BRPI0314979B1

BRPI0314979B1 - método de produção de um valenceno e microorganismo transgênico

Info

Publication number: BRPI0314979B1
Application number: BRPI0314979A
Authority: BR
Inventors: Clark Anthony; Schalk Michel
Original assignee: Firmenich & Cie
Priority date: 2002-10-04
Filing date: 2003-10-02
Publication date: 2019-10-22
Also published as: US20050210549A1; US20080213832A1; ATE546521T1; US7273735B2; US7790426B2; ES2607122T3

Abstract

ácido nucleico isolado, polipeptídeo, vetor, célula hospedeira, organismo não humano, e, métodos de fabricar uma célula hospedeira recombinante, de produzir um polipeptídeo, de fabricar pelo menos uma sesquiterpeno sintase, e de fabricar pelo menos um terpenóide. a invenção diz respeito a sesquiterpeno sintases e aos métodos de sua produção e uso. em uma forma de realização, a invenção fornece ácidos nucleicos que compreendem uma seqüência de nucleotídeo como aqui descrito que codifica pelo menos uma sesquiterpeno sintase. em uma outra forma de realização, a invenção também fornece sesquiterpeno sintases e métodos de fabricar e usar estas enzimas. por exemplo, as sesquiterpeno sintases da invenção podem ser usadas para converter farnesil-pirofosfato aos vários sesquiterpenos oxigenados e alifáticos incluindo valenceno, biciclogermacreno, cubebol e delta-cadineno.

Description

“Método de produção de um valenceno e microorganismo transgênico”

Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. N^o 60/415.765, depositado em 4 de outubro de 2002 e os conteúdos dos quais são aqui incorporados por referência. Este pedido também reivindica o benefício da prioridade do Pedido Internacional, PCT/11302/05070, depositado em 2 de dezembro de 2002, os conteúdos dos quais são aqui incorporados por referência.

A presente invenção diz respeito às sesquiterpeno sintases e aos métodos da sua produção e uso. Em uma forma de realização, a invenção fornece ácidos nucleicos que compreendem uma seqüência de nucleotídeo como aqui descrita que codifica pelo menos uma sesquiterpeno sintase. Em uma outra forma de realização, a invenção também fornece sesquiterpeno sintases e métodos de fabricar e usar estas enzimas. Por exemplo, as sesquiterpeno sintases da invenção podem ser usadas para converter famesilpirofosfato aos vários sesquiterpenos oxigenados e alifáticos incluindo valenceno, biciclogermacreno, cubebol e delta-cadineno.

Fundamentos da Invenção

Os compostos de terpeno representam uma ampla faixa de moléculas naturais com uma grande diversidade de estrutura. O reino vegetal contém a mais alta diversidade de monoterpenos e sesquiterpenos. Freqüentemente eles desempenham um papel na defesa das plantas contra patógenos, insetos e herbívoros e para a atração de inseto polinizador.

A biossíntese de terpenos foi extensivamente estudada em muitos organismos. O precursor comum para os terpenos é o pirofosfato de

Petição 870190025523, de 18/03/2019, pág. 7/8 ¢3 isopentenila (IPP) e muitas das enzimas que catalisam as etapas que levam ao IPP foram caracterizadas. Dois caminhos distintos para a biossíntese de IPP são correntemente conhecidos (Figura 1). O caminho do mevalonato é encontrado no citossol das plantas e em levedura e o caminho que não do • 5 mevalonato (ou caminho do desoxixilulose-5-fosfato (DXP)) é encontrado nos plastídeos das plantas e na E. coli.

Por exemplo, o IPP é isomerizado a difosfato de dimetilalila pela IPP isomerase e estes dois compostos C5 podem ser condensados pelas prenil transferases para formar os precursores de pirofosfato terpeno acíclicos 10 para cada classe de terpenos, isto é geranil-pirofosfato (GPP) para os monoterpenos, famesil-pirofosfato (FPP) para os sesquiterpenos, geranilgeranil-pirofosfato (GGPP) para os diterpenos (Figura 2). As enzimas que catalisam a etapa de ciclização dos precursores acíclicos são chamadas de terpeno ciclases ou terpeno sintases, que são aqui aludidas como terpeno 15 sintases.

Estas enzimas podem ser capazes de catalisar ciclização de etapa múltipla complexa para formar o esqueleto de carbono de um composto de terpeno ou sesquiterpeno. Por exemplo, a etapa inicial da ciclização * catalisada pode ser a ionização do grupo difosfato para formar um cátion 20 alílico. O substrato depois passa por isomerizações e rearranjos que podem ser controlados pelo sítio ativo da enzima. O produto, por exemplo, pode ser acíclico, mono-, di ou tri-cíclico. Um próton pode ser depois liberado do carbocátion ou o carbocátion reage com uma molécula de água e o hidrocarboneto ou álcool de terpeno são liberados. Algumas terpeno sintases 25 produzem um produto único, mas muitas produzem produtos múltiplos.

Uma diversidade grande de estruturas de terpeno e sesquiterpeno sintases são encontradas na natureza. Diversas sesquiterpeno sintase que codificam cDNA ou genes foram clonados e caracterizados de fontes vegetais diferentes, por exemplo, 5-epi-aristolocheno sintases de

Nicotiana tabacum (Facchini, P.J. e Chappell, J. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 89, 11088 a 11092) e de Capsicum annum (Back, K., et al. (1998) Plant Cell Physiol. 39 (9), 899 a 904), um vetispiradieno sintase de Hyoscyamus muticus (Back, K e Chappell, J. (1995) J. Biol. Chem. 270 (13), 7375 a 7381), uma (E)-p-fameseno sintase de Mentha piperita (Crock, J., et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 94 (24), 12833 a 12838), uma δselineno sintase e uma γ-humuleno sintase de Abies grandis (Steele, C.L., et al. (1998) J. Biol. Chem. 273 (4), 2078 a 2089), δ-cadineno sintases de Gossypium arboreum (Chen, X.Y., et al. (1995) Arch. Biochem. Biophys. 324 (2), 255 a 266; Chen, X.Y., et al. (1996) J. Nat Prod. 59, 944 a 951), um Ε-α-bisaboleno sintase de Abies grandis (Bohlmann, J., et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 95 (12), 6756 a 6761), uma germacreno C sintase de Lycopersicon esculentum (Colby, S.M., et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 95 (5), 2216 a 2221), uma epi-cedrol sintase e uma amorfa-4,11-dieno sintase de Artemisia anmia (Mercke, P., et al. (1999) Arch. Biochem. Biophys. 369 (2), 213 a 222; Mercke, P., et al. (2000) Arch. Biochem. Biophys. 381 (2), 173 a 180) e germacreno A sintases de Lactuca sativa, de Cichorium intybus e de Solidago canadensis (Bennett, M.H., et al. (2002) Phytochem. 60, 255 a 261; Bouwmeester, H.J., et al. (2002) Plant Physiol. 129 (1), 134 a 144; Prosser I, et al. (2002) Phytochem. 60, 691 a 702).

Muitos compostos de sesquiterpeno são usados em perfumaria (por exemplo, patchoulol, nootkatone, santalol, vetivone, sinensal) e muitos são extraídos de plantas. Como um resultado, a sua disponibilidade e preços podem ser submetidos à flutuação relacionada com a disponibilidade das plantas e a estabilidade dos países produtores. A disponibilidade de um sistema independente da planta para a produção de sesquiterpenos pode ser portanto de interesse. Devido à complexidade estrutural de alguns sesquiterpenos, a sua síntese química a um custo aceitável não pode ser sempre praticável.

Sumário da Invenção

Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a ácidos nucleicos isolados que codificam sesquiterpeno sintases. Como aqui usado, uma sesquiterpeno sintase também pode ser aludida por pelo menos um - 5 composto produzido pela enzima no contato com um precursor de pirofosfato terpeno acíclico tal como famesil-pirofosfato. Por exemplo, uma sesquiterpeno sintase capaz de produzir biciclogermacreno como um de seus produtos pode ser aludido como biciclogermacreno sintase. Usando esta convenção, exemplos de ácidos nucleicos da invenção incluem cDNAs que 10 codificam a cubebol sintase (GFTpsC) (SEQ ID NO: 1); δ-cadino sintase (GFTpsE) (SEQ ID NO: 2); biciclogermacreno sintase (GFTpsB) (SEQ ID NO: 3); valenceno sintase (GFTpsDl & GFTpsD2) (SEQ ID NO: 4 & SEQ ID NO: 5); e.

Em uma forma de realização, a invenção fornece um ácido nucleico isolado selecionado de: (a) um ácido nucleico que compreenda a seqüência de nucleotídeo substancialmente como apresentado na SEQ ID NO:

6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10; (b) um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo substancialmente apresentado na * SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID 20 NO: 5; e (c) um ácido nucleico que hibridiza ao ácido nucleico de (a) ou (b) sob condições de severidade baixa, em que o polipeptídeo codificado pelo dito ácido nucleico é uma sesquiterpeno sintase. Em uma forma de realização, as condições definidas são condições de severidade moderada e em uma outra forma de realização condições de severidade alta. Outras formas de realização 25 incluem: um polipeptídeo codificado por um ácido nucleico da invenção; uma célula hospedeira que compreende um ácido nucleico da invenção; um organismo não humano modificado para abrigar um ácido nucleico da invenção; e métodos de produzir um polipeptídeo que compreende cultivar células hospedeiras da invenção.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece um polipeptídeo isolado que compreende uma seqüência de aminoácido substancialmente como apresentada na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5.

- 5 Em uma outra forma de realização, a invenção fornece um vetor que compreende pelo menos um ácido nucleico escolhido de (a) um ácido nucleico que compreenda a seqüência de nucleotídeo substancialmente como apresentada na SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10; (b) um ácido nucleico que codifique o polipeptídeo substancialmente apresentado na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5; e (c) um ácido nucleico que hibridiza ao ácido nucleico de (a) ou (b) sob condições de severidade baixa, em que o polipeptídeo codificado pelo dito ácido nucleico é uma sesquiterpeno sintase. Outras formas de realização incluem, métodos de fabricar uma célula hospedeira recombinante que compreendem introduzir um vetor da invenção em uma célula hospedeira.

Em uma forma de realização, a invenção fornece um método de fabricar pelo menos uma sesquiterpeno sintase que compreende cultivar > um hospedeiro modificado para conter pelo menos uma seqüência de ácido 20 nucleico sob condições condutivas à produção da dita pelo menos uma sesquiterpeno sintase. Em uma forma de realização, o pelo menos um ácido nucleico é escolhido de (a) um ácido nucleico que compreenda a seqüência de nucleotídeo substancialmente como apresentada na SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10; (b) um ácido 25 nucleico que codifique o polipeptídeo substancialmente apresentado na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5; e (c) um ácido nucleico que hibridiza ao ácido nucleico de (a) ou (b) sob condições de severidade baixa, em que o polipeptídeo codificado pelo dito ácido nucleico é uma sesquiterpeno sintase. O hospedeiro pode ser escolhido, por exemplo, de plantas, microorganismos, células bacterianas, células de levedura, células de vegetal e células de animal.

