ES2607122T3 - Sesquiterpeno sintasas y procedimientos de uso - Google Patents

Abstract

Un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido al menos 90 % idéntico a SEQ ID NO: 1; en el que el polipéptido codificado por dicho ácido nucleico es una cubebol sintasa.

Description

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ejemplos de dichos procedimientos, incluyendo procedimientos para protocolos de PCR que pueden usarse en el presente documento, en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989), Current Protocols in Molecular Biology editado por F.A. Ausubel y col., John Wiley y Sons, Inc. (1987), e Innis, M. y col., eds., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990).

Como se describe en el presente documento, las moléculas de ácido nucleico desveladas en el presente documento incluyen ADN en forma tanto monocatenaria como bicatenaria, así como el complemento de ARN del mismo. El ADN incluye, por ejemplo, ADNc, ADN genómico, ADN sintetizado químicamente, ADN amplificado por PCR y combinaciones de los mismos. El ADN genómico, incluyendo regiones traducidas, no traducidas y de control, puede aislarse mediante técnicas convencionales, por ejemplo, usando uno cualquiera de los ADNc desvelados en el presente documento, o fragmentos adecuados de los mismos, como una sonda, para identificar un trozo de ADN genómico que puede después clonarse usando procedimientos conocidos habitualmente en la técnica. En general, las moléculas de ácido nucleico desveladas en el presente documento incluyen secuencias que hibridan con secuencias desveladas en el presente documento en condiciones de hibridación y lavado descritas anteriormente y de 5°, 10°, 15°, 20°, 25° o 30° por debajo de la temperatura de fusión de la doble cadena de ADN de secuencias desveladas en el presente documento, incluyendo cualquier serie de condiciones subsumidas dentro de estos intervalos.

En otra realización, los ácidos nucleicos desvelados en el presente documento comprenden una secuencia sustancialmente como se expone en SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10. En una realización, los ácidos nucleicos son al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % idénticos a los nucleótidos SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10. En una realización el ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9

o SEQ ID NO: 10. En una realización adicional, el ácido nucleico codifica una proteína que es una sesquiterpeno sintasa, como se demuestra, por ejemplo, en el ensayo enzimático descrito en los ejemplos. También se proporcionan ácidos nucleicos que comprenden regiones conservadas entre diferentes especies.

En otra realización más, el ácido nucleico comprende un tramo contiguo de al menos 50, 100, 250, 500, 750 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10. Dichos fragmentos contiguos de estos nucleótidos también pueden contener al menos una mutación siempre que la secuencia mutante conserve la funcionalidad de la secuencia original y la capacidad de hibridar con estos nucleótidos en condiciones de rigurosidad baja o alta, tales como por ejemplo, condiciones de rigurosidad moderada

o alta. Dicho fragmento puede derivar, por ejemplo, de los nucleótidos (nt) nt 200 a nt 1600, de nt 800 a nt 1600, de nt 1000 a nt 1600, de nt 200 a nt 1000, de nt 200 a nt 800, de nt 400 a nt 1600, o de nt 400 a nt 1000 deSEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10.

Como se ha descrito anteriormente, los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos desvelados en el presente documento también se desvelan en el presente documento. Los ácidos nucleicos aislados desvelados en el presente documento pueden seleccionarse de un ácido nucleico que codifica el polipéptido sustancialmente expuesto en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5. En una realización, los polipéptidos son al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % idénticos a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5.

En una realización, un polipéptido desvelado en el presente documento comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5. En otra realización, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se expone en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5. En otra realización más, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 85 % idéntica, al menos 90 % o al menos 95 % idéntica a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5. En una realización, el polipéptido es una sesquiterpeno sintasa, como se demuestra, por ejemplo, en el ensayo enzimático descrito posteriormente.

Debido a la degeneración del código genético en el que más de un codón puede codificar el mismo aminoácido, múltiples secuencias de ADN pueden codificar el mismo polipéptido. Dichas secuencias de ADN variantes pueden resultar de la deriva genética o manipulación artificial (por ejemplo, aparecen durante la amplificación por PCR o como el producto de mutagénesis deliberada de una secuencia nativa). También se desvela en el presente documento cualquier ácido nucleico capaz de codificar una proteína derivada de las SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10 o variantes de las mismas.

Puede llevarse a cabo mutagénesis deliberada de una secuencia nativa usando numerosas técnicas bien conocidas en este campo. Por ejemplo, pueden emplearse procedimientos de mutagénesis específica de sitio dirigida a oligonucleótidos, particularmente cuando se desee mutar un gen de modo que se alteren nucleótidos de restricción predeterminados o codones mediante sustitución, supresión o inserción. Se desvelan procedimientos ejemplares para realizar dichas alteraciones en Walder y col. (Gene 42: 133, 1986); Bauer y col. (Gene 37: 73, 1985); Craik (BioTechniques, enero 12-19, 1985); Smith y col. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981); Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488, 1985); Kunkel y col. (Methods in Enzymol. 154: 367, 1987); y patentes de Estados Unidos n.º 4.518.584 y 4.737.462.

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También se desvelan en el presente documento polipéptidos aislados. Como se usa en el presente documento, el término “polipéptidos” se refiere a un género de polipéptido o fragmentos peptídicos que abarca las secuencias de aminoácidos identificadas en el presente documento, así como fragmentos más pequeños. Como alternativa, un polipéptido puede definirse con respecto a su relación antigénica con cualquier péptido codificado por las secuencias de ácido nucleico desveladas en el presente documento. Por tanto, en una realización, un polipéptido desvelado en el presente documento se define como una secuencia de aminoácidos que comprende un epítopo lineal o tridimensional compartido con cualquier péptido codificado por las secuencias de ácido nucleico desveladas en el presente documento.

Como alternativa, un polipéptido desvelado en el presente documento se reconoce por un anticuerpo que reconoce específicamente cualquier péptido codificado por las secuencias de ácido nucleico desveladas en el presente documento. Se define que los anticuerpos se unen específicamente si se unen con polipéptidos desvelados en el presente documento con una Ka de más de o igual a aproximadamente 107 M-1, tal como más de o igual a 108 M-1 .

Una "variante" polipeptídica como se indica en el presente documento significa un polipéptido sustancialmente homólogo de un polipéptido nativo, pero que tiene una secuencia de aminoácidos diferente de la codificada por cualquiera de las secuencias de ácido nucleico desveladas en el presente documento debido a una o más supresiones, inserciones o sustituciones.

Las variantes pueden comprender secuencias sustituidas de forma conservativa, lo que significa que un resto de aminoácido dado se reemplaza por un resto que tiene características fisioquímicas similares. Los ejemplos de sustituciones conservativas incluyen sustitución de un resto alifático por otro, tales como Ile, Val, Leu o Ala entre sí,

o sustituciones de un resto polar por otro, tal como entre Lys y Arg; Glu y Asp; o Gin y Asn. Véase Zubay, Biochemistry, Addison-Wesley Pub. Co., (1983). Los efectos de dichas sustituciones pueden calcularse usando matrices de puntuación de sustitución tales como PAM-120, PAM-200 y PAM-250 como se analiza en Altschul, (J. Mol. Biol. 219: 555-65, 1991). Se conocen bien otras de dichas sustituciones conservativas, por ejemplo, las sustituciones de regiones completas que tienen características de hidrofobicidad similares.

