ES2453192T3

ES2453192T3 - Procedimiento de producción de beta-santaleno

Info

Publication number: ES2453192T3
Application number: ES09793603.3T
Authority: ES
Inventors: Michel Schalk
Original assignee: Firmenich SA
Current assignee: Firmenich SA
Priority date: 2008-12-11
Filing date: 2009-12-09
Publication date: 2014-04-04
Anticipated expiration: 2029-12-09
Also published as: PL2772543T3; US9777293B2; BRPI0922490A2; CN104004789A; AU2009325879A1; CN104004789B; US20110281257A1; HUE033145T2; BRPI0922490B1; EP2376643A1; CN102245778B; EP2772543A1; CN102245778A; EP3241906A1; EP2376643B1; US8877461B2; ES2626456T3; WO2010067309A1; US20180105837A1; US10253335B2

Abstract

Un procedimiento de producción de ß-santaleno que comprende a) poner en contacto FPP con al menos un polipéptido con una actividad ß-santaleno sintasa y que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a SEC ID N.º: 1 o 3; b) opcionalmente, aislar el ß-santaleno producido en la etapa a).

Description

Procedimiento de producción de beta-santaleno

Campo técnico

La presente invención proporciona un procedimiento de producción de ß-santaleno, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto al menos un polipéptido con pirofosfato de farnesilo (FPP). En particular, dicho procedimiento se puede llevar a cabo in vitro o in vivo para producir ß-santaleno, un compuesto muy útil en los campos de la perfumería y la aromatización. La presente invención también proporciona la secuencia de aminoácidos de un polipéptido útil en el procedimiento de la invención. Un ácido nucleico que codifica el polipéptido de la invención y un vector de expresión que contiene dicho ácido nucleico son también parte de la presente invención. Un organismo huésped no humano de una célula transformada para usarse en el procedimiento de producción de ß-santaleno es también un objeto de la presente invención. El polipéptido de la invención comprende una secuencia aminoacídica idéntica a SEC ID N.º: 1 o 3 y el ácido nucleico de la invención codifica dicho polipéptido.

Técnica anterior

Se encuentran terpenos en la mayoría de los organismos (microorganismos, animales y plantas). Estos compuestos están compuestos de cinco unidades de carbono llamadas unidades de isopreno y se clasifican por el número de estas unidades presentes en su estructura. Así, los monoterpenos, los sesquiterpenos y los diterpenos son terpenos que contienen 10, 15 y 20 átomos de carbono respectivamente. Los sesquiterpenos, por ejemplo, se encuentran ampliamente en el reino vegetal. Muchas moléculas de sesquiterpenos se conocen por sus propiedades de aroma y fragancia y sus efectos cosméticos, medicinales y antimicrobianos. Se han identificado por encima de 300 hidrocarburos sesquiterpenos y por encima de 3000 sesquiterpenoides (Joulain, D. y König, W.A., The Atlas of Spectral Data of Sesquiterpene Hydrocarbons, EB Verlag, Hamburgo, 1998; Connolly, J.D., Hill R.A., Dictionary of Terpenoids, vol. 1, Chapman and Hall (editor), 1991) y se identifican cada año muchas estructuras nuevas. Los extractos vegetales obtenidos por medios diferentes tales como destilación de vapor o extracción de disolventes se usan como fuente de terpenos. Las moléculas de terpenos se usan a menudo como tales, pero en algunos casos las reacciones químicas se usan para transformar los terpenos en otras moléculas de valor alto.

La producción biosintética de terpenos implica enzimas llamadas terpeno sintasas. Hay virtualmente una infinidad de sesquiterpeno sintasas presentes en el reino vegetal, usando todas el mismo sustrato (pirofosfato de farnesilo, FPP) pero que tienen perfiles de producto diferentes. Los genes y ADNc que codifican sintasas de sesquiterpenos se han clonado y sus las enzimas recombinantes correspondientes se han caracterizado. La biosíntesis de terpenos en plantas y otros organismos se ha estudiado exhaustivamente y no se detalla adicionalmente aquí, pero se hace referencia a Dewick, Nat. Prod. Rep., 2002, 19, 181-222, que revisa el estado de la técnica de las rutas de biosíntesis de terpenos.

ß-santaleno es una molécula de sesquiterpeno que se da en la naturaleza que se puede usar como material de partida para la síntesis química o para la biosíntesis de ß-santalol (como se representa en la figura 2B), que es un constituyente principal de aceite de sándalo. El aceite de sándalo es un ingrediente de perfumería importante que se obtiene por destilación del duramen de las especies de Santalum. El sándalo se usa también grandemente para inciensos y medicina tradicional. El aceite contiene 90 % de alcoholes de sesquiterpenos. Entre los diferentes isómeros de santalol, ß-santalol es el principal contribuyente para el típico olor dulce-leñoso y balsámico de aceite de sándalo. Otros constituyentes tales como epi-ß-santalol y a-santalol pueden contribuir también a la nota de sándalo.

En general, el precio y la disponibilidad de los extractos naturales de plantas son dependientes de la abundancia, producción de aceite y origen geográfico de las plantas. Además, la disponibilidad y calidad de los extractos naturales es muy mucho dependiente del clima y de otras condiciones locales que conducen a variabilidad de año en año, volviendo el uso de tales ingredientes en perfumería de alta calidad muy difícil o incluso imposible algunos años. Debido a la sobreexplotación de los recursos naturales, las dificultades de cultivo, el crecimiento lento de las plantas de Santalum, las disponibilidades de materia prima de sándalo han disminuido radicalmente durante las pasadas décadas. Por lo tanto, sería una ventaja proporcionar una fuente de ß-santalol, que esté menos sujeta a fluctuaciones en disponibilidad y calidad. Una síntesis química de los constituyentes sesquiterpenos de sándalo hasta el momento no está disponible. Una ruta bioquímica que conduce a la síntesis de ß-santaleno, que podría usarse después para producir ß-santalol, sería por lo tanto de gran interés.

El santaleno tipo sesquiterpeno y particularmente sesquiterpenos con el esqueleto de ß-santaleno, se identificaron en varias especies de plantas. Empero, no se ha descrito aún ninguna sesquiterpeno sintasa capaz de producir ß-santaleno.

Una sesquiterpeno sintasa capaz de sintetizar al menos un sesquiterpeno bicíclico y/o tricíclico que tiene un esqueleto de carbono de santaleno, el ácido nucleico correspondiente y un procedimiento de producción tal compuesto que tiene un esqueleto de carbono de santaleno se divulga en la solicitud de patente internacional WO 2006/134523. No obstante, no se detectó ninguna traza de ß-santaleno como producto de las sesquiterpeno sintasas divulgadas en los ejemplos. El único producto con un esqueleto de santaleno fue epi-beta-santaleno. Las propiedades de epi-beta-santaleno son muy diferentes de aquellas de ß-santaleno. En particular, no es de interés la síntesis de

ß-santalol. Además, la sesquiterpeno sintasa divulgada en el documento WO 2006/134523 comparte solo el 27 % de identidad con la secuencia de la invención.

El porcentaje de identidad entre sintasas de sesquiterpenos conocido a partir de las bases de datos y los polipéptidos de la invención es muy bajo. La secuencia de proteínas más cercana a la ß-santaleno sintasa de la invención es una monoterpeno sintasa de Santalum album (n.º de acceso ACF24767; Jones, C.G., Keeling, C.I., Ghisalberti, E.L., Barbour, E.L., Plummer, J.A. y Bohlmann, J. Arch. Biochem. Biophys., 2008, 477(1), 121-130) que comparte identidad de secuencia de aminoácidos del 58 % con la ß-santaleno sintasa de la invención. Cuando se puso en contacto con FPP, esta enzima produce por encima del 90 % de ß-bisaboleno y no se forma ningún isómero de santaleno. Un documento publicado de forma reciente, WO 2011/000026 (6 de enero de 2011), divulga secuencias de santaleno sintasa muy similares.

Además de las diferencias entre las propias secuencias, también ha de indicarse que la estructura y las propiedades de los productos sintetizados por la enzima mencionada anteriormente son muy diferentes de aquellas del sesquiterpeno ß-santaleno. En particular, los monoterpenos producidos por esta enzima, es decir alfa-terpineol, limoneno, geraniol, mirceno, linalool y algunos otros productos secundarios no son adecuados como un material de partida para la síntesis de ß-santalol, que es un ingrediente muy útil en el campo de la perfumería.

A pesar de estudios exhaustivos de ciclación de terpenos, el aislamiento y la caracterización de las terpeno sintasas aún es difícil, en particular en plantas, debido a su baja abundancia, sus patrones de expresión a menudo transitorios y la complejidad de purificarlos a partir de las mezclas de resinas y de los compuestos fenólicos en tejidos donde se expresan.

Es un objetivo de la presente invención proporcionar procedimientos para fabricar ß-santaleno en una ruta económica, como se indica anteriormente. De acuerdo con ello, la presente invención tiene el objetivo de producir ß-santaleno teniendo mientras pocos desechos, un procedimiento más eficiente en lo que respecta a energía y recursos y que reduzca mientras la dependencia de los combustibles fósiles, Es un objetivo adicional proporcionar enzimas capaces de sintetizar ß-santaleno, que es útil como ingrediente de perfumería y/o de aromas.

