CN110869500A

CN110869500A - 用于萜类化合物产物的微生物生产的代谢工程化

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Publication number: CN110869500A
Application number: CN201880021786.1A
Authority: CN
Inventors: 阿吉库玛·帕拉伊尔·库马兰; 莱恩·利姆; 詹森·唐纳德; 曾显忠; 克里斯汀·桑托斯; 莱恩·菲力浦
Original assignee: Manus Biosynthesis Inc
Current assignee: Manus Biosynthesis Inc
Priority date: 2017-01-26
Filing date: 2018-01-26
Publication date: 2020-03-06
Anticipated expiration: 2038-01-26
Also published as: EP3574095A1; EP3574095B1; US10774346B2; US10480015B2; CA3051472C; MX2019008882A; AU2018211953A1; EP3574095A4; KR20190113851A; CA3051472A1; US20210002672A1; US20200002733A1; JP7330888B2; UA127758C2; US11352648B2; US20180216137A1; BR112019015454A2; DK3574095T3; CN110869500B; WO2018140778A1

Abstract

本发明涉及用于制备萜烯和萜类化合物产物的方法和细菌菌株，所述细菌菌株具有改善的通过MEP途径和到下游重组合成途径的碳拉力。

Description

用于萜类化合物产物的微生物生产的代谢工程化

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年1月26日提交的美国临时申请第62/450,707号的优先权，所述美国临时申请的内容特此以引用的方式整体并入。

序列表

本申请含有序列表，所述序列表已以ASCII格式通过EFS-Web提交并且特此以引用的方式整体并入。2018年1月26日创建的所述ASCII拷贝被命名为MAN-009PC_ST25，并且大小为125,103字节。

背景技术

食品和饮料行业以及诸如香水、化妆品和医疗保健行业等其他行业通常使用萜烯和/或萜类化合物产物，包括用作风味剂和芳香剂。但是，因素诸如：(i)植物原料的可用性和高价格；(ii)植物中相对较低的萜烯含量；以及(iii)在工业规模上生产足够量的萜烯产物的繁琐且低效的提取方法，这些原因都刺激了使用与植物无关的系统生物合成萜烯的研究。因此，已经花费了很多努力来开发用于对微生物进行工程化以将诸如葡萄糖的可再生资源转化为萜类化合物产物的技术。与传统方法相比，微生物具有快速生长的优势，而不需要土地来维持发育。

对于必需的类异戊二烯前体异戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)，存在两种主要的生物合成途径：甲羟戊酸(MVA)途径和甲基赤藓糖醇磷酸(MEP)途径。MVA途径存在于大多数真核生物、古细菌和少数真细菌中。MEP途径存在于真细菌、植物的叶绿体、蓝细菌、藻类和顶复门寄生虫中。大肠杆菌和其他革兰氏阴性细菌利用MEP途径合成IPP和DMAPP代谢前体。虽然MEP途径提供了比MVA途径理论上更好的化学计量产率，但是大肠杆菌和其他细菌中的MEP途径具有多种内在调节机制，其控制和/或限制通过该途径的碳通量。参见Zhao等人，Methylerythritol Phosphate Pathway of Isoprenoid Biosynthesis，Annu Rev.Biochem.2013；82：497-530；Ajikumar PK，等人，Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli.Science 2010；330-70-74。

在细菌系统中以工业规模生产萜烯和萜类化合物需要用于改善通过MEP途径和通过重组下游萜烯和萜类化合物合成途径的碳通量的微生物菌株和方法。

发明内容

在各个方面，本发明涉及用于制备萜烯和萜类化合物产物的方法和细菌菌株。在某些方面，本发明提供了具有改善的进入MEP途径和下游重组合成途径的碳通量的细菌菌株，从而通过用廉价碳源(例如葡萄糖)发酵来增加萜烯和/或萜类化合物的生产。

在一些方面，本发明涉及过表达IspG和IspH的细菌菌株，以便为1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸(HMBPP)中间体提供增加的碳通量，但具有平衡的表达以防止HMBPP以减少细胞生长或活力的量或以抑制MEP途径通量和/或萜类化合物生产的量积累。增加IspG和IspH两者的表达显著增加了萜烯和萜类化合物产物的滴度。相比之下，单独过表达IspG会导致生长缺陷，而单独过表达IspH不会显著影响产物滴度。HMBPP代谢物可以充当MEP途径的调节剂或抑制剂，并且在某些水平下可能对细菌细胞有毒。例如，在一些实施方案中，HMBPP积累不超过约10mg/g干细胞重量(DCW)，或在一些实施方案中积累不超过约5mg/g DCW，或超过约2mg/g DCW。因此，IspG和IspH的平衡过表达(例如，有利于更多的IspH活性)对于将MEP碳向下游拉动通过HMBPP到IPP同时防止其失衡和积累是重要的。

在各种实施方案中，细菌菌株过表达平衡的MEP途径以将MEP碳移动至MEcPP中间体(IspG的底物)，并且包括一种或多种遗传修饰以支持IspG和IspH酶的活性，所述IspG和IspH酶是Fe-硫簇酶。示例性修饰包括增强电子通过MEP途径和/或到萜烯或萜类化合物产物的供应和转移的修饰。这些包括一种或多种氧化还原酶的重组表达，包括氧化丙酮酸和/或导致铁氧还蛋白(其向MEP途径供应电子)的还原的氧化还原酶。示例性的氧化还原酶是大肠杆菌YdbK及其直系同源物和衍生物。

在各种实施方案中，微生物菌株包含黄素氧还蛋白(fldA)、黄素氧还蛋白还原酶、铁氧还蛋白(fdx)和铁氧还蛋白还原酶中的一种或多种的过表达或补充。

在其他方面，本发明提供过表达PgpB或NudB的细菌菌株，其将FPP去磷酸化为法呢醇，并分别将IPP和DMAPP去磷酸化为异戊烯醇和戊烯醇。在这些实施方案中，细胞在MEP途径上含有额外的产物拉力，同时将来自所述途径的过量MEP碳排出细胞外，并且从而避免内在反馈抑制机制。此外，由于这些产物在细胞外积累，它们可以用于跟踪通过MEP途径的碳通量，即使没有安装下游萜类化合物合成途径也是如此。因此，过表达PgpB和/或NudB的细菌菌株是平衡MEP途径基因表达的便利工具。另外，或可替代地，在一些实施方案中，细菌菌株过表达一种或多种强合酶，其在MEP途径上具有足够的产物拉力以避免内在反馈抑制机制。以举例的方式，在一些实施方案中，合酶是青蒿法呢烯合酶(Artemisia annuafarnesene synthase)。

为了生产萜烯或萜类化合物产物，细菌细胞将含有重组下游途径，其由IPP和DMAPP前体产生萜类化合物。在某些实施方案中，细菌细胞产生一种或多种萜类化合物，诸如单萜类化合物、倍半萜类化合物、三萜类化合物和二萜类化合物等。此类萜类化合物可用于香料(例如广藿香醇)、风味剂行业(例如，诺卡酮)、甜味剂(例如，甜菊醇糖苷)、着色剂或治疗剂(例如，紫杉醇)。

回收的萜烯或萜类化合物可以掺入产品(例如，消费产品或工业产品)中。例如，所述产品可以是风味剂产品、芳香剂产品、甜味剂、化妆品、清洁产品、洗涤剂或肥皂或害虫防治产品。在本发明的实施方案中产生的较高产率可以提供显著的成本优势以及萜烯或萜类化合物成分的可持续性和质量控制。

本发明的其他方面和实施方案将根据以下对本发明的详细描述而是显而易见的。

附图说明

图1是通过MEP途径产生萜类化合物的示意图。示出了一个细菌细胞，所述细菌细胞吸收葡萄糖作为碳源。葡萄糖通过TCA循环转化为生物质，或通过MEP途径传送至所需的萜类化合物产物。葡萄糖进入细胞并转化为丙酮酸(PYR)，其中3-磷酸甘油醛作为中间体(GAP)。将PYR和GAP组合以制备DOXP，其转化为MEP并将所述途径致力于FPP(经过MEcPP)。DOX和ME分别是DOXP和MEP的去磷酸化产物。DOX、ME和MEcPP位于细胞外。被迫进入MEP途径的通量越多，在细胞外发现的这些产物就越多。这些副产物可以用作MEP途径中瓶颈的标记，并用于识别工程化目标。通过过表达nudB或pgpB，IPP和DMAPP或FPP分别被去磷酸化为戊烯醇和异戊烯醇或法呢醇，其在细胞外积累并且可以用于减轻中间体积累和MEP途径反馈抑制的激活。黑色箭头显示酶介导的对萜类化合物的生化反应，浅灰色箭头显示竞争性副产物，深灰色箭头显示产物在细胞外的转运，并且白色箭头简示了浓缩途径。

图2显示增加单独的ispH表达或ispH和ispG的共同表达提高了进行工程化以增加进入MEP途径的碳量的菌株中的萜类化合物产物滴度，但单独的ispG降低生产力。对照菌株是具有dxs、dxr、ispD、ispE、ispF和idi的额外拷贝(没有ispG或ispH的额外拷贝)的大肠杆菌菌株，以及改善MEP途径通量的其他改变。菌株包括20kb缺失，其未被工程化。

图3显示，在具有增强的MEP途径的修饰的生产菌株中增加ispG和/或ispH表达会影响MEP产物分布模式。上图(1x比例)显示了所有的MEP途径代谢物，大部分产物是DOX、ME和MEcPP。中图(100x比例)显示了未报告DOX、ME和MEcPP的MEP途径代谢物；在这种情况下，DOXP和MEP是最具代表性的。下图(25000x比例)仅显示了HMBPP浓度。在这些图中，显示了来自提取的培养物(肉汤加细胞)中总细胞外和细胞内代谢物，使得报告的浓度与提取物的体积相关。

图4显示了在细胞内或细胞外发现的每种个体MEP代谢物的比例(‘内部’相对于‘外部’)。这些值不反映绝对丰度，例如与HMBPP相比，DOX的总量远远更多。虽然DOX在细胞外是100％，但HMBPP在细胞内是100％。图4中分析的菌株是‘对照+ispH/ispG’表现最佳的菌株。DOXP/DOX、MEP/ME和MEcPP几乎完全(如果不是全部)在细胞外培养基中积累，而CDP-ME、CDP-MEP、HMBPP、IPP/DMAPP和FPP在细胞内100％观察到。细胞内发现的每种代谢物的百分比显示在图的顶部。

图5显示了未补偿的ispG上调导致细胞生长的显著下降，如通过600nm处的UV吸光度所确定的。虽然在用ispH或者ispH和ispG一起补偿的菌株中观察到最终细胞密度的一些变化，但变化不显著。

图6显示了pgpB的过表达可以使进行工程化以增加通过MEP途径的通量、但是没有安装下游萜类化合物产物途径的菌株中的法呢醇滴度变为三倍。对照菌株在不同的组成型表达水平下具有dxs、dxr、ispD、ispF、ispE、ispG、ispH和idi的额外拷贝，并且还具有过表达的ydbK。所述菌株积累了适量的法呢醇，可能是由于过多的FPP积累造成的“溢出”，其在途径上进行反馈，并且与野生型相比，其生长明显较慢。当pgpB在此菌株中过表达时，过量的FPP更有效地转化为法呢醇(防止反馈控制)并且通量被有效地拉动通过MEP途径。

图7显示了在产生法呢醇的菌株中增加和调节ispG’和/或ispH的表达可以提高产物滴度。对照菌株具有dxs、dxr、ispD、ispF、ispE、ispG、ispH和idi的额外拷贝，并且还具有ydbK和pgpB的额外拷贝。在增加的启动子强度(+，++，+++)下，将ispH和/或ispG′的额外拷贝整合到菌株中。

图8显示了法呢醇产物滴度的增加(如图7所示)伴随着MEcPP池大小的降低，并且取决于ispG和ispH的比率。

图9显示了idi过表达增加了不过表达ispGH的菌株中的产物滴度，并且降低了过表达ispGH的两个菌株中的滴度，从而指示由Idi活性控制的IPP与DMAPP之间的平衡可以根据下游途径的需要调高或调低。

图10说明了YdbK作为丙酮酸：黄素氧还蛋白氧化还原酶和/或丙酮酸合酶在增强萜类化合物生物合成中的作用。

图11显示了在增加的启动子强度下表达ydbK的额外拷贝可以提高萜类化合物的产生。对照菌株产生萜类化合物产物A，并且在确定的组成型表达下具有MEP途径的基因dxs、dxr、ispD、ispE、ispF、ispG’、ispH和idi的额外拷贝。

图12显示了来自ydbK过表达的萜类化合物产物滴度的提高需要足够的ispG和/或ispH。对照A具有MEP途径的dxs、ispD、ispF和idi的额外拷贝，非工程化的20kb缺失，以及改善铁-硫簇蛋白性能的其他修饰。对照B是对照A加上操纵子配置中的ispG′和ispH的额外整合拷贝(首先是G′，使得H/G比率有利于G)，而对照C是对照A加上操纵子配置中的ispH和ispG’的额外整合拷贝(首先是H，使得H/G比率有利于H)。

图13显示了除了ydbK之外表达fdx可以提高萜类化合物滴度。对照菌株产生萜类化合物产物A，并且在确定的组成型表达下具有MEP途径的基因dxs、dxr、ispD、ispE、ispF、ispG’、ispH和idi的额外拷贝。所述菌株还具有非工程化的20kb缺失和其他修饰以改善铁-硫簇蛋白的性能。

图14说明了糖酵解与MEP途径之间的联系，并说明了通过改变氧化还原酶的表达来调节辅因子可用性的机会。

图15是说明在大肠杆菌中将丙酮酸(PYR)转化为乙酰辅酶A(AcCoA)的三种已知反应的图，并说明了减少或消除PDH介导的PYR向AcCoA的转化如何导致PFOR介导的PYR向AcCoA的转化的增加。

图16A至图16D是显示与对照相比，具有过表达的YdbK和敲除aceE(ΔaceE)的细菌菌株中萜类化合物产物产生的倍数变化的图。对照是不具有(ΔaceE)的相同菌株。ΔaceE阻止PDH介导的PYR向AcCoA的转化。图16A显示了产生萜类化合物产物B的细菌菌株的倍数变化。图16B显示了产生萜类化合物产物C的细菌菌株的倍数变化。图16C显示了产生萜类化合物产物D的细菌菌株的倍数变化。图16D显示了产生萜类化合物产物E的细菌菌株的倍数变化。

图16E是显示了与对照(无ΔaceE)相比，产生萜类化合物产物D，过表达YdbK并具有ΔaceE的细菌菌株显示细胞外MEcPP减少的图。

图17A至图17C是显示与对照(无aceE突变体)相比，具有过表达的YdbK和突变的aceE(aceE突变体)的细菌菌株中萜类化合物产物的倍数变化的图。aceE突变减少了PDH介导的PYR向AcCoA的转化。图17A显示了产生萜类化合物产物B的细菌菌株的倍数变化。图17B显示了产生萜类化合物产物C的细菌菌株的倍数变化。图17C显示了产生萜类化合物产物D的细菌菌株的倍数变化。

图17D是显示与对照(无aceE突变)相比，产生萜类化合物产物D，过表达YdbK并表达aceE突变的细菌菌株具有细胞外MEcPP减少的图。

图18是说明大肠杆菌中将丙酮酸(PYR)转化为乙酰辅酶A(AcCoA)的三种已知反应的图，并说明了表达fdx或fldA同源物如何可以通过Fd氧化还原反应(以粗体显示)增加向IspG和/或IspH的电子供应。

图19A是显示进行工程化以过表达YdbK并过表达fdx或fldA同源物的细菌菌株中萜类化合物产物B产生的倍数变化(与空载体对照(emp)相比)的图。

图19B是显示进行工程化以过表达YdbK和Cv.fdx(来自酒色别样着色菌(Allochromatium vinosum)的fdx同源物)的细菌菌株中萜类化合物产物D的倍数变化(与对照相比)的图。

图19C是显示与对照(无Cv.fdx过表达)相比产生萜类化合物产物D，过表达YdbK和Cv.fdx的细菌菌株具有细胞外MEcPP减少的图。

图20是显示细菌菌株中萜类化合物产物产生的倍数变化的图，所述细菌菌株产生萜类化合物产物F，并且过表达一种或多种PFOR或fpr同源物和任选的fdx或fldA同源物。