Em uma outra forma de realização a invenção fornece um método de fabricar pelo menos um terpenóide que compreende 1) contatar • 5 pelo menos um precursor de pirofosfato terpeno acíclico com pelo menos um polipeptídeo codificado por um ácido nucleico. Em uma forma de realização, o ácido nucleico é escolhido de (a) um ácido nucleico que compreenda a seqüência de nucleotídeo substancialmente como apresentada na SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10; (b) um 10 ácido nucleico que codifique o polipeptídeo substancialmente apresentado na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5; e (c) um ácido nucleico que hibridiza ao ácido nucleico de (a) ou (b) sob condições de severidade baixa, em que o polipeptídeo codificado pelo dito ácido nucleico é uma sesquiterpeno sintase, 2) isolar pelo menos um 15 terpenóide produzido em (1). Em uma forma de realização, o pelo menos um terpenóide é escolhido de sesquiterpenos. Em uma outra forma de realização, o pelo menos um precursor de pirofosfato terpeno acíclico é famesilpirofosfato. Os sesquiterpenos produzidos pelos métodos da invenção ’ incluem, mas não são limitados a, biciclogermacreno, cubebol, valenceno, oc20 cubebeno, germacreno D e δ-cadineno (Figura 3).

Deve ser entendido que tanto a descrição geral precedente quanto a seguinte descrição detalhada são apenas exemplares e explicativas e não são restritivas da invenção como reivindicada. Referência agora serão feitas em detalhes às formas de realização exemplares da presente invenção.

Breve Descrição das Figuras

Figura 1: Caminhos de exemplo para a biossíntese de isopentenil pirofosfato (caminho do Mevalonato (a) e caminho da desoxixilulose (13)).

Figura 2: Biossíntese de terpeno de exemplo partir de

isopentenil difosfonato.

Figura 3: Estrutura de compostos de exemplo de sesquiterpeno.

Figura 4: Parte central dos alinhamentos das seqüências de » 5 aminoácido de dois grupos de sesquitepeno sintase (Germacreno C L. esculentum δ-cadino sintase (SEQ ID NO: 11); (E)-beta-Fameseno M. piperita (SEQ ID NO: 12); delta-Selineno A. grandis (SEQ ID NO: 13); Sesquiterpeno sintase C. junos (SEQ ID NO: 14); 5-epi-Aristolocheno N. tabacum (SEQ ID NO: 15); 5-epi-Aristolocheno C. annuum (SEQ ID NO: 10 16); Vetispiradieno S. tuberosum (SEQ ID NO: 17); Vetispiradieno H.

muticus (SEQ ID NO: 18); delta-Cadineno G. arboreum (SEQ ID NO: 19); Amorfa-4,11-dieno A. annua (SEQ ID NO: 20); epi-Cedrol A. annua (SEQ ID NO: 21); delta-Humuleno A. grandis (SEQ ID NO: 22)) e a seqüência dos preparadores degenerados deduzidos (TpsVFl (SEQ ID NO: 23); TpsVF2 (SEQ ID NO: 24); TpsVR3 (SEQ ID NO: 25); TpsCFl (SEQ ID NO: 26); TpsCF2 (SEQ ID NO: ID NO: 27); TpsCR3 (SEQ ID NO: 28)). As setas abaixo de cada alinhamento mostram as regiões do alinhamento usadas para planejar os preparadores degenerados e a sua orientação.

I Figura 5: Alinhamento das seqüências de aminoácido deduzidas a partir dos produtos de amplificação obtidos pela RT-PCR em RNA total de toranja (GFTpsA (SEQ ID NO: 29); GFTpsB (SEQ ID NO: 30); e GFTpsC (SEQ ID NO: 31)).

Figura 6: Alinhamento de seqüência de aminoácido das sesquiterpeno sintases GFTpsA (clone parcial) (SEQ ID NO: 32), GFTpsB 25 (SEQ ID NO: 3), GFTbsC (SEQ ID NO: 1), GFTpsDl (SEQ ID NO: 4), GFTpsD2 (SEQ ID NO: 5) e GFTpsE (SEQ ID NO: 2) de C. paradisi.

Figura 7: Perfis GC de sesquiterpenos produzidos pelas sesquiterpeno sintases de toranja recombinantes.

Figura 8: As seqüências de aminoácido e nucleotídeo de (a)

GFTpsA (SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 33), (b) GFTpsB (SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 8), (c) GFTbsC (SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 6), (d) GFTpsDl (SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 9), (e) GFTpsD2 (SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 10) e (f) GFTpsE (SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 7).

• 5 Descrição da Invenção

Um terpeno é um hidrocarboneto insaturado com base em uma unidade de isopreno (C5H8) que pode ser acíclica ou cíclica. Os derivados de terpeno, incluem mas não são limitados a cânfora, mentol, terpineol e bomeol, geraniol. Terpenos ou Terpenóide, como aqui usados incluem terpenos e 10 derivados de terpeno, incluindo compostos que passaram por uma ou mais etapas de funcionalização tais como hidroxilações, isomerizações, óxidoreduções ou acilações. Como aqui usado, um sesquiterpeno é terpeno com base em uma estrutura C15 e inclui sesquiterpenos e derivados de sesquiterpenos, incluindo compostos que passaram por uma ou mais etapas de 15 funcionalização tais como hidroxilações, isomerizações, óxido-reduções ou acilações.

Como aqui usado, um derivado é qualquer composto obtido a partir de um composto conhecido ou hipotético e contendo elementos essenciais da substância precursora.

Como aqui usado, sesquiterpeno sintase é qualquer enzima que catalise a síntese de um sesquiterpeno.

A frase “idêntica,” “substancialmente idêntica,” ou “substancialmente como apresentado,” significa que uma sequência relevante é pelo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 25 ou 99 % idêntica a uma dada seqüência. Por via de exemplo, tais sequências podem ser variantes alélicas, seqüências derivadas de várias espécies ou elas podem ser derivadas da seqüência dada pela truncagem, supressão, substituição ou adição de aminoácido. Para os polipeptídeos, o comprimento de seqüências de comparação no geral será de pelo menos 20, 30, 50, 100 ou mais aminoácidos. Para ácidos nucleicos, o comprimento de seqüências de comparação no geral será de pelo menos 50, 100, 150, 300 ou mais nucleotídeos. A identidade percentual entre duas seqüências é determinada pelos algoritmos de alinhamento padrão tais como, por exemplo, Basic Local • 5 Alignment Tool (BLAST) descrito em Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol.,

215: 403 a 410, o algoritmo de Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol., 48: 444 a 453 ou o algoritmo de Meyers et al. (1988) Comput. Appl. Biosci., 4: 11 a 17.

A invenção assim fornece, em uma forma de realização, um ácido nucleico isolado selecionado de: (a) um ácido nucleico que compreendem a seqüência de nucleotídeo substancialmente como apresentado na SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10; (b) um ácido nucleico que codifique o polipeptídeo substancialmente apresentado na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5; e (c) um ácido nucleico que hibridiza ao ácido nucleico de (a) ou (b) sob condições de severidade baixa, em que o polipeptídeo codificado pelo dito ácido nucleico é uma sesquiterpeno sintase. Em uma forma de realização, as condições definidas são condições de severidade ¹ moderada e em uma outra forma de realização condições de severidade alta.

Como aqui usado, determina-se se um polipeptídeo codificado por um ácido nucleico da invenção é uma sesquiterpeno sintase pelo ensaio de caracterização de enzima descrito aqui nos exemplos.

Como aqui usado, os termos hibridização ou hibridiza sob certas condições são intencionados a descrever condições para a hibridização 25 e lavagens sob as quais as seqüências de nucleotídeo que são significantemente idênticas ou homólogas entre si permanecem ligadas entre si. As condições podem ser tais que as seqüências, que são pelo menos cerca de 70 %, tais como pelo menos cerca de 80 % e tais como pelo menos cerca de 85 a 90 % idênticas, permanecem ligadas entre si. As definições de baixa severidade, severidade moderada e alta são aqui fornecidas.

As condições de hibridização apropriadas podem ser selecionadas por aqueles habilitados na técnica com experimentação mínima como exemplificado em Ausubel et al. (1995), Current Protocols in Molecular - 5 Biology, John Wiley & Sons, seções 2, 4 e 6. Adicionalmente, as condições de severidade são descritas em Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^a ed., Cold Spring Harbor Press, capítulos 7, 9 e 11. Como aqui usado, as condições definidas de baixa severidade são como segue. Os filtros contendo DNA são pré tratados durante 6 horas a 40°C. Em 10 uma solução contendo 35 % de formamida, 5 x SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM de EDTA, 0,1 % de PVP, 0,1 % de Ficoll, 1 % de BSA e 500 pg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado. As hibridizações são realizadas na mesma solução com as seguintes modificações: 0,02 % de PVP, 0,02 % de Ficoll, 0,2 % de BSA, 100 pg/ml de DNA de esperma de salmão, 15 10 % (p/vol) de sulfato de dextrano e 5 a 20 x 10⁶ de sonda rotulada com ³²P é usada. Os filtros são incubados na mistura de hibridização durante 18 a 20 horas a 40°C e depois lavados durante 1,5 hora a 55°C. Em uma solução contendo 2x SSC, 25 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM de EDTA e 0,1 % de SDS. A solução de lavagem é substituída com solução fresca e incubada um 20 adicional de 1,5 hora a 60°C. Os filtros são manchados secos e expostos para auto-radiografia.

Como aqui usado, condições definidas de severidade moderada são como segue. Os filtros contendo DNA são pré tratados durante 7 horas a 50°C. Em uma solução contendo 35 % de formamida, 5x SSC, 50 25 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM de EDTA, 0,1 % de PVP, 0,1 % de Ficoll, 1 % de BSA e 500 pg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado. As hibridizações são realizadas na mesma solução com as seguintes modificações: 0,02 % de PVP, 0,02 % de Ficoll, 0,2 % de BSA, 100 pg/ml de DNA de esperma de salmão, 10 % (p/vol) de sulfato de dextrano e 5 a 20 x ¹¹ : : : : ·’·· *·· ^: • · · ···· ···· , ΙΟ⁶ de sonda rotulada com ³²P são usados. Os filtros são incubados em mistura de hibridização durante 30 horas a 50°C e depois lavados durante 1,5 hora a 55°C. Em uma solução contendo 2x SSC, 25 mM de Tris-EICl (pH 7,4), 5 mM de EDTA e 0,1 % de SDS. A solução de lavagem é substituída com solução fresca e incubada um adicional de 1,5 hora a 60°C. Os filtros são manchados seco e expostos para auto-radiografia.

Como aqui usado, as condições definidas de alta severidade são como segue. A pré hibridização de filtros contendo DNA é realizada durante 8 horas até durante a noite a 65°C em tampão composto de 6x SSC, 10 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM de EDTA, 0,02 % de PVP, 0,02 % de

Ficoll, 0,02 % de BS A e 500 pg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado. Os filtros são hibridizados durante 48 horas a 65°C na mistura de pré hibridização contendo 100 pg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado e 5 a 20 x 10 cpm de sonda rotulada com P. A lavagem dos 15 filtros é feita a 37°C durante 1 hora em uma solução contendo 2x SSC, 0,01 % de PVP, 0,01 % de Ficoll e 0,01 % de BS A. Isto é seguido por uma lavagem em 0,lx SSC a 50°C durante 45 minutos.

Outras condições de severidade baixa, moderada e alta bem conhecidas na técnica (por exemplo, como utilizadas para hibridizações de 20 espécies cruzadas) podem ser usadas se as condições acima forem inapropriadas (por exemplo, como utilizadas para hibridizações de espécies cruzadas).