Abreviaturas usadas

ACC: ácido 1-aminociclopropanocarboxílico

pb: par de bases

kb: kilobase

BSA: seroalbúmina bovina

2,4D: ácido 2,4-diclorofenoxiacético

ADN: ácido desoxirribonucleico

ADNc: ADN complementario

dNTP: desoxinucleotido trifosfato

DTT: ditiotreitol

EDTA: ácido etilendiaminatetraacético

FPP: pirofosfato de farnesilo

CG: cromatografía de gases

IPTG: isopropil-D-tiogalacto-piranósido

Kin: cinetina

LB: caldo de lisogenia

EM: espectrómetro de masas

PCR: reacción en cadena de la polimerasa

RMCE: intercambio de casetes mediado por recombinasa

3'-/5'-RACE amplificación rápida de ADNc en 3' y en 5' ARN ácido ribonucleico

ARNm ácido ribonucleico mensajero

ARNsa Ribonucleasa

Descripción de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento de producción de biosintéticamente ß-santaleno en un modo económico, fiable y reproducible, usando un polipéptido que tiene una actividad ß-santaleno sintasa. La presente invención es particularmente útil debido a que no se conoce en la técnica anterior nada de tal polipéptido y debido a que no se ha descrito tal biosíntesis de ß-santaleno. Esto resuelve el muy importante problema del suministro de ß-santaleno, un compuesto que es muy útil para la industria de la perfumería. La presente invención también proporciona una secuencia de ácidos nucleicos que codifica los polipéptidos usados en el procedimiento de la invención, que está así íntimamente ligada a dicho polipéptido. El polipéptido y el ácido nucleico son herramientas muy importantes, que son ambas necesarias para llevar a cabo el procedimiento de la invención. Lo mismo es cierto para vectores y para organismos modificados con el ácido nucleico de la invención para expresar heterólogamente el polipéptido de la invención.

Una "sesquiterpeno sintasa" o un "polipéptido que tiene una actividad sesquiterpeno sintasa" se desea para el propósito de la presente aplicación como un polipéptido capaz de catalizar la síntesis de una molécula de sesquiterpeno o de una mezcla de moléculas de sesquiterpenos a partir del precursor de terpeno acíclico FPP.

Como una "ß-santaleno sintasa" o como un "polipéptido que tiene una actividad ß-santaleno sintasa", los autores de la presente invención quieren decir aquí un polipéptido capaz de catalizar la síntesis de ß-santaleno, en forma de cualquiera de sus estereoisómeros o de una mezcla de ellos, comenzando a partir de FPP. ß-santaleno puede ser el único producto o puede ser parte de una mezcla de sesquiterpenos. ß-santaleno se define por su estructura, como se representa en la Figura 2A.

La capacidad de un polipéptido para catalizar la síntesis de un sesquiterpeno en particular (por ejemplo ß-santaleno) se puede confirmar simplemente llevando a cabo el ensayo enzimático como se detalla en el Ejemplo 3.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias peptídicas o nucleotídicas es una función del número de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son idénticos en las dos secuencias cuando un alineamiento de estas dos secuencias se ha generado. Los residuos idénticos se definen como el mismo en las dos secuencias en una posición dada del alineamiento. El porcentaje de identidad de secuencia, como se usa en el presente documento, se calcula a partir del alineamiento óptimo tomando el número de residuos idénticos entre dos secuencias dividiéndolo por el número total de residuos en la secuencia más corta y multiplicando por 100. El alineamiento óptimo es el alineamiento en el que el porcentaje de identidad es el más alto posible. Se pueden introducir huecos dentro de una o dentro de ambas secuencias en una o más posiciones del alineamiento para obtener el alineamiento óptimo. Estos huecos se toman después en cuenta como residuos no idénticos para el cálculo del porcentaje de identidad de secuencia.

El alineamiento para el propósito de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos se puede lograr en distintas maneras usando programas de ordenador y por ejemplo programas de ordenador disponibles públicamente en la red mundial. Preferentemente, el programa BLAST (Tatiana y cols., FEMS Microbio/Lett., 1999, 174: 247-250, 1999) ajustado a los parámetros por defecto, disponible a partir del National Center for Biotechnology Information (NCBI) en http://www.nc-bi.nlm.nih.gov/BLAST/b12seq/wblast2.cgi, se puede usar para obtener un alineamiento óptimo de las secuencias de nucleótidos y para calcular el porcentaje de identidad de secuencia.

Un objeto de la presente invención es por lo tanto un procedimiento de producción de ß-santaleno comprendiendo

a) poner en contacto FPP con al menos un polipéptido que tenga una actividad ß-santaleno sintasa y que comprenda una secuencia de aminoácidos idéntica a SEC ID N.º: 1 o 3;

b) opcionalmente, aislar el ß-santaleno producido en la etapa a).

De acuerdo con una realización preferente, ß-santaleno representa al menos el 20 %, preferentemente al menos el 30 %, preferentemente al menos el 35 % de los productos producidos por el procedimiento de la invención.

El procedimiento puede llevarse a cabo in vitro así como in vivo, dado que los procedimientos que implican solo el metabolismo natural de la planta, sin ninguna transformación, no están comprendidos por los procedimientos de la presente invención, como se explicará en detalle adicionalmente.

El polipéptido a ponerse en contacto con FPP in vitro se puede obtener por extracción a partir de cualquier organismo que lo exprese, usando proteína estándar o tecnología de extracción de enzimas. Si el organismo huésped es un organismo unicelular o célula que libera el polipéptido de la invención en el medio de cultivo, el polipéptido puede recogerse simplemente del medio de cultivo, por ejemplo por centrifugación, opcionalmente seguido por etapas de lavado y de resuspensión en soluciones de tampón adecuadas. Si el organismo o célula acumula el polipéptido dentro de sus células, el polipéptido puede obtenerse por disrupción o lisis de las células y por extracción adicional del

polipéptido a partir del lisado de la célula.

El polipéptido que tiene una actividad ß-santaleno sintasa, bien en una forma aislada o bien conjuntamente con otras proteínas, por ejemplo en un extracto de proteína en bruto obtenida de células cultivadas o de microorganismos cultivados, puede estar suspendido en una solución tampón a pH óptimo. Si es adecuado, sales, DTT, BSA y otras clases de cofactores enzimáticos, se pueden añadir con el fin de optimizar la actividad enzimática. La concentración de estos co-factores se puede ajustar con el fin de lograr un rendimiento optimizado. Por ejemplo, bajar la concentración de iones de Mg2+ en la suspensión polipeptídica es particularmente ventajosa para incrementar el rendimiento de ß-santaleno. La concentración óptima de iones Mg2+ está comprendida entre 2 y 0,75 mM. Las condiciones apropiadas se describen en más detalle en los ejemplos adicionalmente.

El precursor FPP se añade a la suspensión polipéptídica, que se incuba a temperatura óptima, por ejemplo entre 15 y 40 ºC, preferentemente entre 25 y 35 °C, más preferentemente a 30 °C. Después de incubación, el ß-santaleno producido se puede aislar de la solución incubada por procedimientos de aislamiento estándar, tales como extracción y destilación de disolvente, opcionalmente después de eliminar los polipéptidos de la solución.

De acuerdo con otra realización preferida, el procedimiento de cualquiera de las realizaciones anteriormente descritas se lleva a cabo in vivo. En este caso, la etapa a) comprende cultivar un organismo huésped no humano o célula capaz de producir FPP y transformada para expresar al menos un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a SEC ID N.º: 1 o 3 y que tiene una actividad ß-santaleno sintasa, según condiciones que conducen a la producción de ß-santaleno.

De acuerdo con una realización más preferida, el procedimiento comprende adicionalmente, antes de la etapa a), transformar un organismo no humano o una célula no humana capaz de producir FPP con al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEC ID N.º: 1 o 3 y que tiene una actividad ß-santaleno sintasa, tal que dicho organismo expresa dicho polipéptido.

Estas realizaciones de la invención son particularmente ventajosas dado que es posible que lleven a cabo el procedimiento in vivo aislando anteriormente el polipéptido. La reacción tiene lugar directamente dentro del organismo

o célula transformada para expresar dicho polipéptido.

De acuerdo con una realización de la invención, el al menos un ácido nucleico que codifica la ß-santaleno sintasa, según se define anteriormente, es idéntica a la SEC ID N.º: 2, 4 o al complemento de las mismas. De acuerdo con otra realización, dicho ácido nucleico comprende la secuencia nucleotídica SEC ID N.º: 2, 4 o el complemento de la misma.

De acuerdo con otra realización, el al menos un ácido nucleico, según se define anteriormente, está aislado de una planta de la especie Santalum, preferentemente de Santalum album.