具体实施方式

在各个方面，本发明涉及用于制备萜烯和萜类化合物产物的细菌菌株和方法，所述细菌菌株具有通过MEP途径和到下游重组合成途径的改善的碳通量。在各种实施方案中，本发明通过用碳源诸如葡萄糖、甘油、蔗糖等发酵细菌菌株来提供增加的萜烯和/或萜类化合物产物产量。

例如，在一些方面，本发明提供了一种细菌菌株，其通过MEP途径产生异戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)，并通过下游合成途径将IPP和DMAPP转化为萜烯或萜类化合物产物。在细菌菌株中，过表达IspG和IspH，使得IspG活性和IspH活性被增强，以便为1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸(HMBPP)中间体提供增加的碳通量，但被平衡以防止HMBPP以显著降低细胞生长、活力、MEP途径通量或产物滴度的量积累。

增加IspG和IspH两者的表达可以显著增加萜烯和萜类化合物产物的滴度。单独增加仅IspG或IspH的表达不会显著提高滴度。此外，单独过表达IspG可能导致生长缺陷，这可能与观察到HMBPP(由IspG产生并由IspH消耗的MEP途径中的中间体)在细胞外未发现，但在细胞内100％发现有关。HMBPP代谢物似乎充当MEP途径的抑制剂，并且在某些水平下似乎对细菌细胞有毒。因此，IspG与IspH之间的活性平衡对于防止HMBPP失衡和积累是重要的。

HMBPP积累可以确定为每干细胞重量(DCW)的量。例如，在一些实施方案中，HMBPP积累不超过约10mg/g DCW，或在一些实施方案中积累不超过约8mg/g DCW，或在一些实施方案中积累不超过约5mg/g DCW，或在一些实施方案中，积累不超过约4mg/g DCW，或在一些实施方案中积累不超过约2mg/g DCW。在一些实施方案中，HMBPP积累不超过约1mg/g DCW，或积累不超过约0.5mg/g DCW，或积累不超过约0.2mg/g DCW，或不超过约0.1mg/g DCW。IspG和IspH的平衡过表达(例如，有利于更多的IspH活性)对于将MEP碳向下游拉动通过HMBPP到IPP同时防止其失衡和积累是重要的。

在一些实施方案中，通过将重组ispG和ispH基因引入细菌菌株中来过表达IspG和IspH。在其他实施方案中，可以通过修饰例如内源启动子或核糖体结合位点来过表达内源基因。当引入重组ispG和/或ispH基因时，基因可以任选地包含一个或多个有益突变。

在一些实施方案中，另外的基因可以与野生型酶(例如，大肠杆菌野生型酶)基本相同，或者可以被修饰以增加活性，或者可以是具有与天然细菌(例如大肠杆菌)酶相比相似、更高或更低活性的IspG或IspH直系同源物。例如，关于IspG，氨基酸序列可以与SEQ IDNO：1具有50％或更多的序列同一性，或与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少约60％的序列同一性、或至少约70％的序列同一性、或至少约80％的序列同一性、或至少约90％的序列同一性、或至少约95％的序列同一性、或至少约98％的序列同一性。在一些实施方案中，对IspG氨基酸序列(SEQ ID NO：1)进行1至约10或1至约5个氨基酸取代、缺失和/或插入以改变蛋白质的活性，包括对底物结合位点或活性位点中的一个或多个的取代。可以通过构建同源性模型来获知对大肠杆菌或其他IspG的修饰。例如，用于构建大肠杆菌IspG同源性模型的合适同源物公开于：Lee M，等人Biosynthesis of isoprenoids：crystal structure of the[4Fe-4S]cluster protein IspG.J Mol Biol.2010年12月10日；404(4)：600-10。相对于野生型大肠杆菌酶，具有活性改善的示例性IspG突变体具有四个氨基酸取代(在本文中称为IspG′)。

此外，关于IspH，氨基酸序列可以与SEQ ID NO：2具有50％或更多的序列同一性，或与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少约60％的序列同一性、或至少约70％的序列同一性、或至少约80％的序列同一性、或至少约90％的序列同一性、或至少约95％的序列同一性、或至少约98％的序列同一性。在一些实施方案中，对IspH氨基酸序列(SEQ ID NO：2)进行1至约10或1至约5个氨基酸取代、缺失和/或插入以改变蛋白质的活性，包括对底物结合位点或活性位点中的一个或多个的取代。IspH酶的修饰可以通过可用的IspH结构来获知，包括Grawert，T.，等人Structure of active IspH enzyme from Escherichia coli provides mechanistic insights into substrate reduction 2009Angew.Chem.Int.Ed.Engl.48：5756-5759。

表1提供了可用于构建细菌菌株和/或修饰IspG或IspH酶以增强细菌细胞中的表达或增强物理特性的替代酶的列表，其中每种酶可以通过氨基酸取代、缺失和/或插入进行修饰。例如，所述氨基酸序列可以与表1中描述的氨基酸序列具有50％或更多的序列同一性、或至少约60％的序列同一性、或至少约70％的序列同一性、或至少约80％的序列同一性、或至少约90％的序列同一性、或至少约95％的序列同一性、或至少约98％的序列同一性。在一些实施方案中，对表1的序列进行1至约10或1至约5个的氨基酸取代、缺失和/或插入以改变蛋白质的活性，包括对底物结合位点或活性位点中的一个或多个的取代。在一些实施方案中，IspG和/或IspH酶是大肠杆菌酶的直系同源物，其在用于培养的条件下具有改善的特性或活性。

表1

基因	种	登录号
			ispG	枯草芽胞杆菌	NP_390386.1
ispG	厌氧嗜热绿色硫细菌	NP_661053.1
			ispG	藻属PCC 6803	WP_010872347.1
ispH	枯草芽胞杆菌	NP_390395.2
			ispH	伯克霍尔德氏菌MSh1	WP_031398482.1
ispH	厌氧嗜热绿色硫细菌	NP_661187.1
			ispH	甜叶菊	ABB88836.2
ispH	甜叶菊	ALJ30091.1
			ispH	藻属PCC 6803	WP_010873388.1

可以例如通过修饰启动子强度、基因拷贝数、操纵子中基因的位置和/或修饰ispG和/或ispH重组基因的核糖体结合位点序列来平衡重组IspG和IspH酶的表达。当IspG和IspH的表达和/或活性平衡时，HMBPP中间体在细胞中不比在不包含重组或修饰的ispG和ispH基因的亲本菌株中积累明显更多。即使对于通过发酵商业生产萜烯和萜类化合物需要通过MEP途径的碳通量显著增加，也是这种情况。此结果在图3中示出，其中与不过表达ispG和ispH的对照菌株相比，可以产生接近4倍的产物滴度增加(图2)的过表达ispG和ispH的菌株却不会积累高于对照中的HMBPP中间体。

在一些实施方案中，重组IspH的活性和/或表达高于所述重组IspG的活性和/或表达。有利于更多H酶的IspG/IspH比率相对于有利于比率的IspG侧的菌株导致通过MEP途径的高通量。IspG和IspH依次运作以将MEcPP转化为HMBPP，然后转化为IPP。增加IspG会积累更大的HMBPP池(其可以显示对菌株生长的抑制作用)，而增加IspH会使HMBPP池缩小，因为它被转化为IPP。因此，IspG与IspH之间的理想平衡增强了HMBPP形成和消耗两者的速率，同时避免了HMBPP积累，这显著改善了通过MEP途径到目标萜类化合物的通量。相对于IspG稍微有利于IspH可以进一步使生产力提高25％，这几乎是亲本菌株滴度的4倍。参见图2。

因此，在一些实施方案中，重组IspH的表达高于重组IspG的表达。例如，重组IspH和IspG酶可以由操纵子表达，其中ispH在操纵子中定位在ispG之前。位于操纵子中的第一个基因稍微有利于表达，从而为IspH和IspG提供了精妙的平衡机制。在一些实施方案中，可以首先定位ispG，任选地与其他修饰一起定位，诸如对RBS的减少表达的突变，或者对IspG和IspH之一或两者的在酶生产力水平下平衡活性的点突变。在一些实施方案中，ispG和ispH在单独的操纵子(例如，单顺反子)中表达，并使用不同强度的启动子或RBS进行表达平衡。

在一些实施方案中，IspH和IspG一起由操纵子(其中ispH基因定位在ispG基因之前)表达，并且其中操纵子在强启动子的控制下表达。当ispH在操纵子中定位在ispG之前时，增加启动子强度对生产力具有积极影响，而当ispG定位在ispH之前时，增加启动子强度可能具有负面影响。参见图7，使用法呢醇产品作为产品的替代品。

重组IspG和IspH酶可以由质粒表达，或者编码基因可以整合到染色体中，并且可以以单拷贝或多拷贝存在，在一些实施方案中，例如，以每个细胞约2个拷贝、约5个拷贝或约10个拷贝存在。拷贝数可以通过使用具有不同拷贝数的质粒(如本领域所熟知的)来控制，或者通过将多个拷贝掺入基因组中来控制，例如通过串联基因复制。

在一些实施方案中，微生物菌株具有通过MEP途径的高通量，包括例如通过一种或多种MEP酶的过表达(例如，除了IspG和IspH之外)。以葡萄糖为碳源，进入MEP途径的碳的理论最大值在大肠杆菌中为约30％。文献中报道的MEP碳的先前产率小于1％。参见Zhou K，Zou R，Stephanopoulos G，Too H-P(2012)Metabolite Profiling Identified Methylerythritol Cyclodiphosphate Efflux as a Limiting Step in Microbial Isoprenoid Production.PLoS ONE 7(11)：e47513.doi：10.1371/journal.pone.0047513。除了本文所述的其他修饰之外，MEP途径基因的过表达和平衡可以将碳拉动通过MEP途径并进入下游合成途径以改善到萜烯和/或萜类化合物产物的碳通量。

宿主细胞(细菌菌株)表达产生异戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)的MEP途径。具体地，葡萄糖进入细胞并转化为丙酮酸(PYR)，其中3-磷酸甘油醛作为中间体(G3P或GAP)。将G3P和PYR组合以制备1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(DOXP)，其转化为2-C-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸(MEP)并且使所述途径致力于IPP和DMAPP。DOX、ME和MEcPP位于细胞外。进入MEP途径的通量越多，具有不平衡途径的菌株中的细胞外发现的这些产物越多。参见图1。

MEP(2-C-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸)途径也称为MEP/DOXP(2-C-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸/1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸)途径或非甲羟戊酸途径或不依赖甲羟戊酸的途径。所述途径通常涉及以下酶的作用：1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(Dxs)、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(Dxr或IspC)、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合酶(IspD)、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶(IspE)、2C-甲基-D-赤藓糖醇2，4-环二磷酸合酶(IspF)、1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基 4-二磷酸合酶(IspG)、1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸还原酶(IspH)和异戊烯基二磷酸异构酶(Idi)。MEP途径以及构成MEP途径的基因和酶描述于US 8,512,988中，其特此以引用的方式整体并入。因此，构成MEP途径的基因包括dxs、dxr(或ispC)、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH、idi和ispA。MEP途径酶的氨基酸序列显示在随附的序列表中。

IPP和DMAPP(MEP途径的产物)是萜烯和萜类化合物的前体，包括单萜类化合物、倍半萜类化合物、三萜类化合物和二萜类化合物，其在风味剂、芳香剂、化妆品和食品领域中具有特别的用途。萜烯和萜类化合物的合成通过异戊二烯基转移酶(例如GPPS、FPPS或GGPPS)的作用将IPP和DMAPP前体转化为香叶基二磷酸(GPP)、法呢基二磷酸(FPP)或香叶基香叶基二磷酸(GGPP)进行。此类酶是已知的，并且描述于例如US 8,927,241，、WO 2016/073740和WO 2016/029153中，其特此以引用的方式整体并入。

在各种实施方案中，本发明使得MEP碳显著改善。如本文所用，术语“MEP碳”是指作为MEP途径的输入、中间体、代谢物或产物存在的总碳。代谢物包括衍生物，诸如分解产物，以及磷酸化和去磷酸化的产物。MEP碳包括下游途径(包括萜类化合物合成途径)的产物和中间体。出于本公开的目的，MEP碳包括MEP途径的以下输入、中间体和代谢物：D-甘油醛 3-磷酸、丙酮酸、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸、1-脱氧-D-木酮糖、2-C-甲基-D-赤藓糖醇-5-磷酸、2-C-甲基-D-赤藓糖醇、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇、2-磷酸-4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇、2C-甲基-D-赤藓糖醇2，4-环二磷酸、1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸、异戊烯基二磷酸和二甲基烯丙基二磷酸。MEP碳还包括由细胞表达的下游萜类化合物合成途径中的中间体和关键代谢物。虽然同一性将根据所采用的途径和酶而变化，但此类产物包括：香叶基二磷酸(GPP)、法呢基二磷酸(FPP)、香叶基香叶基二磷酸(GGPP)或香叶基法呢基二磷酸(FGPP)；它们的单磷酸化形式，香叶基磷酸、法呢基磷酸、香叶基香叶基磷酸或香叶基法呢基磷酸；它们的醇类，香叶醇、法呢醇、香叶基香叶醇或香叶基法尼醇；以及下游萜烯和萜类化合物产物。MEP碳还包括衍生自FPP或使用FPP的途径的化合物，包括角鲨烯、十一异戊二烯基二磷酸(UPP)、十一异戊二烯基磷酸、十异戊二烯基二磷酸(OPP)、4-羟基苯甲酸酯、3-十异戊二烯基-4-羟基苯甲酸酯、2-十异戊二烯基苯酚、3-十异戊二烯基苯-1，2-二醇、2-甲氧基-6-十异戊二烯基-2-甲氧基-1，4-苯醌醇、6-甲氧基-3-甲基十异戊二烯基-1，4-苯醌醇、3-去甲基泛醇-8、泛醇-8、泛醌、2-羧基-1，4-萘醌醇、去甲基甲基萘醌-8、甲基萘醌-8和甲基萘醌。MEP碳还包括异戊烯醇、戊烯醇、异戊烯基磷酸和二甲基烯丙基磷酸代谢物。MEP碳(上述中间体和代谢物)可以通过质谱法(MS)定量，诸如通过三重四极杆(QQQ)质量检测器的串联质谱法(MS/MS)。示例性系统是Agilent 6460 QQQ；可替代地，具有定量飞行时间(QTOF)、飞行时间(TOF)或离子阱质量检测器。

在一些实施方案中，微生物菌株具有dxs、ispD、ispF和/或idi基因的至少一个额外拷贝，其可以是速率限制的，并且可以在质粒上或整合到细菌染色体中由操纵子或模块表达。在一些实施方案中，细菌菌株具有dxs和idi的至少一个额外拷贝，表达为操纵子/模块；或者dxs、ispD、ispF和idi，表达为操纵子或模块。在一些实施方案中，细菌菌株表达dxs、dxr、ispD、ispE、ispF和idi作为重组基因，其任选地表达为1、2或3个单独的操纵子或模块。MEP途径的重组基因由一种或多种质粒表达或整合到染色体中。在这些实施方案中，与野生型相比，菌株提供通过MEP途径的增加的通量。

野生型大肠杆菌酶Dxs、Dxr、IspD、IspE、IspF和Idi的氨基酸序列在本文中如SEQID NO：3至8所示。在各种实施方案中，可以采用具有结构或序列同源性和相当功能性的酶(包括细菌同源物)。例如，氨基酸序列可以与SEQ ID NO：3-8中的任一个具有50％或更多的序列同一性，或与SEQ ID NO：3-8中任一个的氨基酸序列具有至少约60％的序列同一性、或至少约70％的序列同一性、或至少约80％的序列同一性、或至少约90％的序列同一性、或至少约95％的序列同一性、或至少约98％的序列同一性。在一些实施方案中，对氨基酸序列(SEQ ID NO：3-8)进行1至约10或1至约5个氨基酸取代、缺失和/或插入以改变蛋白质的活性，包括对底物结合位点或活性位点中的一个或多个的取代。可以通过构建同源性模型来获知对酶的修饰。此类突变体可以通过本领域可获得的酶结构来获知，包括Yajima S，等人，Structure of 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase in a quaternary complex with a magnesium ion，NADPH and the antimalarial drug fosmidomycin，Acta Cryst.F63，466-470(2007)。

在一些实施方案中，MEP补充增强DOXP和MEP池向MEcPP(IspG的底物)的转化。参见图1。从dxs到ispF的MEP途径中的瓶颈可以关于DOX、ME和MEcPP水平来确定，其可以在细胞外检测。可以平衡MEP途径酶的补充和表达以将碳通量移动至MEcPP中间体，如通过代谢物谱分析所确定的。在一些实施方案中，IspG和IspH的表达或活性在Dxr、Dxs、IspD、IspE和IspF的表达或活性方面是平衡的，以将MEcPP代谢物拉动至IPP和DMAPP前体。MEcPP可以被转运到细胞外培养基中，并且因此大的MEcPP池可能导致MEP碳损失。