Em uma forma de realização, um ácido nucleico e/ou polipeptídeo da invenção é isolado a partir de um cítrico, tal como, por 25 exemplo uma toranja ou uma laranja. Em um forma de realização particular, a invenção diz respeito a certas seqüências de nucleotídeo isoladas incluindo aquelas que são substancialmente livres de material endógeno contaminante. Os termos “ácido nucleico” ou “molécula de ácido nucleico” referem-se a um polímero de desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo na forma de filamento ¹² : ::: /: j ·’·: ^:·: /’ ^: único ou duplo e a menos que de outro modo limitado, pode abranger análogos conhecidos de nucleotídeos naturais que podem funcionar em uma maneira similar como nucleotídeos que ocorrem naturalmente. Uma “seqüência de nucleotídeo” também refere-se a uma molécula de 5 polinucleotídeo ou molécula de oligonucleotídeo na forma de um fragmento separado ou como um componente de um ácido nucleico grande. A seqüência ou molécula de nucleotídeo também podem ser aludidas como uma “sonda de nucleotídeo.” Algumas das moléculas de ácido nucleico da invenção são derivadas de DNA ou RNA isolados pelo menos uma vez na forma 10 substancialmente pura e em uma quantidade ou concentração que permitam a identificação, manipulação e recuperação de sua seqüência de nucleotídeo componente pelos métodos bioquímicos padrão. Os exemplos de tais métodos, incluindo os métodos para os protocolos de PCR que podem ser aqui usados, são divulgados em Sambrook et al., Molecular Cloning: A 15 Laboratory Manual, 2^a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring

Harbor, NY (1989), Current Protocols in Molecular Biology editado por F.A.

Ausubel et al., John Wiley and Sons, Inc. (1987) e Innis, M. et al., eds., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990).

Como aqui descrito, as moléculas de ácido nucleico da 20 invenção incluem DNA tanto na forma de filamento único quanto de filamento duplo, assim como o seu complemento de RNA. O DNA inclui, por exemplo, cDNA, DNA genômico, DNA quimicamente sintetizado, DNA amplificado pela PCR e combinações destes. O DNA genômico, incluindo as regiões traduzidas, não traduzidas e de controle, pode ser isolado pelas 25 técnicas convencionais, por exemplo, usando qualquer um dos cDNAs da invenção ou fragmentos adequados destes, como uma sonda, para identificar um pedaço de DNA genômico que pode ser depois clonado usando métodos habitualmente conhecidos na técnica. No geral, as moléculas de ácido nucleico dentro do escopo da invenção incluem seqüências que hibridizam com as seqüências da invenção sob condições de hibridização e lavagem descritas acima e de 5^o, 10°, 15°, 20°, 25° ou 30° abaixo da temperatura de fusão do duplex de DNA das seqüências da invenção, incluindo qualquer faixa de condições agrupadas dentro destas faixas.

• 5 Em uma outra forma de realização, os ácidos nucleicos da invenção compreendem uma sequência substancialmente como apresentadas na SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10. Em uma forma de realização, os ácidos nucleicos são pelo menos 85 %, pelo menos 90 % ou pelo menos 95 % idênticos aos nucleotídeos da SEQ 10 ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10.

Em uma forma de realização, o ácido nucleico compreende a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10. Em uma outra forma de realização, o ácido nucleico codifica uma proteína que é uma sesquiterpeno sintase, como demonstrado, 15 por exemplo, no ensaio de enzima descrito nos exemplos. Os ácidos nucleicos que compreendem regiões conservadas entre espécies diferentes, também são fornecidos.

Já em uma outra forma de realização, o ácido nucleico compreende um trecho contínuo de pelo menos 50, 100, 250, 500, 750 20 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10. Tais fragmentos contíguos destes nucleotídeos também podem conter pelo menos uma mutação contanto que a seqüência mutante retenha a funcionalidade da seqüência original e a capacidade para hibridizar a estes nucleotídeos sob condições de severidade 25 baixa ou alta, tal como por exemplo, condições de severidade moderada ou alta. Um tal fragmento pode ser derivado, por exemplo, do nucleotídeo (nt) 200 até o nt 1600, do nt 800 até o nt 1600, do nt 1000 até o nt 1600, do nt 200 até o nt 1000, do nt 200 até o nt 800, do nt 400 até o nt 1600 ou do nt 400 até o nt 1000 da SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10.

Como descrito acima, polipeptídeos codificados pelos ácidos nucleicos da invenção são abrangidos pela invenção. Os ácidos nucleicos isolados da invenção podem ser selecionados de um ácido nucleico que - 5 codifique o polipeptídeo substancialmente apresentado na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5. Em uma forma de realização, os polipeptídeos são pelo menos 85 %, pelo menos 90 % ou pelo menos 95 % idênticos à SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5.

Em uma forma de realização, um polipeptídeo da invenção compreende uma sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO:

1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5. Em uma outra forma de realização, o polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido substancialmente como apresentada na SEQ ID NO: 1, SEQ ID 15 NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5. Já em uma outra forma de realização, o polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 85 % idêntica, pelo menos 90 % ou pelo menos 95 % idêntica à SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:

ou SEQ ID NO: 5. Em uma forma de realização, o polipeptídeo é uma sesquiterpeno sintase, còmo demonstrado, por exemplo, no ensaio de enzima descrito abaixo.

Devido à degenerescência do código genético em que mais do que um códon pode codificar o mesmo aminoácido, seqüências de DNA múltiplos podem codificar o mesmo polipeptídeo. Tais seqüências de DNA 25 variantes podem resultar de desvio genético ou manipulação artificial (por exemplo, que ocorrem durante a amplificação pela PCR ou como o produto da mutagênese deliberada de uma seqüência nativa). A presente invenção assim abrange qualquer ácido nucleico capaz de codificar uma proteína derivada da SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ou

SEQ ID NO: 10 ou variantes destas.

A mutagênese deliberada de uma seqüência nativa pode ser realizada usando numerosas técnicas bem conhecidas no ramo. Por exemplo, procedimentos de mutagênese específicas de sítio direcionadas ao oligonucleotídeo podem ser utilizados, particularmente onde é desejado mutar um gene tal que nucleotídeos ou códons de restrição pré determinados sejam alterados pela substituição, supressão ou inserção. Os métodos exemplares de fabricar tais alterações são divulgados por Walder et al. (Gene 42: 133, 1986); Bauer et al. (Gene 37: 73, 1985); Craik (BioTechniques, 12-19 de janeiro, 1985); Smith et al. (Genetic Engineering: Principies and Methods, Plenum Press, 1981); Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488, 1985); Kunkel et al. (Methods in Enzymol. 154: 367, 1987); e Patente U.S. N° 4.518.584 e 4.737.462.

Em uma forma de realização, a invenção fornece polipeptídeos isolados. Como aqui usado, o termo “polipeptídeos” refere-se a um gênero de polipeptídeo ou fragmentos de peptídeo que abrangem as seqüências de aminoácido aqui identificados, assim como fragmentos menores. Altemativamente, um polipeptídeo pode ser definido em termos de seu relacionamento antigênico a qualquer peptídeo codificado pelas seqüências de ácido nucleico da invenção. Assim, em uma forma de realização, um polipeptídeo dentro do escopo da invenção é definido como uma seqüência de aminoácido que compreende um epítopo linear ou 3-dimensional compartilhado com qualquer peptídeo codificado pelas seqüências de ácido nucleico da invenção. Altemativamente, um polipeptídeo dentro do escopo da invenção é reconhecido por um anticorpo que especificamente reconhece qualquer peptídeo codificado pelas seqüências de ácido nucleico da invenção. Os anticorpos são definidos ser de ligação específica se eles se ligam aos polipeptídeos da invenção com um K. maior ou igual a cerca de 10 M’ , tal

1 como maior ou igual a 10 M' .

Uma “variante” de polipeptídeo como aqui aludido significa um polipeptídeo substancialmente homólogo a um polipeptídeo nativo, mas que tem uma seqüência de aminoácido diferente daquela codificada por qualquer uma das seqüências de ácido nucleico da invenção por causa de uma - 5 ou mais supressões, inserções ou substituições.

Variantes podem compreender seqüências conservativamente substituídas, significando que um dado resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo tendo características físico-químicas similares. Os exemplos de substituições conservativas incluem a substituição de um resíduo alifático 10 por um outro, tal como Ile, Vai, Leu ou Ala por um outro ou substituições de um resíduo polar por um outro, tal como entre Lys e Arg; Glu e Asp; ou Gin e Asn. Ver Zubay, Biochemistry, Addison-Wesley Pub. Co., (1983). Os efeitos de tais substituições podem ser calculados usando matrizes de pontuação de substituição tais como uma PAM-120, PAM-200 e PAM-250 como debatido 15 em Altschul, (J. Mol. Biol. 219: 555 a 565, 1991). Outras de tais substituições conservativas, por exemplo, substituições de regiões inteiras tendo características de hidrofobicidade similares, são bem conhecidas.

As variantes de peptídeo que ocorrem naturalmente também são abrangidas pela invenção. Os exemplos de tais variantes são proteínas que 20 resultam de eventos de divisão de mRNA alternados ou da divagem proteolítica dos polipeptídeos aqui descritos. As variações atribuíveis à proteólise incluem, por exemplo, diferenças nos términos N ou C na expressão em tipos diferentes de células hospedeiras, devido à remoção proteolítica de um ou mais aminoácidos terminais dos polipeptídeos 25 codificados pelas seqüências da invenção.

As variantes da sesquiterpenos sintases da invenção podem ser usadas obter a atividade enzimática realçada ou reduzida desejada, regioquímica ou estereoquímica modificadas ou utilização de substrato ou distribuição de produto alteradas. Uma variante ou mutante direcionados a sítio podem ser fabricados por qualquer um dos métodos conhecidos na técnica.

Como estabelecido acima, a invenção fornece polipeptídeos recombinantes e não recombinantes, isolados e purificados, tais como a partir - 5 de plantas cítricas. As variantes e derivados de polipeptídeos nativos podem ser obtidos isolando-se variantes que ocorrem naturalmente ou a seqüência de nucleotídeo de variantes, de outras ou da mesma linhagem ou espécies de planta ou pelas mutações artificialmente programadas de seqüências de nucleotídeo que codifica os polipeptídeos de cítricos nativos. As alterações da 10 seqüência de aminoácido nativa podem ser realizadas por qualquer um de vários métodos convencionais. As mutações podem ser introduzidas em locais particulares sintetizando-se oligonucleotídeos contendo uma seqüência mutante, flanqueada pelos sítios de restrição que permitem a ligação aos fragmentos da seqüência nativa. A seguir da ligação, a seqüência reconstruída 15 resultante codifica um análogo tendo a inserção, substituição ou supressão de aminoácido desejadas. Altemativamente, os procedimentos de mutagênese específica de sítio direcionada a oligonucleotídeo podem ser utilizados para fornecer um gene alterado em que códons pré determinados podem ser ¹ alterados pela substituição, supressão ou inserção.

Em uma forma de realização, a invenção considera: vetores que compreendem os ácidos nucleicos da invenção. Por exemplo, um vetor que compreende pelo menos um ácido nucleico escolhido de (a) um ácido nucleico que compreenda a seqüência de nucleotídeo substancialmente como apresentada na SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 25 ou SEQ ID NO: 10; (b) um ácido nucleico que codifique o polipeptídeo substancialmente apresentado na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5; e (c) um ácido nucleico que hibridiza ao ácido nucleico de (a) ou (b) sob condições de severidade baixa, em que o polipeptídeo codificado pelo dito ácido nucleico é uma sesquiterpeno sintase.

