CN104004789A - 用于生产β-檀香萜的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种生产β-檀香萜的方法，所述方法包含将至少一种多肽与法呢基焦磷酸酯(FPP)接触。具体地，所述方法可在体外或体内生产香料和调味料领域非常有用的化合物—β-檀香萜。本发明还提供了在用于本发明方法中的多肽的氨基酸序列。本发明的又一部分是编码本发明多肽的核酸以及含有所述核酸的表达载体。本发明的又一目的是用于生产β-檀香萜的方法的经转化的非人宿主生物体或细胞。

Description

用于生产β-檀香萜的方法
本发明是2009年12月9日申请的发明名称为“用于生产β-檀香萜的方法”的第200980149896.7号发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明提供一种生产β-檀香萜的方法，所述方法包括将至少一种多肽与法呢基焦磷酸酯(FPP)接触。特别是，所述方法可以在体外或体内进行以产生β-檀香萜，其是一种在香料和调味料领域中非常有用的化合物。本发明还提供可用于本发明方法的多肽的氨基酸序列。编码本发明多肽的核酸和含有所述核酸的表达载体也是本发明的一部分。本发明的另一个目的是一种经转化以在生产β-檀香萜的方法中使用的非人宿主生物体或细胞。
背景技术
已经在大多数生物体(微生物、动物和植物)中发现了萜。这些化合物由称为异戊二烯单元的五碳单元组成，并按由结构之中存在的这些单元的数目来进行划分。因此单萜、倍半萜和双萜分别是包含10、15和20个碳原子的萜。例如，倍半萜已广泛见于植物界。许多倍半萜分子因它们的调味料和香味性质以及它们的美容、医药和抗菌效果而众所周知。已经鉴定出了300多种倍半萜烃类和3000多种倍半萜化合物(Joulain,D.,和W.A.,The Atlasof Spectral Data of Sesquiterpene Hydrocarbons,EB Verlag,Hamburg,1998；Connolly,J.D.,Hill R.A.,Dictionary of Terpenoids,Vol1,Chapman and Hall(publisher),1991)，并且每年还鉴定出许多新的结构。将通过不同方式如蒸汽蒸馏或溶剂萃取获得的植物提取物用作萜源。萜分子往往原样使用，但是有时候使用化学反应将该萜转化成其它的高价值分子。
萜的生物合成生产涉及的酶被称为萜合酶。事实上植物界中存在大量的倍半萜合酶，其全部使用相同的底物(法呢基焦磷酸酯,FPP)但是具有不同的产物分布。已经克隆了编码倍半萜合酶的基因和cDNA并且描述了相应的重组体酶。在植物中及其他生物体中的萜的生物合成已经被广泛研究，在此不另外详述，但可参考Dewick的Nat.Prod.Rep.，2002，19，181-222，其综述了萜生物合成路径的现有技术的状况。
β-檀香萜是天然生成的倍半萜分子，其可以被用作化学合成或生物合成β-檀香醇(如图2B所示)的起始原料，该檀香醇为檀香油的主要组分。通过蒸馏檀香物种的心材获得的檀香油是重要的香料成分。檀香也被大量用于熏香和传统医学。该油包含90％的倍半萜醇。在不同的檀香醇的异构体中，β-檀香醇对于典型的檀香油的甜木香和香脂气味起到主要贡献。其它组分例如表-β-檀香醇和α-檀香醇可同样有助于檀香木气味。
通常，植物天然提取物的价格和可用性取决于植物的丰度、油的收率和地理来源。另外，天然提取物的可获性和品质极大地依赖于导致每年差异化的气候及其他当地条件，使得某些年在高品质香料中使用上述成分非常困难，甚至不可能使用。由于过度开发自然资源、难以耕作、檀香植物的缓慢生长，在过去的十年期间檀香原料的可获性已经显著地减少。因此，有利的是提供一种β-檀香醇的来源，其更少地受可获性和品质的波动的影响。檀香倍半萜组分的化学合成迄今为止是不可利用的。因此合成β-檀香萜(然后其可被用于生产β-檀香醇)的生物化学途径很受关注。
在若干植物品种中鉴定出檀香烷型倍半萜、特别是具有β-檀香烷骨架的倍半萜。但是还未有能合成β-檀香萜的倍半萜合酶的记载。
在国际专利申请WO2006/134523中公开了一种能够合成至少一种双环和/或三环的具有檀香烷碳骨架的倍半萜的倍半萜合酶、相应的核酸和具有檀香烷碳骨架的该化合物的制备方法。但是，在其实施例中公开的倍半萜合酶产物中并没有检测到β-檀香萜的踪迹，仅有的具有檀香烷骨架的产物为表-β-檀香萜。表-β-檀香萜的性质与β-檀香萜的性质悬殊。特别是，在β-檀香醇的合成过程中表-β-檀香萜不是重要的。此外，在WO2006/134523中公开的倍半萜合酶仅仅与本发明序列共有27％的同一性。
从数据库中公知的倍半萜合酶和本发明的多肽的同一性的比率非常低。与本发明的β-檀香萜合酶最接近的蛋白序列是来自于白檀(Santalum album)(检索号ACF24767；Jones,C.G.,Keeling,C.I.,Ghisalberti,E.L.,Barbour,E.L.,Plummer,J.A.和Bohlmann,J.Arch.Biochem.Biophys.,2008,477(1),121-130)的单萜合酶，其与本发明的β-檀香萜合酶具有58％的氨基酸序列同一性。当与FPP接触之后，该酶产生超过90％的β-红没药烯并且没有檀香萜异构体形成。
除序列本身之间的差异之外，还应指出的是，由上述酶合成的产物的结构和性质与倍半萜β-檀香萜的结构和性质相差悬殊。特别是由该酶产生的单萜，即α-松油萜、柠檬稀、香茅醇、月桂烯、里哪醇和其它一些单体产物都不适合作为香料领域非常有用的成分β-檀香醇的合成的起始原料。
尽管广泛研究了萜的环化，但是由于它们的低丰度、通常的瞬时表达模式和在其表达组织中从树脂和酚类化合物的混合物中纯化它们的复杂性的原因，萜合酶的分离和表征仍然是困难的，尤其是在植物中。
本发明的目的是，如上所指出的，提供以经济的方式生产β-檀香萜的方法。因此，本发明的目的是生产β-檀香萜，同时有极少的浪费的方法、其节约能源和资源并同时减少了对化石燃料的依赖性。本发明的另一目的是提供能够合成可用作香料和/或芳香成分的β-檀香萜的酶。
使用的缩写
ACC     1-氨基环丙烷甲酸
bp      碱基对
kb      千碱基
BSA     牛血清清蛋白
2,4D    2,4-二氯苯氧基乙酸
DNA     脱氧核糖核酸
cDNA    互补DNA
dNTP    脱氧核苷三磷酸
DTT     二硫苏糖醇
EDTA    乙二胺四乙酸
FPP     法呢基焦磷酸酯
GC      气相色谱
IPTG    异丙基-D-硫代半乳糖苷
Kin     细胞分裂素
LB      溶菌肉汤
MS      质谱
PCR     聚合酶链式反应
RMCE    重组酶介导的盒式交换
3’-/5’-RACE  3’和5’cDNA末端快速扩增
RNA            核糖核酸
mRNA           信使核糖核酸
RNAse          核糖核酸酶
发明内容
本发明提供一种使用具有β-檀香萜合酶活性的多肽以经济、可靠并且可再现的方式生物合成生产β-檀香萜的方法。由于现有技术未曾记载过该多肽并且未曾描述过该β-檀香萜的生物合成，本发明是特别有价值的。本发明解决了对于香料业工业非常有用的化合物β-檀香萜的供给的非常重要的难题。本发明还提供一种与所述多肽密切相关的编码本发明方法中使用的多肽的核酸序列。多肽和核酸是非常重要的工具，它们同为实施本发明所必需的。对于用本发明的核酸进行修饰以异源表达本发明的多肽的载体和生物体来说也是同样的。
“倍半萜合酶”或“具有倍半萜合酶活性的多肽”是用于本发明目的作为能够催化从无环萜前体FPP合成倍半萜分子或倍半萜分子混合物的多肽。