在一些实施方案中，调节重组idi基因的表达或活性以增加萜烯或萜类化合物产生。Idi酶催化IPP向DMAPP的可逆异构化。由于每个所需的萜类化合物产物或不需要的MEP副产物(例如，UPP)使用一个DMAPP和不同数量的IPP，所以两种前体之间的比率可以对菌株生产力产生影响。改变IPP：DMAPP的比率，例如通过改变Idi表达或活性可以相对于来自MEP途径的其他不需要的产物对所需萜类化合物的产生产生影响。例如，如图9所示，虽然Idi过表达在不过表达IspGH的菌株(菌株1)中稍微增加产物滴度，但是它降低了过表达IspGH的两个菌株(菌株2和3)中的滴度，从而指示由Idi控制的IPP与DMAPP之间的平衡可以根据下游途径的需要调高或调低。然而，菌株4(图9)，其具有不同的MEP途径酶表达平衡，在Idi补充的情况下使滴度超过双倍。除了点突变以增加或降低酶生产力之外，通过修饰启动子强度、基因拷贝数、操纵子中的位置或核糖体结合位点，可以在各种实施方案中调节重组idi基因的表达。

微生物菌株提供MEP碳的明显增加，包括IPP和DMAPP前体通量的明显增加，但对菌株生长和活力没有明显影响，例如，如通过培养物中的光密度(O.D.)、峰值O.D.和/或生长率来确定。例如，尽管通过MEP途径的通量增加，其在细菌细胞中受到严格控制，但微生物菌株的峰值O.D.没有超过约20％的下降，或在一些实施方案中，峰值O.D.没有超过约15％、或超过约10％、或超过约5％的下降。在一些实施方案中，所述菌株对菌株生长或活力没有表现出可测量的影响，如例如通过测量生长速率或峰值O.D.所确定的。

在一些实施方案中，细菌菌株含有一种或多种遗传修饰，其增强电子通过MEP途径和/或到萜烯或萜类化合物产物的供应和转移。在一些实施方案中，电子通过MEP途径增强的供应和转移是通过重组表达一种或多种氧化还原酶进行的，包括氧化丙酮酸和/或导致铁氧还蛋白还原的氧化还原酶。铁氧还蛋白向MEP途径供应电子并支持IspG和IspH(其为Fe-S簇酶)的活性。参见图10。在各种实施方案中，微生物菌株包含黄素氧还蛋白(fldA)、黄素氧还蛋白还原酶、铁氧还蛋白(fdx)和铁氧还蛋白还原酶中的一种或多种的过表达或补充。

以举例的方式，在一些实施方案中，氧化还原酶为丙酮酸：黄素氧还蛋白氧化还原酶(PFOR)。在一些实施方案中，PFOR是YdbK。在一些实施方案中，YdbK是大肠杆菌YdbK或其直系同源物和衍生物。

在一些实施方案中，菌株含有YdbK的补充或过表达。预测YdbK充当丙酮酸：黄素氧还蛋白氧化还原酶和/或丙酮酸合酶。认为氧化还原酶将丙酮酸氧化成乙酰辅酶A，还原铁氧还蛋白，然后铁氧还蛋白可以向MEP途径供应电子，尤其是支持含有Fe-S簇的强烈上调的IspG和IspH酶。在一些实施方案中，重组YdbK的表达与IspG和IspH的表达平衡，其可以通过产物滴度(或如下所述的法呢醇滴度)来确定。在一些实施方案中，YdbK基因处于弱或中等强度启动子的控制下。另外，额外的携带电子或转移的辅因子可以在YdbK过表达之上表达。参见例如Akhtar，等人，Metabolic Engineering，11(3)：139-147(2009)。在一些实验中，YdbK与来自巴斯德氏梭状芽胞杆菌(Clostridium pasteurianum)(SEQ ID NO：10)和/或大肠杆菌(Ec.ydhY)(SEQ ID NO：34)的fdx(铁氧还蛋白)或与其具有至少80％或至少90％的序列同一性的酶过表达。细菌菌株可以包含重组YdbK基因，其可以整合到染色体中或由质粒表达。大肠杆菌YdbK酶的氨基酸序列在本文中如SEQ ID NO：9所示。在各种实施方案中，可以采用具有结构或序列同源性和相当功能性的酶。例如，氨基酸序列可以与SEQ ID NO：9中的任一个具有50％或更多的序列同一性，或与SEQ ID NO：9的氨基酸序列具有至少约60％的序列同一性、或至少约70％的序列同一性、或至少约80％的序列同一性、或至少约90％的序列同一性、或至少约95％的序列同一性、或至少约97％的序列同一性、或至少约98％的序列同一性。在一些实施方案中，对氨基酸序列(SEQ ID NO：9)进行1至约10或1至约5个氨基酸取代、缺失和/或插入以改变蛋白质的活性。

在一些实施方案中，所述菌株包含一种或多种用于产生萜类化合物的P450酶。YdbK和可能的其他氧化还原酶的过表达可能支持更高水平的P450氧化化学。

在一些实施方案中，包括在细菌菌株过表达或具有更高活性的丙酮酸：黄素氧还蛋白氧化还原酶(PFOR)的实施方案中，所述菌株表现出减少的丙酮酸通过丙酮酸脱氢酶(PDH)向乙酰辅酶A的转化。在一些实施方案中，通过使PDH缺失或失活，或通过降低PDH的表达或活性，减少丙酮酸通过PDH向乙酰辅酶A的转化。在一些实施方案中，PDH缺失。可替代地，PDH的活性可以通过一个或多个氨基酸修饰来降低。降低PDH活性的示例性突变是aceE中的G267C突变。

在一些实施方案中，通过修饰PDH的aceE-aceF-lpd复合物来减少丙酮酸通过PDH向乙酰辅酶A的转化。在一些实施方案中，aceE-aceF-lpd复合物通过aceE、aceF、lpd或其组合的缺失、失活或降低的表达或活性进行修饰。以举例的方式，在一些实施方案中，aceE缺失(例如，通过敲除)。可替代地，在一些实施方案中，aceE-aceF-lpd复合物通过aceE、aceF、lpd或其组合的一种或多种突变进行修饰。

通过减少丙酮酸通过PDH向乙酰辅酶A的转化，细菌菌株将更多地依赖PFOR(例如YdbK)将丙酮酸转化为乙酰辅酶A。参见图15。这种依赖性增强了IspG和IspH活性。

在一些实施方案中，通过一种或多种氧化还原酶(例如像PFOR)的过表达或补充，改善了向IspG和IspH的电子供应和转移。以举例的方式，在一些实施方案中，PFOR或其同源物选自YdbK(SEQ ID NO：9)、Scy.pfor(藻属)(SEQ ID NO：29)、Ki.pfor(居中克吕沃尔氏菌(Kluyvera intermedia))(SEQ ID NO：30)、Da.pfor(非洲脱硫弧菌(Desulfovibrioafricanus))(SEQ ID NO：31)、Ns.pfor(念珠藻属(Nostoc sp.))(SEQ ID NO：32)、Ec.ydhV(大肠杆菌)(SEQ ID NO：33)、Ga.pfor(蜜蜂吉利氏菌(Gilliamella apicola))(SEQ IDNO：35)，以及Sco.pfor(聚球藻属(Synechococcus sp.))。在一些实施方案中，PFOR是YdbK。

在一些实施方案中，PFOR包含与SEQ ID NO.29-35中的任一个具有至少60％同一性的序列。例如，PFOR可以包含与SEQ ID NO.29-35中的任一个具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性的序列。

在一些实施方案中，通过表达具有约400至550mV或在一些实施方案中在约400至约500mV的范围内、或在约400至475mV的范围内的氧化还原电势的电子载体，PFOR(例如像YdbK)的过表达或补充可以使得性能改善。在一些实施方案中，电子载体是铁氧还蛋白、黄素氧还蛋白或NADPH。以举例的方式，在一些实施方案中，电子载体是Cv.fdx(酒色别样着色菌)。

在一些实施方案中，细菌菌株具有一种或多种fpr同源物的过表达或补充。以举例的方式，在一些实施方案中，fpr同源物选自Ns.fpr(念珠藻属)(SEQ ID NO：36)、Sco.fpr(聚球藻属)(SEQ ID NO：37)和Ec.fpr(大肠杆菌)(SEQ ID NO：38)。

在一些实施方案中，fpr包含与SEQ ID NO.36-38中的任一个具有至少60％同一性的序列。例如，fpr可包含与SEQ ID No.36-38中的任一个具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性的序列。

在一些实施方案中，过表达YdbK或其同源物或衍生物的细菌菌株还表达非天然电子受体/供体，诸如一种或多种非天然fdx和/或fldA同源物。以举例的方式，fdx同源物可以选自Hm.fdxl(嗜中温螺旋杆菌(Heliobacterium modesticaldum))(SEQ ID NO：15)、Pa.fdx(铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))(SEQ ID NO：16)、Cv.fdx(酒色别样着色菌)(SEQ ID NO：17)、Cv.fdx_C57A(合成的)(SEQ ID NO：18)、Ec.yfhL(大肠杆菌)(SEQID NO：19)、Ca.fdx(丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum))(SEQ ID NO：20)、Cp.fdx(巴斯德氏梭状芽胞杆菌)(SEQ ID NO：10)、Ec.fdx(大肠杆菌)(SEQ ID NO：21)、Ev2.fdx(沙氏外硫红螺菌(Ectothiorhodospira shaposhnikovii))(SEQ ID NO：22)、Pp1.fdx(恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida))(SEQ ID NO：23)和Pp2.fdx(恶臭假单胞菌)(SEQ ID NO：24)。在一些实施方案中，fldA同源物包括选自Ec.fldA(大肠杆菌)(SEQ IDNO：27)、Ac.fldA2(圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum))(SEQ ID NO：26)、Av.fldA2(棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii))(SEQ ID NO：25)和Bs.fldA(枯草芽孢杆菌(B.subtilis))(SEQ ID NO：28)中的一种或多种。非天然fdx同源物和/或fldA同源物的表达导致向IspG和/或IspH的电子供应增加、IspG/H活性增加以及萜类化合物产生增加。参见图19A至图19C。

在一些实施方案中，非天然fdx同源物包含与SEQ ID No.10和15-24中的任一个具有至少60％同一性的序列。例如，非天然fdx同源物可以包含与SEQ ID No.10和15-24中的任一个具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性的序列。

在一些实施方案中，非天然fldA同源物包含与SEQ ID No.25-28中的任一个具有至少60％同一性的序列。例如，非天然fldA同源物可以包含与SEQ ID No.25-28中的任一个具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性的序列。

在一些实施方案中，所述细菌菌株具有一种或多种PFOR和/或fpr以及任选地黄素氧还蛋白(fldA)、黄素氧还蛋白还原酶、铁氧还蛋白(fdx)和铁氧还蛋白还原酶中的一种或多种的过表达或补充。以举例的方式，在一些实施方案中，细菌菌株包括Ec.ydhV(大肠杆菌)(SEQ ID NO：33)和Ec.ydhY(大肠杆菌)(SEQ ID NO：34)；Ec.ydbK(大肠杆菌)(SEQ IDNO：9)和Cp.fdx(巴斯德氏梭状芽胞杆菌)(SEQ ID NO：10)；Ec.fpr(大肠杆菌)(SEQ ID NO：38)和Ec.fdx(大肠杆菌)(SEQ ID NO：21)；或Ec.fpr(大肠杆菌)(SEQ ID NO：38)和Ec.fldA(大肠杆菌)(SEQ ID NO：27)。

在其他方面，本发明提供过表达PgpB或NudB酶的细菌菌株，用于增加MEP碳拉力。通过过表达诸如pgpB和nudB等基因来安装这种替代‘产物’拉动甚至更多通过MEP途径(尽管到非目标产物)的通量，并最大限度地减少潜在毒性或反馈抑制中间体(例如IPP、DMAPP、FPP)的积累。在一些实施方案中，PgpB或NudB过表达缺乏下游萜类化合物途径，从而产生“通用底物”；即，可以具有在下游转化为其的任何萜类化合物并且可以快速优化用于商业生产的菌株。

更具体地，碳可以拉动通过MEP途径，以产生在细胞外聚集的替代产物。PgpB将FPP去磷酸化为法呢醇(FOH)，并且NudB分别将IPP和DMAPP去磷酸化为异戊烯醇(3-甲基-3-丁烯-1-醇)和戊烯醇(3-甲基-2-丁烯-1-醇)(参见图1)。增强这些产物在细胞外的转运防止IPP、DMAPP和FPP的累积；类似HMBPP，其可以反馈并对MEP途径施加控制。IPP抑制生长，并且反馈抑制Dxs。参见Cordoba，Salmi和Leon(2009)J.Exp.Bot.60，10，2933-2943。FPP抑制生长并且反馈抑制ispF-MEP复合物，其在MEP以前馈方式结合并增强IspF活性时自身形成。Bitok和Meyers(2012)ACS Chem.Biol.2012，7，1702-1710。法呢醇、异戊烯醇和戊烯醇在细胞外积累，并且与MEP途径中的中间体一样，可以用于通过LC/MS或GC/MS定量来追踪通过MEP途径的碳通量。

在各种实施方案中，可以采用具有结构或序列同源性和相当功能性的酶。例如，氨基酸序列可以与SEQ ID NO：11(PgpB)或12(NudB)具有50％或更多的序列同一性，或与SEQID NO：11或12的氨基酸序列具有至少约60％的序列同一性、或至少约70％的序列同一性、或至少约80％的序列同一性、或至少约90％的序列同一性、或至少约95％的序列同一性。在一些实施方案中，对氨基酸序列(SEQ ID NO：11或12)进行1至约10或1至约5个氨基酸取代、缺失和/或插入以改变蛋白质的活性，包括对底物结合位点或活性位点中的一个或多个的取代。

因此，通过组成型表达pgpB或nudB的额外拷贝，可以改善通过MEP途径的碳通量，并且缓慢生长表型得到改善。在ispG和ispH平衡且pgpB或nudB过表达的情况下，法呢醇产物的增加或减少与MEcPP水平呈负相关(图7和图8)。

然而，过多的PgpB或NudB表达可能对到法呢醇的总通量产生负面影响，滴度较低且倍数变化较小。参见图6。因此，在各种实施方案中，调节重组PgpB和/或NudB的表达以提供更高的萜烯或萜类化合物产物滴度，任选地通过改变启动子强度、基因拷贝数、操纵子中的位置和/或核糖体结合位点进行。在一些实施方案中，重组pgpB和/或nudB基因在弱或中等强度的启动子的控制下表达。重组pgpB或nudB可以整合到染色体中或由质粒表达。

在一些实施方案中，细菌菌株过表达一种或多种合酶以增加MEP碳拉力。以举例的方式，在一些实施方案中，合酶选自青蒿法呢烯合酶和瓦伦烯合酶(valencene synthase)。

在一些实施方案中，细菌菌株具有一种或多种另外的修饰以增加辅因子可用性或周转，包括NADH和NADPH辅因子，从而使得MEP碳增加。参见图14。在一些实施方案中，细菌菌株表达3-磷酸甘油醛铁氧还蛋白氧化还原酶(GAPOR)，例如，来自海沼甲烷球菌(Methanococcus maripaludis)(SEQ ID NO：14)或其他嗜温生物体。GAPOR的表达将为中心碳代谢中的铁氧还蛋白提供电子，并且可以为IspG、IspH或P450酶提供电子。在一些实施方案中，细菌菌株过表达ydh操纵子的一个或多个基因，诸如ydhV或ydhY(例如，通过补充野生型基因或增强内源细菌基因的表达)。YdhV或具有GAPOR样活性的其他细菌基因可以增加辅因子可用性以进一步增强MEP碳。其他遗传修饰包括gshA的下调、失活或缺失或CHAC1和/或CHAC2的表达(例如来自智人(Homo sapiens))。这些修饰可以改变谷胱甘肽水平，从而间接增加NADPH的可用性。