Se desvelan en el presente documento también variantes peptídicas de origen natural. Son ejemplos de dichas variantes proteínas que resultan de acontecimientos de corte y empalme de ARNm alternativos o de escisión proteolítica de los polipéptidos descritos en el presente documento. Las variaciones atribuibles a proteólisis incluyen, por ejemplo, diferencias en el extremo N o C terminal tras la expresión en diferentes tipos de células huéspedes, debido a la retirada proteolítica de uno o más aminoácidos terminales de los polipéptidos codificados por las secuencias desveladas en el presente documento.

Las variantes de las sesquiterpeno sintasas desveladas en el presente documento pueden usarse para obtener actividad enzimática potenciada o reducida deseada, regioquímica o estereoquímica modificadas, o utilización de sustrato o distribución de producto alteradas. Una variante o un mutante directo de sitio pueden realizarse mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica.

Como se ha indicado anteriormente, se desvelan en el presente documento polipéptidos recombinantes y no recombinantes, aislados y purificados, tales como de plantas de cítricos. Pueden obtenerse variantes y derivados de polipéptidos nativos aislando variantes de origen natural o la secuencia de nucleótidos de variantes, de otras líneas

o especies vegetales o las mismas, o programando artificialmente mutaciones de secuencias de nucleótidos que codifiquen polipéptidos de cítricos nativos. Pueden conseguirse alteraciones de la secuencia de aminoácidos nativa por cualquiera de varios procedimientos convencionales. Pueden introducirse mutaciones en loci particulares sintetizando oligonucleótidos que contienen una secuencia mutante, flanqueada por sitios de restricción que permiten el ligamento a fragmentos de la secuencia nativa. Después del ligamiento, la secuencia reconstruida resultante codifica un análogo que tiene la inserción, sustitución o supresión de aminoácidos deseada. Como alternativa, pueden emplearse procedimientos de mutagénesis específica de sitio dirigida a oligonucleótido para proporcionar un gen alterado en el que pueden alterarse los codones predeterminados por sustitución, supresión o inserción.

En una realización, la divulgación contempla: vectores que comprenden los ácidos nucleicos desvelados en el presente documento. Por ejemplo, un vector que comprende al menos un ácido nucleico seleccionado de (a) un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos sustancialmente como se expone en SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10; (b) un ácido nucleico que codifica el polipéptido sustancialmente expuesto en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5; y (c) un ácido nucleico que hibrida con el ácido nucleico de (a) o (b) en condiciones de baja rigurosidad, en el que el polipéptido codificado por dicho ácido nucleico es una sesquiterpeno sintasa.

Un vector como se usa en el presente documento incluye cualquier vector recombinante incluyendo pero sin limitación vectores virales, bacteriófagos y plásmidos.

Pueden prepararse vectores de expresión recombinantes que contienen una secuencia de ácido nucleico desvelada en el presente documento usando procedimientos bien conocidos. En una realización, los vectores de expresión incluyen una secuencia de ADNc que codifica el polipéptido unido operativamente con secuencias de nucleótidos

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Laboratory, p. 412, 1982). Un sistema de expresión de células huéspedes procariotas útil emplea un promotor PL de fago λ y una secuencia represora termolábil de cl857ts. Los vectores plasmídicos disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo ("ATCC"), que incorporan derivados del promotor PL, incluyen el plásmido pHUB2 (residente en la cepa de E. coli JMB9 (ATCC 37092)) y pPLc28 (residente en E. coli RR1 (ATCC 53082)).

Los polipéptidos desvelados en el presente documento también pueden expresarse en células huéspedes de levadura, preferentemente del género Saccharomyces (por ejemplo, S. cerevisiae). También pueden emplearse otros géneros de levadura, tales como Pichia o Kluyveromyces (por ejemplo K. lactis). Los vectores de levadura contendrán con frecuencia una secuencia de origen de replicación de un plásmido de levadura 2μ, una secuencia de replicación autónoma (ARS), una región promotora, secuencias para poliadenilación, secuencias para terminación de la transcripción y un gen marcador seleccionable. Las secuencias promotoras adecuadas para vectores de levadura incluyen, entre otros, promotores para metalotionina, 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman y col., J. Biol. Chem. 255: 2073, 1980), u otras enzimas glucolíticas (Hess y col., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968; y Holland y col., Biochem. 17: 4900, 1978), tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa. Otros vectores y promotores adecuados para su uso en expresión de levadura se describen adicionalmente en Hitzeman, documento EPA-73.657 o en Fleer y col., Gene, 107: 285-195 (1991); y van den Berg y col., Bio/Technology, 8: 135-139 (1990). Otra alternativa es el promotor de ADH2 reprimible por glucosa descrito en Russell y col. (J. Biol. Chem. 258: 2674, 1982) y Beier y col. (Nature 300: 724, 1982). Pueden construirse vectores lanzadera replicables tanto en levadura como en E. coli insertando secuencias de ADN de pBR322 para selección y replicación en E. coli (gen de Ampr y origen de replicación) en los vectores de levadura anteriormente descritos.

También se desvela en el presente documento un organismo no humano modificado para albergar un ácido nucleico desvelado en el presente documento. El organismo no humano y/o la célula huésped pueden modificarse por cualquier procedimiento conocido en la técnica para transferencia génica incluyendo, por ejemplo, el uso de dispositivos de suministro tales como lípidos y vectores virales, ADN desnudo, electroporación y transferencia génica mediada por partículas. En una realización, el organismo no humano es una planta, un insecto o un microoorganismo.

Por ejemplo, se desvela en el presente documento un procedimiento para preparar al menos una sesquiterpeno sintasa que comprende cultivar un huésped modificado para contener al menos un ácido nucleico en condiciones que conducen a la producción de dicha al menos una sesquiterpeno sintasa en el que dicho al menos un ácido nucleico se selecciona de (a) un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos sustancialmente como se expone en SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10; (b) un ácido nucleico que codifica el polipéptido sustancialmente expuesto en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4

o SEQ ID NO: 5; y (c) un ácido nucleico que hibrida con el ácido nucleico de (a) o (b) en condiciones de baja rigurosidad, en el que el polipéptido codificado por dicho ácido nucleico es una sesquiterpeno sintasa.

En una realización adicional, el huésped es una planta tal como tabaco, animal o microorganismo incluyendo también pero sin limitación células bacterianas, células de levadura, células vegetales y células animales. Como se usa en el presente documento, las células vegetales y células animales incluyen el uso de plantas y animales como un huésped. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la expresión es en un organismo no humano modificado genéticamente.

En una realización, se emplean sistemas de cultivo de células huéspedes de mamífero o de insecto para expresar polipéptidos recombinantes desvelados en el presente documento. Se revisan sistemas de baculovirus para producción de proteínas heterólogas en células de insectos en Luckow y Summers, Bio/Technology 6: 47 (1988). También pueden emplearse líneas celulares establecidas de origen mamífero. Los ejemplos de líneas de células huéspedes de mamífero adecuadas incluyen la línea COS-7 de células de riñón de mono (ATCC CRL 1651) (Gluzman y col., Cell 23: 175, 1981), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa y líneas celulares BHK (ATCC CRL 10), y la línea celular CV-1/EBNA-1 (ATCC CRL 10478) derivada de la línea celular de riñón de mono verde africano CVI (ATCC CCL 70) como se describe en McMahan y col. (EMBO J. 10: 2821,1991).