El organismo o célula se desea para "expresar" un polipéptido, dado que el organismo o célula se transforma para albergar un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido, este ácido nucleico se transforma para albergar un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido, este ácido nucleico se transcribe a ARNm y el polipéptido se encuentra en el organismo huésped o célula huésped. El término "expresa" comprende "expresa heterólogamente" y "sobre-expresa", refiriéndose el último a niveles de ARNm, polipéptido y/o actividad enzimática sobre y por encima de lo que se mide en un organismo o célula no transformado. Una descripción más detallada de procedimientos adecuados para transformar un organismo huésped no humano o una célula huésped no humana se describirá más adelante en la parte de la memoria descriptiva que está dedicada a tales organismos o células huéspedes no humanos transformados de la presente invención y en los ejemplos.

Un organismo o célula particular se considera que es "capaz de producir FPP" cuando produce FPP de forma natural o cuando no produce FPP de forma natural pero se transforma para producir FPP, bien antes de la transformación con un ácido nucleico como se describe en el presente documento o bien conjuntamente con dicho ácido nucleico. Los organismos o células transformados para producir una cantidad más alta de FPP que el organismo o célula que se da en la naturaleza están también comprendidos por los "organismos o células capaces de producir FPP". Procedimientos para transformar organismos, por ejemplo microorganismos, de tal forma que producen FPP ya se conocen en la técnica. Tales procedimientos pueden encontrarse por ejemplo en la bibliografía, por ejemplo en las siguientes publicaciones: Martin, V.J., Pitera, D.J., Withers, S.T., Newman, J.D. y Keasling, J.D. Nat Biotechnol., 2003, 21(7), 796-802 (transformación de E. coli); Wu, S., Schalk, M., Clark, A., Miles, R.B., Coates, R. y Chappell, J., Nat Biotechnol., 2006, 24 (11), 1441-1447 (transformación de plantas); Takahashi, S., Yeo, Y., Greenhagen, B. T., McMullin, T., Song, L., Maurina-Brunker, J., Rosson, R., Noel, J., Chappell, J, Biotechnology and Bioengineering, 2007, 97(1), 170-181 (transformación de levadura).

Para llevar a cabo la invención in vivo, el organismo huésped o la célula huésped se cultivan según condiciones que conducen a la producción de ß-santaleno. De acuerdo con ello, si el huésped es una planta transgénica, se proporcionan condiciones de crecimiento óptimas, tales como condiciones de nutrientes, de luz y de agua óptimas, por ejemplo. Si el huésped es un organismo unicelular, las condiciones que conducen a la producción de ß-santaleno pueden comprender adición de cofactores adecuados al medio de cultivo del huésped. Además, se puede seleccionar un medio de cultivo, tal como para maximizar síntesis de ß-santaleno. Las condiciones de cultivos óptimos se describen en una manera más detallada en los siguientes ejemplos.

Organismos huéspedes no humanos adecuados para llevar a cabo el procedimiento de la invención in vivo pueden ser cualesquiera organismos pluricelulares o unicelulares no humanos. En una realización preferida, el organismo huésped no humano usado para llevar a cabo la invención in vivo es una planta, un procariota o un hongo. Se puede usar cualquier planta, procariota u hongo. Plantas particularmente útiles son aquellas que producen de forma natural cantidades altas de terpenos. En una realización más preferida, la planta se selecciona a partir de la familia de las solanáceas, poáceas, brasicáceas, fabáceas, malváceas, asteráceas o lamiáceas. Por ejemplo, la planta está seleccionada de los géneros Nicotiana, Solanum, Sorghum, Arabidopsis, Brassica (colza), Medicago (alfalfa), Gossypium (algodón), Artemisia, Salvia y Mentha. Preferentemente, la planta pertenece a la especie Nicotiana tabacum.

En una realización más preferida el organismo huésped no humano usado para llevar a cabo el procedimiento de la invención in vivo es un microorganismo. Se puede usar cualquier microorganismo pero de acuerdo con una realización incluso más preferida dicho microorganismo es una bacteria o levadura. Lo más preferentemente, dicha bacteria es E. coli y dicha levadura es Saccharomyces cerevisiae.

Algunos de estos organismos no producen FPP de forma natural. Para ser adecuado para llevar a cabo el procedimiento de la invención, estos organismos se han transformado para producir dicho precursor. Se pueden transformar así bien antes de la modificación con el ácido nucleico descrito de acuerdo con cualesquiera de las realizaciones anteriores o bien simultáneamente, como se explica anteriormente.

Se pueden usar también células eucariotas superiores aisladas, en vez de organismos completos, como huéspedes para llevar a cabo el procedimiento de la invención in vivo. Las células eucariotas adecuadas pueden ser cualesquiera células no humanas, pero son preferentemente células vegetales o fúngicas.

El al menos un polipéptido que tiene una actividad ß-santaleno sintasa usada en cualquiera de las realizaciones anteriormente descritas o codificada por el ácido nucleico en cualquiera de las realizaciones anteriormente descritas comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a SEC ID N.º: 1 o 3.

En otra realización, dicho polipéptido consiste en SEC ID N.º: 1 o 3.

Las variantes polipeptídicas que resultan de una fusión de secuencias peptídicas adicionales en los extremos aminoterminales y carboxiterminales se pueden usar también en los procedimientos de la invención. En particular una fusión tal puede potenciar la expresión de los polipéptidos, ser útil en la purificación de la proteína o mejorar la actividad enzimática del polipéptido en un ambiente deseado o en un sistema de expresión deseado. Tales secuencias peptídicas adicionales pueden ser péptidos señal, por ejemplo. De acuerdo con ello, la presente invención comprende procedimientos que usan polipéptidos variantes, tales como aquellos obtenidos por fusión con otros oligopéptidos o polipéptidos y/o aquellos que están unidos a péptidos señal. Los polipéptidos que resultan de una fusión con otra proteína funcional, tales como otra proteína de la ruta de la biosíntesis de terpenos, se pueden usar también ventajosamente en los procedimientos de la invención.

De acuerdo con otra realización, el al menos un polipéptido que tiene una actividad ß-santaleno sintasa usada en cualquiera de las realizaciones anteriormente descritas o codificada por el ácido nucleico usado en cualquiera de las realizaciones anteriormente descritas está aislado de una planta de las especies de Santalum, preferentemente de Santalum album.

Una herramienta importante para llevar a cabo el procedimiento de la invención es el polipéptido en sí mismo. Un polipéptido que tiene una actividad p-santaleno sintasa y que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a SEC ID N.º: 1 o 3 es por lo tanto otro objeto de la presente invención.

De acuerdo con una realización preferida, el polipéptido es capaz de producir una mezcla de sesquiterpenos en la que ß-santaleno representa al menos el 20 %, preferentemente al menos el 30 %, preferentemente al menos el 35 %, de los sesquiterpenos producidos.

En una realización preferida, el polipéptido consiste en SEC ID N.º: 1 o 3.

De acuerdo con otra realización, el polipéptido está aislado de una planta de las especies de Santalum, preferentemente de Santalum album.

Las variantes polipeptídicas que resultan de una fusión de secuencias de péptidos adicionales en los extremos aminoterminal y carboxiterminal están también comprendidas por los polipéptidos de la presente invención. En particular una fusión tal puede potenciar la expresión de los polipéptidos, ser útil en la purificación de la proteína o mejorar la actividad enzimática del polipéptido en un ambiente deseado o en un sistema de expresión deseado. Tales secuencias peptídicas adicionales pueden ser péptidos señal, por ejemplo. De acuerdo con ello, la presente invención comprende variantes de los polipéptidos de la invención, tales como aquellos obtenidos por fusión con otros oligopéptidos o polipéptidos y/o aquellos que están unidos a péptidos señal. Los polipéptidos que resultan de una fusión con otra proteína funcional, tal como otra proteína de la ruta de la biosíntesis de terpenos, están también comprendidos por los polipéptidos de la invención.

Como se menciona anteriormente, el ácido nucleico que codifica el polipéptido de la invención es una herramienta útil para modificar organismos huéspedes no humanos o células deseadas para usarse cuando el procedimiento se lleva a cabo in vivo.

Un ácido nucleico que codifica un polipéptido de acuerdo con cualesquiera de las reivindicaciones descritas anteriormente es por lo tanto también un objeto de la presente invención.

De acuerdo con una realización preferida, el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos idéntica a SEC ID N.º: 2, 4 o al complemento de las mismas.

De acuerdo con otra realización, el ácido nucleico consiste en una secuencia de nucleótidos idéntica a SEC ID N.º: 2, 4 o al complemento de las mismas.

De acuerdo con otra realización, el ácido nucleico está aislado de una planta de las especies de Santalum, preferentemente de Santalum album.

El ácido nucleico de la invención se puede definir como que incluye polímeros de desoxirribonucleótidos o de ribonucleótidos bien en forma de cadena simple o bien en forma de cadena doble (ADN y/o ARN). Los términos "secuencia de nucleótidos" deben entenderse también como comprendiendo una molécula polinucleotídica o una molécula oligonucleotídica en forma de un fragmento separado o como un componente de un ácido nucleico más grande. Los ácidos nucleicos de la invención también abarcan ciertas secuencia de nucleótidos aisladas que incluyen aquellas que están sustancialmente libres de material endógeno contaminante. El ácido nucleico de la invención puede truncarse, dado que codifica un polipéptido comprendido por la presente invención, como se describe anteriormente.