虽然可以根据本公开修饰各种细菌种属，但在一些实施方案中，细菌菌株为选自埃希氏菌属(Escherichia spp.)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium spp.)、红细菌属(Rhodobacter spp.)、发酵单胞菌属(Zymomonasspp.)、弧菌属(Vibrio spp.)和假单胞菌属(Pseudomonas spp.)的细菌。在一些实施方案中，细菌菌株为选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、球形红细菌(Rhodobactersphaeroides)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、需钠弧菌(Vibrio natriegens)或恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的种属。在一些实施方案中，细菌菌株为大肠杆菌。

根据本文描述的实施方案，可以采用各种策略来改造重组基因和酶的表达或活性，包括例如修饰或替换不同强度的启动子，修饰核糖体结合序列、修饰操纵子或模块中的基因的顺序、基因密码子的使用、RNA或蛋白质稳定性、RNA二级结构和基因拷贝数等。

在一些实施方案中，可以改变核糖体结合位点序列，以调节mRNA的翻译。Shine-Dalgarno(SD)序列是细菌中的核糖体结合位点，并且通常位于起始密码子AUG上游约8个碱基处。RNA序列通过将核糖体与起始密码子对齐来帮助将核糖体募集到信使RNA(mRNA)以启动蛋白质合成。六碱基共有序列是大肠杆菌中的AGGAGG(SEQ ID NO：13)。可以针对产物滴度(在一些实施方案中包括法呢醇滴度)的提高筛选共有序列中的突变，或通过MEP碳的代谢组学分析筛选。

对于基因的补充，可以采用野生型基因，并且在一些实施方案中，所述基因是野生型大肠杆菌基因。可替代地，可以采用各种直系同源物，其可以显示与大肠杆菌基因的核苷酸或氨基酸同源性。示例性基因可以衍生自例如芽孢杆菌属、棒状杆菌属、红细菌属、发酵单胞菌属、弧菌属、假单胞菌属、绿棒菌属(Chloroboculum spp.)、藻属、伯克霍尔德氏菌属和甜叶菊属的直系同源物。

核苷酸和氨基酸序列的相似性，即序列同一性的百分比，可以通过序列比对来确定。此类比对可以用几种本领域已知的算法进行，诸如使用Karlin和Altschul的数学算法(Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877)，使用hmmalign(HMMER包，http：//hmmer.wustl.edu/)或使用CLUSTAL算法(Thompson，J.D.，Higgins，D.G.和Gibson，T.J.(1994)Nucleic Acids Res.22，4673-80)。序列同一性的等级(序列匹配)可以使用例如BLAST、BLAT或BlastZ(或BlastX)计算。将类似的算法并入Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410的BLASTN和BLASTP程序中。BLAST多核苷酸搜索可以用BLASTN程序进行，得分＝100，字长＝12。

BLAST蛋白质搜索可以用BLASTP程序进行，得分＝50，字长＝3。为了获得用于比较目的的空位比对，如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402所述，利用空位BLAST。当利用BLAST和空位BLAST程序时，使用相应程序的默认参数。序列匹配分析可以通过已建立的同源映射技术补充，例如Shuffle-LAGAN(Brudno M.，Bioinformatics2003b，19 Suppl 1：154-162)或Markov随机场(Markov random fields)。

例如，“保守取代”可以基于所涉及的氨基酸残基的极性、电荷、大小、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性来完成。20种天然存在的氨基酸可以分为以下六个标准氨基酸组：

(1)疏水性：Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr；Asn、Gln；

(3)酸性：Asp、Glu；

(4)碱性；His、Lys、Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；以及

(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。

如本文所用，“保守取代”定义为氨基酸被上文所示的六个标准氨基酸组的相同组中列出的另一种氨基酸交换。例如，由Glu交换Asp在如此修饰的多肽中保留一个负电荷。另外，甘氨酸和脯氨酸可以基于它们破坏α-螺旋的能力而彼此取代。上述六组中的一些优选保守取代是以下子组内的交换：(i)Ala、Val、Leu和Ile；(ii)Ser和Thr；(ii)Asn和Gin；(iv)Lys和Arg；以及(v)Tyr和Phe。

如本文所用，“非保守取代”定义为氨基酸被上文所示的六个标准氨基酸组(1)至(6)的不同组中列出的另一种氨基酸交换。

如本文所述的酶的修饰可以包括保守和/或非保守突变。

在一些实施方案中，“合理设计”涉及构建酶中的特定突变。合理设计是指将酶或相关酶的知识(诸如其反应热力学和动力学、其三维结构、其一个或多个活性位点、其一种或多种底物和/或酶与底物之间的相互作用)并入到特定突变的设计中。基于合理的设计方法，可以在酶中产生突变，然后可以针对于相对于亲本菌株水平增加的萜烯或萜类化合物的产生或与MEP碳的改善相对应的代谢物谱筛选突变。在一些实施方案中，可以基于同源性建模合理地设计突变。“同源性建模”是指使用相关同源蛋白质的三维结构从其氨基酸序列构建蛋白质的原子分辨率模型的过程。

可以对酶进行氨基酸修饰以增加或降低酶或酶复合物的活性。可以使用本领域已知的任何遗传突变方法进行基因突变。在一些实施方案中，基因敲除全部或部分消除基因产物。可以使用本领域已知的任何敲除方法进行基因敲除。

可以通过各种方法实现基因和/或蛋白质(包括基因模块)表达的操纵。例如，可以通过选择具有不同强度(例如，强、中或弱)的启动子(诸如诱导型或组成型启动子)来调节基因或操纵子的表达。启动子的几个非限制性实例包括Trc、T5和T7。另外，可以通过操纵细胞中基因或操纵子的拷贝数来调节基因或操纵子的表达。在一些实施方案中，可以通过操纵模块内基因的顺序来调节基因或操纵子的表达，其中首先转录的基因通常以较高水平表达。在一些实施方案中，通过将一个或多个基因或操纵子整合到染色体中来调节基因或操纵子的表达。

在一些实施方案中，平衡基因表达包括选择高拷贝数质粒，或单拷贝数、低拷贝数或中拷贝数质粒。在又其他实施方案中，转录终止步骤也可以通过引入或消除诸如茎环的结构而靶向基因表达的调节。

含有用于表达的所有必需元件的表达载体是可商购获得的并且是本领域技术人员已知的。参见例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。通过将异源DNA引入细胞中来对细胞进行基因工程化。将异源DNA置于转录元件的可操作控制下，以允许异源DNA在宿主细胞中表达。

在一些实施方案中，编辑内源基因而不是基因补充。编辑可以修饰内源启动子、核糖体结合序列或其他表达控制序列，和/或在一些实施方案中修饰基因调节中的反式作用和/或顺式作用因子。基因组编辑可以使用CRISPR/Cas基因组编辑技术或采用锌指核酸酶和TALEN的类似技术进行。在一些实施方案中，内源基因被同源重组替代。

在一些实施方案中，基因至少部分地通过控制基因拷贝数过表达。虽然可以使用具有不同拷贝数的质粒方便地控制基因拷贝数，但也可以采用基因复制和染色体整合。例如，遗传稳定的串联基因复制的方法描述于US 2011/0236927中，其特此以引用的方式整体并入。

在某些实施方案中，细菌细胞产生一种或多种萜烯或萜类化合物。萜类化合物，也称为类异戊二烯，是衍生自五碳异戊二烯单元(C5)的有机化学品。基于它们含有的异戊二烯单元的数量分类的萜类化合物的几个非限制性实例包括：半萜类化合物(1个异戊二烯单元)、单萜类化合物(2个异戊二烯单元)、倍半萜类化合物(3个异戊二烯单元)、二萜类化合物(4个异戊二烯单元)、二倍半萜类化合物(5个异戊二烯单元)、三萜类化合物(6个异戊二烯单元)、四萜类化合物(8个异戊二烯单元)和具有大量异戊二烯单元的多萜类化合物。在一个实施方案中，细菌宿主细胞产生选自单萜类化合物、倍半萜类化合物、二萜类化合物、二倍半萜类化合物或三萜类化合物的萜类化合物。萜类化合物代表多样种类的分子，其提供了许多商业应用，包括食品和饮料行业以及香水、化妆品和保健行业。以举例的方式，萜类化合物可用于香料(例如广藿香醇)、香料行业(例如，诺卡酮)、甜味剂(例如，甜菊醇)、着色剂或治疗剂(例如，紫杉醇)，并且许多通常从植物中提取。然而，萜类化合物分子在自然界中以ppm水平存在，并且因此需要大量收获以获得足够的量用于商业应用。

细菌细胞通常含有重组下游途径，其由IPP和DMAPP前体产生萜类化合物。萜烯诸如单萜(C10)、倍半萜(C15)、二萜(C20)、二倍半萜(C25)和三萜(C30)衍生自异戊二烯基二磷酸底物、香叶基二磷酸(GPP)、法呢基二磷酸(FPP)、香叶基香叶基二磷酸(GGPP)、香叶基法呢基二磷酸(FGPP)和两个FPP，分别通过称为萜烯(萜类化合物)合酶的非常大的一组酶的作用衍生。这些酶通常被称为萜烯环化酶，因为反应产物被环化成各种单萜、倍半萜、二萜、二倍半萜和三萜碳骨架产物。许多所得的碳骨架经细胞色素P450酶进行亚序列氧化，产生大量衍生物。

可以根据本发明产生的示例性萜烯或萜类化合物产物描述于US8,927,241中，其特此以引用的方式并入，并且包括：法呢烯、紫穗槐二烯、青蒿酸、青蒿素、红没药醇、红没药烯、α-甜橙醛、β-侧柏酮、樟脑、葛缕醇、香芹酮、桉叶油醇、柠檬醛、香茅醛、荜澄茄醇、香叶醇、柠檬烯、薄荷醇、薄荷酮、香叶烯、诺卡酮、诺卡醇、广藿香、胡椒酮、玫瑰醚、桧烯、甜菊醇、甜菊醣苷(包括瑞鲍迪甙D(Rebaudioside D)或瑞鲍迪甙M)、紫杉烯、百里酚以及瓦伦烯。用于在大肠杆菌中重组构建途径的酶描述于US 8,927,241，WO 2016/073740和WO2016/029153中，其特此以引用的方式并入。

在倍半萜支架上起作用以产生含氧萜类化合物的示例性P450酶描述于WO 2016/029153中，其特此以引用的方式并入。另外，在WO 2016/029153以及WO 2016/073740中描述了可用于本文所述的细菌菌株的P450还原酶蛋白。

如本文所用，术语“含氧萜类化合物”是指具有一个或多个氧合事件的萜烯支架，其产生对应的醇、醛、羧酸和/或酮。在一些实施方案中，细菌细胞产生至少一种选自松香二烯、松香酸、α-甜橙醛、β-侧柏酮、樟脑、葛缕醇、香芹酮、雷公藤红素、二十五烧醇(Ceroplastol)、桉叶油醇、柠檬醛、香茅醛、荜澄茄醇、葫芦烷、毛喉素、Gascardic Acid、香叶醇、Haslene、左旋海松酸、柠檬烯、羽扇豆醇、薄荷醇、薄荷酮、罗汉果苷、诺卡酮、诺卡醇、蛇孢假壳素A、广藿香、胡椒酮、瑞鲍迪甙D、瑞鲍迪甙M、桧烯、甜菊醇、甜菊醇糖苷、紫杉烯、百里酚和熊果酸的萜类化合物。

在一些实施方案中，升级萜类合酶以增强酶的动力学、稳定性、产物分布和/或温度耐受性，例如在WO 2016/029153和WO 2016/073740中公开，其特此以引用的方式并入。

在另一个实施方案中，细菌细胞产生瓦伦烯和/或诺卡酮。在这种实施方案中，细菌细胞可以表达生物合成途径，其还包括法呢基二磷酸合酶、瓦伦烯合酶和瓦伦烯氧化酶。法呢基二磷酸合酶(FPPS)由异戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)产生法呢基二磷酸。示例性法呢基二磷酸合酶是酿酒酵母的ERG20(NCBI登录号P08524)和大肠杆菌ispA。瓦伦烯合酶产生倍半萜支架并描述于例如US 2012/0107893、US 2012/0246767和US 7,273,735中，其特此以引用的方式整体并入。用于产生包含瓦伦烯和/或诺卡酮的萜类化合物产物的基因和宿主细胞描述于WO 2016/029153中，其特此以引用的方式并入。

在一个实施方案中，细菌细胞产生甜菊醇或甜菊醇糖苷(例如，RebD或RebM)。甜菊醇由贝壳杉烯通过两种P450酶，贝壳杉烯氧化酶(KO)和贝壳杉烯酸羟化酶(KAH)的作用产生。在产生甜菊醇后，可以通过一系列糖基化反应产生各种甜菊醇糖苷产物，其可以在体外或体内发生。用于产生甜菊醇和甜菊醇糖苷的途径和酶公开于US 2013/0171328、US 2012/0107893、WO2012/075030、WO 2014/122328，其特此以引用的方式整体并入。WO 2016/073740还公开了用于产生RebM的酶和细菌宿主细胞。

用于产生萜烯或萜类化合物的其他生物合成途径公开于US 8,927,241中，其特此以引用的方式整体并入。

细菌菌株可以分批培养、连续培养或半连续培养进行培养。在一些实施方案中，使用补料分批方法培养细菌菌株，所述补料分批方法包括产生细菌生物质的第一阶段，然后是萜烯或萜类化合物生产阶段。补料分批培养是在培养期间将营养物供给生物反应器并且其中一种或多种产物保留在生物反应器中直至运行结束的过程。通常，基础培养基支持初始细胞培养，并添加补料培养基以防止营养物耗尽。营养物的受控添加直接影响培养物的生长速率，并有助于避免溢出代谢和副代谢物的形成。

用于使细菌菌株(产生生物质)生长的示例性分批培养基包括但不限于酵母提取物。在一些实施方案中，将碳底物如C1、C2、C3、C4、C5和/或C6碳底物进料至培养物中以产生萜烯或萜类化合物产物。在示例性实施方案中，碳源是葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖和/或甘油。培养条件通常选自有氧、微氧和厌氧。

在一些实施方案中，培养物维持在有氧条件或微氧条件下。例如，当使用补料分批方法时，生物质生产阶段可以在有氧条件下进行，然后降低氧水平以用于产物生产阶段。例如，培养物可以在约10至约20小时后转变为微氧条件。在本文中，术语“微氧条件”意指培养物维持在刚刚低于可检测的溶解氧下。参见Partridge JD，等人，Transition of Escherichia coli from Aerobic to Micro-aerobic Conditions Involves Fast and Slow Reacting Regulatory Components，J.Biol.Chem.282(15)：11230-11237(2007)。

生产阶段包括供给氮源和碳源。例如，氮源可以包含铵(例如，氢氧化铵)。碳源可以含有C1、C2、C3、C4、C5和/或C6碳源，在一些实施方案中诸如葡萄糖、蔗糖或甘油。当消耗预定量的分批培养基时，可以启动氮和碳进料，这是提供易于缩放比例的过程。在一些实施方案中，氮进料速率为约8L/小时至约20L/小时，但部分取决于产物、菌株和规模。

在各种实施方案中，细菌宿主细胞可以在22℃至37℃的温度下培养。虽然细菌诸如大肠杆菌中的商业生物合成可以受到过表达和/或外源酶稳定的温度的限制，可以对重组酶(包括萜类化合物合酶)进行工程化以使培养物维持在较高温度下，从而产生更高的产率和更高的总生产力。在一些实施方案中，培养在约22℃或更高、约23℃或更高、约24℃或更高、约25℃或更高、约26℃或更高、约27℃或更高、约28℃或更高、约29℃或更高、约30℃或更高、约31℃或更高、约32℃或更高、约33℃或更高、约34℃或更高、约35℃或更高、约36℃或更高、或约37℃下实施。在一些实施方案中，培养物维持在22℃至37℃的温度、或25℃至37℃的温度、或27℃至37℃的温度、或30℃至37℃的温度下。

在一些实施方案中，细菌菌株以商业规模培养。在一些实施方案中，培养物的大小为至少约100L、或至少约200L、或至少约500L、或至少约1,000L、或至少约10,000L、或至少约100,000L、或至少约500,000L。在一些实施方案中，培养物为约300L至约1,000,000L。

在各种实施方案中，方法还包括从细胞培养物或细胞裂解物中回收萜烯或萜类化合物产物。在一些实施方案中，培养物产生至少约100mg/L、至少约150mg/L、或至少约200mg/L、或至少约500mg/L、或至少约1g/L、或至少约5g/L、或至少约10g/L、或至少约15g/L的萜烯或萜类化合物产物。

