UA127758C2

UA127758C2 - Метаболічний інжиніринг мікробного продукування терпеноїдного продукту

Info

Publication number: UA127758C2
Application number: UAA201909447A
Authority: UA
Inventors: Аджікумар Парайіл Кумаран; Аджикумар Парайил Кумаран; Райан Лім; Райан Лим; Джейсон Дональд; Сянь-Чун Тсен; Крістін Сантос; Кристин Сантос; Райан Філіпп; Райан Филипп
Original assignee: Манус Байо, Інк.; Манус Байо, Инк.
Priority date: 2017-01-26
Filing date: 2018-01-26
Publication date: 2023-12-27
Also published as: KR102656420B1; CA3051472A1; KR20190113851A; BR112019015454A2; JP2020505051A; WO2018140778A1; US20180216137A1; US20200002733A1; CA3051472C; CN110869500A; US20210002672A1; US20220251607A1; DK3574095T5; MX2019008882A; US11352648B2; DK3574095T3; JP7330888B2; US10774346B2; CN110869500B; AU2018211953A1

Abstract

Винахід належить до способу та бактеріальних штамів для отримання терпенових і терпеноїдних продуктів, бактеріальних штамів з покращеним проходженням вуглецю через шлях MEP та до низхідного рекомбінантного шляху синтезу.

Description

(57) Реферат:

Винахід належить до способу та бактеріальних штамів для отримання терпенових і терпеноїдних продуктів, бактеріальних штамів з покращеним проходженням вуглецю через шлях МЕР та до низхідного рекомбінантного шляху синтезу.

Тека у з Позакттинні денне еееннетнненненеек нене чек тент еенен ке еетенян - Внутвішньоскатннні. Зоя еп р СО нов У В вн оо во ВИК Ме НМ

Мини и НН НИ пБпучи ниви нн І

Бо НИЖНІ о нд ен нн и вн

Кн В Ек ти КОЕ ЕК еди Но К ИМ олюКюнод о АК о о он дв о В во в Нв от Ж ою отв КК ян з ши сн нн нм нн нм но пе и нс п о ев нн п в п в п п ко в в В В БВ З ти ТП

БеосеоН ов в ою во о о В и ДВ Ве фол кто в п во св є вв

КОЛЕ НВ о Ко ВВЕ ВИК ЕК о ВИМИ ЗО МВ СО в ЕЕ о пф В о кн в Ж а В В ОС о НК

Б в в в в Кв ди кв ВК вк ко вс ко в в и ВО ЕК Кв хох со 5 ВНИВВВВвввм с: подо КЕКВ ЕЕ пн нн нн ее ВН нн он о ро в ЯКЕ о В ВВ ВЕ КО ер ВВ тя фо ово КВК В БВ Я КЕ Кек Яр БЕЗЕ М ВЕ Яд у ке вові схе мин ов ях Кз т, що п Бе Бе я щї вав я ЕЕ К с дя о ще т ШІ що СО. до Пл СЕ 4 СВЙ Ж - ЕІ о ШоЯ, й во ІК МЕ ше т ої МОВ шим п фесту Ко В вв и в ВВ оо ВН рив КК

Ми М пов и в Кв Ко а е Пр В в ов я

Кот яв В В НКИ о ник пи ин нн нн о пс нн пон п роко і КО в и ЕК и В ВК вк

Бо ї фо ша о нн в и НК а НН о Ко вх ато те о ва В ЕК Кв ВМ а ший В су п -к Пт нею шо шо -щ- ем дні я : шій, п Е тя тин ши с подій вих ще МК Грежкух Ехукухка Яка Телене Те кеяди сріг. 1

Ця заявка заявляє пріоритет попередньої заявки США Мо 62/450,707, поданої 26 січня 2017 року, зміст якої у цьому документі включено як посилання в повному обсязі.

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

Дана заявка містить перелік послідовностей, який був поданий у форматі АЗСІЇ через ЕЕ5-

Умеь і таким чином включений як посилання в повному обсязі. Вказана копія А5СІЇ, створена 26 січня 2018 року, має назву МАМ-009РС 5Т25 і має розмір 125,103 байт.

ПОПЕРЕДНІЙ РІВЕНЬ ТЕХНІКИ

Харчова промисловість та виробництво напоїв, а також інші галузі промисловості, такі як парфумерна, косметична та медична, зазвичай використовують терпенові та/або терпеноїдні продукти, у тому числі для використання як ароматизаторів та ароматів. Проте, такі фактори, як: (ї) наявність та висока ціна рослинної сировини; (ії) відносно низький вміст терпенів у рослині; і (ії) затяжні та неефективні процеси екстракції для отримання достатньої кількості терпенової продукції в промислових масштабах, разом стимулювали дослідження біосинтезу терпенів за допомогою незалежних від рослин систем. Отже, зусилля були витрачені на розробку технологій для конструювання мікроорганізмів для перетворення поновлюваних ресурсів, таких як глюкоза, у терпеноїдні продукти. У порівнянні з традиційними методами мікроорганізми мають перевагу швидкого росту без необхідності використання грунту для підтримки розвитку.

Існують два основні біосинтетичні шляхи для основних ізопреноїдних попередників - ізопентенілдифосфату (ІРР) та диметилалілдифосфату (ОМАРР), шлях мевалонату (ММА) та шлях метилеритритолфосфату (МЕР). Шлях ММА виявлений у більшості еукаріот, архей і деяких еубактерій. Шлях МЕР виявлений в еубактерій, хлоропластах рослин, ціанобактерій, водоростей і паразитів найпростіших. Е. сої та інші грамнегативні бактерії використовують шлях

МЕР для синтезу метаболічних попередників ІРР і ОМАРР. Хоча шлях МЕР забезпечує теоретично кращий стехіометричний вихід у порівнянні зі шляхом ММА, шлях МЕР в Е. сої та інших бактеріях має безліч внутрішніх механізмів регуляції, які контролюють та/або обмежують проходження вуглецю через шлях. Див. 2йпао еї аї., Меїйпуїегуїпгйо! Рпозрпаге Раїпйулау ої

Іворгепоїй Віозупіпевзі5х, Аппи Нем. Віоспет. 2013; 82:497-530; Ад|Китаг! РК, еї аї., Ізоргепоїй рашШшучлау оріітігайоп ог Тахо! ргесигзог омегргодисійп іп ЕвзсПетгісніа соїї. 5сівєпсе 2010; 330-70- 74.

Зо Мікробні штами і способи поліпшення проходження вуглецю через шлях МЕР і через рекомбінантні наступні шляхи синтезу терпенів і терпеноїдів необхідні для промислового виробництва терпенів і терпеноїдів у бактеріальних системах.

КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

У різних аспектах винахід належить до способів і бактеріальних штамів для отримання терпенових і терпеноїдних продуктів. У певних аспектах винахід забезпечує бактеріальні штами з поліпшеним надходженням вуглецю до шляху МЕР і до наступного рекомбінантному шляху синтезу, щоб тим самим збільшити продукування терпенів та/або терпеноїдів шляхом ферментації з недорогими джерелами вуглецю (наприклад, глюкозою).

У деяких аспектах винахід належить до бактеріальних штамів, які надекспресують і5ро і

ІрН, щоб забезпечити збільшення надходження вуглецю до проміжної сполуки 1-гідрокси-2- метил-2-(Е)-бутеніл-4-дифосфату (НМВРР), але зі збалансованою експресією для запобігання накопичення НМВРР у кількості, яка знижує ріст або життєздатність клітин, або в кількості, яка пригнічує проходження шляху МЕР та/або продукування терпеноїдів. Збільшення експресії як

Ібро, так і ІєрН значно підвишує титри терпенових і терпеноїдних продуктів. | навпаки, надекспресія одного Ізро призводить до дефектів росту, у той час як надекспресія одного Ізрн не викликає значного впливу на титр продуктів. Метаболіт НМВРР може діяти як регулятор або інгібітор шляху МЕР і може бути токсичним для бактеріальних клітин на певних рівнях.

Наприклад, у деяких варіантах здійснення винаходу НМВРР не накопичується більше, ніж приблизно 10 мг/г сухої маси клітин (ОСМ/), або в деяких варіантах здійснення винаходу не

БО накопичується в кількостях більших, ніж приблизно 5 мг/г ОСМУ або в кількостях більших, ніж приблизно 2 мг/г ЮСМУ. Таким чином, збалансована надекспресія Ієро і ІєрН (наприклад, сприяюча більшій активності ІгрН) важлива для направлення вуглецю МЕР до наступного шляху через НМВРР до ІРР, одночасно запобігаючи його дисбалансу й накопиченню.

У різних варіантах здійснення винаходу бактеріальний штам надекспресує збалансований шлях МЕР для переміщення вуглецю МЕР до проміжної сполуки МЕСРР, субстрату для Ізро, і включає в себе одну або більше генетичних модифікацій для підтримки активності ферментів

Івро і І5рН, які є ферментами з кластером Ее-сірка. Типові модифікації включають ті, які збільшують надходження і перенесення електронів шляхом МЕР та/або до терпенових або терпеноїдних продуктів. Вони включають рекомбінантну експресію одного або декількох бо оксидоредуктазних ферментів, включаючи оксидоредуктази, які окиснюють піруват та/або призводять до відновлення фередоксину (який постачає електрони до шляху МЕР). Типовою оксидоредуктазою є Уарк Е. соїї й її ортологи та похідні.

У різних варіантах здійснення винаходу мікробний штам включає в себе надекспресію або комплементацію одним або декількома з флаводоксину (ПаА), флаводоксинредуктази, фередоксину (ах) і фередоксинредуктази.

В інших аспектах винахід пропонує бактеріальні штами, які надекспресують РорВ або миав, які дефосфорилюють ЕРР до фарнезолу, а ІРР і ОМАРР - до ізопренолу і пренолу, відповідно. У цих варіантах здійснення винаходу клітина містить додатковий пул продуктів на шляху МЕР, тим самим відводячи надлишковий вуглець МЕР з цього шляху за межі клітини і, таким чином, уникаючи внутрішніх механізмів інгібування зворотного зв'язку. Крім того, оскільки ці продукти накопичуються поза клітиною, їх можна використовувати для відстеження проходження вуглецю через шлях МЕР, навіть без встановленого наступного шляху терпеноїдного синтезу. Таким чином, штами бактерій із надекспресією РорВ і/або Миав є зручними інструментами для балансування експресії генів шляху МЕР. Додатково чи альтернативно, у деяких варіантах здійснення винаходу бактеріальний штам надекспресує одну або декілька сильних синтаз із достатнім продуктовим пулом на шляху МЕР, щоб уникнути внутрішніх механізмів інгібування зворотного зв'язку. Як приклад, у деяких варіантах здійснення винаходу синтаза є фарнезенсинтазою Апйетівіа аппиа.

Для продукування терпенового або терпеноїдного продукту бактеріальна клітина буде містити рекомбінантний низхідний шлях, який продукує терпеноїд із попередників ІРР і ОМАРР.

У деяких варіантах здійснення винаходу бактеріальна клітина продукує одну або декілька терпеноїдних сполук, таких як монотерпеноїди, сесквітерпеноїди, тритерпеноїди й дитерпеноїди, серед інших. Такі терпеноїдні сполуки знаходять застосування в парфумерії (наприклад, пачулол), в ароматичній промисловості (наприклад, нооткатон), як підсолоджувачі (наприклад, стевіолглікозиди), як барвники або як терапевтичні агенти (наприклад, таксол).

Вилучений терпен або терпеноїд можуть бути включені до продукту (наприклад, споживчий або промисловий продукт). Наприклад, продукт може бути ароматичним продуктом, ароматизувальним продуктом, підсолоджувачем, косметичним засобом, засобом для чищення, миючим засобом або милом, або продуктом для боротьби зі шкідниками. Більш високі виходи,

Зо отримувані у варіантах здійснення винаходу, можуть забезпечувати істотні переваги за вартістю, а також стійкість і контроль якості терпенового або терпеноїдного інгредієнта.

Інші аспекти й варіанти здійснення винаходу будуть очевидні з наступного докладного опису винаходу.

КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ ЗОБРАЖЕНЬ

Фі. 1 являє собою схему продукування терпеноїдів шляхом МЕР. Репрезентована бактеріальна клітина, яка засвоює глюкозу як джерело вуглецю. Глюкоза перетворюється на біомасу через цикл ТКК або проходить шляхом МЕР до бажаних терпеноїдних продуктів.

Глюкоза надходить в клітину й перетворюється на піруват (РУК) з гліцеральдегід-3-фосфатом як проміжною сполукою (АР). РУК і САР об'єднуються для створення ЮОХР, який перетворюється на МЕР і залучається шляхом до ЕРР (проходить через МЕСРР). ОХ і МЕ є дефосфорильованими продуктами СОХР і МЕР, відповідно. ОХ, МЕ і МЕСРР знаходять за межами клітини. Чим більше надходження вимушено потрапляє до шляху МЕР, тим більше цих продуктів виявляється поза клітиною. Ці побічні продукти можуть використовуватися як маркери вузьких місць на шляху МЕР і для визначення мішеней для конструювання. При надекспресії пав або рорВвВ, ІРР їі ОМАРР або ЕРР дефосфорилюються до пренолу й ізопренолу або фарнезолу відповідно, які накопичуються поза клітиною та можуть використовуватися для полегшення проміжного накопичення й активації інгібування зворотного зв'язку шляху МЕР.

Чорні стрілки показують опосередковані ферментами біохімічні реакції щодо терпеноїдів, світло-сірі стрілки показують конкуруючий побічний продукт, темно-сірі стрілки показують перенесення продукту за межі клітини, а білі стрілки показують скорочені для простоти шляхи.

На Фіг. 2 показано, що збільшення експресії одного ігрН або разом ізрнН і ігра підвищує титри терпеноїдних продуктів у штамах, сконструйованих для збільшення кількості вуглецю, що надходить до шляху МЕР, а тільки ізрії - знижує продуктивність. Контрольний штам являє собою штам Е. соїї з додатковими копіями ахв5, ахг, ізроО, іврЕ, ірЕ та іді (без додаткових копій івраї або і5рН), серед інших змін, спрямованих на поліпшення проходження шляху МЕР. Штами включають делецію розміром 20 т. н., яка не була сконструйована.

На Фіг. З показано, що збільшення експресії ігра та/або ігрН у штамах модифікованого продукування з поліпшеними шляхами МЕР впливає на схему розподілу продуктів МЕР. Верхня панель (шкала 1х) показує всі метаболіти шляху МЕР, при цьому більшість продуктів є ООХ, МЕ бо і МЕСРР. Середня панель (шкала 100х), показує метаболіти шляху МЕР із ПООХ, МЕ і МЕсСРР,

про які не повідомляється; у цьому випадку ООХР і МЕР є найбільш представленими. Нижня панель (шкала 25000х) показує тільки концентрацію НМВРР. На цих панелях показані сумарні позаклітинні та внутрішньоклітинні метаболіти з екстрагованих культур (бульйон плюс клітини), так що зазначена концентрація відноситься до об'єму екстракту.

На Фіг. 4 показана частка кожного окремого метаболіту МЕР, виявленого всередині або зовні клітини ("Іпіга" проти "Ехіга"). Ці значення не відображають абсолютну чисельність, наприклад у цілому набагато білоше БОХ, ніж НМВРР. У той час як ОХ є на 100 95 позаклітинним, НМВРР є на 100 95 внутрішньоклітинним. Штам, представлений на фіг. 4, є найбільш ефективним штамом "Контроль ж- ізрн/5рос". рОХР/ЮОХ, МЕР/МЕ і МЕсРР накопичуються майже повністю, якщо не повністю, у позаклітинному середовищі, тоді як СОР-

МЕ, СОР-МЕР, НМВРР, ІРРІОМАРР і ЕРР спостерігаються на 100 95 внутрішньоклітинно.

Відсотковий вміст кожного метаболіту, виявленого внутрішньоклітинно, показано у верхній частині графіка.

На Фіг. 5 показано, що некомпенсована активація ізгріх викликає значне зниження росту клітин, що визначається шляхом УФ-поглинання при 600 нм. Хоча деякі зміни в кінцевій щільності клітин спостерігаються для штамів, скомпенсованих за і5рН або разом іврН і ізра, зміни не є значущими.

На Фіг. 6 показано, що надекспресія рорВ може потроїти титри фарнезолу в штамах, сконструйованих для посилення проходження через шлях МЕР, але без встановленого низхідного шляху терпеноїдного продукту. Контрольний штам має додаткові копії ах5, ахг, іро, ієрЕ, ізрЕ, ізра, іврН та іді при різних рівнях конститутивної експресії, а також має надекспресію удЬкК. Штам накопичує помірні кількості фарнезолу, імовірно, як "перетікання" через занадто велике накопичення ЕРР, який повертається на цей шлях, і зазнає помітно більш повільного росту в порівнянні з диким типом. Коли рорВ надекспресується в цьому штамі, надлишок ЕРР більш ефективно перетворюється на фарнезол (запобігаючи контролю зворотного зв'язку), і потік ефективно проводиться через шлях МЕР.

На Фіг. 7 показано, що збільшення та підлаштування експресії ігра" та/або ізрН у штамі, який продукує фарнезол, може поліпшувати титр продукту. Контрольний штам має додаткові копії ахв, ахг, ізрбО, іврЕ, і5рЕ, ігра, ірН та іді, а також додаткові копії удЬК і рорВ. Додаткові

Зо копії ірН та/або і5ро" інтегрують у штами при збільшенні сили промотора (ж, жк, --к).

На Фіг. 8 показано, що збільшення титру продукту фарнезолу (показано на Фіг. 7) супроводжується зменшенням розміру пулу МЕСРР і залежить від співвідношення ізра та ірн.

На Фіг. 9 показано, що надекспресія іді збільшує титр продукту в штамі, який не надекспресує ізран, і знижує титр у двох штамів, які дійсно надекспресують ізранН, вказуючи на те, що баланс між ІРР і ОМАРР, контрольований активністю Іді, може бути збільшений або зменшений у залежності від потреби низхідного шляху.

На Фіг. 10 показано роль Марк як піруват:флаводоксин оксидоредуктази та/або піруватсинтази в посиленні біосинтезу терпеноїдів.

На Фіг. 11 показано, що експресія додаткової копії удБК при збільшенні сили промотора може поліпшувати продукування терпеноїдів. Контрольний штам продукує терпеноїдний продукт А і містить додаткові копії генів сх5, ахг, ізроО, ізрЕ, і5рЕ, ігра", ірН та іді шляху МЕР при певній конститутивній експресії.

На Фіг. 12 показано, що для поліпшення титру терпеноїдних продуктів через надекспресію удьк потрібна достатня кількість іхро та/або і5рН. Контроль А має додаткові копії ахв, ізроО, іврЕ та іді шляху МЕР, несконструйовану делецію розміром 20 т.н., а також інші модифікації для поліпшення характеристик білків з кластерами залізо-сірка. Контроль В - це контроль А плюс додаткова інтегрована копія і5ро" і ібрН у конфігурації оперона (спочатку С", так що співвідношення Н/З схиляється до б), тоді як контроль С - це контроль А плюс додаткова інтегрована копія ірН і ігра" у конфігурації оперона (спочатку Н, так що співвідношення Н/ схиляється до Н).

На Фіг. 13 показано, що експресія тах додатково до удЬК може поліпшити титри терпеноїдів.

Контрольний штам продукує терпеноїдний продукт А і містить додаткові копії генів ахв5, ахг, іро, ієрЕ, ізрЕ, ігра", ірН та іді шляху МЕР при певній конститутивній експресії. Штам також має несконструйовану делецію розміром 20 т.н. та інші модифікації для поліпшення характеристик білків з кластерами залізо-сірка.

На Фіг. 14 показано взаємодію між гліколізом і шляхом МЕР і проілюстровано можливості для налаштування доступності кофакторів шляхом зміни експресії оксидоредуктазних ферментів.

Фіг. 15 являє собою діаграму, яка ілюструє три відомі реакції в Е. соїї для перетворення бо пірувату (РМК) в ацетил-СоА (АсСоА), і ілюструє, як зниження або усунення РОН-

опосередкованої конверсії РУК в АсСоА призводить до збільшення опосередкованої РЕОК конверсії РУК в АсСоА.

Фіг. 16А-О є графіками, що показують кратну зміну продукування терпеноїдних продуктів у бактеріальних штамах, що мають надекспресований Марк і нокаутований асеЕ (ААасеЕ), у порівнянні з контролем. Контролем є той самий штам без (ДАасеЕ). ДасеєЄ запобігає РОН- опосередкованому перетворенню РУК в АсСоА. На Фіг. 16А показана кратна зміна в бактеріальних штамів, які продукують терпеноїдний продукт В. На Фіг. 168 показана кратна зміна в бактеріальних штамів, які продукують терпеноїдний продукт С. На Фіг. 16С показана кратна зміна в бактеріальних штамів, які продукують терпеноїдний продукт О. На Фіг. 160 показана кратна зміна в бактеріальних штамів, які продукують терпеноїдний продукт Е.

Фіг. 16Е є графіком, який показує, що бактеріальні штами, які продукують терпеноїдний продукт О, надекспресують УарБкК і мають ЛласеЕ, показують зниження позаклітинного МЕСРР у порівнянні з контролем (без ДЛасеЕ).

Фіг. 17А-С являють собою графіки, що показують кратну зміну терпеноїдного продукту в бактеріальних штамах, що мають надекспресовану МаЬБК і мутовану асеЕ (асеЕ ти), у порівнянні з контролем (без асеЕ ти). асеЕ тиї зменшує РОН-опосередковане перетворення

РУК в АсСоА. На фіг. 17А показана кратна зміна в бактеріальних штамів, які продукують терпеноїдний продукт В. На Фіг. 17В показана кратна зміна в бактеріальних штамів, які продукують терпеноїдний продукт С. На Фіг. 17С показана кратна зміна в бактеріальних штамів, які продукують терпеноїдний продукт 0.

Фіг. 170 являє собою графік, який показує, що бактеріальний штам, який продукує терпеноїдний продукт ОО, надекспресує Марк й оекспресує асеЕЄ тиї, має зниження позаклітинного МЕСРР у порівнянні з контролем (без асеЕ тий.

Фіг. 18 являє собою діаграму, яка ілюструє три відомі реакції в Е. соїї для перетворення пірувату (РУК) в ацетил-СоА (АсСоА), та ілюструє, як експресія гомологів їх або ПЯА може збільшувати постачання електронів в І5рО та/або ІєрН через окисно-відновну реакцію Га (показано жирним шрифтом).

Фіг. 19А являє собою графік, що показує зміну кратності (в порівнянні з контролем порожнього вектора (етр)) терпеноїдного продукту В у бактеріальному штамі,

Зо сконструйованому для надекспресії ак і надекспресії гомолога їдх або пад.

Фіг. 198 являє собою графік, що показує зміну кратності (в порівнянні з контролем) терпеноїдного продукту О у бактеріальному штамі, сконструйованому для надекспресії Мак і

Сулах (гомолог ах з АПосптотайит міпозит).

Фіг. 19С являє собою графік, який показує, що бактеріальний штам, який продукує терпеноїдний продукт О та надекспресує Уаьк ї См.ах, має зниження позаклітинного МЕСРР у порівнянні з контролем (без надекспресії См.1ах).

Фіг. 20 являє собою графік, що показує кратну зміну продукування терпеноїдного продукту в бактеріальних штамах, які продукують терпеноїдний продукт Е і які надекспресують один або декілька гомологів РЕОК або їрг і, необов'язково, гомолог ах або Па.

ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

У різних аспектах винахід належить до бактеріальних штамів і способів отримання терпенових і терпеноїдних продуктів, причому бактеріальні штами мають покращене проходження вуглецю через шлях МЕР і низхідний рекомбінантний шлях синтезу. У різних варіантах здійснення винахід забезпечує збільшення виходу терпенових та/або терпеноїдних продуктів шляхом ферментації бактеріальних штамів із джерелами вуглецю, такими як глюкоза, гліцерин, цукроза та інші.

Наприклад, у деяких аспектах винахід забезпечує бактеріальний штам, який продукує ізопентенілдифосфат (ІРР) і диметилалілдифосфат (ОМАРР) шляхом МЕР, і перетворює ІРР і

ОМАРР у терпеновий або терпеноїдний продукт низхідного шляху синтезу. У бактеріальному штамі ІзрО і І5рН надекспресуються, завдяки чому активність І5роО і активність Ізрн посилюється, забезпечуючи підвищене надходження вуглецю до проміжної сполуки 1-гідрокси- 2-метил-2-(Е)-бутеніл-4--дифосфату (НМВРР), але збалансоване для запобігання накопичення

НМВРР у кількості, що значуще знижує ріст клітин, їх життєздатність, проходження МЕР -шляху або титр продукту.

Підвищення експресії як Ір, так і ІгрН може значуще збільшувати титри терпенових і терпеноїдних продуктів. Збільшення експресії тільки І5ро або І5рН не призводить до значущого поліпшення титру. Крім того, надекспресія одного Іхро може призводити до дефектів росту, що може бути пов'язано зі спостереженням того, що НМВРР (проміжна ланка на шляху МЕР, що продукується Ір і споживається І5рнН) не виявляється поза клітиною, але виявляється на бо 100 95 внутрішньоклітинно. Метаболіт НМВРР виявляється діє як інгібітор шляху МЕР і виявляється токсичним для бактеріальної клітини на певних рівнях. Таким чином, баланс активності між І5ро і ІєрН важливий для запобігання дисбалансу й накопичення НМВРР.

Накопичення НМВРР може бути визначено як кількість на суху масу клітин (ЮОСМ/).

Наприклад, у деяких варіантах здійснення винаходу НМВРР не накопичується в кількості більше, ніж приблизно 10 мг/г ОСМУ, або в деяких варіантах здійснення винаходу НМВРР не накопичується в кількості більше, ніж приблизно 8 мг/г ОСМУ, або в деяких варіантах здійснення винаходу НМВРР не накопичується в кількості більше, ніж приблизно 5 мг/г ОСМУ або в деяких варіантах здійснення винаходу НМВРР не накопичується в кількості більше, ніж приблизно 4 мг/г ОСМУ, або в деяких варіантах здійснення винаходу НМВРР не накопичується в кількості більше, ніж приблизно 2 мг/г ЮСМУ. У деяких варіантах здійснення винаходу НМВРР не накопичується більше, ніж приблизно 1 мг/г ОСМУУ або не накопичується більше, ніж приблизно 0,5 мг/г ОСМУ, або більше, ніж приблизно 0,2 мг/г ОСМ/, або більше, ніж приблизно 0,1 мг/м реСМу. Збалансована надекспресія І5ро і ІзрН (наприклад, сприяюча більшій активності І5рН) важлива для того, щоб провести вуглець МЕР висхідним шляхом через НМВРР до ІРР, одночасно запобігаючи його дисбалансу й накопиченню.

У деяких варіантах здійснення винаходу І5ро і ІрН надекспресуються шляхом введення рекомбінантних генів і5ро і ієрН у бактеріальний штам. В інших варіантах здійснення винаходу ендогенні гени можуть надекспресуватись завдяки модифікації, наприклад, ендогенного промотора або сайту зв'язування рибосоми. При введенні рекомбінантних генів ігра та/або ігрн гени можуть необов'язково містити одну або декілька корисних мутацій.

У деяких варіантах здійснення винаходу додатковий ген може бути по суті ідентичним ферменту дикого типу (наприклад, ферменту дикого типу Е. сої) або може бути модифікованим для збільшення активності, або може бути ортологом Ізро або І5рН, який має подібну, більш високу або більш низьку активність, ніж у нативного бактеріального ферменту (наприклад, Е. сої). Наприклад, що стосується Ізро, амінокислотна послідовність може мати 50 95 або більше ідентичності послідовності з ЗЕО ІЮ МО: 1, або принаймні приблизно 60 95 ідентичності послідовності, або принаймні приблизно 7095 ідентичності послідовності, або принаймні приблизно 8095 ідентичності послідовності, або принаймні приблизно 90 95 ідентичності послідовності, або принаймні приблизно 9595 ідентичності послідовності або принаймні

Зо приблизно 98 95 ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮО МО: 1. У деяких варіантах здійснення винаходу від 1 до приблизно 10 або від 1 до приблизно 5 амінокислотних замін, делецій і/або вставок вносяться в амінокислотну послідовність Іро (ЗЕ

ІО МО: 1) для зміни активності білка, включаючи заміни одного або декількох сайтів зв'язування субстрату або активних сайтів. Модифікації Е. соїї або інших Ізро можуть бути сформовані шляхом побудови моделі гомології. Наприклад, відповідний гомолог для побудови моделі гомології Іро Е. соїї розкритий у: І ее М, еї а. Віозупіпевів ої ізоргепоїав: сгуєа! вігисіиге ої те

І4ЕРе-451 сіивієгї ргоївіп Ієрсї. ) Мої! Віої. 2010 Оеєс 10:404(4):600-10. Типовий мутант Ізро із поліпшеною активністю має чотири амінокислотні заміни відносно ферменту Е. соїї дикого типу (в цьому документі названий Ізро").

Крім того, що стосується І5рН, амінокислотна послідовність може мати 50 95 або більше ідентичності послідовності з ЗЕО ІЮ МО: 2, або принаймні приблизно 60 95 ідентичності послідовності, або принаймні приблизно 7095 ідентичності послідовності, або принаймні приблизно 8095 ідентичності послідовності, або принаймні приблизно 90 95 ідентичності послідовності, або принаймні приблизно 9595 ідентичності послідовності або принаймні приблизно 98 95 ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮО МО: 2. У деяких варіантах здійснення винаходу від 1 до приблизно 10 або від 1 до приблизно 5 амінокислотних замін, делецій та/або вставок вносять в амінокислотну послідовність ІєрН (ЗЕО

ІО МО: 2) для зміни активності білка, включаючи заміни одного або декількох сайтів зв'язування субстрату або активних сайтів. Модифікації ферменту І5рН можуть бути отримані за допомогою доступних структур ІзрН, включаючи Огамегі, Т., ег а. Бігисішге ої асіме ІрН епгуте їтот

Езспетісніа соїї ргоміде5 теспапівіїс іпвіднів іп взиБзігаєе гедисіоп 2009 Апдем/.Спет.Іпі.Еа. Епаді. 48: 5756-5759.

У таблиці 1 представлений список альтернативних ферментів, корисних для конструювання штамів бактерій та/або модифікації ферментів Ір або І5рН для посилення експресії в бактеріальних клітинах або поліпшення фізичних властивостей, кожен з яких може бути модифікований шляхом заміни, делеції і/або вставки амінокислоти. Наприклад, амінокислотна послідовність може мати 50 95 або більше ідентичності послідовності, або принаймні приблизно 60 95 ідентичності послідовності, або принаймні приблизно 70 95 ідентичності послідовності, або принаймні приблизно 8095 ідентичності послідовності, або принаймні приблизно 90 95 60 ідентичності послідовності, або принаймні приблизно 9595 ідентичності послідовності або принаймні приблизно 9895 ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю, описаною в таблиці 1. У деяких варіантах здійснення винаходу від 1 до приблизно 10 або від 1 до приблизно 5 амінокислотних замін, делецій та/або вставок вносять у послідовність з таблиці 1, щоб змінити активність білка, включаючи заміни одного або декількох із сайтів зв'язування субстрату або активних сайтів. У деяких варіантах здійснення винаходу фермент Ізро та/або

ІрН є ортологом ферменту Е. соїї, що має поліпшені властивості або активність в умовах, які використовуються для культивування.

Таблиця 1

Тен! Вид | /// Номердостулу./7/:

Експресія рекомбінантних ферментів Ір і ІзрН може бути збалансована, наприклад, шляхом зміни сили промотора, кількості копій гена, положення генів в опероні та/або модифікації послідовності сайту зв'язування рибосоми рекомбінантних генів ізрсї та/або ізрн.

Коли експресія та/або активність І5ро і ІєрН збалансовані, проміжна сполука НМВРР не накопичується в клітинах істотно більше, ніж у батьківському штамі, який не містить рекомбінантних або модифікованих генів ізраї і ігрН. Це відбувається, незважаючи на істотне збільшення проходження вуглецю через шлях МЕР, який необхідний для комерційного виробництва терпенів і терпеноїдів шляхом ферментації. Цей результат показаний на Фіг. 3, де штами із надекспресією ієрсї і ієрН, які можуть давати майже 4-кратне збільшення титру продукту в порівнянні з контрольним штамом, який не надекспресує ізра і ізрН (Фіг. 2), тим не менш, не накопичують проміжний НМВРР вище, ніж в контролі.

У деяких варіантах винаходу активність та/або експресія рекомбінантного І5рН вище, ніж активність і/або експресія рекомбінантного І5ро. Співвідношення І5ре/І5рН, яке схиляється до більшої кількості ферменту Н, призводить до високого проходження через шлях МЕР у порівнянні зі штамом із перевагою на бік Ігро у вищевказаному співвідношенні. І5ро і І5рн працюють послідовно для перетворення МЕСРР на НМВРР, а потім на ІРР. Збільшення Ізро накопичує більший пул НМВРР (який може надавати інгібуючий вплив на ріст штаму), в той час як збільшення ІєрН скорочує пул НМВРР по мірі його перетворення в ІРР. Таким чином, ідеальний баланс між І5ро і І5рН збільшує швидкість як утворення, так і споживання НМВРР, уникаючи накопичення НМВРР, що значно покращує проходження через шлях МЕР до

Зо цільового терпеноїду. Невелика перевага І5рнН у порівнянні з Ігро може додатково підвищувати продуктивність на 25 95, майже в 4 рази перевищуючи титри батьківського штаму. Дивіться Фіг. 2.

Таким чином, у деяких варіантах здійснення винаходу експресія рекомбінантного І5рН вища, ніж експресія рекомбінантного І5ро. Наприклад, рекомбінантні ферменти І5рН і Ієро можуть експресуватися з оперона, причому і5рН розташовується в опероні перед ізра. Ген, розташований першим в опероні, буде дещо переважати при експресії, забезпечуючи елегантний механізм балансування для І5рнН і Ієро. У деяких варіантах здійснення винаходу ібврй можна позиціонувати першим, необов'язково разом з іншими модифікаціями, такими як мутації в сайті зв'язування рибосоми (КВ5) для зниження експресії, або точкові мутації в одному або обох Ізро і ІзрН, які врівноважують активність на рівні продуктивності ферменту. У деяких варіантах здійснення винаходу ізрії і ієрН експресуються в окремих оперонах (наприклад, моноцистронних) і експресія врівноважується з використанням промоторів або КВ5 різної сили.

У деяких варіантах здійснення винаходу І5рнН і Ігро експресуються разом з оперона (з геном ібрН, розташованим перед геном ізрі) і за допомогою оперона, що експресується під контролем сильного промотора. Хоча збільшення сили промотора чинить позитивний вплив на продуктивність, коли ієрН розташований перед ієрії в опероні, збільшення сили промотора може чинити негативний вплив, коли ігрсї розташований перед із5рН. Див. Фіг. 7, де фарнезол використовується як імітація продукту.

Рекомбінантні ферменти Ізхро і ІєрН можуть експресуватись із плазміди або кодуючі гени можуть бути інтегровані в хромосому і можуть бути присутніми в одній або декількох копіях, у деяких варіантах здійснення винаходу, наприклад, приблизно 2 копіях, приблизно 5 копіях або приблизно 10 копіях на клітину. Кількість копій можна контролювати за допомогою використання плазмід із різною кількістю копій (як це добре відомо в даній галузі) або шляхом включення ряду копій у геном, наприклад, шляхом тандемної дуплікації генів.

У деяких варіантах здійснення винаходу мікробний штам має високе проходження через шлях МЕР, включаючи, наприклад, надекспресію одного або декількох ферментів МЕР (наприклад, додатково до І5ро і І5рН). Зі глюкозою як джерелом вуглецю теоретичний максимум для вуглецю, який потрапляє до шляху МЕР, становить приблизно 30 95 в Е. соїї. Попередні виходи по вуглецю МЕР, зазначені в літературі, становлять менше 1 95. Див. 2пои К, 20и К, зерпапороціоз С, Тоо Н-Р (2012) Меїабоїйе Ргоїїйпу Ідепійвй Меїпуїегуїнино! СусіодірнозрНаїє

ЕШих аз а ітйпо Біер іп Місгобіа! Іворгепоіїй Ргодисіоп. Ріоб5 ОМЕ 7(11): е47513. доі:10.137 1/ЛоигпаІ.ропе.0047513. Надекспресія й балансування генів шляху МЕР на додаток до інших модифікацій, описаних в даному документі, можуть проводити вуглець через шлях МЕР і до низхідного шляху синтезу для поліпшення надходження вуглецю до терпенових та/або терпеноїдних продуктів.

Клітина-хазяїн (бактеріальний штам) експресує шлях МЕР, який продукує ізопентенілдифосфат (ІРР) і диметилалілдифосфат (ОМАРР). Зокрема, глюкоза надходить у клітину й перетворюється на піруват (РУК) із гліцеральдегід-3-фосфатом як проміжної сполуки (СЗР або САР). ЗР ії РУК об'єднуються для отримання 1-дезокси-О-ксилулозо-5-фосфату (СОХР), який перетворюється на 2-С-метил-О-еритритол-4-фосфат (МЕР) і спрямовує шлях до

ІРР ії ОМАРР. БОХ, МЕ і МЕСРР знаходять за межами клітини. Чим більше надходження до шляху МЕР, тим більше ці продукти виявляються позаклітинно у штамів із незбалансованими шляхами. Дивіться Фіг. 1.

Шлях МЕР (2-С-метил-О-еритритол-4-фосфат) також називають шляхом МЕР/ЮОХР. (2-0- метил-О-еритритол-4-фосфат/1-дезокси-О-ксилулозо-5-фосфат) або немевалонатним шляхом, або незалежним від мевалонової кислоти шляхом. Цей шлях зазвичай включає в себе дію наступних ферментів: 1-дезокси-О-ксилулозо-5-фосфатсинтази (Ох5), 1-дезокси-О-ксилулозо-5-

Зо фосфатредуктоїзомерази (ЮОхг або ІіІзрс), 4-дифосфоцитидил-2-С-метил-О-еритритсинтази (ІгрО), 4-дифосфоцитидил-2-С-метил-О-еритритолкінази (І5рЕ), 2С-метил-О-еритритол-2,4- циклодифосфатсинтази (І5рЕ), 1-гідрокси-2-метил-2-(Е)-бутеніл-4-дифосфатсинтази (Ізро), 1- гідрокси-2-метил-2- (Е)-бутеніл-4-дифосфатредуктази (І5рН) і ізопентенілдифосфатізомерази (Ід). Шлях МЕР, а також гени й ферменти, які складають шлях МЕР, описані в патенті США 8,512,988, який повністю включений у цей опис як посилання. Таким чином, гени, які складають шлях МЕР, включають ахв, ахг (або ізрс), іврбО, ізрЕ, ізрЕ, ігра, ізрн, іді та іврА. Амінокислотні послідовності для ферментів шляху МЕР показані в доданому списку послідовностей.

ІРР їі ОМАРР (продукти шляху МЕР) є попередниками терпенів і терпеноїдів, включаючи монотерпеноїди, сесквітерпеноїди, тритерпеноїди та дитерпеноїди, які особливо застосовні в смакових, ароматичних, косметичних і харчових секторах. Синтез терпенів і терпеноїдів відбувається шляхом перетворення попередників ІРР і ОМАРР у геранілдифосфат (СРР), фарнезилдифосфат (ЕРР) або геранілгеранілдифосфат (ЗОРР) під дією ферменту пренілтрансферази (наприклад, СОРР5, ЕРРЗ або сОРРБ). Такі ферменти відомі й описані, наприклад, в О5 8,927,241, МО 2016/073740 і МО 2016/029153, які повністю включені в цей опис як посилання.

У різних варіантах здійснення винахід призводить до суттєвих поліпшень щодо вуглецю

МЕР. Використовуваний тут термін "вуглець МЕР" відноситься до загальної кількості вуглецю, присутнього як вихідна речовина, проміжний продукт, метаболіт або продукт шляху МЕР.

Метаболіти включають похідні, такі як продукти розпаду і продукти фосфорилювання й дефосфорилювання. Вуглець МЕР включає продукти та проміжні сполуки низхідних шляхів, включаючи шляхи синтезу терпеноїдів. Для цілей цього опису вуглець МЕР включає наступні вихідні речовини, проміжні сполуки й метаболіти шляху МЕР: О-гліцеральдегід-3-фосфат, піруват, 1-дезокси-О-ксилулозо-5-фосфат, 1-дезокси-О-ксилулозу, 2-С-метил-О-еритритол-5- фосфат, 2-С-метил-О-еритритол, 4-дифосфоцитидил-2-С-метил-О-еритритол, 2-фосфо-4- дифосфоцитидил-2-С-метил-О-еритритол, 2С-метил-О-еритритол, 2,4-циклодифосфат, 1- гідрокси-2-метил-2-(Е)-бутеніл-4-дифосфат, ізопентенілдифосфат і диметилалілдифосфат.

Вуглець МЕР додатково включає проміжні сполуки та ключові метаболіти на низхідному шляху синтезу терпеноїдів, що експресуються клітиною. Хоча ідентичність буде варіювати в залежності від шляху й використовуваних ферментів, такі продукти включають: бо геранілдифосфат (СРР), фарнезилдифосфат (ЕРР), геранілгеранілдифосфат (СОРР) або геранілфарнезилдифосфат (БОРР); їх монофосфорильовані варіанти -- геранілфосфат, фарнезилфосфат, геранілгеранілфосфат або геранілфарнезилфосфат; їх спирти -- гераніол, фарнезол, геранілгераніол або геранілфарнезол; а також подальші терпенові й терпеноїдні продукти. Вуглець МЕР додатково включає сполуки, отримані з ЕРР або шляхів, які використовують ЕРР, включаючи сквален, ундекапренілдифосфат (РР), ундекапренілфосфат, октапренілдифосфат (ОРР), 4-гідроксибензоат, З-октапреніл-4-гідроксибензоат, 2- октапренілфенол, З-октапренілбензол-1 2-діол, 2-метокси-6-октапреніл-2-метокси-1,4- бензохінол, б-метокси-З-метилоктапреніл-1,4-бензохінол, З-деметилубіхінол-8, убіхінол-8, убіхінон, 2-карбокси-1,4-нафтохінол, деметилменахінол-8, менахінол-8 і менахінон. Вуглець

МЕР додатково включає метаболіти ізопренолу, пренолу, ізопентенілфосфату й диметилалілфосфату. Вуглець МЕР (вищезгадані проміжні продукти та метаболіти) можна кількісно визначати за допомогою мас-спектрометрії (М5), такої як тандемна мас-спектрометрія (М5/М5) за допомогою мас-детектора з потрійним квадруполем (20023). Орієнтовна система --

Адіепі 6460 02000); альтернативно, з кількісними датчиками часу прольоту (ОТОРБ), часу прольоту (ТОЕ) або мас-детекторами іонної пастки.

У деяких варіантах здійснення винаходу мікробний штам має принаймні одну додаткову копію генів сїх5, і5рО, і5рЕ та/або іді які можуть обмежувати швидкість і які можуть експресуватись з оперона або модуля, розташовані як на плазміді, так й інтегровані в бактеріальну хромосому. У деяких варіантах здійснення винаходу бактеріальний штам має принаймні одну додаткову копію ах5 та іді, що експресується як оперон/модуль; або ахв, івро, іврЕ та іді, що експресуються як оперон або модуль. У деяких варіантах здійснення винаходу бактеріальний штам експресує ахв, ах, ізрО, ієрЕ, ієрЕ та іді як рекомбінантні гени, які необов'язково експресуються як 1, 2 або З окремі оперони або модулі. Рекомбінантні гени шляху МЕР експресуються з однієї або декількох плазмід або інтегруються в хромосому. У цих варіантах здійснення винаходу штам забезпечує підвищене проходження через шлях МЕР у порівнянні з диким типом.

Амінокислотні послідовності для ферментів Е. соїї дикого типу ЮОх5, Охг, І5рО, І5рЕ, І5рЕ та ді показані тут як ЗЕО ІЮ МО: 3-8 У різних варіантах здійснення винаходу можуть бути використані ферменти, які мають структурну гомологію або гомологію послідовностей і порівняльну

Зо функціональність (включаючи бактеріальні гомологи). Наприклад, амінокислотна послідовність може мати 50 95 або більше ідентичності послідовності з будь-якою з 5ЕО ІЮО МО: 3-8, або принаймні приблизно 6095 ідентичності послідовності, або принаймні приблизно 70 95 ідентичності послідовності, або принаймні приблизно 80 95 ідентичності послідовності, або принаймні приблизно 9095 ідентичності послідовності, або принаймні приблизно 95 95 ідентичності послідовності або принаймні приблизно 98 95 ідентичності послідовності з будь- якою з амінокислотних послідовностей ЗЕО ІЮО МО: 3-8. У деяких варіантах здійснення винаходу від 1 до приблизно 10 або від 1 до приблизно 5 амінокислотних замін, делецій та/або вставок здійснюється в амінокислотній послідовності (ЗЕО І МО: 3-8) для зміни активності білка, включаючи заміни на одному або декількох сайтах зв'язування субстрату або активних сайтах.