Um vetor como aqui usado inclui qualquer vetor recombinante incluindo mas não limitado aos vetores virais, bacteriofagos e plasmídeos.

Os vetores de expressão recombinantes contendo uma seqüência de ácido nucleico da invenção podem ser preparados usando • 5 métodos bem conhecidos. Em uma forma de realização, os vetores de expressão incluem uma seqüência de cDNA que codifica o polipeptídeo operavelmente ligado às seqüências de nucleotídeo reguladoras transcricionais ou translacionais adequadas, tais como aquelas derivadas de um gene de mamífero, de micróbio, viral ou de inseto. Os exemplos de 10 seqüências reguladoras incluem promotores, operadores ou realçadores transcricionais, sítios de ligação ribossômica de mRNA e seqüências apropriadas que controlam o início e término de transcrição e tradução. As seqüências de nucleotídeo são “operavelmente ligadas” quando a seqüência reguladora funcionalmente diz respeito à seqüência de cDNA da invenção.

Assim, uma seqüência de nucleotídeo promotora é operavelmente ligada a uma seqüência de cDNA se a seqüência de nucleotídeo promotora controla a transcrição da seqüência de cDNA. A capacidade para replicar nas células hospedeiras desejadas, usualmente conferida por uma origem de replicação e ¹ um gene de seleção pelo qual os transformantes são identificados podem ser 20 adicionalmente incorporados no vetor de expressão.

Além disso, as seqüências que codificam peptídeos de sinal apropriados que não estão naturalmente associados com os polipeptídeos da invenção podem ser incorporados nos vetores de expressão. Por exemplo, uma seqüência de DNA para um peptídeo de sinal (líder secretor) podem ser 25 fundidos na matriz a uma seqüência de nucleotídeo da invenção de modo que os polipeptídeos da invenção sejam inicialmente traduzidos como uma proteína de fusão que compreendem o peptídeo sinal. Um peptídeo de sinal que é funcional nas células hospedeiras pretendidas realça a secreção extracelular do polipeptídeo expressado. O peptídeo de sinal pode ser clivado do polipeptídeo na secreção a partir da célula.

As fusões de seqüências de peptídeo adicionais nas extremidades de terminal amino e carboxila dos polipeptídeos da invenção podem ser usadas para realçar a expressão dos polipeptídeos ou ajudam na • 5 purificação da proteína.

Em uma forma de realização, a invenção inclui uma célula hospedeira que compreende um ácido nucleico da invenção. Uma outra forma de realização da invenção é um método de fabricar uma célula hospedeira recombinante que compreende introduzir os vetores da invenção, em uma 10 célula hospedeira. Em uma outra forma de realização, um método de produzir um polipeptídeo que compreende cultivar as células hospedeiras da invenção sob condições para produzir o polipeptídeo é considerado. Em uma forma de realização o polipeptídeo é recuperado. Os métodos da invenção incluem métodos de fabricar pelo menos uma sesquiterpeno sintase da invenção que 15 compreende cultivar uma célula hospedeira que compreende um ácido nucleico da invenção e recuperar a sesquiterpeno sintase acumulada.

As células hospedeiras adequadas para a expressão de polipeptídeos da invenção incluem células procariotas, de levedura ou ¹ eucarióticas superiores. Os vetores de clonagem e expressão apropriados para 20 o uso com hospedeiros celulares bacterianos, fungicos, de levedura e de mamífero são descritos, por exemplo, em Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nova Iorque, (1985). Sistemas de tradução isentas de célula também podem ser utilizados para produzir os polipeptídeos divulgados usando RNAs derivados de construções de DNA aqui divulgadas.

Os procariotas incluem organismos gram negativos ou gram positivos, por exemplo, E. coli ou Bacilli. As células hospedeiras procarióticas adequadas para a transformação incluem, por exemplo, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium e várias outras espécies dentro do gênero Pseudomonas, Streptomyces e Staphylococcus. Em uma célula hospedeira procariótica, tal como E. coli, os polipeptídeos podem incluir um Resíduo de metionina de terminal N para facilitar a expressão do polipeptídeo recombinante na célula hospedeira procariótica. A metionina de terminal N pode ser clivada a partir do polipeptídeo recombinante expressado.

- 5 Os exemplos de vetores de expressão úteis para as células hospedeiras procarióticas incluem aquelas derivadas de plasmídeos comercialmente disponíveis tais como os plasmídeos do vetor de clonagem pET (Novagen, Madison, WI, USA) ou ainda pBR322 (ATCC 37017). O pBR322 contém genes para a resistência à ampicilina e tetraciclina e assim 10 fornece meios simples para identificar células transformadas. Para construir um vetor de expressão usando pBR322, um promotor apropriado e uma seqüência de DNA que codifique um ou mais dos polipeptídeos da invenção são inseridos no vetor pBR322. Outros vetores comercialmente disponíveis incluem, por exemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, 15 Suécia) e pGEM-1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA). Outros vetores comercialmente disponíveis incluem aqueles que são especificamente planejados para a expressão de proteínas; estes podem incluir vetores pMALp2 e pMAL-c2 que são usados para a expressão de proteínas fundidas à proteína de ligação de maltose (New England Biolabs, Beverly, MA, USA).

As seqüências promotoras habitualmente usadas para vetores de expressão de célula hospedeira procariótica recombinante incluem promotor de bacteriofago T7 (Studier F. W. e Moffatt B. A., J. Mol. Biol. 189: 113, 1986), β-lactamase (penicilinase), sistema promotor de lactose (Chang et al., Nature 275: 615, 1978; e Goeddel et al., Nature 281: 544, 25 1979), sistema promotor de triptofano (trp) (Goeddel et al., Nucl. Acids Res.

8: 4057, 19, 80; e EP-A-36776) e promotor tac (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 412, 1982). Um sistema de expressão de célula hospedeira procariótica particularmente útil utiliza um promotor de fago λ PL e uma seqüência repressora termo-instável

- Μ cl857ts. Os vetores plasmídicos disponíveis da American Type Culture Collection (“ATCC”), que incorporam derivados do promotor PL, incluem o plasmídeo pHUB2 (residente na cepa JMB9 da E. coli (ATCC 37092)) e pPLc28 (residente na E. coli RR1 (ATCC 53082)).

Os polipeptídeos da invenção também podem ser expressados em células hospedeiras de levedura, preferivelmente do gênero Saccharomyces (por exemplo., S. cerevisiae). Outros gêneros de levedura, tais como Pichia ou Kluyveromyces (por exemplo. K. lactis), também podem ser utilizados. Os vetores de levedura frequentemente conterão uma origem de seqüência de replicação a partir de um plasmídeo de levedura 2p, uma seqüência que se replica autonomamente (ARS), uma região promotora, seqüências para a poliadenilação, seqüências para o término de transcrição e um gene marcador selecionável. As seqüências promotoras adequadas para os vetores de levedura incluem, entre outras, promotores para a metalotionina, 3fosfoglicerato cinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 2073, 1980) ou outras enzimas glicolíticas (Hess et al., J. Adv. Enzima Reg. 7: 149, 1968; e Holland et al., Biochem. 17: 4900, 1978), tais como enolase, gliceraldeído-3fosfato desidrogenase, hexocinase, piruvato descarboxilase, fosfofrutocinase, glicose-6-fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato mutase, piruvato cinase, triosefosfato isomerase, fosfoglicose isomerase e glicocinase. Outros vetores e promotores adequados para o uso na expressão de levedura são ainda descritos em Hitzeman, EPA-73.657 ou em Fleer et aZ., Gene, 107: 285-195 (1991); e van den Berg et al., Bio/Technology, 8: 135 a 139 (1990). Uma outra alternativa é o promotor ADH2 repressível por glicose descrito por Russell et al. (J. Biol. Chem. 258: 2674, 1982) e Beier et al. (Nature 300: 724, 1982). Os vetores transportadores replicáveis tanto em levedura quanto na E. coli podem ser construídos pela inserção de seqüências de DNA a partir de pBR322 para a seleção e replicação na E. coli (gene e origem de replicação Ampr) nos vetores de levedura descrito acima.

Uma forma de realização da invenção é um organismo não humano modificado para abrigar um ácido nucleico da invenção. O organismo não humano e/ou célula hospedeira podem ser modificados por quaisquer métodos conhecidos na técnica para a transferência de gene - 5 incluindo, por exemplo, o uso de dispositivo de liberação tal como lipídeos e vetores virais, DNA nu, eletroporação e transferência de gene mediada por partícula. Em uma forma de realização, o organismo não humano é uma planta, inseto ou microorganismo.

Por exemplo, em uma forma de realização a invenção fornece um método de fabricar pelo menos uma sesquiterpeno sintase que compreende cultivar um hospedeiro modificado para conter pelo menos um ácido nucleico sob condições condutivas à produção da dita pelo menos uma sesquiterpeno sintase em que o dito pelo menos um ácido nucleico é escolhido de (a) um ácido nucleico que compreenda a seqüência de nucleotídeo substancialmente como apresentada na SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10; (b) um ácido nucleico que codifique o polipeptídeo substancialmente apresentado na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5; e (c) um ¹ ácido nucleico que hibridiza ao ácido nucleico de (a) ou (b) sob condições de severidade baixa, em que o polipeptídeo codificado pelo dito ácido nucleico é uma sesquiterpeno sintase.

Em uma outra forma de realização, o hospedeiro é uma planta tal como tabaco, animal ou microorganismo também incluindo mas não limitado às células bacterianas, células de levedura, células de vegetal e 25 células de animal. Como aqui usado, células de planta e células de animal incluem o uso de plantas e animais como um hospedeiro. Por exemplo, em algumas formas de realização da invenção, a expressão é em um organismo não humano geneticamente modificado.

Em uma forma de realização, sistemas de cultura de célula hospedeira de mamífero ou inseto são utilizados para expressar polipeptídeos recombinantes da invenção. Os sistemas de Baculovirus para a produção de proteínas heterólogas em células de inseto são revisadas por Luckow e Summers, Bio/Technology 6: 47 (1988). As linhas de célula estabelecidas de • 5 origem de mamífero também podem ser utilizadas. Os exemplos de linhas de célula hospedeira de mamífero adequadas incluem a linhagem COS-7 de células renais de macaco (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., Cell 23: 175, 1981), células L, células Cl27, células 3T3 (ATCC CCL 163), células do ovário do hamster chinês (CHO), células HeLa e linhagens de célula BHK 10 (ATCC CRL 10) e a linhagem de célula CV-l/EBNA-1 (ATCC CRL 10478) derivadas da linhagem de célula renal de macaco verde africano CVI (ATCC CCL 70) como descrito por McMahan et al. (EMBO J. 10: 2821, 1991).

Métodos estabelecidos para introduzir DNA em células de mamífero foram descritas (Kaufman, R. J., Large Scale Mammalian Cell 15 Culture, 1990, pp. 15 a 69). Os protocolos adicionais usando reagentes comercialmente disponíveis, tais como Lipofectamina (Gibco/BRL) ou Lipofectamina-Plus, podem ser usados para transfectar células (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413 a 7417, 1987). Além disso, a ' eletroporação podem ser usadas para transfectar células de mamífero usando 20 procedimentos convencionais, tais como aqueles em Sambrook et al.

Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^a ed. Vol. 1 a 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). A seleção de transformantes estáveis pode ser realizada usando a resistência a medicamentos citotóxicos como um método de seleção. Kaufman et al., Meth. in Enzymology 185: 487 a 511, 25 1990, descreve diversos esquemas de seleção, tais como a resistência à diidrofoliato reductase (DHFR). Uma cepa hospedeira adequada para a seleção de DHFR pode ser a cepa DX-1311 de CHO, que é deficiente em DHFR (Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 a 4220, 1980). Um plasmídeo que expressa o cDNA de DHFR pode ser introduzido na cepa

DX-1311 e apenas células que contém o plasmídeo podem se desenvolver nos meios seletivos apropriados.

As seqüências de controle transcricional e translacional para vetores de expressão de célula hospedeira de mamífero podem ser excisadas a partir de genomas virais. As seqüências promotoras habitualmente usadas e as seqüências realçadoras são derivadas de vírus de polioma, adenovírus 2, vírus símio 40 (SV40) e citomegalovírus humano. As seqüências de DNA derivadas do genoma viral de SV40, por exemplo, origem, promotor precoce e tardio, realçador, sítios de união e poliadenilação de SV40 podem ser usadas para fornecer outros elementos genéticos para a expressão de uma seqüência de gene estrutural em uma célula hospedeira de mamífero. Os promotores virais precoce e tardio são particularmente úteis porque ambos são facilmente obtidos a partir de um genoma viral como um fragmento, que também pode conter uma origem viral de replicação (Fiers et al., Nature 273: 113, 1978; Kaufman, Meth. in Enzymology, 1990).

Existem diversos métodos conhecidos na técnica para a criação de plantas transgênicas. Estes incluem, mas não são limitados à: eletroporação de protoplastos vegetais, transformação mediada por lipossoma, transformação mediada por polietileno glicol, microinjeção de células vegetais e transformação usando vírus. Em uma forma de realização, a transferência de gene direta pelo bombardeamento de partícula é utilizada.

A transferência de gene direta pelo bombardeamento de partícula fornece um exemplo para transformar tecido vegetal. Nesta técnica uma partícula ou microprojétil revestidos com DNA são lançados através das barreiras físicas da célula. O bombardeamento de partícula pode ser usado para introduzir DNA em qualquer tecido alvo que seja penetrável pelas partículas revestidas com DNA, mas para a transformação estável, é imperativo que células regeneráveis sejam usadas, tipicamente, as partículas são fabricadas de ouro ou tungstênio. As partículas são revestidas com DNA usando os métodos de precipitação com CaCh ou etanol que são habitualmente conhecidos na técnica.

As partículas revestidas com DNA são lançadas de uma pistola de partícula. Uma pistola de partícula adequada pode ser adquirida de Bio- 5 Rad Laboratories (Hercules, CA). A penetração da partícula é controlada variando-se os parâmetros tais como a intensidade do estouro explosivo, o tamanho das partículas ou a distância que as partículas devem viajar para atingir o tecido alvo.

O DNA usado para revestir as partículas pode compreender 10 um cassete de expressão adequado para direcionar a expressão do gene de interesse que compreenderá um promotor operavelmente ligado ao gene de interesse.

Os métodos para realizar a transferência de gene direta pelo bombardeamento de partícula são divulgados na Patente U.S. 5.990.387 15 concedida a Tomes et al.

Em uma forma de realização, os cDNAs da invenção podem ser expressados em tal modo como para produzir RNA de sentido ou antisentido. RNA anti-sentido é o RNA que tem uma seqüência que é o complemento reverso do mRNA (RNA de sentido) codificado por um gene. 20 Um vetor que direcionará a expressão de RNA de anti-sentido é um em que o cDNA é colocado na “orientação reversa” com respeito ao promotor tal que o filamento não codificador (ao invés do filamento codificador) seja transcrito. A expressão de RNA de anti-sentido pode ser usada para infra-modular a expressão da proteína codificada pelo mRNA para o qual o RNA de anti25 sentido é complementar. Os vetores que produzem RNA’s de anti-sentido podem ser usados para fabricar plantas transgênicas, como descrito acima.

Em uma forma de realização, o DNA transfectado é integrado em um cromossoma de um organismo não humano tal que um sistema recombinante estável resulte. Qualquer método de integração cromossômica conhecido na técnica pode ser usado na prática da invenção, incluindo mas não limitado à troca de cassete mediada pela recombinase (RMCE), inserção cromossômica específica de sítio viral, injeção de adenovírus e pronuclear.

Uma outra forma de realização da invenção é métodos de fabricar terpenóides e compostos de sesquiterpeno, por exemplo, usando os nucleotídeos e polipeptídeos da invenção. Os exemplos incluem métodos de fabricar pelo menos um terpenóide que compreendem contatar pelo menos um precursor de pirofosfato terpeno acíclico com pelo menos um polipeptídeo codificado por um ácido nucleico escolhido de (a) um ácido nucleico que compreenda a seqüência de nucleotídeo substancialmente como apresentada na SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10; (b) um ácido nucleico que codifique o polipeptídeo substancialmente apresentado na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5; e (c) um ácido nucleico que hibridiza ao ácido nucleico de (a) ou (b) sob condições de severidade baixa, em que o polipeptídeo codificado pelo dito ácido nucleico é uma sesquiterpeno sintase e isolando pelo menos um terpenóide produzido. Um outra exemplo é um método de fabricar pelo menos um terpenóide que compreende contatar pelo menos um precursor de pirofosfato terpeno acíclico com pelo menos um polipeptídeo substançialmente apresentado na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5 e isolando pelo menos um terpenóide produzido.

Como aqui usado um precursor de pirofosfato terpeno acíclico é qualquer composto de pirofosfato acíclico que seja um precursor para a produção de pelo menos um terpeno incluindo mas não limitado a geranilpirofosfato (GPP), famesil-pirofosfato (FPP) e geranilgeranil-pirofosfato (GGPP).

Em uma forma de realização, o pelo menos um terpenóide é escolhido de sesquiterpenos. Em uma forma de realização, o pelo menos um • · ··♦ ··· · 5S precursor de pirofosfato terpeno acíclico é famesil-pirofosfato. Em uma outra forma de realização, o pelo menos um sesquiterpeno é escolhido de biciclogermacreno ((E,E)-3,7,11,1 ltetrametil-biciclo[8,1,0]undeca-2,6-dieno), cubebol ((1 R,4S,5R,6R,7S, 10R)7-isopropil-4,1O-dimetil-triciclo. 5 [4,4,0,0(l,5)]decan-4-ol, valenceno (lR)-l,2,3,5,6,7,8,8A-octaidro-7isopropenil-l@,8A@dimetilnaftaleno), ot-cubebeno, germacreno D e δcadineno(rel-(lR, 8AS)-1,2,3,5,6,8A-hexaidro-l -isopropil-4,7dimetilnaftaleno) (Figura 2). Os terpenóides da invenção podem ser isolados por qualquer método usado na técnica incluindo mas não limitado à 10 cromatografia, extração e destilação.

Em uma forma de realização, a distribuição de produtos ou os produtos reais formados podem ser alterados variando-se o pH no qual a sintase contata o precursor de pirofosfato terpeno acíclico, tal como, por exemplo, famesil-pirofosfato. Em uma forma de realização, o pH é 7. Em 15 uma outra forma de realização o pH é menor do que 7, tal como, por exemplo, 6, 5,4 e 3.

Também dentro da prática da invenção está um organismo (por exemplo, microorganismo ou planta) que é usado para construir uma plataforma para a produção de alto nível de um substrato de sesquiterpeno 20 sintases (por exemplo, FPP) e a introdução de um ácido nucleico da invenção no organismo. Por exemplo, pelo menos um ácido nucleico da invenção que codifica uma sesquiterpeno sintase é incorporado em um organismo não humano que produz FPP efetuando deste modo a conversão de FPP a um sesquiterpeno e a produção metabólica subseqüente do sesquiterpeno. Em 25 uma forma de realização, isto resulta em uma plataforma para a produção de alto nível de sesquiterpenos.

Em uma forma de realização, os ácidos nucleicos da invenção são usados para criar outros ácidos nucleicos que codificam as sesquiterpeno sintases. Por exemplo, a invenção fornece um método de identificar uma sesquiterpeno sintases que compreende construir uma coleção de DNA usando os ácidos nucleicos da invenção, triando a coleção quanto aos ácidos nucleicos que codificam pelo menos uma sesquiterpeno sintase. A coleção de DNA usando os ácidos nucleicos da invenção podem ser construídos por qualquer processo conhecido na técnica onde as seqüências de DNA são criadas usando os ácidos nucleicos da invenção como um ponto de partida, incluindo mas não limitado ao embaralhamento de DNA. Em um tal método, a coleção pode ser tríada quanto as sesquiterpeno sintases usando um ensaio funcional para encontrar um ácido nucleico alvo que codifique uma sesquiterpeno sintase. A atividade de uma sesquiterpeno sintase pode ser analisada usando, por exemplo, os métodos aqui descritos. Em uma forma de realização, a triagem de alta produção é utilizada para analisar a atividade dos polipeptídeos codificados.

Como aqui usado uma “sonda de nucleotídeo” é definida como um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo capaz de ligar-se a um ácido nucleico alvo de seqüência complementar através de um ou mais tipos de ligações químicas, através da base complementar ou através da formação de ligação de hidrogênio. Como descrito acima, a sonda de oligonucleotídeo pode incluir bases naturais (isto é, A, G, C ou T) ou bases modificadas (7desazaguanosina, inosina, etc). Além disso, as bases em uma sonda de nucleotídeo podem ser unidas por uma ligação outra que não uma ligação de fosfodiéster, contanto que isto não impeça a hibridização. Assim, as sondas de oligonucleotídeo podem ter bases constituintes unidas pelas ligações peptídicas ao invés de ligações de fosfodiéster.

Um “ácido nucleico alvo” aqui refere-se a um ácido nucleico ao qual a sonda ou molécula de nucleotídeo podem especificamente hibridizar. A sonda é planejada para determinar a presença ou ausência do ácido nucleico alvo e a quantidade de ácido nucleico alvo. O ácido nucleico alvo tem uma seqüência que é complementar à seqüência de ácido nucleico da sonda correspondente direcionada ao alvo. Como reconhecido por uma pessoa de habilidade na técnica, a sonda também pode conter ácidos nucleicos adicionais ou outras porções, tais como rótulos, que podem não hibridizar especificamente ao alvo. O termo ácido nucleico alvo pode se referir à - 5 seqüência de nucleotídeo específica de um ácido nucleico maior ao qual a sonda é direcionada ou à seqüência global (por exemplo, gene ou mRNA). Uma pessoa habilitada na técnica reconhecerá que a utilidade completa sob várias condições.

Exceto no exemplo de operação ou onde de outro modo indicado, todos os números que expressam quantidades de ingredientes, condições de reação e assim por diante usados no relatório descritivo e reivindicações devem ser entendidos como sendo modificados em todos os casos pelo termo “cerca de.” Conseqüentemente, a menos que indicado ao contrário, os parâmetros numéricos apresentados no relatório descritivo e reivindicações são aproximações que podem variar dependendo das propriedades desejadas procuradas ser obtidas pela presente invenção. No mínimo e não como uma tentativa para limitar a aplicação da doutrina de equivalentes para o escopo das reivindicações, cada parâmetro numérico deve ser interpretado considerando-se o número de dígitos significantes e 20 aproximações de arredondamento comuns.