Los ácidos nucleicos que comprenden una secuencia obtenida por mutación de SEC ID N.º: 2, 4 o el complemento de las mismas están abarcados por la invención, siempre que las secuencias codifiquen un polipéptido que tiene una actividad ß-santaleno sintasa, según se define en las realizaciones anteriores. Las mutaciones pueden ser cualquier clase de mutaciones de estos ácidos nucleicos, tales como mutaciones puntuales, mutaciones de deleción, mutaciones de inserción y/o mutaciones de cambio de fase. Se puede preparar un ácido nucleico variante con el fin de adaptar su secuencia de nucleótidos a un sistema de expresión específico. Por ejemplo, los sistemas de expresión bacterianos se conocen por expresar más eficientemente polipéptidos si los aminoácidos se codifican por un codón preferido. Debido a la degeneración del código genético, en el que más de un codón puede codificar el mismo aminoácido, múltiples secuencias de ADN pueden codificar para el mismo polipéptido, estando todas estas secuencias de ADN comprendidas por la invención.

Otra herramienta importante para transformar organismos o células huéspedes adecuados para llevar a cabo el procedimiento de la invención in vivo es un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de acuerdo con cualquier realización de la invención. Un vector tal es por lo tanto también un objeto de la presente invención.

Un "vector de expresión" como se usa en el presente documento incluye cualquier vector lineal o recombinante incluyendo pero no limitado a vectores virales, bacteriófagos y plásmidos. La persona experta es capaz de seleccionar un vector adecuado de acuerdo con el sistema de expresión. En una realización, el vector de expresión incluye el ácido nucleico de la invención operativamente unido a al menos una secuencia reguladora, que controla transcripción, traducción, iniciación y terminación, tal como un promotor regional, operador o potenciador, o un sitio de unión ribosómico de ARNm y opcionalmente, que incluye al menos un marcador de selección. Las secuencias de nucleótidos están "enlazadas operativamente" cuando la secuencia reguladora está relacionada funcionalmente con el ácido nucleico de la invención.

Los vectores de expresión de la presente invención se pueden usar en los procedimientos para preparar un organismo huésped genéticamente transformado y/o una célula huésped genéticamente transformada, en organismos y/o células huéspedes que albergan los ácidos nucleicos de la invención y en los procedimientos de fabricación de polipéptidos que tienen una actividad ß-santaleno sintasa, como se describe adicionalmente más adelante.

Los organismos y células huéspedes no humanos recombinantes transformados para albergar al menos un ácido nucleico de la invención de forma que ello expresa o sobreexpresa heterólogamente al menos un polipéptido de la invención son también herramientas muy útiles para llevar a cabo el procedimiento de la invención. Tales organismos huéspedes no humanos y tales células huéspedes no humanas son por lo tanto otro objeto de la presente invención.

Un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriormente descritas se puede usar para transformar los organismos y células huéspedes no humanos y el polipéptido expresado puede ser cualquiera de los polipéptidos anteriormente descritos.

Los organismos huéspedes no humanos de la invención pueden ser cualesquiera organismos pluricelulares o unicelulares no humanos. En una realización preferida, el organismo huésped no humano es una planta, un procariota

o un hongo. Cualquier planta, procariota u hongo es adecuado para transformarse de acuerdo con la presente invención. Plantas particularmente útiles son aquellas que producen de forma natural cantidades altas de terpenos. En una realización más preferida, la planta se selecciona a partir de la familia de las solanáceas, poáceas, brasicáceas,

fabáceas, malváceas, asteráceas o lamiáceas. Por ejemplo, la planta está seleccionada de los géneros Nicotiana, Solanum, Sorghum, Arabidopsis, Brassica (colza), Medicago (alfalfa), Gossypium (algodón), Artemisia, Salvia y Mentha. Preferentemente, la planta pertenece a la especie Nicotiana tabacum.

En una realización más preferida el organismo huésped no humano es un microorganismo. Cualquier microorganismo es adecuado para la presente invención, pero de acuerdo con una realización más preferida dicho microorganismo es una bacteria o levadura. Lo más preferentemente, dicha bacteria es E. coli y dicha levadura es Saccharomyces cerevisiae.

Células eucariotas superiores aisladas se pueden transformar también, en lugar de organismos completos. Como células eucariotas superiores, los autores de la presente invención quieren decir aquí cualquier célula eucariota no humana salvo células de levaduras. Células eucariotas superiores preferidas son células vegetales o células fúngicas.

El término "transformado" se refiere al hecho de que el huésped está sometida a ingeniería genética para comprender una, dos o más copias de cada uno de los ácidos nucleicos requeridos en cualquier realización de las anteriormente descritas. Preferentemente el término "transformado" se refiere a huéspedes que expresan heterólogamente los polipéptidos codificados por el ácido nucleico con el que se transforman, así como que sobre-expresan dichos polipéptidos. De acuerdo con ello, en una realización, la presente invención proporciona un organismo transformado, en el que los polipéptidos se expresan en cantidad más alta que en el mismo organismo no transformado así.

Hay varios procedimientos conocidos en la técnica para la creación de organismos huésped transgénicos o células tales como plantas, hongos, procariotas o cultivos de células eucariotas superiores. Los vectores de clonación y de expresión adecuados para usar con huéspedes bacterianos, fúngicos, de levaduras, de plantas y de mamíferos se describen en Pouwels y cols., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, Elsevier, Nueva York y Sambrook y cols., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Vectores de clonación y expresión para plantas superiores y/o células vegetales en particular están disponibles para la persona experta. Véase por ejemplo Schardl y cols. Gen 61: 1-11, 1987.

Procedimientos para transformar organismos huéspedes o células huéspedes para albergar ácidos nucleicos transgénicos son familiares para la persona experta. Para la creación de plantas transgénicas, por ejemplo, los procedimientos actuales incluyen: electroporación de protoplastos vegetales, transformación mediada por liposomas, transformación mediada por Agrobacterium, transformación mediada por polietilenglicol, bombardeo de partículas, microinyección de células vegetales y transformación usando virus.

En una realización, el ADN transformado está integrado dentro de un cromosoma de un organismo huésped no humano y/o célula huésped no humana de tal forma que da como resultado un sistema recombinante estable. Cualquier procedimiento de integración cromosómica conocido en la técnica se puede usar en la práctica de la invención, incluyendo pero no limitado a intercambio de casetes mediado por recombinasas (RMCE), inserción cromosómica específica de sitio, adenovirus e inyección pronuclear.

Con el fin de llevar a cabo el procedimiento de producción de ß-santaleno in vitro, como se expone anteriormente en el presente documento, es muy ventajoso proporcionar un procedimiento de fabricación de al menos un polipéptido que tenga una actividad ß-santaleno sintasa según se describe en cualquier realización de la invención. Por lo tanto, la invención proporciona un procedimiento de producción de al menos un polipéptido de acuerdo con cualquier realización de la invención que comprende

a) cultivar un organismo o célula huésped no humano transformado con el vector de expresión de la invención, tal que ello alberga un ácido nucleico de acuerdo con la invención y expresa o sobre-expresa un polipéptido de la invención;

b) aislar el polipéptido del organismo huésped no humano o de la célula huésped no humana cultivado en la etapa a).

De acuerdo con una realización preferida, dicho procedimiento comprende adicionalmente, antes de la etapa a), transformar un organismo huésped no humano o una célula huésped no humana con el vector de expresión de la invención, tal que ello alberga un ácido nucleico de acuerdo con la invención y expresa o sobre-expresa el polipéptido de la invención.

Se puede usar un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente.

La transformación y el cultivo del organismo huésped no humano o de la célula huésped no humana se puede llevar a cabo según se describe anteriormente por el procedimiento de producción de ß-santaleno in vivo. La etapa b) se puede llevar a cabo usando cualquier técnica bien conocida en la técnica para aislar un polipéptido particular a partir de un organismo o célula.

Las variantes polipeptídicas que resultan de una fusión de secuencias peptídicas adicionales en los extremos amino y carboxiterminales de los polipéptidos de la invención se pueden usar para potenciar la expresión de los polipéptidos, ser útiles en la purificación de la proteína o mejorar la actividad enzimática del polipéptido en un ambiente deseado o

en un sistema de expresión deseado. Tales secuencias peptídicas adicionales pueden ser péptidos señal, por ejemplo. De acuerdo con ello, la presente invención comprende variantes de los polipéptidos de la invención, tales como aquellos obtenidos por fusión con otros oligopéptidos o polipéptidos y/o aquellos que están unidos a péptidos señal. El polipéptido de fusión comprendido por la invención también comprende polipéptidos de fusión que resultan de una fusión de otras proteínas funcionales, tales como otras proteínas de la ruta de biosíntesis de terpenos.