Модифікації ферментів можуть бути отримані шляхом побудови моделі гомології. Такі мутанти можуть формуватись ферментними структурами, доступними в даній галузі, включаючи Уаїїйта з, еї аї!., Зігисіште ої 1-деоху-О-хуІшозе 5-рпозрНаїєе гедисіоізотегавзе іп а диаїегтагу сотріех м/ййп а тадпевзішт іоп, МАОРН апа їНе апіїтаїага! агид 5тідотусіп, Асіа Стузі. Е63, 466-470 (2007).

У деяких варіантах здійснення винаходу доповнення МЕР підсилює перетворення пулів роХхР і МЕР на МЕСРР, субстрат для Ізро. Дивіться фіг. 1. Вузькі місця на шляху МЕР від ахв до ібрЕ можуть бути визначені, враховуючи концентрації ПООХ, МЕ і МЕсСРР, які можна виявити позаклітинно. Доповнення й експресія ферментів шляху МЕР можуть бути збалансовані для переміщення надходження вуглецю до проміжної сполуки МЕСРР, як визначено профілюванням метаболітів. У деяких варіантах здійснення винаходу експресія або активність І5ро і І5рн збалансована відносно експресії або активності ЮОхг, Ох5, І5рО, ІєрЕ і ІєрЕ для переходу метаболіту МЕсСРР у попередники ІРР і ОМАРР. МЕсРР може транспортуватися до позаклітинного середовища, і, таким чином, великі пули МЕСРР можуть призводити до втрати вуглецю МЕР.

У деяких варіантах здійснення винаходу експресія або активність рекомбінантного гена іа налаштовується для збільшення продукції терпену або терпеноїду. Фермент Іді каталізує оборотну ізомеризацію ІРР у ОМАРР. Оскільки кожен бажаний терпеноїдний продукт або небажаний побічний продукт МЕР (наприклад, ОРР) використовує один ОМАРР і різні кількості

ІРР, співвідношення між цими двома попередниками може впливати на продуктивність штаму.

Зміна доступного співвідношення ІРР:ОМАРР, наприклад, шляхом зміни експресії або бо активності Іді може впливати на продукування бажаного терпеноїду в порівнянні з іншими небажаними продуктами зі шляху МЕР. Наприклад, як показано на Фіг. 9, хоча надекспресія ді трохи збільшує титр продуктів у штамі, що не надекспресує І5роОнН (штам 1), але вона знижує титр у двох штамах, які це роблять (штами 2 і 3), вказуючи, що баланс між ІРР і ОМАРР, керований ді, може бути налаштований на підвищення або зниження в залежності від потреб низхідного шляху. Проте, штам 4 (Фіг. 9), який має інший баланс експресії ферментів шляху

МЕР, збільшує більше ніж удвічі титр із комплементацією ді. Експресія рекомбінантного гена іа може бути налаштована в різних варіантах втілення винаходу шляхом модифікації сили промотора, числа копій гена, положення в опероні або сайту зв'язування рибосоми на додаток до точкових мутацій для збільшення або зменшення продуктивності ферменту.

Мікробний штам забезпечує значне збільшення за вуглецем МЕР, включаючи значне збільшення надходження попередників ІРР і ОМАРР без істотного впливу на ріст і життєздатність штаму, що визначається оптичною щільністю (0.0.) у культурі, піковим значення

О.О. та/або швидкістю росту. Наприклад, незважаючи на посилене проходження через шлях

МЕР, який жорстко контролюється в бактеріальних клітинах, мікробний штам не дає падіння пікового значення 0.0. більше, ніж приблизно на 20 95, або в деяких варіантах, не дає падіння пікового значення 0.0. більше, ніж приблизно на 15 95, або більше, ніж приблизно на 10 95, або більше, ніж приблизно на 595. У деяких варіантах здійснення винаходу штам не виявляє вимірюваного впливу на ріст або життєздатність штаму, як це визначено, наприклад, шляхом вимірювання швидкості росту або пікового значення 0.0.

У деяких варіантах здійснення винаходу штам бактерій містить одну або більше генетичних модифікацій, які посилюють надходження та перенесення електронів через шлях МЕР і/або до терпенових або терпеноїдних продуктів. У деяких варіантах здійснення винаходу підвищене надходження та перенесення електронів через шлях МЕР відбувається завдяки рекомбінантній експресії одного або декількох ферментів оксидоредуктаз, включаючи оксидоредуктази, які окиснюють піруват і/або призводять до відновлення фередоксину. Фередоксин надає електрони до шляху МЕР та підтримує активність Ір і І5рН (які є ферментами з кластером Ее-5).

Дивіться Фіг. 10. У різних варіантах здійснення винаходу мікробний штам включає в себе надекспресію або комплементацію одним або декількома з флаводоксину (ПаА), флаводоксинредуктази, фередоксину (їдх) і фередоксинредуктази.

Зо Наприклад, у деяких варіантах винаходу оксидоредуктаза Є піруват:рлаводоксиноксидоредуктазою (РЕОК). У деяких варіантах здійснення РЕОК є хаьк. У деяких варіантах здійснення Мак є Мак Е. сої або її ортологом і похідними.

У деяких варіантах здійснення винаходу штам містить комплементацію або надекспресію

УаркК. Прогнозується, що Марк діє як піруват:рлаводоксиноксидоредуктаза і/або піруватсинтаза. Вважається, що оксидоредуктаза окиснює піруват до ацетил-СоА, відновлюючи фередоксин, який потім може постачати електрони на шлях МЕР, особливо для підтримки сильно активованих ферментів І5ро і І5рН, які містять кластери Бе-5. У деяких варіантах здійснення винаходу експресія рекомбінантного ХаЬК збалансована з експресією Ізро і ІРрнН, яка може бути визначена за титром продукту (або титром фарнезолу, як описано нижче). У деяких варіантах здійснення винаходу ген ак знаходиться під контролем слабкого промотора або промотора проміжної сили. Крім того, додаткові ко-фактори, які несуть або переносять електрони, можуть експресуватись, контролюючи надекспресію УаБК. Див., наприклад, АкКпаг, еї аЇ., Меїароїїс Епдіпеегіпу, 11(3): 139-147 (2009). У деяких експериментах чаьк надекспресується за допомогою ах (фередоксину) з Сіовітідійт разівигіапит (ЗЕО ІЮО МО: 10) та/або Е. Соїї (Ес.уапм) (ЗЕО ІЮО МО: 34) або ферменту з принаймні 80 95 або принаймні 90 95 ідентичності послідовності з ним. Бактеріальний штам може містити рекомбінантний ген УаЬк, який може бути інтегрований у хромосому або експресуватись із плазміди. Амінокислотна послідовність ферменту УаБК Е. соїї показана в даному документі як ББЕО ІЮ МО:9. У різних варіантах здійснення винаходу можуть бути використані ферменти, які мають структурну гомологію або гомологію послідовностей і опорівнянну функціональність. Наприклад, амінокислотна послідовність може мати 50 95 або більше ідентичності послідовності з будь-якою з 5ЕО ІЮ МО:9, або принаймні приблизно 60 95 ідентичності послідовності, або принаймні приблизно 7095 ідентичності послідовності, або принаймні приблизно 80 95 ідентичності послідовності, або принаймні приблизно 90 95 ідентичності послідовності, або принаймні приблизно 9595 ідентичності послідовності, або принаймні приблизно 97 95 ідентичності послідовності або принаймні приблизно 98 95 ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО:9. У деяких варіантах здійснення винаходу від 1 до приблизно 10 або від 1 до приблизно 5 амінокислотних замін, делецій та/або вставок вносяться в амінокислотну послідовність (ЗЕО ІЮ МО:9), щоб змінити активність цього білка.

У деяких варіантах здійснення винаходу штам містить один або декілька ферментів Р450 для продукування терпеноїдних сполук. Надекспресія УаБк і потенційно інших оксидоредуктаз може підтримувати більш високі рівні окиснювальної хімічної активності Р4А50.

У деяких варіантах здійснення винаходу, в тому числі у варіантах, де бактеріальний штам надекспресує або має більш високу активність піруват:рлаводоксиноксидоредуктази (РЕОК), штам проявляє знижену конверсію пірувату на ацетил-СОА під дією піруватдегідрогенази (РОН). У деяких варіантах здійснення винаходу перетворення пірувату на ацетил-СОА за допомогою РОН знижується шляхом видалення або інактивації РОН, або шляхом зниження експресії або активності РОН. У деяких варіантах здійснення винаходу РОН видаляється.

Альтернативно, активність РОН може бути зменшена однією або декількома модифікаціями амінокислот. Типовою мутацією для зниження активності РОН є мутація 5267 в асекп.

У деяких варіантах перетворення пірувату в ацетил-СОА за допомогою РОН зменшується шляхом модифікації комплексу асеЕ-асен-Іра в РОН. У деяких варіантах здійснення винаходу комплекс асеЕ-асенв-Іра модифікується делецією, інактивацією або зниженою експресією або активністю асеєЄ, асен, Іра, або їх комбінацією. Наприклад, у деяких варіантах здійснення винаходу асеємЄ видаляється (наприклад, нокаутом). Альтернативно, у деяких варіантах здійснення винаходу комплекс асеЕ-асен-Іра модифікується однією або декількома мутаціями асеЕ, асеР, Іра або їх комбінацією.

При зменшенні перетворення пірувату на ацетил-СОА за допомогою РОН бактеріальний штам буде більше покладатися на РЕОК (наприклад, ХаькК) для перетворення пірувату на ацетил-СОА. Дивіться Фіг. 15. Ця залежність посилює активність І5ро і І5рнН.

У деяких варіантах здійснення винаходу постачання й перенесення електронів до І5ро і І5рн поліпшується за рахунок надекспресії або комплементації з однією або декількома оксидоредуктазами, такими як, наприклад, РЕОК. Наприклад, у деяких варіантах здійснення винаходу РЕОК або його гомолог вибраний із Марк (5ЕО ІЮ МО: 9), Зсу.ріог (Зупеспосувіїв 5р.) (ЗЕО ІО МО: 29), Кі.ріог (КіІсумега іпіегтедіа) (ЗЕО ІЮ МО: 30), ба.ріог (ОезиМомірго айісапив) (ЗЕО ІО МО: 31), Мв.ріог (Мовіос в5р.) (ЗЕО ІО МО: 32), Ес.уанМ (Е. Соїї) (ЗЕО ІО МО: 33), Сза.ріог (СіШатеййа арісоїа)» (ЗЕО ІЮО МО: 35), і Зсо.ріог (Бупеспососси5 5р.). У деяких варіантах здійснення РЕОЕ є чУаьк.

У деяких варіантах здійснення винаходу РЕОК містить послідовність, яка принаймні на 60 95 ідентична будь-якій із послідовностей ЗЕО ІЮ МО. 29-35. Наприклад, РЕОК може містити послідовність, яка принаймні приблизно на 60 95, принаймні приблизно на 70 95, принаймні приблизно на 80 95, принаймні приблизно на 90 95, принаймні приблизно на 95 95, принаймні приблизно на 97 95, принаймні приблизно на 98 95, принаймні приблизно на 99 95 або на 100 95 ідентична будь-якій із послідовностей 5ЕО ІЮ МО. 29-35.

У деяких варіантах здійснення винаходу надекспресія або комплементація з РЕОК, такого як, наприклад, арк, може призводити до поліпшення продуктивності за рахунок експресії носіїв електронів, що мають окиснювально-відновний потенціал від приблизно 400 до 550 мВ або, в деяких варіантах здійснення винаходу, в діапазоні від приблизно 400 до 500 мВ або в діапазоні від 400 до 475 мВ. У деяких варіантах здійснення винаходу носієм електронів є феродоксин, флаводоксин або МАЮРН. Наприклад, у деяких варіантах здійснення винаходу носієм електронів є См.Тах (АПоспготаїйіт міпозит).

У деяких варіантах здійснення винаходу бактеріальний штам має надекспресією або комплементацією з одним або декількома гомологами їрг. Наприклад, у деяких варіантах винаходу гомолог їрг вибраний із М5.Трг (Мовіос 5р.) (ЗЕО ІЮ МО: 36), со. рг (зупеспососсив 5р.) (ЗЕО ІО МО: 37) та Ес. рг (Е. Соїї) (ЗЕО ІО МО: 38).

У деяких варіантах здійснення винаходу їрг містить послідовність, яка принаймні на 60 95 ідентична будь-якій із послідовностей 5БЕО І МО. 36-38. Наприклад, їрг може містити послідовність, яка принаймні приблизно на 60 95, принаймні приблизно на 70 95, принаймні приблизно на 80 95, принаймні приблизно на 90 95, принаймні приблизно на 95 95, принаймні приблизно на 97 95, принаймні приблизно на 98 95, принаймні приблизно на 99 95 або 100 95 ідентична будь-якій із послідовностей 5ЕО ІЮ МО: 36-38.

У деяких варіантах здійснення винаходу бактеріальний штам, надекспресуючий арк або його гомолог або похідне, додатково експресує ненативний акцептор/донор електронів, такий як один або декілька ненативних гомологів їх та/або ЯаА. Наприклад, гомолог їх може бути вибраний із Нт.ях1 (Неїїобасіегішт тоаевзіїса(дит) (ЗЕО ІО МО: 15), Ралах (Рвейдотопав аегидіпова) (ЗЕО І МО: 16), См.лах (АПоспготаїййшт міпозит) (ЗЕО ІО МО: 17), Смлах С57А (синтетичний) (ЗЕО 10 МО: 18), Ес.уті! (Е. Сої) (5ЕБЕО ІЮ МО: 19), Салах (Сіовігідійт асеюбршуїїсит) (ЗЕО І МО: 20), Ср.Тдх (Сіозтіайт разівишпіапит) (ЗЕО ІЮ МО: 10), Есах (Е. 60 Соїї) (ЗЕО І МО: 21), Ем2лах (ЕсюїПпіотодозріга 5парозппікомії) (ЗЕО ІО МО: 22), Рр1.тах

(Рзейдотопах ршиїіда) (ЗЕО ІЮ МО: 23) і Рр2 лах (Рзейидотопах ршіда) (ЗЕО ІЮ МО: 24). У деяких варіантах здійснення винаходу гомолог ПдА включає один або декілька компонентів, вибраних з

ЕстаА (Е. соїї) (ЗЕО ІО МО: 27), Асладг (Агоїорасієг спгоососсит) (ЗЕО ІЮ МО: 26), АмЛадаг (Агоїобрасіег міпеїІапай) (ЗЕБО ІЮ МО: 25) та В5.ЛаА (В. зиріШв5) (ЗБО ІЮ МО: 28). Експресія ненативного гомолога йіх та/або гомолога ПЧА призводить до збільшення постачання електронів до Іб5роО та/або І5рН, збільшення активності І5рО/Н і збільшення продукції терпеноїдов. Дивіться Фіг. 19А-6.

У деяких варіантах здійснення винаходу ненативні гомологи їх містять послідовність, яка принаймні на 60 95 ідентична будь-якій із послідовностей 5ЕО ІЮО МО. 10 і 15-24. Наприклад, ненативні гомологи їйїх можуть містити послідовність, яка принаймні приблизно на 60 95, принаймні приблизно на 70 95, принаймні приблизно на 80 95, принаймні приблизно на 90 95, принаймні приблизно на 95 95, принаймні приблизно на 97 95, принаймні приблизно на 98 95, принаймні приблизно на 99 95 або 100 95 ідентична будь-якій із послідовностей 5ЕО ІЮ МО. 10 і 15-24.

У деяких варіантах здійснення винаходу ненативні гомологи ЯДА містять послідовність, яка принаймні на 60 95 ідентична будь-якій із послідовностей 5ЕО ІЮ МО. 25-28. Наприклад, ненативні гомологи ЯЯА можуть містити послідовність, яка принаймні приблизно на 60 95, принаймні приблизно на 70 95, принаймні приблизно на 80 95, принаймні приблизно на 90 95, принаймні приблизно на 95 95, принаймні приблизно на 97 95, принаймні приблизно на 98 95, принаймні приблизно на 99 95 або 100 95 ідентична будь-якій із послідовностей 5ЕО ІЮ МО. 25-- 28.

У деяких варіантах здійснення винаходу бактеріальний штам має надекспресію або комплементацію з одним або декількома РЕОЖК та/або їрг і, необов'язково, одним або декількома з флаводоксину (ПЯА), флаводоксинредуктази, фередоксину (їх) («4 фередоксинредуктази. Як приклад, у деяких варіантах здійснення винаходу бактеріальний штам включає Ес.удпМ (Е. Соїї) (ЗЕО ІЮО МО: 33) і Ес.уанм (Е. Соїї) (ЗЕО ІЮ МО: 34); Ес.удькК (Е. Соїї) (ЗЕО ІО МО: 9) і Ср.Кіх (Сіовігідішт равівигіапит) (ЗЕО ІО МО: 10); Ес.Трг (Е. Соїї) (ЗЕО ІЮО МО: 38) і Ес.їах (Е. Соїї) (ЗЕО ІЮ МО: 21); або Ес.рг (Е. Соїї) (ЗЕО ІЮ МО: 38) і Ес.ЛаА (Е. соїї) (ЗЕО ІЮ

МО: 27).

Зо В інших аспектах винахід належить до бактеріальних штамів, які надекспресують ферменти

РорВвВ або Миав для збільшення проведення вуглецю МЕР. Установка цього альтернативного "продуктового" пулу шляхом надекспресії генів, таких як рорВ і пиав, спрямовує ще більше проходження через шлях МЕР (хоча і до нецільових продуктів) і зводить до мінімуму накопичення потенційно токсичних або інгібуючих за зворотним зв'язком проміжних продуктів (наприклад, ІРР, ОМАРР, ЕРР). У деяких варіантах здійснення винаходу надекспресія РорВ або

Миав відбувається за відсутності низхідного терпеноїдного шляху, створюючи тим самим "універсальний базис"; тобто штам, у якому можна перетворювати будь-який низхідний терпеноїдний шлях і який швидко можна оптимізувати для комерційного виробництва.

Точніше кажучи, вуглець може проходити через шлях МЕР для утворення альтернативних продуктів, які будуть накопичуватися поза клітиною. РорВ дефосфорилює ЕРР у фарнезол (РОН), а Миав дефосфорилює ІРР ії ОМАРР в ізопренол (З3-метил-З3-бутен-1-ол) і пренол (3- метил-2-бутен-1-ол), відповідно (див. Фіг. 1). Посилення транспорту цих продуктів за межі клітини запобігає накопиченню ІРР, ОМАРР і ЕРР; які, як і НМВРР, можуть здійснювати зворотний зв'язок і здійснювати контроль шляху МЕР. ІРР пригнічує ріст і за зворотним зв'язком інгібує Ох5. Див. Согдоба, Заїті 8. І еоп (2009) у). Ехр. Вої. 60, 10, 2933-2943. ЕРР пригнічує ріст і за зворотним зв'язком інгібує комплекс І5рЕ-МЕР, який утворюється сам по собі, коли зв'язується МЕР і посилює активність І5рЕ способом прямого зв'язку. ВНОоК 4 Меуеєг5 (2012) АС5

Спет. Віої. 2012, 7, 1702-1710. Фарнезол, ізопренол і пренол накопичуються поза клітиною і, подібно до проміжних сполук на шляху МЕР, можуть використовуватися для відстеження проходження вуглецю через шлях МЕР методом кількісного визначення І С/М5 або СС/М5.

У різних варіантах здійснення винаходу можуть бути використані ферменти, які мають структурну гомологію або гомологію послідовностей і порівнянну функціональність. Наприклад, амінокислотна послідовність може мати 50 95 або більше ідентичності з послідовністю 5ЕО ІЮ

МО:11 (РорВ) або 12 (мМиав), або принаймні приблизно 60 95 ідентичності послідовності, або принаймні приблизно 7095 ідентичності послідовності, або принаймні приблизно 80 95 ідентичності послідовності, або принаймні приблизно 90 95 ідентичності послідовності або принаймні приблизно 95 95 ідентичності послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ

МО:11 або 12. У деяких варіантах здійснення винаходу від 1 до приблизно 10 або від 1 до приблизно 5 амінокислотних замін, делецій та/або вставок вносяться в амінокислотну послідовність (ЗЕО ІЮ МО:11 або 12), щоб змінити активність білка, включаючи заміни одного або декількох сайтів зв'язування субстрату або активного сайту.

Таким чином, шляхом конститутивної експресії додаткової копії рррВ або пиав, проходження вуглецю через шлях МЕР може бути поліпшений, а фенотип із повільним ростом -- поліпшений.

У випадках, коли ізхро і і;рН збалансовані, а раорВ або пиав надекспресуються, збільшення або зменшення продукту фарнезолу інверсійно корелює з рівнем МЕсСРР (Фіг. 7 і 8).

Проте, занадто висока експресія РорВ або МийаВ може негативно впливати на загальне надходження до фарнезолу, з більш низьким титром і меншою зміною кратності. Дивіться фіг. 6.

Таким чином, у різних варіантах здійснення винаходу експресія рекомбінантного РорВ та/або

Миав налаштовується для забезпечення більш високого титру терпенового або терпеноїдного продукту, необов'язково, шляхом зміни сили промотора, числа копій гена, положення в опероні та/або сайту зв'язування рибосоми. У деяких варіантах здійснення винаходу експресія рекомбінантних генів РарВ та/або Миав відбувається під контролем слабкого промотора або промотора помірної сили. Рекомбінантний рорВ або пиав може інтегруватись в хромосому або експресуватись із плазміди.

У деяких варіантах здійснення винаходу бактеріальні штами надекспресують одну або декілька синтаз для збільшення вуглецевого пулу МЕР. Наприклад, у деяких варіантах здійснення винаходу синтаза вибрана з фарнезенсинтази і валенсенсинтази Апетівіа аппиа.

У деяких варіантах здійснення винаходу бактеріальний штам має одну або декілька додаткових модифікацій для збільшення доступності або обороту кофактору, включаючи кофактор МАБСН і МАОРН, що призводить до збільшення вмісту вуглецю в МЕР. Дивіться Фіг. 14.

У деяких варіантах здійснення винаходу бактеріальний штам експресує гліцеральдегід-3- фосфат-фередоксиноксидоредуктазу (ЗАРОК), наприклад із Меїпапососсив таїгіраїнаїв (5ЕО І

МО: 14) або іншого мезофільного організму. Експресія СОЗАРОК може забезпечувати електрони для фередоксинів у центральному вуглецевому метаболізмі та може забезпечувати електрони для ферментів І5ро, ІрН або Р450. У деяких варіантах здійснення винаходу бактеріальний штам надекспресує один або декілька генів оперона удп, таких як уайпМ або уану (наприклад, шляхом комплементації гена дикого типу або посилення експресії ендогенного бактеріального гена). МанпмМ або інші бактеріальні гени, що мають САРОК-подібну активність, можуть

Зо збільшувати доступність кофактора для подальшого збільшення щодо вуглецю МЕР. Інші генетичні модифікації полягають у пригніченні, інактивації або делеції д5пА або експресії

СНАСІ1 та/або СНАС2 (наприклад, із Ното зарієпв). Ці модифікації можуть змінювати рівні глутатіону, тим самим побічно збільшуючи доступність МАОЮОРН.

Хоча різні види бактерій можуть бути модифіковані відповідно до цього розкриття, у деяких варіантах здійснення винаходу бактеріальний штам являє собою бактерію, вибрану з

ЕзсеПетісніа 5рр., Васійи5 в5рр., Согупебасівгцт з5рр., Вподобасіег 5рр., 7утотопав 5рр., Мірно 5рр. та Рзхепдотопазх 5рр. У деяких варіантах здійснення винаходу бактеріальний штам являє собою вид, вибраний з ЕзсПегісніа соїї, Васійив5 зиБбій5, Согуперасіеп ит дішатісит, АНодобасіег сарзціай5, ЕПподобасіег 5рпаєгоїде5, 7утотопа5 торії, Мібгіо пайієдеп5, або Рхепдотопа5 ршийда. У деяких варіантах здійснення винаходу бактеріальний штам є Е. соїї.

Відповідно до варіантів здійснення винаходу, описаних у цьому документі, можуть бути використані різні стратегії для конструювання експресії або активності рекомбінантних генів і ферментів, включаючи, наприклад, модифікації або заміну промоторів різної сили, модифікації послідовності, що зв'язує рибосому, модифікації порядку розміщення генів в опероні або модулі, використання генних кодонів, стабільності РНК або білка, вторинної структури РНК і кількості копій гена, поряд з іншими.

У деяких варіантах здійснення винаходу послідовність сайту зв'язування рибосоми може бути змінена для налаштування трансляції мРНК. Послідовність Шайна-Дальгарно (50) є сайтом зв'язування рибосоми в бактерій і зазвичай розташована біля 8 основ перед стартовим кодоном АШО. Ця послідовність РНК допомагає рекрутувати рибосому до матричної РНК (МРНК), щоб ініціювати синтез білка шляхом вирівнювання рибосоми зі стартовим кодоном.

Консенсусна послідовність із шістьма основами являє собою дДОосАСсОс (5БО ІЮО МО:13) в

Е5спегіспіа соїї. Мутації в цій консенсусній послідовності можуть відбиратись на предмет поліпшення титру продукту (включаючи титр фарнезолу в деяких варіантах здійснення винаходу) або відбиратись шляхом метаболомічного аналізу вуглецю МЕР.

Для комплементації генів можна використовувати гени дикого типу, і в деяких варіантах здійснення винаходу ген являє собою ген Е. соїїЇ дикого типу. Альтернативно можуть бути використані різні ортологи, які можуть демонструвати нуклеотидну або амінокислотну гомологію з геном Е. соїї. Типові гени можуть бути отримані, наприклад, з ортологів Васійи5 5рр.,

Согуперасіегцт 5рр., Аподобрасієї 5рр., 7утотопавз 5рр., Мірпо 5рр., Рзепдотопав5 зрр.,

Спіогоросшит 5рр., зупеспосузвії5 5р., ВигКпоїдегіа 5рр. і 5іеміа герацадіапа.

Подібність нуклеотидної й амінокислотної послідовностей, тобто відсоток ідентичності послідовностей, можна визначити за допомогою вирівнювань послідовностей. Такі вирівнювання можуть бути виконані за допомогою декількох відомих в галузі алгоритмів, таких як математичний алгоритм Карліна й Альтшуля (Кагіїп 4. Айвспи! (1993) Ргос. Май. Асад. 5сі.

ИБА 90: 5873-5877), за допомогою Ппттаїїдп (пакет НММЕК, пер:/пттег.мив5і.еди/) або за допомогою алгоритму СГОБТАГС (Тпотрзоп, у. О., Ніддіп5, ЮО. б. 5 бірзоп, Т. 9. (1994) Мисівїс

Асіа5 Ве. 22, 4673-80). Ступінь ідентичності послідовності (співпадіння послідовності) може бути обчислений із використанням, наприклад, ВІ А5Т, ВІ АТ або Віавзі7 (або ВіазіХ). Подібний алгоритм включений до програм ВІАБТМ і ВІ АТР у Ай5спиї еї аї. (1990) 9). Мої. Віої. 215: 403-- 410. Полінуклеотидний пошук ВГА5Т можна проводити за допомогою програми ВІА5ТМ, оцінка

Е 100, довжина слова - 12.

Пошук білка ВГА5Т може бути виконаний за допомогою програми ВІ АЗТР, оцінка - 50, довжина слова - 3. Для отримання вирівнювання з проміжками для порівняльних цілей використовують Сарреа ВГ А5Т, як описано в Ай5епиЇ еї аї. (1997) Мисієїс Асіа5 Нев. 25: 3389- 3402. При застосуванні програм ВГАБТ і Саррей ВГАБТ використовуються параметри за замовчуванням відповідних програм. Аналіз відповідності послідовностей може доповнюватись встановленими методами відображення гомології, такими як Зпитщше--АСАМ (Вгидпо М.,

Віоіптоптаїййсв 20036, 19 Зиррі 1:154-162) або випадкові поля Маркова. "Консервативні заміни" можуть бути зроблені, наприклад, на основі подібності за полярністю, зарядом, розміром, розчинністю, гідрофобністю, гідрофільністю та/або амфіпатичною природою залучених амінокислотних залишків. 20 природних амінокислот можуть бути згруповані в наступні шість стандартних амінокислотних груп: (1) гідрофобні: Меї, Айа, Маї, І еи, Пе; (2) нейтральні гідрофільні: Суб, Зег, ТАг; Азп, Зіп; (3) кислотні: Ар, См; (4) основні: Нів, Г ув, Ага; (5) залишки, які впливають на орієнтацію ланцюга: Су, Рго; та

Зо (6) ароматичні: Тгр, Туг, Ріє.

Використовуваний у цьому документі термін "консервативні заміни" визначається як заміни амінокислоти іншою амінокислотою, переліченою в тій самій групі з шести стандартних амінокислотних груп, показаних вище. Наприклад, заміна Ар на Сім зберігає один негативний заряд у таким чином модифікованому поліпептиді. Крім того, гліцин і пролін можуть заміняти один одного в залежності від їх здатності руйнувати а-спіралі. Деякі переважаючі консервативні заміни в вищевказаних шести групах є замінами в наступних підгрупах: (ії) Аа, маї, ем та Пе; (ії) зег та ТАг; (ії) Ап та іп; (ім) Гуз та Аго; і (м) Туг та Ре.

Використовуваний у цьому документі термін "неконсервативні заміни" визначається як заміни амінокислоти іншою амінокислотою, зазначеною в іншій групі з шести стандартних амінокислотних груп (1)-(6), показаних вище.

Модифікації ферментів, як описано в даному документі, можуть включати консервативні та/або неконсервативні мутації.

У деяких варіантах здійснення винаходу залучають "раціональний дизайн" до конструювання специфічних мутацій у ферментах. Раціональний дизайн відноситься до включення знань про фермент або споріднених ферментів, таких як його термодинаміка й кінетика, його тривимірна структура, його активний (-ї) сайт (-и), його субстрат (-и) та/або взаємодія між ферментом і субстратом, до конструювання конкретної мутації. На основі раціонального підходу до конструювання можуть бути створені мутації в ферменті, який потім може бути підданий скринінгу на предмет збільшення продукції терпену або терпеноїду в порівнянні з рівнями вихідного штаму або метаболітного профілю, який відповідає за поліпшення стосовно вуглецю МЕР. У деяких варіантах здійснення винаходу мутації можуть бути раціонально розроблені на основі моделювання гомології. "Моделювання гомології" належить до процесу побудови моделі з атомним розрізненням білка з його амінокислотної послідовності з використанням тривимірної структури спорідненого гомологічного білка.

Амінокислотні модифікації можуть бути внесені в ферменти для збільшення або зменшення активності ферменту або ферментного комплексу. Генні мутації можуть бути виконані з використанням будь-якого методу внесення генетичної мутації, відомого в даній галузі. У деяких варіантах здійснення винаходу нокаут гена усуває продукт гена повністю або частково. Нокаути генів можуть бути виконані з використанням будь-якого способу нокауту, відомого в даній галузі.

Маніпуляції з експресією генів та/або білків, включаючи генні модулі, можуть бути досягнуті різними способами. Наприклад, експресія генів або оперонів може регулюватися за допомогою вибору промоторів, таких як індуцибельні або конститутивні промотори з різною силою (наприклад, сильні, помірні або слабкі). Декілька не обмежуючих прикладів промоторів включають Тгс, Т5 і Т7. Крім того, експресія генів або оперонів може регулюватися шляхом маніпулювання кількістю копій гена або оперонів у клітині. У деяких варіантах здійснення винаходу експресія генів або оперонів може регулюватися за допомогою маніпулювання порядком розташування генів у модулі, де гени, що транскрибуються першими, в основному експресуються на більш високому рівні. У деяких варіантах здійснення винаходу експресія генів або оперонів регулюється шляхом інтеграції одного або декількох генів або оперонів у хромосому.

У деяких варіантах здійснення винаходу балансування експресії генів включає відбір плазмід із високим числом копій або плазмід з однією копією, низьким або середнім числом копій. У ще інших варіантах здійснення винаходу етап термінації транскрипції також може бути спрямований на регуляцію експресії гена за допомогою введення або видалення структур, таких як шпилькові петлі.

Вектори експресії, що містять усі необхідні елементи для експресії, є комерційно доступними й відомі фахівцям у даній галузі. Див., е.9д., затргоок еї аіІ., Моіесшаг СіІопіпд: А Гарогаюгу

Мапиа!, бЗесопа Еаййоп, Со Зргіпд Нагрог Іарогаїогу Ргеб55, 1989. Клітини генетично конструюються шляхом введення в клітини гетерологічної ДНК. Для забезпечення експресування гетерологічної ДНК у клітині-хазяїні гетерологічну ДНК поміщають під оперативний контроль транскрипційних елементів.

У деяких варіантах здійснення винаходу ендогенні гени редагуються на відміну від комплементації генів. Редагування може модифікувати ендогенні промотори, послідовності зв'язування рибосом або інші послідовності контролю експресії, талабо в деяких варіантах здійснення винаходу модифікують транс-діючі та/або цис-діючі фактори в регуляції генів.

Редагування генома може здійснюватися з використанням методів редагування генома

СКІБРЕ/Са5 або аналогічних методів, які використовують нуклеази цинкового пальця й ТАГЕМ.

У деяких варіантах здійснення винаходу ендогенні гени замінюються шляхом гомологічної

Зо рекомбінації.

У деяких варіантах здійснення винаходу гени надекспресуються, принаймні частково, шляхом контролю кількості копій гена. Хоча кількість копій гена можна зручно контролювати з використанням плазмід із різною кількістю копій, також можна використовувати дуплікацію генів і хромосомну інтеграцію. Наприклад, процес генетично стабільної тандемної дуплікації гена описаний в О5 2011/0236927, який повністю включений у цей опис як посилання.

В окремих випадках здійснення винаходу бактеріальна клітина продукує одну або декілька терпенових або терпеноїдних сполук. Терпеноїд, який також називають ізопреноїдом, являє собою органічну хімічну речовину, отриману з п'ятивуглецевої ізопренової одиниці (С5).

Декілька не обмежуючих прикладів терпеноїдів, класифікованих за кількістю ізопренових одиниць, включають: гемітерпеноїди (1 ізопренова одиниця), монотерпеноїди (2 ізопренові одиниці), сесквітерпеноїди (3 ізопренові одиниці), дитерпеноїди (4 ізопренові одиниці), сестертерпеноїди (5 одиниць ізопрену), тритерпеноїди (6 одиниць ізопрену), тетратерпеноїди (8 одиниць ізопрену) і політерпеноїди з великою кількістю одиниць ізопрену. В одному варіанті здійснення винаходу бактеріальна клітина-хазяїн продукує терпеноїд, вибраний із монотерпеноїду, сесквітерпеноїдів, дитерпеноїду, сестерпеноїду або тритерпеноїду. Терпеноїди репрезентують різноманітний клас молекул, які забезпечують численні комерційні застосування, в тому числі в харчовій промисловості й виробництві напоїв, а також у парфумерній, косметичній та медичній промисловості. Наприклад, терпеноїдні сполуки знаходять застосування в парфумерії (наприклад, пачулол), в ароматичній промисловості (наприклад, нооткатон), як підсолоджувачі (наприклад, стевіол), барвники або терапевтичні агенти (наприклад, таксол), і багато які з них зазвичай екстрагуються з рослин. Проте, у природі молекули терпеноїдів виявлені на рівні м. д. і тому вимагають масового збирання, щоб отримати достатні кількості для комерційного застосування.

Бактеріальна клітина зазвичай містить рекомбінантний низхідний шлях, який продукує терпеноїд із попередників ІРР і ОМАРР. Терпени, такі як монотерпени (С10), сесквітерпени (С15), дитерпени (С20), сестертерпени (С25) і тритерпени (С30), отримують із субстратів пренілдифосфату, геранілдифосфату (СРР), фарнезилдифосфату (ЕРР), геранілгеранілдифосфату (СОРР), геранілфарнезилдифосфату (ЕОРР) і двох ЕРР, відповідно, під дією дуже великої групи ферментів, названих терпенові (терпеноїдні) синтази. Ці ферменти бо часто називають терпенциклазами, оскільки продукти реакцій циклізуються в різні продукти вуглецевого скелета: монотерпен, сесквітерпени, дитерпени, сестертерпени і тритерпени.

Багато з отриманих вуглецевих скелетів піддаються наступній оксигенації ферментами цитохрому Р450, що призводить до утворення великих родин похідних.

Типові терпенові або терпеноїдні продукти, які можуть бути отримані згідно 3 цим винаходом, описані в 5 8,927,241, який включений у цей опис як посилання, і включають: фарнезен, аморфадієн, артемізинову кислоту, артемізинін, бісаболол, бісаболен, альфа- сіненсал, бета-туйон, камфору, карвеол, карвон, цинеол, цитраль, цитронелаль, кубебол, гераніол, лімонен, ментол, ментон, мірцен, нооткатон, нооткатол, пачулі, піперитон, розеноксид, сабінен, стевіол, глікозид стевіолу (включаючи ребаудіозид Ю або ребаудіозид М), таксадієн, тимол і валенсен. Ферменти для рекомбінантного конструювання шляхів в Е. соїї описані в О5 8,927,241, МО 2016/073740 ї ММО 2016/029153, які включені в цей опис як посилання.

Типові ферменти Ра450, які діють на сесквітерпенові каркаси для продукування кисневмісних терпеноїдів, описані в МО 2016/029153, яка включена в цей опис як посилання. Крім того, білки редуктази Р450, які знаходять застосування в бактеріальних штамах, описаних у цьому документі, описані в М/О 2016/029153, а також в УМО 2016/073740.

Використовуваний тут термін "насичений киснем терпеноїд" стосується терпенового каркасу, який має одну або декілька подій оксигенації, які викликають утворення відповідного спирту, альдегіду, карбонової кислоти та/або кетону. У деяких варіантах здійснення винаходу бактеріальна клітина продукує принаймні один терпеноїд, вибраний із абієтадієну, абієтової кислоти, альфа-синензалу, бета-туйону, камфори, карвеолу, карвону, целастролу, церопластолу, цинеолу, цитралю, цитронелалю, кубеболу, кукурбітану, форсколіну, гаскаркадієвої кислоти, гераніолу, гаслену, левопімарової кислоти, лімонену, лупеолу, ментолу, ментону, могрозиду, нооткатону, нооткатолу, офіоболіну А, пачулі, піперитону, ребаудіозиду О, ребаудіозиду М, сабіну, стевіолу, стевіолглікозиду, таксадієну, тимолу та урсолової кислоти.

У деяких варіантах здійснення винаходу фермент терпеноїдсинтаза модернізується для покращення кінетики, стабільності, профілю продукту та/або температурної стійкості ферменту, як розкрито, наприклад, в МО 2016/029153 і УМО 2016/073740, які в цей документ включені як посилання.

В іншому варіанті здійснення винаходу бактеріальна клітина продукує валенсен та/або

Зо нооткатон. У такому варіанті здійснення винаходу бактеріальна клітина може експресувати шлях біосинтезу, який додатково включає фарнезилдифосфатсинтазу, валенсенсинтазу й валенсеноксидазу. Фарнезилдифосфатсинтази (ЕРР5) продукують фарнезилдифосфати з ізопентенілдифосфату (ІРР) і диметилалілдифосфату (ОМАРР). Прикладом фарнезилдифосфатсинтази є ЕКО20 Засспаготусе5 сегемізіае (МСВІ інвентарний номер

РО8524) і ізрА Е. соїї. Валенсенсинтаза продукує сесквітерпенові каркаси й описана, наприклад, в 05 2012/0107893, 05 2012/0246767 і 5 7,273,735, які тим самим повністю включені в цей опис як посилання. Гени і клітини-хазяї для продукування терпеноїдного продукту, що містить валенсен та/або нооткатон, описані в УМО 2016/029153, яка включена в цей опис як посилання.

В одному варіанті здійснення винаходу бактеріальна клітина продукує стевіол або стевіолглікозид (наприклад, КеБО або КермМ). Стевіол утворюється з каурену під дією двох ферментів Р4і50, кауреноксидази (КО) і гідроксилази кауренової кислоти (КАН). Після продукування стевіолу різні продукти стевіолглікозиду можуть бути отримані за допомогою ряду реакцій глікозилювання, які можуть відбуватися іп міго або іп мімо. Шляхи й ферменти для отримання стевіолу та глікозидів стевіолу розкриті в О5 2013/0171328, 005 2012/0107893, УМО 2012/075030, УМО 2014/122328, які повністю включені в цей опис як посилання. У У/О 2016/073740 додатково розкриваються ферменти і бактеріальні клітини-хазяї для продукування

Верм.

Інші шляхи біосинтезу для отримання терпенових або терпеноїдних сполук розкриті в О5 8,927,241, який повністю включений у цей опис як посилання.

Бактеріальний штам може культивуватися в періодичній культурі, безперервній культурі або напівбезперервній культурі. У деяких варіантах здійснення винаходу бактеріальний штам культивують із використанням періодичного процесу з підживленням, який включає першу фазу, де утворюється бактеріальна біомаса, з подальшою фазою продукування терпену або терпеноїду. Культура з підживленням являє собою процес, у якому поживні речовини подаються в біореактор під час культивування і в якому продукт (-и) залишаються в біореакторі до завершення циклу. Як правило, базове середовище підтримує вихідну клітинну культуру, а живильне середовище додається для запобігання виснаженню поживних речовин.

Контрольоване додавання поживної речовини безпосередньо впливає на швидкість росту культури й допомагає уникнути надмірного метаболізму й утворення побічних метаболітів.

Типове періодичне середовище для вирощування бактеріального штаму (продукування біомаси) включає, без обмеження, дріжджовий екстракт. У деяких варіантах здійснення винаходу вуглецеві субстрати, такі як вуглецеві субстрати С1, С2, С3, С4, С5 та/або Сб, подають у культуру для отримання терпенового або терпеноїдного продукту. У зразкових варіантах здійснення винаходу джерелом вуглецю є глюкоза, цукроза, фруктоза, ксилоза та/або гліцерин. Умови культивування зазвичай вибирають із аеробних, мікроаеробних і анаеробних.

У деяких варіантах культура підтримується в аеробних умовах або в мікроаеробних умовах.

Наприклад, при використанні процесу з підживленням фаза продукування біомаси може проходити в аеробних умовах із подальшим зниженням концентрацій кисню для фази продукування продукту. Наприклад, культура може бути переведена в мікроаеробні умови через від приблизно 10 до приблизно 20 годин. У цьому контексті термін "мікроаеробні умови" означає, що культури підтримуються при концентрації розчиненого кисню, яка трохи менше межі його виявлення. Див., Рагігідде 90, еї аї., Тгапзйоп ої ЕвсПегісніа соїї їот Аегобіс то Місто- аегобіс Сопайіопе Іпмоїмез Равзі апа біом/у Неасіїпд Ведшіаюту Сотропепів, у. Віої. Спет. 15. 282(15)11230-11237 (2007).

Фаза продукування включає підживлення джерелом азоту та джерелом вуглецю.

Наприклад, джерело азоту може містити амоній (наприклад, гідроксид амонію). Джерело вуглецю може містити джерела вуглецю С1, С2, С3, С4, С5 та/або Сб, такі як, у деяких варіантах, глюкоза, сахароза або гліцерин. Підживлення азотом та вуглецем може починатись, коли споживається задана кількість порційних середовищ, це процес, який забезпечує легке масштабування. У деяких варіантах здійснення винаходу швидкість підживлення азоту становить від приблизно 8 л на годину до приблизно 20 л на годину, але буде залежати частково від продукту, штаму та масштабу.

