的重要基因。

Description

一个参与桃芳樟醇生物合成的基因及其应用
技术领域
本发明属于植物分子生物技术和基因工程技术领域，涉及一个参与桃芳樟醇生物合成的基因及其应用，是一个参与桃果实挥发性萜烯类物质芳樟醇生物合成的基因及应用。
背景技术
萜类途径挥发性物质是植物种类最为丰富的次生代谢产物，在生长发育过程中具有重要作用。芳樟醇是一种线性的单萜醇，具有花香、甜香和醇香，是很多果实和花香气的重要来源。此外，芳樟醇在植物防御反应及植物间信号转导中发挥重要作用。芳樟醇是重要的化学信息素，可吸引植物取食害虫的天敌或直接作为一些蚜虫的驱虫剂，也具有一定抗菌作用。
桃(Prunus Persica)属于蔷薇科、桃属植物，原产于中国，在世界各地均有栽植。桃作为重要的大众经济水果，其基因组较小，可以作为蔷薇科植物研究的模式材料。芳香是影响果实消费的重要品质，芳樟醇是桃果实香味形成的重要物质基础。因此，鉴别参与芳樟醇合成关键基因具有重要生物学和产业意义。
芳樟醇是单萜(C10)类化合物，主要在质体中通过甲基赤藓醇磷酸(MEP)途径合成，其前体物质是牻牛儿基二磷酸(GPP)。萜类合成酶TPS是芳樟醇生物合成途径的末端酶，已经在番茄，苹果，葡萄，猕猴桃，小苍兰等多个物种上有研究。对于芳樟醇等萜类物质而言，它可以由多个TPS催化合成。同时，TPS蛋白可以催化GPP生产多个产物。TPS基因包括多个家族成员，由于萜类物质代谢的复杂性，参与桃果实芳樟醇生物合成的TPS基因有待进一步鉴别。
发明内容
本发明的目的是提供一个参与桃芳樟醇生物合成的基因，所述基因是PpTPS3基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述PpTPS3基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQID NO.4所示。
该基因的特征功能如下：
1.基因的表达特征：在不同品种的桃果实，果实的不同发育阶段和不同组织中，PpTPS3的基因表达都与芳樟醇的含量呈正相关关系。在花叶果等组织中，PpTPS3在果实中表达量最高，见实施例1。
2.基因的功能特征：在大肠杆菌中表达pET6xHN-N-PpTPS3重组载体从而得到重组蛋白，检测蛋白活性结果证明PpTPS3编码的蛋白能将牦牛儿基二磷酸(GPP)转化为单萜类挥发性物质芳樟醇，见实施例2。
本发明的另一个目的是提供所述PpTPS3基因在基因工程中的应用，是开展基因工程和改良育种的重要候选基因，可改善果实的芳香品质和提高抗性能力。通过将pGreenII002962-SK-PpTPS3重组载体和pBI121-PpTPS3重组载体分别在桃果实和番茄果实中过量表达，结果证明PpTPS3编码的蛋白能够促进芳樟醇的积累，见实施例3和实施例4。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一个参与桃芳樟醇生物合成的基因PpTPS3,所述PpTPS3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述PpTPS3的PCR扩增的上游引物具有如序列表中SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列；所述PpTPS3的PCR扩增的下游引物序列如SEQ ID No.3所示。
本发明提供了上述方案所述基因PpTPS3编码的蛋白质含有535个氨基酸，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了一种包含上述方案所述基因PpTPS3的重组载体，所述重组载体优选的以pET6xHN-N(Clonetech，Takara)为原始载体，在pET6xHN-N的多克隆位点插入基因PpTPS3。
本发明还提供了一种包含上述方案所述基因PpTPS3的体外重组蛋白。
本发明还提供了所述基因PpTPS3的蛋白在体外合成芳樟醇的应用。
本发明还提供了所述的基因PpTPS3在桃果实和番茄果实中合成芳樟醇的应用。
本发明还提供了上述方案所述的基因PpTPS3在桃育种中的应用，所述应用优选为基因PpTPS3在桃果实芳香品质改善的基因工程育种中的应用。
本发明的有益效果：本发明提供了一个来源于桃的基因PpTPS3，并证明其重组蛋白具有催化合成芳樟醇的活性。本发明中，桃果实的PpTPS3基因表达与芳樟醇含量呈正相关关系。体外功能验证表明，重组蛋白PpTPS3能够以GPP为底物催化合成芳樟醇。在桃果实中过量表达PpTPS3，显著促进了芳樟醇含量的增加。在番茄果实中采用遗传转化技术过量表达PpTPS3也显著提升了芳樟醇的积累。所述PpTPS3可显著促进芳樟醇生物合成，是利用基因工程和育种技术改善桃果实芳香品质的重要基因。本发明利用基因工程方法过量表达该基因，显著促进了桃果实和番茄果实的芳樟醇含量。本发明对于利用基因工程提高芳樟醇含量，提升桃果实芳香品质，具有重要应用价值。