Não obstante que as faixas numéricas e parâmetros que apresentam o amplo escopo da invenção sejam aproximações, os valores numéricos apresentados nos exemplos específicos são relatados tão precisamente quanto possível. Qualquer valor numérico, entretanto, 25 inerentemente contém certos erros que necessariamente resultam do desvio padrão encontrado em suas respectivas medições de teste. Os seguintes exemplos são intencionados a ilustrar a invenção sem limitar o escopo como um resultado. As porcentagens são dadas em uma base em peso.

Os seguintes exemplos são intencionados a ilustrar a invenção sem limitar o escopo como um resultado.

Exemplos

Material

Um flavedo da toranja (Citrus paradisí) foi usado como material de partida para os experimentos aqui descritos. O flavedo (porção externa, colorida da casca da fruta) contém as glândulas oleosas que são o sítio da biossíntese de terpeno. O flavedo da toranja foi preparado na Simone Gatto (Sicília) a partir de frutas maturativas recém picadas. O flavedo (3 a 4 mm de espessura) foi cortado, imediatamente congelado e mantido congelado 10 durante o transporte e todas as etapas subseqüentes de modo a prevenir da degradação.

Exemplo 1: Isolar o cDNA da Sesquiterpeno Sintase usando RT-PCR

As seqüências de aminoácido deduzidas de sesquiterpeno sintases vegetais foram alinhadas para identificar regiões conservadas e 15 planejar oligonucleotídeos específicos das sesquiterpeno sintases vegetais. De modo a obter melhor homologia de seqüência, as seqüências foram separadas em dois grupos (Figura 4). O primeiro grupo conteve as seqüências da Germacreno C sintase de Lycopersicon esculentum cv. VFNT cereja (Colby et al, 1998), a (E)-P-fameseno sintase de Menta x piperita (Crock et al, 1997), a 20 δ-selineno sintase de Abies grandis (Steele et al, 1998), uma sesquiterpeno sintase de Citrus junos (Acesso do GenBank n° AF288465) as 5-epi aristolocheno sintases de Nicotiana tabacum (Facchini e Chappell, 1992) e de Capsicum annuurn (Back et al, 1998), as vetispiradieno sintases de Solanum tuberosum e de Hyoscyamus muticus (Back e Chappel, 1995). O segundo 25 grupo conteve seqüências das (+)-ó-cadineno sintases de Gossypium arboreum (Chen et al. 1995), a amorfa-4,11-dieno sintase (Mercke et al, 2000) e a epi-cedrol sintase (Merck et al, 1999) de Artemisia annua e a γhumuleno sintase de Abies grandis (Steele et al, 1998). A homologia de seqüência mais alta foi encontrada na parte central das seqüências. Três regiões contendo aminoácidos suficientemente conservados foram selecionados e oligonucleotídeos degenerados específicos para estas regiões foram planejadas (isto é dois preparadores avançados e um reverso foram deduzidos de cada alinhamento) (Figura 4).

- 5 A RT-PCR foi realizada usando RNA total de flavedo de toranja preparado pela técnica Borato Quente e a combinação diferente dos preparadores degenerados avançado e reverso. O método de Borato Quente para a extração de RNA total foi adaptada de Wan e Wilkins (Wan et al. (1994) Anal. Biochem. 223, 7 a 12). Os tecidos foram triturados até um pó 10 fino em nitrogênio líquido usando um almofariz e pistilo. O pó foi adicionado a 5 ml de tampão de extração (200 mM de borato, 30 mM de EGTA, 10 mM de DTT, 1 % de SIDS, 1 % de desoxicolato de Na, 2 % de PVP, 0,5 % de nonidet NP-40) pré aquecidos a 80°C. A mistura foi homogeneizada usando um homogeneizador Ultraturax® e filtrada através de duas camadas de filtro 15 Miracloth® (Calbiochem). A mistura foi incubada 90 minutos a 42°C na presença de 0,5 mg/ml de proteinase K (para a digestão de proteína/ribonuclease). KC1 foi depois adicionado na concentração final de 1 M e, depois de 1 hora de incubação em gelo, a mistura foi colocada em um centrífuga durante 10 min a lOOOOg e 4°C. O sobrenadante foi recuperado e 20 1/3 do volume de LiCl 8 M foi adicionado. A mistura foi incubada durante a noite a 4°C e colocada em uma centrífuga durante 20 minutos a lOOOOg e 4°C. O sobrenadante foi descartado e, a pelota lavada com LiCl 2 M e centrifugada mais uma vez como antes. A pelota foi depois recolocada em suspensão em água destilada isenta de RNase e 0,15 vol de solução 2 M de 25 acetato de potássio e 2,5 volumes de etanol absoluto foram adicionados. O RNA foi precipitado incubando-se 2 horas a -20°C e pelotizado pela centrifugação como antes. A pelota de RNA foi lavada com 80 % de etanol e recolocada em suspensão em água destilada isenta de RNase.

A concentração de RNA foi estimada a partir da OD a 260 nm.

A integridade do RNA foi avaliada em um gel de agarose verificando-se a integridade das faixas de RNA ribossômico.

A RT-PCR foi realizada usando o Kit de RT-PCR OneStep da Qiagen e um ciclador térmico de gradiente Eppendorf Mastercycler. As . 5 misturas de reação típicas contiveram 10 μΐ de tampão de RT-PCR 5X OneStep da Qiagen, 400 μΜ de cada dNTP, 400 nM de cada preparador, 2 μΐ de Mistura de Enzima de RT-PCR OneStep da Qiagen, 1 μΐ de Inibidor de Ribonuclease RNasin® (Promega Co) e 1 μg de RNA total em um volume final de 50 μΐ. As condições do ciclador térmico foram: 30 min a 50°C 10 (transcrição reversa); 15 min a 95°C (ativação da DNA polimerase); 40 ciclos de 45 s a 94°C, 10 s de 42°C a 45°C (dependendo do preparador usado), 45 s a 90 s (dependendo do tamanho do fragmento de DNA a ser amplificado) a 72°C; e 10mina72°C.

O tamanho dos produtos de PCR foi avaliado em um gel de 15 agarose a 1 %. As faixas que correspondem ao tamanho esperado foram excisado a partir do gel, purificados usando o Kit de Extração de Gel QIAquick® (Qiagen) e clonado no vetor pCR®2.1-TOPO usando o Kit de clonagem TOPO TA (Invitrogen). Os cDNAs inseridos foram depois submetido ao seqüenciamento de DNA e a seqüência comparada contra a base 20 de dados de proteína não redundante do GenBank (NCBI) usando o algoritmo BLASTX (Altschul et al 1990).

A análise pelo seqüenciamento de DNA e a procura Blast dos produtos de PCR com comprimento esperado (80 a 240 pares de base no tamanho) revelou fragmentos de três sesquiterpeno sintases diferentes, que 25 foram denominados GFTpsA, GFtpsB e GFTpsC. O fragmento de GFTpsA de 180 pares de base foi amplificado com os preparadores TpsVFl e TpsVR3, o fragmento GFtpsB de 115 pares de base foi amplificado com os preparadores TpsVF2 e TpsVR3 e o fragmento de GFTpsA de 115 pares de base foi amplificado com os preparadores TpsVFl e TpsVR3. As seqüências de aminoácido deduzidas revelaram diferenças significantes entre estes três fragmentos (Figura 5).

Exemplo 2: Isolação do cDNA da Sesquiterpeno Sintase usando 573’RACE • 5 Para isolar as seqüências de tamanho natural das sesquiterpeno sintases, um método 573’-RACE foi primeiro usado. O cDNA foi sintetizado usando o Kit de Amplificação de cDNA Marathon® (Clontech) e partindo de 1 pg de mRNA purificado a partir de RNA total preparado com a técnica do Borato Quente. A qualidade do cDNA sintetizado foi deficiente, cDNAs de 10 tamanho essencialmente pequeno foram obtidos (tamanho médio de 0,5 Kb).

Entretanto, usando este cDNA, as extremidades 3’ do GFTpsB e GFTpsC foram obtidas usando os preparadores específicos de gene GFTpsBRFl e GFTpsBRF2 para GFTpsB e os preparadores específicos de gene GFTpsCRFl e GFTpsCRF2 para GFTpsC (ver a Tabela 1). O mRNA preparado pelo método de extração com guanidínio-tiocianato/fenol deu cDNA de qualidade superior com um tamanho médio de 2 Kb e permitiu a isolação da seqüência de extremidade 5’ de GFTpsC usando os preparadores específicos de gene GFTpsCRRl e GFTpsRR2 (ver a Tabela 1), completando a seqüência de tamanho natural deste clone. A extremidade 5’ de GFTpsB e a extremidade 5’ e a extremidade 3’ de GFTpsA não puderam ser obtidas por este método.

O método de extração de guanidínio-tiocianato/fenol foi com base na técnica descrita por Chomczynski e Sacchi usando a solução de RNAClean® da ThermoHybaid (Chomczynski, P. e Sacchi, N., (1987) Anal.

Biochem. 162, 156 a 159). Em resumo, 2 g de tecidos congelados foram triturados até um pó fino em nitrogênio líquido usando um almofariz e pistilo. O pó foi transferido a 20 ml de solução de RNAClean® e a suspensão foi homogeneizada usando um homogeneizador Ultraturax® e filtrada através de filtro Miracloth® (Calbiochem). Depois da adição de 0,1 volume de clorofórmio, o tubo foi colocado em gelo e centrifugado 20 min a 12000g e 4°C. A fase aquosa superior foi recuperada e um volume de isopropanol foi adicionado. Depois de 20 min. De incubação a -20°C, a amostra foi centrifugada 20 min. a 12000g e 4°C. As pelotas brancas maiores obtidas . 5 foram lavadas com etanol a 70 % e secadas na temperatura ambiente. Esta pelota, contendo o RNA total, foi imediatamente submetida à purificação do mRNA pela cromatografia de afinidade de oligodT-celulose usando o Kit de isolação de mRNA FastTrack® 2.0 (Invitrogen). O protocolo do fabricante foi seguido exceto que depois da recolocação em suspensão do RNA total no 10 tampão de lise, a amostra foi aquecida a 100°C ao invés de 65°C.

A amplificação rápida em 3’ e 5’ de extremidades de cDNA (RACE) foi realizada usando o Kit de Amplificação de cDNA Marathon® (Clontech). O procedimento começou com a síntese do primeiro filamento de cDNA partindo de mRNA usando um preparador oligo(dT). Depois da síntese do segundo filamento, adaptadores específicos foram ligados às extremidades do cDNA de filamento duplo (ds cDNA). Este procedimento forneceu uma coleção não clonada de ds cDNA ligado ao adaptador. mRNA de toranja purificado (1 pg) foi usado como material de partida. A qualidade e a l quantidade do cDNA foi avaliada em um gel de agarose.