Se han descrito procedimientos establecidos para introducir ADN en células de mamífero (Kaufman, R.J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, pp. 15-69). Pueden usarse protocolos adicionales usando reactivos disponibles en el mercado, tales como Lipofectamine (Gibco/BRL) o Lipofectamine-Plus, para transfectar células (Feigner y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417, 1987). Además, puede usarse electroporación para transfectar células de mamífero usando procedimientos convencionales, tales como los de Sambrook y col. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Puede realizarse selección de transformantes estables usando resistencia a fármacos citotóxicos como un procedimiento de selección. Kaufman y col., Meth. in Enzymology 185: 487-511, 1990, describe varios esquemas de selección, tales como resistencia a dihidrofolato reductasa (DHFR). Una cepa huésped adecuada para selección de DHFR puede ser la cepa de CHO DX-B11, que es deficiente en DHFR (Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220, 1980). Puede introducirse un plásmido que expresa el ADNc de DHFR en la cepa DX-B11, y solamente células que contienen el plásmido pueden crecer en los medios selectivos apropiados.

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Pueden escindirse secuencias de control de la transcripción y la traducción para vectores de expresión de células huéspedes de mamífero de genomas virales. Secuencias promotoras y secuencias potenciadoras habitualmente usadas derivan de virus del polioma, adenovirus 2, virus de simio 40 (SV40) y citomegalovirus humano. Pueden usarse secuencias de ADN derivadas del genoma viral de SV40, por ejemplo, origen de SV40, promotor temprano y tardío, potenciador, sitios de corte y empalme y de poliadenilación para proporcionar otros elementos genéticos para expresión de una secuencia génica estructural en una célula huésped de mamífero. Los promotores virales temprano y tardío son particularmente útiles porque ambos se obtienen fácilmente de un genoma viral como un fragmento, que también puede contener un origen de replicación viral (Fiers y col., Nature 273: 113, 1978; Kaufman, Meth. in Enzymology, 1990).

Existen varios procedimientos conocidos en la técnica para la creación de plantas transgénicas. Estos incluyen, pero sin limitación: electroporación de protoplastos vegetales, transformación mediada por liposomas, transformación mediada por polietilenglicol, microinyección de células vegetales y transformación usando virus.

En una realización, se utiliza transferencia génica directa por bombardeo de partículas.

La transferencia génica directa por bombardeo de partículas proporciona un ejemplo para transformar tejido vegetal. En esta técnica se dispara una partícula, o un microproyectil, revestido con ADN a través de las barreras físicas de la célula. Puede usarse bombardeo de partículas para introducir ADN en cualquier tejido diana que sea penetrable por partículas revestidas con ADN, pero para transformación estable, es imperativo usar células regenerables. Típicamente, las partículas están hechas de oro o wolframio. Las partículas se revisten con ADN usando procedimientos de precipitación con CaCl2 o etanol que se conocen habitualmente en la técnica.

Se disparan partículas revestidas con ADN de una pistola de partículas. Puede obtenerse una pistola de partículas adecuada de Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA). La penetración de partículas se controla por diversos parámetros tales como la intensidad de la ráfaga explosiva, el tamaño de las partículas, o la distancia que las partículas deben viajar para alcanzar el tejido diana.

El ADN usado para revestir las partículas puede comprender un casete de expresión adecuado para conducir la expresión del gen de interés que comprenderá un promotor unido operativamente con el gen de interés.

Se desvelan procedimientos para realizar transferencia génica directa por bombardeo de partículas en la patente de Estados Unidos 5.990.387 de Tomes y col.

En una realización, los ADNc desvelados en el presente documento pueden expresarse de tal manera que produzcan ARN con sentido o antisentido. El ARN antisentido es ARN que tiene una secuencia que es el complemento inverso del ARNm (ARN con sentido) codificado por un gen. Un vector que conducirá la expresión de ARN antisentido es uno en el que el ADNc se coloca en “orientación inversa” con respecto al promotor de modo que se transcribe la cadena no codificante (en lugar de la cadena codificante). La expresión de ARN antisentido puede usarse para modular negativamente la expresión de la proteína codificada por el ARNm para el que el ARN antisentido es complementario. Podrían usarse vectores que producen ARN antisentido para realizar plantas transgénicas, como se ha descrito anteriormente.

En una realización, el ADN transfectado se integra en un cromosoma de un organismo no humano de modo que se produzca un sistema recombinante estable. Puede usarse cualquier procedimiento de integración cromosómica conocido en la técnica en la práctica de la invención, incluyendo pero sin limitación intercambio de casete mediado por recombinasa (RMCE), inserción cromosómica específica de sitio viral, adenovirus e inyección pronuclear.

También se desvelan en el presente documento procedimientos para preparar terpenoides y compuestos de sesquiterpeno, por ejemplo, usando los nucleótidos y polipéptidos desvelados en el presente documento. Los ejemplos incluyen procedimientos para preparar al menos un terpenoide que comprenden poner en contacto al menos un precursor de pirofosfato terpeno acíclico con al menos un polipéptido codificado por un ácido nucleico seleccionado de (a) un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos sustancialmente como se expone en SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10; (b) un ácido nucleico que codifica el polipéptido sustancialmente expuesto en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5; y (c) un ácido nucleico que hibrida con el ácido nucleico de (a) o (b) en condiciones de baja rigurosidad, en el que el polipéptido codificado por dicho ácido nucleico es una sesquiterpeno sintasa, y aislar al menos un terpenoide producido. Otro ejemplo es un procedimiento para preparar al menos un terpenoide que comprende poner en contacto al menos un precursor de pirofosfato terpeno acíclico con al menos un polipéptido sustancialmente expuesto en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5 y aislar al menos un terpenoide producido.

Como se usa en el presente documento un precursor de pirofosfato terpeno acíclico es cualquier compuesto de pirofosfato acíclico que sea un precursor para la producción de al menos un terpeno incluyendo pero sin limitación geranil-pirofosfato (GPP), farnesil-pirofosfato (FPP) y geranilgeranil-pirofosfato (GGPP).

En una realización, el al menos un terpenoide se selecciona de sesquiterpenos. En una realización, el al menos un precursor de pirofosfato terpeno acíclico es farnesil-pirofosfato. En una realización adicional, el al menos un

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sesquiterpeno se selecciona de biciclogermacreno ((E,E)-3,7,11,11-tetrametil-biciclo[8.1.0]undeca-2,6-dieno), cubebol ((1R,4S,5R,6R,7S,10R)-7-isopropil-4,10-dimetil-triciclo[4.4.0.0(1,5)]decan-4-ol, valenceno ((+)-(1R)1,2,3,5,6,7,8,8A-octahidro-7-isopropenil-1 @,8A@-dimetilnaftaleno), α-cubebeno, germacreno D, y δ -cadineno(rel(1R,8AS)-1,2,3,5,6,8A-hexahidro-1-isopropil-4,7-dimetilnaftaleno) (Figura 2). Los terpenoides desvelados en el presente documento pueden aislarse por cualquier procedimiento usado en la técnica incluyendo pero sin limitación cromatografía, extracción y destilación.

En una realización, la distribución de productos o los productos reales formados pueden alterarse variando el pH al que la sintasa entra en contacto con el precursor de pirofosfato terpeno acíclico, tal como, por ejemplo farnesilpirofosfato. En una realización, el pH es 7. En una realización adicional el pH es menor de 7, tal como, por ejemplo, 6, 5, 4 y 3.