作为“β-檀香萜合酶”或“具有β-檀香萜合酶活性的多肽”，此处我们是指能够催化从FPP开始合成任何立体异构体或其混合物形式的β-檀香萜的多肽。β-檀香萜可以是唯一的产物或可以是倍半萜混合物的一部分。β-檀香萜以图2A所示的结构来定义。
多肽催化特定倍半萜(例如β-檀香萜)的合成的能力可以简单地通过实施实施例3详述的酶活性分析来确认。
根据本发明，多肽也意味着包括截短的多肽，条件是它们能够保持如任何上述实施方案所定义的倍半萜合酶活性，而且它们与SEQ ID NO:1的相应片段共有至少规定百分数的同一性。
如本文以下所指出的，“通过修饰SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或它们的互补序列而获得的核苷酸序列”包含已经通过使用本领域公知的任何方法(例如通过引入任何类型的突变如缺失、插入或取代的突变)改变SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或它们的互补序列的序列所获得的任何序列。在与变体多肽及其制备方法有关的描述部分列举了上述方法的实例。
在两个肽或核苷酸序列之间的同一性百分比是在已经生成这两个序列的比对时，在这两个序列中相同的氨基酸或核苷酸残基数目的函数。相同的残基定义为在这两个序列中在给定的比对位置上相同的残基。在此处使用的序列同一性的百分比是由最优比对，通过将在两个序列之间的相同残基的数目除以在最短的序列中的残基的总数然后乘以100而计算得到的。该最佳比对是同一性百分比可能是最高的比对。在该比对的一个或多个位置中的一或两个序列中引入间隙以便获得最佳比对。然后在序列同一性的百分比计算中将这些间隙作为不相同的残基来考虑。
以测定氨基酸或核酸序列同一性百分比为目的的比对可以使用计算机程序以多种方式来实现，例如在万维网上可获得的公开可用的计算机程序。优选，可使用来自National Center for BiotechnologyInformation(NCBI)的地址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/bl2seq/wblast2.cgi的BLAST程序(Tatianaet al,FEMS Microbiol Lett.,1999,174:247-250,1999)，其参数设为默认，来获得肽或核苷酸序列的最优比对，以及来计算序列同一性的百分比。
因此，本发明的一个目的是一种生产β-檀香萜的方法，其包含：
a)使FPP与至少一种具有β-檀香萜合酶活性的多肽接触，该多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3有至少50％同一性的氨基酸序列；
b)非强制选择地，分离在步骤a)中产生的β-檀香萜。
根据一个优选的实施方案，β-檀香萜占由本发明方法生产的产物的至少20％、优选至少30％、优选至少35％。
该方法可在体外和体内实施，条件是本发明方法不包含仅涉及植物天然代谢而无任何转化的方法，其在下文中将进一步详细解释。
要与FPP在体外接触的多肽可以通过使用标准蛋白质或酶提取技术从表达它的任何生物体中提取来获得。如果宿主生物体是将本发明多肽释放到培养基内的单细胞生物或细胞，可以简单地从该培养基内收集该多肽，例如通过离心法、非强制选择地随后进行洗涤步骤和在适合的缓冲溶液中再悬浮。如果该生物体或细胞将该多肽聚集在它的细胞之内，该多肽可以通过分裂或溶解该细胞并进一步自该细胞溶解产物提取该多肽来获得。
然后可以将具有β-檀香萜合酶活性的多肽(以分离形式或与其它蛋白质一起，例如以从培养细胞或微生物中获得的粗蛋白提取物的方式)悬浮在最佳pH下的缓冲溶液中。如果适当，可以添加盐、DTT、BSA及其他种类的酶辅助因子以便优化酶活性。可以调节这些酶辅助因子的浓度以获得最佳的收率。例如降低多肽悬浊液中Mg2+离子浓度对于增加β-檀香萜的收率是非常有利的。最佳的Mg2+离子浓度为2～0.75mM。适当的条件将在下文的实施例中更详细地描述。
将前体FPP添加到该多肽悬浮液中，然后将其在最佳的温度下培养，例如在15℃和40℃之间、优选在25℃和35℃之间、更优选在30℃下。在培养之后，可以非强制选择地在自该溶液去除多肽之后通过标准分离工序如溶剂萃取和蒸馏将产生的β-檀香萜从该培养的溶液中分离出来。
根据另一个优选方案，任何上述实施方案中的方法是在体内进行的。在这种情况下，步骤a)包含在有利于生产β-檀香萜的条件下培养能够生产FPP并且经转化以表达至少一种多肽的非人宿主生物体或细胞，其中该多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3有至少50％同一性的氨基酸序列并且具有β-檀香萜合酶活性。
根据更优选的实施方案，该方法在步骤a)之前还包含用编码多肽的至少一种核酸将能够生产FPP的非人生物体或细胞转化以使所述生物体表达所述多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQID NO:3有至少50％同一性的氨基酸序列并且具有β-檀香萜合酶活性。
本发明的这些实施方案是特别有益的，因为有可能在体内进行该方法，无需预先分离该多肽。在经转化以表达所述多肽的生物体或细胞之内直接发生该反应。
根据本发明特定的实施方案，该至少一种编码β-檀香萜合酶的核酸包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或它们的互补序列有至少50％、优选至少55％、优选至少60％、优选至少65％、优选至少70％、优选至少75％、优选至少80％、优选至少85％、优选至少90％、更优选至少95％甚至更加优选至少98％同一性的核苷酸序列。根据更优选的实施方案，所述核酸包含核苷酸序列SEQ IDNO:2，SEQ ID NO:4或它们的互补序列。在更加优选的实施方案中，所述核酸由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或它们的互补序列组成。
在另一优选实施方式中，核酸由与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或它们的互补序列有至少50％、优选至少55％、优选至少60％、优选至少65％、优选至少70％、优选至少75％、优选至少80％、优选至少85％、优选至少90％、更优选至少95％甚至更加优选至少98％同一性的核苷酸序列组成。在更优选的实施方案中，所述核酸由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或它们的互补序列组成。
根据更加优选的实施方式，任何上述实施方式中使用的该至少一种核酸包含通过修饰SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或它们的互补序列获得的核苷酸序列。根据更加优选的实施方式，所述至少一种核酸由通过修饰SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或它们的互补序列获得的核苷酸序列组成，优选SEQ ID NO:3或它的互补序列。
根据另一实施方式，该至少一种核酸分离自檀香种的植物，优选自白檀。
该生物体或细胞意在“表达”多肽，条件是该生物体或细胞被转化以包含编码所述多肽的核酸，该核酸被转录成mRNA并且在该宿主生物体或细胞中发现该多肽。术语“表达”包含“异源表达”和“过表达”，后者是指mRNA、多肽和/或酶活性的水平超过在非转化生物体或细胞内测量得到的水平。随后在致力于将上述转化的非人宿主生物体或细胞作为本发明特定目的的说明书部分和实施例中对转化非人宿主生物体或细胞的适合方法作更详细地描述。