As extremidades 3’ ou 5’ dos cDNAs específicos foram amplificados com Mistura de Advantage® 2 Polimerase usando uma combinação de oligonucleotídeos específicos de gene e adaptador. As misturas de reação RACE típicas contiveram, em um volume final de 50 μΐ, 5 μΐ de Tampão de Reação 10X cDNA PCR (clontech), 200 nM de cada dNTP,

1 μΐ de Mistura Advantage 2 Polimerase, 200 μΜ de preparador específico de adaptador (Clontech), 200 μΜ de preparador específico de gene (ver a Tabela 1) e 5 μΐ de cDNA ligado ao adaptador diluídos de 50 a 250 vezes. A amplificação foi realizada em um ciclador térmico de gradiente Eppendorf Masterciclor. As condições do ciclador térmico foram como segue: 1 min a

94°C, 5 ciclos de 30 s a 94°C e 2 a 4 min a 72°C, 5 ciclos de 30 s a 94°C e 2 a min a 70°C, 20 ciclos de 30 s a 94°C e de 2 a 4 min a 68°C. Quando necessário uma segunda rodada de amplificação foi realizada usando um preparador específico de adaptador abrigado (Clontech) e um preparador - 5 específico de gene abrigado.

Os produtos de amplificação foram avaliados, sub-clonados e a seqüência analisada como acima para os produtos de RT-PCR.

TABELA 1: Os seguintes preparadores foram usados nos experimentos de

375’-RACE:

Nome	Descrição	Seqüência (5’ para 3’).
GFTpsARFl (SEQ ID NO: 33)	Preparador avançado de 3’RACE.	CTGGGAGTGTCCTA TGAGCTCAATTTGG
GFTpsARF2 (SEQ ID NO: 34)	Preparador abrigado avançado de GFTpsA 3’RACE.	GTAGAATTTTTGCAT CCAAAGTGGTGTGC
GFTpsARRl (SEQ ID NO: 35)	Preparador reverso GFTpsA 5’-RACE.	CACACCACTTTGGA TGCAAAAATTCATC
GFTpsARR2 (SEQ ID NO: 36)	Preparador abrigado reverso GFTpsA 5’-RACE.	CCAAATTGGGCTCAT AGGACACTCCCAG
GFTpsBRFl (SEQ ID NO: 37)	Preparador avançado de GFTpsB 3’-RACE.	TAGGGACGTATTTTG AACCAAAGTAC
GFTpsBRF2 (SEQ ID NO: 38)	Preparador abrigado avançado GFTpsB 3’-RACE.	AAATAATGACCAAA ACAAMACACGG
GFTpsBRRl (SEQ ID NO: 39)	Preparador reverso GFTpsB 5’-RACE.	GCACTTTCATGTATTCTGGA A
GFTpsBRR2 (SEQ ID NO: 40)	Preparador abrigado reverso GFTpsB 5’-RACE.	Gtttgagctcttcaaagaa ACC
GFTpsCRFl (SEQ ID NO: 41)	Preparador avançado GFTpsC 3’-RACE.	AATGGGAGTGTATTTTGAG CCTCGATACTCC
GFTpsCRF2 (SEQ ID NO: 42)	Preparador abrigado avançado GFTpsC 3’-RACE.	GATATTTTCCAAAGTAATT GCAATGGCATCC
GFTpsCRRl (SEQ ID NO: 43)	Preparador reverso GFTpsC 5’-RACE.	GTTGCTAATATCCCACCTTT TGATAGC
GFTpsCRR2 (SEQ ID NO: 44)	Preparador abrigado reverso GFTpsC 5’-RACE.	AAGTGTGCCATAGGCGTCG TAGG
GFTpsDRRl (SEQ ID NO: 45)	Preparador reverso GFTpsD 5’-RACE.	CTGTTCCGCAAGCTTAGGG GTTACATG

GFTpsDRR2 (SEQ ID NO: 46)	Preparador abrigado reverso GFTpsD 5’-RACE.	CTGAGCTACCAATGACTTC AGGTGAGTGG
GFTpsERRI (SEQ ID NO: 47)	Preparador reverso GFTpsE 5’-RACE.	CAATTTTGCCATACACATC ATAGATATCATC
GFTpsERR2 (SEQ ID NO: 48)	Preparador abrigado reverso GFTpsE 5’-RACE.	AACAGAAGTCATGGAGATC ACTTTCGTC
GFTpsERR3 (SEQ ID NO: 49)	Preparador reverso GFTpsE 5’-RACE.	CGCAAGAGATGTTTTAAAG TTCCCATCC
GFTpsERR4 (SEQ ID NO: 50)	Preparador abrigado reverso GFTpsE 5’-RACE.	TGAACATCAGCGGAAATTT TATAGCC

O cDNA parcial GFTpsB cDNA obtido pelo 3’-RACE revelou alta identidade de seqüência a um cDNA da terpeno sintase putativo encontrado nas bases de dados públicas (Acesso GeneBank n² AF288465) e isolado de Citrus junos. Os preparadores específicos para a seqüência desta terpeno sintase foram planejados: um par de preparadores avançado e reverso junosFl e junosRl) planejados contra a região não codificadora da terpeno sintase de C. junos e um par de preparadores avançado e reverso junosF2 e junosR2) planejados na região codificadora incluindo os códons de início e parada. A PCR na coleção de cDNA Marathon® de toranja usando os preparadores junosFl e junosRl produzidos no amplicon. Usando os preparadores junosF2 e junosR2 um fragmento de 1,6 Kb foi amplificado. O seqüenciamento de DNA confirmou este produto de PCR como sendo uma sesquiterpeno sintase de comprimento completo de 1669 pares de base do clone GFTpsB. (Figura 6).

Exemplo 3: Triagem de coleção de cDNA e seqüenciamento de EST

De modo a obter o cDNA de tamanho natural dos clones parciais obtidos pelo método de PCR, uma coleção de cDNA preparada a partir do mRNA flavedo de toranja foi construída.

A síntese de cDNA e a construção da coleção foram realizadas usando o Kit de construção de coleção Uni-ZAP® XR (Stratagene) de acordo com o protocolo dos fabricantes partindo de 7,5 pg de mRNA de flavedo de toranja (preparado pelo método de Guanidínio-Tiocianato/Fenol). O título original da coleção foi de 2 x 10⁷ PFU (unidades formadoras de placa) e o tamanho de inserto médio foi de 1,1 Kb.

Dois métodos foram usados para isolar os cDNAs que codificam as sesquiterpeno sintases da coleção de cDNA: seqüenciamento EST e triagem usando uma sonda de DNA. Para o seqüenciamento de EST (rótulo de seqüência expressado), uma fração da coleção foi usada para excisar o fagomídeo de pBluescript a partir do vetor Uni-ZAP XR de acordo com o protocolo de excisão de massa da Stratagene. As colônias bacterianas transformadas resultantes (576) foram aleatoriamente coletadas e os plasmídeos purificados. Uma reação de seqüenciamento foi realizada para cada clone usando o preparador T3. As seqüências foram primeiro editadas para remover seqüências de vetor e comparadas contra a base de dados de proteína não redundante do GenBank (NCBI) usando o algoritmo BLASTX (Altschul et al 1990).

A coleção foi tríada com digoxigenina sondas de DNA rotuladas com (DIG). As sondas foram sintetizadas pela incorporação de DIG-dUTP em um fragmento de DNA pela PCR usando o Kit de Síntese de Sonda PCR DIG (digoxigenina) (Roche Diagnostics). Uma sonda de DNA derivada de GFTpsA de 149 pares de base foi amplificada a partir de uma alíquota da coleção usando o preparador avançado GFTpsAproF (SEQ ID NO: 51) (5’-ACGATTTAGGCTTCCCTAAAAAGG-3’) e o preparador reverso GFTpsAproR (SEQ ID NO: 52) (5’-TATTATGGAATATTA TGCACACCAC-3’). Uma sonda derivada de GFTpsB 1036 pares de base foi amplificada a partir do plasmídeo pET-GFTpsB2-2 usando o preparador avançado junosF2 (SEQ ID NO: 53) (5’-AAATGTCCGCTCAAGTTCTA GCAACGG-3’) e o preparador reverso GFTpsBRR2 (SEQ ID NO: 54) (5’GTTTGAGCTCTTCAAAGAAACC-3’). Uma sonda de DNA derivada de GFTpsC de 1008 pares de base foi amplificada a partir do plasmídeo pETGFTpsC usando o preparador avançado GFTpsCpetFl (SEQ ID NO: 55) (5’

ATGGCACTTCAAGATTCAGAAGTTCC-3’) e o preparador reverso GFTpsCRRl (SEQ ID NO: 56) (5’-GTTGCTAATATCCCACC TTTTGATAGCT-3’).

As sondas foram hibridizadas em levantamentos de placa, • 5 preparados a partir de placas contendo 5.000 a 25.000 PFU, a 40°C em solução de hibridização Dig Easy Hyb (Roche Diagnostics). A detecção dos híbridos da sonda alvo nas membranas foi realizada pela quimioluminescência usando AntiDigoxigenina-Alcalino Fosfatase (Roche Diagnostics) e substrato de fosfato alcalino CDP-Star (Roche Diagnostics) e a 10 visualização foi feita em um Sistema de Produção de Imagem VersaDoc (BioRad).

Os fagos de sinais positivos foram retirados da parte central das placas de ágar e submetidos à triagem secundária e se necessário da terciária para se obter sinais positivos de placa única. Os isolados positivos 15 foram excisados in vivo e o inserto seqüenciado como descrito acima.

A coleção foi triada usando sondas de DNA preparadas a partir de GFTpsA, GFTpsB e GFTpsC. Este método produziu três cDNAs de sesquiterpeno sintase diferentes. Dois deles foram clones anteriormente encontrados: um clone, denominado GF2-30-1, foi uma forma truncada de 20 300 pares de base de extremidade 5’ do cDNA de GFTpsC; o segundo clone, denominado 9-13-6, foi um clone parcial de GFtpsA que foi truncado na sua extremidade 5’ em aproximadamente 168 pares de base como julgado pela comparação com outras sesquiterpeno sintases. O clone 9-13-6 forneceu informação de seqüência de extremidade 5’ adicional de 618 pares de base 25 comparado com o clone GFTpsA parcial mencionado acima obtido pela RTPCR. Na sua extremidade 3’, o clone 9-13-6 também foi incompleto. Aproximadamente 680 nucleotídeos foram perdidos e foram substituídos por um fragmento de 600 pares de base de nenhuma função definida. O terceiro cDNA que codifica a sesquiterpeno sintase obtido pela triagem, GF2-5-11, codificou uma nova sesquiterpeno sintase que foi denominada GFTpsD. Este clone foi truncado na extremidade 5’, mas os 414 pares de base perdidos foram recuperados pela 5’-RACE usando os preparadores descritos na Tabela 1. O GFTpsD de comprimento completo foi depois amplificado a partir da coleção de cDNA Marathon® e clonado no vetor de expressão bacteriano como descrito acima. A análise da seqüência de DNA de diversos cDNAs de GFTpsD de tamanho natural revelou que duas sesquiterpeno sintases intimamente relacionadas com diferenças de seqüência menores estavam presentes, eles foram denominados GFTpsD 1 e GFTpsD2 (Figura 6). A seqüência de aminoácido deduzida destas duas variantes diferiram entre si em resíduos.

Para o método de seqüenciamento EST, 576 clones foram seqüenciados. Entre eles, apenas três clones codificaram as terpeno-sintases putativas como proteínas e mais precisamente, duas proteínas como a sesquiterpeno sintase diferentes e uma proteína como a monoterpeno sintase. Um dos dois clones como a sesquiterpeno sintase (clone GF002-G3) foi o clone anteriormente identificado GFTpsD 1. O segundo (clone GF006-G7) foi um cDNA truncado que codifica uma nova sesquiterpeno sintase que foi denominado GFTpsE. Este clone foi mais uma vez truncado na extremidade ’ (em aproximadamente 800 pares de base) e o fragmento perdido pôde ser amplificado pela 5’-RACE em dois estágios como segue. Uma primeira 5’RACE usando os preparadores GFTpsERRl e GFTpsERR2 (ver a Tabela 1) forneceu 500 nucleotídeos na extremidade 5’ adicionais e uma segunda 5’RACE usando os preparadores GFTpsERR3 e GFTpsERR4 (ver a Tabela 1) forneceu a seqüência de DNA de extremidade 5 ’ perdida para reconstituir o cDNA de GFTpsE de tamanho natural (Figura 6).