У різних варіантах здійснення винаходу бактеріальна клітина-хазяїн може культивуватися при температурі від 22 "С до 37 "С. У той час як комерційний біосинтез у бактерій, таких як Е. соїї, може бути обмежений температурою, при якій надекспресовані та/або чужорідні ферменти є стабільними, рекомбінантні ферменти (включаючи терпеноїдсинтазу) можуть бути сконструйовані так, щоб дозволити культурам підтримуватися при більш високих температурах, що призводить до більш високих виходів і більш високої загальної продуктивності. У деяких

Зо варіантах здійснення винаходу культивування проводять при температурі приблизно 22 "С або вище, приблизно 23 "С або вище, приблизно 24 "С або вище, приблизно 25 "С або вище, приблизно 26 "С або вище, приблизно 27 "С або вище, приблизно 28 "С або вище, приблизно 29 С або вище, приблизно 30 "С або вище, приблизно 31 "С або вище, приблизно 32 "С або вище, приблизно 33 "С або вище, приблизно 34 "С або вище, приблизно 35 "С або вище, приблизно 36 "С або вище або приблизно 37 "С. У деяких варіантах здійснення винаходу культуру підтримують при температурі від 22 до 37 "С або температурі від 25 до 37 "С, або температурі від 27 до 37 "С або температурі від 30 до 37 "С.

У деяких варіантах здійснення винаходу бактеріальний штам культивують у промисловому масштабі. У деяких варіантах здійснення винаходу розмір культури становить принаймні приблизно 100 л, або принаймні приблизно 200 л, або принаймні приблизно 500 л, або принаймні приблизно 1000 л, або принаймні приблизно 10000 л, або принаймні приблизно 100000 л, або принаймні приблизно 500000 л. У деяких варіантах здійснення винаходу культура становить від приблизно 300 л до приблизно 1000000 л.

У різних варіантах здійснення винаходу способи додатково включають вилучення терпенового або терпеноїдного продукту з клітинної культури або з клітинних лізатів. У деяких варіантах здійснення винаходу культура продукує принаймні приблизно 100 мг/л, принаймні приблизно 150 мг/л, або принаймні приблизно 200 мг/л, або принаймні приблизно 500 мг/л, або принаймні приблизно 1 г/л, або принаймні приблизно 5 г/л, або принаймні приблизно 10 г/л, або принаймні приблизно 15 г/л терпенового або терпеноїдного продукту.

У деяких варіантах здійснення винаходу продукування індолу використовується як імітаційний маркер для продукування терпеноїдів, та/або накопичення індолу в культурі контролюється для збільшення продукування. Наприклад, у різних варіантах здійснення винаходу накопичення індолу в культурі контролюється до концентрації нижче, ніж приблизно 100 мг/л, або нижче, ніж приблизно 75 мг/л, або нижче, ніж приблизно 50 мг/л, або нижче, ніж приблизно 25 мг/л, або нижче, ніж приблизно 10 мг/л. Накопичення індолу можна контролювати, врівноважуючи експресію (і, зокрема, врівноважуючи низхідний і висхідний шляхи) і активність ферменту, використовуючи багатопараметричний модульний підхід, як описано в патенті США 8,927,241 (який включений у цей опис як посилання). У деяких варіантах здійснення винаходу накопичення індолу контролюється хімічними засобами.

Інші маркери для ефективного продукування терпенів і терпеноїдів включають накопичення в культуральному середовищі ОХ або МЕ. Як правило, бактеріальні штами, описані в цьому документі, не накопичують великі кількості цих хімічних речовин, які накопичуються в культурі в кількості меншій, ніж приблизно 5 г/л, або меншій, ніж приблизно 4 г/л, або меншій, ніж приблизно З г/л, або меншій, ніж приблизно 2 г/л або меншій, ніж приблизно 1 г/л, або меншій, ніж приблизно 500 мг/л, або меншій, ніж приблизно 100 мг/л.

У деяких варіантах здійснення винаходу МЕСРР є переважаючим метаболітом МЕР у культуральному середовищі, хоча його накопичення обмежене генетичними модифікаціями бактеріального штаму, які переносять вуглець МЕР низхідного шляху до попередників ІРР і

ОМАРР. У різних варіантах здійснення винаходу МЕсРР накопичується в культурі до концентрації меншій, ніж приблизно 30 г/л, або меншій, ніж приблизно 20 г/л, або меншій, ніж приблизно 2 г/л, або меншій, ніж приблизно 1 г/л, або меншій, ніж приблизно 500 мг/л, або меншій, ніж 100 мг/л.

Не очікується, що оптимізація продукування терпену або терпеноїду шляхом маніпулювання генами шляху МЕР, а також маніпулювання низхідним і висхідним шляхами, не буде простим лінійним або адитивним процесом. Скоріше, завдяки комбінаторному аналізу, оптимізація досягається за рахунок балансування компонентів шляху МЕР, а також висхідного і низхідного шляхів. Накопичення індолу (включаючи пренильований індол) і накопичення метаболітів МЕР (наприклад, ОХ, МЕ, МЕСРР, НМВРР, фарнезолу, пренолу й ізопренолу) в культурі або клітинах можна використовувати як імітаційні маркери для керування цим процесом.

Терпеновий або терпеноїдний продукт може бути вилучений будь-яким придатним способом. Зазвичай вилучення включає відділення матеріалу, що містить продукт, від культури або клітин з наступною екстракцією й очищенням. Наприклад, вилучення може включати розділення бажаного продукту на органічну фазу або гідрофобну фазу. Альтернативно, для подальшої обробки може бути виділена водна фаза або може бути виділена вся клітинна біомаса.

Наприклад, у деяких варіантах здійснення винаходу продукт являє собою леткий терпеновий або терпеноїдний продукт. У таких варіантах здійснення винаходу терпеновий або терпеноїдний продукт може вилучатись із органічної або гідрофобної фази, яка механічно

Зо відокремлена від культури. Альтернативно або додатково, терпеновий або терпеноїдний продукт збирають із рідкої та/лабо твердої фази. У деяких варіантах здійснення винаходу продукт очищають шляхом послідовної екстракції й очищення. Наприклад, продукт може бути очищений шляхом хроматографічного розділення й вилучення, такого як надкритична флюїдна хроматографія. Продукт може бути очищений шляхом перегонки, включаючи просту перегонку, перегонку з водяною парою, фракційну перегонку, перегонку з проточною плівкою або безперервну перегонку.

У деяких варіантах здійснення винаходу продукт являє собою нелеткий терпеновий або терпеноїдний продукт, який у деяких варіантах здійснення винаходу являє собою позаклітинний продукт, вилучений із культурального середовища. Альтернативно, продукт являє собою внутрішньоклітинний продукт, вилучений із зібраного клітинного матеріалу. Коли продукт погано розчинний, його можна вилучати фільтрацією і необов'язково екстракцією розчинником (наприклад, екстракцією етанолом). Альтернативно або додатково, продукт вилучають шляхом хроматографічного розділення, такого як рідинна хроматографія. У деяких варіантах здійснення винаходу продукт вилучають шляхом послідовної екстракції й очищення. В інших варіантах здійснення винаходу продукт кристалізують із розчину.

Продукування бажаного продукту може бути визначено та/або кількісно визначено, наприклад, за допомогою газової хроматографії (наприклад, ГХ-МС). Виробництво продукту, вилучення та/або аналіз продукту можуть бути виконані, як описано в 05 2012/0246767, який повністю включений до даного документа як посилання. Наприклад, у деяких варіантах здійснення винаходу вироблену олію екстрагують із водного реакційного середовища з використанням органічного розчинника, такого як алкан, наприклад гептан або додекан, із подальшою фракційною перегонкою. В інших варіантах здійснення винаходу вироблену олію екстрагують із водного реакційного середовища з використанням гідрофобної фази, такої як рослинна олія, з подальшою екстракцією органічним розчинником і фракційною перегонкою.

Терпенові та терпеноїдні компоненти фракцій можуть бути кількісно виміряні за допомогою

ГХ/МС із подальшим змішуванням фракцій для отримання бажаного профілю продукту.

У різних варіантах здійснення винаходу вилучений терпен або терпеноїд вводять до продукту (наприклад, споживчого або промислового продукту). Наприклад, продукт може бути ароматичним продуктом, ароматизувальним продуктом, підсолоджувачем, косметичним 60 засобом, засобом для чищення, миючим засобом або милом, або продуктом для боротьби зі шкідниками. Наприклад, у деяких варіантах здійснення винаходу вилучений продукт містить нооткатон, і цей продукт являє собою ароматизатор для напоїв, жувальної гумки, цукерок, або смакову добавку, або продукт являє собою засіб від комах. У деяких варіантах здійснення винаходу окиснений продукт являє собою стевіол або глікозид стевіолу (наприклад, КерМ), який надається як підсолоджувач або включається в інгредієнти, ароматизатори, напої або харчові продукти.

Винахід, крім того, забезпечує способи виготовлення таких продуктів, як продукти харчування, напої, текстурні добавки (наприклад, крохмалі, волокна, камеді, жири і жироподібні продукти й емульгатори), фармацевтичні продукти, тютюнові вироби, нутрицевтичні продукти, засоби для гігієни порожнини рота й косметичні продукти, шляхом включення терпену або терпеноїдів, отриманих згідно з цим документом. Більш високі виходи таких видів, отриманих у варіантах здійснення винаходу, можуть забезпечити істотні переваги за вартістю, а також стійкість.

В інших аспектах винахід належить до бактеріальних клітин, таких як Е. соїї, що має одну або декілька генетичних модифікацій, які збільшують продукти попередників ІРР і ОМАРР. У різних варіантах здійснення винаходу бактеріальні клітини продукують ізопентенілдифосфат (ІРР) ії диметилалілдифосфат (ОМАРР) завдяки шляху МЕР та перетворюють ІРР і ОМАРР на терпеновий або терпеноїдний продукт низхідним шляхом синтезу. Низхідний шлях синтезу зазвичай являє собою рекомбінантний шлях і може включати пренілтрансферазу, одну або декілька терпенсинтаз і необов'язково один або декілька ферментів Р450 і ферменти редуктази

Р4і50 (наприклад, кожен з описаних вище). Наприклад, продукт може бути дитерпеном або дитерпеноїдом із послідовною дією рекомбінантної дитерпенсинтази типу ІІ (СіТРБ) на СОРР із подальшою дією рекомбінантної рітТРБ5 типу І, або, альтернативно, одна рекомбінантна синтаза виконує обидві стадії.

Крім того, щоб поліпшити доступність вуглецю МЕР для біосинтезу продукту, бактеріальний штам має одну або декілька з наступних генетичних модифікацій: (а) надекспресія ферментів І5ро і ІєрН, причому ферменти Іх5ро і ІєрН мають збалансовану експресію, щоб запобігти накопиченню проміжної сполуки НМВРР, (Б) рекомбінантний або модифікований ген, що кодує фермент, який посилює постачання та/або перенос електронів через шлях МЕР та/або до терпенових або терпеноїдних продуктів, який необов'язково забезпечується надекспресією гена Марк і необов'язково з ненативним гомологом їадх та/або ПаА, (с) інактивацію або делецію, або знижену експресію або активність ферментного комплексу асеє або асеЕ, та необов'язково (4) рекомбінантний або модифікований ген іді для налаштування активності для підвищеного продукування терпену або терпеноїду.

Гени можуть надекспресуватись шляхом комплементації з рекомбінантними генами, або ендогенні гени можуть бути модифіковані для зміни експресії, як розкрито в іншому місці цього документа.

Бактеріальний штам є бактерією, вибраною з ЕвспПегісніа 5рр., Васіїив5 5рр., Согупебасіветт 5рр., КПподорасіег 5рр., 2утотопа5з 5рр., Мібгіо 5рр. і Рз5епдотопа5 б5рр. Наприклад, бактеріальний штам є бактерією, вибраною з видів ЕвсПегісніа соїї, Васійи5 в5ибБійів,

Согупебасієгішт аішатісит, АВНодорасієї сарзціайве, ВПодобрасієї зрпаєгоїде5, 7утотопав5 торбіїїв, Мібгіо пайіедепе або Реєепдотопаз риїйда. У деяких варіантах здійснення винаходу бактеріальний штам є Е. соїї.

У різних варіантах здійснення винаходу при культивуванні НМВРР не накопичується більше, ніж приблизно 10 мг/г ОСМУМ, або в деяких варіантах здійснення винаходу не накопичується більше, ніж приблизно 8 мг/г ОСМУМ, або в деяких варіантах здійснення винаходу не накопичується більше, ніж приблизно 5 мг/г ОСМУ, або в деяких варіантах здійснення винаходу не накопичується більше, ніж приблизно 4 мг/г ЮСМУ, або в деяких варіантах здійснення винаходу не накопичується більше, ніж приблизно 2 мг/г ОСМУ. У деяких варіантах здійснення винаходу НМВРР не накопичується більше, ніж приблизно 1 мг/г ОСМУ або не накопичується більше, ніж приблизно 0,5 мг/г ОСМУ, або більше, ніж приблизно 0,2 мг/г ОСМУ, або більше, ніж приблизно 0,1 мг/м ОСУМУ.

У деяких варіантах здійснення винаходу бактеріальний штам експресує ахв, ірбО, іврЕ та іді як рекомбінантні гени (наприклад, як комплементація ферментам шляху МЕР дикого типу), які необов'язково експресуються як оперон. У деяких варіантах здійснення винаходу бактеріальний штам експресує ахв, ахг, ізрО, ізрЕ, ізрЕ та іді як рекомбінантні гени, які необов'язково експресуються як 1, 2 або З окремі оперони. Рекомбінантні гени шляху МЕР експресуються з 60 однієї або декількох плазмід або інтегруються в хромосому, і експресії збалансовані для поліпшення надходження вуглецю до МЕР. Зокрема, бактеріальна клітина може продукувати

МЕСРР як переважаючий метаболіт МЕР у позаклітинне середовище.

Рекомбінантні гени І5ро та І5рН можуть містити одну або декілька корисних мутацій або можуть являти собою ортологи Із5ро або і5рН з поліпшеними властивостями або активністю, як описано в даному документі. Крім того, в різних варіантах здійснення винаходу експресія рекомбінантного ІєрН є вищою, ніж експресія рекомбінантного Ієро, що необов'язково може бути досягнуто, принаймні частково, шляхом позиціонування в опероні ігрН перед ігра. Таким чином, бактеріальний штам може експресувати ізрН та ізраї з одного і того самого оперона (з і6рН, розташованим першим) і під контролем сильного промотора. Рекомбінантні гени І5ро та

ІєрН експресуються з плазміди або інтегруються до хромосоми.

У деяких варіантах здійснення винаходу бактеріальний штам експресує рекомбінантний ген іді, який налаштований для збільшення продукту, необов'язково шляхом модифікації сили промотора, числа копій гена, положення в опероні або сайта зв'язування рибосоми.

У деяких варіантах здійснення винаходу бактеріальний штам експресує рекомбінантний ген

УарК, який інтегрований у хромосому або експресується з плазміди. Бактеріальний штам може додатково включати надекспресію одного або декількох із флаводоксину, флаводоксинредуктази, фередоксину та фередоксинредуктази, наприклад фередоксину

Сіовігідіит разівшіапит (Ср.їах). У деяких варіантах здійснення винаходу штам експресує один або декілька ненативних гомологів йіх та/або ПА. Як приклад, гомолог їх може бути вибраний із Нт.ах! (Неїорасієгйт /тодаевіїса(йит), Ра Бах (Реепдотопаб5 аєгидіпоза), Смлах (АПоспготаїййшт міповит), Салах (Сіозіідійт асеюбршуїїсит), Ср.Тахигіві (Сіовігівї Сіов5і). Ем2 ах (Есіоїйпіотоадозріга зпарознНпіКомії), Рр1 лах (Рзендотопах риїйда) і Рр2 лах (Рзендотопах риїда).

У деяких варіантах гомолог ПдА включає один або декілька компонентів, вибраних із Ес.ЛаА (Е. соїї), Ас Лада (Аг2оїобасієг спгоососсит), Ам. Лада (Аг2оїобасієг міпеїапаійї) ії Вз ЛА (В. вишів).

У деяких варіантах гомологи йіх містять послідовність, яка приблизно на 60 95 ідентична будь-якій із послідовностей 5ЕО ІЮ МО. 10 і 15-24. Наприклад, ненативні гомологи їх можуть містити послідовність, яка принаймні приблизно на 6095, принаймні приблизно на 70 95, принаймні приблизно на 80 95, принаймні приблизно на 90 95, принаймні приблизно на 95 95, принаймні приблизно на 97 95, принаймні приблизно на 98 95, принаймні приблизно на 99 95 або

Зо 100 95 ідентична будь-якій із послідовностей 5ЕО ІЮ МО. 10 і 15--24.

У деяких варіантах здійснення винаходу гомологи ДА містять послідовність, яка приблизно на 60 95 ідентична будь-якій із послідовностей 5ЕО І МО. 25-28. Наприклад, ненативні гомологи ЯЯА можуть містити послідовність, яка принаймні приблизно на 60 95, принаймні приблизно на 70 95, принаймні приблизно на 80 95, принаймні приблизно на 90 95, принаймні приблизно на 95 95, принаймні приблизно на 97 95, принаймні приблизно на 98 95, принаймні приблизно на 99 95 або 100 95 ідентична будь-якій із послідовностей 5ЕО ІЮ МО. 25-28.

У деяких варіантах здійснення винаходу бактеріальний штам має надекспресію або комплементацію з одним або декількома РЕОЖК та/або їрг і, необов'язково, одним або декількома з флаводоксину (ПЯА), флаводоксинредуктази, фередоксину (їх) Ф« фередоксинредуктази. Як приклад, у деяких варіантах здійснення винаходу бактеріальний штам включає Ес.удпМ (Е. Соїї) (ЗЕО ІЮО МО: 33) і Ес.уанм (Е. Соїї) (ЗЕО ІЮ МО: 34); Ес.удькК (Е. Соїї) (ЗЕО ІЮО МО: 9) і Ср.Кіх (Сіозійаіт разівшгіапит) (ЗЕО ІЮО МО: 10); Ес.рг (Е. Соїї) (ЗЕО І МО: 38) і Ес.їах (Е. Соїї) (ЗЕО ІЮ МО: 21); або Ес.рг (Е. Соїї) (ЗЕО ІЮ МО: 38) і Ес.ЛаА (Е. соїї) (ЗЕО ІЮ

МО: 27).

У деяких варіантах здійснення винаходу бактеріальний штам надекспресує або комплементує з одними або декількома РЕОК або їх гомологом. Наприклад, у деяких варіантах здійснення винаходу РЕОЕ вибрано з Маьк (5ЕО ІЮ МО: 9), Зсу.ргог (Бупеспосувії5 5р.) (ЗЕО ІЮ

МО: 29), Кі.ргог (Кісумега іпіегптедіа) (5ЕО 10 МО: 30), ба.ріог (Оезиїомірго аїісапив) (ЗЕО ІЮ

МО: 31), Ме5.ріог (Мовіос 5р.) (ЗЕО ІО МО: 32), Ес. уанМ (Е. Сої) (5ЕБЕО ІО МО: 33), Са.ріог (СіПатейЦйа арісоїа» (ЗЕБО ІО МО: 35), ії Зсо.ріог (Зупеспососси5 5зр.). У деяких варіантах здійснення РЕОЕ є чУаьк.

У деяких варіантах здійснення винаходу надекспресія або комплементація з РЕОК, такого як, наприклад, Харк, може призводити до поліпшення продуктивності за рахунок експресії носіїв 60 електронів, що мають окиснювально-відновний потенціал від приблизно 400 до 550 мВ або, в деяких варіантах здійснення винаходу, в діапазоні від приблизно 400 до 500 мВ або в діапазоні від 400 до 475 мВ. У деяких варіантах здійснення винаходу носієм електронів є феродоксин, флаводоксин або МАЮРН. Наприклад, у деяких варіантах здійснення винаходу носієм електронів є См.ах (АПоспготайит міпозит).

У деяких варіантах здійснення винаходу бактеріальний штам має надекспресією або комплементацією з одним або декількома гомологами їрг. Наприклад, у деяких варіантах винаходу гомолог їрг вибраний із Мз5.Трг (Мовіос 5р.) (ЗЕО І МО: 36), 5со.рг (Зупеспососсиз вр.) (ЗЕО ІО МО: 37) та Ес. рг (Е. Соїї) (ЗЕО ІО МО: 38).

У деяких варіантах здійснення винаходу Е. соїї містить делецію одного або декількох генів, вибраних з: рагЕ, трраА, упаї, іп5Н-4, упау, и5рЕ, їпг, оді, араТ, абов, абдА, аровВ, тсаб, івгА, 5тгА, удам, удам, їттг5, С0о343, аррА, ВЕР 15, КСА, іпІВ, удас, удас, гаїА, га!ІВ, гест, гесЕ, гасс, удає та КІВ.

Експресія рекомбінантного рдорВ та/або пиаВ може бути налаштована для забезпечення вищого титру продукту, необов'язково шляхом зміни сили промотора, числа копій гена, положення в опероні та/або сайта зв'язування рибосоми. У деяких варіантах здійснення винаходу рекомбінантні рарВ та/або пав експресуються під контролем слабкого промотора або промотора помірної сили. Рекомбінантний рорВ або пиавВ інтегрується в хромосому або експресується з плазміди.

У різних варіантах здійснення винаходу бактеріальний штам продукує терпен або терпеноїдний продукт, який містить принаймні один з наступних: аморфадієн, артемізинову кислоту, артемізинін, бісаболол, бісаболен, альфа-синензал, бета-туйон, камфору, карвеол, карвон, цинеол, цитраль, цитронелаль, кубебол, фарнезен, гераніол, лімонен, ментол, ментон, мірцен, нооткатон, нооткатол, пачулі, піперітон, розеноксид, сабінен, стевіол, глікозид стевіолу

Зо (включаючи ребаудіозид О або ребаудіозид М), таксадієн, тимол і валенсен.

Аспекти й варіанти здійснення винаходу додатково демонструються нижче з посиланням на наступні приклади.

ПРИКЛАДИ

Приклад 1. Налаштування експресії Ігро/І5рн

Висновки

Надекспресія та балансування генів шляху МЕР можуть призводити до більшої кількості вуглецю, що надходить до шляху МЕР, і можуть переміщувати цей вуглець у "низхідному" напрямку від СОХР ії МЕР до МЕсРР. Зміна експресії ієрсо та/або ієрН може додатково перетворювати МЕСРР на НМВРР і на ІРР.

Фактично, збільшення експресії як і5ро, так і ізрН значно збільшувало титри терпенових і терпеноїдних продуктів. Проте збільшення експресії тільки ігро або ієрН саме по собі не покращувало титр. Надекспресія одного тільки іхрОо призводила до дефектів росту, а надекспресія одного тільки ізрН істотно не покращувала титр, але перетворювала НМВРР на

ІРР. Ефекти надекспресії ігро можуть бути пов'язані із спостереженням того факту, що НМВРР не виявляється позаклітинно, але виявляється на 100 95 внутрішньоклітинно. Оскільки ця молекула, мабуть, не транспортується з клітини, вона може діяти як молекула зворотного зв'язку, забезпечуючи різку зупинку на шляху МЕР. Наприклад, якщо пул НМВРР перевищує певний розмір, то шлях припиняє роботу. Альтернативно або додатково, НМВРР може бути токсичним при певних рівнях, що узгоджується із спостереженням впливу надекспресії Ієро на ріст клітин.

Таким чином, баланс активності між ізро і ігрН важливий для запобігання дисбалансу й накопичення НМВРР. У деяких ситуаціях менше означає більше; тобто найсильніша надекспресія генів МЕР може почати знижувати продуктивність.

Таким чином, надекспресія і5ро і ізрН разом, коли один або обидва з іхро або і5рнН є дикими або мутованими/сконструйованими, у правильно збалансованій конфігурації запобігає накопиченню й токсичності НМВРР і проводить вуглець через шлях МЕР до ІРР, ОМАРР і наступні терпенові й терпеноїдні продукти.

Опис експериментальних результатів

На фіг. 2 показано, що збільшення експресії одного І5рН або разом І5рН їі Ієро покращує бо титри терпеноїдних продуктів у виробничих штамах, які вже сконструйовані для збільшення кількості вуглецю, що надходить до шляху МЕР, але тільки один ізхро знижує продуктивність. У цьому прикладі контрольним штамом є штам Е. соїї зі збалансованою надекспресією генів шляху МЕР (але без додаткових копій ігр або ізрН), який збільшує кількість вуглецю, що надходить до шляху МЕР. Як показано, надекспресія Ієро знижує титр продукту приблизно на 1595, у той час як надекспресія І5рН при тій самій силі експресії збільшує титр продукту на 17 95. Надекспресія І5ро і ІрН більш ніж у три рази збільшує титр продукту.

Дані також показують, що співвідношення ізхро/5рн з переважанням до більшої кількості ферменту Н, призводить до ще більшого поліпшення проходження через шлях МЕР у порівнянні зі штамом, що забезпечує переважання на бік іхро цього співвідношення. І5ро і ігрнН експресуються тут в форматі оперона, і, таким чином, другий ген в опероні матиме нижчий рівень експресії, ніж перший. Таким чином, оперон і5рН/5ро показав значно більший титр продукту, ніж ігро/5рн.

Ієро їі іїігрН працюють послідовно для перетворення МЕСРР на НМВРР, а потім на ІРР.

Збільшення іхро призведе до накопичення більшого пулу НМВРР, у той час як збільшення із5рн призведе до зменшення пулу НМВРР при його перетворенні на ІРР. Той факт, що Ізро сам по собі знижує продуктивність, у той час як тільки і5рН збільшує її, переконливо свідчить про те, що накопичення НМВРР має негативний вплив зворотного зв'язку на шлях МЕР. Коли і Ізро, і ІєрнН надекспресуються, ми збільшуємо швидкість утворення та споживання НМВРР, що значно покращує проходження через шлях МЕР до цільового терпеноїду. Проте, навіть у цьому посиленому режимі надходження баланс Ізро і І5рН є важливим, оскільки невелика перевага іерН у порівнянні з ігро може додатково підвищувати продуктивність на 25 95, майже в 4 рази перевищуючи титри батьківського штаму з експресією дикого типу І5ро і І5рн.

Збільшення експресії Іро та/або І5рН у модифікованих виробничих штамах із поліпшеними шляхами МЕР впливає на шаблон розподілу продуктів МЕР (Фіг. 3). Більшість продуктів -- це роХ, МЕ їі МЕСРР (Фіг. 3, верхня панель), з наступними БОХР і МЕР (Фіг. 3, середня панель), і

НМВРР (Фіг. З, нижня панель)» На цих панелях загальна кількість позаклітинних і внутрішньоклітинних метаболітів екстрагується з культур (бульйон плюс клітини), так що зазначена концентрація відповідає об'єму екстракту.

Збільшення тільки І5ро або І5рН збільшує швидкість перетворення МЕСРР і зменшує розмір

Зо пулу (верхня панель), навіть незважаючи на те, що І5рН збільшує титр продукту, а Ігро знижує титр продукту. Проте значна різниця між цими двома варіантами очевидна за концентрацією

НМВРР (нижня панель), де тільки один І5ро збільшує її в 2,5 рази в порівнянні з контролем, у той час як один І5рН знижує її на 20 95. Це накопичення НМВРР може бути зворотним зв'язком на шляху МЕР і зупиняти посилення надходження. НМВРР накопичується на дуже низьких рівнях (концентрація нМ), і 100 95 його виявляється внутрішньоклітинно.

Можна помітити, що збільшення експресії ігр і ієрН у будь-якому порядку в опероні дозволяє повністю перетворювати залишковий БОХ і зменшує розмір пулу МЕ. Крім того, співвідношення І5ро/І5рН із переважанням більшої кількості І5рН, здатне поліпшити конверсію

МЕСРР (і поліпшити титр продукту) в порівнянні зі штамом із збільшеним І5ро.

Пропорція кожного окремого метаболіту МЕР, виявленого всередині або зовні клітини ("Іпіга" проти "Ехіга"), показана на фіг. 4. Ці значення не відображають абсолютну кількість, як показано на фіг. 3, загалом набагато більше ОХ, ніж НМВРР. У той час як ОХ є на 100 95 позаклітинним, НМВРР є на 100 95 внутрішньоклітинним. Штам, представлений на даному графічному зображенні, є найбільш ефективним штамом "Контроль « і5рн/5ро" на Фіг. 2 і 3. рОХР/рОХ, МЕР/МЕ і МЕСсСРР практично повністю накопичуються в позаклітинному середовищі, тоді як СОР-МЕ, СОР-МЕР, НМВРР, ІРР/ОМАРР і БЕРР спостерігаються на 100 95 внутрішньоклітинно. Відсотковий вміст кожного метаболіту, виявленого внутрішньоклітинно, показано у верхній частині графіка.

Некомпенсована активація ізро викликає значне зниження росту клітин, що визначається завдяки УФ-поглинанню при 600 нм (Фіг. 5). Хоча деякі зміни в кінцевій щільності клітин спостерігаються на штамі, компенсованому за і5рН або разом і5рн і іхро, проте ці зміни не є значними.

Щоб визначити накопичення НМВРР, НМВРР можна виразити за показником сухої маси клітин (ОСУМ). Наприклад, використовуючи штам із збалансованою експресією ірон:

ІНМВРРІ - 0,42 мкг/мл у 0,35 мл відібраної культури

ІООб6001І - 12,69

Допущення: 1 00600-0,4 Г-ОСУМ/л - 0,4 мг-ОСУМ/мл

Вихід НМВРР - (0,42 мкг/мл) " (0,35 мл)| / (12,69 7 0,4 мг-ЮСМу/мл) " 0,35 мл))

У цьому прикладі НМВРР-0,0827 мкг/мг ОСММ або 0,0827 мг/г ОСМУ. бо Приклад 2. Надекспресія рорВ і пиав

Висновки

Улаштування альтернативного пулу "продукту" за допомогою надекспресії генів, таких як рорВ ії пиав, може викликати ще більше проходження через шлях МЕР (хоча і до нецільових продуктів) або навіть замінити різні низхідні шляхи терпеноїдів з метою створення інструмента для розробки "універсального базису" (тобто штаму, у якому може бути будь-який терпеноїдний низхідний шлях перетвореним на цей шлях і який швидко оптимізувати для комерційного виробництва).

Вуглець може бути проведений через шлях МЕР для утворення альтернативних продуктів, які будуть накопичуватися поза клітиною. РарРВ дефосфорилює ЕРР у фарнезол (ЕБОН) і пиав дефосфорилює ІРР і ОМАРР в ізопренол (3-метил-3-бутен-1-ол) і пренол (3-метил-2-бутен-1-ол) відповідно. Посилення транспорту цих продуктів за межі клітини запобігає накопиченню ІРР,

ОМАРР і ЕРР; які, як ії НМВРР, можуть здійснювати зворотний зв'язок і здійснювати контроль шляху МЕР. ІРР пригнічує ріст і за зворотним зв'язком інгібує ЮОх5. Див. Согаовба, Заїті 8 ГГ еоп (2009) 9). Ехр. Вої. 60, 10, 2933-2943. Зворотній зв'язок ЕРР інгібує комплекс І5рЕ-МЕР, який утворюється сам по собі, коли зв'язується МЕР і посилює активність (ре способом прямого зв'язку. ВЦОК 8 Меуеєг5 (2012) АС5 Спет. Віої. 2012, 7, 1702-1710. Ці продукти накопичуються поза клітиною і, подібно до проміжних продуктів на шляху МЕР, можуть бути використані для відстеження С-проходження через шлях МЕР за допомогою кількісного визначення метаболоміки методом РХ/МС.

Шляхом конститутивної експресії додаткової копії роурВ можна поліпшити проходження вуглецю через шлях МЕР і покращити фенотип повільного росту в штамі, у якому надекспресуються гени МЕР, але немає додаткового низхідного шляху, щоб проводити весь цей вуглець через шлях у продукт. По суті, низхідного "пул" зазнає перетворення ЕРР у фарнезол, який експортується за межі клітини. Аналогічно, конститутивна експресія пив повинна призводити до того, що пули ІРР і ОМАРР все частіше перенаправляються на позаклітинні продукти ізопренолу та пренолу.

Подальша модуляція рівнів експресії генів шляху МЕР у присутності надекспресованих рарв або пав може значно впливати на проходження МЕР і розподіл вуглецю через цей шлях.

Збільшення або зменшення кількості продукту фарнезолу, пренолу або ізопренолу може

Зо обернено корелювати з рівнем МЕсСРР.

Опис експериментальних результатів

Надекспресія РорВ може потроїти титри фарнезолу в штамах, сконструйованих для посилення проходження через шлях МЕР, але без встановленого низхідного шляху терпеноїдного продукту (Фіг. 6). Контрольний штам має додаткові копії ахв, ах", іро, іврЕ, і5рЕ, івраї, ієрН та іді при різних рівнях конститутивної експресії, а також має надекспресію МаЬК (приклад 4). У контролі накопичуються помірні кількості фарнезолу, імовірно, як "перетікання" через занадто велике накопичення ЕРР, який створює зворотній зв'язок на цьому шляху, і контроль зазнає помітно більш повільного зростання в порівнянні з диким типом. Коли РорВ надекспресується в цьому штамі, надлишок ЕРР більш ефективно перетворюється на фарнезол (запобігаючи контролю зворотного зв'язку), і потік ефективно проводиться через шлях МЕР.

Проте занадто велика експресія РорВ (умова «ж---х), мабуть, негативно впливає на загальне проходження через фарнезол, при цьому в середньому спостерігається більш низький титр і менш кратна зміна. Деякі потенційні причини цього результату включають: (1) занадто сильний потік від РорВ підриває здатність шляху МЕР підтримувати попит на ЕРР, особливо від необхідних конкуруючих продуктів; або (2) оскільки відомо, що РарВ дефосфорилює декілька мішеней іп мімо, включаючи незамінний мембранний фосфоліпід, високий рівень експресії РаорвВ може мати неочікувані негативні наслідки для здорового стану клітини.

Збільшення й налаштування експресії Ієро" та/або І5рН у штамі, який продукує фарнезол, може поліпшити титр продукту (Фіг. 7). У цьому прикладі фермент І5ро" являє собою сконструйовану версію з більш високою активністю, ніж у дикого типу. Контрольний штам має додаткові копії ахв, ахг, ізро, і5рЕ, ізрЕ, ізра, і5рН та іаі, а також додаткові копії МаБкК і рорвВ.

Додаткові копії ігрН та/або ізра" інтегрують у штами при збільшенні сили промотора (жк, ж, зя).

При надекспресії І5рН (Фіг. 7, панель А) значної зміни титру продукту не спостерігається.

Хоча збільшення кількості ІБрН здається має поліпшити перетворення НМВРР на ІРР, не існує додаткового Ір", щоб забезпечити цей додатковий НМВРР. Пул МЕСРР, опосередкований активністю ІєрО, стає обмежуючою швидкість стадією на цьому шляху. Проте, коли Іб5ро" надекспресується додатково до І5рН (Фіг. 7, панель В), ми бачимо значне збільшення титру продукту фарнезолу. У цій ситуації додатковий НМВРР, доступний завдяки додатковій копії

Ієро", швидко перетворюється на ІРР за рахунок підвищеного рівня І5рН, запобігаючи накопиченню НМВРР і зворотньому зв'язку на цьому шляху.

Зрозуміло, що баланс між Ієро і ІєрН є дуже важливим. Дані показують, що І5ро/Н має експресуватися у форматі оперона так, що другий ген в опероні матиме нижчий рівень експресії, ніж перший. Коли порядок генів в опероні для і5ро" і і;рН міняється (тобто ізрНяі5ро" замість ієро" ж ібрН) і, таким чином, змінюється співвідношення експресії Ієро/5рН, ми бачимо протилежні тенденції даних. Коли співвідношення схиляється на користь І5рН у порівнянні з

Ієро" (В), збільшення сили промотора призводить до невпинного збільшення титру продукту.

Проте, коли співвідношення схиляється на користь Із5ро" у порівнянні з І5рН (С), надлишок

НМВРР, який може бути створений цим незбалансованим шляхом, постійно накопичується по мірі збільшення сили промотора, що призводить до все меншого поліпшення щодо продукту і уповільнення росту.

Збільшення титру продукту фарнезолу може супроводжуватися зменшенням розміру пулу

МЕСРР, хоча це залежить від співвідношення і5ро і І5рН (Фіг. 8). Як видно на Фіг. 7, додаткові копії Ір" ії ІзрН у штамах, які продукують фарнезол, можуть підвищувати титр продукту фарнезолу до 2,5 разів. Коли активується тільки І5рН без додаткового І5ро (Фіг. 8, панель А), то титр значно не змінився, як не змінився і МЕСРР. МЕСРР дійсно знижується помірно, ймовірно, через те, що МЕСРР проводиться низхідним шляхом, оскільки НМВРР більш ефективно перетворюється на ІРР за допомогою додаткового ферменту ІзрН. Коли ІзрН експресувався відносно більше, ніж І5ро" (фіг. 8, панель В), то по мірі збільшення сили промотора титр продукту фарнезолу збільшувався. МЕСРР навпаки зменшується, оскільки він споживається збалансованим шляхом, який розподіляє проходження до бажаного кінцевого продукту.

Проте, навіть не зважаючи на неоптимальне співвідношення, яке схиляється на користь

Івро" у порівнянні з ІгрН, може поліпшитися перетворення МЕСРР на ІРР через НМВРР і поліпшитися титр продукту фарнезолу, у кінцевому підсумку дисбаланс стає занадто серйозним для утримання штамом Е. сої, і поліпшення щодо продукту зникає, оскільки ще більше МЕСРР накопичується й потрапляє в проміжний вуглецевий пул шляху МЕР.

Приклад 3. Налаштування експресії Іді

Висновки

Зо Фермент Іді каталізує оборотну ізомеризацію ІРР на ОМАРР. Оскільки кожен бажаний терпеноїдний продукт або небажаний побічний продукт МЕР (наприклад, ОРР) використовує один ОМАРР ії різну кількість ІРР, співвідношення між цими двома попередниками може завдавати фундаментального впливу на продуктивність штаму. Наприклад, 1 ЕРР-1 ОМАРР42

ІРР, тоді як 1 ОРР-1 ЕРР--8 ІРР (або 1 ОМАРР--10 ІРР). Отже, оптимальне співвідношення для

ЕРРБЗ для продукування ЕРР складає 2:11 ІРР:ЮОМАРР, але 10:11 для ОРР. Таким чином, варіювання співвідношення ІРРЮОМАРР шляхом варіювання експресії іді впливатиме на продукування бажаного терпеноїду в порівнянні з іншими небажаними продуктами з шляху

МЕР.

Опис експериментальних результатів

Іді комплементували в різні штами, які продукують продукт А або В. Клітини культивували в 9б-лункових культуральних планшетах при 37 "С протягом 48 годин при 280 об/хв у спеціально розробленому середовищі з глюкозою як джерелом вуглецю. ді експресували з рвВАС під контролем ІРТО-індуцибельного промотора. Штам 1 вже має надекспресію ахв, ахг, івро, ів5рЕ, і5рЕ, іді, ЕРРЗ ї Мак, у той час як штами 2 і З додатково отримують ізрН і мутантну версію

ІбєроО, яка надекспресується додатково. Навпаки, штам 4 має ті ж самі ферменти, які надекспресуються, але в іншому режимі експресії.

У той час як надекспресія Іді збільшує титр продукту в штамі, який не надекспресує і5рон, вона знижує титр у двох штамів з такою надекспресією, що вказує на те, що баланс між ІРР і

ОМАРР, контрольований ді може бути налаштований на підвищення або зниження в залежності від потреб низхідного шляху (Фіг. 9). Проте, штам 4 більш ніж удвічі збільшує титр за допомогою комплементації іді У цьому штамі надекспресуються такі ж самі гени, але баланс між експресією генів МЕР дуже різний.

Приклад 4. Надекспресія ак

Висновки

Прогнозується, що Маьк діє як піруват:рлаводоксиноксидоредуктаза та/або піруватсинтаза.

Вважається, що оксидоредуктаза окиснює піруват до ацетил-СоОА, відновлюючи фередоксин, який потім може постачати електрони на шлях МЕР, особливо для підтримки сильно активованих ферментів І5ро і І5рн, які містять кластери Ре-5. Надекспресія УаЬК була показана при продукуванні водню (Нг) (АКніаг МК 5 допез РЕ (2014), Сотасюг епдіпеетгіпа їог еппапсіпд їе

Пих ої теїароїїс раїйжау5." Егопіг5 іп Віоепод. апа Віоїесп.), але не при продукуванні терпеноїдів.

У цих штамах титр продукту терпенового продукту А подвоєний. Кластери Бе-5 краще підтримуються додатковим кофактором УарК, і їх активність поліпшується. Титр продукту підвищується, і коли визначається профіль метаболітів МЕР, ми бачимо підвищену конверсію

МЕСРР, подібно до того, що спостерігається, коли до контрольного штаму додатково додається ще одна копія оперона і5рН-івра".

З іншого боку, коли штам продукту В, який не мав надекспресії ІрО/Н щодо дикого типу (МУТ), був доповнений ХаБК, титр продукту В знизився. Коли співвідношення І5ро/Н було збільшено в цьому штамі, комплементація ак дійсно поліпшила титр продукту В, вказуючи на те, що експресія МаЬК повинна бути ретельно збалансована з експресією Ізро/Н (яка, у свою чергу, повинна бути ретельно збалансована на співвідношення Н/б).

Додатково, щоб побачити, чи можливо нам далі поліпшити титри, на додаток до надекспресії МаЬК були додані додаткові кофактори, які несуть або переносять електрони. У деяких експериментах МаЬК плюс їх (фередоксин) із Сіовігдішт рабвівшіапит дещо покращували продуктивність.

Опис експериментальних результатів

Додаткова копія гена УдБЬК Е. соїї інтегрується в хромосому або експресується на плазміді (зокрема, в однокопійній рРВАС або в багатокопійних плазмідах) під контролем конститутивних або індуцибельних промоторів. Додатково, копії нативних або ненативних рекомбінантних акцепторів/донорів електронів також можуть надекспресуватись разом з ХарвК, щоб отримати вигоду та найбільш ефективно використовувати додаткові електрони, надані для біосинтезу.

Експресування додаткової копії МаБК при збільшенні сили промотора може поліпшувати продукування терпеноїдів. У цьому прикладі контрольний штам продукує терпеноїдний продукт

А та має додаткові копії генів ах5, ахг, іро, і5рЕ, і5рЕ, і5ро", ірН та іді шляху МЕР при певній конститутивній експресії.

У цьому штамі додавання додаткової копії ієрН і Ієрі" в форматі оперона (так що співвідношення Н/" схиляється до Н) додатково більше збільшує титр продукту А, вказуючи на те, що ці стадії є лімітуючими (Фіг. 10, панель А). Збільшення кількості цих генів, що містять

Зо кластер ГРе-5, явно збільшує конверсію МЕСРР і знижує його концентрацію, що спостерігається в культурі (Фіг. 10, панель С).

Коли ХаьК комплементується в контрольному штамі, ми бачимо прогресивну відповідь на підвищення регуляції, де збільшення експресії призводить до збільшення продукції терпеноїдів до певного моменту, коли перехід до більш сильної експресії призводить до зниження на 50 95 продукту А в штамі МаьЬкК ж---- (Фіг. 10, панель В). Ми бачимо те ж саме перетворення МЕсСРР, що відбувається для цих штамів (Фіг. 10, панель О), припускаючи, що УаБК підтримує посилену активність Ієро та/або І5рН. Слід зазначити, що профіль метаболітів МЕР у штамів - у порівнянні 3 ж-- істотно не змінюється, але вони мають приблизно в З рази менший титр продукту, що вказує на те, що активовані якісь механізми зворотного зв'язку. З огляду на спостереження за роботою з Ір і ІзрН, можливо, що цей зворотний зв'язок обумовлений накопиченням НМВРР.

Поліпшення титру терпеноїдного продукту в результаті збільшення експресії МаьЬК вимагає достатнього прояву І5ро та/або І5рН (Фіг. 11). У цьому прикладі контроль А має додаткові копії ах5, ірО, і5рЕ та іді шляху МЕР, а також делецію гпуВ і зміни оперона ізс. Контроль В - це контроль А плюс додаткова інтегрована копія іхра" і ігрН у конфігурації оперона (спочатку С", так що співвідношення Н/(З схиляється до (3), тоді як контроль С - це контроль А плюс додаткова інтегрована копія ірН і ігра" у конфігурації оперона (спочатку Н, так що співвідношення Н/З схиляється до Н).

На панелі А ми бачимо, що комплементація Маьк за відсутності позитивної регуляції Ігро/Н знижує титр терпеноїдного продукту В приблизно на 25 95. Проте, коли комплементується арк у штамах додатковими копіями ізро'-ізрН або ізрн-ізра", то спостерігається поліпшення титрів терпеноїдів на 18 95 і 27 95. Очевидно, що іІз5ро і І5рН повинні бути надекспресованими щодо шляху МЕР М/Т, щоб побачити переваги Уаьк.