También se desvela en el presente documento un organismo (por ejemplo, microorganismo o planta) que se usa para construir una plataforma para producción a alto nivel de un sustrato de sesquiterpenos sintasas (por ejemplo, FPP) y la introducción de un ácido nucleico desvelado en el presente documento en el organismo. Por ejemplo, se incorpora al menos un ácido nucleico desvelado en el presente documento que codifica una sesquiterpeno sintasa en un organismo no humano que produce FPP efectuando de este modo conversión de FPP a un sesquiterpeno, y la producción metabólica posterior de sesquiterpeno. En una realización, esto da como resultado una plataforma para la producción a alto nivel de sesquiterpenos.

En una realización, los ácidos nucleicos desvelados en el presente documento se usan para crear otros ácidos nucleicos que codifican sesquiterpenos sintasas. Por ejemplo, se desvela en el presente documento un procedimiento para identificar sesquiterpenos sintasas que comprende construir una biblioteca de ADN usando los ácidos nucleicos desvelados en el presente documento, explorar la biblioteca con respecto a ácidos nucleicos que codifiquen al menos una sesquiterpeno sintasa. La biblioteca de ADN usando los ácidos nucleicos desvelados en el presente documento puede construirse por cualquier proceso conocido en la técnica en el que se crean secuencias de ADN usando los ácidos nucleicos desvelados en el presente documento como un punto de partida, incluyendo, pero sin limitación redistribución de ADN. En dicho procedimiento, la biblioteca puede explorarse con respecto a sesquiterpeno sintasas usando un ensayo funcional para encontrar un ácido nucleico diana que codifique una sesquiterpeno sintasa. La actividad de una sesquiterpeno sintasa puede analizarse usando, por ejemplo, los procedimientos descritos en el presente documento. En una realización, se utiliza exploración de alto rendimiento para analizar la actividad de los polipéptidos codificados.

Como se usa en el presente documento una “sonda nucleotídica” se define como un oligonucleótido o polinucleótido capaz de unirse con un ácido nucleico diana de secuencia complementaria mediante uno o más tipos de enlaces químicos, mediante formación de pares de bases complementarias o mediante formación de enlaces de hidrógeno. Como se ha descrito anteriormente, la sonda oligonucleotídica puede incluir bases naturales (es decir A, G, C, o T) o modificadas (7-desazaguanosina, inosina, etc.). Además, las bases en una sonda de nucleótidos pueden unirse por un enlace distinto de un enlace fosfodiéster, siempre que no eviten la hibridación. Por lo tanto, las sondas oligonucleotídicas pueden tener bases constituyentes unidas por enlaces peptídicos en lugar de enlaces fosfodiéster.

Un “ácido nucleico diana” en el presente documento se refiere a un ácido nucleico con el que puede hibridar específicamente la sonda o molécula de nucleótidos. La sonda se diseña para determinar la presencia o ausencia del ácido nucleico diana, y la cantidad de ácido nucleico diana. El ácido nucleico diana tiene una secuencia que es complementaria de la secuencia de ácido nucleico de la sonda correspondiente dirigida a la diana. Como se reconoce por un experto en la materia, la sonda también puede contener ácidos nucleicos adicionales u otros restos, tales como marcadores, que pueden no hibridar específicamente con la diana. La expresión ácido nucleico diana puede referirse a la secuencia de nucleótidos específica de un ácido nucleico mayor al que se dirige la sonda o a la secuencia general (por ejemplo, gen o ARNm). Un experto en la materia reconocerá la utilidad completa en diversas condiciones.

Además del ejemplo operativo, o cuando se indique de otro modo, todos los números que expresan cantidades de ingredientes, condiciones de reacción y así sucesivamente usados en la memoria descriptiva y reivindicaciones deben entenderse como modificados en todos los casos por el término “aproximadamente”. En consecuencia, a no ser que se indique lo contrario, los parámetros numéricos expuestos en la memoria descriptiva y reivindicaciones son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se busca obtener por la presente invención. Como mínimo, y no como un intento de limitar la aplicación de la doctrina de equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada parámetro numérico debería interpretarse a la luz del número de dígitos significativos y enfoques de redondeo ordinarios.

A pesar de que los intervalos numéricos y parámetros que exponen el amplio alcance de la invención con aproximaciones, los valores numéricos expuestos en los ejemplos específicos se presentan con tanta precisión como sea posible. Cualquier valor numérico, sin embargo, contiene inherentemente ciertos errores necesariamente resultantes de la desviación típica hallada en sus mediciones de ensayo respectivas. Se pretende que los siguientes ejemplos ilustren la divulgación sin limitar el alcance como resultado. Los porcentajes se proporcionan en peso.

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Ejemplos

Material

Una piel externa de pomelo (Citrus paradisi) se usó como material de partida para los experimentos descritos en el presente documento. La piel externa (parte coloreada externa de la piel de la fruta) contiene las glándulas oleosas que son el sitio de biosíntesis de terpenos. La piel externa del pomelo se preparó en Simone Gatto (Sicilia) a partir de frutos en maduración recién recolectado. La piel externa (3-4 mm de grosor) se cortó, se congeló inmediatamente y se mantuvo congelada durante el transporte y todas las etapas posteriores para evitar la degradación.

Ejemplo 1: Aislamiento de ADNc de sesquiterpeno sintasa usando RT-PCR

Las secuencias de aminoácidos deducidas de sesquiterpeno sintasas vegetales se alinearon para identificar regiones conservadas y diseñar oligonucleótidos específicos de sesquiterpeno sintasas vegetales. Para obtener mejor homología de secuencia, las secuencias se separaron en dos grupos (Figura 4). El primer grupo contenía las secuencias de la germacreno C sintasa de Lycopersicon esculentum cv. VFNT cherry (Colby y col, 1998), la (E)-βfarneseno sintasa de Mentha x piperita (Crock y col, 1997), la δ-selineno sintasa de Abies grandis (Steele y col, 1998), una sesquiterpeno sintasa de Citrus junos (n.º de referencia de GenBank AF288465), las 5-epi aristoloqueno sintasas de Nicotiana tabacum (Facchini y Chappell, 1992) y de Capsicum annuum (Back y col, 1998), las vetispiradieno sintasas de Solanum tuberosum y de Hyoscyamus muticus (Back y Chappel, 1995). El segundo grupo contenía secuencias de las (+)-δ-cadineno sintasas de Gossypium arboreum (Chen y col. 1995), la amorfa-4,11dieno sintasa (Mercke y col, 2000) y la epi-cedrol sintasa (Merck y col, 1999) de Artemisia annua y la γ-humuleno sintasa de Abies grandis (Steele y col, 1998). La mayor homología de secuencia se encontró en la parte central de las secuencias. Se seleccionaron tres regiones que contenían aminoácidos suficientemente conservados y se diseñaron oligonucleótidos degradados específicos para estas regiones (es decir dos cebadores directos y uno inverso se dedujeron de cada alineamiento) (Figura 4).