特定的生物体或细胞，当其天然产生FPP时或当其并不天然产生FPP但可经转化以产生FPP时，不管是用此处描述的核酸转化之前还是与所述核酸一起都意味着“能够产生FPP”。经转化的与天然存在的生物体或细胞相比产生更高量FPP的生物体或细胞也包括在“能够产生FPP的生物体或细胞”内。转化生物体(例如微生物)以便它们产生FPP的方法已经是本领域公知的。这些方法可以例如在文献中找到，例如在下列出版物中：Martin,V.J.,Pitera，D.J.,Withers,S.T.,Newman,J.D.和Keasling,J.D.Nat Biotechnol.,2003,21(7),796-802(大肠杆菌的转化)；Wu,S.,Schalk,M.,Clark,A.,Miles,R.B.,Coates,R.和Chappell,J.,Nat Biotechnol.,2006,24(11),1441-1447(植物的转化)；Takahashi,S.,Yeo,Y.,Greenhagen,B.T.,McMullin,T.,Song,L.,Maurina-Brunker,J.,Rosson,R.,Noel,J.,Chappell,J,Biotechnology andBioengineering,2007,97(1),170-181(酵母的转化)。
为了在体内实施本发明，在有利于生产β-檀香萜的条件下培养宿主生物体或细胞。因此，如果该宿主是转基因植物，则提供最佳的生长条件，例如，如最佳的光、水和营养条件。如果该宿主是单细胞生物，有利于生产β-檀香萜的条件可以包含在宿主的培养基内添加适合的辅助因子。另外，可以选择培养基，以便最佳化β-檀香萜的合成。在下列实施例中更详细地描述了最佳的培养条件。
适合于在体内进行本发明方法的非人宿主生物体可以是任何非人的多细胞或单细胞生物体。在优选的实施方案中，用于在体内进行本发明的非人宿主生物体是植物、原核生物或真菌。可以使用任何植物、原核生物或真菌。特别有用的植物是天然产生高含量萜的植物。在更优选的方案中，该植物选自茄科(Solanaceae)、禾本科(Poaceae)、十字花科(Brassicaceae)、碟形花科(Fabaceae)、锦葵科(Malvaceae)、菊科(Asteraceae)或唇形科(Lamiaceae)。例如，该植物选自烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、高粱属(Sorghum)、拟南芥属(Arabidopsis)、芸苔属(Brassica(油菜))、苜蓿属(Medicago(紫花苜蓿))、棉属(Gossypium(棉花))、蒿属(Artemisia)、鼠尾草属(Salvia)和薄荷属(Mentha)。优选，该植物属于烟草(Nicotiana tabacum)种。
在更优选的实施方案中，用于在体内进行本发明方法的非人宿主生物体是微生物。可以使用任何微生物，但是根据更加优选的实施方案，所述微生物是细菌或酵母。最优选，所述细菌是大肠杆菌(E.coli)，所述酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
这些生物体中的一些天然不会产生FPP。为了适于进行本发明的方法，必须将这些生物体转化以产生所述前体。如以上所述，可以在用上述任何实施方案描述的用核酸修饰之前或者同时将它们进行转化。
还可以使用分离的高等真核细胞代替完整生物体作为宿主以便在体内实施本发明的方法。适合的真核细胞可以是任何非人的细胞，但是优选植物细胞或真菌细胞。
根据一个优选实施方案，具有β-檀香萜合酶活性并在上述任何实施方案中使用的至少一种多肽或由用于任何上述实施方案中的核酸编码的至少一种多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3有至少55％、优选至少60％、优选至少65％、优选至少70％、优选至少75％、优选至少80％、优选至少85％、优选至少90％、更优选至少95％甚至更加优选至少98％同一性的氨基酸序列。根据更优选的实施方案，所述多肽包括氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQID NO:3。在更加优选的实施方案中，所述多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3。
在另一个优选实施方案中，多肽由与SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3有至少50％、优选至少55％、优选至少60％、优选至少65％、优选至少70％、优选至少75％、优选至少80％、优选至少85％、优选至少90％、更优选至少95％甚至更加优选至少98％同一性的氨基酸序列组成。在更加优选的实施方式中，所述多肽由SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:3组成。
根据另一优选实施方式，上述任一实施方式中使用的或由上述任一实施方式中使用的核苷酸编码的具有β-檀香萜合酶活性的至少一种多肽包含通过基因工程获得的SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3的变体氨基酸序列，条件是所述变体保持了如上定义的β-檀香萜合酶活性并且与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3具有所需百分比的同一性。换句话说，所述多肽优选包含通过修饰SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4或它们的互补序列获得的核苷酸序列编码的氨基酸序列。根据更优选的实施方式，上述任一实施方式中使用的或由上述任一实施方式中使用的核苷酸编码的具有β-檀香萜合酶活性的至少一种多肽由通过基因工程获得的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的变体氨基酸序列组成，即，通过修饰SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或它们的互补序列获得核苷酸序列编码的氨基酸序列。
根据另一优选实施方式，上述任一实施方式中使用的或由上述任一实施方式中使用的核苷酸编码的具有β-檀香萜合酶活性的至少一种多肽是可在其它生物体中(例如其它植物品种中)天然发现的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的变体，条件是该变体保持了如上定义的β-檀香萜合酶活性并且它们与SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3具有规定百分比的同一性。
在此处所使用的多肽指的是包含此处标明的氨基酸序列的多肽或肽片段、以及截短的或变体多肽，条件是它们保持如以上定义的β-檀香萜合酶活性，而且它们与相应的SEQ ID NO:1或SEQID NO:3片段共有至少所定义的百分比的同一性。
变体多肽的实例是由选择性mRNA剪接或此处所述形成多肽的蛋白酶剪切而得到的天然产生的蛋白质。可归因于蛋白水解的变体包括，例如，当在不同类型的宿主细胞中表达时，由于从本发明多肽上蛋白水解移除一个或多个末端氨基酸而导致在N-或C-末端的差异。本发明也包含如其后所描述的用由本发明核酸的天然或人工突变而获得的核酸编码的多肽。
由在氨基和羧基末端融合额外的肽序列而产生的多肽变体也可用于本发明的方法。尤其是这样的融合可以提高多肽的表达，在期望的环境或表达系统中利于蛋白质的提纯或多肽酶活性的改善。这种额外的肽序列可以例如是信号肽。因此，本发明包含使用变体多肽的方法，例如通过与其它寡肽或多肽融合而获得的多肽和/或与信号肽连接的多肽。在本发明的方法中有利地还可以使用由与另外的功能蛋白(例如来源于萜生物合成路径的另外的蛋白质)融合而产生的多肽。