Більш того, ці дані ще раз підкреслюють, наскільки важливим може бути баланс експресії між Ієро і ІзрН для проходження шляху МЕР і продуктивності терпеноїдів. У контролі В у порівнянні з С, одні й ті ж ферменти активуються при однаковій силі промотора, різниця полягає в порядку генів в опероні. Гени, найближчі до промотора, будуть експресуватися сильніше, ніж наступні гени в опероні, так що співвідношення ферментів Н/З схиляється до І5ро у контролі В або до І5рН у контролі С. З огляду на це, ми спостерігаємо, що співвідношення на користь Н 60 підвищує титр більше, ніж співвідношення на користь б. Більше того, поліпшення, яке стало можливим завдяки УаБкК, посилюється в штамі, у якому переважає Н. Таким чином, баланс між

ІрН і Ігро дуже важливий для підвищення продуктивності штамів.

Експресія ах на додаток до ХаЬК може додатково поліпшити титри терпеноїдів (Фіг. 12). У цьому прикладі контрольний штам продукує терпеноїдний продукт А та має додаткові копії генів ахв, ахг, ізрО, ізрЕ, ізрЕ, ігра", іврН та іді шляху МЕР при певній конститутивній експресії.

Як показано на Фіг. 10, експресія додаткової копії МаБК в умовах конститутивної експресії збільшує продукування продукту А. Була зроблена спроба комплементування трьома додатковими акцепторами/донорами електронів: ПаА, ПТаА та егрА (кожен з Е. соїї) або ах із

Сіовігідіит. равівштіапит (який може підтримувати кластери 4Ре-45, які виявлені в І5ро і І5рнН, але не кластери 2Ее-25).

Додавання ще однієї копії ТЯА (флаводоксин) або ЛА та егрА (незамінний респіраторний білок А) у доповнення до Харк додатково не поліпшило титр продукту А, але додавання їах

Сіовігідінт равівшгіапит дійсно покращило титри продукту А. Цікаво, що оскільки додавання

УаркК призводить до повного перетворення ПООХ/ЮОХР на МЕ/МЕР на нисхідному шляху, подальше додавання ПЛаА змушує деяку кількість вуглецю накопичуватися на висхідній стадії на шляху МЕР як ПООХ/0ОХР. Додавання егрА до цієї суміші відновлює профіль. Проте профіль метаболіту МЕР для подальшого посилення штаму удбК-кх є найбільш схожим до уабКапалх, що дозволяє припустити, що оптимальний проходження МЕР буде результатом скоординованого балансування експресії генів шляху МЕР, а також експресії особливо важливих донорів/акцепторів електронів.

Приклад 5. Зменшення РОН-перетворення пірувату на ацетил-СОА підсилює чарк- перетворення пірувату на ацетил-СОА

Підвищення залежності Харк для перетворення пірувату на ацетил-СОА може поліпшувати продукування терпенових та/або терпеноїдних продуктів за допомогою сконструйованого мікробного штаму, оскільки УаЬК має більш низький окиснювально-відновний потенціал (більше абсолютне число в таблиці 4), ніж гідрохінон/семіхінонова пара ЕММ у ЯПДА. Як такий, Марк є кращим джерелом електронів (не Трг/МАО РН) завдяки І5ро і І5рН.

Кластери сірки-заліза (наприклад, Бе«54) у ферментах (таких як І5ро і ІзрН) використовують широкий діапазон потенціалів відновлення, наприклад від -200 до -800 мВ. Віаспіу, еї аї.,

Зо Іпогдапіс Спетівігу, 54(13): 6439-6461 (2015).

Потенціали відновлення для заряджання носіїв електронів Мак і їрг розкриті в таблицях 2 і

З, відповідно, а потенціали відновлення для розряджання носіїв електронів (наприклад, ХаБк і

Тр) до Ізро і І5рН розкриті в таблиці 4. Див. Мсімег, еї аІ., РЕВЗ У, 257(3):577-85 (1998) і І иріоп, еї аї., У Васіетіої, 159: 843-9 (1984).

Таблиця 2

Заряджання носія електронів Харк винні 1 пірувату) опіруватж СоА зацетил-СоАеСО»я2Н" ге | 540(О.айісапиї) нини

Таблиця З

Заряджання носія електронів Трг до єо (мВ) (ккал/моль

МАОРН зовитнютьтию | спе!

МАОРН -» МАЮ Р» -. де: Не (370 для МАОРН/ . МАО Р. - 60 падяттттттьтьстьььсть й? 6: 7-2 2 6Ж2 ( ж Ж щЩ- -5 .3:1 2 4-20 5 докисненихірге2е 12Н" -»2семіхінонїрг | 308 | 06 2 Л нФоЕ и нини (Напівреакціяокиснення потенційногоїр:.д | (77/17 ссеміхінонірг-»окисненийрче я НУ | 308 ЇЇ сідрохінонірг-» семіхінонірізме я Не |77111111268|1111С1С стадя?! |! 77711770. порт нянні я електронів:

Таблиця 4

Розрядження носіїв електронів до І5ро та І5рнН

Оптимальна активність Ієро була перевірена іп міго з використанням ряду окиснювально- відновних барвників. Хіао, еї аї., Віоспетівігу, 48(44)10483-10485 (2009). Оптимальну активність І5ро тестували з метилвіологеном, що вводиться ззовні (629-446 мВ). Активність І5ро, визначена з використанням введення метилвіологену (502-446 мВ), була в 20 разів вищою, ніж у системі Трі-ЯаА іп міо.

Активність І5рН була в 50 разів вищою при використанні метилвіологену (602-446 мВ) і в 100 разів вищою при використанні введеного дитіоніт-МОС (602-490 мВ). Хіао, еї аї., доигпаї! ої Те

Атетгісап Спетіса! босієїу, 131(29): 9931-9933 (2009).

Припускається, що пара ПаА-семіхінон/гідрохінон, доступна для УарК, але не для Їрг, є кращою іп мімо системою відновлення для Ізро і І5рН.

Щоб збільшити залежність мікробного штаму від опосередкованої РЕОК (наприклад, Уарк) конверсії пірувату на ацетил-СОА, РОН-опосередкована конверсія пірувату на ацетил-СОА була знижена. Дивіться Фіг. 15.

В Е. сої існує три відомі реакції перетворення пірувату (РУК) на ацетил-СоА (АсСоА): ріїВ,

РОН і РЕОК або хУаьк.

З трьох ферментів переважає РОН, і він являє собою мультиферментний комплекс (асеєг- асев-Ірі), який складається з 24 субодиниць піруватдегідрогенази (асеЕ), 24 субодиниць ліпоатацетилтрансферази (асект) і 12 субодиниць дигідроліпоатдегідрогенази (Іра). Сумарна реакція системи РОН, на додачу до зниження МАЮ», полягає в перетворенні пірувату на АсСоА та СО», ключової реакції центрального метаболізму, оскільки вона пов'язує гліколіз І, який генерує піруват, із циклом ТКК, у якому використовується АсСоА. Під час аеробного росту РОН є важливим джерелом АсСоА для підживлення циклу ТКК і тим самим задовольняє клітинні потреби в метаболітах попередників, які він утворює. Штами мутантів, дефектні за комплексом

РОН, вимагають екзогенного джерела ацетату для задоволення цієї вимоги.

РІВ активний лише в анаеробних умовах. Як такий він не забезпечує первинну реакцію перетворення РУК на АссСоА в мікроаеробних і аеробних умовах.

У штамах мікроорганізмів із принаймні надекспресією Хаьк РОН (див. приміром приклад 4) більше не є незамінним, оскільки Марк можна використовувати для постачання АсСоА. Для гарантування того, що стадія перетворення РУК на АсСоА головним чином каталізується арк, який, у свою чергу, постачає електрони до І5ро і І5рН, активність РОН була знижена або усунена за допомогою нокаутів або нокдаунів генів (наприклад, мутацією).

Елімінація РОН за допомогою нокауту асеє

Чотири різні штами БЕ. соїї, сконструйовані для отримання чотирьох різних терпеноїдних продуктів (позначених як продукт В, продукт С, продукт ОО і продукт Е), були додатково сконструйовані для нокауту асеєЕ (ЛасеЕ), який усував активність РОН. Контрольні штами були такими самими, але без нокауту асеєЕ.

Дані показують збільшення титру кожного з чотирьох терпеноїдних продуктів за рахунок делеції асеЕ в порівнянні з контролем. Дивіться Фіг. 16А-О. Відмінності в поліпшенні кратності зміни можна в значній мірі пояснити біохімічними характеристиками (наприклад, Кт та Кса) різних терпеноїдсинтазних ферментів, використовуваних для низхідного шляху. Зокрема, ферменти з більш низькою синтазною активністю в порівнянні з синтазою продукту О (найбільш каталітично ефективної) мали дещо менші поліпшення кратності зміни, ймовірно через накопичення субстрату ЕРР, який може накопичуватися та призводити або до клітинної токсичності, або до регуляції зворотного зв'язку на висхідні компоненти шляху МЕР.

Дані також показують зниження концентрацій МЕСРР у позаклітинному бульйоні (Фіг. 16Е) в порівнянні з контролем, що підтверджує, що проходження вуглецю направляється через стадії

Іро/Н на продукт. Дивіться Фіг. 1.

Нокдаун РОН за допомогою мутованого асеЕ

Три штами БЕ. соїї, кожен з яких був сконструйований для отримання трьох різних терпеноїдних продуктів (показані як продукт В, продукт С і продукт 0), були додатково сконструйовані для експресії мутованого асеєЕ (5267С; асеЕ ти), що призвело до зниження активності РОН. Контрольні штами були такими самими, але не мали мутованого асеЕ.

Подібно результатам нокауту асеЕ, дані показують збільшення титру кожного з трьох

Зо терпеноїдних продуктів у мікробних штамах, що експресують мутований асеЕ, у порівнянні з контролем. Дивіться Фіг. 17А-С.

Дані також показують зниження концентрацій МЕСРР у позаклітинному бульйоні (Фіг. 170) у порівнянні з контролем, що підтверджує те, що проходження вуглецю направляється через стадії ІгрО/Н на продукт. Дивіться Фіг. 1.

Приклад 6. Ненативні акцептори/донори електронів збільшують МарвК-залежну продукцію ізопреноїдів

Коли Хаьк надекспресувався в Е. соїї, нативний фередоксин (Тах) або флаводоксин (ПА) переносив електрони до Ізро і ІєрН (РУК/уаркКлідА або тах). Сконструйовану Е. соїї для отримання продукту В і надекспресії МаЬК додатково конструювали для надекспресії одного з наступних гомологів Мїх у таблиці 5 або гомологів ЯЯА в таблиці 6. Перші сім гомологів йкіх являють собою фередоксини 2|4Ре-45), що означає, що вони містять два кластери заліза-сірки 4Ре-45, які можуть мати однакові або різні окиснювально-відновні потенціали. Для фередоксину, де кластери відрізняються за окисно-відновним потенціалом, враховуючи окисно- відновний потенціал УаБК, ми очікуємо, що в більшості випадків кластер 1 буде релевантним кластером. Решта гомологів їх є фередоксином 2Ре-25 і високоактивним фередоксином 4Ее- 45, які містять один кластер. Контрольна Е. соїї не експресує будь-яких гомологів гах або ПА.

Таблиця 5

Гомологи Бах

ЕмМалйх | 77777450. | ...юЮюЮюЮюЮюЮюИ- 11111111 ЕсюШіотосйоврігавпаровппікомі

Рріяїх ОЇ 77777717 -1777171711111717171717171- 11111111 0Реейдотопавруйда.7//:////СЗ

ІРраййх ОЇ 7777-7717 - 11111111 ІРеейдотопаврийда.7//:///е

Таблиця 6

Гомологи РІЗА

Семіхінон Гідрохінон-»семіхінон .

Дані показують, що надекспресія деяких гомологів йіх або ПаА в Е. соїї й надекспресія ак дала підвищені титри терпеноїдного продукту (продукт В у цьому прикладі) в порівнянні з контролем порожнього вектора (етр) (наприклад, Н. лах, См.гах, Смллахо57А та Ра ах). Фіг. 19А.

Е. соїї, сконструйована для отримання продукту Ю і надекспресії МаЬК, була додатково сконструйована для надекспресії См.лах. Подібно попереднім результатам, дані показують, що надекспресія См.ах в Е. соїї, сконструйована для одержання терпеноїдного продукту (продукт Ю у цьому прикладі) і надекспресія УЯБК, дала підвищені титри терпеноїдного продукту в порівнянні з контролем. Фіг. 198. Крім того, дані показують зниження концентрацій МЕСРР у позаклітинному бульйоні (Фіг. 192) у порівнянні з контролем, що підтверджує те, що проходження вуглецю направлялося на продукт через стадії І5ро/Н. Дивіться Фіг. 1.

Приклад 7. Надекспресія або комплементація гомологами РЕОК, гомологами їрг та/або гомологами йіх або ПаА

Е. соїї, сконструйована для отримання продукту Е, була додатково сконструйована для надекспресії принаймні одного гомолога РЕОК або гомологів їрг і, необов'язково, гомолога їМіх або ПДА, як показано в таблиці 7.

Таблиця 7 4 Зсоріог(Зупеспососсиввр.)ї//////7777777711-1 6 Сарюг(Спатейаарісоа) ЗБОЮ МО:35 -/:/(/ ССС 8 ЕсуарКтасСрлах(Е. Соїта С. разієшіапит) ЗБОЮ МО9Ї10 71 9 Мелрг(Мовюсвр) 77777 5ЕОІЮМОЇ36 77777777

Дані показують, що деякі бактеріальні штами, сконструйовані для експресії гомологів РЕОК і

Трг, мали підвищені титри терпеноїдного продукту (продукт Е у цьому прикладі) в порівнянні з контролем порожнього вектора (СТЕК) (наприклад, ра.ріог (Оезийомірго аїісапив) (ЗЕО ІЮ МО: 31); Зсо.ріог (Зупеспососсив вр.); Са.ргог (СіПатепйа арісоїа) (ЗЕО ІЮ МО: 35); Ес.удьк (Е. Соїї) (ЗЕО ІО МО: 9) та 5со.рг (Бупеспососсиз 5р.) (ЗЕО ІЮО МО: 37). Дивіться Фіг. 20.

Дані також показують, що бактеріальні штами, сконструйовані для надекспресії принаймні одного гомолога РЕОК і їх, мали підвищені титри терпеноїдного продукту (продукт Е) у порівнянні з контролем порожнього вектора (СТЕ) (наприклад, Ес. удпМ/Ес.уанм; Е. соїї (ЗЕО ІЮ

МО: 33 і 5ЕО ІЮ МО: 34, відповідно) та Ес.уаЬК/Ср.гах; Е. соїї (5ЕО ІЮО МО: 9 ї 10 відповідно)).

Дивіться Фіг. 20.

Крім того, дані показують, що бактеріальні штами, сконструйовані для надекспресії принаймні одного гомолога їрг і їх або ЯдА, мали підвищені титри терпеноїдного продукту (продукт Е) у порівнянні з контролем порожнього вектора (СТЕК) (наприклад, Ес.Трг/Ес.ах; Е. соїї (ЗЕО ІЮ МО: 38 і БЕО ІО МО: 21, відповідно) та Ес.трг/Ес.ЛПаА; Е. соїї (ЗЕО ІЮ МО: 38 і ЗЕО ІЮ

МО: 27, відповідно)). Дивіться Фіг. 20.

ПОСЛІДОВНОСТІ

ЗЕО ІО МО: 1 (Е. сої Іврах)

МНМОАРІОВАКВТАІУМамУРІЖОСАРІАМОЗМТМТАТТОМЕАТУММОЇКАГЕАМалорІМАУЗМРТМ рААЕАРКІ ІКОСОУМУРІ МАВІНЕОМУВІАЇ КМАЕМаМОСІ ВІМРЕМІСМЕЕВІАВМУМОСАВОКМІРІВІСЬМ

МАСІ ЕКО ОЄЕКУСЕРТРОАГІ ЕЗАМАНУВЮНІ ОВ МЕСОРЄКУЗУКАБЗОМ НІ АМЕЗУВІ ЇЇ АКОІВОРІ

НІ аІТЕАВСАНЗИАМУКЗАаІ СИП І ЗеЕСІСОТІ ВУ5І ААОРМЕБІКМОа ЕІ КІ ВІНЗАСІМЕІАСРТО

ВОЕРОМІСТУМАГ ЕОВГЕОПТРМОУБНЕСУУМаРСЕАЇ УТ аУтасМКкКкЗагМЕрамУвков ОМ

ОМІБОГГЕАВІВАКАБОЇ ОБЕАВВІОМООМЕК

ЗЕО ІО МО: 2 (Е. сої ІврН)

МОШГ АМРАСЕСАСМОВАІЗІМЕМАГАІМИАРІММАНЕУУНМАУММОБІ ВЕВСАЇРІЕОІЗЕМРОСАЇ

ПЕЗАНИУЗОАМАМЕАКЗАОЇ ТМЕСАТОСРІА У/ТКУНМЕМАВАЗАВОЕЕЗІЕНАСНРЕМєЄТМОИаОУ5

МРЕСИММУІ МЕЗРОВВУМКІ ТУКМЕЕКІ БЕМТОТТІ 5МООТ5ОМІСАГ АКАЕРКІМА РАКОВІСМАТТМА

ОЕБАМААГ АЕОАЕУМІ УМаЗКМЗОМОМАІ АБ АОВМаТквВАРПОВАКОІЮСЮЕЕМУКЕУКСУаМУТАСАЗА

РОП'МОМУМАВІ ОСІ ССС ЕАЇІРІ ЕСВЕЕМІМЕЕУРКЕЇ АМОІВЕМО

ЗЕО ІО МО: З (Е. соїї Охв)

М5ЕОІАКУРТІ А МОТО ВІЇ РКЕБІ РК СОБГ ВАМИ Ю5УЗАЗЗаНЕАЗаг атм тА нНУМ

УМТРЕВОГ ІМ ОМЕОНОАУРНКІ ТавВАеОКІСТІВОКИааІ НРЕРУВСОЕЗЕМОМІ БУНТ ЗІЗАСІСІАМ

ААЕКЕеЯКМАВТУСМІБОСАІТАСМАРЕАММНАСОІАРОМІ МІ. МОМЕМ5ІЗЕММСАММНІ АОГ І БИК 551 ВЕСОККМУЕЗОаУРРІКЕГ І КАаТЕЕНІКЕМУМРИТІ ЕЕЕЇ ЯСЕММІСРУВСНОМ СИТІ КММАОІ

КаРОННІМТККавВаИамЕРАЕКОРІТЕНАУМРКЕОРБЗБЗаСІ РКЗБИаСІ РОМ ЗКІРО ОМ СЕТААКОМКІ

МАІТРАМАЕЗИаИММУЕРЗАКЕРОВУЕОМАІАЕОНАМТЕАДаї АІС УКРІМАЇМЗТР ОВАМВОМІ НОМ

АЇОКІ РМ ЕАІОВАСИМЕАДИОТнНОСАНРОІ ЗМІ ВСІРЕММІМТРОСЕМЕСВОМІ УТаМНУМОС,СРБЗАМУА

УРВАВОМАМОИМЕЇ ТРІЕКІ РІЕКСІМКАВСЕКІ АП МЕСТІ МРЕААКМАЕБІ МАТІ МОМАЕМУКРІ СОЕАГІ Є

МААЗНЕАЇ УТМЕЕМАІМССАСЗИаУМЕМІ МАНАКРУРМІ МІС РОЕРІРОСТОЕЕМААЕЇ а ДАО МЕ

АКІКАМІ А

ЗЕО ІО МО: 4 (Е. соїї Ох)

МКкО ті автавІсСЗтТІ ОМУАНМРЕНЕНУМАЇ МАЯКМУТАМУЕОСІ ЕЕЗ2РАУАУМОРЕАЗАКІ

КТМІ О00,5АТЕМІ БВБООААСОМААЇ ЕОСМООУМААІМИаААа І РТ ААІВАСКТШІ АМКЕБІ МТС

ВГРЕМОАУКО5КАОІ І РМОЗЕНМАЇІРОБІ РОРІОНМІ СМАВІ ЕОМИа МУ ТаЗОССРЕВЕТРІ ВОГАТ

МТРООАСАНРМУМУЗМаИавКкІЗМОЗАТМММКИаї ЕМЕАВУМ ЕМАЗБАЗОМЕМ ІНРОБМІНЗОМУВ УОВвСИа5

МІ ОЇ аЕРОМАТРІАНТМАМ РМАУМЗСОИМКРІ ОРЕСКІ БА ТЕААРОМОВУ РСІ КІ АМЕАРГЕОСОААТТ

А МААМЕ!ТМААНРІ АООСІВЕТОІААЇ МІ ЗМ ЕКМОМАЕРОСУВОМІ БМОАМАВЕЕМАВКЕУМВІ АБ

ЗЕО ІО МО: 5 (Е. сої ІврО)

МАТТН ОМСАУУРААСЕРСААМОТЕСРКОМІ БІСМОТІ ЕНЗУНАП АНРАЕУКАУМІАІЗРИОЗАБА

ОГРГ АМНРОІ ТУМраСОЕВАОБ5БМІ АСІ КААДИБВАСМУМІ УНОААВРСІ НОВІ АВГ АІЇ ЗЕТЗАТОИИІ.

ААРУВОТМКВААЕРСЕКМАІАНТУМОВМИїЇ МУНАГТРОЕЕРАЕЕТІ НОСІ ТВА МЕСАТІТОЕАЗАГЕУСИаЕ

НРОЇ МЕСВАОМІКУТАРЕОІ АГАЕРМІ ТАТІНОЕМТ

ЗЕО ІО МО: 6 (Е. сої ІврЕ)

МАТОМУРБРАКІ МІ РІ МІТасВАВИХМНТІ ОТ ЕОР ОмМартіІЗІЕЄ ВррабріІвВІ /ТРУЄСМЕНЕОМІ І

МАААВІ І МКТААОЗОВІ РТаЗСОАМІБІОКВІ РМаАасИЇЕаСЗОМААТМІ МА МНІ МОСС, ЗМО ГАЕ

Мат аАОМРУЕУВаНААРАЕСаМаєТРМОРРЕКМ/МІ МАНРИМ5ІРТРМІРЕКОРЕЇ РАМТРКАБІЕТІ.

ГКСЕЕЗМОСЕМІАВКАЕВЕМОАМІ БУЛ ЕМАРЗАІ ТатаАСМЕАЕРОТЕЗЕАВОМІ ЕОАРЕМІ МС ЕМ

АКОСАМІ 5РІ НВАМІ. бо

ЗЕО ІО МО: 7 (Е. соїї ІврЕ)

МАВІСНОРОМНАРГССЕСРІШССМВІРМЕКОГ І АНБОСОМАЇІ НАГТОАГІ САДАГООІСКІЕРОТОРА

ЕКОАОЗВАЕГ І ВЕАМ/АВІОАКОМТІ СММОМТПАОАРКМІРНІРОМАУРІАЕП ССНМООУМУКАТТТЕ

КГОРтТавВОаЕСІАСЕАМА ІКАТК

ЗЕО ІЮО МО: 8 (Е. сої 1аї)

МОТЕНМІІ МАОСУРТОТІ ЕКУААНТАОТВІ НІ АЕ5БУМІ ЕМАКОаОГІ МТАВАГ 5ККАУМУРОМУМУТМ

ЗМСОНРОЇ СЕЗМЕОАМІВАСАУЕЇ СМЕІТРРЕБІМРОРВУВАТОРБСІМЕМЕМСРМУЕБГААВТТ5АГ ОЇІМО

РЕММОМОМ/ СО АСМІ НаІЮАТРУ АЕРУУМУМОАТМАЕАВКНІ 5АБЕТОЇ К

ЗЕО ІО МО: 9 (Е. соїї Марк)

МІТІВЕМОаАМАЗБМАРВТЗЕМІАІМРІТРОЗТМАЕОАВАМ ДОМИ КМУМ СОТРАММЕМО5ЕАСАЇА

ТУНОАГ ОТОАІ 5Т5ЕТ55ОСІІ МІРТІ УКІ АСЕЇ ТРЕМІ НМААВТМАТНАГЇ БІЕРФОНБОУМАМНОТО

САМІ СААММОЕАООЮРГАЇ ІБОІАТІ КОВУРЕРІНЕЕОСЕВТ5НЕЇІМКІМРІ АООТІ ОЇ МРОМЕІЮАНВАВА

ГАЯРЕНРМІВОТЗАМРОТУРО5ЗВЕАТМРУМУ УМАММОНМЕОАММОЕЗААТаВОМОРРГЕУУСОНРОАЕВМІЇ

ІМабБАІСТСЕЕММОБЕГ І ТАСЕКМОМІ КУВІ МАРЕБАКНІ Г ОА РИЗУВЗМАМІ ОВТКЕРСОАОАЕРІ МІ.

ОММтТААЕАРММОєЕВЕТІ РАМІСИСВМУСІ 55КЕРОРОСМІ АМЕАЕІЇ МААКРКАВЕТУМСІМООМТМІ БІ Р

ГРЕМТІ РМБАКІ ЕАГЕМСИаї Са5ОИБМЗАТКММІКПИМОТРУМАСаМЕММО5ККАСИ ТУЗНІ ВУ5ЕОРІ

ВАБАМІИ ІЗОАВЕМаснНОї ОРІОКУОМАЕНІ КРОСІБ І МТРУБАВЕММУМУЗВІ РОЕМОАМІ МОККАВ ЕУМІ

МААКІАНКЕСОЇ ААВІМТУМОМАРЕЕНІ ТОП РООБАЇГ АБ! ОСАІАКОЗУВОКОИОВІ МЕВМУУОАГ АГ АВЕ5

МЕЕМРГОРУМРНІЗАМАРРУМЗОААРОЄМКТМУТААМІ АС ОарАГРУБАІ РРОСТУРМОатТТеРУЕКВМІ

АЕЕІРМ/КЕЕЇ СТОСМНОМААСРНОЗАІВАКУУМРРЕАМЕМАРАБІ НОЗІ ОСМКЗЕАОМАСОКУМ ОМАРЕО

СТасмМмі сСмМЕМСРАКОВКОМРЕЇІКАІМММ5АГЕНМЕЕЕКІММОЕРІ МІ РЕІОВЗКІЕВІОІТАТ5ОЇ ІТРІ ЕЕ

УБаАСЗасаєЕТРМІКІ ТОЇ МСОВМІАМАТаСЗБІМОСМІ РОЕТРИТТОАМаВаРАМАМ5І РЕОМАЕ

ЕСІ сЕВГ ТМрСОНАМУВРМІ ВІ ООГБГАОКІРАЕТІ ТА КООАТРЕМАВЕОМААІ АООСЇ МОМАЕАНЕТІ ВА

РА МЕКБІМ аСОСУАМОІ!СЕССІ ОНМІ БІ ТЕМУМИІ М ОТОСУЗМТЯСОАБКАТРІ ЧСАМТКЕСЕНО

КАКАНКОЇ ЯСУ5ММММУаЇНМУММАОІВІ АС МОТУКАІОЄАЕАМРЕРБІ ПАМЗРСОЕЕНИМОЇ АГ ЗНО

МАО ТАТОРМУРІ УВЕОРАВАОЕСКІ РІ АГОЗАРРОЕАРЕЕТІ І НЕОВЕАВІ МБООРЕМАЕОЇ МКОА

ААРІ ОКАМОРІ АОМАСКАЕКОМТО

ЗЕО ІО МО: 10 (Сіовзміаїшт равзівшишіапит ах; Ср.ах)

МАУКІАОЗСУЗСОАСАБЕСРУМАІЗОСОБІРМІВВАО ТСІЮСОМСАММСРМИаАРМОЕ

ЗЕО ІО МО: 11 (Е. соїї РорВ)

МАБІАВАТАМИаААН І УМРМАМУ/ЗИИУМ ВМОРОЕОБУЛИ КААЕМ/МТЕТУТОРУОМІТНІ ГОМ Е

І МСІ ВЕВІКААРМІ БА АДАМА ОСУКВУЛКОКМОЕРАРЕМІМІ ЕКТННІРМОЕРУТІ КААЕНОМІ МК

ЕОЇ АЕЕКМІРОМІ ВІН ОКЕТОГАЕРБОНТМЕААБУАГ І АМИа гі МУ РАВАТІ ТА УМАТаУМаА

ГЛ амнУуРАВОІ УМАТИІЗУАІЇ МАМАТУ/ АОВІСОРІ ТРРАЕЕМАЕІДОВЕОЕ5

ЗЕО ІО МО: 12 (Е. соїї Миав)

МКОКУУКАРМУБІ МУМІМАСООТКАМІ МІ ОВАООРОРМОЗУТаЗМЕЕСЕТАРОААМАЕМКЕЕМТІО

МУАЕОЇ ТЛОСОВТМЕРЕЇІЕЗНІ АНАХАРОМТАМТЕБМУЕСІ АІЇ РНЕКОЇМЕТЕНІ АУКУМІ ОАРАДААІ Т

КБУ ЗМАОАІЕОРМІМАА

ЗЕО ІЮ МО: 13 (Е. соїї послідовність Шайна-Дальгарно) дааАса

ЗЕО І МО: 14 (МеїШапососсизв тагіраїндіє САРОВ)

ММ ОСИ ЗАОМУЕЕГЕЕБЕРЕРІБЕСІМІ НТКОЕТУКУОАРОЕКМІ ЕСРОКИп РИІССНВАГ ІЕ5ЕВОР

ГУ ООЄНЕБАМОСАСУТЕКОТСОИІОММАІТакКСЕМРТМІМІ МСЕЕОКІ КІЕЕМРЕТЕЄЕІ! ТОІМЕЄМОКИОІ Є

КЕКМУВАРІ МАРАБКТТММОаСІУЗОТІВМаКІМЕВЗЕОУМААНО,СИавмМІ ХОАНММІ ОСММЕРОаККТРЕ

КМ КЕІМЕЕНУМКРУТКУМГЕНТЕКУВУ5ЕЕККТаСсСТЕОММУНУТМЕ! ТРИЄМУАМРЕІЮКМКАМКІ.

НККПЕМЕММАЕРЕЕАЛІЕТКМУ ТМСЯЕРСРУМСККУВКОЇ НМОМЕРУЕАМО РСІЯМЕРІМААОКУМНТІ

РОКІ ЯЕрАІЕРОМІ СБУ ТЕРЕ ГП ОМОМІ КРЕЕМСТЕКРУБОВІЗМЕЕМОЕОП КМЗМНМАЕОСАМКІ АЕПАЕ

ОТМЕРОКІСКЗОаТАВАСКІЇ МЕКУРОВІКОККЕРЕОРО УМ ОБЕСЕВСОІ5РТМУУМАІСМЕМРМ ІДСаКУ

ІТНУОСОМР ГГ ЕРЕЕЇГАБЕЇ 5МКМ5ІЕБЕЇІТІ ЕМ ОІСАЕНАКУУМТРІЕКІ МКЕМБЗОМУМІ МЕЄЕЗМЕЇ ЕККІА

КМОБМОаСРЕМЕБЕВМУКЕЇ ПАСБАРЕРЕМЕКМУЗКЕРЕМОМЕОЕМІКАМІ ЕКУ5ЗЕ І БІОМУКІ КЕ

ЗЕО ІО МО: 15 (Неїїорасієгішт тодевіїсаідит, Нт.гах1)

МАУКІТОАСТАСААСМОаССУСАІМЕСККУВІТЗОСУОСИаМСАОКСРМОАПРО

ЗЕО І МО: 16 (Рхеийдотопаз аєгидіпоза, Ра ах)

М5І КІТООСІМСОМСЕРЕСРМОАІЗОСЕЕІММІОРМІ СТЕСМОНУРЕРОСООМСРМОСІРІ ОБАММ

ЕБКООЇ МЕКУВКІТОКА

ЗЕО І МО: 17 (АПоспгтотаїйит міпозит, См ах)

МАЇ МІТОЕСІМСОМСЕРЕСРМОаАІЗОСОЕТУМІЕРБІ СТЕСМаНУМЕТ5ОСМЕМСРМОСТКОРЗНЕ

ЕТЕОЕЇ ВАКУЕВІТаЕС

ЗЕО ІО МО: 18 (См.лах С57А)

МА! МІТОЕСІМСОМСЕРЕСРМИадІБОСОЕТУМІЕРБІ СТЕСМаНМЕТЗОСМЕМСРМОАНКОРЗНЕ

ЕТЕОЕ ВАКУЕВІТОЕС

ЗЕО ІО МО: 19 (Е. сої, Ес. ут)

МАС ІТККСІМСОМСЕРЕСРМЕАІЗМОаОНІМЕІМ5ОКСТЕСМанхухЕТРТСОКМСРІРМТІМКОРАНМ

ЕТЕЕОГЇ М/ОКЕМІ МННАОКІ

ЗЕО І МО: 20 (Сіозіаіт асеюбршуїїсит, Са. ах)

МАУКІТОАСУВСОаЗСАБЕСРУБАІЗОСОТОРМІВАОТСІЕСИМСАМУСРУСАРМОЕ

ЗЕО ІО МО: 21 (Е. соїї, Ес.Тах)

МРКІМІ-РНООІ СРОСАМІ ЕАМЗОСИЕТІІ СААЇ АМИаТЕІЕНАСЕКЗСАСТТОНСІМВЕСРЕОБІ РЕЗЗЕ 13 ОБООМГОКАМИГЕРЕЗВІ БСОАНАМТОЕОІ ММЕІРАМТІМНАНЕН

ЗЕО ІО МО: 22 (Есіоїпіогподозріга зпарозппіКомії, Ем2 ах)

МЕНІ БЕВОРААОАГЕМАНОАЗЗМОНРАМЕЕСОТСІ МСГ І УТОАБАОВМИТРСЗМЕРОКІ МАМО

МСТАММУАН

ЗЕО ІО МО: 23 (Рзендотопаз риїйда, Рр1.гах)

МЗІПТООСІМСОМСЕРЕСРМААІЗОСЕЕІММІОРМ.СТОСМанурЕРОСООМСРМОСІРІ ОЕАНР

ЕТНОЕ! МЕКУКВІТОКА

ЗЕО ІО МО: 24 (Рзепдотопаз риїйда, Ррае.гах)

МЗІІТООСІМСОМСЕРЕСРМЕАІБОСЕЕІММІОРМГСТОСУМанНМУрЕРОСООМСРМОСІРІ ОЕАНР

ЕТЕЕЕЇ МАКУВВІТ

ЗЕО ІО МО: 25 (Агоіобасієг міпеїІапайїї 1алдг; Ам Ладг)

МАКІСІ РЄРОЗМТакТАКМАКОІККАРОСЕТМ5ОАЇ МУМА!АУЗАЕОРАОМОГРІ І ОСТРТІ ЕСЕ РОЇ.

ЗЗОСЕМЕБУЕЕРІ РКІЕСІ ОГБОКТМАЇ Ра! аромамРЕММІ СА СЕ МЗЕЕКОВОАКІМа МУЗ ТО

ЖЕРЕЗЗЕАММУРИкКЕМаг АГ ОГОМОБОаКТОЕВМААМ АОІАРЕБСІ 5.

ЗЕО ІО МО: 26 (Агоїобасієг спгоососсит ПаАг; Ас ПадАг)

МАКІСІ ЕЄРа5МТЯаКТАКМАКЗІККАЕОСЕТМЗОАУММУМАУЗАЕОБАОМОР І ИТРТІ ЕСЕ РИ.

ЗЗОСЕМЕБМУЕЕРІ РКІЕСІ ОГБОКТМАЇ Ра! ЯроОомМамРЕМЕГОАМОЕЇІ НЗЕЕТЕВОАКУМСАМ ТО

СМЕРЕСЗТАММОСКЕМИї АГ ОГОМОБакКТОЕВМААУ АОІАРЕРИІ 5.

ЗЕО ІЮ МО: 27 (Е. соїї, ЕсЛаА)

МАІТа!єРазотамтЕМІАКМІОКОЇ КОМАЮМНОІАКООКЕО ЕАМОШ І СІРТМУУУСЕАОСОМУ

ООРЕРТІГЕБІОЕМОКІ МАГ ГаСароєгоМАЕМЕСОАЇ патІВОПЕРВСАТІМанНнУРТАСУНЕЕАБКИЇ А

ООНЕМаГАІЮЕОВОРЕЇ ТАЕВМЕКМУМКОЇІЗЕЕБЕЇ НІ ОБ МА

ЗЕО ІО МО: 28 (В. зибіів, В5.Лал)

МАКАСІТУАЗМ5аМТЕОІАРНКОТГОЕМЕ! ОТОСУЕІМОМОАЗС ТЕО атУтмараріРМЕ

АЕОРГРЕЕМКОЇОЇ Ма КТАСРаЗОЮМ5УРКЕСЕАММІ ЕМУМІ ОБАСААММОЕТІ КІЕЇ АРЕТОЕОМЕ5

СВАРАВСОР АМАОУММКЕКІНУ5

ЗЕО ІО МО: 29 (Зупеспосувіїв вр., Зсу. ріог)

М5І РТМУАТІ ОСМЕАМАВМАМІ І ЗЕМІАІМРІТРОЗРМОЕЄЕМ БОАМААЕНАРМІ МИ ТУРІ ММЕМОЗЕ

СОСААДСИТУНОСАГОБСИАЇ ТТТЕТАБОСІ МІ МІ РІММНКІАСЕСТАММІ НМААВНБІ ААХОСІ БІЄСЮНЗОУМ

ААВМТОаРАМІ Б5М5МОЕАНОРАГІАТАТ5ОЕАТВАІРОЇ НЕЕОСЕВАТОНЕЕОКІЕІ РОЕМІ- ВС ІКОЕОМ

ГАНВОВАЇ ТРОВРКІ ВЙТАОМРОМУРОАВЕТУМРЕМАБУРММІ ЕОММЕОРИаОІ ТавнУВАРМЕМССО

НРЕАЕВНМІМ МА5САЕТАОЕТМОРІ ТАОСЕКМСИ І КУВІ МАРЕАСОВІ УМАСРКТМОКІАМІ ОВСКЕР

СБІСЕРІ МОСМІ ТАЕЕЕАСММРКИІСИавмаїі З56еКкКЕЕТРАМУКаТм ОНІМОТУМРКМНЕТМУСІМОІ НТ

ЗІОМОРБЕЗТЕАОЗМУВАІЕМа авратиМасАМКМЗІКІСЕОТОММАОСУгУМоБККБОаБМУТУ5НІ ВЕГО

РМРІЄЗТМ ІЗОАМЕМАСНОМ ЕРГЕОРЕМГЕРАМОСОМРІ УМЗРУСРЕЕМ ВЕЕРАВКМООБПОКМІ КМ

М ТтІМАМОМАВРАСМавВАТМТУМОТСЕРАГАСМІ РВЕЕАІАКІКОБМОКТМаккКаовБІМЕММІКАМО5Т

ГАНГМЕМУ5ЗМРЕТМ5ОБАРАМАРУУРОМАРМЕУВЕМІ аКІМАВОСООІ РУИБАГРСООСТУРТАТТОМЕ

КАМУанєЕІРУМОРОМСМОСаТксСМІМСРНАМІВЯКУУЕЕАЕІ АМАРУИЗЕКЕТМАКОНОМ ОСБКЕТІОЮМ

АРЕОСТасСОІСМОМСРАКМКБЗОРВЇІ ВАІММАРОЇ РІ НВЕОЕВЕММУОЕРІ ОІ РМРОВІ 5І МІ МКІЗНОС

МОЕРІРЕЕЗОАСАСССЕТРМУЇ КІ М5ОЇ РЯОВМІ МАМАТОаСБІМИСМІ РТТРУУХЛОМАЕСВОа РАМ 5

М5ІЕЕОМАЕРаї аєвВМАІОКОТЕРАСЕЇ І КТЕАСБЕЇ СОБІ МЗЕП.ММАОТТЕАПІРЕОВОЇ МЕОМКОВІ.

ОМГЕТРОАОМЕЇ ЗМАОМІ УККОМУ ПАС ОСУАМОІС УСІ ОНМ АБаВМУМІ ММОТЕМУЗМТОСОА

ЗКАТРАААМАКЕРААСИТкРОЗРККОЇ І МАМТУЯАМУУМАБІАМИАКМЕОЗІКАРМЕАЕАМРОМБІ ПАМ

НСІАНСІММТТАММНОКЕ! МОБОРУМ І МАУМРІЇ АСЕСКМРІ ОС ОМаЗРКМАІОКТУУ5ЕМА ГАМІ Т

ВАБОРЕЕАКВІ МК АОСОУМТВУАМУЕМІ АКАБІ ааєІМаММнамеРЗРЕМІАКВМ

ЗЕО ІО МО: 30 (Кісумега іпіегтеаіа, Кі. ріог)

МЗакмМкТмМрамААдАдАмМІЗУАРЄТОМААІУРІТРУТРМАЕММОЕМУ ТАОСККМІ ГСОРМАВІ МЕМО5

ЕАСАДСАМУНОАІ ОАСАЇ ТТТУТАБОСИ І МІРМІ УКІАСЕГ І РОМЕНМ5АВАГАТМ5І МІЕМОНОСУМ

АУВОТОасСАМІ АЕМММОСММОІ БАМАНІ БАІКОВАУРРІМЕРОСЕВТ5ЗНЕЇОКІЕМІ ЕНЕАГ АРІ І ОСОБА.

МІ ЕВАМАСМРОНРМІВИ ТАОМРОЇМРОЕВЕАЗМАЕМОАГРОЇМЕСУМАЕЇУВІТаВЕМНІ ЕОУУОаБРО 60 / АЕОШАМа5БУСОТІОЕММОАМІОЗИЕКМИї УЗУНІЕАРЕБІ АНЕМАКІРАБУКАІАМІ ОВТКЕРИАОАЕ

РІ ССОУКМАЕЄУННОМРРИМасаАМАІ Сакормі РЕаНІМ5МЕЕМІ ККРІ РМОСЕТУМагООМТНТБІРУР

АУОРІНУ5АЕСІТАСКЕРМУа 5 ТУ5АМКМАІКПИОМТ5МЕАОАМУгАМОоККаситмМ5нНІ ВЕОКАРІ

Т5РМИІНМАОРІАСЗООБУМОКМОГ ОСІМРИСІТР МОСТУ РЕСЕЕМЕВНІ РІМКМКАПАВОСУВЕМТІ М

АМОІАВКІ а сОАЕММІ МОААРЕКІ ТОПОАКТАБЕНІЮ ККАМАКОМОЗКООМУМОМММААІОГ а МОАГ.