Se realizó RT-PCR usando ARN total de piel externa de pomelo preparada por la técnica de borato caliente y la diferente combinación de los cebadores degradados directos e inversos. El procedimiento de borato caliente para extracción de ARN total se adaptó de Wan y Wilkins (Wan y col. (1994) Anal. Biochem. 223, 7-12.). Los tejidos se trituraron hasta obtener un polvo fino en nitrógeno líquido usando un mortero. El polvo se añadió a 5 ml de tampón de extracción (borato 200 mM, EGTA 30 mM, DTT 10 mM, SDS 1 %, NA desoxicolato 1 %, PVP 2 %, nonidet NP-40 0,5 %) precalentado a 80 °C. La mezcla se homogeneizó usando un homogeneizador Ultraturax TM y se filtró a través de dos capas de filtro MiraclothTM (Calbiochem). La mezcla se incubó 90 minutos a 42 °C en presencia de proteinasa K 0,5 mg/ml (para digestión de proteína/ribonucleasa). Después se añadió KCl a una concentración final 1 M y, después de 1 hora de incubación en hielo, la mezcla se colocó en una centrífuga durante 10 min a 10.000 g y 4 °C. El sobrenadante se recuperó y se añadió 1/3 del volumen de LiCl 8 M. La mezcla se incubó durante una noche a 4 °C y se colocó en una centrífuga durante 20 minutos a 10.000 g y 4 °C.

El sobrenadante se descartó y el sedimento se lavó con LiCl 2 M y se centrifugó de nuevo como anteriormente. El sedimento se resuspendió después en agua destilada sin ARNasa y se añadieron 0,15 volúmenes de solución de acetato potásico 2 M y 2,5 volúmenes de etanol absoluto. El ARN se precipitó incubando 2 horas a -20 °C y se sedimentó mediante centrifugación como anteriormente. El sedimento de ARN se lavó con etanol al 80 % y se resuspendió en agua destilada sin ARNasa.

La concentración de ARN se estimó a partir de la DO a 260 nm. La integridad del ARN se evaluó en un gel de agarosa verificando la integridad de las bandas de ARN ribosómico.

Se realizó RT-PCR usando el kit de RT-PCR OneStep de Qiagen y un termociclador de gradiente Mastercycler Eppendorf. Las mezclas de reacción típicas contenían 10 μl de tampón RT-PCR OneStep de Qiagen 5X, 400 μM de cada dNTP, 400 nM de cada cebador, 2 μl de mezcla de enzimas de RT-PCR OneStep de Qiagen, 1 μl de inhibidor de ribonucleasa RNasin® (Promega Co.) y 1 μg de ARN total en un volumen final de 50 μl. Las condiciones del termociclador fueron: 30 min a 50 °C (transcripción inversa); 15 min a 95 °C (activación de ADN polimerasa); 40 ciclos de 45 s a 94 °C, 10 s a 42 °C hasta 45 °C (dependiendo del cebador usado), 45 s a 90 s (dependiendo del tamaño del fragmento de ADN para amplificar) a 72 °C; y 10 min a 72 °C.

El tamaño de los productos de PCR se evaluó en un gel de agarosa al 1 %. Las bandas correspondientes al tamaño esperado se escindieron del gel, se purificaron usando el kit de extracción en gel QIAquick® (Qiagen) y se clonaron en el vector pCR®2.1-TOPO usando el kit de clonación TOPO TA (Invitrogen). Se sometieron después ADNc insertados a secuenciación de ADN y la secuencia se comparó con respecto a la base de datos de proteínas no redundante de GenBank (NCBI) usando el algoritmo BLASTX (Altschul y col 1990).

El análisis por secuenciación de ADN y la búsqueda de Blast de los productos de PCR con longitud esperada (de 80 a 240 pb de tamaño) reveló fragmentos de tres sesquiterpeno sintasas diferentes, que se denominaron GFTpsA, GFtpsB y GFTpsC. El fragmento de GFTpsA de 180 pb se amplificó con los cebadores TpsVF1 y TpsVR3, el fragmento de GFtpsB de 115 pb se amplificó con los cebadores TpsVF2 y TpsVR3, y el fragmento de GFTpsA de 115 pb se amplificó con los cebadores TpsVF1 y TpsVR3. Las secuencias de aminoácidos deducidas revelaron diferencias significativas entre estos tres fragmentos (Figura 5).

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Ejemplo 2: Aislamiento de ADNc de sesquiterpeno sintasa usando 5’/3’-RACE

Para aislar las secuencias de longitud completa de las sesquiterpeno sintasas, se usó en primer lugar un enfoque de 5’/3’-RACE. Se sintetizó ADNc usando kit de amplificación de ADNc Marathon™ (Clontech) y partiendo de 1 μg de ARNm purificado a partir de ARN total preparado con la técnica de borato caliente. La calidad del ADNc sintetizado era escasa, esencialmente se obtuvieron ADNc de tamaño pequeño (tamaño promedio de 0,5 Kb). Sin embargo, usando este ADNc, se obtuvo el extremo 3’ de los GFTpsB y GFTpsC usando los cebadores específicos de genes GFTpsBRF1 y GFTpsBRF2 para GFTpsB y los cebadores específicos de genes GFTpsCRF1 y GFTpsCRF2 para GFTpsC (véase Tabla 1). El ARNm preparado por el procedimiento de extracción de tiocianato de guanidinio/fenol proporcionó ADNc de mayor calidad con un tamaño promedio de 2 Kb y permitió el aislamiento de la secuencia del extremo 5’ de GFTpsC usando los cebadores específicos de genes GFTpsCRR1 y GFTpsRR2 (véase Tabla 1), completando la secuencia de longitud completa de este clon. El extremo 5’ de GFTpsB y el extremo 5’ y extremo 3’ de GFTpsA no pudieron obtenerse por este enfoque.

El procedimiento de extracción de tiocianato de guanidinio /fenol se basa en la técnica descrita por Chomczynski y Sacchi usando la solución RNAClean™ de ThermoHybaid (Chomczynski, P., y Sacchi, N., (1987) Anal. Biochem. 162, 156-159.). Brevemente, se trituraron 2 g de tejidos congelados hasta obtener un polvo fino en nitrógeno líquido usando un mortero. El polvo se transfirió a 20 ml de solución RNAClean™ y la suspensión se homogeneizó usando un homogeneizador Ultraturax™ y se filtró a través de un filtro Miracloth™ (Calbiochem). Después de la adición de 0,1 volúmenes de cloroformo, el tubo se colocó en hielo y se centrifugó durante 20 min a 12.000 g y 4 °C. La fase acuosa superior se recuperó y se añadió un volumen de isopropanol.

Después de 20 min de incubación a -20 °C, la muestra se centrifugó durante 20 min. a 12.000 g y 4 °C. El sedimento blanco grande obtenido se lavó con etanol 70 % y se secó a temperatura ambiente. Este sedimento, que contenía el ARN total, se sometió inmediatamente a purificación de ARNm mediante cromatografía de afinidad de oligodTcelulosa usando el kit de aislamiento de ARNm FastTrack® 2.0 (Invitrogen). Se siguió el protocolo del fabricante excepto que después de la resuspensión de ARN total en el tampón de lisis, la muestra se calentó a 100 °C en lugar de a 65 °C.