在一些实施方案中，吲哚的产生用作萜类化合物产生的替代标记，并且/或者控制培养物中吲哚的积累以增加产量。例如，在各种实施方案中，将培养物中吲哚的积累控制在低于约100mg/L、或低于约75mg/L、或低于约50mg/L、或低于约25mg/L、或低于约10mg/L。吲哚的积累可以通过使用如US 8,927,241(其特此以引用的方式并入)中描述的多变量模块方法平衡酶表达(并且特别是平衡上游和下游途径)和活性来控制。在一些实施方案中，吲哚的积累通过化学方法控制。

有效产生萜烯和萜类化合物的其他标记包括培养基中DOX或ME的积累。通常，本文所述的细菌菌株不会积累大量的这些化学物质，其在培养物中积累小于约5g/L、或小于约4g/L、或小于约3g/L、或小于约2g/L、或小于约1g/L、或小于约500mg/L、或小于约100mg/L。

在一些实施方案中，MEcPP是培养基中的主要MEP代谢物，尽管其积累受到细菌菌株的遗传修饰的限制，其将MEP碳向下游拉至IPP和DMAPP前体。在各种实施方案中，MEcPP在培养物中积累小于约30g/L、或小于约20g/L、或小于约2g/L、或小于约1g/L、或小于约500mg/L、或小于约100mg/L。

通过操纵MEP途径基因以及操纵上游和下游途径来优化萜烯或萜类化合物生产，预计不是简单的线性或加成过程。相反，通过组合分析，通过平衡MEP途径以及上游和下游途径的组分来实现优化。培养物或细胞中的吲哚积累(包括异戊二烯化的吲哚)和MEP代谢物积累(例如，DOX、ME、MEcPP、HMBPP、法呢醇、戊烯醇和异戊烯醇)可以用作指导此过程的替代标志。

可以通过任何合适的方法回收萜烯或萜类化合物产物。通常，回收包括从培养物或细胞中分离包含产物的物质，然后进行提取和纯化。例如，回收可以包括将所需产物分配成有机相或疏水相。可替代地，可以回收水相，或者可以回收全细胞生物质，用于进一步加工。

例如，在一些实施方案中，产物是挥发性萜烯或萜类化合物产物。在此类实施方案中，可以从与培养物机械分离的有机相或疏水相中回收萜烯或萜类化合物产物。可替代地或另外，从液相和/或固相收获萜烯或萜类化合物产物。在一些实施方案中，通过依序提取和纯化来纯化产物。例如，可以通过基于色谱法的分离和回收来纯化产物，诸如超临界流体色谱法。产物可以通过蒸馏纯化，包括简单蒸馏、蒸汽蒸馏、分馏、擦拭膜蒸馏或连续蒸馏。

在一些实施方案中，产物是非挥发性萜烯或萜类化合物产物，其在一些实施方案中是从培养基中回收的细胞外产物。可替代地，产物是从收获的细胞材料中回收的细胞内产物。当产物可溶性较差时，它可以通过过滤回收，并且任选地用溶剂萃取(例如，用乙醇萃取)。可替代地或另外，通过基于色谱法的分离(诸如液相色谱法)回收产物。在一些实施方案中，通过依序提取和纯化来回收产物。在又其他实施方案中，产物从溶液中结晶出来。

可以例如通过气相色谱法(例如，GC-MS)确定和/或定量所需产物的产生。产物的生产、回收和/或产物分析可以如US 2012/0246767中所述进行，其特此以引用的方式整体并入。例如，在一些实施方案中，使用有机溶剂(诸如烷烃，诸如庚烷或十二烷)从含水反应介质中提取产物油，然后进行分馏。在其他实施方案中，使用疏水相(诸如植物油)从含水反应介质中提取产物油，然后进行有机溶剂萃取和分馏。馏分的萜烯和萜类化合物组分可以通过GC/MS定量测量，然后将馏分共混以产生所需的产物分布。

在各种实施方案中，将回收的萜烯或萜类化合物掺入产品(例如，消费产品或工业产品)中。例如，所述产品可以是风味剂产品、芳香剂产品、甜味剂、化妆品、清洁产品、洗涤剂或肥皂或害虫防治产品。例如，在一些实施方案中，回收的产物包含诺卡酮，并且产物是选自饮料、口香糖、糖果或风味剂添加剂的风味剂产品，或者产品是驱虫剂。在一些实施方案中，含氧产物是甜菊醇或甜菊醇糖苷(例如，RebM)，其作为甜味剂提供，或掺入配料、风味剂、饮料或食品中。

本发明还提供通过掺入本文产生的萜烯或萜类化合物制备产品的方法，所述产品诸如食品、饮料、纹理剂(texturant)(诸如淀粉、纤维、树胶、脂肪和脂肪模拟物和乳化剂)、药物产品、烟草产品、营养品、口腔卫生产品和化妆品。在本发明的实施方案中产生的此类物质的较高产率可以提供显著的成本优势以及可持续性。

在其他方面，本发明提供细菌细胞，诸如大肠杆菌，其具有一种或多种增加IPP和DMAPP前体产物的遗传修饰。在各种实施方案中，细菌细胞通过MEP途径产生异戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)，并通过下游合成途径将IPP和DMAPP转化为萜烯或萜类化合物产物。下游合成途径通常是重组途径，并且可以包含异戊二烯基转移酶、一种或多种萜烯合酶和任选地一种或多种P450酶和P450还原酶(例如，各自如上所述)。例如，产物可以是二萜或二萜化合物，具有重组II型二萜合酶(DiTPS)接着是重组I型DiTPS对于GGPP的顺序作用，或者可替代地，单个重组合酶执行两个步骤。

此外，为了改善可用于产物生物合成的MEP碳，细菌菌株具有一种或多种以下遗传修饰：

(a)过表达IspG和IspH酶，IspG和IspH酶具有平衡表达以防止HMBPP中间体的积累，

(b)编码增强通过所述MEP途径和/或到萜烯或萜类化合物产物的电子供应和/或转移的酶的重组或修饰基因，其任选地是YdbK基因以及任选地非天然fdx和/或fldA同源物的过表达，

(c)aceE或aceE酶复合物的灭活或缺失，或表达或活性的降低，以及任选地

(d)重组或修饰的idi基因，用于调节活性以用于更高的萜烯或萜类化合物产生。

如本文其他部分所公开的，基因可以通过重组基因的补充而过表达，或者可以修饰内源基因以改变表达。

细菌菌株为选自埃希氏菌属、芽孢杆菌属、棒状杆菌属、红细菌属、发酵单胞菌属、弧菌属和假单胞菌属的细菌。例如，细菌菌株为选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、荚膜红细菌、球形红细菌、运动发酵单胞菌、需钠弧菌或恶臭假单胞菌的种属。在一些实施方案中，细菌菌株为大肠杆菌。

在各种实施方案中，在培养时，HMBPP积累不超过约10mg/g DCW，或在一些实施方案中积累不超过约8mg/g DCW，或在一些实施方案中积累不超过约5mg/g DCW，或在一些实施方案中积累不超过约4mg/g DCW，或在一些实施方案中积累不超过约2mg/g DCW。在一些实施方案中，HMBPP积累不超过约1mg/g DCW，或积累不超过约0.5mg/g DCW，或积累不超过约0.2mg/g DCW，或不超过约0.1mg/g DCW。

在一些实施方案中，细菌菌株表达dxs、ispD、ispF和idi作为重组基因(例如，作为野生型MEP途径酶的补充)，并且其任选地表达为操纵子。在一些实施方案中，细菌菌株表达dxs、dxr、ispD、ispE、ispF和idi作为重组基因，其任选地表达为1、2或3个单独的操纵子。MEP途径的重组基因由一种或多种质粒表达或整合到染色体中，并且表达平衡以改善MEP碳通量。具体地，细菌细胞可以产生MEcPP作为细胞外培养基中的主要MEP代谢物。

重组IspG和IspH基因可以包含一种或多种有益突变，或者可以是具有改善的特性或活性的IspG或ispH直系同源物，如本文所述。此外，在各种实施方案中，重组IspH的表达高于重组IspG的表达，其可以任选地通过将ispH在操纵子中定位在ispG之前来至少部分地实现。因此，细菌菌株可以表达来自相同操纵子的ispH和ispG(首先定位ispH)，并且在强启动子的控制下。所述重组IspG和IspH基因由质粒表达或整合到染色体中。

在一些实施方案中，细菌菌株表达重组idi基因，其被调节以增加产物，任选地通过修饰启动子强度、基因拷贝数、操纵子中的位置或核糖体结合位点进行。

在一些实施方案中，细菌菌株表达重组YdbK基因，其整合到染色体中或由质粒表达。细菌菌株还可以包含黄素氧还蛋白、黄素氧还蛋白还原酶、铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶中的一种或多种(诸如巴斯德氏梭状芽胞杆菌铁氧还蛋白(Cp.fdx))的过表达。在一些实施方案中，菌株表达一种或多种非天然fdx和/或fldA同源物。以举例的方式，fdx同源物可以选自Hm.fdx1(嗜中温螺旋杆菌)、Pa.fdx(铜绿假单胞菌)、Cv.fdx(酒色别样着色菌)、Ca.fdx(丙酮丁醇梭菌)、Cp.fdx(巴斯德氏梭状芽胞杆菌)、Ev2.fdx(沙氏外硫红螺菌)、Pp1.fdx(恶臭假单胞菌)和Pp2.fdx(恶臭假单胞菌)。在一些实施方案中，fldA同源物包括选自Ec.fldA(大肠杆菌)、Ac.fldA2(圆褐固氮菌)、Av.fldA2(棕色固氮菌)和Bs.fldA(枯草芽孢杆菌)中的一种或多种。

在一些实施方案中，fdx同源物包含与SEQ ID No.10和15-24中的任一个具有至少60％同一性的序列。例如，非天然fdx同源物可以包含与SEQ ID No.10和15-24中的任一个具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性的序列。

在一些实施方案中，fldA同源物包含与SEQ ID No.25-28中的任一个具有至少60％同一性的序列。例如，非天然fldA同源物可以包含与SEQ ID No.25-28中的任一个具有至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性的序列。

在一些实施方案中，细菌菌株具有一种或多种PFOR或其同源物的过表达或补充。以举例的方式，在一些实施方案中，PFOR选自YdbK(SEQ ID NO：9)、Scy.pfor(藻属)(SEQ IDNO：29)、Ki.pfor(居中克吕沃尔氏菌)(SEQ ID NO：30)、Da.pfor(非洲脱硫弧菌)(SEQIDNO：31)、Ns.pfor(念珠藻属)(SEQ ID NO：32)、Ec.ydhV(大肠杆菌)(SEQ ID NO：33)、Ga.pfor(蜜蜂吉利氏菌)(SEQ ID NO：35)，以及Sco.pfor(聚球藻属)。在一些实施方案中，PFOR是YdbK。

在一些实施方案中，大肠杆菌含有选自以下的一种或多种基因的缺失：pgrR、mppA、ynaI、insH-4、ynaJ、uspE、fnr、ogt、abgT、abgB、abgA、abgR、mcaS、isrA、smrA、ydaM、ydaN、fnrS、C0343、dbpA、REP115、ttcA、intR、ydaQ、ydaC、ralA、ralR、recT、recE、racC、ydaE和kilR。

可以调节重组pgpB和/或nudB的表达以提供更高的产物滴度，任选地通过改变启动子强度、基因拷贝数、操纵子中的位置和/或核糖体结合位点进行。在一些实施方案中，重组pgpB和/或nudB在弱或中等强度启动子的控制下表达。重组pgpB或nudB整合到染色体中或从质粒表达。

在各种实施方案中，细菌菌株产生萜烯或萜类化合物产物，其包括紫穗槐二烯、青蒿酸、青蒿素、红没药醇、红没药烯、α-甜橙醛、β-侧柏酮、樟脑、葛缕醇、香芹酮、桉叶油醇、柠檬醛、香茅醛、荜澄茄醇、法呢烯、香叶醇、柠檬烯、薄荷醇、薄荷酮、香叶烯、诺卡酮、诺卡醇、广藿香、胡椒酮、玫瑰醚、桧烯、甜菊醇、甜菊醣苷(包括瑞鲍迪甙D或瑞鲍迪甙M)、紫杉烯、百里酚以及瓦伦烯中的至少一种。

下面参考以下实施例进一步在下文中说明本发明的方面和实施方案。

实施例

实施例1：IspG/IspH表达调节

结论

MEP途径基因的过表达和平衡可以导致更多的碳进入MEP途径，并且可以将此碳从DOXP和MEP向‘下游’转移至MEcPP。修饰ispG和/或ispH的表达可以进一步将MEcPP转化为HMBPP至IPP。

实际上，增加IspG和IspH两者的表达显著增加了萜烯和萜类化合物产物的滴度。然而，单独增加仅IspG或IspH的表达不会提高滴度。单独过表达ispG导致生长缺陷，并且单独过表达ispH并未显著提高滴度，但确实将HMBPP转化为IPP。ispG过表达的影响可能与观察到HMBPP未在细胞外发现，但在细胞内100％发现有关。由于所述分子似乎不会被运出细胞，因此它可以充当反馈分子，在MEP途径上提供硬停止。例如，如果HMBPP池超过一定大小，则该路径将关闭。可替代地，或另外，HMBPP在某些水平下可能具有毒性，这与IspG过表达对细胞生长的影响的观察一致。

因此，ispG与ispH之间的活性平衡对于防止HMBPP失衡和积累是重要的。在某些情况下，少即是多；也就是说，MEP基因的最强过表达可能开始影响生产力。

总之，一起过表达ispG和ispH(其中在适当平衡的配置中，ispG或ispH中的一个或两个是野生型或突变的/工程化的)防止HMBPP积累变得有毒并将碳推动通过MEP途径到IPP、DMAPP并向下游推动到萜烯和萜类化合物产物。

实验结果描述

图2显示了增加单独的IspH表达或IspH和IspG的共同表达提高了已进行工程化以增加进入MEP途径的碳量的生产菌株中的萜类化合物产物滴度，但单独的ispG降低生产力。在此实施例中，对照菌株是具有MEP途径基因的平衡过表达的大肠杆菌菌株(但没有ispG或ispH的额外拷贝)，增加了进入MEP途径的碳量。如图所示，IspG的过表达使产物滴度降低约15％，而在相同表达强度下IspH的过表达使产物滴度增加17％。IspG和IspH两者的过表达超过产物滴度的三倍。

数据还显示，相对于有利于比率的ispG侧的菌株，有利于更多H酶的ispG/ispH比率导致通过MEP途径的甚至更改善的通量。IspG和ispH在此以操纵子形式表达，并且因此操纵子中的第二个基因将具有比第一个更低的表达水平。因此，ispH/ispG操纵子显示出比ispG/ispH显著更高的产物滴度。

IspG和ispH依次运作以将MEcPP转化为HMBPP，然后转化为IPP。增加ispG将积累更大的HMBPP池，而增加ispH将缩小HMBPP池，因为它被转化为IPP。单独使用IspG降低生产力，而单独使用ispH增加生产力，这一事实强烈表明HMBPP的积累对MEP途径具有负反馈影响。当IspG和IspH两者都过表达时，我们提高了HMBPP形成和消耗两者的速率，这显著改善了通过MEP途径到目标萜类化合物的通量。然而，即使在这种增强的通量方案中，IspG与IspH的平衡也是至关重要的，因为相对于ispG稍微有利于ispH可以进一步使生产力提高25％，达到具有IspG和IspH野生型表达的亲本菌株的几乎4倍。

在具有增强的MEP途径的修饰的生产菌株中增加IspG和/或IspH表达会影响MEP产物分布模式(图3)。大多数产品是DOX、ME和MEcPP(图3，上图)，其次是DOXP和MEP(图3，中图)和HMBPP(图3，下图)。在这些图中，从培养物(肉汤加细胞)中提取总细胞外和细胞内代谢物，使得报告的浓度与提取物的体积相关。

单独增加IspG或IspH会增加MEcPP的转化率并降低池大小(上图)，即使IspH增加产物滴度并且IspG损失产物滴度也是如此。然而，两种变体之间的显著差异在于HMBPP浓度(下图)，其中单独的IspG相对于对照使其增加2.5x，而单独的IspH使其减少20％。HMBPP的这种积累可能在MEP途径上进行反馈并且关闭通量的增加。HMBPP积累至非常低的水平(nM浓度)，并且其在细胞内发现100％。

以操纵子顺序一起增加ispG和ispH表达可以看出能够完全转化剩余的DOX，并减小ME池的大小。此外，与有利于IspG的菌株相比，有利于更多IspH的IspG/IspH比率能够改善MEcPP的转化(并提高产物滴度)。