ОБПІМРОНМАУМЕЕЕАММОСКІМРОБРІАВМІСЕРМЯМВОМОа ОК РИЗБАРІ ОМЕОСТЕРРИТтТААМЕКНСЇ

АМОМРУМЖМОРЕССТОСМОСАРІСРНААІВРАГ І 55ЕЕНЕААРМАЇТ І БКМАОСАКНУЕТМНІ АМ5РІ ОС5 аСамсмМрІСРБОКОКАЇ АМКРІ ОБОВНМУРМУМ/ОНАГАГАРКЕМРЕЗКАТУКасСОРЕРРІ ГЕЕЗИАСА

ССОЕТРМУАВИ ТОЇ РФОВММІАМАТаС5ЗБІМ САБАРБІРМ ТТМНКООСРАМАМ5І РЕЕОМАЕРИГ СМ

МІ Са ВАІВЕОЇ АБОАДАБМІ ЕВАРІ НРОГООАГ ВРУ ЕНКОЇ СЕСТААВАЕКІ ЗАГ АДЕКО ОВО МА

ГМОМООМЕТКАЗОУМІЕаараУАМОІСРСОИІ ОНМІ АБСЕОУМИІ МЕОТЕУУЗМТаСОЗЗКОЗТРМААІА

КЕРААЕСКАТАККОЇ аММАУБМамМУММАОМАМОИАОКАОТІ ВАІАДАЕАДЕАМ/ РО РБІ МІАМААСІМНИЇ КА

СМавВ5БІЗЕАКААМЕАС УМ НІ М/АУМРОГ І АКОКМРРЕІОЗЕЕРЕЕБЕВОРІ МОЕУВУАБІ автТОРЕМ

АОБІ ЕЛОТЕОВАКОВУАОУ ВВ АСЕ

ЗЕО ІО МО: 31 (Оєзигїомібгіо апйісапив, Оа.ріог)

МаккмМмМТТрОМтТАТАНМАМАМ5ЕМААІУРІТРОЗТМОЕЕАООМ ААОСАКМІРСОТІ ТІВЕМОБЕ

АСААСАМУНОИАЇ ААСАЇ ТТТЕТАБОСИ І МІРММУКІЗСЕ ГРОМЕНМТАВАЇІААНАЇ 5ІРЯСНОВІМАА

ВОТОагАМІ АБ55МОЕАНОМАЇ МАНІ ААІЕЗМУРЕМНЕРОСЕВТЗНЕОКІЕМІ ОМАОМАБІ ММОКАЇ А

ЕЕРЕВАКЗМУМРЕНРНУВатАОМРОІМРОСВЕААМРУМІ КУИРИМАЕММОКМААТаТВЗУКІ ЕОМУСАРО

АЕВМІМ5МО55СЕТІЕЕМІМНІ ААКОаОКІСІ ІКУВ МАРЕМЗЕАРЕЕААЇ РАБАКМІТМІ ОВТКЕРСОАРОЮ

РІ МІОМС5ЗАРМЕНСЕАМРКІГ АИВУСІ О5КЕЕЗРАМУКЗУМОММ5ИАККМНЕТМаєррУтатві Р

ОМАРАОТТРКаТтІОСОРМаІ САрИТУаАМКОАІКПИОМТОЇ ЕДОСУЕЗМУОБККЗОСІТІЗНІ АВРСЕК

РІОБТМ ММВАЮУМАСНМРАМУМСІТМОІ ЕС,ІКОСІСИ ТЕМІ МЗРМ/ БІ ЕОМОКНІ РІЗСаІКАТІАМККІ КЕМ

МІОАУКІАТОМОЇ СОаВІММІМОТАРЕКІ АОМІ РЕЕКАМОГ І КК5БІНКАМаККОаЕКІМКММТСАМООАМТ

ЗІ ОБЕЕКУРАБМКОАРАЕТКАЕРКТМЕРЕРКМУМКРІТООСОКІ РИЗАРЕАВСОВЕРІ аТ5ОРЕКВОМАЇ

ММРОМУРЕМСІОСМОСАЕМСРНБАЇ РМІ АКЕЕЕЇ МОАРАМЕТАЇ ЕАКОКЕЇ КОУКЕВІОЇІМТІ ОСМИ

СОМСАВІСРРКЕКАЇ УМОРІ ОТОВОСАОМУРМІ ЕМААВІРУКБОЕМІ РАОБІ КаБОРОЕРІ МЕЗО дДО5Оа

ССОЕТРУУВАМІТОЇ РЕФЕВМЕІАМАТаСЗБІМаАЗАРЗМРУКТМ5І ЧаОСРАМСМ5І ЕЕВААЕМа ГО ММ

М5МЕАВАТНІ АОІГААКАГЕБОАБИаОрУКЕАГ ОСУМ АЯКМОРІКЗКЕМСОКІ КК АСОКОСТ ПОТІАА

МОЇ УТККЗУУМеЕаСраУАМОСУСаИі ОНМ АБЕЕОУМУгУМОТЕМУЗМТО4О5ЗКАТРТОАМАКЕ

АААДОКАТакККОЇ АВМУМТУЯУУУМАТУЗМИаУКООРІ КМІ КЕАЕБЕРОРБІ МІАМАТСІМОСІ НКОМ

СКБООУММТАУКБИаумМРІ ЕВМОРАВІ ААОСКМРЕОЇ О5КАРОСЗМЕЕРІ МАОМАБГАМІ ОВЗЕРЕВА

КАІГААОМАНЕГ ОМАЕКЕГЕВМААТМІРГЕЗЕАРАВОКАВОЗМОГСЕСАЕРСТАООТРММАВРОЗОЕА

СсРОМААатТЗЕООСОІ ЗКАТКК

ЗЕО ІО МО: 32 (Мовіюос вр., Мв5.ргог)

МЗОТЕАТІПАМЕАМАВМАУКІ МЕМІАІУРІТРОБАМИЕМ АРАМ/МАЕСАРМІ УМА ТУРБУМОМО5Е

СОААСАМНОАГОТавбІ 5ТТЕТАБОСТИІ МІРМІ УКІССЕЇ Т5МУУНМУААВЗБІ АТНАГІ Б5ІЕСОНЗОУМА

АВаИтТагАМІ СЗА5БМОЕЗНОРГАПІАНААТІ ОТ АУ5РІ НЕЕЄВСЕАВТЗНЕМОКМЕП І АВОБМУАЗИМЕОКІЕ

АНАРАВАГ ТРОБРІ І ВИТАОМРОМЕРОАВЕСАМРУУМАСРАІМОСІМОКЕСЕВАТавВУМОІМЕУНОАЗО

АОАШІМа5БасЕТУНЕТМОМІ МАВЕЕКМОМІ КУВІГ ЕАРМИОМЕВЕМОАЇ РНІМОАІАМІ ОВТКЕРОБА

СЕР МООУМТАІНЕСМУ УМКММЗРУРБРОБРУРКІПИС ВУСІ 65КЕЕТРАМУКАМЕОМІ АОАТРКМНЕ

ТІСІМОСУТНТЗ ЕМО РБЕЗБТЕРОМУУМВАМЕУС аЗБОИаТтуУсСАМКМЗІКІИВСЕСТОММАОСУгУМОКК

ЗазМТУЗНІ ВРа5ОРІВЗТМ ІЮОАМЕаСННУСГЕВІЕМІ МАААНОСАТІС І М5РУМААТУМУУЕМІ РІК

МАГОІГ ОКО КІУМІМАМОМАНОВаМСаВІМТІМОМСЕРАГАСМІ РЕМОАІАКІКОАІЕКТУаККаТмМЕМ

МАММГОАМООТІ ЕМІ НЕУКІРІЕЕКОКУЛОЕЕАГІ 5МОЗРЕЗТЗАРКЕУВОМІ аКІМУУМ ОСІ РУТ

ГРРОСТЕРТОТАКМЕКАММАОБІРУМ ОТОІСМОСЗКСУММУСРНААІВАКУММОРБЗЕЇ ЕМАРРТЕКВМО

АКОВОРАМОКЕТІОМАРЕОЮОСТОСАІСУММСРАКМК5ЕРБІ КАІММАМОЇ РІ ВЕОЕВОМУУОЄБРІ МС М

РОААМІКІ МОТВОСОГ ОЄЕРІ РЕЕЕЄВВАСАССОЕТРУМКИ ЇЇ ТОЇ ЕЄСОВОМІАМАТаС5БІУСИОМІ РТТР

М ТКММОСІПаРАМУЗМ5І РЕЕОМАЕРСРСУВІ І ОКОАЕРААЕ ООБЗТЕМИОЮМІ МОБІІЇ КАРОКТЕА

РІМ/ ЕОВОВІЕГІ КОСІ ОКІРТЕРОРМІ КЗКІОМІ КІ АОМІ УККЗУУпасосУАМОІЮРаСІОНМІАЗОВ

МУМІ ММОТЕМУЗМТаСО5ЗКАТРКААМАКЕААБИКРАОККОМИЇ МАМММИамМУММАБМАІ аАКОО

ОСТІ КАРГЕАЕАЕОСРЗІШАУЗНСТАНСІММТТаММООКАЇ МЕЗИаВУЛ І МАУМРІ ОБОСКМРІ ОГС ОМ

ВА5РТОЗМЕОЗМУОЄЕМАЕКМІ ТКЗКРЕМАКОІ ГЕОАОАЕМОАВУОММОМІ АЗА

ЗЕО ІО МО: 33 (Е. соїї, Єс.уаймМ)

МАМСУУТаміАУМсттТампт ЕО55КЕКЗЕМаМаТагамикІММрЕМРРааТКкКРЕОЕАМКІ МЕАТОРІ.

Та5БОАРС5З5ЗАМУМІТ5І БТЕТКОМІ ММОАНМаСЕРААОМКЕАаМОМПЕСКАКЗРУМІ КІКООКМУ5І ЕК

АРРІЖОаКОаТВАТТЕЕІСВІ ТРЕТСМААІСОАСЕМІ МРІ МІ МЗАМНОСИАСТОАІМа5кКМІ КАІАМ

ЕТКОаУМІАОВОЄЕМКАІ МОУММТЕ ІЗАМММНУМРЗТРОБУАЕМЗОРКЗАУ/ТАВКИЇ ЕМО ААЕСИ

РІЕТаЕІРРаОМОМТМаєвАтТУКОМУЕОЇ аРААЕКУТУКМЗасСнНЗоСРІАВСМТОММІРАУКЕРСУРЗТОСМ

ТОМАМЕМНТТІЕРМАРКОРЕОКО СС МІИМІ Ма МЕррхусаігмсмМмао!і НнарЕТтУСУЗКОаМЕКАМІ Р 60 АЕБЕМАБІВМ РОЇ ЕАСОММРІКОЕМУ ВІ АНАМОЕЇІ ЗНІ АВИБМАІАЕВММІ СЕЕМУОМАКМКІ МР Е

СМРУННАМЕАБАОЮМОа5ІММСМЕМАОСМТНТНІМР аа РІ КГОВЕМАКЕЇ ГАЗЕОСАМОЕТКМУТРІМ

РАКІКМАКМУ5І І ВМС НМАМТІ СМ ММ РМТУ5РІ КЗАМУВООІ АГЕАКЕРЕКАІ!ТЯЕЕМТОЕКІ ОЇ АА

ЕВІЕТІЕНВАУТУК МОТКОМАМЕНОГ ІСБМУМЕОКОРОІРУЕТЕСТОКМОВООМНАБІТМЕУКЕМОМУ

ОРОГОЯСРТАЕТІГОВІ СІГЕОІААОІААНМ РА

ЗЕО ІО МО: 34 (Е. соїї, Єс.уанм)

ММУРМОАРІ С ОІСІ ТА ЕРІ ВІЗБаКаг АС ТАРА БИ ЯСКОЕОТОБатмМаі ІМТРКОМІ МТОВАВ

СТаснНасСЕІ5СТМЕМравматЕЕ5вВІКІНАМУєРОаЮОМОаМмазаацаї Марі МУТАОТОВОСКЕРОСММ

МСРІБАІТМ ООКЕССІТМОНКАСІССЗАСТТАСРМУ ММАТУМТЕЗККОЗКОМІ СОЕСАМАСРТИАЇ КІЇ

ЕМУКОІТМ

ЗЕО ІО МО: 35 (Сіатегїа арісоїа, Са.ргог)

МИ5ОАМЗАУЗЗМАМУВАМЕМІАІУРІТРОЗ5МАЕОАЗТУМАЕРОКРМУРСОІРАУММЕМОЗЕАСАІАТМ

НОАЇГ МТОАГАТ5ОЕТЗ5ОСИ І МІРБІ УКІАСЕСТРЕМІ НУАДАВТМАТНАГ БІГРФОНЗОУММЗУВОТавА

МІ С555МОЕАООІ АГ ІЗОІАЗЕКЗВІРЕМНЕРО С ЕАВТЗНЕММКІМ РІ БОЕОІНОЇІ І РНЕАІКАМАЗВАЇ Т

РОКРМІВаТ5ЗАМРОТУРОСВЕАІМЗУМОМАМОНУМОАМТОРЕКОТаВвВКМОРЕРЕМУМСАБОАЕВИМІМ аБОАБТЗКЕМІОМИЇ КЕМОКМОМУМІМВІЕАВРЕЗАОНІ І АМІРОБУККІАМІ ОАВТКЕРСАОАЕРІ МІ ІМТ

АГРАЕБІ БВОЕВМТІРОМаСАУСІ Б5КЕРОРАБМІ СІЕМЕЇ БІ ЕКРАРАЕТМСІМООІТИІ 5І РІ РОКТІ

РОКЗАЇ ЕАГ ЕМа! а ТУ5ЗАТКММІКІПВО5ЗРЕУМОСУРМУМОБККАСИї ТТ5НІ ВУМІОРІОБРМИІТ

ЗАНЕІаСНОВБОРІОКМОІМОКІ КМОСІЕС СМТ РУМКОЕМНАСРКЕМОМОГ ІККВАНЕМИМААКІАВЕСМ

І сАВІМТУМОААРЕНІ ЗОІЕКМОЕБІБЗОЇ КЕМАКЗУЗБЗКООБЇ МЕМММУУКАЇ ОІГАІТ5І ЕОІРІ МСМ0ОО5 5РБОМРРІМРММАРОРУКТУТАТМІ АС О5І РИЗАЕРРОСАМРТИаТТКУЕКАМІАЕЕІРІМКОЕ! СТО

СМНСАМАСРНААІВАКУМЕРОАМІ МАРОТІ ЕБІ ЕУКАВОМКОаОВУМІ ОМАРЕОСТОаСМІ СМЕМСРБ

ВОВММЕОІКАІММОРАІЮМСОТОВУМЕЕРЕЗАСРОВОІКБІ ОВІОІВТ5ОЇ ІТРІ РЕУ5БСАСАИаСОСЕТРУ

ІКІСТОЇ МОН АІАМАТИаСЗБІМИСМІ РОТРУТТОВЗавагРАМАМБІ ЕЕОМАЕРАГ аУВІТУМОНАК

ВАГ ВІ ОН АСЕІ5РЕЇМІТ О5ЗОАТІАЕКАТОМО І ВЕОЇ КНІОБАЕАКЕТ ЕОТММ ОКУ АСа,О

ЯМ АУВІСРСИаІ ОНУМБСТОМУМІ МГ ОТОСУЗМТапООБКАТРМОАМ5КЕАОІ СКНКАНКОЇГ СМ5І

МММанмумуАОМмАаТавзої МОТІ КАГОБЕАЕАМОрОИаРБІ МІАУЗРСЕЕНОИМОЇ АКЗНЕОМКОЇ МКБагМ Р

ГУАУОРААБЗАЕСКРОИЇ МІ О5КЗРМБЕАЇ 5511 КЕОВЕВВГЕТІ ЕРТМАМІ НЕВЗТКММУМЕЗКУВНЕ СО

МІ 5545ОІЕТРРОБ5

ЗЕО ІО МО: 36 (Мовіос 5р., Мв5.Трі)

МЗМОСАРОСААМУМЕЗИЗАМЕУМЕУМаТмМАВОМЕЕТООТМУРІВКЗОЗУМРІВМРУМАММОЕМОВІТ

ВІ аСКІМТІОТУ5АГ ОО МавВТТАТУМУТОАЗЗЕІАКЗЕОМОКАТРУКТОЗСАКАРАКРРАЕЕОЇІ КККОМ

Кам'мМмт'ТОАКАКНАЮУРУМІ МАРМАРЕТаКМІЗМЕРІ УКЕВС,СІСТМОНІКЕОІ ТаСМІ КМІЕСОБІСНПРР

СМОКМОаКРЕКІ ВІ УБІАЗТАНИаОСОМООКТІБІ СУВОГЕУКНРЕБСЕТУМС,МСЗТМІ ТНІЕРАЗЕМКІТ

СРМОКЕМІ ГРООРЕАММІМІ АТаТтТапдйРМАТМІ М/АМЕКОАЕВААМРЕМОРКО БУ МЕОСМРТТРМІЇ.

УКЕЕГЕБІООКУРОМЕВІТМАІЗВЕОКМРОСИаВвВмММІОВВМАЕНАОЕ МОГ ІКМОКТНТМІССІ ВОМЕ

ЕСІОААІ БААААКЕСМ ТМ БОМОКОЇ ККАСВУМ/НМЕТУ

ЗЕО І МО: 37 (Бупеспососсиз 5р., 5со рі)

МУСІТЗТАМЗТамМО5МАМВІ РІМЕУМаГ СаравмМмЕМ5І УАКЗатТРІТМРУАВММОЕМОВІТКІ СА

СКІМ5БІВРАЕСААОЇМЗЕВОЗЗАОАБАОЗРМАБЗТКІМНРКТТОТ5УРУМІМА РКТРЕГ ЯКСІЕММУЕЇ М рЕСаБатТУВвНУТЕРІЗЕСОЇ ВМ ЕСОБІСПРРИЕЄОКМОКРНКІ ВІ УБІАЗТАНИОМЕОМКТУБІ СУВ

ОГЕМООРЕБСЕТУУСМУСЗТМІ СМ РУАТОСУКІТаРМОаКЕМІ І РОСБЕОАТУМУМІ АТаТОаІАРЕВАРІ.

МАМЕКЕОНЕОУКЕКОакКАУ ІРСМРУТАМІ МКООРЕКМААЕМРОМЕВІ ТМАІЗВЕОКТАОССЯКУММО

ЗВУБЕМАОЕЇ РГЕМІОКРІТНУУМСИІ КаОМОРРІСЕТЕТАЕАЕКВИЇ МУ ЕЕМААВЗМККЕНАВУ НМЕМ

У

ЗЕО ІО МО: 38 (Е. сої, Єс.Трг)

МАМ УТОаКУтТКкМОМуУТрАЇ ЕБІ ТМНАРМІ РЕТАСОЕТКІ СІ ЕІОСЕВМОВАУЗУУМОРОМРОГЕ

ЕМГМТУРРООКІ 5РАГ ААІ КРИВЕМОМУ5ЕААСЕЕМІ СЕМРНОСЕТІ М/МІ АТаТАІСРМІ З ОГСКОГО

ВАЕКМІ МІЕІМНААВУААОІ 5МІ РІ МОЕГЕКАУЕСКІ ВІОТУМ5АЕТААОБІ ТаВІРАПЕЗОБЕЇ ЕБТІСІ Р

ММКЕТ5НУМІ СЯМРОМУВОТООТГ І КЕТВОМТКНІ ВАВРаНМТАЕНУМ

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

«118» Мапи Віз, ІМС. «ї2а» МЕТАБОЛІЧНИЙ ІНЖИНІРИНГ МІКРОБНОГО ПРОДУКУВАННЯ ТЕРПЕНОЇДНИХ

ПРОДУКТІВ

«130» МАК-оЯчРОЗВУ НО - яЕНЗ «іза» 05 яоуачв,7а? «іЗзї» дві -ві-26 «ев» 28 «ітя» Рвізпвіїїв)з версія 3.5 «вв» 1 «ЕІР» 375 «І ВЕК «813з ЕЕ. коії снах 1

Мек нія йзп зів АРТа Бго ї12е Біб ве АгЕ уз Бек Тг о дгеЕ ї132 Туг і 5 ІВ 15

Заї сіє Азп Меаі Бго Тіз сіу Азрозіу дів Бго Іі Аїа Маї лій бег та 25 за

Ме тВкоАзи ТВе о АБЕд ТБготне азроУві Біб вів тб о Маіф Аблобія Ії ще 45 уз Аїя ів» біз Абе о уаі зіу АБа й5р оті Маї Ак Уаі зег Уві рко

ТНе Ме до дія Аів біз діва Рне ів ів І1в їув сія біп Маї Аа

Бе З 75 5 маї Бра іеги Маі Аза Ар Ії Ніє Ре Ар тре дкв ї11е дід іги вух ва а зь меаї дів 5іб Туг БІіу Маї Азв Суз іем о АгЕ ТІ дхва о Бго піу дм 112 іа ї185 її піт два дій піз дев о ї1е дев М зді під - пе до 2 сх - бі вхв міч зіз АгЕ ї1і2е дДгЕ Меї Уві Чаї Азр огГуя« дів Ягре йсро в о 115 155 125 йзп хів вга о їїе дра Іів Бі Уві дкп дія Біу зебоіго Біб і е5 Ав іа їі55 ії іти Бі Бій іує тук пі бів Бго ТВе оБко Бій діа іев іви Біб бЗег 1-5 ї55 і155 ї15а дід МЕТ дев оНіз Маі йср Ні іви др о дгр їги Ап вве др біл Бе 155 ї7а їУ5 іуз маі Бег маі 15 діа Баг д5р чаї Ре ігн діа Маї бій Бек тТуг 1-5 1855 Ма

АкЕ іеб іец дів ге дій Іїе д5робіз Рго їв Ні іев Біу Кіз Тв

Ії ща 5 ій Азїз зі бБіу дів вк хек Б1у Аїа а) зує хек дів Бі БЩіу ії г 218 ді аа сіу їгецй івц їео Бек дів бі Тіз бір Ар о тйгоісу Аг Уві Заг ої з

ВІ ших З ад дід Аїз дбав Рго зві Біб бБіш тів ї5 ві Біу ББе дБр Кі іо їх та га Ева

Бег оіегз Аке І115:АгЕ 5Зек йгЕ 5ІУ І12 А5п Ре ІЗе діа Се5 Рго тТвг вва еВ ау їу: Хек дк сій піц Бве Асроуві Ііе сі Те Маї Аб5подів їв бі в Бе 8Е сіп Аг ів Бій Аза ІЗе Ті таб оРБко Меї дзр о Уаї 5Зег Біг 112 спі ва ЗВ щава пу Уві Маї Азп пі» Бго біт жі дід ізо Маї Бен Тк їм Бі Уві

Ве Вів ЗЕ зЕВ

Так обіу зі дом іуз уз жак біу 1і2ц Тук біс бер бБіу маі Аг і ув 335 зза з35 азр о АгЕ іви АзооАзп деп дер Меї І12 дхр сія іец бів Аїв Агв о ї1е зав За5 ша ге Аі іух Аів Бег обзій іги Авзроші вів АгсЕ Абе їі Авор оУві зіп

ЗВ зок зб ціп ві іп вує зв

ЕЕ и «вії» БІБ «ВЕ» ВК «із» ЕЕ. коіїї «80 г

Мет сів Ті ів о іги діа Аза о Рго АгЕ Бі вне Су Аіа зі Маї др 1 в їв 15

АгЕ дів тів хек ті Узі бій деп дій іо діз Гі тТуг Біу дів вга

ЖЕ 25 а

Тівг Туг Мві АгЕ Нів біз Уві уУаї ні бза Агш Тук чаї Уві д5зрожек

З ЗВ аз ен Агв Бі АгЕ ЗІ діа ї11іе Бе ті Бі: 5ій Іф» 5зегобБіш Уві Бго а 5 ев др Бі Аів ї11е іє: 118 ББе о пег ойів Ні5 злі Уві зегобБіз дів Уві

Бь тв У ви

АгЕв о йсз Біб Аівз гу5 МекоАгв др і ви те о Маі Ре д5родів Тег су вх за ЕЕ

Рг іга чаї таб гу Уві Ніз Меї бій Мві йіз агЕ АТа Бек АгЕ дгЕ за ї85 ї18

Зі біз бів бек Біг їем Іфе о сіу Ніє вів бі нів Рео Бій Уві зів її5 ІЗ 125 зіФ тт омеї сіб дій Те Зве Аба Бра б3б бір біб Меб те іви Маї їз і135 їди бін охає Рго йзр о бзр Уві тгроїуз іа о тБг оУаї іуз й5п БІЛО Іс; їу5 їлЕ і5В І55 і їй бек ве Меб тб біб Те о Твеоівго бек Уві Агро Азр о тТаг баг Азр ї6б5 ї178 їх чаї Іі Азр Аїз іо Аве іусє Абсд ББе бго їуб5 ІЗе Уві бі Рга ВгеЕ 153 і155 158 їув йви ар І12 Сує туго дів Твг о тТНе Аяй АгЕ біб біз діа Уві АгЕ 195 вка 885 іа іги дів біз бів Аіа бій Уві Уві іех Уві Ууді Бір бек і в АБИ з1 215 228

Зег обег йлп зво вх йгд іви Аіз біб іе: АтТа вів дгв Ме Біф і в

ЗІБ Вк за5 са

Аг Аіа Ріе іп Іі Дзр Вхр дів іуз йев Кі бів із Зій Тер Уві їщО 258 їя5 вах 313 ци вто что бів фу у о ШИ ИчЯ зЗіУ хі бу ід було йт уз Бі шМаї Гуз Сус Маї біу Уаї ТВк Аіз піу дів дегодів га Аа

Ба Бе ув

Тіз і2ги Уді біз Аби Уві Уві дів АбБ іви зів Біб іга бів і БІ тя 55 28 біс дів тіж Бро ів піс щі АДквобіз Біб Аби" Іі маї Ре бі: Уві ща 85 хай

Бгпоіїує біб Ге Агро Уаії Азр оті агЕ Біб Уаї дер

Зах 18 ЗЕ «гів» 5 «Ії БІВ

ЕВЖх РН «тіЗз ЕЕ. соії «ач

Меї бек Рбв Аз ІТ АЗа їз Туг РК ТБгоїви дів Ге Маі Азов озеє ї - ІВ і

Тк бів біб ів дев еп оіїво Рео іїуз ій его іегм Рко іу5 ів Суб 2 25 за д5р Бі ів ДгЕ Агро Туг ій івн о йха ЗвгоУзі заг одед Зегозег о піу з 4 5

Ніз Бе Аїв звбосіу ген оБІу ТБго Уві вір оіви тБгоуУаї Аїв ів Ні ча 55 ща

ТУук Уві Ту дсп Тг Бо ББе дробів івеи ті Теройхр Уві Бі Ні 55 т 8 Бе біп дів тує Бго Нія руз Іі ім оте БІ1у АгроАгЕ дві ІЇ112е б5іу -Е 5 пе т лу т хіх оз п з що 34 диня пе зу що п г ОІіе дга пі» їу5 йіу пір ів о Ніз Бга Рпе Бго о тгбо ага о сіх а їв ій зї18

Ббет озівз ТУ Азрдоуаї іен Зег Мві біу Ні бер бек ТНгобеагкг Ііє Бе 115 125 ї25

Аіа біт ІТ біс тів аїв Уві Ата дія Біб те б3и бір іх бзи йге їіза 155 148

Аг о Твг оМві Су5 Уді 112 Б1у дяр бі аів І112 ТК о Аіз сіу Межї діа 145 156 ї52 156

Яре сій Ата Меї Дхп Ні дія піу Аср тів Агро Бгео Ав Меб о івь маі

І1Б5 їх ї75 тІі2е із лев Ап Ахп бів Меж бек І1е бег йіш длл о Уді Сі Аів і ен

І5и 385 іа дБ два Ніз ів дів бій ів ігб Бек Шіу ру іви Тук Бек бек ів 185 за за5 дев осів БІіу шіж гу гуз Мві Ре беб о Біт Уа)і Бго вро Кіз іує ій тІВ зії ЗУ із із і ув Агв о Твб бів біб Ні Ііе їуз щіу Меї Уді Уві Ра Біу

ТБгоїго Ве бій біб рен віт РНе Аа тує Ті бі Бк Маї Азвобіу

Ніз Аза Уаі ів Біб рен Іі Тр Твгоіги іу5 дзп Мет йгЕ Азр і го ей 55 зв іїуз чіу ка ціп Рве Бей Ні Ті Меї ТВкоїуз іх Віу йгк обі тУг жі г св січ Бгто Ата шім їу5 АзроБко Т1іе тВке о РБа Ні Аїа Уві Рео іуз РВЕ «ща дае а дер РКО Заг ев йпіу Суб івм Реп оіуз Бек обек біт біф із Бгто озер

Зак 15 315 338

Туг Зег отуз Т1е Ре 2іу йлр о Тевоівз Суз біб тб о Аїа Діва іуз зр 325 :5е 335

Ат їв іван Мет Аїа Іі Те Бго діз Меж дгд БІ щіу бек бБіу Мех вча 355 5 чаї зі Бе его дув Бех Реве Рко д5а Ася Тук Ре др Уві Аза тів пат зе Ява

Аіа сій шіб Ні діа Маі ТвБе РБе діз авіа Біу іго Аїа тів обі бі з7та зтя зва

Туг їу5 Рго Т1е Уві Аїз І1е Туб бес ТВ РНге о івз бій дев дів птуг

ЗЕ за 5 за8 вро Бій Уві іви Ніз АзроУві дів 112 бів іуз ів Бгто Маї ем Бе «18 «і діа ті Ав АгЕ Аїв бі Іів Уві піу діз д5р ові ів тБк Ні бів «2а 825 438 с іч дів Бве йероіемн бегв туго ігм дгбя Сух 112 Рга Зі) Меї Уві тів

Я5 й ща

Меж тк оВга бек оАевоій Ази пін Ст дгр ой Мет фено отек Те БІу «58 «55 «58

ТЖУж Ніє Тут Ас Ав Зі Бго зек дів чаі Аг ТтТуг Рго аАгЕ Біу Ап

ЗЕ5 зв аа зна

Аіа уві діу Мі сзіз Гвез ТБгбоРго ів біб Ге5 їв Рко тів Біу Ру 485 «а 445

Зіу Бів Маї Гуз дкЕ Агв Бі спіш іуз івь Аїд тів ів Аха Реве Зі кВА 55 ІВ

ТВгоївги Меї Бко 51: Аів дія іуз Уві дів льш бек обшь Аа діа ТЬг 5і8 530 5Ія ев Уві Аа Межї Агро ге Уві іма Рко іш Азр Бі: дів ів 112 рез 5за 5ІБ ває іч Неї дів діа бек Ні5 бін дія іо баї ТБгоУВі діб Бій дей АБа

БІВ Б ЕВ їі Явї бі Біу діз йщіхж бег озі Уді дп ій Узі ген Меї дія НІ

АгЕ іУуз Вга Уві Бгто Уві іви Аза отхіе жі Гей Бго д5роБбе ББе їі1г «Ви ВЕ зи

Рг бів біу таб бій біз Бій Меї АгБ о АЇвз біз їй біу ігн вз5р віз

Ба БЕ за дів БІу Меї бін діа уз Ті іуз діа Тор іє дів еВ» 4 «21ї» 398 «ЕРИ» РАІ «ліх» ЕЕ. кеії «ваз 4

Мет їе5 біп ем Таг о Іі ім обі Бек ТБгопіш бек Тіє біу Су 5ег ї 5 18 15

ТВг іга дзроуУуві Уаії ге Ні Ап Рго 53 Ні ББе Агд Уві Уаї Вів ша 5 За їви Маі віз пі їух доп Угі Те Арк Меї Маі Біц Бій Суб іч БЦ а 45

Ре зак оБго Абш Тут Дів Угі Меї Авр ода Бій йід бег АЇв іус і ви ве ве ще їн іт5 ТК о Меж іво бів біз бів Біб бес дв Тве біо Ма іво бек

Би а а ва

Зім зів дій дів Аіз Су5х Яр Меє ліз Азв ген біз Ар Уві Ав під

Е ща ЗБ уаї Меє віз дів тів уві щіу АатТа дів Б3іу іп ів Бго ТБгоїевец дів 158 і55 ЗІ йіа І1іе дгв обі біж їуз ТБК Оті іец іо Дій доп уз бій Зег їн

І Іде ї25

Уаї Тнг оС піж Аброїен РНе Меї йзо АЇв Маї іт5 бій беє і у5 дів іза 135 і48 піпоівгз ге Рго уві АБробек ж Ні Ах Аа Ії Бе бій зЗег ої ем ї45 і і55 і5Е

Бра шій Рго Тіз бій Ні дхлоівго Біу Туб діа йо го Біб 3» Азп пін Уві Маї бек Іів іеноівга Тег обі Зеб бБіу бі Рео ББе Агд Біб ї5 івЕ їв

ТБгоБго івгц Аг йзвоіви дів ТБеоМВеї тТвб о Бго дев Зп АїЇв бух АгеЕ

І55 88 285

Ні Рго АзпоТбробЗеє Мекосіу ага о іїу5 ІЗ 5ег оУгі Ар обег Аія Тег іа 215 дае

А

Мет Мат Ап із Бі їз із Тук 118 020 АїВ дкЕ Тгроїгм РНе Ар 225 238 235 248

Аіа хег Аіа бет бів Меб бі. Уаі іо 138 Ні го біп о бег Уві їі ще 58 55

Ні зег Мет Уві Агв туго сія дер сі Зег о ма)ф ге Аів біп іг5 Бі

ТА шо ий піс Бго йзроМеї Ага ТВгобго Тів Аза НІ Тк оМеї Аїа ТероБго йхн 275 зва З85 вгЕ Маі зп бег піу Мазі іч Рго іец д5р РНе сує ух ін Заг Аа 232 295 зав ін тТагоББе дів Аів го Ав туго Або Аге Туг Бго Суб ів ої У5 ви

ВІВ ЗІ5 325 діа Меї бій діа Бе біз сія біж бій Аза Аїа ТЬБе тк дія Гвб Аза 335 58 3535 іа діа дп зі Тіе твгозві Віа Аа вБае ген дія біп біб Б38 АгрЕ зав за5 ї5и

Фпе тТпк ази 112 Аа діа івци дДвпоіви бек Маф ім бій іуз Мет Азр

ЗЕ зей ЗБЕ

Беж АгЕ 51) Ргж бів Сузх Уві дар ойзр о Маі ігор бек Уві Ар дів АБИ ха яУБ Зах діа ге зіц мві Аза дед о іує бій Маі Мех Агд ігец діа Зак «ійх 5 «81їх 36 «218 ВТ «233» ЕЕ. «вії ск

Мет Аїа те оТБгоНів во АчроМаі Суб Ава Уві Уві Рго дів Аза йІу ї 5 їй їх вве бі Яги Агв Меї біп тк обі Се Рга і бів Тук іти 5ег Її за 25 за сі деп сів ТВ Оті ів бів Ніс баг оУуві Ні лів ів іо дів Ні «в ще го йкв о Уаї уз Агж Маі Уві ІТ дів Ії2 Хег о Бго біб Абп бег АгЕ ща 55 ща

БНе віз Біпоіви Бго гей віз дп Ні го зій Кіа Трголаі Маї хр 5 та 75 як

Бі бБіу Аза Бій Аге Аіа Ав о бег оУаі 1-5 Аів бі ів 15 дів дів ща а З5 сіу Ар дів йдій ТгроМаі іви Уві Ні А5р діа бів Агя Рго Сус в за 185 ії

Ні біл Ар о дороівгю дів йгЕ іви ївео Віз гей беб Бій ТВ о 5ев АгЕ її5 ії 125

Такобіу Зі ті2е ів: Ада Аїа Рго Уві Агро др отТвВе о Меб і у5 Аг АЇВ ї138 15 і45 бін го Зіу Ру А5в о Аіа Бі Аіа Ні5 тБг ота) Ав о АгЕ дп бі ве їа5 іча 155 158

Тер Ніє дів ге; Таб оРго бів Ре Бке Рго йгвЕ зі ій ів Ні Ар

ІБ ІВ їт5

Сух Гей Таб ойгв йів іенойчав бів бі Аїд Тс тів ТнгоАзр біс Аа 158 ік із бек Аїа іги бій Тує Су бі Бве Ні бо бій оіви Маїф сіб піф АгеЕ

І еВ 85

Аіз др Аза Ті уз Уві ТБеодгЕ Рро 5БІ д5роіео діа іго дія біб ій гій 22 не Ту ізо тб ог Твг о ІЗіе Ні бів Бі) да ТвЕ тая 2-5 з3а «вів Б «ЛІХЕх лих «2І35 РЕ «135 ЕЕ. со1ії «ща» 5 меж АгЕ Твгозіп Тео о Рго Бає бго віз іух ів йслоіен БвВе ігу Тук ї з їв 15 ті тьгобіу зіп Агн дів Аза сіє тТук Ні Тргоїєз бів ТВгоівг5 ВНе

З 5 8 пів не ів) Ар оТує біу дБЮ Тр Іі Бег Ті 13 ге Врд Ар о Азр «8 ак і й 112 АгЕ іє гез тТве оБго Уаії 51; бі Уві бів Ні 515 Дар

В БЕ 5

Депоівен тів Уві ВгЕ дів Аза дгЕ ів іо Меї їу5 Тг Віз дів Ар

Б Уа 5 ща дек обіу йгдобгноБко тТвгоБіу Жеговіу дія деп ІЗЇе Бек Ії д5р ух ве ве ЗЕ

Агвіво Рго Меж бі Зі Біу іви бі зіу піч бек бег Ачп дів дів ща 185 її

ТР Уві ігуи Маї ДАІ гц Аа Ні іга Тгробіп Сев бБіу ів бек Мет

Ії ї125 15

Ар осі ів Аза бі ЩебЄ піу іец Тк оіго бі дів Др о Мві Рога Уді

ІБ 125 14

ББе узі Ага щіу Ні йіз діва Бе діз Біб; бі Уві 0іу Бій Рів г го ї4х її їх 155

Тек орго баі йза Рго Рез Бі 15 Ткр оТує їз Уві дія Ні Бго 5іФ їх ї7а їх5

Мві бек тів Рго Те Бко уві тів ББа і ш5 йзр Рг Бій іви Ркго АгЕ їі88 1855 і58 дсп твВеоРко рух дкв о щаг Іі сіб тТвВбР ої ів оіє5 Суз ші Ре бет й«кп о йхр обу» йпім Маі Тіе дів деж іус АГЕ Ре АгЕ біз Уді Ахр АТа 218 15 га уУгі ів бек тТгроіго івем бій Тут діа Бга Бек АбЕ їз тТВробіу ТВе 225 238 235 зав

Оіу дів Суз Уві Ре діа вій Бе Азрп о Ті. бів бег біз вів Ак вій зак р, 355

Маї іо бін біб Аів Рей біз Тгроівм А5п йпіу РБе Уві Аіа іу5 біт діа йзпоіен Зеє Бга із Ні Ягве дів Меї і ви т» ав «жів 7 «я1ї1х 155 «2133 РТ «ВІі8» ЕЕ. «її «апа» 7

Беє агЕ 112 пі Ні діу РБа д5об о маї Ні Аід Ре біу Бі» Б3а пу 1 к Ів її

Ред оїіве Ті тіе піу йпіу уві дги Бі Бга тує Бі їуз Біу іги г ем

ЗЕ 25 за дів Ні бен Азропіу др мві діа ігев Ні Аїва ів БК о йБр Аза г ви за 45 іем біу дія дія Аїя ізн біт Абротіе Біу іуз ів ВБе Без Аа ТК 8 55 ке др Рго діа Бе ої5 біу Аїв Яхв бег АгЕ піц оігц іївем дев бін лід ща 7а В 5 тероакЕ пгя тів бій дів ів піу Туг Ті оівнобіу дп омаії Ар чаї вк а 5

ТвкК отхіе тів Вів біп дів Бра 1у5 Мет ів Бго Ні тів го дій Ме

Еко 185 115 ігд Жаї Рпе тів дів біб Я5в о іем біу Су« Ні Меї Ар о аАзроМаї Ап дгд Чаї Ре Іі дів біб 85; сіу Сух Нії Ме Ахр йзр уві А

ІБ ї-а 175

Уаї іже дів Так о Тре ТВгобібв іуз5 їео о бІіу ББе тк Біу ге Біб Бій ле із іх пі тТіе дів Сье біб дів Уві бід ївб ів; Ії ус діа ТБ іує та5 ї5а ї55 «гій» 5 «2131» ІВ: «818» РЕТ «23Х» ЕЕ. соіїії сно З

Беж бія тт обі Кі мМаї Ііз іем о ї2го д5в АТа ів йбіу Мі Рез тнг ї 5 і8 їх біу таб ген бій іїуз Туг діа два Ні тТАг о АТа хр о тТбгойгв і вц Ні а 5 Б івн Аіа Рв Берг бет Тгроівеи РБе дл ліз їу5 бі біп о і2еи ів чаї «а 45

ТвгоВгЕ йгя А1в ів бегоіує їу5 Аіа Тев о Рго біу Уаї Тгротвг аа ща Ба ща зак Уві Су Зі Ні Бро сій іем о біу Бій бег Або зів АБродДів Уді 5: та та ви

Іі Агв агЕ Сус Дкш Туг сій іем овіу Уві шій І3Зе Тк о Бго рго Бі 85 за зе ваг отів Тут Ргоа бро РБе аг Туб вгш Віз ТБгойхр о Бго бек біб її8 ї88 ії155 і зві бій А5в бін Уаі Суз Рко Маї рКе віз діа дгЕ ТР ТК о Бегодів 125 125 іїви бів Ті Аха Ав др обі; Уві Меї А5ротТуг о бБіп Тер оСуз Ав ої его ї158 155 148 діз в5р о Уаї іеч Ні бі Ііїве Ар о йЗів ТБгобго тТгродДів Бе Заг Бго 145 ї155 із і65

Тер Мет Уді Меї біб діа тЬгой5п овге піс дів дев Бух др оіви йо с м шо 5 ї65 1258 ї75

Віа вне тТаг бів іеб гуз їв «шівйх а «жїї» ТЕР «віз вт «БІЖЬ Є. севії чно а

Ме Іі Таб Іі Ав піу дози біу дід Уві Аїа Зеє таї дів ББе йдге ї - 15 15

ТВгодеє біс Уаі І12 Аів ї11е туго Бго Т1е ТБг о Бгш Бек заг ТБг Має а а за діва біз сліз ліз Азо діа тер дів бі дом бір іви вуз д5п уві Тев 3 кВ ач оіу зр Те Рко Ага Маії Уві сіб Меї бів бех Бі: Дів зіу Аїа Ііїв

Аза твк Уві Ні Біу дів ів бій тТвб біу діа івц бек ТВ хаб БНе ве я У ща

ТКгобеє его бів ШіУу іш ів ів Меї їі Рго тБгбоген туго іубв і гу з о -

Аза БР; сім оіїен о Твг ого ББе Уві іви Ні Хаі йтіа Аїа Агж тТБг о Уаї та ія ї18

Аіїв тне ніх 81ів ів бег І1із Ре сіу дз о Ніб5 Зек й5р уаї Мат дід ії І-ий 125 чаї Аге бід тВк обі» Се дія Меїф іви Сух Діаз Аза до Уаї хів пін і135 135 ї-е дів бій йвр Ре вів івги Ті Зег біп Іза АтТа ІБ Бен оіуяє заг АгЕ їх 1-58 155 68

Уві Рго Бе ї11е Ніх Ре Ре доро сіу Бе о дге ТП Бек Ні бін тів ї55 ї178 175

Ахроїу5 Іва уві рго іецй дів дер йо Тег Іі ів дйб5роіви Вавї Рга 1-5 їз пів уві жи Ті Азов о Аіз ні Ага вів АгЕ Аїа іегу дво Рго 015 Нів 185 зва хе

Бго Уві Ті дгш БІу тТвг оЗег ДЬа ап Бго д5р ТП Тугк Рве бів Бек гі і Ей

АгЕ іш ДЕВ Тк одзп ого ТгроТуг аза дії мМаї Тут йб5р Ні Уві Бій

В 35 пад піп Аза Мек Аза Азов Бе хек Аіа вів ТБбобіФ йбв бів Ту пів Бгє

ХОЛ За ЗБ вве вів Тут тує БЕу Ні Бра бій Аів зіб Агя Уві Іі тів і в5 Ме

ТЯ 55 За піу зег Аїв Іів:51Уу тТвгосСуз біб бін маі Уві дор бів і еу ївго ТВг шу ЗВ З85

Ак ощіу зви їує Уаї бі маі івб іує Уаї АгЕ ів Ту бе Рога РБе за ах зви зег Діз іу« Ні їем о іем сій Аія ів о Бео січ беб чаї Ягве бегоУуві 355 тів ЗІБ зв діа уаі іч Азр Агв ТР оіує бів Рго біт Ата бів діа 613 Рго ев 3 заха

Тук іви Азвожаі Мек тТвг бів ів 8іБ біс Ата Ре доп дп о 3у зів аа ЕІ за

Дгж бБіш ТвВгоївги Бгто дея уві тів бі біт гр отТукобБіу іец Звевр о5ех

Акв Зіш ТВпгоїгш Бгто Агдоугі Тіз бі біт Ага о тТук бі івеи 5ег бе 385 Бе зе5

ГУ віз Ре обі Бк дзо о Сує Маї ів: вів Уві Ре йіа піц гемо Ах

ЗВ 495 Ба а бівіух ро і дів дгв о Бвв Ті ді БіУ Ті Тег Ази йлзо Ув

Дів дів іух го іух Аіїз дев Бе ТВе Уаї Біу 112 Туг Азп одяр уві зЕ5 зав зак за8

Тнг ой їец хегоігць Бр ігр Бга біб дв о ТБгкоі2о Рг Аза Бег ЛІВ

Зв5 ків зії те іви Біб Аіз іо Ббе о Тут біФф ів; біт бек о дсп Біу бЗек Маї Зег

ІВ 25 аа

Аїа тве іує ляп Азп о Іі іус Ті ІЗі2 бі Ап бек Тв» о Бка Тквотує аз5 яв -85 діа віз БРу туго Бре мМаї Туг д5р баг ої 5 і» Аїа Біу бі івеци ТВе 55 Ба