Se realizó amplificación rápida 3’ y 5’ de los extremos de ADNc (RACE) usando el kit de amplificación de ADNc Marathon™ (Clontech). El procedimiento comenzó con síntesis de ADNc de primera cadena partiendo de ARNm usando un cebador oligo(dT). Después de síntesis de segunda cadena, se ligaron adaptadores específicos a los extremos de ADNc bicatenario (ADNc bc). Este procedimiento proporciona una biblioteca no clonada de ADNc bc ligado a adaptadores. Se usó ARNm de pomelo purificado (1 μg) como material de partida. La calidad y cantidad de ADNc se evaluó en un gel de agarosa.

El extremo 3’ o 5’ de los ADNc específicos se amplificó con mezcla de polimerasa Advantage® 2 usando una combinación de oligonucleótidos específicos de gen y adaptador. Las mezclas de reacción RACE típicas contenían, en un volumen final de 50 μl, 5 μl de tampón de reacción de PCR de ADNc 10X (clontech), 200 nM de cada dNTP, 1 μl de mezcla de polimerasa Advantage® 2, cebador específico de adaptador 200 μM (Clontech), cebador específico de gen 200 μM (véase Tabla 1) y 5 μl de ADNc ligado a adaptador diluido de 50 a 250 veces. Se realizó amplificación en un termociclador de gradiente Mastercycler Eppendorf. Las condiciones de termociclación fueron las siguientes: 1min a 94 °C, 5 ciclos de 30 s a 94°C y de 2 a 4min a 72°C, 5 ciclos de 30 s a 94 °C y de 2 a 4min a 70 °C, 20 ciclos de 30 s a 94 °C y de 2 a 4 min a 68 °C. Cuando fue necesario se realizó un segundo ciclo de amplificación usando un cebador específico de adaptador anidado (Clontech) y un cebador específico de gen anidado.

Los productos de amplificación se evaluaron, se subclonaron y la secuencia se analizó como anteriormente con respecto a los productos de RT-PCR.

TABLA 1: Los siguientes cebadores se usaron en los experimentos de 3’/5’-RACE 5

Nombre

Descripción Secuencia (5’ a 3’).

GFTpsARF1 (SEQ ID NO: 34)

Cebador directo de 3’-RACE. CTGGGAGTGTCCTATGAGCT CAATTTGG

GFTpsARF2 (SEQ ID NO: 35)

Cebador anidado directo de 3’-RACE GFTpsA. GTAGAATTTTTGCATCCAAAG TGGTGTGC

GFTpsARR1 (SEQ ID NO: 36)

Cebador inverso de 5’-RACE GFTpsA. CACACCACTTTGGATGCAAA AATTCATC

GFTpsARR2 (SEQ ID NO: 37)

Cebador inverso anidado de 5’-RACE GFTpsA. CCAAATTGGGCTCATAGGAC ACTCCCAG

GFTpsBRF1 (SEQ ID NO: 38)

Cebador directo de 3’-RACE GFTpsB. TAGGGACGTATTTTGAACCA AAGTAC

GFTpsBRF2 (SEQ ID NO: 39)

Cebador anidado directo de 3’-RACE GFTpsB. AAATAATGACCAAAACAATTT ACACGG

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(continuación)

Nombre

Descripción Secuencia (5’ a 3’).

GFTpsBRR1 (SEQ ID NO: 40)

Cebador inverso de 5’-RACE GFTpsB. GCACTTTCATGTATTCTGGAA G

GFTpsBRR2 (SEQ ID NO: 41)

Cebador inverso anidado de 5’-RACE GFTpsB. GTTTGAGCTCTTCAAAGAAA CC

GFTpsCRF1 (SEQ ID NO: 42)

Cebador directo de 3’-RACE GFTpsC. AATGGGAGTGTATTTTGAGC CTCGATACTCC

GFTpsCRF2 (SEQ ID NO: 43)

Cebador anidado directo de 3’-RACE GFTpsC. GATATTTTCCAAAGTAATTGC AATGGCATCC

GFTpsCRR1 (SEQ ID NO: 44)

Cebador inverso de 5’-RACE GFTpsC. GTTGCTAATATCCCACCTTTT GATAGC

GFTpsCRR2 (SEQ ID NO: 45)

Cebador inverso anidado de 5’-RACE GFTpsC. AAGTGTGCCATAGGCGTCGT AGG

GFTpsDRR1 (SEQ ID NO: 46)

Cebador inverso de 5’-RACE GFTpsD. CTGTTCCGCAAGCTTAGGGG TTACATG

GFTpsDRR2 (SEQ ID NO: 47)

Cebador inverso anidado de 5’-RACE GFTpsD. CTGAGCTACCAATGACTTCA GGTGAGTGG

GFTpsERR1 (SEQ ID NO: 48)

Cebador inverso de 5’-RACE GFTpsE. CAATTTTGCCATACACATCAT AGATATCATC

GFTpsERR2 (SEQ ID NO: 49)

Cebador inverso anidado de 5’-RACE GFTpsE. AACAGAAGTCATGGAGATCA CTTTCGTC

GFTpsERR3 (SEQ ID NO: 50)

Cebador inverso de 5’-RACE GFTpsE. CGCAAGAGATGTTTTAAAGTT CCCATCC

GFTpsERR4 (SEQ ID NO: 51)

Cebador inverso anidado de 5’-RACE GFTpsE. TGAACATCAGCGGAAATTTTA TAGCC

El ADNc parcial de GFTpsB obtenido mediante 3’-RACE reveló alta identidad de secuencia con un ADNc de terpeno sintasa potencial hallado en las bases de datos públicas (n.º de referencia de GeneBank AF288465) y aislado de Citrus junos. Se diseñaron cebadores específicos para la secuencia de esta terpeno sintasa: un par de cebadores directos e inversos (junosF1 y junosR1) diseñados contra la región no codificante de la terpeno sintasa de C. junos y un par de cebadores directo e inverso (junosF2 y junos R2) diseñados en la región codificante incluyendo los codones de inicio y terminación. La PCR en la biblioteca de ADNc Marathon™ de pomelo usando los cebadores junosF1 y junosR1 no produjo amplicón. Usando los cebadores junosF2 y junosR2 se amplificó un fragmento de 1,6 Kb. La secuenciación de ADN confirmó que este producto de PCR era una sesquiterpeno sintasa de longitud completa de 1669 pb del clon GFTpsB (Figura 6).

Ejemplo 3: Exploración de biblioteca de ADNc y secuenciación de EST

Para obtener el ADNc de longitud completa de los clones parciales obtenidos por el enfoque de PCR, se construyó una biblioteca de ADNc preparada a partir de ARNm de piel externa del pomelo.

Se realizó construcción de biblioteca y síntesis de ADNc usando el kit de construcción de biblioteca Uni-ZAP® XR (Stratagene) de acuerdo con el protocolo del fabricante partiendo de 7,5 μg de ARNm de piel externa del pomelo (preparado por el procedimiento de tiocianato de guanidinio/fenol). El título original de la biblioteca fue de 2x107 UFP (unidades formadoras de placas) y el tamaño de inserto promedio fue de 1,1 Kb.

Se usaron dos enfoques para aislar ADNc que codificaban sesquiterpeno sintasas de la biblioteca de ADNc: secuenciación de EST y exploración usando una sonda de ADN. Para secuenciación de EST (marcador de secuencia expresado), se usó una fracción de la biblioteca para escindir el fagémido pBluescript del vector Uni-ZAP XR de acuerdo con el protocolo de escisión de masa de Stratagene. Se seleccionaron aleatoriamente colonias bacterianas transformadas resultantes (576) y el plásmido se purificó. Se realizó una reacción de secuenciación para cada clon usando el cebador T3. Las secuencias se editaron en primer lugar para retirar las secuencias de vector y se compararon con la base de datos de proteínas no redundante de GenBank (NCBI) usando el algoritmo BLASTX (Altschul y col 1990).