附图说明
图1：不同桃品种果实的PpTPS3表达与芳樟醇含量。
图2：桃果实成熟过程中的PpTPS3表达与芳樟醇含量。
图3：重组蛋白PpTPS3催化GPP产生芳樟醇。
图4：过表达PpTPS3显著提高了桃果实芳樟醇含量。
图5：过量表达PpTPS3显著提高了转基因番茄果实芳樟醇含量。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步的阐述，但实施例不限制本发明保护范围。
实施例1桃PpTPS3的表达与芳樟醇含量具有正相关关系
(一)实验方法
1.桃果实材料
采集九个桃品种果实的成熟期样品，包括‘光核桃’(GHT)，‘红根甘肃桃’(HGGST)，‘红花山桃’(HHST)，‘早上海水蜜’(ZSHSM)，‘富阳赤月’(FYCY)，‘红蟠1号’(HP1)，‘红蟠2号’(HP2)，‘湖景蜜露’(HJML)和‘丹霞’(DX)。‘湖景蜜露’桃果实分别在第一次快速生长期(花后34天，34DAB)，硬核期(71DAB)，第二次快速生长期(94DAB)，成熟期(108DAB)和完熟期(111DAB)取样。设置三个生物学重复，每个重复包含5个果实，果肉组织经液氮冷冻后于-80℃保存待用。
2.RNA提取和cDNA合成
利用CTAB法提取果实组织总RNA，利用PrimeScriptTM RT reaget kit with gDNAEraser(Takara)试剂盒去除基因组残留DNA并将RNA逆转录合成单链cDNA。
3.基因表达测定
qPCR以桃PpTEF2(SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6)为内参基因，PpTPS3引物序列为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8。qPCR反应体系总体积为20μL，包括上下游引物(10pM)各lμL，2μL cDNA(或以H2O作为阴性对照)，10μL Ssofast EvaGreen Supermix染料(Bio-Rad)和6μLH2O。PCR程序为：95℃3min；95℃10s，60℃30s，45个循环；95℃10s；从65℃到95℃，每上升0.5℃读取一次荧光信号值。所用仪器为Bio-Rad CFX96(Rio-Rad，Hercules，CA，美国)实时荧光定量PCR仪。
不同成熟阶段桃果实的RNA为材料，送由百迈克生物科技有限公司进行开展转录组测序，分析PpTPS3的表达模式。
4.桃果实挥发性芳樟醇含量分析
取样后的桃果肉样品经液氮研磨后称取5g，加入3mL 200mM EDTA溶液、3mL 20％CaCl2溶液及30μL的内标2-辛醇(0.8mg/mL)密封后混合均匀，恒温平衡30min后，使用65μm聚二甲基硅氧烷和二乙烯苯(PDMS-DVB)萃取头(Supelco Co.)进行30min固相微萃取。萃取头在GC-MS(Agilent 7890-5975)进样口解吸附5min后用DB-WAX毛细管色谱柱(0.25mm，30m，0.25μm，J&W Scientific)进行分离。升温程序为从40℃以3℃·min-1速率升至100℃,然后再以5℃·min-1速率升至245℃。以1.0mL·min-1氦气为载气，MS离子源温度230℃，采用电子轰击电离方式，电子能量为70eV，质谱扫描范围为35到350m/z。采用质谱库NIST-8(NIST/EPA/NIH，美国)和保留指数(Retention index，RI)进行物质鉴别，内标面积归一化方法进行物质的浓度计算。
(二)实验结果
实时定量PCR结果显示，在九个品种中，PpTPS3的表达与芳樟醇含量呈正相关关系(附图1)；桃果实成熟过程中PpTPS3表达持续增强，伴随有芳樟醇含量的持续增加(附图2)。
实施例2PpTPS3重组蛋白体外催化芳樟醇的生物合成
(一)实验方法
1.重组载体构建及大肠杆菌转化