Уаї Зек Ні їй дгд Маї зе сійш піп Бга їі Агш бек АЇв тТуб вер

Фа та як зав тіе бен Бій дів А5р рве Узі біб Суя Ні біп із бій Рве 132 дзр

ЗЕ5 ква а те тує Бій Меї діа зіц йгфд ів іує Рга біу БІ; 112 Рве іо вер

НВ -5яБ БІД

Азпотве Бео Тук о хег А1а Яр бів Уві ТгрозЕк АбЕ ів Рга ій пів 5І5 Ів БІВ

Маї 5із Атв Уві ін дп осіп Гуз гу дів АгроБбе тТук Уві 132 Ар ва 35 аа

Аіа дів іуз Іі бів ве 510 Суб Біу іво діа Аіа дв І1і8 Ахл те

БО Ба Бе5 вка

Уві Мас сій Меї дів ББе Бе Ні іви ТВ обі Іі іги Бго БЕ Ар ях В я бдву о йів о івх йів дім о їви біз пі дів тів дів оіуз бег оТує бек бег уз Бі бій др іем Уві біз агЕ деп тїгв бій дія ги дів ів дів

Ба ве

Ага біз бБет Уві біз піц Узі Рго їв біб Бго Уві дзп бро НЕ бег

Віа Аза св Бкро Рго Уві Узі бек Азв вів Аза бро йзроББе Маї і у

БІЖ За аа ще

Так оУві те діа дів Мех іги ліз бБіу і вб озіу Яр вія Ге Бго Уаії

Ба ока Бо

Зег Віа ів Рко го дріб ТВготероБго Мек 51У ТВг ОТвг Аги тТгр о 55 ІВ піз їж Атдодхп Ті діа 5320 Біб тів Бго 118 тТгроіуз За Біб іс

БІБ БВ Би5

Суз твкошБіп Стя Абпа о нНіз Су5 Маі вів Аїв Суб Бго Ніз бек дів тів

БІ вч аг

Аки о Аіш іує Мві уУаії Рко Бго б5Бо віз Меї бін Ястп Афа Рго дів Зег тав 718 т5ії5 ТЕ

Їги Ні бег ївиу Азов Уві іух Бех Аг беж Меї Ага Б1іу бій гух Туг 725 73а 735

Уві їви бій уві дів Бго Бі азр осСуз ТВ Обі су5 аБп ів Сух Уві тав так т5а зій уві Сух Бро Дів гу йхродкв бів Али Рг біз Іі ув АЗІЇ 785 за 755 д5поМеф Мек бек АгЕ гц Бін Ні Уві Бі: біз бів іа ІТі8 Ав отук а ТУ 78 а5а рве РБе іо ап ого Бго біз тів со Аг аг ої ує ів Бін АтЕ 785 зв Уч ва їі2е дор Іі о дгЕ та обБекобійп ів Ії ТБ Без івео Бвйеозіц Туг Бет

УК вів 15 січ дів Сує зве ошіу Су» пі із ТВкоРго Тук І1е ічБ ів їв тВг

ІВ ок Ви зій іо Туг зіу Ар одкЕ Меї їв ї1е дід доп о Аїа тк обіу Сюв Бек щї5 вла вт:

Бег Ії Туг піу йіу Д5поїєм Ббо беаг ТБК Рг туго ТБг оте Ав АЇа ях БЕ вва а5п бі АгЕ Бі Рго дів тго дів дов бегоїви ББе біс дер Аза Аїа

Ба тв 855 вза із Ббе іу іво біт Рпе йгв ів тТаг узі Дер осів Ні Дед Уві АгЕ в в-е 835 маї і2ео Аг іви іец о д5ропій вне від дзроіу5 І1е го вів Біб г во

За зак а іеи ТВг дів і2го іу5 Зегодяр Дів ТВгоБго біз Уві Аг йгв 515 бів

В ота 25 ві віз дів ів Абе піп бій їз дол Ворді Аіа біб Аів із бін 338 а35 заг їгц іго Абе др вів дор вів іву Уві біб губ Баг Ті терії ен тів зах 5 55 ава пі» піс дов пі те сд ТУуб вдо Іі 5іє Врае бі піз івц й ху

Біу бі Або Бі тТга від Тук Я ІІв 5іЖ Бре о біу шіу ем А5о НІ а55 ате ат

Уві іви бек оі2ги тк обі йлла Уві Аза Ічі2е іс Уві ги Або те зів зкЗ 85 За був Тук зЗек о йза Тс обі Бі. бій Аза ек іт діа ТБ о Бго і ви біб

Зах зава ІВ85

Аїа маі твг огуз Ре Бі бій НІ біу і ух Агв Гу Від Агв ї ф5 іі 1815 Іс дер іви біу ді бе Меї Неї Мебс Тук щі Ні ді Тук Уві діа їі1вт5 іа їах5 піп Бфе обег обега Зі Віа біп їв й5побіп ТгоЗаї їуб діа Тіє іа 15.45 ія5Е піє біс ія шів Діва Тек о Рго о5іу Рго бек че ті тІіз дія Тук ій55 ізвеЕ Хе зекоБко бух ів бій Нія Бі Тег оА5роівен дів ви оЗек Ні дер їівеУш і975 їз-а8 йіп Меж дгв піп іо ТБеойів тТБе обі ВБе Тева Бра іей Туг ке ів їв ївав

РНе йхв о Рго Агро йгв дів Азро Біб біу і уя івги о Рго ів А1в ге ії 1155 їтїК йвр бек о Аг Рго Рео бЗегобіз дів Бра Біб біб ТВ о ігц ів Ні5 1115 її12а 125 піц бій др Ре Абе о АгЕ ев о Ап обегобБів Бій Рго Бі Уві діа ії1х5 1155 її

Яін біб іве тТероіуз5 Азр о Аів дів АТа Азроіее бБівп і АгвоТує ії145 1155 хІ55 ем єї» 18

Ії» Бе «12» ВЕЖ кЗїіЖ» СіозїгідЗіцт ввххвогіваше хі» ІВ ет дів туго їу5 Іі йід Аза о Бег оСуз Уві его Сує 5іу йіз СБ Дів ії ї і ї5

Бек шій Сує Бра Ма) дсп дів Ті Зег зів зву Аяр хег о І1е РБе уві се ак ще і11е дзр Ава Або ТгоСув І1е дер осу5 піу АД5й Сус Дід йо Маї Су

За 45 тка уві Бі діа ко Уві біп зви ха а єї» 11

Ії ШЕ

ЗІіЖ» Б. соіїії ен» Ії

Беж дкЕ бБег ті ді ге АгЕ Твговбів Уві зі дів дід ізо їв; о рец ії ї і ї5 хві Меж га уаі Аів Уві тгр тів Зег 5іу Тека АгЕ Тгробія Рго БІіу «е 25 ще сіб біб Бак тбв іс ви їУ5 Два дід бе тгр о Уукі тк обі тег омаії зв зв 45

ТВгобіб га тго Бі Уві І1зе Тргоніх ів 112 ів; Бе біу ТеровНе за я Би їги тер осСу5 їво Абе о БНе дев 118 іус дів дів РБе Маїф іез Рбе дів та й в їі іви Ава віз Аїв ті іо Мві бі піз зі Уві Гуз бек Тео Її ях а а іж5 дев іує Маі сіп біб Рго Аге о РБга РБе Уві І1а тер оїги 5зіб Гу іа і-5 її8

Тве Ні Ніє Іі Рео чаі дер БІ вве Туб ТВг їв те Абд Дів пі її5 ї-а 125

АгвоБіу Азпоівги Уа Гуз Біб пів іа Аа бій пі Бу Аа Рів Бк ї1385 їі55 145

Зіп тк оіви Агбд бат нія Тго бій Гуз біб твгобіу Ре діа Ре рт ї45 158 і55 158 хек обі ніх ТВк Меї Бе Аза Афа его тер дів іо Гей дія Маї БІу їх ша їт5 іеноївго Тгроргоа дев Ав АКЕ ТВ о їео ТБг їі йіз ї1і2 ів іви Уді їка і55 іа тгр від тк пі Маї Меж піу зес АгЕ ів ів оіїво БІУу Беж Ні їкр їа5 зва та5

Бглойгв Азвоії ви Маї Уді Аза ТБ оівео Тіз бЗвгботТго від їв) Маї Аїа 21й 215 га чаї Аіїз тТіг Тео ів дія біз Аге тів Су Зі Бко ем ТВг Веб Бго

ЖЕ ВЕ ТЕ ЖЕ аіа Бі біб Ап Ав обі їІ1е Аа бів Акевобзів біз зіч Бег

За 258 «гів» 13 «дії 1158 «ВТ2» ВТ «ВАЗ» Е. саії «НМ» 17

Мет їу5 дя оіує уві Тукоіуз Агро Ра Маі бЗегої3Зе ви узі Уві Тіє х ч їй і5

Туг діа біп о д5р ТК о фуз ге Уві івги Мет го бій АгЕ АгЕ Ар др ве 5 за

Бго йБроББе Тев біп Бек Уві ТБгобіу Зег о Уві бів бів бі ів ТБг з5 «8 45 йіз Бко сів дів діз Меї Аге бій чаї їе5 шій бів Чаї тав 112 дзр

Уві чаї діз біз біб ів; отвгоїен о ї11іе йзо Суз бБія йКЕ ТВг ові Бін

БЕ та У ва

Біе біз тів Бе бек Ні ів дгев ні АгЕ ТК Аза Бго бі ді Таб 85 -а а вгв ой ТК о Біз бег тер оБве бух і2го Аів рей бга Ні вій Аг БІВ 1 155 113 ті уві Ре тТвг обі Ні5 і2гц Аїд туго їує Тброіго Ар оАів Бго діа 115 338 125 діа йіз віз іео Таг офуб Бег тгробек йхп Агро обій діа тів ві: біб ї13а 1535 ї35 ме Уві тів Ап А1в Вів 145 158 «щІівх її «жіїх 5 «їй» БВ «тіж» Е. сії «Ов» ІЗ віз зіу біу дія йшіу біб ї 5 «дів» 14 «ії» кіз «217» ват «215» Мекнапасоссич тагізвінфів

«вах 15

Ме ди тів ів) Іі Абробіу бек Аква о Бій доп Тук Бім біб ви зЗін і 5 ІВ 15

Зі бек Зі Ре Рго Іі бдег РБе о піу Хі зп о івуи Ніз Тврог ж вів

В з 35 біз твеоТго обує тТУк о АБродід Ре йзроБіц гу Ам Гей Бве Сув РБе за «в ав біу ін зі Іі ів) Бго Рів Іі Біу Біб ніб5 АгЕ гц гів Бе Бег ще 5 БА

Рне АгЕ цЗег о Рго іє) тгрой5рд о біу Бе Ні Ре баг Ата Мет Сі шіу 55 та 75 ва

Аіз біу Тугт тб о РБе г к5 Ахдо тк піу Ті біп Аза Уві дід тіг тТБг вк га з5 піу їз бух бін Маї Бго ТББ чаї т1іе Уві ви Азм о щІіу Біб біб др 188 ів ї16 їж5 іо оіу5 Іі біб РНе Меї Рео Бне ТБе Осій сіб; ІЇо тТвк Ар о ї12

ТБ 38 її

Тут біо РБе Аа Азов Іде Іі Ясроіец вве їує БІ іуз Ав тк

ІЗ ї155 зу де дів РБе ів уаї 5іу Рго Аів бебі т5 Тв Тег ойхп Ме сіу бі і 155 155

Тіз тТук бек щі ТП Іі2г дк Ап сіу гу 118 уві БІ біж еко сій 165 їта 175 б5в о тгродіз дів Агв БіУу піу Бі сіу бек Маі іеи тк біз Аії8 нів ї155 155 їз два чаї ів5 Ві аїі Уаї ББе РЕе піу Гуз Ру5 Тв Рг Бій їж» дп іга і5 БІ Іів баї бів бі) Кі Тує Або ру» Рко тує ТВкоіу5 Уві 215 зії ха

Маї ів БР Ні Твгобів ех ТК дев тує Звк обі біз їу5 іу5 Те тЕ5 238 235 ї-В сі біу ТвгоБве сіу йзпойзп Туг Ні Мві тТБг о Мет біз ів тБеовга заБ та 255

Уві ББе ди тгродгвЕ Мат Бго Бе Бі Аброгу Ах вуз йгЕ Меї 155 дБ ее? за іем Ні5 іуз їх5 112 112 біз Тук ББе Уді йай йгв Рв о а5р зі: ай зва їй діа Ііе Бій те оїу5 дп Тер отТвк ой Св Біб біб го сСух Бго Мві

Чаї Сез губ іух Тує йгв іх 1у їв Ні Уві йбротуг бів бга тТуг вах Ів 315 зи сх дл душе 33 т бує Тіз зї- т. й тт тем ді ді- дя біз дів зи Біб Бео Суз Хі сфу Маії Рае Ар І3е Тук віз дів зр зЕ5 за за іу5 мві Уві Ні5 Тег оїіє йБроів ївц Біт Ре йо Дів Т12е Бі: Бе ее ах 5 аіу дв ге Су Бек Тгр ТВ РБе бій і2го і ги й5роАзп зі Меї ін хав зве 55 іїув Бра піз бій маї зі Кіз зд їуз Рго Уві ре Асв Т1а Баг Аи за 5 БУ

Ре біз вза бор біб дер ті івм ої уз Азе ек Меї Ні два Аза БІ 5 аб З що зі аіа уві іу5 іп діа бі) тів 118 Афв Ре бій ТК оА5а Бі: Бе чав дів ІБ піу ів тів Сук гуз бЗег шіу ТБгоагЕ АгЕ ДІВ бі уз І18 125 деп ля ах аа

Зій тіж Тук Рко й5р о Аги Ті іуз Азпо! жа уз Рае бід Ахр Бе піу 235 «88 дав

Уві тук дз оЗег Бе піу бін дкв Бі бів І11Те Зег о Рго тТвк Мет туг да вв дка

Тер ойіа 112 біб дза РБНе Меб Рго Ту ів Іі бія бі іт5 Туг їем

ЗБЕ 78 ЗІ 88

Те нія Тук віз Куз Біу уві Бе іви 515 Рго Бій Бій іви Аза пів ях ща я

Рец Бек Уві рух д5п его їів бі бі ї11іе тбгоіга бід й5поіве біу «ва Ба яв їіе Суб йгш Бра нія Агроіуз ТКр Уві ТВгоБго Іі 112 бі ів ін

Зі5 аа 525

Уві їу5 біб Меї бег о йср уві длп і ви Ах дім бі Зег Меї бі; ів вза 2 --

Рбе їух іуз Тіе діа уз Туг Ав бег аа ї11е біб Суз бро бін Мех вав зва 58 зва піц бег зи дгд аї рух біз із 112 13е діа бі; Афа вве бін ве

Б БВ У щіс да 5іц Бує тТев Бак 155 Біз РБе біб А5а о біу Ап каш Ав Бій

ВЕ Ба: За

Те Кіз іує йгаЕ ЩШаї ви бій із Тук Жеб жі івго ївиз біб ті дзр -ч5 БЕ в

Тевріух ів рує Бі; «ків» ї5 «д3Р» 58 «жі» ВК «2і3» Негіобастенкіцюш тойехтісаїфт

«40в» 15

Мет ів Тут їує ІІ ТВгоАкроАїв Су Те Атїа Су» Біу діа Се Веб ії З ї8 їх

Дер ші» Се Су Маі бі бів тів узі біб біб фіує ух Тує бег ІІв дя 25 за

ТБгобег обер Гуз Маї Ар оСуз Сіу Маі Сух« діа й5ріу5 Суз Рго Уві

ЗЕ ща ах

Ве ів Ті Іі Рго щіу «ЕВ» їй «їз 83 «Еі2» ВТ «213» Ровийотопаз зЕгорійоза «нах 15

Меї дер ів їз ІЇ2е ТНК оАєр др о Сує 118 А5п Сус А5роуві Су шій ї т ї8 15

Вера сій Сує Бро Ап щі дів Ті Зеколім Бі Біб БІ тів Тек Уві їй 25 За

Іі1а Взр о Бго Ах ів Ст5 ТК бів Су Ма) біу нів тує дко біб Рг 5 за 45 бін бу Бій вів Уві Су5 Рго Маф Ав о Сув Тів Бго їн о Ахо Ахв А1в 5 58 в деп маі Пій бек оі 5 Ас бій іеб Меї біб Бу тує Аг їуз ІТе ТВге 7а 75 а сі ів вів «ІВ 17

ФЖїїх ва «ІЗ» ВВЕ «ТЇї3» АРіосвровайінш Уїпвазиюв

«Б» 17 ек Аіа ів Бе Іі Те Ахройів Су» 118 Ази Су5 Ахр Уві Сує ші 1 2 ів і15

Вро бій Сує Рео деп обі йів тів зеб обія Зі бер біб Те тек Уві за 25 за

І1е би Бго о дег іен сух ТВ Р бін Су хаі бі Ні тук бів тк Бек з -а 35

Біп бу» Маї піц Маї Суз Кго Уаф АзроСух ІТів ІГ1е груз Ар о Бго бет

БЕ -а

Ніз біз бі тве біб др Бім іо йгЕ АЇВ вує тує бій агЕ ІЗ ТБе

Б та 75 в сіу біз біж «із» 18 «БТї1х 83 «жашя ВТ «2135 Штучнв послідовність «ВІВ» «ЖІ» Синтетичний поліпептид «ва» 18

Мет дів ів Меї Іі Тг ойєр бів Сує Тів АзпосСує Ар ові Се БВ 1 5 Ів 15

Вро обіц Сус Бео деп обі їв тів зеб о бів бі дев біб Те тек Уві за 25 та

І1іе бБіш Рго бевоівем Сх ТБкосій Сух Уві Біу Ні Тук бін твгоЗек - 45 піп був чаї піц Маї Суз Бго Уді Азр дів 118 Б12 груз А5р о Бго бБеб 5 5-5 ща

Ніз біз біс тве біс дор бір о ївго дев лів уз ту пів вед ї12е тве ща У 78 во

Зіу бін біУ «зіва ІВ «ЕАї» же «Ві ВАК «2133 ЕЕ. соїі «ов» ї8

Меї ів ів івм ті ТБКоіїуб іуз Ст Іза йзп Суб дзр Ме су Зі 1 В ії ії

Ргс біц Сух Рго дом біс дів Іі Зек Меї 5Іу йо Ні 118 Тк Біб 2 25 з

Ті й«п зЗег длюв ія м» ТВЕР Зі Сух МАЗ Біб Ні тут Зі) Те Бех ії я5позег АБроіуБ ту їпР ОБ У МВ) біф ПЕ їугоЗіш Ре Кг я щи ма

ТвгоСух іп гу Маїі Су Бго Тіе Бго дбав ТВ оті Уві ус Аза та 5а 55 58 8іа ніх чаї бій тТБгозій Бі піп івеи Тгродзроіу5 БвБе Уаі івгу Меї та У а

Ні5 Ні діа А5роіуз ї1є «Еш» ше «им» БЕ «Ві ВАК с25І13з Сірет сійтїшж всекобовуїїсья «ах» в

Мет дід ТтТУук іул Іі Твг о Ахродія Сус Уві бе сте біт Бек Сує ДІ 1 а Ів 15

Бек бій Су5 Рг зві Зег вів 112 Зег бій сіу йзротвБг обіп вве Уві 2 25 з іі бор бів АзротТБг Се Іів сін Сух Бі» йзпобСуб АтТа Ази Маі Суб з ще п

ВБро маі сі» йів бго маї пів біб же Б5 «218з гі «ії ЦІ еТІ2з РТ «йї5» Е. «ії «аа тії

Ме Бго іє Іів зві їі івз го Ніх бід дер їви бух Рго Ав зву 1 ч за Ів дід чаї їец зій Від Аз о Зес о бБРу біз То І1е їги дор діа дів ігор а 2 БУ

АгЕ АБО пі їі січ Ті біз ніб ліз Су5 піц іує Бвг оСує ДІВ Су 35 ва 45

Ту твгбосСух Ні Су» т1іе Уаії Агд обід зір Бе Аеробег о їер Бра бін ща -и дегожїає зій віп біб Ахройзор Меї ів Ав оїу5 дів Ткр обі іво іш 5 тя ТБ ка

Бро біш бек АгБ ів бег Су» Бій із Дрв Уві ТБ Ар Бій дово ії в 5 ща ЗЕ ві Уві біз Іі Рго йге туго Тйг о Її18 йсапа Ніз дів Аге біс Ні ї3а 155 ї118 «ІБ ши «к1їЕ» 71 «213» РН «513» ЕстоївВіссвосбоввіга зйвробснлікоії «ва 02

Меї бі; дев оіви бегобів дв Ар орга аі8 дів пій Аів ізо бін Тук ї 5 їв 15

АгЕ Ні Ар бів бег Бек Мазі віп нів Бго діа туго біз біб 5іу ців

ТВг оСує ем ойхв Сух гів оіво тус Тр осо дів Звг оАтТа бів Ар о тго її БУ аа

Біу Бгто Суз заг уві Бр Бго БР у5 івем о Маї бек Аїя йсп п3у Тео -5В 55 ще

Гуз ТБ о Аїв тгр ові Ата вге 55 78 «2іфе 23 «Вії» кв РКК «Віл» Рзецосвюта» ратійш «ай З

Мет хаг ген І1з І1а тТвгодзроазр о Суз 118 АяпоСуз Азромаї Сух 51ї ї ї їв ї5 вго Бін Суб го дм дія Аївз тів баг сія зішж бів іш Іі Туб Мді

Іа 15 за 112 Ар Бго йзпоіеий Су5 Те бів Сух Маї бБіу нів тую бро Бів го -к а слів Суз дій бів Уві Се5 Бра Маї бор оСує Тів Без рен Ар пін дів

За -ї 5

Ні ро вій те Нів Асо біб івеб Мет Зі іує Ту огуз вгЕ Ї13е Твг ке 7я 5 зи

Біу їув Вів кеш те «ЗІ» 85 «3125 ВНТ «13» Вовсобовопах потійг «щих са

Беж бакоїеб чів ІТБе ТК оАхо АвроСує Ііе двп о Сев й5роуві Сує біб

1 5 їв її

Бгто сіб Суз бра два біз дів тів бек бій бі сіб бір; т1е Туг ві їй 5 за т1іе Ай5р орга Ах ів уз Те Обі Сух Мві пі нія Тук йхв 015 Рго а 45

Зіп о сує ЗіБ бів Маї Гуз Бго Уаі Ахв Сув Т1іе Бго бен ойев 0315 діа

Ні Бго бів п обі вій бій іен Явї 838 їу5 тує йгрф о АбЕ 132 тБе «щійх 85 «пВЕЕх тва «2Ії35 РТ «Ії» Вгохорастег зіпеівиоії «ех 2Е

Мет ала іїує Іі сіщж гей ББе Бве обі бег ода ТВб о БІУ ус ТВг йге ї 5 18 15

Куз Уві Аїв іух бек Ііе 15 1у5 йгЕ ВББе Абр о АвробБи ТВг Мет бек воза ше а втводів іо д5п о уаії йсп о дгр Уві Зег дів біп йлр о ББе діа Бі тк за за 43 біп ББе іо ті іеб біу тБрорго тТагоів5 Бі Бі шШРу Біб ів Ргй

Ба Б ща біу іви баг бек дод Сух 1 Ази обід баб о тгр Бій ІЄ рве ів Ра те 75 ве

Ку І1е біб сіу іеб дер РБе его оз5іу іш ТК оУді АБа іги Ре бі ве за в ем о сіу д5р біз Уаї Зі туп Рго бід дх» Туг ів йзр о дія ігу бі та 1-5 318 піз ів Тук бег Ве РНге ів Ав АгЕ йіт Аїд їх5 тів Уві Біє Берг її хе 1285

ТЕробег тв дов Бі Туг біз Бе біз ЗвкоЗек біз дід Уві Уаї вер із і135 їз біу ів Рне Уві Біб ізо діз ісп Аса оівб йвройшв бій бек обі руб і45 їБЖ ї155 ї15Е

ТБгойзр бій дке Уаї Дія Аа тгроїво) діа БІВ Ії Аза Рга 515 Рнг і5Е 1-8 і75 бЗіу івц бек і о їі85а «ву Зв «83із 186 «8125 РЕК «ВІ3» Ахоїовасєтег сагоососоцв «ваз дБ

Меї дів іу5 112 Бін ївц оББе Бе біу Зегоасп ІБгб обі і уз ТР АгЕ ї 5 їв ї5 їуз уві Вів губ Баг їі іє5 ік Дкш Ре Адрво й бін тб Мет Берг я 25 ЗЕ дер Аїв Чаї дсз Уа)і Доп Аг Уаї бее Аівз Бін Ап РЕ дів бів тек з5 «е 5

Сію ке іви 118 ів: бі так обка ТБкоївб БІУ біз бі; бід фе; реж -а ще ще бЗіу івц бег о бек о Азв о Сух бід Аза бід бек о Тгр біз біб Ре г вг5 Рг аа КЕ: вк їуз тів зі: бі ів Ав оББе Же Зір губ ТБ оУаі Аїа ів Бе Біу 85 за «5 із бі Вср обіз Уаї піу тек Бгто бів Ав ве ів АхроАів Мет бБіу їде їв їїй пім іен Ніс: бЗеє РВЕ вне твер обію бр обіу діа іх Хаї чаї бі дів 115 125

Тра бек Твг Ах БІУ Туг обі БЯг обід біуУ бек ТБеб дів Уві Уві Ав

Е ї у л Ї іБа і55 ї48 пі із Ре Маі ШІу їв 8ів івзб йо іс; й5родавп пів ее йдіу їх5 уїу У ї Ї хо ї45 155 155 1658

ТБгойвр обі Агвоуаі Аза Аїв Тгроівн Аїд бій ї11е Дів Бго біб Бе їі5ї ї7а ї19їЕ віч і2ги бек гг ї5и «ів 27 «ІТ 195 «ІІїп» Кт «вії» ЕЕ. сеії «ащах 27

Бет дів ІТ1е те б5Іу 112 РБе Бпе біу бег о Дпр о тБробіу дк о ТАаг осів ї 5 їв і5

Ап о т1іе АЇІВ уз Меї Ії сіб оїух біп ів Біу 1у5 Ар Уві дів дор м 5 за

Уві ні др о ї1іе а1з іс Зег 5ег іух Бін Аєроіви спів вів Туг др зв «а 45 ї11іе іемоіеноївь БІу їі Бго ТготТгротжуг о туго БІ бін дів щі Суб 5а ВВ В дар їгройхр о Ао Бе вна Бго Тгоїво 015 біз Іфе Ар Бе Аза сі

ВЕ та Ук а їузх іви Маї дів ів вве сіу Схже біу Аза бій Бі) др тує дів сій ка зе яка

Туг ББе Су5 Ахр Дів ївем біб ТП Бі Абе Авр ї11е 11е бій Бго дгЕ це ї185 115 йпіу Аза тб тів Уві йім Ні Тер обго Те АвРа біу Тек Ні РКе біб 115 ІїтЕ ї75

Аіїа заг іуз Зіу іви діа Азов дор ойор Ні Ре Уві біу іец Аїв 112 їв 5 їде йврожіч Ар АгЕ Бім РКО біб ін о твВгоАів Зім агв чаї біц іує Тер 145 158 125 165 чЧаі їжв дій тіе бек Бін Бій іву Ні і2гх Ахр бій ті іей Ав ліз 165 ї9а АТХ «ЕЕ» В тей» 15 «жі» ВЕК «Тіз» В. «яЖі115 «ша» 8

Меї Віа іу5 Аів івб 1іе твБ о Тук Аів бЧег Меї хек о БІУ Аза тТБг о зій ї 5 їй їх дер ІЗа дія Рбе Ії ї1іе іує дор Тк іо дів осіб тую БІВ 12 дер жа 5 а

Ііїе Ав Суз Уві Бій Ті Азп йзр Меї Ар Авфа бвгоСуз ів Те ве «8 45

Туг Ахо Туг Уві іа їі біу Те Тук Твге Тер о сбіу й5р бів Азріво а - 28

Рг Тут Зіб дів Бій др бе Бе бій піз Уві іуз Бір Ії1в бів ів що В те ВЕ

Ази біт ви вуз Те дід Се РНе щіу его біу дпротук бек Туб Рго ще сна -5 іїуз БРбе Суз Бі Ат Уві Доп оіго КБе Асп Уві Меж рем сій 515 діа 1-5 ї5 ії5 біу віз вата Уаії туго бБіп о бій То ої оз 5 І1е бій івен АЇів Бго 5ід

1ї5 128 ТЕ їБт дробів Ахроуаі бій бек обу» Аг дів Бе Аїв Аг бі Ре гг ї48 із5 14:

Дів тТкр оАїВ Аа Туг Меї доп іт5 бій і Тів Ні Маі бек 145 І5Б 155 «з1ах в «її» 1159 «212» ЕТ «313» Зупесвосузків зр, кю» ша

Мет бек фе; о Ргоа Тк оту Аїа Тгоівги йоробБіу дзпобівю Аів Уві Аїв

Ї ї їз ї5 йгвоУкі Аїа Тук о іецш Ген бек біз Уві І3Зе Діаз І1і2 Тук Бга Ії ТКг їй 2 а го бек жег Рез Мет 01у біз Теробек АзроАів тео аія бів пі: Ні 25 зв 45 дгв ого дз оіви Теробіу тк оМаїі Рго ів: Маї Ууаіф сів Меї Бін бег ве 55 ва піц бі Бі Аїва від йпіу тнгозаі ніх сі Аїз іви Бій беб піу ді та т5 зв їаш о тТБеотаг о тТВе о РБе тТвг дів его осія біУ іа Межї ге МЕЖ ів Бо в 88 а

Ап рт Ні їуз Ті діа Бі піз іви твг Два Мех таї ігц ніх Уді 185 іа 112

Дів Дія АкЕ его оів5 йід дів Бій бі ів зег Іі Бе бі Ав Ні

ТЕ5 ї12 125

Звг дхр уві Меї діа дід АгЕ йсп о їВробіу Бе дів Мет і2) бек бег

І і35 іду

АБпобеє Уаії біб 5ЗБо дів Ні йде ББе дів фе ІГ1е Аїз тне бів ТвК 145 158 155 ІБ

Зег ББе Ата їВкодгбв їі Бго б5іу їво Ні Ре Ббе др сію Бе Аве 165 їт78а 175

Те обегоніз біб Зв: сіб 15 118 біб і8б5 ізо Бго Біб бід Маі ви іа із ї158

Ак о сіу йез Ііз 1у5 бор біс дер о аі іг2ги вдів ніх ге сі АгеЕ лів їі85 зе І

Кен о твг о Бго Аза де Рго іїух іви бгЕ біу ТБголів біб да Рго йзр 21 215 «В маї Туг Ре піп вів Агро біб ТгомМаі Ахап Рко Вне тує бів Зег Тут 825 Ве вла ща вро дов Уві ву зв: пів Уві Меб біо бід Бе осіу сів ів) тТБг обі зах 25 255

Ак нів Те Ак Рго тк біс Туг Суз піу Ніз Рго Бі дів бі АгЕ

ТБ Б зу тві ІТе Уві геи Мет біу зЗегє 5іу іа біб ТБголів Біб Бій ТвБгоУві ху зва 285 дев Бне ів таб дДіз шій бі біз їу5 аї зі іга вро у5 МЕ) Агр пай зак зай еп тук аг Рго пе Азіа бБіж Ар оАгЕ 15 Маї Аа Аів ів) Рга іч за5 зї1в зії 355

Твсоуаі Біб ру 112 біз Уві іш Або дк Пуз із Бів БКга біу Жег 325 зо 535

Ііе БЕРУ Бір Бго іенотугк біп др Уві іо ТБгоАів ве Бве ові: вІа заг за5 з5а

Зі Меї Мет го іу5 1іе І1е 01у Біу АгвБ Туг б5Ііу ігр обег бегої а зей за:

зів рве тт о Рге Аіа Мех Уві із Бі Уві івги йср Ні іец Аха» бій

ЗІ зу За

ТНг оди Бга рух Ап Ніз Ре ТБг ові бі Тіе д5пойзр обняв вен бег за За ке

Ні Тагобет І1іе Абр о Туг ойзро о Бго Бер ББе Зег Тв біц Аїя єв бег - БО 1ї15

Маі Уві Аге Дів ті РБе тТуг сі їецч 5ІуУ Бег йо о Зіу тТнге Уві бі аа ВЕБ За дід дп зує йсп Заг о їЗіее 195 112 Рів бі Бім ср ТіК о АЗо Аза тк 35 вл 445

Аїа бін іє Тек Ре чаї Тут вв пероі кв імп бег Зію Зак уді ТВЕ пів бін біт Тут Ре Уві Тут йзр Бер і у Бе біу БЕК Уві Тр

Бе бр яна

Маі бег Ніз ге йгвБ о РБе бі Рко д5повБго Іі ів бек ТНБ о Туг вбву з Ят зва

Ті бек Зіп Аів дп о ББе Уві АЇв Су Ні біп Тгоозіз Бе іо Бі ко 5 -аш піп Бе бін Уві іво Біб Бго Аїд чаї Азв Бім б1іу Уві Ве ггеци Уві вай ща БІВ йви заг оБеа Тук О1у Рг біз Бі І1їе Тр оАгр вів Ре Рге Агв з ух

ЗА ве вив

Уві віп Бій пів Ті їі Азроієв5 дп оівги іуз чаї Тук Тнг Ізфе дп

ЗА ВА ЧЕ

Аїа да йяєх Уві Аїд дра о длзв діа біс Меї ці й дев о ТЬг дян ТБе

Кіа АБя дво чв а Ага йо о Аіа зі Меї бі АгЕ о АгЕ ТВг о Аза ТЕХ 5а5 Ба 5 ЕБбЕ чаї Меї сіб Тк оСує ББе ВБе АЇа і-о діз Бім Уві Би Рро Авв бій -Бе 57 БУ сін діз 118 дів іує тів іт Бій Бег ущві зів і таб тут БІіу вуз

БВ 5ВЕ ща

Бі іп Бій тів увь бі Меї Ахв Іі гу5 дів мМаїф др бек ТР вах СЕ БВ їн діа Ні іви тТуб Бін зві бег Уві га бій Тк Уві бег Аза др

Бій 515 ай із ко дів Меї дев о гго Уві Уаі га дзро Аза із Реп оуаі рве Уді

ІБ їй шив й

Ага біс уві їем бі» іуб Іі Мех віз аги зів сіу Ар азр ої во Бго вії ББа БУК чаі бек Від ізо Бго Сех йоробіУ Так оТус Рго їБгодів Твйг о твг бій

БОЙ 655 7й

Ткробіб іє Агд дом Уві бі Ніє Зіш Іі Рес маі Тер аза Ргша дор -т вва их

Чаї Сує зві Бій Сує Бі фу сух Уві 1Тіз Маї бух Ргео Ніс Аів Маї ча вч ща

І1е авг сі іух уві туго біш бін діа Біб вс дів Аз Аза Рго Уві таБ тів т15 тка

Заг Рів іух Ре ТБ Ай діа іу5 длр Ніх й5ротго Вів бік баг гу

ТІВ та Та не тб оті бів Уві бід Бго шін дробу ТНг осі Суз БІ Т1е Су щи Я 75

Заі А5р Уві Суз Бра Аіфіа іт й5п оф уз баг бів Бго ге Іі-ц Агв Ата чЕ5 758 тав

І1е вла Меї діа Вго біп оісз Рез іго дб щі бів біб дев оБіВ Азп тта ТЕ тка

Ттро йо о брбе БНе іо дорів Бго да Рга вро йгЕ ей жег і в5 дБА

ВЕ Уа Уа яке іви вза іув Іі2г бег Ні біп піп Меж 5і5 Біш Бго іга вне пі) вне ва5 із ній

БЗвег біж віз Су Аів піу СУБ бі Бі) Тег о Бто Туг їм іт івь Уді

ІВ ІБ яз 5Зевг бЗіп оівги Ре бі дер Агд Мет іеи Маї Аів дп о Аіа тТвг ові Су 835 ще 555 -к кг о Бег Ті Туг біу бі дал оіен Рго тТВке оте Рго Тгровіз Бій доп

Впи 5-5 я вів біз 5іу кеш Бі Бк» дів Теробеє дп о Бегоіви Ре Біч Азро ази ва вт 5 вна

Аіїа бів Бе 01 ів: бі ББе Агш Уві дів ті зр ів бів ТР Бін 8 Ба 585

Біне дів Біч Біб їеноїев їу5 ТВБк о ББе Аза бі біч іга біб Ар озег

ВЗ ща зій ви чаї 5Зеє Біб Ті їеч йхп зп діа сіб ТБ тТаг Бій ліз Авр ті щІ5 зв Зк

Ре біз сі» АгЕ Бій ів уві Біб бів чаї Гуз біб ДК о івеч бій дп зза ще За іен шій Твг о Рка біб йіз сія Меє РБе іви бек уві Аїд дер о Тук еп зах зве зе ЗБЕ "ввів іт ек Ма) Тк тів Тіє піу ші Ап 31у тТкроАфа тук зр

ВЕ иа ІБ

Іі біу тує Б1Уу Біу іви йлр Ні Уаї ів дід Зак озіу аг йзп Уві ве 255 зав

Авт Ті ім уві Мет Авр отв бій Уві Туб Бек АБп о Тго бБіу Бі вів ок Іра ї5а5 ів хек 1-5 А1а те Вго йге діа Аза ма дів їуз ББе Ата дів і8в1: і-ї ше

Біу Біу іух Рез Заг обго 1у5 іус йбрвоіви Біу ів о Веб вів Мет 1025 1435 заз

Твт тує біуУ дп оУві Ту маї АЗв бег тів Дів Меб бі діва іт за ї1вач їа58 дп осі ій Бек Бі їух 8із Ре МежЖ сі; дів від дів Тут Бего і855 ік Щх

БПіу уві оЗего ген Гі 112 дів Туб Зек Ні бу5 Ті дів ні щу ів і18575 ее

Іі2 Ащі Ме Тк тТМйг діа Меї два Ніз біз їу5 шій івз Маї Ад:р і055 98 з-з5 зву Зіу бгд о тТгрогвроїей Туг Ягротуг йзп о Буаоїено во А1Та зр 1їЯк їії1а5 1115 бім сі 15 дп о Рго їв бів івез А5р Ме бі бак вро іус Уві 1115 іа ТБ лів ті а5робуб5 тик оМаі Ту о Бвеє бій дз» АК вне дів Меї і г 13158 155 ЛІ

Те ойгЕ баб біп о Бго піз зії 8315 уз йгд іх Меб іу5 іех діє ї145 ВІ5В лІ15 піп зіу блю Уві ба ТБ АгЕ Тер оАіа Меї Тут біб туго ієц дід 1їба їх 1178 із Аг 5егоіеножіу іу іш ІЗів Азпосіх дзд доз о МНіз зву маї 1175 ії158 1155 звкорво оЗег орг Бі; УжЖі Ііе дів 5 пек Уді 135 135 «війх 3 «ЕЖІ» З1Уй

«жї2» РЕ «ВІЗ Кіпухега іпіершейїа «айи» а

Мет бек іч уз Мет іух Тйг Меї йБи біб Ап Аза Аза Віз дів го 1 5 їв її

І11ї2 бек отут Аїа Ре Тнгойли Маї дія Аїа тІТе Тук Рг Іі» Ті вго 28 25 за

Хевготве Ргое Меї бів біб Аа Уаі Ар оБІій тгротьг о Аіа зів 5іу 1 уз за ча 45 іуз йсп ге Бре сдіу й5іп Рго Уаі йге із Меї Бій МебЄ бі бег бій -а 55 ва

Аів зЗіу діа йіз біу дів Уві Ні б5іу біз іви бій діа Зіу Аза гей 55 та ув 5

Тйготве о Твготує ті діа хег вів біб ів оівн їв) Меї І1е Бго доп зо ще ів тжкофує Іі Аіз йіу піц Ген оівего Бго зву Маі Бе Ніб Уаї баг 1885 155 її1й

Аів АгЕ Аїа гей Аіз ТВгоАсв Хек оієецй Азп о І1іе ББе піу Ар Ні іп

В іа 125 дер Уві Мет Аів уаі дквобпів тагобіє Сує Ава Межї ївип дід 515 дев 135 135 їди

Ахп чаї бій біп Мві Меї дав іен озег із Уві вів Ніз іїен Заг діа ї4:х іх їа5 155

І12е їут5 бБфу ГЕ Хаї Рео Бе Тіе дхи РКе БНе й5р о біу Ре Ак Тнг 155 іо їт5

Бах Ні біб Іів Ра ря Ііе бій Уві ів зів Ні Бій дів і дів 158 І85 і

Ред оівноівей дзр піп біз дів ген ойзпоі2гу Ре ЗгЕ Ага Ап Аза і ей ї55 те ше

Аза РБгш ав Ніз Рез Уві їІ3Зе дгшЕ Біу ТБ дів бів Асп Рка дДяр 112 218 зі зв

Туг РБе піп під дге бів дів Звбойсз бге БНе тує півй діа ів Рга ав ВЕ за ща дап Хі уві Бі бі Ту Меї дів зіз Іів Туб йгш Ії ТВропіу дв

Азв Кі таї бід 01» Тук! а біо тів Тук Агш 112 тТВгобіу АгЕ

Таж 5 ТЕ5

Зіч Тут Ніз ізн о ббе дер тек Туг бі бег о беа Ах Аід ів бій тів ше 55 ва і1е ті АтТа Меї зву деко Уві Сев дев ТВе о їі піз Зім уаі Маї й5р

І ше дв дів Меї Тіе дор бег обі бін іт тУаі Біж ре Уві бег Уаі Ні г ек 298 5 зай

Зве АгЕ Ркго Бе баг о їен дів Ні5 Бе Меї діа 195 2і- Бро Дів бек

Вк ЗІ ЗІВ З2я

Уві їз йгЕ ї11е діва ві ін Ар оййгш РТБгОофуз Біда Рго біу дів біб 325 За ЯЗ дів сіб Бго іо Сх їв др уві їує Доп дів Ре тук Ні Ні дер заа за5 за д5а Бга Бта ів Іі Уві бі віу абд о Туг діз ів бБіу Біб 155 Азр у ку ага ту У у 385 ІВ 365

УК іви Бго цпіу Ні Ті Уві бак Уві РБе бій Ахлоівем і дує і ус Рго пРш 3-75 Б іїец Бго Веї Доп Бі Ре Тве ові бБіу Тів Бе йо йо уві тек НІ

Зав ЗЕ я

Те бек оіги Бго Узі Бо дів Туб йер 118 Ні Уві бег АгЕ зіб ЗІіу 85 зів 15

Ііе твг Вів бух гу РБе тер оБіу іец біб Заг ойяав Б1у твБк о Мві бег аг аЕ5 зе

Аза Аза уз дсп вів ї1іе 15 11е 118 51у Ахр ода ТВгобег Меї РБе ле 5 іа сія Яіз тТуг Ре діа Тук о бзр бек іу5 Гу5 Хег пі бі тів тпг за св ав

Мек Хаег нія Гео йгд Ре бір із Акд Рко ТР Тиг озег о бга Туб і ви аа зв БУ зва

Іі ні5 дяй Дія АзроБвВе Ії- Аіа Сус бег бЗіп біз бек тк Маї Ар іжв Тук дво» огем ім Ар осіу Тів Явп Рога бі бі ті РВе іп ес

Бе 5 БІВ й«п СУ» Те отТеровМе ліу біз біз маії біб вгв Ні із Рго дп ру 5і5 28 БІВ

Мет іт5 Аке ї11е І11е Аза дгЕ бБіп біу Узі дкгв о ББе туго тк ої гу Ав

Аіш Уві бер тів дія йгЕ іш іецй о біу їм о біу Біт Аге ББе А5п о Меї 5435 БА 5а5 БА їец Межї бій йіа Аїв Ре Рбе Зу5 іви Твгодвр о Тіе 116 А5родія ге вБ5 БУВ 75

Твг ойфа ет обіц Ніз геноіуз іуз дів Уві зіва іш бек Тук Біу Заг

Ба 5ВЕ -За із біжу сів йзп Уві Уві Аза Мес асп доп АРа діз Ті Азроіви 5Іу

Зх 5ИЗ Ви

Меї Айр дів ім піз щім Ії тів Уа Рго йор Ні Тгродіз Туг о Маі вів вів 53 піп біц бій Аза Ахп йо Азо о зіУ іує іш Чеб Рго бер Бе Ті АгЕ вав ав 255 НА деп Іі івем бій Рго Мес Ап Агробів Аа бі дор уз ву Бго Уві вах Ба 55

Бек о Аів Ре іву піу Мет щіц дер оБіу Твг вва кг Рго бі т лід 5аа ко вЯй діз тгроБіц руб Акроіу ІЗе Ат Меб Бій маі Бго мМаф Тер бів Рго