图4显示了在细胞内或细胞外发现的每种个体MEP代谢物的比例(‘内部’相对于‘外部’)。这些值不反映绝对丰度，如图3所示，与HMBPP相比，DOX的总量远远更多。虽然DOX在细胞外是100％，但HMBPP在细胞内是100％。在此分析的菌株是来自图2和图3中‘对照+ispH/ispG’表现最佳的菌株。DOXP/DOX、MEP/ME和MEcPP几乎完全积累在细胞外培养基中，而CDP-ME、CDP-MEP、HMBPP、IPP/DMAPP和FPP在细胞内100％观察到。细胞内发现的每种代谢物的百分比显示在图的顶部。

未补偿的ispG上调导致细胞生长的显著下降，如通过600nm处的UV吸光度所确定的(图5)。虽然在用ispH或者ispH和ispG一起补偿的菌株中观察到最终细胞密度的一些变化，但变化不显著。

为了确定HMBPP积累，HMBPP可以用术语干细胞重量(DCW)表示。例如，使用具有平衡的ispGH表达的菌株：

0.35mL取样培养物中[HMBPP]＝0.42ug/mL

[OD600]＝12.69

假设：1 OD600＝0.4g-DCW/L＝0.4mg-DCW/mL

HMBPP产率＝[(0.42ug/mL)*(0.35mL)]/[(12.69^*0.4mg-DCW/m L)^*0.35mL)]

在此实施例中，HMBPP＝0.0827ug/mg DCW或0.0827mg/g DCW。

实施例2：pgpB和nudB过表达

结论

通过过表达诸如pgpB和nudB等基因来安装替代“产物”拉力可以将甚至更多的通量拉动通过MEP途径(尽管到非目标产物)，或者甚至可以替代各种下游萜类化合物途径来创建工具以工程化′通用底物’(即，可以具有在下游转化为其的任何萜类化合物并且可以快速优化用于商业生产的菌株)。

碳可以拉动通过MEP途径，以产生在细胞外聚集的替代产物。PgpB将FPP去磷酸化为法呢醇(FOH)，并且nudB分别将IPP和DMAPP去磷酸化为异戊烯醇(3-甲基-3-丁烯-1-醇)和戊烯醇(3-甲基-2-丁烯-1-醇)。增强这些产物在细胞外的转运防止IPP、DMAPP和FPP的累积；类似HMBPP，其可以反馈并对MEP途径施加控制。IPP抑制生长，并且反馈抑制Dxs。参见Cordoba，Salmi和Leon(2009)J.Exp.Bot.60，10，2933-2943。FPP反馈抑制IspF-MEP复合物，其在MEP以前馈方式结合并增强IspF活性时形成。Bitok和Meyers(2012)ACSChem.Biol.2012，7，1702-1710。这些产物在细胞外积累，并且与MEP途径中的中间体一样，可以用于通过LC/MS代谢组学定量来追踪通过MEP途径的C通量。

通过组成型表达pgpB的额外拷贝，可以改善通过MEP途径的碳通量，并且在具有MEP基因过表达但没有额外的下游途径将所有碳拉动到产物的菌株中缓慢生长表型得到改善。实际上，下游“拉力”成为FPP到法呢醇的转化，法呢醇在细胞外输出。类似地，nudB的组成型表达应导致IPP和DMAPP库越来越多地重定向至异戊烯醇和戊烯醇细胞外产物。

在过表达的pgpB或nudB存在下进一步调节MEP途径基因的表达水平可以显著影响通过所述途径的MEP通量和碳分布。法呢醇、戊烯醇或异戊烯醇产物的增加或减少可能与MEcPP水平负相关。

实验结果描述

PgpB的过表达可以使进行工程化以增加通过MEP途径的通量、但是没有安装下游萜类化合物产物途径的菌株中的法呢醇滴度变为三倍(图6)。对照菌株在不同的组成型表达水平下具有dxs、dxr、ispD、ispF、ispE、ispG、ispH和idi的额外拷贝，并且还具有过表达的YdbK(实施例4)。所述对照积累了适量的法呢醇，可能是由于过多的FPP积累造成的“溢出”，其在途径上进行反馈，并且与野生型相比，其生长明显较慢。当PgpB在此菌株中过表达时，过量的FPP更有效地转化为法呢醇(防止反馈控制)并且通量被有效地拉动通过MEP途径。

然而，过多的PgpB表达(‘+++’条件)似乎对到法呢醇的总通量产生了负面影响，平均而言观察到更低的滴度和更小的倍数变化。此结果的一些潜在原因包括：(1)来自PgpB的过度拉动使得MEP途径无法满足FPP需求，特别是来自所需的竞争产物的需求；或者(2)由于已知PgpB使体内多种靶标(包括必需的膜磷脂)去磷酸化，PgpB的高表达水平可能对细胞健康产生意想不到的负面影响。

在产生法呢醇的菌株中增加和调节IspG’和/或IspH的表达可以提高产物滴度(图7)。在此实施例中，IspG′酶是具有比野生型更高活性的工程化版本。对照菌株具有dxs、dxr、ispD、ispF、ispE、ispG、ispH和idi的额外拷贝，并且还具有YdbK和pgpB的额外拷贝。在增加的启动子强度(+，++，+++)下，将ispH和/或ispG′的额外拷贝整合到菌株中。

当IspH过表达时(图7，图A)，未观察到产物滴度的显著变化。虽然增加IspH的量将改善HMBPP向IPP的转化，但没有额外的IspG′来提供此额外的HMBPP。由IspG活性介导的MEcPP池成为途径中的限速步骤。然而，当除了IspH之外IspG′也过表达时(图7，图B)，我们发现法呢醇产物滴度显著增加。在这种情况下，由IspG′的额外拷贝实现的额外HMBPP通过增加的IspH水平快速转化为IPP，从而阻止HMBPP积累并在途径上进行反馈。

显然，IspG与IspH之间的平衡至关重要。数据显示IspG/H以操纵子形式表达，使得操纵子中的第二个基因具有比第一个更低的表达水平。当转换ispG′和ispH在操纵子中的基因顺序(即，ispH+ispG′相对于ispG′+ispH)并因此改变IspG′/IspH的表达比率时，我们在数据中看到相反的趋势。当比率相对于IspG′有利于IspH(B)时，增加的启动子强度导致产物滴度稳定增加。然而，当比率相对于IspH有利于IspG′(C)时，随着启动子强度增加，由此不平衡途径产生的过量HMBPP稳定地积累，导致产物改善越来越少和生长越慢。

虽然法呢醇产品滴度的增加可能伴随着MEcPP池大小的减小，但它取决于IspG与IspH的比率(图8)。如图7所示，产生法呢醇的菌株中IspG′和IspH的额外拷贝可以将法呢醇产物滴度提高2.5倍。当只有IspH上调而没有额外的IspG时(图8，图A)，滴度没有显著变化，MEcPP也没有变化。MEcPP确实适度降低了，可能是由于MEcPP被拉向下游，因为HMBPP通过额外的IspH酶更有效地转化为IPP。当表达的IspH比IspG′相对更多时(图8，图B)，随着启动子强度增加，法呢醇产物滴度增加。MEcPP相反地减少，因为它通过将通量分配到所需最终产物的平衡路径而被消耗。

然而，尽管相对于IspH有利于IspG′的非最佳比率可以改善MEcPP通过HMBPP向IPP的转化并提高法呢醇产物滴度，但最终失衡对于大肠杆菌菌株来说过于严重，并且产物改善消失，同时甚至更多的MEcPP积累并被困在MEP途径中间体碳池中。

实施例3：Idi表达调节

结论

Idi酶催化IPP向DMAPP的可逆异构化。由于每个所需的萜类化合物产物或不需要的MEP副产物(例如，UPP)使用一个DMAPP和不同数量的IPP，所以两种前体之间的比率可以对菌株生产力产生根本性影响。例如，1 FPP＝1 DMAPP+2 IPP，而1 UPP＝1 FPP+8 IPP(或1DMAPP+10 IPP)。因此，FPPS产生FPP的最佳比率是2∶1IPP：DMAPP，但UPP为10∶1。因此，通过改变idi表达来改变IPP：DMAPP的比率，相对于来自MEP途径的其他不需要的产物，将对所需萜类化合物的产生产生影响。

实验结果描述

在产生产物A或B的不同菌株中补充Idi。将细胞在96孔圆形培养板中在37℃下以280RPM在具有葡萄糖作为碳源的定制培养基中培养48小时。Idi在IPTG诱导型启动子下由pBAC表达。菌株1已经具有dxs、dxr、ispD、ispF、ispE、idi、FPPS和YdbK过表达，而菌株2和3此外还具有ispH和突变体形式的IspG过表达。相反，菌株4具有相同的酶过表达，但是是在非常不同的表达方案下。

虽然Idi过表达增加了不过表达ispGH的菌株中的产物滴度，但它降低了两个菌株中的滴度，从而指示由Idi控制的IPP与DMAPP之间的平衡可以根据下游途径的需要调高或调低(图9)。然而，菌株4在idi补充的情况下使滴度超过双倍。相同的基因在此菌株中过表达，但MEP基因表达之间的平衡是非常不同的。

实施例4：YdbK过表达

结论

预测YdbK充当丙酮酸：黄素氧还蛋白氧化还原酶和/或丙酮酸合酶。认为氧化还原酶将丙酮酸氧化成乙酰辅酶A，还原铁氧还蛋白，然后铁氧还蛋白可以向MEP途径供应电子，尤其是支持含有Fe-S簇的强烈上调的IspG和IspH酶。YdbK过表达已经显示出氢气(H₂)产生(Akhtar MK和Jones PR(2014)，Cofactor engineering for enhancing the flux ofmetabolic pathways.”Frontiers in Bioeng.and Biotech.)，但没有萜类化合物产生。

在这些菌株中，萜烯产物A的产物滴度加倍。额外的YdbK辅因子更好地支持Fe-S簇，并且它们的活性得到改善。产物滴度上升，并且当分析MEP代谢物时，我们看到MEcPP的转化率增加，类似于当对照菌株进一步添加ispH-ispG′操纵子的另一个拷贝时所观察到的。

另一方面，当没有相对于WT过表达IspG/H的产物B菌株用YdbK补充时，产物B滴度下降。当IspG/H在此菌株中增加时，YdbK补充确实提高了产物B的滴度，表明YdbK表达必须与IspG/H表达仔细平衡(进而必须仔细平衡H/G比率)。

另外，在YdbK过表达之上添加额外的携带电子或转移的辅因子，以观察我们是否可以进一步提高滴度。在一些实验中，来自巴斯德氏梭状芽胞杆菌的YdbK加fdx(铁氧还蛋白)在一定程度上提高了生产力。

实验结果描述

在组成型或诱导型启动子的控制下，将大肠杆菌YdbK基因的额外拷贝整合到染色体中或在质粒(特别是单拷贝pBAC或多拷贝质粒)上表达。另外，天然或非天然重组电子受体/供体的拷贝也可以用YdbK过表达，以最有效地利用和使用可用于生物合成的额外电子。

在增加的启动子强度下表达YdbK的额外拷贝可以提高萜类化合物的产生。在此实施例中，对照菌株产生萜类化合物产物A，并且在确定的组成型表达下具有MEP途径的基因dxs、dxr、ispD、ispE、ispF、ispG’、ispH和idi的额外拷贝。

在此菌株中，以操纵子形式添加ispH和ispG’的额外拷贝(使得H/G′比率有利于H)进一步增加产物A滴度，从而指示这些步骤是有限的(图10，图A)。增加这些含Fe-S簇的基因明显增加了MEcPP的转化率并降低了培养物中观察到的浓度(图10，图C)。

当YdbK在对照菌株中得到补充时，我们看到了对上调的分级响应，其中增加的表达预测增加的萜类化合物产生，达到一定程度-转向更强的表达导致+++YdbK菌株中产物A减少50％(图10，图B)。我们看到这些菌株发生了相同的MEcPP转化(图10，图D)，表明YdbK支持增强的IspG和/或IspH活性。值得注意的是，++相对于+++菌株的MEP代谢物谱没有显着变化，但产物滴度降低～3x，表明某种反馈机制已被激活。鉴于使用IspG和IspH的观察结果，这种反馈可能是由于HMBPP积累造成的。

随着YdbK表达增加，萜类产物滴度的提高需要足够的IspG和/或IspH表现出来(图11)。在此实施例中，对照A具有MEP途径的dxs、ispD、ispF和idi的额外拷贝，以及rhyB缺失和isc操纵子改变。对照B是对照A加上操纵子配置中的ispG’和ispH的额外整合拷贝(首先是G′，使得H/G比率有利于G)，而对照C是对照A加上操纵子配置中的ispH和ispG’的额外整合拷贝(首先是H，使得H/G比率有利于H)。

在图A中，我们看到在没有IspG/H上调的情况下补充YdbK使萜类化合物产物B滴度降低约25％。然而，当在具有ispG’-ispH或ispH-ispG’的额外拷贝的菌株中补充YdbK时，我们观察到萜类化合物滴度提高了18％和27％。显然，IspG和IspH必须相对于WT MEP途径过表达以观察到YdbK的益处。

此外，此数据再次强调了IspG与IspH之间的表达平衡对于MEP途径通量和萜类化合物生产力的重要性。在对照B相对于对照C中，相同的酶在相同的启动子强度下上调-差异在于操纵子中基因的顺序。最接近启动子的基因将比操纵子中的后续基因表达更强，使得H/G酶比率有利于对照B中的IspG或对照C中的IspH。鉴于此，我们观察到有利于H的比率比有利于G的比率更多的提高滴度。此外，YdbK所带来的提高在有利于H的菌株中得到了增强。因此，IspH与IspG之间的平衡对于菌株生产力非常重要。

除了YdbK之外表达fdx可以进一步提高萜类化合物滴度(图12)。在此实施例中，对照菌株产生萜类化合物产物A，并且在确定的组成型表达下具有MEP途径的基因dxs、dxr、ispD、ispE、ispF、ispG’、ispH和idi的额外拷贝。

如图10所示，在组成型表达下表达YdbK的额外拷贝增加了产物A的产生。尝试用另外三个电子受体/供体fldA、fldA和erpA(各自来自大肠杆菌)或来自巴斯德氏梭状芽胞杆菌(可以支持4Fe-4S簇，如在IspG和IspH中发现的，而不是2Fe-2S簇)的fdx进行补充。

除了YdbK之外，添加fldA(黄素氧还蛋白)或fldA和erpA(必需呼吸蛋白A)的另一个拷贝并没有进一步提高产物A滴度，但添加巴斯德氏梭状芽胞杆菌fdx确实提高了产物A的滴度。有趣的是，添加YdbK导致DOX/DOXP在下游完全转化为ME/MEP，但进一步添加fldA导致一些碳在MEP途径中向上游聚集为DOX/DOXP。将erpA添加到混合物中恢复分布。然而，进一步增强的ydbK+fdx菌株的MEP代谢物谱与ydbK+fldA最相似，表明最佳MEP通量将由MEP途径基因表达的协调平衡以及关键电子供体/受体的表达产生。

实施例5：降低丙酮酸向乙酰辅酶A的PDH转化增强了丙酮酸向乙酰辅酶A的YdbK转化

因为YdbK具有比fldA中的FMN氢醌/半醌对更低的氧化还原电势(表4中更大的绝对数)，所以增加丙酮酸转化为乙酰辅酶A对于YdbK的依赖可以改善工程化微生物菌株对萜烯和/或萜类化合物产物的产生。因此，YdbK是IspG和IspH的优选电子源(不是fpr/NADPH)。

酶(诸如IspG和IspH)中的铁硫簇(例如，Fe₄S₄)利用了宽范围的还原电势，例如-200至-800mV。Blachly，等人，Inorganic Chemistry，54(13)：6439-6461(2015)。

用于对电子载体YdbK和fpr充电的还原电势分别在表2和3中公开，并且用于将电子载体(例如，YdbK和fpr)释放到IspG和IspH的还原电势在表4中公开。参见McIver，等人，FEBS J，257(3)：577-85(1998)以及Lupton，等人，J Bacteriol，159：843-9(1984)。

通过使用一系列氧化还原染料在体外测试IspG的最佳活性。Xiao，等人，Biochemistry，48(44)：10483-10485(2009)。用外部进料的甲基紫精(ε⁰＝446mV)测试IspG的最佳活性。使用进料的甲基紫精(ε⁰＝446mV)的IspG活性比体外fpr-fldA系统高20x。