根据PpTPS3在桃基因组数据库(phytozome v12)中的参考序列，利用PCR技术，以桃果实cDNA为模板，结合引物对SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3扩增获得PpTPS3全长SEQ IDNO.1。PCR反应体系为50μL，成分分别为：25μL PrimeSTAR Max Premix(2x)酶(TAKARA)，上下游引物(10μM)各1μL，1μL桃果实cDNA，22μL H2O。PCR反应程序为：98℃10s；55℃15s，72℃10s，35个循环。利用Vazyme一步克隆试剂盒将PCR产物与经限制性内切酶Sal I和Hind III在37℃水浴条件下酶切3h后的pET6xHN-N载体5μL连接产物加入20μL DH5α感受态，冰上放置30min，42℃热激90s，转化DH5α，挑取阳性菌落后测序验证。将序列确认正确的PpTPS3-pET6xHN-N载体利用热激转化法转入BL21(DE3)中，挑取阳性克隆保存。
2.诱导表达及重组蛋白的纯化
转化后的BL21(DE3)菌于20mL含AMP(100mg/L)的LB中培养12h，然后以1:50转移至500mL含AMP(100mg/L)的LB中继续培养至OD600＝0.5-0.8，加入IPTG(终浓度0.5mmol/L)，16℃诱导24h后离心(5000g，15min，15℃)集菌。用25mL 1x PBS缓冲液重悬后超声破碎，10000rpm，4℃离心30min。上清液过0.45μm
Figure BDA0002478470530000041
HV的除菌膜后按照说明书过HisTALONTM(Clontech,Takara)的重力柱纯化得到粗蛋白并通过SDS-PAGE电泳检测。粗蛋白液用脱盐柱PD-10(GE Healthcare，英国)进行脱盐，并将蛋白置换到Tris-HCl缓冲液(100mmol/LTris,2mmol/L DTT,pH 7.5)，加入10％甘油储存在超低温冰箱。
3.蛋白体外活性测定
反应底物GPP所用对应缓冲液A(50mmol/L HEPES，7.5mmol/L MgCl2，100mmol/LKCl，5mmol/L dithiothreitol and 10％[v/v]glycerol，pH 7.0)，反应在4ml的密封玻璃瓶进行，1ml的反应体系中分别加入200μL纯化蛋白，10μg反应底物，800μL反应缓冲液，加入适量内标后，在42℃反应15min。空载体表达的蛋白以及底物单独反应加热作为阴性对照。用SPME方法进行挥发性物质的收集测定。
(二)实验结果
在大肠杆菌中诱导PpTPS3-pET6xHN-N重组载体表达，得到大小约为63.45kDa的PpTPS3重组蛋白，以GPP为底物反应产生了4种单萜，最主要的是芳樟醇，占比达98.3％(附图3)，证明PpTPS3能催化芳樟醇的生物合成。
在大肠杆菌中诱导PpTPS3-pET6xHN-N重组载体表达，得到大小约为63.45kDa的PpTPS3重组蛋白，以GPP为底物反应产生了4种单萜，最主要的是芳樟醇，占比达98.3％，证明PpTPS3能催化芳樟醇的生物合成。
实施例3桃果实中过量表达PpTPS3基因增加了芳樟醇的含量
(一)实验方法
1.载体构建及农杆菌转化
结合引物对SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10，利用PCR技术扩增获得PpTPS3，PCR体系及反应程序同实施例2。利用Vazyme一步克隆试剂盒将PCR产物与经限制性内切酶BamH I和Sal I在37℃水浴条件下酶切3h后的pGreen II 002962-SK载体5μL连接产物加入20μL DH5α感受态，冰上放置30min，42℃热激90s，转化DH5α，挑取阳性菌落后测序验证。将序列确认正确的PpTPS3-SK载体利用电击转化法，转入农杆菌GV3101::pSoup中，挑取阳性克隆保存。50μL农杆菌感受态加入5μL重组载体，冰上放置30min，转入Bio-Rad的2mm电击杯，通过Bio-Rad GenePulser Xcell在2.5Kv条件电击转入。
2.桃果实的侵染
将含有PpTPS3-SK载体的GV3101农杆菌在含卡那霉素(50mg/L)及庆大霉素(25mg/L)的固体培养基上划线28℃培养2d后，挑取单克隆菌株于5mL含卡那霉素与庆大霉素的LB中，过夜培养后转移至500mL含LB(Kan 50mg/L+Get 25mg/L)中，培养至OD600＝0.8～1.0。4℃，5000g，离心10min收集菌。用等体积渗透液(10mmol/L MES，10mmol/L MgCl2，150mmol/L乙酰丁香酮，0.04％TritonRX-100，pH 5.6)重悬，常温放置2h，待用。含空SK载体的农杆菌以同样方法准备，作为对照。