Por lo tanto, en una realización, la presente invención proporciona un procedimiento de preparación de un polipéptido variante que tiene una actividad ß-santaleno sintasa, según se describe en cualquiera de las realizaciones anteriores y que comprende las etapas de:

(a): seleccionar un ácido nucleico según se define anteriormente;

(b): modificar el ácido nucleico seleccionado para obtener al menos un ácido nucleico mutante;

(c): transformar células huéspedes u organismos unicelulares huéspedes con la secuencia de ácidos

nucleicos mutante para expresar un polipéptido codificado por la secuencia de ácidos nucleicos mutante;

(d): rastrear el polipéptido por al menos una propiedad modificada; y

(e): opcionalmente, si el polipéptido no tiene ninguna actividad ß-santaleno sintasa variante deseada, repetir las etapas del procedimiento (a) a (d) hasta que se obtiene un polipéptido con una actividad ß-santaleno sintasa variante deseada;

(f): opcionalmente, si un polipéptido que tiene una actividad ß-santaleno sintasa variante deseada se identificó en la etapa (d), aislar el ácido nucleico mutante correspondiente obtenido en la etapa (c).

De acuerdo con una realización preferida, el polipéptido variante es capaz de producir una mezcla de sesquiterpenos en la que ß-santaleno representa al menos el 20 %, preferentemente al menos el 30 %, preferentemente al menos el 35 %, de los sesquiterpenos producidos.

En la etapa (b), se pueden crear un gran número de secuencias de ácidos nucleicos mutantes, por ejemplo por mutagénesis aleatorias, mutagénesis específicas de sitio, o reorganización del ADN. Los procedimientos detallados de reorganización de genes se encuentran en Stemmer, reorganización de ADN por fragmentación aleatoria y reensamblaje: recombinación in vitro para evolución molecular. Proc Natl Acad Sci EE.UU., 1994, 91(22). 10747-1075. Resumiendo, reorganización de ADN se refiere a un procedimiento de recombinación aleatoria de secuencias conocidas in vitro, implicando al menos dos ácidos nucleicos seleccionados por recombinación. Por ejemplo se pueden introducir mutaciones en loci particulares sintetizando oligonucleótidos que contienen una secuencia mutante, flanqueada por sitios de restricción que permiten ligación a fragmentos de la secuencia nativa. Tras la ligación, la secuencia reconstruida resultante codifica un análogo que tiene la inserción, sustitución o deleción aminoacídica deseada. Alternativamente, se pueden emplear procedimientos de mutagénesis específica de sitio dirigida a oligonucleótidos para proporcionar un gen alterado en los que se pueden alterar codones predeterminados por sustitución, deleción o inserción.

De acuerdo con ello, el polipéptido que comprende SEC ID N.º: 1 se puede recombinar con cualesquiera otros ácidos nucleicos que codifiquen sesquiterpeno sintasa, por ejemplo aislados a partir de un microorganismo distinto de Santalum album. Así, se pueden obtener y separar ácidos nucleicos mutantes que se pueden usar para transformar una célula huésped de acuerdo con procedimientos estándar, por ejemplo tal como se divulga en los presentes ejemplos.

En la etapa (d), el polipéptido obtenido en la etapa (c) se rastrea por al menos una propiedad modificada, por ejemplo una actividad enzimática modificada deseada. Ejemplos de actividades enzimáticas deseadas, por las que se puede rastrear un polipéptido deseado, incluyen actividad enzimática potenciada o reducida, según se mide por valor de KM o Vmáx, regioquímica o estereoquímica modificada y utilización de sustrato alterado o de distribución de producto alterada. El rastreo de la actividad enzimática se puede llevar a cabo de acuerdo con procedimientos familiares para el experto y de acuerdo con aquellos procedimientos divulgados en los presentes ejemplos.

La etapa (e) proporciona repetición de las etapas (a)-(d) del procedimiento, lo que se lleva a cabo preferentemente en paralelo. De acuerdo con ello, creando un número significativo de ácidos nucleicos mutantes, se pueden transformar muchas células huéspedes con diferentes ácidos nucleicos al mismo tiempo, permitiendo el rastreo subsiguiente de un número elevado de polipéptidos. Las probabilidades de obtener un polipéptido variante deseado pueden incrementarse así a la discreción de la persona experta.

Descripción de los dibujos

Figura 1: análisis de CG-EM del sesquiterpeno producido por la santaleno sintasa, recombinante de Santalum album (SaSantS).

Parte 1: Cromatograma iónico total. 1, a-santaleno; 2, trans-a-bergamoteno; 3, epi-ß-santaleno; 4, ß-santaleno; 5, ß-farneseno

Partes 2 a 4: Espectros de masas de los picos identificados como sesquiterpenos.

Figura 2: Estructura molecular de ß-santaleno y ß-santalol.

Realizaciones específicas de la invención o ejemplos

La invención se describirá ahora en detalle adicional por medio de los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1

Construcción de biblioteca de ADN, secuenciación y extracción de las secuencias relacionadas de terpeno sintasa

Se usaron segmentos de hipocotilos jóvenes obtenidos de semillas germinadas asépticamente de Santalum album L. (de 5 semanas de edad) induciendo formación de callos. Las semillas de S. album se obtuvieron de B&T World Seeds (Aigues-Vives, Francia) y de Sandeman Seeds (Lalongue, Francia). Las semillas se esterilizaron en superficie primero en HClO al 2,5 % durante 120 minutos y se aclararon tres veces en agua estéril ultrapura. Las semillas se descascararon después y se situaron en un medio basal de MS (Murashige & Skoog, 1962, Physiologia Plantarum 15, 473-497) suplementado con 15 g/l de sacarosa y 7,8 g/l de agar, pH 5,7. La germinación se observó típicamente después de 9 a 18 días con un rendimiento de aproximadamente el 40 %. Las plántulas se dejaron crecer in vitro durante 2 a 3 meses en una habitación de cultivo a una temperatura de 27 °C, con frío, luz fluorescente blanca y con 16 horas de fotoperiodo. Induciendo la formación de callo verde, los fragmentos de hipocotilos se cortaron en 3-4 mm segmentos transversos que se situaron en medio basal Gbg (Gamborg y cols., 1968, Exp Cell Res. 50(1), 151-158) suplementado con 2,4D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético, Sigma-Aldrich Co.) 0,5 mM y Kin (cinetina, Sigma-Aldrich Co.) 10 mM en placas de Petri. El crecimiento del callo se perpetuó transfiriendo el tejido cada cuatro semanas a medio recién preparado en placas de Petri. Todos los cultivos de callos se llevaron a cabo en una cámara de crecimiento en las mismas condiciones que anteriormente.

Los callos obtenidos después de un mes de cultivo en medio Gbg conteniendo Kin 5 μM y ACC 2 mM se usaron para la extracción de ARN y para la construcción de bibliotecas de ADNc. El ARN total se extrajo siguiendo el protocolo descrito por Lefort y Douglas (Ann. For. Sci. 56 (1999), 259-263) salvo que se omitió el tratamiento de ARNsa. El sedimento se resuspendió en 200 ml de agua libre de ARNsa y se centrifugó dos veces durante 10 minutos a 20000 g eliminando los polisacáridos. Se obtuvieron aproximadamente 125 mg de ARN total a partir de 2,2 gramos de células. Los ARNm se purificaron usando el kit de aislamiento de ARNm FastTrack® 2.0 (Invitrogen) y se fabricó una biblioteca de ADNc usando el kit de síntesis de ADNc por PCR SMART® (Clontech Laboratories, Inc.) siguiendo las instrucciones del fabricante.

La tecnología de secuenciación en paralelo masiva de fragmentos de ADN pequeños desarrollada por Illumina (San Diego, California) se usó secuenciando la biblioteca de ADNc completa. La preparación de ADN para secuenciación, la secuenciación y el ensamblaje de las lecturas se llevaron a cabo en Fasteris SA (Plan-les-Ouates, Suiza). La biblioteca de ADNc se trató siguiendo el kit Genomic Sample Prep (Illumina) y se secuenció en el sistema de Genome Analyzer (Illumina). Se obtuvieron un total de 4,03 millones de secuencias de 35 pb (lecturas). Estas lecturas se ensamblaron usando EDENA 2.1.1, un software que halla solapamientos entre las lecturas y que ensambla cóntigos de novo (Hernández y cols., De novo bacterial genome sequencing: Millions of very short reads assembled on a desktop computer. Genome Res. 2008; 18: 802-809). El ensamblaje se hizo funcionar con apareamientos mínimos de 26 a 20 bases. Después de eliminar los cóntigos más cortos de 100 bases, se obtuvieron 1983 a 3473 cóntigos únicos con una longitud máxima de 1331 a 1914 dependiendo de los parámetros seleccionados para el ensamblaje. Se llevó a cabo otro ensamblaje usando el programa Velvet 1.0 (Zerbino y Birney (2008), Velvet: algorithms for de novo short read assembly using de Bruijn graphs. Genome Res. 18(5), 821-829), que proporciona 5905 cóntigos únicos de longitud entre 100 y 1616 bases.