根据另一实施方式，上述任一实施方式中使用的或由上述任一实施方式中使用的核苷酸编码的具有β-檀香萜合酶活性的至少一种多肽是从檀香种类的植物(优选白檀中)分离出来的。
实施本发明的重要工具为多肽本身。因此，具有β-檀香萜合酶活性并且包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3有至少50％同一性的氨基酸序列的多肽是本发明的另一目的。
根据优选实施方式，多肽能够生产倍半萜混合物，其中β-檀香萜占生成的倍半萜的至少20％、优选占至少30％、优选占至少35％。
根据优选实施方式，多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3有至少55％、优选至少60％、优选至少65％、优选至少70％、优选至少75％、优选至少80％、优选至少85％、优选至少90％、更优选至少95％甚至更加优选至少98％同一性的氨基酸序列。根据更优选的实施方式，该多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQID NO:3。
根据另一优选实施方式，多肽由与SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3有至少50％、优选至少55％、优选至少60％、优选至少65％、优选至少70％、优选至少75％、优选至少80％、优选至少85％、优选至少90％、更优选至少95％甚至更加优选至少98％同一性的氨基酸序列组成。根据更优选的实施方式，多肽由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3组成。
至少一种多肽包含由基因工程获得或由檀香植物或其它植物种类中天然发现的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的变种氨基酸序列。换句话说，当变体多肽是通过基因工程获得时，所述多肽包含通过修饰SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或它们的互补序列获得核苷酸序列编码的氨基酸序列。根据更优选的实施方式，具有β-檀香萜合酶活性的该至少一种多肽由通过基因工程获得的SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:3的变体的氨基酸序列组成，即，通过修饰SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或它们的互补序列获得的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
根据另一实施方式，多肽是从檀香种类的植物中，优选白檀中分离出来的。
此处所使用的多肽指的是含有此处确定的氨基酸序列的多肽或肽片段、以及截短的或变体多肽，条件是它们保持如上定义的活性，而且它们与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的相应片段有至少所定义百分比的同一性。
变体多肽的实例是由选择性mRNA剪接或此处所述形成多肽蛋白酶剪切而得到的天然产生的蛋白质。可归因于蛋白水解的变体包括，例如，当在不同类型的宿主细胞中表达时，由于从本发明多肽上蛋白水解去移除一个或多个末端氨基酸而导致在N-或C-末端的差异。如其后所描述本发明还包含用由本发明核酸的天然或人工突变而获得的核酸编码的多肽。
由额外的肽序列在氨基和羧基末端融合而产生的多肽变体也包含于本发明的多肽之中。尤其是这样的融合可以在期望的环境或表达系统中提高多肽的表达，利于蛋白质的提纯或多肽酶活性的改善。这种额外的肽序列可以例如为信号肽。因此，本发明包括本发明的多肽变体，例如通过与其它寡肽或多肽融合而获得的多肽变体和/或与信号肽连接的那些多肽变体。本发明的多肽还可以包括由与另外的功能蛋白(例如来源于萜生物合成路径的另外的蛋白质)融合而产生的多肽。
如上所述，编码本发明多肽的核酸是修饰在体内进行该方法时意欲使用的非人宿主生物体或细胞的有效手段。
因此，编码任何上述实施方案所述的多肽的核酸也是本发明的一个目的。
根据优选的实施方案，该核酸包含与SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4或它们的互补序列有至少50％、优选至少55％、优选至少60％、优选至少65％、优选至少70％、优选至少75％、优选至少80％、优选至少85％、优选至少90％、更优选至少95％甚至更加优选至少98％同一性的核苷酸序列。根据更加优选的实施方案，该核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或它们的互补序列。
根据另一优选的实施方案，该核酸由与SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4或它们的互补序列有至少50％、优选至少55％、优选至少60％、优选至少65％、优选至少70％、优选至少75％、优选至少80％、优选至少85％、优选至少90％、更优选至少95％甚至更加优选至少98％同一性的核苷酸序列组成。根据更加优选的实施方案，该核酸由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或它们的互补序列组成。
根据又一实施方式，该核酸是从檀香种类植物中，优选从白檀中分离出来的。
本发明的核酸可以定义为包括单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物(DNA和/或RNA)。术语“核苷酸序列”也应该被理解为包含分离片段形式或作为较大核酸组分的聚核苷酸分子或寡核苷酸分子。本发明的核酸还包含某些分离的核苷酸序列，其包括基本上无污染内源材料的那些核苷酸序列。本发明的核酸可以是截短的，条件是其编码本发明包含的如上所述的多肽。
本发明的核酸可以是檀香物种或其它物种植物中天然存在的，也可以通过修饰SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或它们的互补序列获得。优选所述核酸由通过修饰SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或它们的互补序列获得的核苷酸序列组成。
本发明也包括包含由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或它们的互补序列突变而获得的序列的核酸，条件是该序列与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或它们互补序列的相应片段有至少所定义百分比的同一性，并且它们编码如上任何实施方案所定义的具有β-檀香萜合酶活性的多肽。突变可以是这些核酸任何种类的突变，如点突变、缺失突变、插入突变和/或移码突变。可以制备变体核酸以便使其核苷酸序列适应特异性表达系统。例如，已知细菌的表达系统在由优选的密码子编码氨基酸时更有效地表达多肽。由于该遗传密码的简并性，其中多于一个的密码子可以编码相同的氨基酸，多个DNA序列可以编码相同的多肽，本发明包含所有这些DNA序列。
另一个用于转化适于在体内实施本发明方法的宿主生物体或细胞的重要工具是包括本发明任何实施方案的核酸的表达载体。因此这种载体也是本发明的一个目的。
如此处所使用的“表达载体”包括任何直线的或环状的重组载体，其包括但不限于病毒载体、噬菌体和质粒。技术人员能够根据表达系统选择适合的载体。在一个实施方案中，该表达载体包括本发明的核酸，其可操作地连接到至少一种控制转录、翻译、开始和终止的调节序列，如转录的启动子、操纵子或增强子，或mRNA核糖体的结合部位，并且非强制选择地包括至少一种选择标记。当该调节序列功能上与本发明的核酸相关时，该核苷酸序列是“可操作地连接的”。