选取转色期的果实，洗净后用50％的乙醇消毒1min，再用有效氯含量在75-100mg·L-1的次氯酸钠水溶液浸泡20min消毒，最后用无菌水漂洗3-5次，在无菌状态下晾干待用。消毒后去除表皮，选取中部果肉，切成为厚度1cm，面积为4-8cm2的小块，将制备好的果肉切片放置在MS固体培养基上，黑暗条件下预培养24-30h。500ml渗透液经过2h诱导后，倒入提前消毒过的真空渗透装置中，将培养基上的切片放入渗透液进行抽真空渗透。每个果实切取的2片一半用来渗透含有重组载体PpTPS3-SK的菌液，一半用来渗透只含SK空载的菌液，互为对照。真空压力抽至-70Kpa，保持压强直到果肉组织表面气泡渗出速度明显下降，开始缓慢释放真空，让侵染液能够渗入果肉组织，过程大约需要15-20min。侵染后的果肉组织用无菌水漂洗3-5次，晾干后转入新配置的MS固体培养基在25℃培养2天，然后用液氮迅速冷冻果肉组织并储藏在-80℃冰箱。
3.桃果实PpTPS3基因表达及香气物质检测
桃果实样品用液氮研磨，利用CTAB法提取总RNA，取1.0μg RNA按(TAKARA)试剂说明书操作合成cDNA。qPCR所用引物，反应体系及检测方法同实施例1。经液氮研磨后的果实组织5g用GC-MS分析挥发性芳樟醇含量。方法参照实施例1。
(二)实验结果
在桃果实体内瞬时过量表达PpTPS3基因后，芳樟醇积累量增加到对照空载的4倍左右(附图4)，图4表示在桃果实中瞬时过表达PpTPS3显著提高了其芳樟醇含量。因此，PpTPS3确实可以在桃果实体内合成芳樟醇。
实施例4转基因技术过量表达PpTPS3显著提高番茄的芳樟醇含量
(一)实验方法
1.载体构建及农杆菌转化
结合引物对SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12，利用PCR技术扩增获得PpTPS3，PCR体系及反应程序同实施例2。利用Vazyme一步克隆试剂盒将PCR产物与经限制性内切酶Xba I和BamH I在37℃水浴条件下酶切3h后的pBI121载体5μL连接产物加入20μL DH5α感受态，冰上放置30min，42℃热激90s，转化DH5α，挑取阳性菌落后测序验证。将序列确认正确的PpTPS3-pBI121载体利用载体利用电击转化法，分别转入农杆菌EHA105中，并分别挑取阳性克隆保存。
2.番茄子叶的侵染
挑选阳性单菌落于3ml含卡那霉素(50μg/mL)及利福平(10μg/mL)的LB液体培养基中，28℃培养过夜后转入20ml LB中，28℃培养至OD600＝0.5～0.6，离心集菌后用无菌水稀释至OD600＝0.1～0.2作为侵染液。无菌条件下生长7-8d的番茄子叶，切去叶尖和叶基，将外植体背面朝上置于铺滤纸的预培养基T1上。将预培养2d后的外植体浸泡于侵染液中，震荡5min后倒掉浸染液，将多余的浸染液用滤纸吸干后，将外植体重新置于预培养培养基。在暗室共培养2d后置于芽诱导培养基T21，在光下培养7d后转入新的T21培养基中进行继代培养。第一次继代培养后，每隔2周继代一次，直至外植体发芽完全。待外植体发芽芽长约为2-3cm时转入芽伸长培养基T22中。培养3-4周当芽伸长至4-5cm时，转入生根培养Tr中培养3-4周。将生根旺盛，生长到一定高度的小苗即时转入土盆里。转入土盆后提取叶片DNA进行阳性植株检测。经过鉴定的T1代转基因番茄及野生型种植于人工气候室(25℃，16h/8h光周期)。采收红熟阶段番茄果实经液氮冷冻后保存于-80℃用于芳樟醇含量及基因表达分析。每个株系选取3株分别作为3个生物学重复，每个重复包含5颗果实。
3.转基因番茄PpTPS3表达及香气物质检测
番茄果实样品用液氮研磨，利用CTAB法提取总RNA，取1.0μg RNA按(TAKARA)试剂说明书操作合成cDNA。qPCR以番茄SlACTIN(SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14)为内参基因，PpTPS3引物序列为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8。qPCR反应体系及检测方法同实施例1。经液氮研磨后的果实组织5g用GC-MS分析挥发性芳樟醇含量。方法参照实施例1。
(二)实验结果
在番茄中采用遗传转化技术过量表达PpTPS3基因后，番茄果实中芳樟醇积累量增加到野生型的4.4倍左右(附图5)。由此可得，PpTPS3确实可以催化芳樟醇的合成。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一个参与桃芳樟醇生物合成的基因及其应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1608