Todos los cóntigos generados se compararon con una base de datos de secuencias proteicas (secuencias de proteínas no redundantes, NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov) usando el algoritmo Blastx (Altschul y cols., J. Mol. Biol. 215, 403-410, 1990; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). Los cóntigos que muestran homología de secuencia significativa con sesquiterpeno sintasas de plantas se retuvieron. Se seleccionaron así un total de 46 cóntigos con una longitud de 100 a 621 bases. Estos cóntigos se procesaron después usando el programa CAP (Huang, Genomics 14(1), 18-25, 1992) ensamblándolos y generando secuencias más largas. Se ensamblaron así cinco cóntigos únicos de longitud de 445 a 1064. Las secuencias de aminoácidos deducidas mostraron homología significativa con sintasas de terpenos vegetales y especialmente con secuencias descritas o anotadas como monoterpeno sintasas. El alineamiento de estas secuencias de aminoácidos mostraron que al menos dos ADNc estaban presentes (se encontraron dos secuencias en la mayoría de las posiciones a través del alineamiento). Este alineamiento mostró también que al menos una secuencia N-terminal y una secuencia C-terminal estuvieron presentes. Para obtener las secuencias completas y para asignar las secuencias de extremo 5' y de extremo 3' exactas a cada ADNc, se empleó un experimento de amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE).

Ejemplo 2

Amplificación de las secuencias de longitud total de un ADNc de terpeno sintasa

Para los experimentos RACE, se diseñó un conjunto de cebadores desde uno de los cinco cóntigos obtenidos como se describe anteriormente. Así los cebadores directos SCH5-Ct58-R1 (SEC ID N.º: 6) y SCH5-Ct58-R2 (SEC ID N.º: 7) y los cebadores inversos SCH5-Ct58-F3 (SEC ID N.º: 8) y SCH5-Ct58-F4 (SEC ID N.º: 9) se dedujeron a partir de SCH5-cóntigo-5 (SEC ID N.º: 5).

La PCR se llevó a cabo con la Mezcla de Cebador Universal A (UPM) (kit de amplificación de ADNc de RACE SMART™, Clontech Laboratories, Inc.) en volumen final de 50 μl conteniendo mezcla de dNTP 200 μM, 5 μl de biblioteca de ADNc (ejemplo 1), cebador específico de gen 0,2 μM, mezcla de cebadores UPM 0,2 μM (Clontech Laboratories, Inc.), 1 μl de mezcla de polimerasas Advantage 2 (Clontech Laboratories, Inc.) y 5 ml de tampón de reacción de PCR de ADNc 10x (Clontech Laboratories, Inc.). Las condiciones de ciclación térmica fueron como sigue: 3 minutos a 94 °C; 5 ciclos de 30 segundos a 94 °C y 3 minutos a 72 °C; 5 ciclos de 30 segundos a 94 °C y 3 minutos a 70 °C; 5 ciclos de 30 segundos a 94 °C y 3 minutos a 68 °C; 3 minutos a 72 °C. Con el RACE de 5', se obtuvo un fragmento de ADN de 610 pb (SCH5-Ct58_RR1, SEC ID N.º: 10) incluyendo el extremo 5' del ADNc. Con el RACE de 3' se obtuvo un fragmento de 1049 pb (SCH5-Ct58-RF4, SEC ID N.º: 11) y la combinación de los dos productos de RACE con la secuencia de SCH5-cóntigo-5 (SEC ID N.º: 5) permitió la reconstitución de un ADNc de longitud completa nuevo (SCH5-Ct58, SEC ID N.º: 12). El ADNc SCH5-Ct58 de 2157 pb codificaba para una proteína de 569 aminoácidos (SEC ID N.º: 13) mostrando homología con secuencias de terpeno sintasas vegetales y conteniendo restos característicos de terpeno sintasas tales como el resto DDxxD presente en todas las monoterpeno sintasas y en todas las sesquiterpeno sintasas. De forma interesante la secuencia de aminoácidos mostró similitud superior a monoterpeno sintasas que a sesquiterpeno sintasas. Sin embargo la presencia de péptido señal de cloroplasto, una característica común en monoterpeno sintasas vegetales, no se predijo a partir del análisis de la secuencia N-terminal (Emanuelsson, O., Nielsen, N. y von Heijne, G. 1999. ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites. Protein Science 8, 978-984).

Ejemplo 3

Expresión heteróloga y actividad enzimática in vitro de SCH5-Ct58

Los presentes inventores decidieron modificar la secuencia de ADN de SCH5-Ct58 (SEC ID N.º: 12) y rediseñar la secuencia para expresión heteróloga óptima en células de E. coli. Para empezar con la secuencia de aminoácidos verdadera, la secuencia nucleotídica exacta de SCH5-Ct58 en la biblioteca de ADNc hubo de estabilizarse primero. El Software Eland (Illumina) se usó recuperando todas las lecturas que coinciden con la secuencia SCH5-Ct58 (SEC ID N.º: 12) con un máximo de 2 apareamientos inadecuados. Un total de 5224 lecturas se recuperaron y se alinearon usando el programa CAP (Huang, Genomics 14(1), 18-25, 1992) con la secuencia de ADN SCH5-Ct58 (SEC ID N.º: 12) como una referencia. La cobertura promedio sobre la secuencia completa estaba por encima de 100x permitiendo la deducción no ambigua de la secuencia SCH5-Ct94 de ADNc (SEC ID N.º: 14). En esta secuencia nueva se corrigieron 5 bases comparadas con la secuencia SCH5-Ct58 (SEC ID N.º: 12) deducida de los resultados de RACE y esas correcciones resultaron en una nueva secuencia de aminoácidos (SCH5-Ct94, SEC ID N.º: 15) con una diferencia de dos residuos. Para expresión heteróloga, la secuencia de ADN de SCH5-Ct94 (SEC ID N.º: 14) se modificó retirando los 23 primeros codones y reemplazando por la secuencia de ATGGCT y el uso del codón se cambió optimizando la secuencia para expresión en E. coli (ADN 2.0, Menlo Park, CA, EE.UU.). El ADNc así diseñado (SCH5-Ct94-opt, SEC ID N.º: 2) se sintetizó (ADN 2.0, Menlo Park, CA, EE.UU.) y se sub-clonó en los sitios NdeI-KpnI del plásmido pETDuet-1 proporcionando el plásmido Ct94-pETDuet. Esta secuencia de ADNc optimizada codificó para el polipéptido SCH5-Ct94-opt (SEC ID N.º: 1).

La expresión heteróloga de Ct94 se llevó a cabo en células de E. coli BL21(DE3) usando el plásmido Ct94-pETDuet. Los ensayos enzimáticos in vitro se llevaron a cabo con FPP como sustrato en las condiciones descritas anteriormente y se observó actividad sesquiterpeno sintasa con formación de una mezcla de cinco sesquiterpenos. La identidad de estos sesquiterpenos se confirmó por CG-EM como que son los sesquiterpenos característicos de Santalum album: a-santaleno, trans-a-bergamoteno, epi-ß-santaleno, ß-santaleno y ß-farneseno (Figura 1). A pH 7,0 y en la presencia de MgCl2 15 mM, la proporción relativa de los productos de sesquiterpeno recombinante fue 38,0 % de a-santaleno, 18,2 % de trans-a-bergamoteno, 5,7 % de epi-ß-santaleno, 36,7 % de ß-santaleno y 1,3 % de ß-farneseno. Así el ADNc SCH-Ct98-opt codifica para una ß-santaleno sintasa. La proporción de los productos fue muy similar a la proporción observada en aceite de Santalum album para los productos hidroxilados de estos sesquiterpenos. No se detectó ninguna actividad cuando MgCl2 se omitió y el medio se suplementó con EDTA 2,5 mM (quelando cationes residuales) que muestran el requerimiento estricto para cationes divalentes. La naturaleza y concentración del catión divalente presente en el ensayo tuvo un efecto en el perfil del producto (tabla 1). Por ejemplo, bajar la concentración de Mg2+ tuvo un efecto benéfico para ß-santaleno, el último llegando a ser el producto principal del enzima. Además, la adición de Mn2+ tuvo un efecto negativo sobre la formación de ß-santaleno dado que la proporción de los productos de sartaleno sesquiterpeno decreció y la proporción de trans-a-bergamoteno y ß-farneseno se incrementó, siendo trans-a-bergamoteno el producto principal de la enzima en presencia de MgCl2 1 mM.

40 Tabla 1: Efecto de la concentración de iones de Mg2+ y Mn2+ en la composición de la mezcla de sesquiterpenos obtenida poniendo en contacto SEC ID N.º: 1 con FPP

: Porcentaje, relativo a la mezcla de productos completa

MgCl2 15 mM: MgCl2 2 mM MgCl2 0,75 mM MgCl2 0,75 mM + MnCl2 1 mM

a-santaleno: 38,0 33,0 36,5 24,5

trans-a-bergamoteno: 18,2 11,8 12,6 35,4

epi-ß-santaleno: 5,7 6,4 5,6 4,1

ß-santaleno: 36,7 47,5 44,1 33,3

ß-farneseno: 1,3 1,3 1,1 2,75

Ejemplo 4

Producción in vivo de sesquiterpenos en E. coli usando el ADNc Ct94

El uso de la santaleno sintasa de S. album para la producción in vivo de sesquiterpenos en células de E. coli se evaluó coexpresando las enzimas de una ruta biosintética de cinco etapas que convierte ácido mevalónico en FPP.