La biblioteca se exploró con sondas de ADN marcadas con digoxigenina (DIG). Las sondas se sintetizaron mediante incorporación de DIG-dUTP en un fragmento de ADN mediante PCR usando el kit de síntesis de sondas PCR DIG (digoxigenina) (Roche Diagnostics). Se amplificó una sonda de ADN derivada de GFTpsA de 149 pb de una alícuota de la biblioteca usando el cebador directo GFTpsAproF (SEQ ID NO: 52) (5’-ACGATTTAGGCTTCCCTAAAAAGG-3’) y el cebador inverso GFTpsAproR (SEQ ID NO: 53) (5’-TATTATGGAATATTATGCACACCAC-3’). Se amplificó una sonda derivada de GFTpsB de 1036 pb del plásmido pET-GFTpsB2-2 usando el cebador directo junosF2 (SEQ ID NO: 54) (5’-AAATGTCCGCTCAAGTTCTAGCAACGG-3’) y el cebador inverso GFTpsBRR2 (SEQ ID NO: 41). Se amplificó una sonda de ADN derivada de GFTpsC de 1008 pb a partir del plásmido pET-GFTpsC usando el cebador directo GFTpsCpetF1 (SEQ ID NO: 55) (5’-ATGGCACTTCAAGATTCAGAAGTTCC-3’) y el cebador inverso

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GFTpsCRR1 (SEQ ID NO: 44).

Las sondas se hibridaron con transferencias de placas, preparadas a partir de placas que contenían de 5.000 a

25.000 UFP, a 40 °C en solución de hibridación Dig Easy Hyb (Roche Diagnostics). La detección de los híbridos de sonda-diana de las membranas se realizó mediante quimioluminiscencia usando alcalina fosfatasa antidigoxigenina (Roche Diagnostics) y sustrato de fosfato alcalino CDP-Star (Roche Diagnostics), y la visualización se realizó en un sistema de captura de imágenes VersaDoc (BioRad).

Se extrajeron fagos de señales positivas de las placas de agar y se sometieron a exploración secundaria y si fuera necesario terciaria para conseguir señales positivas de placas individuales. Los aislados positivos se escindieron in vivo y el inserto se secuenció como se ha descrito anteriormente.

La biblioteca se exploró usando sondas de ADN preparadas a partir de GFTpsA, GFTpsB y GFTpsC. Este enfoque produjo tres ADNc de sesquiterpeno sintasa diferentes. Dos de ellos eran clones previamente hallados: un clon, denominado GF2-30-1, era una forma truncada de 300 pb de extremo 5’ del ADNc de GFTpsC; el segundo clon, denominado 9-13-6, era un clon parcial de GFtpsA que estaba truncado en su extremo 5’ en aproximadamente 168 pb como se valoró por comparación con otras sesquiterpeno sintasas. El clon 9-13-6 proporcionó información de secuencia 5’ adicional de 618 pb en comparación con el clon de GFTpsA parcial anteriormente mencionado obtenido mediante RT-PCR. En su extremo 3’, el clon 9-13-6 también estaba incompleto. Faltaban aproximadamente 680 nucleótidos y se reemplazaron por un fragmento de 600 pb sin función definida. El tercer ADNc que codificaba sesquiterpeno sintasa obtenido por exploración, GF2-5-11, codificaba una nueva sesquiterpeno sintasa que se denominó GFTpsD. Este clon estaba truncado en el extremo 5’, pero los 414 pb ausentes se recuperaron mediante 5’-RACE usando los cebadores descritos en la Tabla 1. El GFTpsD de longitud completa se amplificó después a partir de la biblioteca de ADNc Marathon™ y se clonó en el vector de expresión bacteriana como se ha descrito anteriormente.

El análisis de la secuencia de ADN de varios ADNc de GFTpsD de longitud completa reveló que estaban presentes dos sesquiterpeno sintasas estrechamente relacionadas con diferencias de secuencia menores, se denominaron GFTpsD1 y GFTpsD2 (Figura 6). La secuencia de aminoácidos deducida de estas dos variantes difirió entre sí en cuatro restos.

Para el enfoque de secuenciación de EST, se secuenciaron 576 clones. Entre ellos, solamente tres clones codificaban proteínas de tipo terpeno-sintasas potenciales y, más exactamente, dos proteínas diferentes de tipo sesquiterpeno sintasa y una de tipo monoterpeno sintasa. Uno de los dos clones de tipo sesquiterpeno sintasa (clon GF002-G3) era el clon previamente identificado GFTpsD1. El segundo (clon GF006-G7) era un ADNc truncado que codificaba una nueva sesquiterpeno sintasa que se denominó GFTpsE. Este clon estaba de nuevo truncado en el extremo 5’ (en aproximadamente 800 pb) y el fragmento ausente podría amplificarse mediante 5’-RACE en dos estadios de la siguiente manera. Un primer 5’-RACE usando los cebadores GFTpsERR1 y GFTpsERR2 (véase Tabla 1) proporcionó 500 nucleótidos del extremo 5’ adicionales y un segundo 5’RACE usando los cebadores GFTpsERR3 y GFTpsERR4 (véase Tabla 1) proporcionó la secuencia de ADN del extremo 5’ ausente para reconstituir el ADNc de GFTpsE de longitud completa (Figura 6).

Ejemplo 4: Construcción de plásmidos y expresión de enzimas

Construcción de plásmidos de expresión

El ADNc se subclonó en el plásmido de expresión pET11a (Novagen) para expresión funcional de las sesquiterpeno sintasas. Para GFTpsB, GFtpsD y GFTpsE, los ADNc de longitud completa se amplificaron mediante PCR para introducir un sitio Ndel en el extremo 5’ incluyendo el codón de inicio y un sitio BamHI en el extremo 3’ inmediatamente después del codón de terminación. Para GFTpsB, se usaron el cebador directo GFTpsBNdel (SEQ ID NO: 56) 5’-GCATGTTCCATATGTCCGCTCAAGTTCTAGCAACGGTTTCC-3’ (sitio Ndel en cursiva, codón de inicio subrayado) y el cebador inverso GFTpsBBam (SEQ ID NO: 57) 5’-CGCGGATCCTCAGATGGTAACAGGGTCTCTGAGCACTGC-3’ (sitio BamHI en cursiva, codón de terminación subrayado). De la misma manera, se usaron el cebador directo GFTpsDNdel (SEQ ID NO: 58) 5’-GCATGTTCCATATGTCGTCTGGAGAAACATTTCGTCC-3’ y el cebador inverso GFTpsDBam (SEQ ID NO: 59) 5’-CGCGGATCCTCAAAATGGAACGTGGTCTCCTAG-3’ para GFTpsD y se usaron el cebador directo GFTpsENdel (SEQ ID NO: 60) 5’-GCATGTTCCATATGTCTTTGGAAGTTTCAGCCTCTCCTG-3’ y el cebador inverso GFTpsEBam (SEQ ID NO: 61) 5’-CGCGGATCCTCATATCGGCACAGGATTAATAAACAAAGAAGC-3’ para GFTpsE.