在甲基紫精(ε⁰＝446mV)的情况下IspH活性是50倍大，并且在外部进料的连二亚硫酸盐-MDQ(ε⁰＝490mV)的情况下IspH活性是100倍大。Xiao，等人，Journal of theAmerican Chemical Society，131(29)：9931-9933(2009)。

假设YdbK可获得但fpr不可获得的fldA半醌/氢醌对是IspG和IspH的优选体内还原系统。

为了增加微生物菌株对于PFOR(例如，YdbK)介导的丙酮酸向乙酰辅酶A的转化的依赖性，减少PDH介导的丙酮酸向乙酰辅酶A的转化。参见图15。

在大肠杆菌中存在三种已知的将丙酮酸(PYR)转化为乙酰辅酶A(AcCoA)的反应：pflB、PDH和PFOR或YdbK。

在三种酶中，PDH占优势并且是多酶复合物(aceE-aceF-lpd)，其由24个亚单位的丙酮酸脱氢酶(aceE)、24个亚单位的硫辛酸乙酰转移酶(aceF)和12个亚单位的二氢硫辛酸脱氢酶(lpd)组成。除了减少NAD+之外，PDH系统的净反应是丙酮酸转化为AcCoA和CO₂，这是中枢代谢的关键反应，因为它将产生丙酮酸的糖酵解I与TCA循环联系起来，AcCoA流入其中。在有氧生长期间，PDH是AcCoA的必需来源，以供给TCA循环，并且因此满足其形成的前体代谢物的细胞需求。PDH复合物中缺陷的突变体菌株需要外源乙酸盐来满足此需求。

pflB仅在厌氧条件下有效。因此，主要反应不是在微氧和有氧条件下将PYR转化为AcCoA。

在具有至少YdbK过表达的微生物菌株中，PDH(参见例如实施例4)不再是必需的，因为YdbK可以用于提供AcCoA。为了确保PYR至AcCoA步骤主要由YdbK催化，YdbK进而IspG和IspH供应电子，通过基因敲除或敲减(例如，通过突变)降低或消除PDH活性。

通过敲除aceE消除PDH

将四种不同的大肠杆菌菌株工程化以产生四种不同的萜类化合物产物(表示为产物B、产物C、产物D和产物E)，将所述菌株进一步工程化以敲除aceE(ΔaceE)，其消除PDH活性。对照菌株相同，但没有aceE敲除。

数据显示与对照相比，通过aceE缺失，四种萜类化合物产物中的每一种的滴度增加。参见图16A至图16D。倍数变化改善的差异很大程度上可以归因于用于下游途径的不同萜类化合物合成酶的生物化学特征(例如，Km和k_cat)。具体地，与产物D合酶(催化效率最高)相比具有较低合酶活性的酶具有略低的倍数变化改善，可能是由于FPP底物的积累，其可以积累并导致细胞毒性或MEP途径的上游组分的反馈调节。

数据也显示，与对照相比，细胞外肉汤中MEcPP浓度降低(图16E)，这证实碳通量已经通过IspG/H步骤推入产物中。参见图1。

通过突变的aceE敲减PDH

将三种大肠杆菌菌株工程化以产生三种不同的萜类化合物产物(显示为产物B、产物C和产物D)，这三种菌株被进一步工程化以表达突变的aceE(G267C；aceE突变体)，其导致PDH活性降低。对照菌株相同，但不具有突变的aceE。

与aceE敲除结果类似，数据显示与对照相比，表达突变的aceE的微生物菌株中三种萜类化合物产物中的每一种的滴度增加。参见图17A至图17C。

数据也显示，与对照相比，细胞外肉汤中MEcPP浓度降低(图17D)，这证实碳通量已经通过IspG/H步骤推入产物中。参见图1。

实施例6：非天然电子受体/供体增加YdbK依赖性类异戊二烯产生

当YdbK在大肠杆菌中过表达时，天然铁氧还蛋白(fdx)或黄素氧还蛋白(fldA)将电子穿梭至IspG和IspH(PYR/YdbK/fldA或fdx)。将经过工程化以产生产物B并过表达YdbK的大肠杆菌进一步工程化以过表达表5中的以下fdx同源物或表6中的fldA同源物中的一种。前七个fdx同源物是2[4Fe-4S]铁氧还蛋白，意味着它们含有两个4Fe-4S铁-硫簇，它们可以具有相同或不同的氧化还原电势。对于簇差异在于氧化还原电势的铁氧还蛋白，考虑到YdbK的氧化还原电势，我们预计在大多数情况下，簇1将是相关簇。剩余的fdx同源物是2Fe-2S铁氧还蛋白和高电势4Fe-4S铁氧还蛋白，两者都含有单个簇。对照大肠杆菌不表达任何fdx或fldA同源物。

数据显示，与空载体对照(emp)(例如，H.fdx、Cv.fdx、Cv.fdxC57A和Pa.fdx)相比，在大肠杆菌中过表达某些fdx或fldA同源物并且过表达YdbK增加萜类化合物产物滴度(在此实施例中为产物B)。图19A。

将工程化以产生产物D并过表达YdbK的大肠杆菌进一步工程化以过表达Cv.fdx。与先前的结果类似，数据显示，与对照相比，在工程化以产生萜类化合物产物(在此实施例中为产物D)并过表达YdbK的大肠杆菌中过表达Cv.fdx增加萜类化合物产物的滴度。图19B。另外，数据显示，与对照相比，细胞外肉汤中MEcPP浓度降低(图19C)，这证实碳通量已经通过IspG/H步骤推入产物中。参见图1。

实施例7：PFOR同源物、fpr同源物和/或fdx或fldA同源物的过表达或互补

将工程化以产生产物F的大肠杆菌进一步工程化以过表达至少一种PFOR同源物或fpr同源物以及任选地如表7中所示的fdx或fldA同源物。

数据显示，与空载体对照(CTRL)(例如，Da.pfor(非洲脱硫弧菌)(SEQ ID NO：31)、Sco.pfor(聚球藻属)；Ga.pfor(蜜蜂吉利氏菌)(SEQ ID NO：35)；Ec.ydbk(大肠杆菌)(SEQID NO：9)；以及Sco.fpr(聚球藻属)(SEQ ID NO：37)相比，一些工程化以表达PFOR和fpr同源物的细菌菌株增加萜类化合物产物(在此实施例中为产物F)滴度。参见图20。

数据还显示，与空载体对照(CTRL)(例如，Ec.ydhV/Ec.ydhY；大肠杆菌(分别为SEQID NO：33和SEQ ID NO：34)和Ec.ydbK/Cp.fdx；大肠杆菌(分别为SEQ ID NO：9和10))相比，一些工程化以过表达至少一种PFOR同源物和fdx的细菌菌株增加萜类化合物产物(产物F)滴度。参见图20。

另外，数据显示，与空载体对照(CTRL)(例如，Ec.fpr/Ec.fdx；大肠杆菌(分别为SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：21)和Ec.fpr/Ec.fldA；大肠杆菌(分别为SEQ ID NO：38和SEQID NO：27))相比，一些工程化以过表达至少一种fpr同源物和fdx或fldA的细菌菌株增加萜类化合物产物(产物F)滴度。参见图20。

序列

SEQ ID NO：1(大肠杆菌IspG)

SEQ ID NO：2(大肠杆菌IspH)

SEQ ID NO：3(大肠杆菌Dxs)

SEQ ID NO：4(大肠杆菌Dxr)

SEQ ID NO：5(大肠杆菌IspD)

SEQ ID NO：6(大肠杆菌IspE)

SEQ ID NO：7(大肠杆菌IspF)

SEQ ID NO：8(大肠杆菌Idi)

SEQ ID NO：9(大肠杆菌YdbK)

SEQ ID NO：10(巴斯德氏梭状芽胞杆菌fdx；Cp.fdx)

SEQ ID NO：11(大肠杆菌PgpB)

SEQ ID NO：12(大肠杆菌NudB)

SEQ ID NO：13(大肠杆菌Shine Dalgarno序列)

SEQ ID NO：14(海沼甲烷球菌GAPOR)

SEQ ID NO：15(嗜中温螺旋杆菌，Hm.fdx1)

SEQ ID NO：16(铜绿假单胞菌，Pa.fdx)

SEQ ID NO：17(酒色别样着色菌，Cv.fdx)

SEQ ID NO：18(Cv.fdx_C57A)

SEQ ID NO：19(大肠杆菌，Ec.yfhL)

SEQ ID NO：20(丙酮丁醇梭菌，Ca.fdx)

SEQ ID NO：21(大肠杆菌，Ec.fdx)

SEQ ID NO：22(沙氏外硫红螺菌，Ev2.fdx)

SEQ ID NO：23(恶臭假单胞菌，Pp1.fdx)

SEQ ID NO：24(恶臭假单胞菌，Pp2.fdx)

SEQ ID NO：25(棕色固氮菌fldA2；Av.fldA2)

SEQ ID NO：26(圆褐固氮菌fldA2；Ac.fldA2)

SEQ ID NO：27(大肠杆菌，Ec.fldA)

SEQ ID NO：28(枯草芽胞杆菌，Bs.fldA)

SEQ ID NO：29(藻属，Scy.pfor)

SEQ ID NO：30(居中克吕沃尔氏菌，Ki.pfor)

SEQ ID NO：31(非洲脱硫弧菌，Da.pfor)

SEQ ID NO：32(念珠藻属，Ns.pfor)

SEQ ID NO：33(大肠杆菌，Ec.ydhV)

SEQ ID NO：34(大肠杆菌，Ec.ydhY)

SEQ ID NO：35(蜜蜂吉利氏菌，Ga.pfor)

SEQ ID NO：36(念珠藻属，Ns.fpr)

SEQ ID NO：37(聚球藻属，Sco.fpr)

SEQ ID NO：38(大肠杆菌，Ec.fpr)

Claims

1.一种用于生产萜烯或萜类化合物产物的方法，所述方法包括：

提供一种细菌菌株，其通过上游甲基赤藓糖醇磷酸途径(MEP途径)产生异戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)，并通过下游合成途径将所述IPP和DMAPP转化为萜烯或萜类化合物产物；

其中IspG和IspH在所述细菌菌株中过表达，使得IspG活性和IspH活性平衡，以向1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸(HMBPP)中间体提供增加的碳通量，同时防止HMBPP以产生反馈并降低MEP途径通量和萜烯或萜类化合物生产力的量积累；所述菌株任选地包含一种或多种遗传修饰，所述遗传修饰增强通过所述MEP途径和/或到萜烯和萜类化合物产物的电子供应和/或转移，并且培养所述细菌菌株以产生所述萜烯或萜类化合物产物。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述细菌菌株为选自埃希氏菌属、芽孢杆菌属、棒状杆菌属、红细菌属、发酵单胞菌属、弧菌属和假单胞菌属的细菌。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述细菌菌株为选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、荚膜红细菌、球形红细菌、运动发酵单胞菌、需钠弧菌或恶臭假单胞菌的种属。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述细菌菌株为大肠杆菌。

5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述细菌菌株表达dxs、ispD、ispF和idi作为重组基因，所述重组基因任选地表达为操纵子。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述细菌菌株表达dxs、dxr、ispD、ispE、ispF和idi作为重组基因，所述重组基因任选地表达为1、2或3个操纵子。

7.如权利要求5或6所述的方法，其中所述MEP途径的所述重组基因由一种或多种质粒表达或整合到染色体中。

8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中通过将重组ispG和ispH基因引入所述细菌菌株中来过表达IspG和IspH。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述重组IspG和/或IspH酶包含一种或多种有益突变，或者是在用于培养的条件下具有改善的特性或活性的直系同源物。

10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中重组IspH的活性和/或表达高于所述重组IspG的活性和/或表达。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述重组IspH的表达高于所述重组IspG的表达。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述重组IspH和IspG由操纵子表达，IspH基因在所述操纵子中定位在所述IspG基因之前。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述操纵子在强启动子的控制下表达。

14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中通过修饰所述ispG和/或ispH重组基因的启动子强度、基因拷贝数和/或核糖体结合位点序列来平衡所述重组IspG和IspH酶的表达。

15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中HMBPP在细胞中不比在不包含所述重组ispG和ispH基因的亲本菌株中积累明显更多。

16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述重组ispG和ispH基因由质粒表达或整合到染色体中。

17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中调节重组idi基因的表达或活性以增加萜烯或萜类化合物产生。

18.如权利要求17所述的方法，其中通过修饰启动子强度、基因拷贝数、操纵子中的位置或核糖体结合位点，调节所述重组idi基因的表达。

19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中HMBPP积累不超过10mg/g干细胞重量。

20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述细菌菌株包含一种或多种遗传修饰，所述遗传修饰增强通过所述MEP途径和/或到萜烯和萜类化合物产物的电子供应和/或转移，并且任选地氧化丙酮酸和/或还原铁氧还蛋白。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述细菌菌株含有氧化还原酶的过表达。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述氧化还原酶为丙酮酸：黄素氧还蛋白氧化还原酶(PFOR)。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述PFOR为YdbK。

24.如权利要求21所述的方法，其中所述细菌菌株包含重组YdbK基因。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述重组YdbK基因整合到染色体中或由质粒表达，所述表达任选地在弱或中等强度启动子的控制下。

26.如权利要求21至25中任一项所述的方法，其中所述菌株包含一种或多种用于产生萜类化合物的P450酶。

27.如权利要求21至26中任一项所述的方法，所述方法还包括黄素氧还蛋白、黄素氧还蛋白还原酶、铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶中的一种或多种的过表达。

28.如权利要求1至27中任一项所述的方法，其中IspG和IspH的表达或活性在Dxr、Dxs、IspD、IspE和IspF的表达或活性方面是平衡的，以减少培养物中的MEcPP代谢物。

29.如权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述细菌菌株包含PgpB和/或NudB的过表达。

30.如权利要求29所述的方法，其中所述细菌菌株表达至少一种重组pgpB和/或nudB基因。

31.如权利要求29所述的方法，其中任选地通过改变启动子强度、基因拷贝数、操纵子中的位置和/或核糖体结合位点，调节所述重组PgpB和/或NudB的表达以提供更高的萜烯或萜类化合物产物滴度。

32.如权利要求31所述的方法，其中所述重组PgpB和/或NudB在弱或中等强度启动子的控制下表达。

33.如权利要求30至32中任一项所述的方法，其中所述重组pgpB或nudB整合到染色体中或由质粒表达。

34.如权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述细菌菌株具有一种或多种另外的修饰以增加辅因子可用性或周转，所述一种或多种另外的修饰任选地选自甘油醛-3-磷酸铁氧还蛋白氧化还原酶(GAPOR)的重组表达；ydhV和/或ydhY的过表达；gshA的下调、失活或缺失；以及CHAC1和/或CHAC2的重组表达。

35.一种用于从细菌细胞中的MEP途径排出过量碳通量的方法，所述方法包括：

提供一种细菌菌株，其通过上游甲基赤藓糖醇磷酸途径(MEP途径)产生异戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)，并任选地通过下游合成途径将所述IPP和DMAPP转化为萜烯或萜类化合物产物；

其中所述细菌菌株过表达一种或多种MEP途径基因并过表达PgpB和/或NudB，

培养所述细菌菌株以产生MEP碳。

36.如权利要求35所述的方法，其中所述细菌菌株为选自埃希氏菌属、芽孢杆菌属、棒状杆菌属、红细菌属、发酵单胞菌属、弧菌属和假单胞菌属的细菌。

37.如权利要求35所述的方法，其中所述细菌菌株为选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、荚膜红细菌、球形红细菌、运动发酵单胞菌、需钠弧菌或恶臭假单胞菌的种属。

38.如权利要求37所述的方法，其中所述细菌菌株为大肠杆菌。

39.如权利要求35至38中任一项所述的方法，其中所述细菌菌株表达至少一种重组PgpB和/或NudB基因。

40.如权利要求39所述的方法，其中任选地通过改变启动子强度、基因拷贝数、操纵子中的位置和/或核糖体结合位点，调节所述重组PgpB和/或NudB的表达以提供更高的萜烯或萜类化合物产物滴度。

41.如权利要求40所述的方法，其中所述重组PgpB和/或NudB在弱或中等强度启动子的控制下表达。

42.如权利要求39至41中任一项所述的方法，其中所述重组PgpB或NudB整合到染色体中或由质粒表达。

43.如权利要求35至42中任一项所述的方法，其中所述细菌菌株过表达IspG和IspH，使得IspG活性和IspH活性平衡，以提供增加的到HMBPP中间体的碳通量，同时防止HMBPP以明显降低细胞生长、活力、MEP通量或产物滴度的量积累。