本发明的表达载体可在如下进一步公开的用于在包含本发明核酸的宿主生物体和/或细胞中制备遗传转化的宿主生物体和/或细胞的方法和生产具有β-檀香萜合酶活性的多肽的方法中使用。
经转化以包含本发明至少一种核酸以便使其异源表达或过表达本发明至少一种多肽的重组非人宿主生物体和细胞也是实施本发明方法的十分有用的手段。因此，这种非人宿主生物体和细胞是本发明的另一个目的。
任何上述实施方案所述的核酸都可用于转化该非人宿主生物体和细胞并且所表达的多肽可以是任何上述的多肽。
本发明的非人宿主生物体可以是任何非人的多细胞或单细胞生物体。在优选的实施方案中，该非人宿主生物体是植物、原核生物或真菌。根据本发明任何植物、原核生物或真菌都是适合于转化的。特别有用的植物是天然产生高数量萜的植物。在更优选的实施方案中，该植物选自茄科、禾本科、十字花科、蝶形花科、锦葵科、菊科或唇形科类。例如，该植物选自烟草属、茄属、高粱属、拟南芥属、芸苔属(油菜)、苜蓿属(紫花苜蓿)、棉属(棉花)、蒿属、鼠尾草属和薄荷属。优选地，该植物属于烟草种。
在更优选的实施方案中，该非人宿主生物体是微生物。任何微生物都适合于本发明，但是根据更加优选的实施方案，所述微生物是细菌或酵母。最优选，所述细菌是大肠杆菌，而所述酵母是酿酒酵母。
还可以将分离的高等真核细胞转化以代替完整的生物体。作为高等真核细胞，这里我们是指除酵母细胞之外的任何非人真核细胞。优选的高等真核细胞是植物细胞或真菌细胞。
术语“经转化”是指宿主经过遗传工程以便使其包含上述任何实施方案中所需要的每个核酸的一个、两个或更多个拷贝。优选地，术语“经转化”涉及异源表达由该核酸编码的多肽(该多肽使用所述核酸转化)以及过表达所述多肽的宿主。因此，在实施方案中，本发明提供了经转化的生物体，其中该多肽的表达量高于未经如此转化的相同生物体的表达量。
现有技术中已知有多种方法用于生成转基因宿主生物体或细胞，如植物、真菌、原核生物或高等真核细胞的培养物。适用于细菌、真菌、酵母、植物和哺乳动物细胞宿主的克隆和表达载体的描述参见，例如，Pouwels等的Cloning Vectors：A Laboratory Manual,1985,Elsevier,New York和Sambrook等的Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第二版,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press。尤其用于高等植物和/或植物细胞的克隆和表达载体是技术人员可以得到的。参见例如Schardl等的Gene61:1-11,1987。
转化宿主生物体或细胞以使其包含转基因核酸的方法为技术人员所熟知。对于生产转基因植物，例如通用的方法包括：植物原生质体的电穿孔法、脂质体介导的转化法、土壤杆菌介导的转化法、聚乙二醇介导的转化法、粒子轰击法、植物细胞的显微注射法和应用病毒的转化法。
在一个实施方案中，经转化的DNA被整合到非人宿主生物体和/或细胞的染色体中，从而得到稳定的重组体系统。现有技术中任何公知的染色体整合方法可以应用于本发明的实践中，包括但不限于重组酶介导的盒式交换(RMCE)、病毒位点特异性染色体插入法、腺病毒法和核内注射法。
为了在体外实施如上所述生产β-檀香萜的方法，提供一种制备如本发明任何实施方案所述的至少一种具有β-檀香萜合酶活性的多肽的方法是非常有利的。因此，本发明提供一种本发明任何实施方案所述的至少一种多肽的生产方法，该方法包括：
a)培养用本发明表达载体转化的非人宿主生物体或细胞，以便使其包含本发明的核酸并且表达或过表达本发明的多肽；
b)从步骤a)中培养的非人宿主生物体或细胞中分离该多肽。
根据优选实施方案，所述方法还包含在步骤a)之前，用本发明的表达载体转化非人宿主生物体或细胞，以便使其包含本发明的核酸并且表达或过表达本发明的多肽。
可以使用任何上述实施方案所述的核酸。
可以用如上所述在体内生产β-檀香萜的方法来转化和培养该非人宿主生物体或细胞。可使用本领域公知的任何技术从生物体或细胞中分离出特定多肽以实施步骤b)。
“多肽变体”这里指的是这样一种多肽，其具有β-檀香萜合酶活性且基本上与任何上述实施方案的多肽同源，但是其具有的氨基酸序列因为一处或多处缺失、插入或取代而不同于由本发明任一核酸序列所编码的氨基酸序列。
变体可以包含保守取代序列，意味着某一特定氨基酸残基被一具有类似理化特性的残基所取代。保守取代的实例包括：用一个脂肪族残基取代另一个脂肪族残基，例如，Ile、Val、Leu或Ala之间相互取代；或者用一个极性残基取代另一个极性残基，例如在Lys和Arg之间、Glu和Asp之间或Gln和Asn之间相互取代。参见Zubay,Biochemistry,1983,Addison-Wesley Pub.Co.。这类取代的效果可以用取代打分矩阵，如Altschul,J.Mol.Biol.,1991,219,555-565中所述的PAM-120、PAM-200和PAM-250来计算。其他这类保守取代，例如具有近似疏水特性的完整区域的取代，已为本领域熟知。
天然生成的肽变体也包含在本发明范围之内。这种变体的实例是由于选择性mRNA剪接或者本文所述多肽的蛋白酶剪切而得到的蛋白质。蛋白水解引起的变体包括，例如，在不同类型宿主细胞中表达时，由本发明序列编码的多肽由于蛋白水解移除了一个或多个末端氨基酸而导致N-或C-末端的差异。
本发明多肽的变体可以用于获得例如期望的增强的或减弱的酶活性、改性的区域化学(regiochemistry)或立体化学、或者改变的底物利用或者产物分布、增加了亲和力的底物、改进了特异性的一种或多种目标化合物的生产方法、酶反应速率的增加、在特定环境(pH、温度、溶剂等等)中的更高活性或稳定性、或者在目标表达系统中的改进的表达水平。变体或定位突变体可以通过现有技术已知的任何方法来生成。天然多肽的变体和衍生物能够通过分离其它或相同植物品系或物种(例如，来自檀香属物种的植物)的天然产生的变体或者变体的核苷酸序列来获得，或者通过对编码本发明多肽的核苷酸序列进行人工规划突变来获得。天然氨基酸序列的改变可通过多种传统方法中的任一种完成。
由附加肽序列在本发明多肽的氨基和羧基末端融合产生的多肽变体可被用于增强多肽的表达，在期望的环境或表达系统中利于蛋白的纯化或提高多肽的酶活性。这种附加肽序列例如可为信号肽。因此，本发明包含本发明多肽的变体，例如通过与其它寡肽或多肽和/或连接到信号肽上的多肽融合获得的那些变体。包含在本发明范围内的融合多肽还包含由融合其它功能蛋白质如来自萜生物合成路径的其它蛋白质而产生的融合多肽。
因此，在实施方案中，本发明提供一种如在上述任何实施方案中所述的具有β-檀香萜合酶活性的变体多肽的制备方法，该方法包括步骤：
(a)选择如上公开的任何实施方案的核酸；
(b)修饰所选择的核酸以获得至少一种突变核酸；
(c)用突变核酸序列转化宿主细胞或单细胞生物以表达用该突变核酸序列编码的多肽；
(d)按照至少一种修饰的性质筛选该多肽；和，
(e)非强制选择地，如果该多肽不具有期望的变体β-檀香萜合酶活性，则重复步骤(a)至(d)直到获得具有所期望的变体β-檀香萜合酶活性的多肽；
(f)非强制选择地，如果在步骤(d)中鉴别出具有所期望的变体β-檀香萜合酶活性的多肽，则分离在步骤(c)中获得的相应突变核酸。
根据优选实施方式，制备的变体多肽能够生产倍半萜，其中β-檀香萜占生产的倍半萜的至少20％、优选至少30％、优选至少35％。