БУВ ВВ 585 піз Бі Сує ТВк бій Су Аа осів Су Аїа ВфБе тів Сує Ргшо нів Аїд ва 5 та дів І1е дге Рго від ей ів Зег о хего5ін сіб Яга осів Яік дів Рга т7а5 715 УА 738

Уві Аїз ів рес бегогте Уді ДБао віп сзіу дів іує Ні Туб 15 тк

ТІВ я Я

Ні їви дів Уві бегбоБго ів йзросув Зегобіу Су» Бі» Аа Сує Маї т та Бе

Ав Ті Суз Бго бегогуз бі Гуз діа іви діа Меї уз бро ів Ахр

Тте5 Уве ва -егосія дб Ні Ме хві Рго Маі тТгр ази Ні Аіа Его Аїд ів Аїа

ТВ тт та

Без їуз біб доп Бра Ббе бек огуз діа Тег о Маїф іух ві бух жів РвВе

Уя5 ТЗ та Б зі Бга бро ів іо Зі; ре бек обіу Аза бух Аза БІ Сух Біу пін

Зв 8318 діб

ТвВгоБго Туг дів дгв рен о Іі- ТК бів ів РВе о біу АлродгЕ Меї Мех

Еге во вза їі діа д5п дів Таб о біу Ск бвгобає Іі Тгробіу ДІз Бек вів го

З55 За вах ш-ет Іфе га тер оТвг отак одза Ніз іх Біх бів бі Рго дів тТгродів вв 5 ви йзпобекоіев РНе зі йзр о йзв Від біз Бе о сіу ів Зі Меї Меї гг вБя 5Уув вт ва

Зіу б3іу агв АЇа Ії дев біб біб івез дів зегойор діа Дів Зег чаї и че з

Егю піц дгр о Бго іес Ні Рго вдБроігц бій сій АЇз рез АбБ о йзр отКр ве За вів

Еев вій Ніб рух дв офіц бі іш біу тБгеодгБ о Аїв дгв о Аів фб о Буз

І зи 25

Ген бек Аїн ій оіев А1з азів бід іу бі А5в Азр од оіву їец Аст за жо Зав

Агвроіги ТУгб піп дев бій йею Тук Ре твгоїуя Аг Зек о бій тТгрої1е зак за Зх ака

Ре сіу біт Аз сі Теройів Ту Або ІЗе сі ВББе сіє бі 25 Ар

Б З Зо

Ніз хаі іги діа беб обБіу бі) др Уві Аз» Іі іви Маї Ре Ах ТБх заз а85 зав

Зіз жві Тк бек одзп о Твг осіб бі бій хек Бек іу5 Бек ТіК Рго чаї «ат чеве 1085

Віва вів Ізїе Аїд іт5 Бе Аїз дів зі біб іує АгЕ ТБе о дкКЕ Її у аа 1515 іш

Гуз Ах іви піу Меє Мет Аза Мві Хег тук о зіу дз» Уві Тут Уві 1855 заз век діа бів Уві дів Мет біу 812 азр уз дів зів Тк о іви ДгБ дів аа іч їівха тів йіїя зів дів зів дів Теро Кго біу Бгро 5вгоїво» Уві Ті дів і855х ее ї-е5

Тут дів Аза Су І12е д5п Ні: біу ген їус діз 51 МЕї Б1іу АгЕ івуй і їз

БЗег Їії2 Бег пі. дів іу5 йгЕ Аїв Уві вій Аіз Бі тує тб» Ні і1585 ее їв їви тро дея Ту дев вка Бій їв го Вів ів Бі їіує деп рго з18а ії155 1118

Ре Іі івб др о5ек біз бій Бга бій Бій 5Зег Бе дев дер РБе і115 їла 1125 їви Меж бі 5іц Узі Ак о тТук о дія бегоїецз Б1уУ АБО ТВ о Беє Рго ії15а 1135 зе с ій Уві ів древо іїву ББе дів бів Твг осів бій дзв о АЇв 5 і11545 тї15а8 ЗІБ а5в ОАЕ Туг дів Бій туго дДгЕ бгд о ївец дів Біу бі її155 1155 зла сшіБ ЗІ

ФЕЇ1В» Ід сеЕіб» ВЕТ «хіЗ» пезцітотіреіо вігісапих саяБх Зі

Мек чі Гуз іт Мек Меї ТВ о Твгб Аза пір да ТвгоАТа ТВг о Аїв Ні ії - її її

Уві дів Туг дів Мех Зего бі: Уві Аїв Аза 112 Туг Бго І18е Таг бро ва 5 а

Бек Жет Те Меж ву бій Бій діа дер о Авр отТкроАїв Аів бів спіу АгЕ х5 за а5

Гуз й5п ті Ре бі Бій ТБгоїзи ТВ Ті дев біз Ме бів бего Бін ка че ва

Аіш біу Аіз Аа п1іу дів Уаї ніх сіу Аїв ер дів Аїа біу діз їв 55 й Ук а тТвБгЕОотвг отв вве о ТВгодіа бек обіп зі іено ей івгу Меї Іі го Ап в че зе меж Тук іух їів бвє піч бій іг2гц іво Ргз сіб уві РБе ніх Маі ТЕКк

Ве ї-5 за

Аіш йгв Аіз тіе ліз дів Ніз йїа ігц Зег о ї1іє РБе біб А5р Ні вій ї25 І25 дер тів тус діа Аіз двобій тТнг обі ББе діа Ме ів вів бвб бек 158 і135 ї148

ЗегоХні бі бін Аїа Ні й5р о Меї лів івеноУаї іа Ні5 іви вів діа

ІБ і58 І55 їбе

Іі біс Зжег дсп уУаі Бро ме Меї Ніх Ре Бе дар о шіу РВе дев отБК 1655 158 ї7т5

Законі 51: т112е бій із 112 біб Уаі іо дзр тег о Аія й5р Мет діа ії і55 155

Зегоі2и Маї Ап бій їух 8іа го дів піз Бе АгЕ АРа зб бев Мет їх ав 285 ди Бго бій Ні Рео Ніз Уві Акропі таб дів сія Аза Бко др ої12г 218 15 ІВ

Тут РБе біз бі Агв осів Аїа ліва д5а Рго туго Туг ів їз Уві Рго

І25 238 235 за

Бі тів Уаії Аїа йіцй їк Меб бів іує Уді Аїв дія ів; тає о біу Аве ях аа 355

Зег тек 1іу5і2ац Бра д5р отук Улі бі Аів Бгто йзр Аа бі: Агв уві зви га 28

Іі Мазі Бет Меї бі баг Жатг Суз піз таб тів біз бін маї 112 зп йЖ5 ВВ 885

Ніз івь дів Аів іу5 біу Ар оїу5 Іів 5іУ і2еим Іі бух Уді Агр і ве

Тук йгв Бка Бве чаї ек Біцш діа вБе Ре діда вів во Бео АРа бек ак зів ЗІБ 3585 дів іх Уві їі Те Мві іги д5р о АгЕ ТБгої ув Біб Рго віу дів Рго ги БАЗ за5 зЗіу йБр о БКо іец Туг оі-з йзроМаі Суб бег Аіа ББе Уві Бій Агро біб зай Зак Ве бій дів Мет Бго іуб ї1іе іво Аіа 51 Агш Туг З1іу Без біу бег г ух

За з-58 3655 шін Бе его Рко дів Меї Уві іу5 его Уаї Тук дер А5к Меї 5ег іш

За ЗЕ5 зе

Аіа ія ув Авп Ніс Ре тег мазі 51 тів сій йср Ар о Уді Тр осі зи5 зав за: зада

Так оБег о і2гц Бра Уді Асродяп дів ББе Аїз дер о тБр ТБ Бго іш Бі 510 Зій

Твк тів бів Су5 бів рве тгробіу іго Біу дід й5р о біу тк очді біу 428 425 з3а

Аїа йхпоіуз біп біз Ііе їу5 Тіе Іі зі Азр о йшп ТБг о Азроівге РБе «35 зад ав дів Біпв Бі Туг Ре бек Туг дер о бег і ув іубБ бег біу біу т18е тг

КЕ 5 ща

Іі Бек Ніє іч дгроБве Бі Зі іуб Рко Іі Бій бек ТВгоТуг Рез

Ва ув т ав

Маї д5п Агиш Віа дзр о туг Мві дід уз Ні йзп Бго Аза тТук Уві БІБ

І1е туг Ав Іі іви бій біт тів іт АхроБіу 01у тк оре Уві і гу

БЕ а ІВ дат ЗекоВго тгробжи Звкоївг; ЗИ йлр Мет й5роіу5 Ні із Рга Зек -а ВІВ зіу І3Зе їу5 Аг ТБг Ііїе Аїз Аби іу« іу« еф 1у5 Рпж Бук Ахп Ії2 ва БІБ ча йер йів Уеі їх5 І1е дія ТБгоАхроУуві пір огви сіу зіу АКБ 118 Аза ща ва 8 ав

Мет тів меж піп Тс діа Бе РБе ух івноАїа БР; Уві із Беа рве 655 -еха яв піс гує Аіа ді дзроівн ізо іуз іт Бек Іф Ні р5 Аїя ТУук біф зба ше а їуз із Біу Віз іус Іі Уві іу5 Меї Ав ТР др дів Уві Азов ЗІіВп --5 ще ще аіа Уві То бвг іву піп біс БвБе іух Тус Рго дів ек Ткрог уз Авр ща щі а дід Рго із бій Те фу Дів 5 Бго Зуб тб оа5п ів Ре Бе гу

Важ ва з ав

Ап оМаі Чі іє Рг Ііе ій тк обія зіп зіу дво єв іш Бго Уді в за а

Зак дія Ра пін дід Абробіу Аг Бе Рка ге БРу твгобек бів Бе ка ща Вуд сім іт Акв о біу Уаі АЗа тІ1Їе Аби узі Рго дію тга Узі Бгро Бій Авп

У БЕ БВ

Се Іів бів Суб да бій Сус Ата Ре Ма) Су Бго Ні Зек о Аів Іїв вае Ба: тва їенм Бгоа Уві іви дів іх Бій Бій біс івноуаї Бі дів Рго лів Аза 75 тів 7І5 тав

Вне Так від гео БІ) Аіїа уз Бім іу5 Бій із оі5 бі Те іуз Рве т2я 738 Зк

Аки тів віп Іі дзпоїБК ої й5роСу5 Меї БІу Суз БІу А5я Суз дів т4а тат тча

Ав тів бує Рга Рго Гуз іш ічв дів іш: Уві Ме бій Бра ів Ар

ТБ за те

ТпгобБіс Агед АзроАів бій ові Рго дез ів сій тує Ді А1з Агв 116

УЖ тт5 ти

Рго Узі їух Бег Біо Узі ів Рго Агд дв о бегоівь іуз Біу бБегобіб тва ав та ще

Бве бій Біб Рго іен Меї іш Ре бек зі Аза Су5 бег бі Сує біу яа5 вій 815 біз тТвгоРрго Туг чаї Агд Уві Ті тк біз ів РБе о біу біш Аге Мет

ІВ ВІ ща

Рне І12 Аіз А5п дів ТВ обі бух хек о Зег ї1ї2е їго с01іу Аїз Зег дів 35 ВІВ ач

Рка баг о Мех Рга Тут Гуз Тк оА5а Бе ів: БІу бів бі Река Аза тер ва 85 ба піу й5п о Бвбог во Бе із й5в діа діа 51 Тук о біу Бе бі Меї дп ще щих 875 ве

Меж Жаг о Меї Ре діз агро АгЕ ТИгОНіз ів Аіз Ав ів Дів Аза і с

ВЕ ча ЗЕ йіз їв Біб бек йзо о Аіа его біу до Уаі Гу5 510 Аза іо бів біу зва що зІв

Тероівгч дів Біб іув доп дв Бго Тів із Зег ів Бін тТуб піу взр вра за уз їец іує їуз іев іегм дів Ру сія іує йо січ ів оіви Зіхж вій ща Ж ах

Іі дів Аїв Кеб зегодероівзь Туг ТБгоіув Руз бЗЕг о Уаіф Тер о ї1іе Ре ща зве за зе

Бі біу Ав біу їгв дід тег дю 118 піч Туг пі Біу і ви др НІ

Е У В У тк з вер зів сі зук іу бІу їжи вБроні маї ігци Аід баб бі Бій Азо Уві Ада Мі Ре Уді Меї Азр о тНг йо аа зка зза маї Тут бек дсп те о Б1іУ бів бій о его ес їуб АТЗ Твго бгс тк ОБ їібоб і555 ді« чаї дів уз РБе діз дів віз бі ух Дкш ОТ біб Зув фу 1812 їіщп5 ів

А5рівц вів дев Меї Уді Меї отвгоТуг біу Туг Маі тк Маі діа 1825 тах5 1835

ТвгЕ о Уаї бек Меї піт Туг ек о їуз біп сія Бре і-го ів Маї іга ів4й щу ів уз біб; Аза біз бек РНе бгш Бі Ре дегоївб Уві Ііе віз Ту

Ів ів 125 дів тео Сух ІТ1іе дзп віп Біу фве5 Агвоіу5 біж Меї бір іу5 5ег ї1вта 175 т1в8к бів яп о Уві Меї Аза о їНге дія хаї їу5 бек бі Тук о Тга Рко і га івка БВ із

Бе йгЕ Туг й5е Рко дкроіви Аївз Аїа сія зіж рус дез Рго РНе 11-55 1о5 1пЕ сіпоіви дзробект іу5 діа Бей Ар обіу бег Маії 5іш бід РБе іец 1115 Із 1125

Меї вів 5зіп д5п ойгд ве діа Уа) із дзродке бек о Рее Бго зід її155 1ї35 і1585 йвр діа ув о дквроіги дгд олія ів Маі бів ніх бій івб зр Уді

І145 1158 1755 дев ОРНЕеЕ уз Бін ів біз АгЕ Меї діа дів тБгоАхпо ІЗе РБе бін 115 за 1178

Зекх РНе віз Рго дів п2іу біу їує Афа Аєр С1іу бБег Уві йзр о вне 1175 1158 1185 біт біз віу Аза біз Не Суз ТЗ АКгЕ йзр обр о Таг рго Меж Мет зіза 1195 і28а

Аля ех У «в си 1 253 хід Кс Ддхуь Рій д дон. д іс ів йсЕ Бго Азробаг обі Бій дія Се АзроБій Азпо Абе А1а бі 125 їтІ15 1217

Твгобек о бік обіп бів зі А5ро іо бек оіу5 Аг отТБгР о іув іже іга ї12а5 їз «2385 5 ктїї» ТР

Ії ВТ «ВІЗ» Бак ас Вр. «аща» 32

Мек хек Зіп таб о РБе Аза тБг оті йсробБіу Аа сіб Аія Уві Аїв Адгд ї 5 їй її

УР Аза Тут Гує ів; АБ біз Маї хів Аівз 11іве тує Бгж І1в те Бго ну ак щи

Бет заг дів Меї бі» бін тгв дів йср бів ттв о Меї віз біз сіу АгЕ

За а 45

Веа йез о іво Теровіу Тк Узі Рго Бек Уггі Уаї Бій Меї Бій Заг біз а січ бік дів із Бі Дія Уві ніх бзіу Аів ви бів ТвВе обіу беагої гу що 75 75 ве

Бег тТне ТвгоЯВе тве дів его обБіпб бі іо Бецоівеци Мет ів вБКо дп а щи ем Ту гу тів жіу БІу піц ів тТВке бек Меї Уві Уві Нів Уві від 1 ї25 їіїїй

Аіа дк зегоівм йід тТвнгонік дів ів бек 112 Рче біб деп нів зве їща Її

Ар уві Мет дів діа Акв пі Те бір РБе діа Меї іп Суз бег дів за 155 їі жег маї зіб зЗій бег НІ а5р о РКе діз ів) Іфе Аза Ні5 дів вів твг лах 158 155 і5о їзи Ази ТйгодгЕ Уаї Бек Ре іем ні РБе ре др о шіу Ре дк ТНг та5 Іа 175 зак Вів біс Узі бій Гуз зві бій іегц оівгь Афа др дяр дхр Ууді АгЕ

Іа з ї158

Бег ів Іі Азп бін й5зріух тів Ре діз ніх дк дів акЕ Віз і гу їз в за

ТБкоБго Аби Бек Бго гео ів дгдосіу ТБг о Афа бій Аве Рко др Уві гі ті КІ

Не Рме біп дів Ягв сів сі діа деп Бго туго тТуг Аза дів бує Бго 23 235 235 158 дів Ііе Мві Біп біу їі Меї й5роіуб бе пішж бів Акв тб БіуУ АКЕ за5 5 Я

ТуготТУє вів тіе Тук бів тує Ніз Бі дія бегоАзв Аід Ар йгв і вн

СУХ 55 та тіе І1е їі Меї бі бЗег осі Суз біз тБгомаї Ні бій те маї ар їв зве а

Тугоїги Ап оАів гу біу Бій із Уві Бі Уаї ів гул Уаії Агро вн за 23 зва вве дгЕ Рга ТкроАзр Уві біб АБгроБве Уві хіп йів із Рго Ні ек за5 їв 5:15 20

Уві піп Аїв Ті2г дів Уві ен АхроАгЕ ТАЄ о іїух біб вро Зі бек діа 39 зЗа5

Пі Бій Рго іецз ТУб обій йлро уві Маі тпе дів ї3е ні біз бі» Тер заз За зжха чаї йсп іч5 дв Аз его рго Уві Бра Баг Бго ія бек Бк уді рго зве зве зва із Іфе Іт2е осіб біт дбв о тТуб БІу із бегобег іїу5 шій Ре Твгорго зує Ек: за

Аіз Меї Уві іує« Аїв Уві РБе др о д5п іш дів Бій діа таб орга в ув

Зах Зах Зах ще дп оНіє Рне ТВк тів зі ї1е аз" А5родев о Маї ТВ Ні ТВе о Зег г во ік «ів «15 піц тує Ав о Бко бБегоБве заб ТК бі) Бо д5р дв Уді Уві Аге дів ящЕ 25 За

Межї ре Туг сіу ізо Бі беб Ахросіу Так Уві Біу Афа Ява г ух АБИ ні ща

Зек Іі ів ї12е тів зі 535 Бі тТВгройзро Аби Тук діз Бій оБіу Тук

ЗБа 355 дей

Ре маі Туг дбробяегоїчуя іує его бі бег Меї Тр о Уаі бег НІ ген

Зк в дте ява

АгвовБе ву хек бів Рекс І31е дгд Зек ТБгоТук оїво Ті Ахд бін дів

Зв 98 «95 дп вве 118 51у Суб Ніз Ні Тгробіу ББеЕ із 61 Вге Іі бів Уві

БЕНЕ Бак віз їец еп Аїд йів дів Ні б1іу Афд ТВроЇ1іе іеб ів) Абвп о бБев Бго Тук ві Б2В 2575

Ази вів вів таб оУаї Тер бів допо іве Бго ге іуз чаї АбЕ ів бів «а 85 зав

Ті іги др ря сій івевоіуз їво тре оМві ї1їе А5а пів Аа пім ді 545 558 ва 5ев діа ВкЕ йхр бек бід Мет Бім піу йгЕ 112 Ап тБгої1іе Мет бій уді

БЕ З З був Бе Ре вів іо дів бі шаф ізь Рго бів уві сій дів Ії2 діа 2855 -чи

Ус ІТів св бів дів ї іш іт ТВ Туг зі іш іу5 ім Уві з у: тів їв Бій дів гів Бій іу5 ТВе о Туг о біч іух і уз Біж зві зі -5 а Бек

Маі Уві де Меї ди грец пів діа Уві Ар обІвй ТВкоігз бід зм ої ги

М іш вії ВІВ

Ніз біз чаї Гу тів Ресз Іі біб бій іує біб іує ТгВ тів дер зі 525 53 835 З зЗін дів їеноіец бег йо 5іп Зег Бго Ре бег ТБг Бех дДіз Рго 155 ва5 ва БЕ

Рне уві дгЕ Айр уаї ви Б53у їух Іі Меї Уді тгробіп Біт дар дер з щач БУЄ гц оБго Маї бек тб фев Бго Его дов о б3уУ ТБгоЯВе вгез твгосіє ТК

ТБ ве 5-5 від іє тТгробіц їує йгЕ й«л Уаі бів бій біб Іі Без Уві Тер дер ча дае та

ТвгодБротТіе Су5 Уаї бів Се бегоіїу5 Су Уді Ме Уві Суб Рго Зі» та 716 7і5 ТЕ діа вів тів агЕ Аів уз Уві Туг бій Рго хег біб і во бів Аєп дія 725 756 755

Бго Бго Тг Ра о іує бек уві дю дія 195 дер дКЕ А5в РВЕ дія доп

ТЕ ав 5

Зіп їж» РБе тТве ті біп узі дів Рго 535 дор осСух Те оЗіу Суз дів

Та те Ба

Іі Се Маї Ази Маї уз Бго діа іус депо ув Бек бід Рко бег і ем та 75 тва уз Аїз ті2е Аби Меї Аіїва д5п о зРй івео Бгвоі вн Агв біз Бій 30 Аге

УЩБ ак тЯ5 Ве

Ар да Тгр ода РБе Рбе ізо бспоі ви ко А5п Бго дД5р о Агв Агв доп в5 щі8 5і5 гц фу івем Ап осів Ті Аг сіп бій біп орви біз Бій Бго іем ве вк ща ва

Зі бе 5ег йіу діва Су5 дія 5Ріж Сує Б3У Бій тк обка Тк о Уді ух 835 кВ вах іно івз ТК бій іо Ре зіу й5р АгЕ баг Уаї 1їі2 діз Ави АЗа тТБг ща 55 Б іх Суз цес обег тів Тук обі пі Аха їгв Рго Тс оТвє Вго Тов ТВк 85 вк Зв яка ув йо айви АвроБіу Аг біу Рго Аїв Тго бек одоз бек оівуи Бе Бім ви5 ов вч вер оАс пів біз Ре пі Бе зі Ту дгд Гей бек ої дзроїу5 Бій вик --5 зів ді бів БНе дів дія Зі ів іей о Зів пів ве бе тб оЗін Уві БР; зії аа Ії дероАдха іеб чаі дбо Зк оїів із іу5 діа го зіп їу5 ТВг обі дів 385 ща за

Азр оті Тероб1іб біб агро бів бр тів пів фей оівгц іу5 віп бів ви

За вай ах5 зо дхвоїух тів Рго Тк о РБе йхв о Бго йхв іс уз бек оіує Х1іе пів Ап -5 ув зв

Кей іуз бег о іеь діз дв тек оїен Уві іуз Ру5 Баг Мві тТкв ІЗ її аа а зва піу віУ Ав ойдіу Тов оАЇа тук о Азро Ії11е дхрв о рне сіу Біу 112 а5р нів ча ща І1Б85 чаї тів іа зегозіу дк Аа Уві дви Бі ів Угі Ме А5вотвг івта 1815 зага піч чаі Тук бек дев Твгобіуу 55 бів бек бегоїух віз Так Рго вл їа55 1535 іуз дів дів змві Аза гу Ре Аіз дів бек Бі і5 Рга дів ій ї-а 145 їа5 уз їж дер Мек біб іги Меї діа йеб зп отТУук цЗіу й5п о щаї туг і055 і058 іваї

Уві дів Баг уві Аїв іви біу Аза іуз д5в Ар оБівй ТК ін ве їв її 155 дів РБе зви із азів Бін А1з РБе дев бір Бго бвгео Іів ТІ Іів

Зах іс 1255 діа тТук бек Ні Суз Ті 5ів Ніє бі Бів дз» Меб тег ОтТаг щіх 1155 іт 4118

Мет йчп бів Біпоіу: дів іегно Уві біз зе біу АрЕ тТгріецс ви

Зх 1128 1125

Туг ВгЕ Тжг дп Бго Геноіво біл обвіз біп бі ус дв Бго вв ії15а 1135 Я14х іп іви дв Мек дгв бБегоБго г обі» Зек Уві ії о5іб бак о Мек 1155 1ї158 ТБ

Тут бія біб Аза Ак Ре іух Меї із тТВгоїуз Зеб о іув Рга Бій 115 1155 і175 чаї Аза фуз Біп і вроіви біз бів дів бів дів Зі Уві Ав лів 1175 зІі85а іа

Аг оїго о обіп Меї Тугб біп туго їв Афа хаг Вгд 1355 іта5 «лів» 33 «з1та» 78 «І» ЕТ «кві3» ЕЕ. «кщії аа»

Кат діа А5а пі тро Твгобіу йзйп тів іви АкроМві Азпоіегн тТВге о таг ії я 18 ї5 піу вп о ЇТе Тгоіеи біб Яр бек обек 15 ББе з»5 бег Бре уві бі за 25 за с-іу Мет БІіу РБе с5іу Тут оїув Іі Меж Тк АзроБ)и Уві Рко Рго Біу 35 ча 45

ТвВєЕовує Рго Бе А5робіс Афа Ази їм ів Маі ББе Аа тк опі» Ро

ЗЕ 58 без таб Бір беє 1 дів Рко Суб Бег Заг дгд Уві Аби Іі1е ТБроБек

Вк та 75 58 їво бев о тве вва ТБгогух бі Ах" їв) Уві Уді азр АТа Ні Меб сіє сіу Бе ЕБе д1із із біп Мет іу5 Бне лів зіу Тег о АзроУві 118 Ії 158 185 318

Іі біб біт їу5 ів вуз ер оРБго Мві Терен оїу5 Ії ів пр АБр їх 135 125 їух Заі бек їв Біб гуз діз д5р о РБе іе Тгробіу ух бі ТБ о АгЕ їі5и ї35 ї4й

Віа те отвне зів ЗіБ 116 Суб агро їв тТвг обег о Рго зів тве Су Уві ї45 158 155 тав діа дів ті бі біп дів бі Біб Ап їв Маі Рго геш бБегобБіх Меї 155 іа І75 іч йо бег Агв Аза Ніз зегобіу пі Аїа бі тТвр обі Аївз тів МеЄ

Івб 385 їв сіу бег іч доп івц о гм5 йів Іі діз Уві Біб бі ТБ оїує Бі чаї 155 Та Таз

Ап о І1е Аіа др о Ахв о біп біб Меї ус йсв о іву А5подзр о тТуг Меї Ме 218 15 28

Тнк бів івуа тів пі дів д5п о Адп деп Ні Маі Уві Бго ев Тіф вБго гг 238 238 Зах біп бег Тев о АТа біб Тегобес о йхр о бго Бух Зегобрв о ТкротТвВб лів дев ат БЕ 5 че й» З щі. Бе за ч їх з зла Ук. ки Екзод и бу вх уз Біу іп вве Теропіу Аз Аза біс зі біу Бго ІТіе біс ТБу опію

ЗВ Ба и біз ті Рео Рго біу Аспо бій Абп ТВгоМаї бі бе АгаЕ ТВг Туг гу 175 яв 285 дек о Уді ВБе Ав оіви бі Без Аїв дія зів гу Тукб тТБк Уві ух Меї аа таз зв дек обі Се Ніх баб Се Бго Ті АгбБ Сух Кеї таб бів Меї АбзпотТіє за5 зів 315 Зав

Бго йгЕ Уві ув піц Ре БІ Уві Бро баб тТг о біу піф Аби ТР ог ух за зза 335

Уаї діа Ап Бне уві Ні5 тТвгоТве Іі Рее Бго доп озі Ро і ув дер зад за5 за ве біз бр оїух взр йзр бік ге Уві Ії Зіу Ап ен Мазі пі гей зЗв5 ЗБЕ їБ5 деп ів Бре Азо АзроТуг бі їз ТкроСув ба Тже СРу бій і ву Ні пУВ 375 За

Агро дав Ре 1 тує бує Туг зег о іуз бі Маі Ре уз дгЕ Мая) ів зх ав а як

Рго йіа Бій біс тус дів біз Ті Абв о тге Ав бів рен Бій Аза бзіх ща: а щі вер зві Ап ве Ті уз АзроБНе тук Тук бгЕ оіго Аів ніс Аг Уві аа ЗЕ За біу сій іен о Хеб Ніє Бен дія др обію беготТук дія тів 5ів бі де ві ща

Тер одпв ів Бі біб біб Туб теробіу тує Ава їу5 Азпо1т5 ігу тгр аа АБ зей

Зек Бго РБе бБіу туго Рго Уві Ніз Ніз бів дп Бін АТа зе Ата Бій яв як «5В

Маї сі Зег Іі уаї Ап Сух Меї БНе Ази йгройср о Суз Меї ТВгР ОНів «85 45 495

Твконів Ті дДяз Ре І18 біб Бегосіу ігу Рго їеи вує зез бій Аге зва ща зій піз Мі Дія їз Біб ген Ре сСішж его Біб Аєр Аза тує йхробБій Те

ЗЕ ЕВ ВЖЕ

Бу йзп оТуг тк оБго т11іе бла йдлв діа 15 Ті їз ту дів іу5 Тер а ЖЕ щ--аа бдеб із іез АкБ Уаї Суз їем Ні да Аза Уві Тк овес Сує Явп Тер

БА в КК БВ

Уві тТгв о Рга Бе тб Узі зеє Бе іо оіує зек АКБ АБО Тук дев опію 555 -а т

Азріви лів оівги Зі: Аія уз бе Бе іу5 Аа ІЗе твг обі і) бій зва БВ «ща

Меї те бів біс губ іа Азроі2з вів пів лі) дкд о тіе Ра твгоїец а НЕ БЕ

Ні дгЕ Аія Тут пк оУаії і5 іо Меї бій о ТвБгої95 Ар Ме дгд да ій 5 еВ сів нія Яр ої) ТїТе су БЗег о Тгроуді Ре Арія Ар оБро бів Ії вив вай З ва

Бго Уві Рне Тиг обі: піу Твеб о д5роіух Мет хр АгЕ Ар оллв Мет Ні -що Бо б55Е

Дів ек ген ТВе о Меї Бе Туг іуз бі Ме 51іу тго а5робгоа бін ів ака БЕ ва бі Су га ТР АгЕ біз тБгої2з бій дк івги піу ви БРО др Ті ят5 ЕВ ВЕ

Аїа діа й5вівн Лів Аіїя Ні Вєпоіши іо Рго Аза

БОШ ща тав «Ей» А «81» се «їв» РБТ «813» Е. «коіїї «наз за

Меї йлп о Бго Мві йхр о дрд Рго іем іги да 218 б1у еб тТБг о Агв іє ї я 18 ї5 бів БНе ген дев Ті его сіу іуз сіу ів Аїда Бію іви ТБг оІ1ве дів ша їй ЗЕ

Вес дід іен ізн зак оівз ів; біу ух іч5 ШІй БІО Азрот1іе д5робетг а «а 45 сіу тб омаї Бі ізо о їі2е дйла Те о Бго іт бпіу Уві ем омщі тТбгоспій

Агв вів г Су ТНг щі Сус Ні5 йгЕ Су Бім Бі Звгб оСує Те де ще З т За

РНе дхп Ахв осів бек Уві біу Тв о бБе бе беродея Т1і2е іт І1е Ні а -

Ягве аа Тут Бпе Рйе бі А5р од щБіу уаї бі бек обі біу ліу і гу 1 385 ї18

Тук Біу й5роїец дов о тТук о тТВг дів йо ТВге Се Абе бів Су ух бід ї1:28 125

Рго біп кує Меж д5в Уаї СУ5 Рго І11е 5БІію діа Іі ТБг отгробій бій

Іза ії155 148 їуз біс пі бух Тіз їБг о Уві й5р о Ніз із дгф о Суз Іі сіє Суз беж

У Оу і БУ ха 135 ії ї55 їде

Віа Сус Те о ТвВгодів Сух Бго Ттр Веб Ме АРа так Уві допо тк бів їв ув ХУх

Бег іуш іуб щег бек оїу5 Ку Маії івен Су: Б1у Бі Су» від Ав дів і5е 355 ї1За й Бго тТвгосію діа ів і Ті Ті біб Тгроі єв АБротів того Маї

І55 Ба За «2гІі8в» Зх кі» 1189 «Віа» ВЕЖ «гії» бітіівтеіїва врісоїв «ам» 5

Мет І1е Ті бБег АБ дія дсп обег віз Уві Бег баг оуаї дів Те йгЕ і 5 їй ї5

Аіа Ап Біб; заі ї1іе діа ІКе Ту кра Іі ТБгоРго бЗес бек заг Мес

За 5 38 йіз Біш Бій Аза бек о тївготгв АТа біз ББе дв ої у5 го деп Уаї Ре

ЗЕ за У ніж Ар Іі Рес Аг Уві Уві Сів Меї бів бег біз діа біу із тів а БЕ діз те оУаї Ні сіє Аза івв Меї тТВг біу Аїа іо Атїа тб о Заг ББе

Б У 75 ва

Твк о Жаг обег піп біу ев іга їен о Меї Ті Бго Заг о їіви туго ів Ті ва -о зк дів бБіу Бо іга Твг оРго Бпе Уві іво Ніз Маї Аіва діа АгЕ Те Уві їж 5 з дів те о Ніз діа ген бег Рів Ббе Бір Яр Ніб5 Зек Ар Уві Меї 5ег її15 1258 125

МвЕ АгЕ біз пвг осі Ве дів Мех ів бух бек баг бег Маї зів він їі їі Іа

Аза піп де ів дів івгц Іїв бек отіз 13 АтТа бек обвво ія Зве дев ків бій ольюЮЬр і ви лдЕВ ри вів пЕегБобзіЗ ізе дів зекК кпв ої зег лк

ІЗ і-й 155 їі ї1їе го Ра мМаі ні5 вве Ре д5р бі рве дгв тТве Бак о нів ві Уді

ІБ їта 175 зи іУ5 ТРЬее Тк о рго ів зве о А5робБіс дев ї1тТе Нів дзроіво Зец Бух аБя ї55 іза

Ніз Бій Атва їіе їус Афа Т»г о Агрозеє гр Аа із ТВе о Бго Ар г ув її ше г

Рго Меї 112 АРЕ СіУ Твгобек АІа дя Бго АБроТве Тук Рве бів Сх ді і5 ав дев обіц Атв 112 дп о звкотуєк Тк до дей Афа Тук бів нія Уві Ма1ї 225 ІВ 25 ша дер вів Меї Тве Ар о Рве біз їу5 біз Тс о біу деЕ ії ув Тук бів Рго

ЗАт вав ха туях

Ре бін Тук оТук біу дів бег Азр дів Біб АБбш БТіе Ііе Уві жІЗе Мет

БУ 258 В біу зак бО1іу дів бек о тТвВгобек БУ біз Чаї Ії йо туго ївч івги 155

ЕВ а 85

Зіш йза іп Буз чаї біу Уві Уаії Іїе Уві АгЕ ів Бе АгЕ Бго вбБе

Ви жа за его йів бій Ні іє гвги Аіз Уаї Кіе Рго Авр обБек Уві і у5 і чу 1ї8

Іа зів ІВ ва

Вів Уві іо дер йгЕ ТВг ої з Бій Рко пфу Аїа біз дів Бі Рга і гу ха5 Іа За5

Туг ігм Азор Іі Меб тТВге о йфа РБе йіз б3і: бегоіви бег йгв Бі Бів зав ща5 ва

АгЕв йвпотТБг оті Бгао іп тів Уві біу 5іАу дгЕ Туг о Зіу їв б5ег 5ег з55 Ве ва їу» бім ББе дер Рго Акв баг Удаі іву О2у Ії ББе АБп обіц іву Бе

ЗУ БУБ ЗАЗ ігеч січ іує Рго Аге Рго дев РБе тТвг о Маї 5іу ТЗе тТуг йо дв тів зве заз зав зав

ТвгоЗРу ген обеє іве о Ркз ін о Бго йогу ТВГ ОТХів Рез бів ух 5ег

ЕК 18 515 діа іви бі: Аза ів Бве тує БЕ Гец біо бек В5л шіу Те ді ек а ЕВ ада

Аіа так оіує д5а дев Іів іїує Іф тів 5іб А5рожек бек оБго Бе тук «55 ща яа5

Уві віп Біб Тут РБв Уві Туг ази бек і уз Гуз Вів зіу Біу гав о тТНЕ ва кн вай

Твг оЗес Ні іецз АгЕ оУаї ба іен о длр Бгто 11е дев бег Бра туго ге аа Зв ав ява їі тне бег Аіз Ні Бе Ііз піу Сує Ні бій йев бів не Ті Язр аа яз5

Гуз тк бій т1е ха) дрів івецоіуз й5йп Ах б1у ті рнНе івцп г ем а в зів й«п о Твг оБсо Тук дм рух ср ожіч ХЗіе тТгр Ні дгрБ ви Бра ів пів

БІБ ІВ Баш

Уаї біз уві біз іш Іі зу5 із йгд дід Ні ББе Туг І18 Іі Ахл вина 5 вч діа дів зїух тів віз йгр З) Суз деп їв Ру йіз дге о Іів дз о їБг ва щи ва5 БЕ чаї Меї зів А1ів дів РБне Бе Ні ів бег дя І)Зе РБве іу5 дев Азр

Ба 5-й -тВ

Бпе Бек Іі бе бів ем оіу5 сіб Уві І12 АЇВ зує Зако Тук Бак бек -ея в НЕ їжз Бі віп о зів іви чаї бій деп ода Тгрогу5 дів ви дв ів А1в вав вва -в5 їі тне бег іо діб 5іп Іі Бго іво Асп Су5 Уві Азр бів Хег бек вів ВІВ ех

Бго Бек Мех Рга Рка тів Уві Бр да доп АтТа га Ар она Уві Без

ІБ ви 5 вЛЕХ

Тагожві тве АТа таг Мет іга діа щі іо бі до Баг ів Бго Уві сх ек ЗЕ

Бек дів Бе ко Бго А5розіф Ата тТгроБго ТБеопіу Тео тТвг ог тТерВ

Бей ев вв іш іух йгЕ йсз їі йіз Біч О1б тх1іе Бгто 11іе Тгвогу5 ес БІ г вз 75 Ви 5 мз ТвВе ЗіБ Су да Ні Сех Аза Маі дів Суз Бго Ні дів Аза 11е ща ва тва

ЗгЕш віз іус Уві чаї бій Рос д5р овід МЕеї 2 А5за Аїв го Азротве 735 тів тії Уа ій бій Бег оіецв зів Уві іч Аза ВгЕ дпр Мет ів сіу бів АгЕ Туг 75 их-а 75

Маїф івц піп Маї Аів Бго бів дер осСух ТВ ОЗІіУ Суб Азпоівги Сує Уді ла та т5а

Зій Уві Суз Бго Чег дер ойхв Аг дЗп Аза РНе дер ті імя азів тів та5 те 76 деп оМеї бій Рео Ак о їі2е дер Асов ої дев ТНК бій Ак оМві деп Бе тив хУЕ ява

БЗіш Бе ББе бег бів іа Бго Ахройкв Азор Ііе і бег іву йбзр о дгЕ та тва 785 а

І1і2г Ар Іі агбБ ТНг Бек бів івеб ті ТЬг оБго іо РБе біб Тук Бех 85 вів нія зЗіу дів Су дія Біч Су5 Біу біб Тк оБго ТУк тів руз ів іви ТБге вха вІ5 яз щіпоівц Тує зі Азю Ні івгш діа тів дів Азп Аза тТвк обі Су Бек вах Важ вач швгожхів Туєк Зіу Бі деп іа Бгто зек оте о Рго Тук тк о тТБг дв Аг ав Ба Бе

Зег Бі дгв Зі Рке Аза тгроа1із Ап бБег оіво Ре 510 й5р ода ді1з ща 5УВ У ще ін вве дів івги бі Туг ойгЕ Т1е тв о Туг Ап бій Ні йгЕ іуз5 АгГЕ а вща ви5

А1а їечз Ат іо ів) дер Ні іем дів Бі Бій ІЇфв зе бро 535 ї1в за Зак зІЄ

УВЬ Іі Тк овен бів бегобек о йзр діа Тв Іі дів Бій їу5 дов ОТВг -а 25 піп Уві Ар оігм оївец Або бій бій і-й ої у5 НЬб Іів А5р баг дів дій зв аз щи

Віа їуз зі ів їв) біз Ар о ТБ о Авп тб ів Іі8 а5роїуз бег Уві в ЗБЕ За5 з.