<212> DNA
<213> 桃(Prunus persica)
<400> 1
atggcccttc ttcaagctca ctctgcttcc cccaactgtc caattgttga ttttcacgtc 60
caccatgctc aaaaattgaa ggaattgaag gatgcactgg caaatgttgg agaagatgaa 120
ctgctgattg cggttgatgc catgcagcac ctaggccttg atcatcactt ccgagaggag 180
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cttcttgagg tttcacttcg ttttcgactc ttgagacaac aaggttatca tgtaaccaca 300
gatgtgttta acaaattcaa gaacatccaa gacttgaaat caggactaga caaagacatt 360
gagggattgg tgggattgta tgaagcatct cacttgagtt tccaaggaga agatgcactt 420
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agattcatgg ctaaaaactt tttggactat ttccaaggca cagagaaatg ggccagtatt 600
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gaccagccaa ttaaatggta tacgtggccc atggcatgcc tcacagatcc aagcttatca 780
gaggaaaggc ttgaacttac aaaatcgatc tctcttgtct acataataga tgatattttt 840
gatgtgcatg gaacactcga cgagctcgtc ctcttcacag cagcagttga gagatgggat 900
cttgatgaga ctgatgaact accagattac atgaagataa gttttaaggc tctttatgac 960
attaccaatg aaaccagcga cagggcgtac aaaaggcatg ggtggaaccc tatagaatcc 1020
cttaaaaaat cgtgggcaat attgtgcaag gcgttcctgt tagaagcaca atggtttagg 1080
tgtgggcatt tgccaaacgc tgaagactac ttgaagaatg gggttatcag tacaggggtg 1140
cctgcagttc taacccacgc cttcttcata ttgggtcgcg gtataactca gcaagccata 1200
gatattgttg acaacatcaa cacgcctggc atcatatctt caacggcgac cattctacgg 1260
ctctgggatg actttggaag tgccaaggat gagaaccaaa atgggtatga tggttcgtac 1320
atacagtgtt acgtgaatga acacgaaggt tgctcagatg aagatgcaag ggcttacgtt 1380
atccaaaaga tttcagatga atggaagaga ctcaaccaag aatgcttctc ttcaaatcca 1440
ttttcagagt cttttacaaa acttgctctc aatgttgcta gaatggtgcc gatgatgtat 1500
gattacaata cccaacatcg ccttccaagc cttgaggaga acatgaagtc gttgcttttt 1560
gatagttttc ttgcacaagg gtttcagtcc ccaggccaga cgaaataa 1608
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 2
aaggcctctg tcgacatggc ccttcttcaa gctca 35
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 3
agaattcgca agcttttatt tcgtctggcc tgggg 35
<210> 4
<211> 535
<212> PRT