Exemplo 4: Construção de Plasmídeos e Expressão de Enzima Construção de plasmídeos de expressão.

O cDNA foi sub-clonado no plasmídeo de expressão pETlla

(Novagen) para a expressão funcional das sesquiterpeno sintases. Para GFTpsB, GFtpsD e GFTpsE, os cDNAs de comprimento natural foram amplificados pela PCR para introduzir um sítio Ndel na extremidade 5’ incluindo o códon de partida e um sítio BamHI na extremidade 5’ • 5 imediatamente depois do códon de parada. Para GFTpsB, o preparador avançado GFTpsBNdel (SEQ ID NO: 57) 5 ’-GCATGTTCCT7ATGTCCG CTCAAGTTCTAGCAACGGTTTCC-3’ (sítio Ndel em itálicos, códon de parada sublinhado) e o preparador reverso GFTpsBBam (SEQ ID NO: 58) 5’CGCGGATCCTÇAGATGGTAACAGGGTCTCTGAGCACTGC-3 ’ (sítio 10 BamHI em itálicos, códon de parada sublinhado) foram usados. Do mesmo modo, o preparador avançado GFTpsDNdel (SEQ ID NO: 59) 5’GCATGTTCG47ATGTCGTCTGGAGAAACATTTCGTCC-3’ e o preparador reverso GFTpsDBam (SEQ ID NO: 60) 5’CGCGGATCCTÇAAAATGGAACGTGGTCTCCTAG-3’ foram usados para 15 GFTpsD e o preparador avançado GFTpsENdel (SEQ ID NO: 61) 5’GCATGTTCG47ATGTCTTTGGAAGTTTCAGCCTCTCCTG-3’ e o preparador reverso GFTpsEBam (SEQ ID NO: 62) 5’CGCGGATCCTÇATATCGGCACAGGATTAATAAACAAAGAAGC-3’ foram usados para GFTpsE.

As amplificações foram realizadas usando a Pfii DNA polimerase (Promega) em um volume final de 50 μΐ contendo 5 μΐ de Pfu tampão 10X de DNA polimerase, 200 μΜ de cada dNTP, 0,4 μΜ de cada preparador avançado e reverso, 2,9 unidades de Pfu DNA polimerase e 5 μΐ de cDNA diluído 100 vezes (preparado como descrito acima usando o Kit de 25 Amplificação de cDNA Marathon® (Clontech)). As condições de ciclagem térmica foram como segue: 2 min a 95°C; 25 ciclos de 30 s a 95°C, 30 s a 55°C e 4 min a 72°C; e 10 min a 72°C. O produto de PCR foi purificado em um gel de agarose, eluído usando o Kit de Extração de Gel QIAquicke (Qiagen), digeridos com Ndel e BamHI e ligados no plasmídeo pETlla similarrnente digerido.

Para a construção do vetor de expressão GFTpsC-pETlla, duas PCR separadas foram utilizadas para gerar o inserto flanqueado com as extremidades coesivas Ndel e BamHI. Uma primeira PCR foi realizada na • 5 mesma condição como descrito acima, usando o preparador avançado GFTpsCpETFl (SEQ ID NO: 63) 5’-TAATGGCACTTCAAGATTC AGAAGTTCCTC-3 ’ e o preparador reverso GFTpsCpETRl (SEQ ID NO: 64) 5’-AAAAGGGAACAGGCTTCTCAAGCAATG-3’e uma segunda PCR foi realizada usando o preparador avançado GFTpsCpETF2 (encurtado em 10 AT na extremidade 5’ comparado com GFTpsCpETFl) (SEQ ID NO: 65) 5’ATGGCACTTCAAGATTC AGAAGTTCCTC-3’ e o preparador reverso GFTpsCpETR2 (estendido por GATC na extremidade 5’ comparado com GFTpsCpETRl) (SEQ ID NO: 66) 5’-GATCAAAAGGG AACAGGCTTCTCAAGCAATG-3’. Os dois produtos de PCR foram 15 purificados como descrito acima, combinados, desnaturados em 5 min de ebulição e esfriado em 5 min em gelo. O cDNA resultante foi usado diretamente para ligação no plasmídeo pETl la.

Os produtos de ligação foram inicialmente transformados nas células E. coli JM 109 e as construções foram verificadas pela digestão de 20 restrição e seqüenciamento de DNA.

Expressão de Sesquiterpeno Sintases.

Para a expressão de proteína, os plasmídeos pETl la contendo os cDNAs da sesquiterpeno sintase assim como o plasmídeo pETlla vazio foram transformados nas células E. coli BL21 (DE3) (Novagen). As colônias 25 únicas foram usadas para inocular 5 ml de meio LB. Depois de 5 a 6 horas de incubação a 37°C, as culturas foram transferidas a um incubador a 20°C e deixado 1 hora para equilíbrio. A expressão da proteína foi depois induzida pela adição de 0,5 mM de IPTG e as cultura incubadas durante a noite a 20°C.

No dia seguinte, as células foram coletadas pela centrifugação, recolocadas em suspensão em 0,5 ml de Tampão de Extração (50 mM de MOPSO pH 7, 5 mM de EDTA, 5 mM de EDTA, 10 % de glicerol) e sonificado 3 vezes 30 s. Os fragmentos de célula foram sedimentados pela centrifugação 30 min a 18.000g e o sobrenadante contendo as proteínas . 5 solúveis foi recuperado. A expressão das sesquiterpeno sintases foi avaliada pela separação do extrato de proteína em uma SDS-PAGE (eletroforese em gel de poliacrilamida) e tingimento com azul de coomassie e comparação com o extrato de proteína obtido a partir das células transformadas com o plasmídeo vazio.

Uma faixa distinta com o peso molecular calculado esperado foi observada para todas as construções e a faixa não estava presente nas proteínas solúveis a partir da E coli transformada com o plasmídeo vazio.

Exemplo 4 Ensaio de Função de Enzima

Os ensaios enzimáticos foram realizados em tubos de vidro selados usando 50 a 100 μΐ de extrato de proteína em um volume final de

Tampão de Extração suplementado com 15 mM de MgCl₂ e 100 a 250 μΜ de

FPP (Sigma). O meio foi sobreposto com 1 ml de pentano e os tubos incubados durante a noite a 30°C. A fase de pentano, contendo os I sesquiterpenos, foi recuperada e o extrato do meio com um segundo volume 20 de pentano. As frações de pentano combinadas foram concentradas sob nitrogênio e analisadas pela Cromatografia a Gás em um sistema de CG da Hewlett-Packard Série 6890 usando uma coluna capilar SPB-1 (Supelco) de diâmetro interno de 0,25 mm por 30 m. O gás carregador foi He em fluxo constante de 1,6 ml/min. A injeção foi feita em uma relação de separação de 25 2:1 com a temperatura do injetor ajustada a 200°C e a estufa programada de

80°C (manutenção de 0 min) a 7,5°C/min até 200°C (manutenção de 0 min) seguido por 20°C/min a 280°C (manutenção de 2 min). A detecção foi feita com um detector de ionização de chama. A identificação do composto foi com base na identidade do tempo de retenção time com padrões autênticos quando disponíveis. Para a confirmação das identidades de produtos, as amostras foram analisadas pela GC-MS capilar combinada usando um sistema de detector seletivo de massa de quadrupolo 6890 GC da Hewlett-Packard, equipado com uma coluna capilar SPB-1 (Supelco) de diâmetro interno de . 5 0,25 mm por 30 m. A estufa foi programada a partir de 80°C (manutenção de min) a 280°C a 7,5°C em um fluxo constante de 1,5 ml/min He. Os espectros foram registrados a 70 eV com uma voltagem de multiplicador eletrônico de 2200 V.

A atividade de enzima das enzimas recombinantes diferentes foram avaliadas neste ensaio usando a fração de proteína solúvel e famesildifosfato como substrato. A atividade de sesquiterpeno sintase foi obtida para todos os clones testados e o produto formado foi caracterizado pelo tempo de retenção e GC-MS (Figura 7). O cDNA de GFTpsB codificou uma sesquiterpeno sintase produzindo biciclogermacreno (Figura 3) como produto principal e pelo menos 15 olefinas de sesquiterpeno menores ou sesquiterpenos oxigenados tais como delta-cadineno (Figura 3) (cicloelemeno (Figura 3), que resulta do rearranjo térmico de biciclogermacreno também foi observado no traço GC). O cDNA GFTpsC codificou um produto múltiplo formando sesquiterpeno sintase com um produto principal sendo identificado como cubebol (Figura 3). A enzima também produziu 3 outros sesquiterpenos em uma proporção grande relativa de (-)-a-cubebeno e 2 sesquiterpenos oxigenados e em quantidades pequenas, pelo menos 11 olefinas de sesquiterpeno ou sesquiterpenos oxigenados. GFtpsD codificou uma sesquiterpeno sintase que produz Valenceno como um produto principal.

Dez outros picos menores também foram identificados como olefinas de sesquiterpeno ou álcoois. Entre eles, β-elemeno é um produto da degradação térmica de germacreno A. GFTpsE codificou uma sesquiterpeno sintase produzindo uma mistura complexa de compostos de sesquiterpeno com δcadineno (Figura 3) sendo levemente o mais abundante. Cubebol e : : ·.· .·. ··: ·

Germacreno D (Figura 3) também foram identificados na mistura de produtos formados pelo GFTpsE.

As sesquiterpeno sintases isoladas demonstraram propriedades de formação de produto múltiplo nos experimentos descritos. Por exemplo, a • 5 cubebol sintase e a δ-cadineno produzem 3 ou 5 produtos em proporção relativamente grande. A biciclogermacreno sintase produziu uma sesquiterpeno principal e diversos produtos secundários em quantidades traço.

Claims

1. Método de produção de um valenceno caracterizado pelo fato de que compreender:

A) o contato de farnesil pirofosfato com pelo menos um valenceno sintase que :

(a) compreende a sequência de aminoácidos SED ID No4 ou SED ID No5; e

B) o isolamento do valenceno produzido em A).

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pH no momento do contato é de 7 ou menos.

3. Método de acordo com as reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que pelo menos um valenceno sintase é produzido por cultura de um microorganismo ou uma célula hospedeira compreendendo o ácido nucleico, onde a célula hospedeira é escolhido a partir de uma célula bacteriana ou uma célula de levedura.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula bacteriana, tipo E. coli.

5. Microorganismo transgênico, caracterizado pelo fato de:

(a) abrigar um ácido nucleico compreendendo a sequência nucleotídica SED ID No9 ou SED ID No10; ou (b) expressar um polipeptídio compreendendo a sequência de aminoácidos SED ID No4 ou SED ID No5.

6. Microrganismo transgênico, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de ser um procariota ou uma levedura.

7. Microorganismo transgênico, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o referido procarioto é Escherichia coli e que a referida levedura é Saccharomyces cerevisiae.