Las amplificaciones se realizaron usando la ADN polimerasa Pfu (Promega) en un volumen final de 50 μl que contenía 5 μl de ADN polimerasa Pfu tampón 10X, 200 μM de cada dNTP, 0,4 μM de cada cebador directo e inverso, 2,9 unidades de ADN polimerasa Pfu y 5 μl de ADNc diluido 100 veces (preparado como se ha descrito anteriormente usando el kit de amplificación de ADNc Marathon™ (Clontech)). Las condiciones de termociclación fueron las siguientes: 2min a 95°C; 25 ciclos de 30s a 95°C, 30s a 55°C y 4min a 72°C; y 10min a 72°C. El producto de PCR se purificó en un gel de agarosa, se diluyó usando el kit de extracción en gel QIAquick® (Qiagen), se digirió con Ndel y BamHI y se ligó en el plásmido pET11a digerido de forma similar.

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Para construcción del vector de expresión GFTpsC-pET11, se emplearon dos PCR separadas para generar el inserto flanqueado con los extremos cohesivos Ndel y BamHI. Se realizó una primera PCR en la misma condición que se ha descrito anteriormente, usando el cebador directo GFTpsCpETF1 (SEQ ID NO: 62) 5’-TAATGGCACTTCAAGATTCAGAAGTTCCTC-3’ y el cebador inverso GFTpsCpETR1 (SEQ ID NO: 63) 5’-AAAAGGGAACAGGCTTCTCAAGCAATG-3’ y se realizó una segunda PCR usando el cebador directo GFTpsCpETF2 (acortado por AT en el extremo 5’ en comparación con GFTpsCpETF1) (SEQ ID NO: 64) 5’-ATGGCACTTCAAGATTCAGAAGTTCCTC-3’ y el cebador inverso GFTpsCpETR2 (extendido por GATC en el extremo 5' en comparación con GFTpsCpETRI) (SEQ ID NO: 65) 5'-GATCAAAAGGGAACAGGCTTCTCAAGCAATG-3'. Los dos productos de PCR se purificaron como se ha descrito ante, se combinaron, se desnaturalizaron mediante hervido de 5 min y se enfriaron 5 min en hielo. El ADNc resultante se usó directamente para ligamiento en el plásmido pET11 a.

Los productos de ligamientos se transformaron inicialmente en células E. coli JM109 y las construcciones se verificaron mediante digestión de restricción y secuenciación de ADN.

Expresión de sesquiterpeno sintasas

Para expresión de proteínas, los plásmidos pET11 a que contenían los ADNc de sesquiterpeno sintasa así como el plásmido pET11 a vacío se transformaron en las células E. coli BL21 (DE3) (Novagen). Se usaron colonias individuales para inocular 5 ml de medio LB. Después de 5 a 6 horas de incubación a 37 °C, los cultivos se transfirieron a un incubador a 20 °C y se dejaron durante 1 h para equilibrado. Después se indujo la expresión de la proteína mediante la adición de IPTG 0,5 mM y el cultivo se incubó durante una noche a 20 °C.

Al día siguiente, las células se recogieron por centrifugación, se resuspendieron en 0,5 ml de tampón de extracción (MOPSO 50 mM pH 7, EDTA 5 mM, EDTA 5 mM, glicerol 10 %) y se sonicó 3 veces durante 30 s. Los residuos celulares se sedimentaron por centrifugación durante 30 min a 18.000 g y el sobrenadante que contenía las proteínas solubles se recuperó. La expresión de las sesquiterpeno sintasas se evaluó mediante separación del extracto proteico en un SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida SDS) y se tiñó con azul de coomassie y comparación con el extracto de proteína obtenido de células transformadas con el plásmido vacío.

Se observó una banda definida con el peso molecular calculado esperado para todas las construcciones y la banda no estaba presente en las proteínas solubles de E. coli transformadas con el plásmido vacío.

Ejemplo 5: ensayo de función enzimática

Los ensayos enzimáticos se realizaron en tubos de vidrio sellados usando de 50 a 100 μl de extracto proteico en un volumen final de tampón de extracción complementado con MgCl2 15 mM y FPP de 100 a 250 μM (Sigma). El medio se superpuso con 1 ml de pentano y los tubos se incubaron durante una noche a 30 °C. La fase de pentano, que contenía los sesquiterpenos, se recuperó y el extracto de medio con un segundo volumen de pentano. Las fracciones de pentano combinadas se concentraron con nitrógeno y se analizaron mediante cromatografía de gases en un sistema GC de serie 6890 de Hewlett-Packard usando un diámetro interno de 0,25 mm mediante columna capilar SPB-1 de 30 m (Supelco). El gas transportador era He a flujo constante de 1,6 ml/min. Se realizó inyección a una relación de división de 2:1 con la temperatura de inyector establecida en 200 °C y el horno programado de 80 °C (0 min de mantenimiento) a 7,5 °C/min hasta 200 °C (0 min de mantenimiento) seguido de 20 °C/min hasta 280 °C (2 min de mantenimiento). Se realizó detección con un detector de ionización de llama. La identificación de compuestos se basó en la identidad del tiempo de retención con patrones auténticos cuando estén disponibles. Para confirmación de las identidades de productos, se analizaron muestras mediante GC-MS capilar combinada usando un sistema detector selectivo de masas cuadripolo GC 6890 de Hewlett-Packard, equipado con un diámetro interno de 0,25 mm por una columna capilar de SPB-1 de 30 m (Supelco). El horno se programó de 80 °C (0 min de mantenimiento) a 280 °C a 7,5 °C a un flujo constante de 1,5 ml/min de He. Los espectros se registraron a 70 eV con una tensión multiplicadora de electrones de 2.200 V.

La actividad enzimática de las diferentes enzimas recombinantes se evaluó en este ensayo usando la fracción de proteína soluble y farnesil-difosfato como sustrato. La actividad sesquiterpeno sintasa se obtuvo para todos los clones ensayados y los productos formados se caracterizaron por tiempo de retención y GC-MS (Figura 7).

El ADNc de GFTpsB codificó una sesquiterpeno sintasa que producía biciclo-germacreno (Figura 3) como un producto principal en al menos 15 olefinas de sesquiterpeno menores o sesquiterpenos oxigenados tales como delta-cadineno (Figura 3) (biciclo-elemeno (Figura 3), resultante del reordenamiento por calor de biciclo-germacreno también se observó en la traza de GC). El ADNc de GFTpsC codificaba un producto múltiple que formaba sesquiterpeno sintasa identificándose un producto importante como cubebol (Figura 3). La enzima también produjo 3 sesquiterpenos adicionales en una proporción relativamente grande, (-)-α-cubebeno y sesquiterpenos 2 oxigenados y en cantidades pequeñas, al menos 11 olefinas de sesquiterpeno o sesquiterpenos oxigenados. GFtpsD codificaba una sesquiterpeno sintasa que produce valenceno como un producto importante. Se identificaron también otros diez picos menores como olefinas de sesquiterpeno o alcoholes. Entre ellos, β-elemeno es un producto de degradación por calor de germacreno A. GFTpsE codificaba una sesquiterpeno sintasa produciendo una mezcla compleja de compuestos de sesquiterpeno siendo δ-cadineno (Figura 3) ligeramente la más abundante. También se identificaron

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