44.如权利要求43所述的方法，其中HMBPP积累不超过10mg/g干细胞重量。

45.如权利要求35至44中任一项所述的方法，其中所述细菌菌株表达dxs、ispD、ispF和idi作为重组基因，所述重组基因任选地表达为操纵子。

46.如权利要求45所述的方法，其中所述细菌菌株表达dxs、dxr、ispD、ispF和idi作为重组基因，所述重组基因任选地表达为1、2或3个操纵子。

47.如权利要求45或46所述的方法，其中所述MEP途径的所述重组基因由一种或多种质粒表达或整合到染色体中。

48.如权利要求43至47中任一项所述的方法，其中通过将至少一种重组IspG和IspH基因引入所述细菌菌株中来过表达IspG和IspH。

49.如权利要求48所述的方法，其中重组IspH的活性和/或表达高于所述重组IspG的活性和/或表达。

50.如权利要求49所述的方法，其中所述重组IspH和IspG表达为操纵子，IspH在所述操纵子中定位在IspG之前，其中所述操纵子任选地在强启动子的控制下表达。

51.如权利要求43至50中任一项所述的方法，其中所述重组IspG和IspH基因由质粒表达或整合到染色体中。

52.如权利要求35至51中任一项所述的方法，其中调节重组idi基因的表达或活性以增加萜烯或萜类化合物产生。

53.如权利要求42至52中任一项所述的方法，其中所述细菌菌株含有氧化还原酶的过表达。

54.如权利要求53所述的方法，其中所述氧化还原酶为丙酮酸：黄素氧还蛋白氧化还原酶(PFOR)。

55.如权利要求54所述的方法，其中所述PFOR为YdbK。

56.如权利要求55所述的方法，其中重组YdbK基因整合到染色体中或由质粒表达。

57.如权利要求53至56中任一项所述的方法，其中所述菌株包含一种或多种用于产生萜类化合物的P450酶。

58.如权利要求53至57中任一项所述的方法，所述方法还包括黄素氧还蛋白、黄素氧还蛋白还原酶、铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶中的一种或多种的过表达。

59.如权利要求35至58中任一项所述的方法，其中所述细菌菌株具有一种或多种另外的修饰以增加辅因子可用性或周转，所述一种或多种另外的修饰任选地选自甘油醛-3-磷酸铁氧还蛋白氧化还原酶(GAPOR)的重组表达；ydhV和/或ydhY的过表达；gshA的下调、失活或缺失；以及CHAC1和/或CHAC2的重组表达。

60.如权利要求1至59中任一项所述的方法，其中所述细菌菌株具有减少或消除的PDH介导的丙酮酸向乙酰辅酶A的转化。

61.如权利要求60所述的方法，其中所述细菌菌株表达突变体aceE，其中所述突变为G267C。

62.如权利要求60所述的方法，其中所述细菌菌株具有aceE的缺失或失活。

63.如权利要求1至62中任一项所述的方法，其中所述细菌菌株过表达一种或多种非天然fdx和/或fldA同源物。

64.如权利要求63所述的方法，其中所述fdx同源物选自Hm.fdx1(嗜中温螺旋杆菌)、Pa.fdx(铜绿假单胞菌)、Cv.fdx(酒色别样着色菌)、Ca.fdx(丙酮丁醇梭菌)、Cp.fdx(巴斯德氏梭状芽胞杆菌)、Ev2.fdx(沙氏外硫红螺菌)、Pp1.fdx(恶臭假单胞菌)和Pp2.fdx(恶臭假单胞菌)或前述物质中的任一种的衍生物。

65.如权利要求63所述的方法，其中所述fldA同源物选自Ac.fldA2(圆褐固氮菌)、Av.fldA2(棕色固氮菌)和Bs.fldA(枯草芽孢杆菌)或其衍生物。

66.如权利要求1至65中任一项所述的方法，其中所述萜烯或萜类化合物产物包括至少一种选自以下的化合物：法呢烯、紫穗槐二烯、青蒿酸、青蒿素、红没药醇、红没药烯、α-甜橙醛、β-侧柏酮、樟脑、葛缕醇、香芹酮、桉叶油醇、柠檬醛、香茅醛、荜澄茄醇、香叶醇、柠烯、薄荷醇、薄荷酮、香叶烯、诺卡酮、诺卡醇、广藿香、胡椒酮、玫瑰醚、桧烯、甜菊醇、甜菊醣苷(包括瑞鲍迪甙D或瑞鲍迪甙M)、紫杉烯、百里酚以及瓦伦烯。

67.如权利要求1至66中任一项所述的方法，其中所述菌株包含萜烯合酶，所述萜合酶具有一种或多种修饰以改善酶动力学、萜烯或萜类化合物产物分布、稳定性和温度耐受性中的一种或多种。

68.如权利要求1至67中任一项所述的方法，其中所述菌株用C1、C2、C3、C4、C5或C6碳源培养。

69.如权利要求68所述的方法，其中所述碳源为葡萄糖、蔗糖或甘油。

70.如权利要求68或69所述的方法，其中所述细菌菌株在22℃与37℃之间的温度下培养。

71.如权利要求1至70中任一项所述的方法，其中培养步骤是补料分批方法，所述方法包括产生细菌生物质的第一阶段，然后是萜烯或萜类化合物生产阶段。

72.如权利要求71所述的方法，其中所述培养物为至少约100L。

73.如权利要求72所述的方法，其中所述培养物为约300L至约1,000,000L。

74.如权利要求68至73中任一项所述的方法，其中所述培养物维持在有氧条件下。

75.如权利要求74所述的方法，其中所述培养物维持在微氧条件下。

76.如权利要求74或75所述的方法，其中所述生物质生产阶段在有氧条件下发生，然后在约10至约20小时后降低氧气水平。

77.如权利要求68至76中任一项所述的方法，其中所述生产阶段包括供给氮源，所述氮源任选地包含氢氧化铵。

78.如权利要求68至77中任一项所述的方法，其中所述生产阶段包括供给碳源，所述碳源任选地包含葡萄糖、蔗糖和/或甘油。

79.如权利要求76至78中任一项所述的方法，其中当消耗了预定量的分批培养基时，启动所述氮和碳供给。

80.如权利要求78或79所述的方法，其中所述氮进料速率为约8L/小时至约20L/小时。

81.如权利要求68至80中任一项所述的方法，所述方法还包括监测或测试所述培养物中吲哚的积累。

82.如权利要求68至81中任一项所述的方法，所述方法还包括监测或测试所述培养物中MEcPP的积累。

83.如权利要求68至82中任一项所述的方法，所述方法还包括监测或测试所述细胞中HMBPP的水平。

84.如权利要求1至83中任一项所述的方法，所述方法还包括回收所述萜烯或萜类化合物产物。

85.如权利要求84所述的方法，其中所述产物是挥发性萜烯或萜类化合物产物。

86.如权利要求85所述的方法，其中从与所述培养物机械分离的有机相或疏水相中回收所述萜烯或萜类化合物产物。

87.如权利要求86所述的方法，其中从液相和/或固相中收获所述萜烯或萜类化合物产物。

88.如权利要求85至87中任一项所述的方法，其中通过蒸馏纯化所述产物，所述蒸馏任选地是简单蒸馏、蒸汽蒸馏、分馏、擦拭膜蒸馏或连续蒸馏。

89.如权利要求85至88中任一项所述的方法，其中通过依序提取和纯化来纯化所述产物。

90.如权利要求85至89中任一项所述的方法，其中通过基于色谱法的分离和回收来纯化所述产物，所述基于色谱法的分离和回收任选地是超临界流体色谱法。

91.如权利要求84所述的方法，其中所述产物是非挥发性萜烯或萜类化合物产物。

92.如权利要求91所述的方法，其中所述产物是从培养基中回收的细胞外产物。

93.如权利要求91所述的方法，其中所述产物是从收获的细胞材料中回收的细胞内产物。

94.如权利要求91至93中任一项所述的方法，其中所述产物可溶性较差并通过过滤回收，任选地用溶剂萃取。

95.如权利要求94所述的方法，其中所述溶剂为乙醇。

96.如权利要求91至95中任一项所述的方法，其中通过基于色谱法的分离回收所述产物，所述基于色谱法的分离任选地是液相色谱法。

97.如权利要求96所述的方法，其中通过过滤回收所述产物。

98.如权利要求89至96中任一项所述的方法，其中通过依序提取和纯化来回收所述产物。

99.如权利要求92或93所述的方法，其中所述产物从溶液中结晶出来。

100.一种用于制备工业或消费产品的方法，所述方法包括将根据权利要求1至100中任一项所述的方法制备的萜烯或萜类化合物掺入所述工业或消费产品中。

101.如权利要求100所述的方法，其中所述工业或消费产品是风味剂产品、芳香剂产品、甜味剂、化妆品、清洁产品、洗涤剂或肥皂或害虫防治产品。

102.如权利要求100所述的方法，其中所述工业或消费产品是食品、饮料、纹理剂、药品、烟草产品、营养品、口腔卫生产品或化妆品。

103.如权利要求1至102中任一项所述的方法，其中所述细菌菌株或细胞过表达香叶基二磷酸合酶(GPPS)、法呢基二磷酸合酶(FPPS)和香叶基香叶基二磷酸合酶(GGPPS)中的一种或多种。

104.一种具有一种或多种遗传修饰的细菌菌株，所述一种或多种遗传修饰增加由异戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)前体进行的产物产生；所述细菌菌株通过MEP途径产生异戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)，并且所述MEP途径包含一种或多种过表达基因；所述菌株通过下游合成途径将所述IPP和DMAPP转化为萜烯或萜类化合物产物；其中所述遗传修饰包括：

(a)重组或修饰的IspG和IspH酶，所述IspG和IspH酶具有平衡的表达或活性以防止HMBPP中间体的积累，

(b)编码增强通过所述MEP途径和/或到萜烯或萜类化合物产物的电子供应和/或转移的酶的重组或修饰基因，所述重组或修饰基因任选地是YdbK基因以及任选地非天然fdx和/或fldA同源物的过表达，

105.如权利要求104所述的细菌菌株，其中所述细菌菌株为选自埃希氏菌属、芽孢杆菌属、棒状杆菌属、红细菌属、发酵单胞菌属、弧菌属和假单胞菌属的细菌。

106.如权利要求105所述的细菌菌株，其中所述细菌菌株为选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、荚膜红细菌、球形红细菌、运动发酵单胞菌、需钠弧菌或恶臭假单胞菌的种属。

107.如权利要求106所述的细菌菌株，其中所述细菌菌株为大肠杆菌。

108.如权利要求104至107中任一项所述的细菌菌株，其中所述细菌菌株表达dxs、ispD、ispF和idi作为重组基因，所述重组基因任选地表达为操纵子。

109.如权利要求108所述的细菌菌株，其中所述细菌菌株表达dxs、dxr、ispD、ispE、ispF和idi作为重组基因，所述重组基因任选地表达为1、2或3个操纵子。

110.如权利要求108或109所述的细菌菌株，其中所述MEP途径的所述重组基因由一种或多种质粒表达或整合到染色体中。

111.如权利要求104至110中任一项所述的细菌菌株，其中HMBPP积累不超过10mg/g干细胞重量。

112.如权利要求104至111中任一项所述的细菌菌株，其中所述重组ispG和ispH基因包含一个或多个有益突变，或编码具有改善的特性或活性的IspG或IspH直系同源物。

113.如权利要求104至112中任一项所述的细菌菌株，其中重组IspH的表达高于所述重组IspG的表达。

114.如权利要求113所述的细菌菌株，其中所述重组ispH和ispG表达为操纵子，ispH在所述操纵子中定位在ispG之前。

115.如权利要求114所述的细菌菌株，其中所述操纵子在强启动子的控制下表达。

116.如权利要求112至115中任一项所述的细菌菌株，其中所述重组ispG和ispH基因由质粒表达或整合到染色体中。

117.如权利要求104至116中任一项所述的细菌菌株，其中任选地通过修饰启动子强度、基因拷贝数、操纵子中的位置或核糖体结合位点，调节重组idi基因的表达或活性以增加萜烯或萜类化合物产生。

118.如权利要求104至117中任一项所述的细菌菌株，其中所述细菌菌株含有氧化还原酶的过表达。

119.如权利要求118所述的细菌菌株，其中所述氧化还原酶为丙酮酸：黄素氧还蛋白氧化还原酶(PFOR)。

120.如权利要求119所述的细菌菌株，其中所述PFOR为YdbK。

121.如权利要求104至120中任一项所述的细菌菌株，其中所述菌株含有氧化丙酮酸和/或还原铁氧还蛋白的酶，其任选地为重组YdbK基因，并且任选地整合到染色体中或由质粒表达。

122.如权利要求121所述的细菌菌株，其中所述菌株包含一种或多种用于产生萜类化合物的P450酶。

123.如权利要求121或122所述的细菌菌株，所述细菌菌株还包括黄素氧还蛋白、黄素氧还蛋白还原酶、铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶中的一种或多种的过表达。

124.如权利要求104至123中任一项所述的细菌菌株，其中任选地通过改变启动子强度、基因拷贝数、操纵子中的位置和/或核糖体结合位点，调节所述重组pgpB和/或nudB的表达以提供更高的萜烯或萜类化合物产物滴度。

125.如权利要求104至124中任一项所述的细菌菌株，其中所述菌株具有一种或多种另外的选自以下的修饰：甘油醛-3-磷酸铁氧还蛋白氧化还原酶(GAPOR)的重组表达；ydhV和/或ydhY的过表达；gshA的下调、失活或缺失；以及CHAC1和/或CHAC2的重组表达。

126.如权利要求125所述的细菌菌株，其中所述重组pgpB和/或nudB在弱或中等强度启动子的控制下表达。

127.如权利要求126所述的细菌菌株，其中所述重组pgpB或nudB整合到染色体中或由质粒表达。

128.如权利要求104至127中任一项所述的细菌菌株，其中所述细菌菌株具有减少或消除的PDH介导的丙酮酸向乙酰辅酶A的转化。

129.如权利要求128所述的细菌菌株，其中所述细菌菌株表达突变体aceE，其中所述突变为G267C。

130.如权利要求129所述的细菌菌株，其中所述细菌菌株具有aceE的缺失或失活。

131.如权利要求104至130中任一项所述的细菌菌株，其中所述细菌菌株过表达一种或多种非天然fdx和/或fldA同源物。

132.如权利要求131所述的细菌菌株，其中所述非天然fdx同源物选自Hm.fdx1(嗜中温螺旋杆菌)、Pa.fdx(铜绿假单胞菌)、Cv.fdx(酒色别样着色菌)、Ca.fdx(丙酮丁醇梭菌)、Cp.fdx(巴斯德氏梭状芽胞杆菌)、和Ev2.fdx(沙氏外硫红螺菌)、Pp1.fdx(恶臭假单胞菌)和Pp2.fdx(恶臭假单胞菌)或前述物质中的任一种的衍生物。

133.如权利要求132所述的细菌菌株，其中所述fldA同源物选自Ac.fldA2(圆褐固氮菌)、Av.fldA2(棕色固氮菌)和Bs.fldA(枯草芽孢杆菌)或其衍生物。

134.如权利要求104至133中任一项所述的细菌菌株，其中所述萜烯或萜类化合物产物包括至少一种选自以下的化合物：法呢烯、紫穗槐二烯、青蒿酸、青蒿素、红没药醇、红没药烯、α-甜橙醛、β-侧柏酮、樟脑、葛缕醇、香芹酮、桉叶油醇、柠檬醛、香茅醛、荜澄茄醇、香叶醇、柠烯、薄荷醇、薄荷酮、香叶烯、诺卡酮、诺卡醇、广藿香、胡椒酮、玫瑰醚、桧烯、甜菊醇、甜菊醣苷(包括瑞鲍迪甙D或瑞鲍迪甙M)、紫杉烯、百里酚以及瓦伦烯。

135.如权利要求134所述的细菌菌株，其中所述菌株包含萜烯合酶，所述萜合酶具有一种或多种修饰以改善酶动力学、萜烯或萜类化合物产物分布、稳定性和温度耐受性中的一种或多种。

136.如权利要求104至135中任一项所述的细菌菌株，其中所述细菌菌株过表达香叶基二磷酸合酶(GPPS)、法呢基二磷酸合酶(FPPS)和香叶基香叶基二磷酸合酶(GGPPS)中的一种或多种。