在步骤(b)中，例如通过随机诱变，位点特异性诱变或DNA改组方法可生成大量的突变核酸序列。基因改组的详细的步骤可在Stemmer的DNA shuffling by random fragmentation and reassembly：in vitrorecombination for molecular evolution.Proc Natl Acad Sci USA.,1994,91(22):10747-1075中发现。总之，DNA改组指的是已知序列在体外的随机重组的方法，其包括选择至少两种核酸用于重组。例如能够通过合成含有突变序列的寡聚核苷酸在特定位点引入突变，与能够连接到天然序列片段的限制性位点侧面相连。连接之后，得到的重构序列编码具有期望的氨基酸插入、置换或缺失的类似物。另外，可使用寡聚核苷酸-定位位点特异性诱变步骤以提供改变的基因，其中预先确定的密码子可通过置换、缺失或插入来改变。
因此，包含SEQ ID NO：1的多肽可与任何其它编码核酸的倍半萜合酶例如从除白檀之外的有机体中分离出来的倍半萜合酶进行重组。因此，可获得并分离出突变核酸，其可根据例如本实施例公开的标准步骤来转化宿主细胞。
在步骤(d)中，对步骤(c)中获得的多肽进行至少一种修饰的特性例如期望改变的酶活性的筛选。对表达的多肽进行活性筛选所期望的酶活性的实例包括由KM或Vmax值度量的增强或减弱的酶活性、修饰的区域化学或立体化学、和改变的底物利用或产物分布。酶活性的筛选可根据本领域的技术人员熟知的步骤以及在本实施例中公开的步骤来实施。
提供步骤(e)以重复步骤(a)～(d)的过程，优选其可平行操作。因此，通过生成大量的突变核酸，可同时用不同的突变核酸将多个宿主细胞转化，使较多数量的多肽进行随后的筛选。因此获得期望的多肽变体的机会随技术人员意愿增加。
本申请中提及的所有出版物均以参照的方式并入于此，以公开并描述与所引用出版物有关的方法和/或材料。
附图说明
图1：由来自白檀(SaSantS)的重组檀香萜合酶生产的倍半萜的GC-MS分析。
图1(1)：总离子色谱图。1：α-檀香萜；2：反式-α-佛手柑油烯；3：表-β-檀香萜；4：β-檀香萜；5：β-法呢烯
图1(2)-图1(4)：确认为倍半萜的峰值的质谱
图2：β-檀香萜和β-檀香醇的分子结构。
具体实施方式
现在将通过下列实施例进一步详细地描述本发明。
实施例1
萜合酶相关序列的DNA文库构建、测序和提取
将从白檀(五周龄)无菌发芽的种子获得的幼下胚轴段用于诱导愈伤组织形成。白檀的种子由B&T World Seeds(Aigues-Vives,法国)和Sandeman Seeds(Lalongue,法国)处获得。首先将种子在2.5％HClO中表面消毒120分钟，并且在无菌的超纯水中清洗三次。然后将种子去壳并置于添加了15g/L蔗糖和7.8g/L琼脂，pH为5.7的MS基础培养基(Murashige&Skoog,1962,Physiologia Plantarum15,473-497)上。通常在9-18天后发芽，发芽率大约40％。在27℃的，阴凉、白色萤光以及16小时的光照周期的培养室内使幼芽离体生长2-3个月。将下胚轴段切成3-4mm横向段，并将其置于在陪替氏培养皿中添加了0.5μM2,4D(2,4-二氯苯氧基乙酸，Sigma-Aldrich Co.)和10μM Kin(细胞分裂素,Sigma-Aldrich Co.)的Gbg基础培养基(Gamborg&al,1968,Exp Cell Res.50(1),151-158)上，以诱导绿色愈伤组织的形成。通过每四周将所述组织转移到陪替氏培养皿中的新培养基上来维持愈伤组织的生长。所有的愈伤组织培养均在生长室内并在上述相同条件下进行。
将在含有5μM Kin和2mM ACC的Gbg培养基中培养1个月后获得的愈伤组织用于RNA的提取和cDNA文库的构建。按照Lefort和Douglas(Ann.For.Sci.56(1999),259-263)所述的步骤提取总RNA，只是省略了RNA酶处理。在200μl不含RNA酶的水中将提取物再悬浮，并以20000g将其离心两次，每次10分钟以除去多糖。从2.2g的细胞中获得大约125μg总RNA。根据制造商手册使用2.0mRNA分离试剂盒(Invitrogen)纯化mRNA，和使用合成试剂盒(Clontech Laboratories,Inc.)生成cDNA文库。
将由Illumina(San Diego,California)开发的小DNA片段的大规模并行测序技术用于整个cDNA文库的测序。制备用于测序DNA，通过Fasteris SA(Plan-les-Ouates，瑞士)实施对read(读出序列)的测序和组装。cDNA文库用如下基因组样本制备试剂盒(Illumina)进行处理并在Genome Analyzer system(Illumina)上进行测序。总共获得了4.03×106的35bp序列(read)。这些read使用EDENA2.1.1进行拼接，该软件用于发现read间重叠和拼接从头重叠群(de novocontig)(Hernandez等，De novo bacterial genome sequencing:Millions of veryshort reads assembled on a desktop computer.Genome Res.2008；18:802–809)。使用最小匹配26-20碱基进行拼接。在排除短于100碱基的contig后，根据用于拼接所选择的参数得到最大长度为1331-1914的1983-3473个独特的contig。另一拼接使用Velvet1.0程序(Zerbinoand Birney(2008),Velvet:algorithms for de novo short read assembly using deBruijn graphs.Genome Res.18(5),821-829)进行，得到100-1616之间的碱基长度的5905个独特contig。
使用Blastx算法(Altschul等,J.Mol.Biol.215,403-410,1990；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)将所有产生的contig与蛋白序列数据库(非冗余蛋白序列，NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov)比较。将显示出与植物倍半萜合酶具有显著的序列同源性的这些contig保留下来。总共选出具有100-621个碱基长度的46个contig。随后使用CAP程序(Huang,Genomics14(1),18-25,1992)处理这些contig以拼接和生成更长的序列。5个445-1064长度的独特的contig由此被拼接出来。推定的氨基酸序列显示出与植物萜合酶，特别是与记载或注释作为单萜合酶的序列，具有显著同源性。这些氨基酸序列的比对显示存在至少2条不同的cDNA(在整个序列比对中绝大多数位置上都发现了这两条序列)。该序列比对还显示存在至少一个N-末端和一个C-末端序列。为了获得全长序列以及为每一条cDNA定位确切的5’-末端和3’-末端序列，使用了cDNA末端快速扩增(RACE)实验。
实施例2
萜合酶cDNA的全长序列的扩增
从如上所述的5个contig的一个设计一系列引物用于RACE实验。因此，根据SCH5-contig-5(SEQ ID NO:5)得出了正向引物SCH5-Ct58-R1(SEQ ID NO:6)和SCH5-Ct58-R2(SEQ ID NO:7)和反向引物SCH5-Ct58-F3(SEQ ID NO:8)和SCH5-Ct58-F4(SEQ ID NO:9)。