El gen de la FPP sintasa de levaduras se amplificó a partir del ADN genómico de S. cerevisiae usando los cebadores FPPy_NcoI (SEC ID N.º: 16) y fppY-Eco (SEC ID N.º: 17). El ADN amplificado se ligó al fragmento NdeI-EcorI en el primer sitio de multiclonación (MCS1) del plásmido pACYCDuet-1 proporcionando el plásmido FPPs-pACYCDuet que alberga el gen FPPs sometido al control del promotor T7. Un operón que incluye los genes que codifican para una mevalonato cinasa (mvaK1), una fosfomevalonato cinasa (mvaK2), una mevalonato difosfato decarboxilasa (MvaD) y una isopentenil difosfato isomerasa (idi) se amplificó a partir de ADN genómico de Streptococcus pneumoniae (ATCC BAA-334) con los cebadores MVA-up1-start (SEC ID N.º: 18) y MVA-up2-stop (SEC ID N.º: 19). La PCR se llevó a cabo usando la ADN polimerasa PfuUltra™ II Fusion HS (Stratagene). La composición de la mezcla de PCR estaba de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La condición de ciclación térmica fueron 2 minutos a 95 °C; 30 ciclos de 20 segundos a 95 °C, 20 segundos a 58 °C y 90 segundos a 72 °C; y 3 minutos a 72 °C. El fragmento de 3,8 Kb se purificó en un gel de agarosa y se ligó usando el kit de clonación de PRC después de secar In-Fusion™ (Clontech) dentro del segundo MCS del plásmido FPPs-pACYCDuet digerido con NdeI y XhoI proporcionando el plásmido pACYCDuet-4506. Las secuencias de los dos insertos se secuenciaron totalmente excluyendo cualquier mutación. Se cotransformaron células de E. coli BL21 Star™(DE3) (Invitrogen) con los plásmidos pACYCDuet-4506 y Ct94-pETDuet y las células transformadas se seleccionaron de placas de LB-agarosa con carbenicilina (50 μg/ml) cloranfenicol (34 μg/ml). Se usaron colonias individuales inoculando 5 ml de medio LB con 50 μg/ml de carbenicilina y 34 μg/ml de cloranfenicol. El cultivo se incubó durante toda una noche a 37 °C. El día siguiente se inocularon 2 ml de medio TB suplementado con los mismos antibióticos con 0,2 ml del cultivo durante toda una noche. Después de 6 horas de incubación a 37 °C, el cultivo se enfrió hasta 28 °C y se añadieron IPTG 1 mM, 2 mg/ml de mevalonato (preparados disolviendo mevalonolactona (Sigma) en NaOH 0,5 N a una concentración de 1 g/ml e incubando la solución durante 30 minutos a 37 °C) y 0,2 ml de decano a cada tubo. Los cultivos se incubaron durante 48 horas a 28 °C. Los cultivos se extrajeron después dos veces con 2 volúmenes de acetato de etilo, la fase orgánica se concentró a 500 ml y se analizó por CG-EM como se describe anteriormente en el ejemplo 3. En estas condiciones se logró rutinariamente producción de sesquiterpenos por encima de 200 mg/l. Se produjo beta-santaleno.

Ejemplo 5

Producción in vivo de sesquiterpenos en S. cerevisiae usando el ADNc Ct94

Para producción in vivo de sesquiterpenos en células de levadura, una cepa de Saccharomyces cerevisiae YNP5 en la que el gen ERG9 (que codifica para escualeno sintasa, la enzima que convierte FPP a escualeno) se ha regulado a la baja reemplazando el promotor ERG9 nativo con el promotor regulable MET3. En trabajo anterior con sintasas de sesquiterpeno en plantas, esta estrategia condujo a una biosíntesis de ergosterol reducida en las células y a una acumulación de FPP disponible por sesquiterpeno sintasas (Asadollahi, Biotechnology and Bioengineering, 99(3), 666-677, 2008).

El ADNc SCH5-Ct94-opt (SEC ID N.º: 2) se amplificó a partir del Ct94-pETDuet con los cebadores Ct94_BamHI (SEC ID N.º: 20) y T7term (SEC ID N.º: 21). La PCR se llevó a cabo con la ADN polimerasa Pfu (Promega) usando las siguientes condiciones de ciclación térmica: 90 segundos a 94 °C; 35 ciclos de 45 segundos a 94 °C, 45 segundos a 55 °C, 4 minutos a 72 °C; y 10 minutos a 72 °C. El ADNc amplificado se digirió con los sitios de restricción de BamHI y de

XhoI y se ligó en los sitios correspondientes del plásmido pESC-URA (Stratagene) proporcionando el plásmido Ct94-pESC-ura. S.c. Las células YNP5 se transformaron usando el kit de transformación EasyComp™ S.c. (Invitrogen).

Una sola colonia de cepas de levaduras transformadas se usó inoculando 20 ml de medio YNB (5 g/l de (NH4)2SO4; 3 g/l de KH2PO4; 0,5 g/l de MgSO4.7 H2O; 1 ml/l de solución de metal traza) suplementado con glucosa al 2 %. El cultivo se incubó durante 24 horas a 28 °C. Las células se recuperaron por centrifugación y se resuspendieron en 20 ml de medio YNB suplementado con galactosa al 2 %. Después de cultivo de 1 hora, se añadieron al cultivo metionina a concentración final de 0,5 mM y 2 ml de decano. Después de 24 horas de incubación a 28 °C, los cultivos se extrajeron con acetato de etilo y se analizaron por CG-EM como se describe en el ejemplo 4. La cantidad total de sesquiterpenos producidos por las células de levaduras en estas condiciones se estimó en 50 mg/l.

Ejemplo 6

Aislamiento de una santaleno sintasa a partir de raíces de Santalum album

Plantones de Santalum album obtenidos de semillas germinadas asépticamente se transfirieron al suelo 5 a 10 semanas después de la germinación. Dado que las especies de Santalum son hemiparásitos de raíces, la adaptación al suelo se hizo en estrecho contacto con plantas de Citrus de 6 meses a 1 año (Citrus sinensis). Las raíces de plantas de Santalum se cosecharon, 2-3 años después se transfirieron a los suelos y se separaron de las raíces de la planta huésped. El análisis de CG-EM de un extracto de estas raíces mostró la presencia de los sesquiterpenos característicos del aceite de sándalo. El ARN total se extrajo a partir de las raíces usando el reactivo de ARN de plantas Concert™ (Invitrogen). A partir de 12 g de tejido, se aislaron 640 mg de ARN total. El ARNm se purificó usando el kit de aislamiento de ARNm FastTrack® 2.0 (Invitrogen) y una biblioteca de ADNc se fabricó usando el kit de amplificación de ADNc Marathon™ (Clontech Laboratories, Inc.) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Una cantidad de 1 μg de ADNc se usó para secuenciación usando el Sistema Analizador de Genoma (Illumina). Se obtuvieron un total de 10,3 millones de lecturas de 35 pares de bases de longitud. Estas lecturas se ensamblaron usando en paralelo los softwares ensambladores Edena (Hernández y cols., 2008, Genome Res. 18, 802-809) y Velvet (Zerbinoa y Birney, 2008, Genome Res. 18: 821-829) que dan como resultado cóntigos únicos 18'937 y 22'414 con un promedio de 242 y 211 pb. Las lecturas se registraron usando el programa tBlastn (Altschul y cols., 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410) con la secuencia de aminoácidos SCH5-CT94 (SEC ID N.º: 15) como secuencia de consulta. Se seleccionaron quince cóntigos mostrando homología significativa de sus secuencias de aminoácidos deducidas con sesquiterpeno sintasas de plantas. Estos cóntigos seleccionados se reensamblaron en dos secuencias distintas, de las que SCH10-Ct8201 (SEC ID N.º: 22) fue de 383 pb en longitud y mostró la homología más alta con la secuencia de ADN SCH5-CT94 (SEC ID N.º: 14). El cebador directo SCH10-Ctg8201-F2 (SEC ID N.º: 23) se diseñó a partir de la secuencia de SCH10-Ct8201 y se usó sucesivamente para RACE de 3' usando el kit de amplificación de Marathon™ (Clontech Laboratories, Inc.). A partir de la secuencia del producto de 3'RACE así obtenida, se diseñaron dos cebadores inversos (SCH10-Ct19779-R3 (SEC ID N.º: 24) y SCH10-Ct19779-R4 (SEC ID N.º: 25)) y se usaron sucesivamente para la amplificación por RACE de 5' del extremo 5' del ADNc correspondiente. A partir de las secuencias del RACE de 5' y del RACE de 3' se reconstituyó así una secuencia de longitud total de una nueva terpeno sintasa. Con el fin de verificar la secuencia, se usó el programa MAQ (Li y cols., 2008, Genome Res. 18(11), 1851-1858) buscando y mapeando las lecturas con un máximo de 2 apareamientos inadecuados. Esta aproximación proporciona una secuencia de ADN de 1725 pares de bases de longitud (SEC ID N.º: 26) que codifica una proteína de 570 aminoácidos de longitud (SEC ID N.º: 27) que tiene una identidad del 91,9 % con la secuencia de aminoácidos de SCH5-Ct94 (SEC ID N.º: 15).