<213> 桃(Prunus persica)
<400> 4
Met Ala Leu Leu Gln Ala His Ser Ala Ser Pro Asn Cys Pro Ile Val
1 5 10 15
Asp Phe His Val His His Ala Gln Lys Leu Lys Glu Leu Lys Asp Ala
20 25 30
Leu Ala Asn Val Gly Glu Asp Glu Leu Leu Ile Ala Val Asp Ala Met
35 40 45
Gln His Leu Gly Leu Asp His His Phe Arg Glu Glu Ile Glu Ala Phe
50 55 60
Leu Gln Lys Gln Tyr His Ala Arg Ala Tyr Asp Asn Cys Asn His Gln
65 70 75 80
Leu Leu Glu Val Ser Leu Arg Phe Arg Leu Leu Arg Gln Gln Gly Tyr
85 90 95
His Val Thr Thr Asp Val Phe Asn Lys Phe Lys Asn Ile Gln Asp Leu
100 105 110
Lys Ser Gly Leu Asp Lys Asp Ile Glu Gly Leu Val Gly Leu Tyr Glu
115 120 125
Ala Ser His Leu Ser Phe Gln Gly Glu Asp Ala Leu Asp Glu Ala Gly
130 135 140
Lys Leu Ser His Gln Ile Leu Thr Ala Trp Leu Pro Asn Asn Leu Asp
145 150 155 160
Asp His Arg Ala Pro Leu Val Ala His Ser Leu Lys His Pro Tyr His
165 170 175
Lys Ser Leu Thr Arg Phe Met Ala Lys Asn Phe Leu Asp Tyr Phe Gln
180 185 190
Gly Thr Glu Lys Trp Ala Ser Ile Leu Gln Glu Leu Ala Lys Leu Glu
195 200 205
Leu Asn Val Val Glu Ser Ile Ile Arg Asn Glu Ile Leu Gln Ile Ser
210 215 220
Lys Trp Trp Lys Glu Leu Gly Leu Thr Lys Glu Leu Asn Phe Val Arg
225 230 235 240
Asp Gln Pro Ile Lys Trp Tyr Thr Trp Pro Met Ala Cys Leu Thr Asp
245 250 255
Pro Ser Leu Ser Glu Glu Arg Leu Glu Leu Thr Lys Ser Ile Ser Leu
260 265 270
Val Tyr Ile Ile Asp Asp Ile Phe Asp Val His Gly Thr Leu Asp Glu
275 280 285
Leu Val Leu Phe Thr Ala Ala Val Glu Arg Trp Asp Leu Asp Glu Thr
290 295 300
Asp Glu Leu Pro Asp Tyr Met Lys Ile Ser Phe Lys Ala Leu Tyr Asp
305 310 315 320
Ile Thr Asn Glu Thr Ser Asp Arg Ala Tyr Lys Arg His Gly Trp Asn
325 330 335
Pro Ile Glu Ser Leu Lys Lys Ser Trp Ala Ile Leu Cys Lys Ala Phe
340 345 350
Leu Leu Glu Ala Gln Trp Phe Arg Cys Gly His Leu Pro Asn Ala Glu
355 360 365
Asp Tyr Leu Lys Asn Gly Val Ile Ser Thr Gly Val Pro Ala Val Leu
370 375 380
Thr His Ala Phe Phe Ile Leu Gly Arg Gly Ile Thr Gln Gln Ala Ile
385 390 395 400
Asp Ile Val Asp Asn Ile Asn Thr Pro Gly Ile Ile Ser Ser Thr Ala