使用通用混合引物(UPM)(SMARTTM RACE cDNA扩增试剂盒,Clontech Laboratories,Inc.)进行PCR，在50μl最终体积中含200μM混合dNTP、5μl cDNA文库(实施例1)、0.2μM基因特定引物、0.2μM UPM混合引物(Clontech Laboratories,Inc.)、1μl Advantage2混合聚合酶(Clontech Laboratories,Inc.)和5μl10x cDNA PCR反应缓冲液(Clontech Laboratories,Inc.)。热循环条件如下：94℃下3分钟；94℃下30秒和72℃下3分钟，5个循环；94℃下30秒和70℃下3分钟，5个循环；94℃下30秒和68℃下3分钟，5个循环；72℃下3分钟。使用5’RACE，获得了包括5’末端的cDNA的610bp DNA片段(SCH5-Ct58_RR1,SEQ ID NO:10)。使用3’RACE，获得了1049bp片段(SCH5-Ct58-RF4,SEQ ID NO:11)，并且具有SCH5-contig-5序列(SEQ ID NO:5)的两个RACE产物的结合重组为一个新的全长cDNA(SCH5-Ct58,SEQ ID NO:12)。2157bp SCH5-Ct58cDNA编码569个氨基酸蛋白(SEQ ID NO:13)，该蛋白显示出与植物萜合酶序列有同源性，并且含有萜合酶特征的基序(例如存在于所有单萜和倍半萜合酶中的DDxxD基序)。有趣的是与倍半萜合酶相比该蛋白显示出与单萜合酶更高的相似性。然而，叶绿体肽信号(植物单萜合酶中常见特征)的存在不能从N-末端序列的分析(Emanuelsson,O.,Nielsen,N.和von Heijne,G.1999.ChloroP,a neuralnetwork-based method for predicting chloroplast transit peptides and theircleavage sites.Protein Science8,978-984)中预测得到。
实施例3
SCH5-Ct58的异源表达和体外酶活性
我们决定对SCH5-Ct58(SEQ ID NO:12)的DNA序列进行修饰并且重新设计该序列以获得在大肠杆菌细胞中最佳的异源表达。以真实的氨基酸序列为起始，首先必须在cDNA文库中建立SCH5-Ct58的确切的核苷酸序列。使用Eland软件(Illumina)以最大2个错配来提取与SCH5-Ct58序列(SEQ ID NO:12)匹配的所有read。总共恢复了5224个read，并且使用CAP程序(Huang,Genomics14(1),18-25,1992)以SCH5-Ct58DNA序列(SEQ IDNO:12)作为参照进行比对。整个序列的平均覆盖率高于100X，这使得明确地推定出新cDNA序列SCH5-Ct94(SEQ ID NO:14)。在这个新的序列中，与从RACE结果推定的SCH5-Ct58序列(SEQ IDNO:12)相比订正了5个碱基，并且那些订正得出了具有两个残基差异的新的氨基酸序列(SCH5-Ct94,SEQ ID NO:15)。对于异源表达来说，SCH5-Ct94(SEQ ID NO:14)的DNA序列被修饰以移去了第一个23位密码子并且用ATGGCT序列取代，并且改变该密码子使用以优化用于大肠杆菌表达的序列(DNA2.0,Menlo Park,CA,USA)。由此设计出的cDNA(SCH5-Ct94-opt,SEQ ID NO:2)被合成(DNA2.0,Menlo Park,CA,USA)并被亚克隆到pETDuet-1质粒的NdeI-KpnI位点，获得质粒Ct94-pETDuet。这种优化后的cDNA序列编码多肽SCH5-Ct94-opt(SEQ ID NO:1)。
使用质粒Ct94-pETDuet在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中来实施Ct94的异源表达。体外酶的测定使用FPP作为底物在上述条件下进行，并且倍半萜合酶活性上观测到5种倍半萜的混合物的形成。以白檀的倍半萜特征：α-檀香萜、反式-α-佛手柑油烯、表-β-檀香萜、β-檀香萜和β-法呢烯(图1)，通过GC-MS确认这些倍半萜的同一性。在pH7.0和15mM MgCl2的存在下，重组倍半萜产物的相对比例为：38.0％的α-檀香萜、18.2％的反式-α-佛手柑油烯、5.7％的表-β-檀香萜、36.7％的β-檀香萜和1.3％的β-法呢烯。因此SCH-Ct98-opt cDNA编码β-檀香萜合酶。产物的比例与用作这些倍半萜的羟化产物的檀香油中观察到的比例非常相似。当省略MgCl2并且在培养基上添加2.5mM EDTA(以螯合剩余阳离子)时没有检测到任何活度，这表明二价阳离子是必要条件。存在于检测中的二价阳离子的性质和浓度对于产物分布有影响(表1)。例如，降低Mg2+的浓度对于β-檀香萜有有利影响，最终成为酶的主要产物。此外，Mn2+的添加对于β-檀香萜的形成有不利影响，因为檀香萜倍半萜产物的比例降低并且反式-α-佛手柑油烯和β-法呢烯的比例增加，反式-α-佛手柑油烯为1mM MgCl2存在下酶的主要产物。
表1：Mg 2+ 和Mn 2+ 离子的浓度对用FPP接触SEQ ID NO:1 获得的倍半萜混合物的组合物的作用
实施例4
使用Ct94cDNA在大肠杆菌体内生产倍半萜
通过将甲羟戊酸转化为FPP共表达可五步生物合成路径中的酶来评估白檀檀香萜合酶在大肠杆菌细胞中体内生成倍半萜的应用。
使用引物FPPy_NcoI(SEQ ID NO:16)和fppY-Eco(SEQ IDNO:17)从酿酒酵母(S.cerevisiae)基因组DNA中扩增出酵母FPP合酶基因。在T7启动子控制下，将扩增出的DNA在pACYCDuet-1质粒的第一多克隆位点(MCS1)上连接为NdeI-EcorI片段，得到包含FPP基因的质粒FPPs-pACYCDuet。使用引物MVA-up1-start(SEQ ID NO:18)和MVA-up2-stop(SEQ ID NO:19)将包含编码甲羟戊酸激酶(mvaK1)、磷酸甲羟戊酸激酶(mvaK2)、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MvaD)和异戊烯基焦磷酸异构酶(idi)的基因的操纵子从肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(ATCC BAA-334)的基因组DNA中扩增出来。用PfuUltraTM II Fusion HS DNA聚合酶(Stratagen)进行PCR。根据制造商手册配制PCR mix的组合物。热循环条件为95℃下2分钟；95℃下20秒，58℃下20秒和72℃下90秒，30个循环；和72℃下3分钟。3.8Kb的片段在琼脂糖凝胶上进行纯化，并使用In-FusionTM Dry-Down PCR克隆试剂盒(clontech)将其连接到具有NdeI和XhoI的FPPs-pACYCDuet质粒的第二个MCS上，得到质粒pACYCDuet-4506。将两个插入的序列进行全长测序以排除任何突变。
使用质粒pACYCDuet-4506和Ct94-pETDuet共转化BL21StarTM(DE3)大肠杆菌细胞(Invitrogen)，并且转化后的细胞在羧苄青霉素(50μg/ml)和氯霉素(34μg/ml)的LB-琼脂平板上进行选择。用单一菌落接种于具有50μg/ml的羧苄青霉素和34μg/ml的氯霉素的5mL LB培养基中。在37℃下将培养物培养过夜。第二天将0.2mL的过夜培养物接种于在2mL的添加了相同抗生素的TB培养基中。在37℃下培养6小时后，将培养物冷却到28℃并向每个管中添加1mM IPTG、2mg/mL甲羟戊酸酯(通过将甲羟戊酸内酯(Sigma)以1g/mL的浓度溶解在0.5N NaOH中并且在37℃下温育溶液30分钟来制备的)和0.2mL癸烷。在28℃下将培养物培养48小时。然后将培养物用2体积的乙酸乙酯萃取2次，将有机相浓缩到500μL并如实施例3所述进行GC-MS分析。在这些条件下通常得到高于200mg/L的倍半萜产物。生成了β-檀香萜。
实施例5
使用Ct94cDNA在酿酒酵母中体内生成倍半萜