Para expresión heteróloga en E. coli, una ADNc optimizada se diseñó delecionando los 21 primeros codones, añadiendo la secuencia ATGGCTACC como los 3 primeros codones y optimizando el uso del codón por E. coli. Esta secuencia optimizada (SCH10-Ct8201-opt, SEC ID N.º: 4) que codifica para la proteína modificada en su parte N-terminal SCH10-Tps8201-opt (SEC ID N.º: 3) se sintetizó (ADN 2.0; Menlo Park, CA, EE.UU.) y se subclonó en los sitios NdeI-KpnI del plásmidos de expresión pETDuet-1 (Novagen). La expresión heteróloga u la caracterización enzimática de SCH10-Tps8201-opt (SEC ID N.º: 3) se llevó a cabo como se describe en el ejemplo 3. La proteína recombinante mostró actividad sesquiterpeno sintasa y produjo a partir de FPP la misma mezcla de sesquiterpenos como la proteína recombinante SCH5-CT94-opt (SEC ID N.º: 1, ejemplo 3) con las mismas proporciones relativas.

Listado de secuencias

<110> Firmenich SA

<120> Procedimiento de producción de beta-santaleno

<130> 7530PRIOR

<160> 27

<170> PatentIn versión 3.5

<210> 1

<211> 548

<212> PRT

<213> Santalum album

<400> 1

<210> 2

<211> 1650

<212> ADN

<213> Santalum album

<400> 2

<210> 3

<211> 551

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Polipéptido codificado por la secuencia optimizada SCH10-ctg8201-opt para expresión en E. coli.

<400> 3

<210> 4

<211> 1656

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia optimizada para expresión en E. coli.

<400> 4

<210>5

<211> 1064

<212> ADN

<213> Santalum album

<400> 5

<210> 6

<211> 29

<212> ADN 5 <213> Artificial

<220>

<223> Cebador sintetizado en base a SCH5-Cóntigo5.

<400> 6

cttcactctt ttggcaagcc acttttggg 29 10 <210> 7

<211> 30

<212> ADN

<213> Artificial

<220>: 15 <223> Cebador sintetizado en base a SCH5-cóntigo5.

<400> 7 gtggcgaagg ctttggcttc atctaagatg 30

<210> 8

<211> 31

<212> ADN

<213> Artificial

<220>: 5 <223> Cebador sintetizado en base a SCH5-Cóntigo5

<400> 8 gcatatgacg tctatggttc aatggatgaa c 31

<210> 9

<211> 30 10 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador sintetizado en base a SCH5-Cóntigo5

<400> 9 15 gttgaaaggt ggagctgtac agaaattgac 30

<210> 10

<211> 610

<212> ADN

<213> Santalum album 20 <400> 10

<210> 11

<211> 1049

<212>: ADN 25 <213> Santalum album

<400> 11

<210> 12

<211> 2157

<212> ADN

<213> Santalum album

<400> 12

<210> 13

<211> 569

<212> PRT

<213> Santalum album

<400> 13

<210> 14

<211> 1710

<212> ADN

<213> Santalum album

<400> 14

<210> 15

<211> 569

<212> PRT

<213> Santalum album

<400> 15

<210> 16

<211> 34

<212>: ADN 5 <213> Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 16

ctagccatgg cttcagaaaa agaaattagg agag 34 10 <210> 17

<211> 40

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 15 <223> Cebador

<400> 17 ccggaattcc tatttgcttc tcttgtaaac tttgttcaag 40

<210> 18

<211> 42 20 <212> ADN

<213> Artificial

<220> <223> Cebador

<400> 18 aaggagatat acatatgaca aaaaaagttg gtgtcggtca gg 42

<210> 19 5 <211> 43

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador

10 <400> 19 ctttaccaga ctcgagttac gcctttttca tctgatcctt tgc 43

<210> 20

<211> 35

<212> ADN 15 <213> Cebador

<400> 20 cccgggggat ccatggctac cgataatgac agctc 35

<210> 21

<211> 23 20 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 21 25 caccgctgag caataactag cat 23

<210> 22

<211> 383

<212> ADN

<213> Santalum album 30 <400> 22

<210> 23

<211> 26

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 23

ccgaaaagtg gttagccaaa agagtg 26 10 <210> 24

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 15 <223> Cebador

<400> 24 cgggtcggaa gcaatcgcgc agc 23

<210> 25

<211> 26 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 25 25 ccgatttcga caatagtttc tctagc 26

<210> 26

<211> 1725

<212> ADN

<213> Santalum album

<400> 26

<210> 27

<211> 569

<212> PRT

<213> Santalum album

<400> 27

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un procedimiento de producción de ß-santaleno que comprende

a) poner en contacto FPP con al menos un polipéptido con una actividad ß-santaleno sintasa y que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a SEC ID N.º: 1 o 3; b) opcionalmente, aislar el ß-santaleno producido en la etapa a).
2.

El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa a) comprende cultivar un organismo huésped no humano o célula capaz de producir FPP y transformada para expresar al menos un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a SEC ID N.º: 1 o 3 y que tiene una actividad ß-santaleno sintasa, según condiciones que conducen a la producción de ß-santaleno.
3.

El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el procedimiento comprende adicionalmente, antes de la etapa a), transformar un organismo huésped no humano o una célula huésped no humana capaz de producir FPP con al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEC ID N.º: 1 o 3 y que tiene una actividad ß-santaleno sintasa, tal que dicho organismo expresa dicho polipéptido.
4.

El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el al menos un ácido nucleico que codifica la ß-santaleno sintasa, comprende una secuencia de nucleótidos idéntica a la SEC ID N.º: 2, 4 o al complemento de la misma.
5.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que el organismo huésped no humano es una planta, una procariota o un hongo.
6.

El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el organismo huésped no humano es un microorganismo.
7.

El procedimiento de la reivindicación 6, en el que el microorganismo es una bacteria o levadura.
8.

El procedimiento de la reivindicación 7, en el que dicha bacteria es E. coli y dicha levadura es Saccharomyces cerevisiae.
9.

Un polipéptido que tiene una actividad ß-santaleno sintasa y que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEC ID N.º: 1 o 3.
10.

El polipéptido de la reivindicación 9, que consiste en una secuencia de aminoácidos idéntica a SEC ID N.º: 1 o 3.
11.

Un ácido nucleico que codifica un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 9 o 10.
12.

El ácido nucleico de la reivindicación 11, que comprende una secuencia de nucleótidos idéntica a SEC ID N.º: 2, 4

o al complemento de la misma.
13. El ácido nucleico de la reivindicación 12, que consiste en una secuencia de nucleótidos idéntica a SEC ID N.º: 2, 4

o al complemento de la misma.
14.

Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13.
15.

Un organismo o célula huésped no humano transformado para albergar al menos un ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, de tal forma que exprese o sobreexprese heterólogamente al menos un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 9 o 10.
16.

El organismo huésped no humano de la reivindicación 15, en el que dicho organismo huésped no humano es una planta, un procariota o un hongo.
17.

El organismo huésped no humano de la reivindicación 16, en el que dicho organismo huésped no humano es un microorganismo.
18.

El organismo huésped no humano de la reivindicación 17, en el que dicho microorganismo es una bacteria o levadura.
19.

El organismo huésped no humano de la reivindicación 18, en el que dicha bacteria es E. coli y dicha levadura es Saccharomyces cerevisiae.
20.

Un procedimiento de producción de al menos un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 19 que comprende

a) cultivar un organismo o célula huésped no humano transformado con el vector de expresión de la reivindicación 14, tal que ello alberge un ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 y exprese o sobreexprese un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 9 o 10;

b) aislar el polipéptido del organismo huésped no humano o de la célula huésped no humana cultivado en la etapa a).
21. El procedimiento de la reivindicación 20, que comprende adicionalmente, antes de la etapa a), transformar un organismo o célula huésped no humano con el vector de expresión de la reivindicación 14, tal que ello alberge un ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 y exprese o sobreexprese el polipéptido de la

5 reivindicación 9 o 10.
22. Un procedimiento de preparación de un polipéptido variante que tiene una actividad ß-santaleno sintasa que comprende las etapas de:

(a)

seleccionar un ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13;

(b)

modificar el ácido nucleico seleccionado para obtener al menos un ácido nucleico mutante;

10 (c) transformar células huéspedes u organismos unicelulares huéspedes con la secuencia de ácidos nucleicos mutante para expresar un polipéptido codificado por la secuencia de ácidos nucleicos mutante;

(d)

rastrear el polipéptido por al menos una propiedad modificada; y

(e)

opcionalmente, si el polipéptido no tiene ninguna actividad ß-santaleno sintasa variante deseada,

repetir las etapas del procedimiento (a) a (d) hasta que se obtiene un polipéptido con una actividad 15 ß-santaleno sintasa variante deseada;

(f) opcionalmente, si un polipéptido que tiene una actividad ß-santaleno sintasa variante deseada se identificó en la etapa (d), aislar el ácido nucleico mutante correspondiente obtenido en la etapa (c).

Figura 1, parte 2 Figura 1, parte 3 Figura 1, parte 4

Beta Santaleno

Figura 2A

Figura 2B