405 410 415
Thr Ile Leu Arg Leu Trp Asp Asp Phe Gly Ser Ala Lys Asp Glu Asn
420 425 430
Gln Asn Gly Tyr Asp Gly Ser Tyr Ile Gln Cys Tyr Val Asn Glu His
435 440 445
Glu Gly Cys Ser Asp Glu Asp Ala Arg Ala Tyr Val Ile Gln Lys Ile
450 455 460
Ser Asp Glu Trp Lys Arg Leu Asn Gln Glu Cys Phe Ser Ser Asn Pro
465 470 475 480
Phe Ser Glu Ser Phe Thr Lys Leu Ala Leu Asn Val Ala Arg Met Val
485 490 495
Pro Met Met Tyr Asp Tyr Asn Thr Gln His Arg Leu Pro Ser Leu Glu
500 505 510
Glu Asn Met Lys Ser Leu Leu Phe Asp Ser Phe Leu Ala Gln Gly Phe
515 520 525
Gln Ser Pro Gly Gln Thr Lys
530 535
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 5
ggtgtgacga tgaagagtga tg 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 6
tgaaggagag ggaaggtgaa ag 22
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 7
ggtcgcggta taactcagca 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 8
caaagtcatc ccagagccgt 20
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 9
agaactagtg gatccatggc ccttcttcaa gctca 35
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 10
cccctcgagg tcgacttatt tcgtctggcc tgggg 35
<210> 11
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 11
acgggggact ctagaatggc ccttcttcaa gctca 35
<210> 12
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 12
accacccggg gatcctttcg tctggcctgg ggact 35
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 13
tgtccctatt tacgagggtt atgc 24
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 14
cagttaaatc acgaccagca agat 24

Claims (6)

1.一个参与桃芳樟醇生物合成的基因，其特征在于，所述基因为PpTPS3，所述PpTPS3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述基因，其特征在于，所述基因PpTPS3编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.一种包含权利要求1所述基因PpTPS3的重组载体和体外重组蛋白。
4.根据权利要求1所述的基因PpTPS3在基因工程中的应用，其特征在于，所述应用是基因PpTPS3的蛋白在体外催化芳樟醇合成。
5.根据权利要求4所述的基因PpTPS3在基因工程中的应用，其特征在于，所述应用是在桃果实和番茄果实中显著提升芳樟醇含量。
6.根据权利要求4所述的基因PpTPS3在基因工程中的应用，其特征在于，所述应用是在果实芳香品质改善的基因工程育种中的应用。
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