Тер Віа т12 5іу Бі дер віу тгтроАла Тут Або 11е піу РБе Бі біт зе5 ета ат їгеноАзв Ні уві Меї бек оівц тп Аза дба Уві дп оТів ів Уві г ви

Апротвг ові Су тТук баг одлй ТБ о біу бі яійб бій бек о їух дів Твг п їі88о ївох

Бгл Ме ожіу дів жЖаї бек оієв Ббе Аїв йод оівц бі іує Ніз ів іще іч 125

Аїа Аг гу5 дво івк о бпіу Уві бБег Тїе Каб Меї ТУуг о БІ3у Нія Уві ів іа ї--5

Тугомаві дів бій чні АТа і2гз біо Бег обі іє йзп о Бій твг о фев іа і 1855

Гу йів ви зів жін Аія зі: Аз тує Ав бік Бго зе оїен Уві іа ів ї-е5 їіе віза туго бег о Бго Су5 бій біс Ні щіу Туг бро Ти АЇв і у5 1579 іа95 ізша паб оНія хі біп Место гу вро іїеномМаі іх бек обі ббе тер о Рго 1555 і55е 1855

Кен туго агЕ Тук др оБга Аг АгЕ Бек олів зі Бі і Рука 0їу ії і ї115 іїги Маві ізн дев Щегофуз бег Бга Аб5п бебоБІй Від ів бегобег 1115 1126 125 їІїе їецч ігр оіуз піц Біб о Абв о ББе йкЕ дгБ ів сіб їВкоїгь зів 1158 ЗІЗ дя

Ре тТвго ув) діа й5и Ті іви Ні зій дев Заг о ТВг о іух Меї Уві 115 ї1ї55 1155 сів бек о їує Туг Аги Бе їв ів Меб ів) бегобБег о Туг бегобор 1158 1155. іхУув її іє тТБкоРго Рго А5рохетг 1175 1188 ке кеш» ВНТ «Іл» Мо5жас яр. «еВ» за

Мет заг Ап піп бпіу діа РБе Азробію За діа йхп уві бін беє віу і 5 їв ї5 дег обгш Уві Ве Уаї Туг сі Уві Уві зіу Мах Аг о біп йо Бій він а шк За

ТБгобкрозій Таб Ав о Туг о бго Тіе вгЕ іух Бек пі бег Мві еБе Тіє за а Як аАгЕ Маї Рга туго дво дов Мет Ап бів 53; Меї бів АбБ Бі тБе о Аге ів біт пі Гу Тії2 Уві ТБгоТ1іе біа ТвгоУаї его дів їв Бій Бій та 75 яв іви дз біє йгаи ТЯгб о тТве Іф АТа Твгобаї ТБ одзр АТ хеб бег аБ 85 а як ті- 53 зе сову сту 4 ді її, т ті Єтучих з і чат ПУ дк

Іі: 8ї8 1у5 Бек ші зіу й ОІіу їв дів ТВ оБго Маф і5 ТБКг о АБр їі 185 115

Зак біуУу дів їу5 із гне дів 15 Бгж Бго йіа бій пі білі ух

Та 155 ї25 іх іух йди два гу Віу сп ТВгоМек те бій діа іув А1в ів НІ

Але 155 148 діа Ар уаі Рго Мві йбпоіву Туг Агд Бго Азподів Рго ББе тів бі її і58 ї55 ї16б8 іу: Уві 118 бХег й5п обі го ів чаї ус бів сбіу зіу т1е б1іу тів ї55 ї7а її7 уаї біб Ні Іі2 їу5 Рне йсроіва те Біб біб дзпоіец ої Тук 118 ї15а 155 із

Бін біб сія бег ІІТв лім І11іе ті бро РБга бі Уві Азроіу5 Аа пі їз5 зав зве їжа Его бій їуз іер о Агш ій ТугоБЕє Ті йїа Зег ТБгоЯгЕ Ні Бі дій 2іБ 228

Ахр Ар оуаі д5р азрогуз ТВг Ті баб ів Су5 ззі АгЕ бів їз біз

ТЕ 238 235 гад

Тук іує Нія Бро БЕ бек бі Ба тТне Уві тує сіу Маї Су5 бек Тег

ХА 5 вав

Тук іє; Твгбоніб Ії зів го біу бак біб чаі іус Ті Те о діу вка

ІБ шо шУВ

Уві Бі уз біз Меї Ген оівехи Рго йородйпр о Рго біз дій Ахп УВІ 112

З75 ях 85

Ше і-й; дів Те оБІу Твеощіу тіе дія Бгв Мет дев ТВг Тур їв їкр ча 2я5 аа

АгЕ Меї Рів гує Азр діа Бі: дге дів дів АзпоБго зім туго зі вне

Зах зів ЗІі5 зак ке бік Вбе бег о Тев о іви Маі Бе зіф Уаі Бго тає Т1бг о Рго А5а Тів за 36 35

Ггз Тут зї5 біб піш ів піц бій тів ів олій ї55 Ту Бго Ав о Дза жа за зав ве йгЕ їв ТВг о Тус дія ї11е бБег Аги Пів ЗіБ іїуз д5поБго зів Зі; 355 зе8 зве піч АгЕ Мет ТК тів піп Яр о дгв уві дів 51 Ніс Аіз ва біб і ви

ВУЖ 375 ЗЕ

ТероБІй Зеп тів 15 де" Бій ів ЖВе Ні тре Тек тіж Су зі зви зва Іза 355 ч-щ--а

АгЕ бБіу Мет Біш Бі» Бі тїІ1е й5р Аїа Аїв івей бегойіа Аів лів діа «ВЕ 16 щі т Бій ват Уд котїкробак о взр о Тук шій уз Арго їує 1 у

Рух БРи ов Уві Тг 1 Зек о дзроТує піп уз Або іо іув і ух дід

З ак аа

Зі дгдк тев о Ні Маї Бій твб гук 435 ща «218» 37 «ІРЕх ай «гі3» НТ «2І13» бупеспососсох р, «ваз 57

Щеї Тут Біу Тів Те бек о тнг від дп бек о тТрг о біж дея бів ЗекоТує ї З ї18 ії5 лів й5п о Аги оіїец Бе ї18е тек бів Уві аз Бі ів БЕ Бім дев БТу а ЗЕ за

Акад йзи Біб ди Звгоіви Уві дк ів его обіу Твб оТвВе Бав о ї1312е так «а ще чві го тує дів ге Меї дев Бів зів Меї бів дев тів твб і є5 ев

Ба 55 ва сіу Бі іч І12 Уві Беаг ЇІїе АгЕ о Бго віз піц вхо дів дів бів Ітіе та У В

Уві Бек бі Зі бБіп бек бек АБа бів дія бек Аів БІВ бек о Рго Ще 85 аа 5 діа бек о бег ТВгоїуз Іі Уві Ні5 Рга іус ТВ Тег др о тТвК хег Уві їУка їй 115

Беа Уві Ап 18 ТУб де Рго іув ТВе Рго ББЕ ігу Бі 1 уз Св Ті 115 їв 125 бій Ап туго біб івем Уві Азд ій бі біу бегопіу ТБгоМаії Аге Ні

Чаї те о РБе дер т1і2е баг біз бі Асп ів дгЕ Тує о їгм осі) йпіу бій 145 їІ58 155 ха

Хек ті Бі ті І12е Бра Рго біу Біц Апроіує Ап обі іу5 Рго НІ5 ї165 ї7а 175 іуз іч Агрогео тТуб Зек їІ3Зе Аїд бек о тве Аке Ніз зі др Веб пів дер ойхп вух ТВг Уві Бегоіегз Суз Маі дйгв о біпоівен бін Туг бій Авр

Тго біц бег обі Біб те оУві Тує Зір Уві Су» веб ТВеотук ів Су5 тій тії да д5п іч Бго Маі біу пгойзо А5ромві гс5 тів ТБг зі Рго Уаі пі

ВЕ ІВ 85 де іїуз5 Бін Меї ів зіву рвго й5д о Азробів а5ролівз тб мав Маї Меє ге а Ба 55 дів тв о сІУ тТвВгоБІіУ Іїе Аза Рго Бе дгд АЇвд РБе о їеи Тед АгЕ Меє

Ів зе5 за вне ів пів бів Ні бін Ав оТуг о іуя Ре гу БІУ їу5 Вів тгріви

КБУ Ва Во

ТІів вве бі Уві Бгто Ту Те АТа дхв тів Бей туго їу5 дор ар РНе ша Фе зай сіб іух Мех Аіа АБа біс Аза Рго Азройха РБе Абе ів отве Тек дів 85 318 зії За

Ії хек дгд обі Бій оїт5 Тве АЇв длропіу Бір; ів Уві Тукє Узі бів 355 За 35 бЗег агЕ Уві бек біс туго дід бор біс і-5 РНе бів Меб тів бів і ув за 5 зав

РБео о йлв Те Ніз Уаї Тук Веє Сух Біу ів Еуз БІуУ Меж вій Рго Рго

Зе8 я Зо тів Азв бів ТВг обве ТВг о Ата йів Аїа й3ій вуз Ас оБІу іо зв Трр пУВ шт5 За біб сів Мех Агд Аг бег Меї їу5 іт піц Ні й ТгроНів Уві БІ 185 358 Зк як чаї Тук «дів» ЗБ «8115 548 «8125 РЕК «13» ЕЕ, «вії «ще» їв

Меї віз бер отв оМаї тБк обі гу чаї ТБгогу5 Маі бій Ап тро оптве ї - 16 15 аз дів ій Вре зегоївец те Маї ніх АЇвз Рго Уві ін Без Ре тТВг а зх за

Віз сзіхж зіп Бе ТБгоїт5 ги бБіу 12ги біз 112 Ахр біу біб АгроУаї я5 да 45

Піп Ага вів тує бек о туго Маі ав обев Бго дов й Рго йхп о івь бій ва як ва

Бре туго іо Маі Трг о маї Рго йзробіу іх го Зек Ркго АгЕ іги дів де за те ща віза іго іуз Ро сзіу ар бін уві бів уві Маї бег бін вів віз 5

Рце РБе Ма) ер Апвр ойщій Уві Рго Ні бух 515 ТВ б ге Тго Яеї ів 182 їйк їв

Віва тве опіу тТвг дів тів біу Бка Туг іенобдес тТіе ви бій іго Біу тів ї3а 125 їж: Ав іє Ар одгд Бе уз й5пи їв зві іез Узі Ні дів Аїя Агв їі39 135 зай

Тут Дів Дів зрізи бек о Тук ій Рго ів) Меб Бій бів їей біб уз

ІЯ5 ї5В їх3 1658

АгвотТук із бі фу ем АбЕ Іф бій тб оМаї Уві бер йге 5105 ТНе 165 їта 175

Аіа дів Біб бегоівю твгобБіу агЕ І1е Рго діа іец тів бін Зег обі 189 ї8х ї98 бі оіга піц бек тн їіе 5іу іем Бра Меї Ап оіує Сів ТБгб бек НІів

Уві Меб івб5 Суб бішж АбзпоРго Біб Меї ві ВгБ бр о тТвг о біп ів іа зів 215 228 іївц іу5 Біб Таб дгв бів Маг ТК оїУБ Ні їз дев Аг др оБго зу 338 зв 234 за

Ніз Ме Те о Аїа бій Ні Туб тер за5

Claims

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Спосіб продукування терпенового або терпеноїдного продукту, який включає: пропонування бактеріального штаму, який продукує ізопентенілдифосфат (ІРР) і диметилалілдифосфат (ОМАРР) через висхідний шлях метилеритритолфосфату (шлях МЕР) та перетворює ІРР і ОМАРР на терпеновий або терпеноїдний продукт через низхідний шлях синтезу; де І5ро і ІєрН надекспресуються в бактеріальному штамі таким чином, що активності І5ро та ІєрН збалансовані для забезпечення збільшення надходження вуглецю до проміжної сполуки 1- гідрокси-2-метил-2-(Е)-бутеніл-4-дифосфату (НМВРР), одночасно попереджуючи накопичення НМВРР у кількості, яка забезпечує зворотній зв'язок та знижує проходження шляху МЕР і продуктивність щодо терпенів або терпеноїдів; цей штам містить одну або декілька генетичних модифікацій, які посилюють постачання та/або перенос електронів через шлях МЕР та/або до терпенових або терпеноїдних продуктів; та культивування цього бактеріального штаму з одержанням терпенового або терпеноїдного продукту, при цьому бактеріальний штам містить надекспресію піруват-флаводоксин оксидоредуктази (РЕОК)

2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що бактеріальний штам є бактерією, вибраною з ЕзсНепсніа зрр., Васійи5 5рр., Согупебасіепит врр., ВНодйобасіег в5рр., 7утотопаз 5рр., Мібпо

5рр. та Рхенйотопаз 5рр.

З. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що бактеріальний штам є видом, вибраним із ЕвсНепісніа сої, Васійи5 5иршШії, Согуперасіепит дійатісит, НЕВРоаобасіеї сарзшашв, НРодорбасіеєг зрпаєгоїдез5, гутотопаз торбіїїв, Мірпо папіведепо або Рзеидотопазх риїїда.

4. Спосіб за п. 3, який відрізняється тим, що бактеріальний штам є Є. со).

5. Спосіб за будь-яким із пп. 1-4, який відрізняється тим, що бактеріальний штам експресує ахв, ієрі), ізрЕ та ді як рекомбінантні гени.

6. Спосіб за п. 5, який відрізняється тим, що бактеріальний штам експресує ах», ахтг, іро, і5рЕ, ірЕ та ідї як рекомбінантні гени.

7. Спосіб за п. 5 або б, який відрізняється тим, що рекомбінантні гени шляху МЕР експресуються з однієї або декількох плазмід або інтегруються в хромосому.

8. Спосіб за будь-яким із пп. 1-7, який відрізняється тим, що І5ро та І5рН надекспресуються шляхом введення рекомбінантних генів і5ро та і5рН у бактеріальний штам.

9. Спосіб за п. 8, який відрізняється тим, що рекомбінантні ферменти І5ро та/або І5рН містять одну або декілька корисних мутацій або є ортологами з покращеними властивостями або активністю за умов, використовуваних для культивування.

10. Спосіб за будь-яким із пп. 1-9, який відрізняється тим, що активність та/або експресія рекомбінантного І5рН є вищою, ніж активність та/або експресія рекомбінантного І5ро.

11. Спосіб за п. 10, який відрізняється тим, що експресія рекомбінантного Із5рН є вищою, ніж експресія рекомбінантного Ізро.

12. Спосіб за п. 11, який відрізняється тим, що рекомбінантні І5рН та Ієро експресуються з оперону, де в цьому опероні ген І5рН розміщений перед геном Ізро.

13. Спосіб за п. 12, який відрізняється тим, що оперон експресується під контролем сильного промотора. Зо 14. Спосіб за будь-яким із пп. 1-13, який відрізняється тим, що експресію рекомбінантних ферментів Ізро та І5рН урівноважують шляхом модифікації сили промотора, кількості копій гена та/або послідовності сайту зв'язування рибосоми рекомбінантних генів ігра та/або і5рн.

15. Спосіб за будь-яким із пп. 1-14, який відрізняється тим, що НМВРР не накопичується в клітинах суттєво більше, ніж у батьківському штамі, який не містить рекомбінантних генів ігро та іБрн.

16. Спосіб за будь-яким із пп. 1-15, який відрізняється тим, що рекомбінантні гени і5ро та і5рн експресуються з плазміди або інтегруються в хромосому.

17. Спосіб за будь-яким із пп. 1-16, який відрізняється тим, що експресія або активність рекомбінантного гена /д/ налаштована на підвищення продукування терпену або терпеноїду.

18. Спосіб за п. 17, який відрізняється тим, що експресія рекомбінантного гена /саї/ налаштовується шляхом модифікації сили промотора, кількості копій гена, положення в опероні або сайту зв'язування рибосоми.

19. Спосіб за будь-яким із пп. 1-18, який відрізняється тим, що НМВРР не накопичується в кількості, більшій ніж 10 мг/г сухої маси клітин.

20. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що РЕОК є УаБк.

21. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що бактеріальний штам містить рекомбінантний ген уарк.

22. Спосіб за п. 21, який відрізняється тим, що рекомбінантний ген УабК інтегрується в хромосому або експресується з плазміди.

23. Спосіб за будь-яким із пп. 1-22, який відрізняється тим, що штам містить один або декілька ферментів Р450 для продукування терпеноїдної сполуки.

24. Спосіб за будь-яким із пп. 1-23, який додатково має надекспресію одного або більше з флаводоксину, флаводоксинредуктази, феродоксину та феродоксинредуктази.

25. Спосіб за будь-яким із пп. 1-24, який відрізняється тим, що експресія або активність І5ро та ІрН збалансована відносно експресії або активності Охг, Ох5, І5рО, І5рЕ та І5рЕ для зниження метаболіту МЕСРР у культурі.

26. Спосіб за будь-яким із пп. 1-24, який відрізняється тим, що бактеріальний штам має надекспресію РорВ та/або миав.

27. Спосіб за п. 26, який відрізняється тим, що бактеріальний штам експресує принаймні один 60 рекомбінантний ген рорВ та/або пиав.

28. Спосіб за будь-яким із пп. 1-27, який відрізняється тим, що у бактеріальному штамі знижена або видалена опосередкована РОН конверсія пірувату на ацетил-СоА.

29. Спосіб за п. 28, який відрізняється тим, що бактеріальний штам експресує мутантний асеЕ, при цьому мутація являє собою 52670.

30. Спосіб за п. 28, який відрізняється тим, що бактеріальний штам має делецію або інактивацію асеЕ.

31. Спосіб за будь-яким із пп. 1-30, який відрізняється тим, що бактеріальний штам надекспресує один або декілька ненативних гомологів їх та/або ПаА.

32. Спосіб за п. 31, який відрізняється тим, що гомолог йіх вибраний із Нт.х1 (Не/обасіенит тоаезіїса(йит), Ралах (Рзеййотопаз аегидіпоза), Смлах (АпЛоспготайит уіпозит), Салах (Сіозіпаіит асеюориїуїїсит), Срах (Сіозіпдіит равівешпапит), Еме2лах (Есіоїпіотодовзріга 5Нпарознпікомії), Рр1 лах (Рзендотопаз риліда) та Рр2.лдх (Рзендотопах риліда) або походить від будь-якого з вищевказаних.

33. Спосіб за п. 31, який відрізняється тим, що гомолог ТаА вибраний з Ас.ЛаАг (Агогобасіег спгоососсит), Ам. Ладг (Агогобасіег уіпеіапаї) та Вз ЛаА (8. виб) або їх похідного.

34. Спосіб за будь-яким із пп. 1-33, який відрізняється тим, що терпеновий або терпеноїдний продукт містить принаймні одну сполуку, вибрану з: фарнезену, аморфадієну, артемізинової кислоти, артемізиніну, бісабололу, бісаболену, альфа-синензалу, бета-туйону, камфори, карвеолу, карвону, цинеолу, цитралю, цитронелалю, кубеболу, гераніолу, лімонену, ментолу, ментону, мірцену, нооткатону, нооткатолу, пачулі, піперитону, розеноксиду, сабінену, стевіолу, глікозиду стевіолу (включаючи ребаудіозид О або ребаудіоз О)) таксадієну, тимолу та валенсену.

35. Спосіб за будь-яким із пп. 1-34, який відрізняється тим, що штам містить терпенсинтазний фермент, що має одну або більше модифікацій для покращення одного або більше з кінетичних властивостей, профілю терпенового або терпеноїдного продукту, стабільності та температурної стійкості ферменту.

36. Спосіб за будь-яким із пп. 1-35, який відрізняється тим, що штам культивують із джерелом вуглецю С1, С2, С3, С4, С5 або Сб.

37. Спосіб за п. 36, який відрізняється тим, що бактеріальний штам культивують при температурі між 22 "С та 37 "С.

38. Спосіб за будь-яким із пп. 1-37, який відрізняється тим, що стадія культивування являє собою періодичний процес з підживленням, який включає першу фазу, на якій утворюється бактеріальна біомаса, з наступною фазою продукування терпену або терпеноїду.

39. Спосіб за п. 38, який відрізняється тим, що культура складає принаймні приблизно 100 л.

40. Спосіб за п. 39, який відрізняється тим, що культура складає від приблизно 300 л до приблизно 1000000 л.

41. Спосіб за будь-яким із пп. 36-40, який відрізняється тим, що культуру підтримують в аеробних умовах.

42. Спосіб за п. 41, який відрізняється тим, що культуру підтримують у мікроаеробних умовах.

43. Спосіб за п. 41 або 42, який відрізняється тим, що фаза продукування біомаси проходить в аеробних умовах із наступним зниженням концентрацій кисню через від приблизно 10 годин до приблизно 20 годин.

44. Спосіб за будь-яким із пп. 36-43, який відрізняється тим, що фаза продукування включає підживлення джерелом азоту.

45. Спосіб за будь-яким із пп. 36-44, який відрізняється тим, що фаза продукування включає підживлення джерелом вуглецю.

46. Спосіб за будь-яким із пп. 43-45, який відрізняється тим, що підживлення азоту або вуглецю ініціюється, коли споживається попередньо визначена кількість порційного середовища.

47. Спосіб за п. 45 або 46, який відрізняється тим, що швидкість підживлення азотом складає від приблизно 8 л на годину до приблизно 20 л на годину.

48. Спосіб за будь-яким із пп. 36-47, який додатково включає моніторинг або тестування накопичення індолу в культурі.

49. Спосіб за будь-яким із пп. 36-48, який додатково включає моніторинг або тестування накопичення МЕсСРР в культурі.

50. Спосіб за будь-яким із пп. 36-49, який додатково включає моніторинг або тестування рівня НМВРР у клітинах.

51. Спосіб за будь-яким із пп. 1-50, який додатково включає вилучення терпенового або терпеноїдного продукту.

52. Спосіб за п. 51, який відрізняється тим, що продукт являє собою леткий терпеновий або бо терпеноїдний продукт.

53. Спосіб за п. 52, який відрізняється тим, що терпеновий або терпеноїдний продукт вилучають з органічної або гідрофобної фази, що механічно відділяється від культури.

54. Спосіб за п. 53, який відрізняється тим, що терпеновий або терпеноїдний продукт збирають із рідкої та/або твердої фази.

55. Спосіб за будь-яким із пп. 52-54, який відрізняється тим, що продукт очищають перегонкою.

56. Спосіб за будь-яким із пп. 52-55, який відрізняється тим, що продукт очищають шляхом послідовної екстракції та очищення.

57. Спосіб за будь-яким із пп. 52-56, який відрізняється тим, що продукт очищають шляхом розділення та вилучення на основі хроматографії.

58. Спосіб за п. 51, який відрізняється тим, що продукт являє собою нелеткий терпеновий або терпеноїдний продукт.

59. Спосіб за п. 58, який відрізняється тим, що продукт є позаклітинним продуктом, який вилучають із культурального середовища.

60. Спосіб за п. 58, який відрізняється тим, що продукт є внутрішньоклітинним продуктом, який вилучають із зібраного клітинного матеріалу.

61. Спосіб за будь-яким із пп. 58-60, який відрізняється тим, що продукт є важкорозчинним і його вилучають фільтрацією.

62. Спосіб за п. 61, який відрізняється тим, що розчинником є етанол.

63. Спосіб за будь-яким із пп. 58-62, який відрізняється тим, що продукт вилучають шляхом хроматографічного розділення.

64. Спосіб за п. 63, який відрізняється тим, що продукт вилучають фільтрацією.

65. Спосіб за будь-яким із пп. 56-63, який відрізняється тим, що продукт вилучають послідовними екстрацією й очищенням.

66. Спосіб за п. 59 або 60, який відрізняється тим, що продукт кристалізують із розчину.

67. Спосіб за будь-яким із пп. 1-66, який відрізняється тим, що бактеріальний штам або клітина надекспресує одну або більше з геранілдифосфатсинтази (РР), фарнезилдифосфатсинтази (ЕРРБ) та геранілгеранілдифосфатсинтази (СОРРБ).

68. Бактеріальний штам б. со), який має одну або більше генетичних модифікацій, які підвищують продукування продуктів із попередників ізопентенілдифосфату (ІРР) і Зо диметилалілдифосфату (ОМАРР); бактеріальний штам, що продукує ізопентенілдифосфат (ІРР) і диметилалілдифосфат (ОМАРР) завдяки шляху МЕР, і шлях МЕР, який має один або більше надекспресованих генів; цей штам перетворює ІРР і ОМАРР у терпеновий або терпеноїдний продукт низхідним шляхом синтезу, при цьому вказані генетичні модифікації включають: (а) рекомбінантні або модифіковані ферменти І5рсС та І5рН, ферменти ІзрО та І5рН із збалансованою експресією або активністю для попередження накопичення проміжної сполуки НМВРР, (б) рекомбінантний або модифікований ген, що кодує фермент, який посилює постачання та/або перенос електронів через шлях МЕР та/або до терпенових або терпеноїдних продуктів, який містить надекспресію гена хаьк і з надекспресію ненативного гомологу їх та/або ПаА, (с) інактивацію або делецію, або знижену експресію, або активність ферментного комплексу асеєЕ або асеЕ, та (4) рекомбінантний або модифікований ген іді для налаштування активності для підвищеного продукування терпену або терпеноїду.

69. Бактеріальний штам за п. 68, який відрізняється тим, що цей бактеріальний штам експресує ахз, ізрі), і5рЕ та /аї як рекомбінантні гени.

710. Бактеріальний штам за п. 69, який відрізняється тим, що бактеріальний штам експресує ах», ахт, іврі, іврЕ, ізрЕ та іді як рекомбінантні гени.

71. Бактеріальний штам за п. 69 або 70, який відрізняється тим, що рекомбінантні гени шляху МЕР експресуються з однієї або декількох плазмід або інтегруються в хромосому.

72. Бактеріальний штам за будь-яким із пп. 68-71, який відрізняється тим, що НМВРР не накопичується більше ніж 10 мг/г сухої маси клітин.

73. Бактеріальний штам за будь-яким із пп. 68-72, який відрізняється тим, що експресія рекомбінантного І5рН є вищою, ніж експресія рекомбінантного І5ро.

74. Бактеріальний штам за п. 73, який відрізняється тим, що рекомбінантні ієрН та іхро експресуються як оперон з і5рН, розташованим в опероні перед ізро.

75. Бактеріальний штам за п. 74, який відрізняється тим, що оперон експресується під контролем сильного промотора.

716. Бактеріальний штам за будь-яким із пп. 73-75, який відрізняється тим, що рекомбінантні гени і5ро та і5рН експресуються з плазміди або інтегруються в хромосому. бо 77. Бактеріальний штам за будь-яким із пп. 68-76, який відрізняється тим, що експресія або активність рекомбінантного гена іді налаштована на підвищення продукування терпену або терпеноїду.

718. Бактеріальний штам за будь-яким із пп. 68-77, який відрізняється тим, що штам містить один або декілька ферментів Р450 для продукування терпеноїдної сполуки.

79. Бактеріальний штам за будь-яким із пп. 68-78, який відрізняється тим, що експресію рекомбінантного рорВ та/або пиав налаштовують таким чином, щоб забезпечити вищий титр терпенового або терпеноїдного продукту.

80. Бактеріальний штам за будь-яким із пп. 68-79, який відрізняється тим, що бактеріальний штам експресує мутантний асеЕ, при цьому мутація являє собою 2670.

81. Бактеріальний штам за будь-яким із пп. 68-80, який відрізняється тим, що ненативний гомолог їх вибраний із Нт.ййх! (Не/обасіепит тодезіїса(дит), Ралах (Резеййотопав аегидіпоза), Смлах (АйЙосбготайит міповит), Салах (Сіозіпдіит асеюориуїїсит), Ср.тах (Сіозіпайт равіеипапит) та Ем2.Міх (Есіоїпіотодозріга 5парознНпікомії), Ррі лах (Рзеййотопав рийда) і Рр2.Мдх (Рзендотопах риїда) або похідних будь-якого з вищеперелічених.

82. Бактеріальний штам за п. 81, який відрізняється тим, що гомолог ЯЗА вибраний з Ас.Лад2 (Агоїобасіег сптоососсит), Ам Лада (Агогобасіег міпеіапаїї) та В5 ЛаА (В. виб) або їх похідного.

83. Бактеріальний штам за будь-яким із пп. 68-82, який відрізняється тим, що терпеновий або терпеноїдний продукт містить принаймні одну сполуку, вибрану з: фарнезену, аморфадієну, артемізинової кислоти, артемізиніну, бісабололу, бісаболену, альфа-синензалу, бета-туйону, камфори, карвеолу, карвону, цинеолу, цитралю, цитронелалю, кубеболу, гераніолу, лімонену, ментолу, ментону, мірцену, нооткатону, нооткатолу, пачулі, піперитону, розеноксиду, сабінену, стевіолу, глікозиду стевіолу (включаючи ребаудіозид О або ребаудіоз 0) таксадієну, тимолу та валенсену.

84. Бактеріальний штам за п. 83, який відрізняється тим, що штам містить терпенсинтазний фермент, який має одну або більше модифікацій для покращення однієї або більше з кінетичних властивостей, профілю терпенового або терпеноїдного продукту, стабільності та температурної стійкості ферменту.

85. Бактеріальний штам за будь-яким із пп. 68-84, який відрізняється тим, що бактеріальний штам надекспресує одну або більше З геранілдифосфатсинтази (ОРРБ), Зо фарнезилдифосфатсинтази (ЕРРЗ) і геранілгеранілдифосфатсинтази (СОР РБ).

Гржиокні нет Кт т позаклітинні и имя нн вм вненКн нен ен нини кмин ення іосесовієчаюкя нн пи ВЖИ ПЕ ше он ши ПІДОМЖИ Мт: МЖК КОЖ ЖИМ кеВ в В ОК В ВК В В ЗВ ОВ ОВО ВО СОЮ Ки ти нд м УТ и и ся ПИ Кв о мой п ни В пор хом нн доб о КК Кв нд пе НУ КВН ВОК НН Гана "Бнутрівньокпітинні: пе КОН Кр ких не Вк КУКИ ик в р и ня А фею к рвВ го в апа в по ро нер ше ШЕ що МеВ вв в СО п КВ пи в в. т ПЕК ев в вв о ню а п ша ау пив т не вет сет акт во ен екв ко вжи кв ПК и и УК М и он ов гово ко т ее Ту пи ош о оя вне пови ох мч Ро йо дги ЕЕ КВ ща. пон и прак пий " вия і. пи ж с пове пев вою вк вк шовк з в с о о кіт ніш нн, пор ке ПОН МНК и же но В он о во он ва а ШІ пли й в хо зас ка м м Ж ЖК и В о и м ех ко М оо ак мое ее ЖКОВКННЕ Ж ос ЖЯКВЕ кон, й ши о В ОО в екв В В а нн Ге нн ЕВ В В В я се Кт Її пою р с вою кни о ов о дк онов ен ак ов пн но виш ан нн а о ВВ А ВИК од днк ре пиши я опа п в БО т КК т В пе Ко в т В ОККО І КИ ДК Ви ' СК поФоео ери перо пакт Кен п вве ро ко о вело во и ро ке о ї Е М щ З око кі сін ккд жжіктя іа ріс ку кжіктідюютя Ку скіни їж мехв вон цк Є ї в Гран ікикаку: Знаки Зеумннє Терка

Фіг. 1 ж т КДКА КАТІ ВАТИ МИХ ре ККУ КІ КТК Тит ЖК КТК КОЖ ГТК ІК АТ ПИ КИ лити ТУ ЖК ЗВИК ЛІК ВК КИ ТК Я ТК ТИ АК АТ зи КАТ, : ; Я З дк ЗХ 5 | і ча х Е ОО З З х їх ОО 3 В х : КО Ох хх о. ї . ї ОК 5 ОХ 5 г 25 . ; о ХО х х х ЗОМ КО й ху їх дО ОХ їх с. ї СКК МОВ х

З . ; ОБОХ о 2

З . : . 0 ї х Її о ЗОЯ : : ОО 5 КО ОК ХО ОА З «І ї о. ї о о Ко о ; . тре ОО х З о о о . ; в о о с дж окон о о о. о. не 0 не жен нн поляни НН лин Конерол зі мЕ оздеій х зсен ее 4 д знтроль НО ім клен тв Бо ріг. 2 дня її ми мим ї ї екю УЖ хх ж з г ; пєххеюенк екю екю пли У ММК г 1. пу псекекккисту СТУ т Що шк В Ознак Ї є ж фо ме : : в г 5 Її месуююя і ш і ри вима шк 3 РОЛИК : ЩЕ ха 0 В овкмаюо З шк р ях она. се і М тих У пи 5 : п їі ГО МУ Кк пен Її силу 1 СН о о ши. Ям : ща В я се .

2 В | з сек ВВ со Уки Бк ми ї еї я г чи с Б ІК ї дн : ВО - ши шк Є шен о: Фе ща й Ко Ко х 7 :

в. й Е г Й сну: : : Е «7 - Ко : 30 т Ко К і Зв ! З їж В щОлЕ і мер: он х - Вик : юю кратне тт х є вин в збільше : га її ши ПТУ ун Р Ж В І докт вк ОН і Ех 1: меню пиитютя пан ї ; Во шк -і т о. : : по - Кк : -й ЕЕ У ; ЖЖ КО и НИ |і - як . ЕІ ж вх Б : : Б ЩЕ с о пеуве

Ж. о . х о С ве : БЕК КМ че як ВХ хо У 5 ери ОВ : я Ї сосен БУ БО ВО ОМ що : шк НН. 5 З ХВОСТИК МАЕ: ! ! г хе ПАХ КО В х БААЕР ї рес Ї о спо Ме Б: ї Ж ї У КЗ х 7 я зок : Вп : і Е « їх с ня : е х ОЖе Ще с | ; Ж шк й ' ши ки ей кине : Е ш долити хом Б ж путем У Роз Й : : ДНЯ вчи х з « й дитолетняннаннкст пня Я щ- В. НЕ : ії

В. : о с х ї Ї : ; -Е : : а «кра їх : : дю ї а - рат не т ! Ме я збіль : З : : Щі еНН ко : : ення ще їі Ух МОЖ : : Аг КО: УКХ МЕ ї ї ШЕ МВ В : ! їі ТЕ КК ї З ше фа нлккукю А КИ - їз : Ех ДА з шен нення Мо ща ї вен : я В я в я ВО. я од Є в шо : БЕ шк во ї в й ща І : : ж З х : пику кни ки кі х я : я х : УИЛКУ КИ Ек тежую ух ; пиєжеттиси 5 іг 4 сеть

ЕР: НМ пеня . ш Кл є | . І 27758 С зболіт пт внут утріц с х ї і: Ше ІТИ Фо я жі г . с Її . т У В А що не 4 чі -Е й ; З 5 . ь і : . о . Кв зно с. 5 ЕХ ж КО | ; х б о вд . . . що й ОХ 5 З. 5 5 о З Сл : : з | С Зх ох ЗО о. ОХ в ке Яаше і ; . СО М КО ж МО КЕ я й | ОО ще с М З що ЩЕ щі х фо ко 5 М Ох що я ВО КО ОХ ТК ЕЕ З вх п . . с с. о. жа 1 с. З с що ще о о 5 п І Ш . | о о. І КО у Я ТО що щ- ї ! Ши с о о о і і : З « ЖК ТЯ Я . І | '

й . о ї ще нта ях Хоч ОЗ - 5 ТЗ Її З : шо ЩЕ г. : Ен КО ху Я Що Фі Й 2 «АЖ ух ІГ КУ ще ї гою» | | і жк ї соми ш дод ї І о тв. ща я х. ШЕ 5 ї ї З З о. с . о ї : . зх о. х З їх о. ж о о лк З ОХ 5 М БК МО о; . кан ще о : о її шк . | с. сі о хх о ї Ш ОО С зх З ХО Хе Куй п ї

З . о : о о ОХ З ї М : о. З о. «во сн о.

Ї о. о. і ж со г. 5 ьІврВі схе о . сухим врнЯвою р

Фоосее в ше пектин ї ї нога коллі Кх 3 їх пе ееккннннчнк ек зх ї Її п гххек куяк А їх 5 їв : хллняхиткхкки б г в - ї Б з У З Е : ї у : і щ в т. шк : ; - у З: КЕ х Її КО ; о я : їх щ ша Би ї ; . і ; ж І 5 ХХ 35 ж М Б: Її ж ши. ШЕ . : ЕЕ ше ; ; ЩЕ : о ще. | ї У | ; ї : ж щи її ї їх ЗК Я ЕЕ Ох КО ШК : 5 - 3 ї що КО ЖЕ 58 КО: ШЕ чНЕ у ух вк й ї що ОХ х : а хо З : 3 о з ЕЕ Х х 5 ОО хі ї ж ек х ж о : т 5 5 : -х КО с : и щі щ щ ши ше. ШЕ в че - 4 з ЕІ. І ши . ШЕ ше шЕ. ШЕ вн и шшщі шщі їй ак і . - МК. . , о ще . ї Е : с КО :

ХУ. щЕ щ Х г : с її 5 тот сим З її З : Її ще т - У. ЩЕ Ії ЩО І 5 ще ; Ж ї 5 В : з ї хх Ж ЗЕ ОН АК су З 5 нн щі. ши ши. ще гг В. с в З ї 5 В Б і де | БО і Х Ди с До З : 5 ЖЕ ше не. З Еш ї с ї х ух Хм і З | і : З о . : З Ф ї в їх Ії ї х ї «ЗК, сою с 5 зх С ще М Не З 7 З я пут г : х В Ж Я зії 2 ши ОО. Н 5 4 вк їх з з ше ши що І ревб ! ж а зе ї й х ій ї т " ху Ро : Я вав 7 2 З : В рев во ї : ак а 3 ї : я В. 4 і Фі ! '

ріг. 5 і п : ха деєкнктюрккєтттяня дк мож . й Ні нина Фо : | пня М Е ї ї т 5 Є ї щи х ї ї Е є ї - Е ї Б х

; . ЩЕ ; ж хо В х з ЗО Ех Її ; ; п ї х х ї ЗМ І х ас З ї 5 -к М 3 зу ї ще З ї ; з ах - 5 ї ї ве о о їх ЩЕ т ; . е Ех ї Ж У У їх х ке ; їх Ж бе ОО Ж ї В ще КЗ Ше: Ах ї і ї Ха у аа ї ох ЗУ : Е ще ї ї З ши М ; |і Б: ШЕ ; ї ш щ а приді ши ще ОО ке З хо У -

чо . С, я ЕЕ шення У ше. щ тої се як Ж Ма ї ЗО КО З ї ОЙ ОХОВНИШИНХ я Ох ї Е КО и щ ші. ші пи щ о о. й Ж ї БЕ М 5 5 БЕ С З КОХ А З 5 ВО ОХ хоЯ х ї З. ОК я : КОХ У Ж ді . о. и. ШЕ ій М фіни хх КОХ М с - ї КО : 5 ї е Коліно Кс і. З ї : КО ї С КЕ ОО її і 5 зслорисео юну. : Б 5 ХО ОХ ОХ їх Ед ху КУ оби щ : ОХ І ке 5 ж Фк хуя Ше 5 ща що " МЕ жк і стайня З Ії Її кю) х я її - - ек ириюки АХ дя : с х х х ї а У ЖК схе У ЗЕ х т с х ї ж: о 5 рми ня ОМ х х : . : фа 4 сен Е х те 5 и 5 ж их ст чо а ше я У Е ; ї т о. З жа ї їєміб » івнне У а оон ів а . У 7 їх св У ї 2 З Кк У т. - КЕ Фі ооврБ нен іг. 7 ' о. : ї

: ух х ї х пгеежеютоеюю хо З ї н дити ноут чен х | д дреннннння г Ма ; В повернення в ; рення вч : ї 5 ї пн З Е х ї ЕО" ї ) : ; : : . 4 53 Х х 3 ї Е п ХХ ї З : : ; З ; ї : х Оз | : ш ще тв . . о. т 2 : хх : дон м меч мот Н : Уж се ї ш 0 в пенні сш о. ш й щоки еф ШЕ - ш а ов о. її : соня що ; ЕЕ Ш х Б ОЙ. як ЖИ я ШІ ба ШЕ. щі. : ш. і Еш з - х Ох х х ОХ її ІЗ Х У ООН ба дп 5 Е що ОХ З с : с З ОХ ІТ й Кз що ї ХК Ох З Ж хо СОЯ : . . ! . З У МАХ ЗХ : х з х З ї Ох З з Я «чі 5 що ще о п З 3 що | о ! ча й дике х ї ХЕ з СЕ З ОО у ХЕ ї Ох о 5 х х Ж ї з. уденинко ХХ я х о КО Я . с. о ї ГЕ От за с» ОО ОО | щ Ще : ї З ї клучехН : ще : В дО кі х

8. з. нн ще ; БО фо ! Хоб п і ШІ: ; ру : , ї жк ах : Хочу ОХ х Ж ж « Кк Вон : т в ї . зонної ї як: Ї ван іо : Фі ? вве.

Фіг. 8 ! У х кя щи | ря з Е ему юихям ї Е. 3 ї ую в ш Ї 1 ї писккиєухтехчтх Е: М ї з Ф : , й В ї ! : : - 3 | ' і ! ща і Є з Е ї КО ї Ж 5 Ше «а. З і що : ж шк не ! : ; "ж ШЕ. ШЕ І і ве: ! ш Ко ш й . зах | с піхв ш : ЕЕ 5 о Б. шо мих - - 2... о що Кі ЩО. що М. КО Шк а 5-5 ЩЕ | п. ШЕ. й г ши шля | й с. 0 о й : ! сення | ще ш Ох й а СЕ роли ш щ ш й х с ; дике КМИН. БО ЗЕ З 5555 Ж г | х г: ! є сфе о хі о о. . дн І ЖК жккикки у ММ МК че їж і ве і прес І ші ! й седсн Щ 501 Я Б Ал - ї вк ОВ о с -Е і м ка шо ща - З ЕЕ ЩЕ І маш ма | Ж з ; З ЕЕ і ' о ря ши й ї : щ і - і « х !

і о. КО » Е ; і їх 3 : і -шО-- 3 ня 1 х ще З НІ в. їх 1 Н ке 1

Фіг. 8 ! ШЕ 3 ї іпкжоа ВАРВН КЕ ; дян т ТЛ кхОиМхО с х | і тк МУР фр АКИ м з НВЩИ ее ; МР вРЛЖААТІ Но зовн НЕЖРР ФеЛУМАВИ і . а сі сера мі ії ЕЕ ! ки і Ж . яка пк Ем й і їж і ї зи КО вад ї я: ; и и і ї У ін я і жи Бо ох щи Я и є ! одн і ал жо Ки : З плоОя ї що Ярорнкає Є і МНЕ ох б і Ї г "7 ! Щ кети манох 1 ! ЖЖ век ; 1 Тент не Р ! т о, підиУне соя : вар» у й КЕ Ї ве як Ж см ж пооднин, й щдншох МиХКЕНЯІ Кол і КУНИКУТИ вки аа . і ТЯ сріг. 10 - ї її. 18 : ; | А . В ; Е і ; і '

0. і і :

Ві. : ! в: : ОТ Е : 0 ; ї ії шк 5 : о | шщЕ с , 3 ї : : х я СЯ М : : ї х х ї о фе СО домолн ою В мли і ії 5 ОВ 5 м З її щ55 ОХ: ОХ ОХ : - і БО ї ОХ Ї У ХХ КК : : її ОО ЗК 5 : а і ; М С БУК щХ : й ш шщ- шщ с. ш їх МО ї ШО МОЄ ОО З ї Коатваль а іч н.е І пи я орМмекеєх зе УК ле УВК зе УВК - 5 селжн ї ї : шо в. ї зокре ї : Її щі РО і ї ВиБвлвддог шо 000 ше : то ПЕК Вае? шо БИ ! ї аНнМмВЕ х й ях х т ї Ії ї- 7 ЖИ х ї : Я : Крутий ї їх ї ХЕ МЕКРЕ Я ї КК : 1 : Й І Геї 5 Мк : ї і х і вдсреюн : : а ОО : ОВК м . Ки ї 1 ї В ОЕМ ; Е : РЕЯ: ока Її ж зосиех Ук її щем ОБ М в ФО 010 КМ 1 шЩМ 000 жу ком ої а : Мк ОХ ї Ук Ту ї КИ я : днюв : Ек Е хау Бр Така ро МЕ 5 : ме ім Бех Миоте Киї 2 ООЖНЄЖЯ Ро бен 0000 жеркей роя КЕ Е СО БМиИМ О ї Би їж синя шижня 30 0 ВЕ : ДН ї ХУ і Мити Я У БО ж 5 Ки ї Ех Кия І Мукияея : р : вимі 0000 Я і ПЕ ВО шиї виюЖ Б овен ОО БУС РО УУУХ тиж и 10 ВНюЮЖК Ж і БМ о 000 КО Ки ик х Може КОХ нене феяктнх ВМ КК каджнні техн Ан ть. М ЖЯ : Кк пен м и их лит вт З контракт " " : - « «котки хнллсннї щук з Кастраль вену кн Б . др - " ех КЕ ИО Ж та жНх «ви

Фіг. 11

00 вк ння ве кет

Надес м Я Кк З ї ; ххх н ' пкскюрня но-відно ї ; Е потен вними к - хо 1 спри е р : ї тучних х Я - о З КО ХХ КОХ ї ї ях ї ОК ОЗ ЩО М 1 оч я : зе і що: о с Б Ох т вк ОО і щі 5 ШИ що о ї : ОХ ї Я КИ хе : -Х т я ї о ї : ХО ще о АХ : БО й а й п ї ХМ о Я КО ї д Ж ках СХ ХЕ 2 ОО 5 ОХ КА 1 Дек ММ : 3 ш-- ХХ СО Х Е о т х сля ВЗ СО З ОО і ан Жеонтпє і З Сх х г. ке вя кити МОХ 1 с дит Й м: Ух х 7 аж КЕКВ М Ї а рення як -. длосуккиякс З ШЕ а. і питнкх нюх й . - я і І ше х кі ві ї ДВ ї Моя Ден кеннтянняння й ї.2000В п Е ех зхлняя з шлЕ ху х а зх Е: ї в ЖК . 5 мя духи ве їх т : пинннння панни рон жо і БИ дя п Ше ОВЕН ж шо ї пеня понии ТОН й : р х зичжжютя мн : ХО Кох рен ВИК ї уся зхжнпнжя пилу : Же я БО о Ми сухоти 0 ЕХ ї вк т вн зкух пнях ГО студ фе : йо 4 х ІК Ж шия земних ї Те-аЕЕ ! г во КО ке ее т ії ж ЖЕ рми о ї ПеЖОХ Во х пежх іхлчннх х лк ро ВВ Кс ТАКЕ МК сетневнняні ям ШЕ Конт ши шя Кен ши сон Шия ож ї Ж ЯН огВх Кк Вс раку іх хо Бе ке ще «КИМ Ме дн - є М екю мох. С шт Е тих ЩЕ М і У ак ке Пс : Б х СУ ХМК ноеюи ОО : - я | с секонд щлох 8 ее Я сю і Ж кА х сом пк ей Я гсхВ « У я осхе я Ем ще КЗ щх ж Фі фіг. 15

І с : : оо ака? 1 ДЖ В ше Ко гай уроков ; хорих Кий ї ; ТЕХ лосідихомки умо у Ей і х й схо, ри ї ; сеедк Кий ехо я З

1. ї о шок їх ї 5 зи ЖК Х х 1 зумів Є Е ї КЕ ї : До ек ї 3 ї ї жк : оддлиннннкниввю ДВОЄ : я й : «хр Б сюяееЬ і шен овен ЩО» Вол в я" в Ко МЩілях МК я ЖЕ У «Флжоже З КЗ ї ї Я , ; ші ї - Е Тож т в х ча Я ех ж т 7 ско і 2 ж ж : ДР зано РО я ех 1 чини Я ТрукоАх ; дехто З фс АСКЕ ше: і Ток 1 шля ї М ж М дня пятою куля

Фіг. 14 трюкоай , зкрузат пллялкна тент ; ! у

Зх. ЗДУ | вх : і х й по і п и БИ. НМР ВуВВеАтЕ поунат і шк Бі рух ТЕКУ ії г 1 оку Хи І Я оо Ж зок Я ВАД З. я і Кк: михання РОК Я МАЕ чеУпМмиии і ще ї В й сама МІ вес и Ї | ж х і Е г їх ЩЕ Пк Е Пекун ! , » ої 7 : ї тих Е і к дин Буду : З їх й фс ев : В дкшеве см їх КД й Ж т

1. | месре НМВЕЕ ш фени ВНД Я ка і і 1 М " ї 1 хлів пою дою соА ще? ті | ПК ро ща іч т і х я Ж бок аа Но . ж Я Ь; ЕМВ а ел ж зх ик Я я ке ях ет КК З ОДУ мі киманної лорі 7 РУ ол А я яру лік є х Унаемя ацетат цикв нки тимонної зека-а ее УКХ вата кдаун або нокаут РОН

Фіг. 15