为了在酵母细胞中体内生产倍半萜，在酿酒酵母菌株YNP5中通过用可调控的MET3启动子取代原本的ERG9启动子来下调ERG9基因(编码角鲨烯合酶、将FPP转化为角鲨烯的酶)。在之前的关于植物倍半萜合酶的文献中，该策略导致细胞中的麦角甾醇生物合成降低和可用于倍半萜合酶FPP的积聚(Asadollahi,Biotechnology and Bioengineering,99(3),666-677,2008)。
使用引物Ct94_BamHI(SEQ ID NO:20)和T7term(SEQ IDNO:21)将SCH5-Ct94-opt cDNA(SEQ ID NO:2)从Ct94-pETDuet扩增出来。用Pfu DNA聚合酶(Promega)使用如下热循环条件实施PCR：94℃下90秒；94℃下45秒，55℃下45秒，35个循环；72℃下4分钟；和72℃下10分钟。将扩增出的cDNA用BamHI和XhoI限制位点消化，并将其连接到pESC-URA质粒(Stratagen)的相应位点上得到质粒Ct94-pESC-ura.S.c。使用S.c.EasyCompTM转化试剂盒(Invitrogen)转化YNP5细胞。
转化后酵母菌株的单一的菌落用于接种20ml的添加了2％葡萄糖的YNB培养基(5g/L(NH4)2SO4；3g/L KH2PO4；0.5g/LMgSO4.7H2O；1mL/L痕量金属溶液)。将培养物在28℃下培养24小时。通过离心回收细胞并在20mL的添加了2％半乳糖的YNB培养基中再悬浮。培养1小时后，向培养物中添加蛋氨酸至0.5mM终浓度和2mL癸烷。在28℃下培养24小时后，培养物用乙酸乙酯提取，并如实施例4所述用GC-MS进行分析。在这样的条件下由酵母细胞生成的倍半萜的总量约为50mg/L。
实施例6
来自白檀根的檀香萜合酶的分离
将从无菌发芽种子获得的白檀的幼苗在发芽后5-10周后转移至土壤中。由于檀香种类为根半寄生植物，与6个月到1年柑橘属(Citrus sinensis)植物密切接触产生土壤适应性。在将檀香植物的根转移到土壤2-3年后，并且将其与宿主植物的根分离来收获檀香植物的根。这些根的提取物的GC-MS分析显示出存在檀香油典型的倍半萜。使用ConcertTM Plant RNA试剂(Invitrogen)从根中提取总RNA。从12g的组织中分离出640μg的总RNA。根据制造商的说明书，使用2.0mRNA分离试剂盒(Invitrogen)纯化mRNA，并且使用MarathonTM cDNA扩增试剂盒(Clontech Laboratories,Inc.)生成cDNA文库。
将1μg量的cDNA使用基因组分析系统(Genome AnalyzerSystem)(Illumina)进行测序。总共获得了10.3×106个35bp长度的read。平行使用Edena(Hernandez et al,2008,Genome Res.18,802–809)和Velvet(Zerbinoa and Birney,2008,Genome Res.18:821-829)拼接软件拼接这些read，得到平均范围242-211bp的18937和22414个独特的contig。使用tBlastn程序(Altschul et al,1990,J.Mol.Biol.215,403-410)以SCH5-CT94氨基酸序列(SEQ ID NO:15)作为查询序列对read进行检索。选出的15个contig，显示出其推导的氨基酸序列与植物倍半萜合酶具显著同源性。将这些选出的contig重新拼接形成两个不同的序列，其中SCH10-Ct8201(SEQ ID NO:22)长度为383bp并显示出与SCH5-CT94DNA序列(SEQ ID NO:14)具最高同源性。根据SCH10-Ct8201序列设计的正向引物SCH10-Ctg8201-F2(SEQ IDNO:23)，使用MarathonTM cDNA扩增试剂盒(Clontech Laboratories,Inc.)其被成功地用于3’RACE。从由此获得3’RACE的产物序列，设计了两个反向引物(SCH10-Ct19779-R3(SEQ ID NO:24)和SCH10-Ct19779-R4(SEQ ID NO:25))并成功地用于通过5’RACE对相应cDNA的5’末端的扩增。从3’RACE和5’RACE的序列，重新构建出了新的萜合酶全长序列。为了验证该序列，使用MAQ程序(Li等,2008,Genome Res.18(11),1851–1858)以最大2错配对所有的read进行检索并谱图。该方法得到了1725bp-长度的DNA序列(SEQ ID NO:26)，其编码与SCH5-Ct94(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列具有91.9％同一性的570个氨基酸长度的蛋白(SEQ ID NO:27)。
为了在大肠杆菌中异源表达，通过删除21位第一密码子、添加序列ATGGCTACC作为第一个3位密码子和优化为大肠杆菌用密码子设计出了优化的cDNA。合成了(DNA2.0；Menlo Park,CA,USA)编码N-末端修饰蛋白SCH10-Tps8201-opt(SEQ ID NO:3)的该优化序列(SCH10-Ct8201-opt,SEQ ID NO:4)并将其亚克隆到pETDuet-1表达质粒(Novagen)的NdeI-KpnI位点。SCH10-Tps8201-opt(SEQ IDNO:3)的异源表达和酶的表征按实施例3所述来进行。重组蛋白显示出倍半萜合酶活性并且从FPP以相同的相对比例生成了与SCH5-CT94-opt重组蛋白(SEQ ID NO:1,实施例3)相同的倍半萜混合物。

Claims (18)

1.一种生产β-檀香萜的方法，包含：
a)使FPP与至少一种具有β-檀香萜合酶活性的多肽接触，该多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3有至少50％同一性的氨基酸序列；
b)非强制选择地，分离在步骤a)中产生的β-檀香萜。
2.权利要求1所述的方法，其中步骤a)包含在有利于生产β-檀香萜的条件下培养能够生产FPP并且经转化以表达至少一种多肽的非人宿主生物体或细胞，其中该多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3有至少50％同一性的氨基酸序列并且具有β-檀香萜合酶活性。
3.权利要求2所述的方法，其中该方法还包含在步骤a)之前用至少一种编码多肽的核酸将能够生产FPP的非人生物体或细胞转化以使所述生物体表达所述多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3有至少50％同一性的氨基酸序列并且具有β-檀香萜合酶活性。
4.权利要求3所述的方法，其中所述至少一种编码β-檀香萜合酶的核酸包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或它们的互补序列有至少50％、优选至少60％、优选至少70％、优选至少90％同一性的核苷酸序列。
5.权利要求2～4中任一项所述的方法，其中非人宿主生物体为植物、原核生物或真菌。
6.权利要求5所述的方法，其中非人宿主生物体为微生物，优选细菌或酵母。
7.权利要求6所述的方法，其中所述细菌为大肠杆菌并且所述酵母为酿酒酵母。
8.具有β-檀香萜合酶活性并且包含与SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3有至少50％同一性的氨基酸序列的多肽。
9.编码权利要求8所述的多肽的核酸。
10.权利要求9所述的核酸，其包含与SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4或它们的互补序列有至少50％、优选至少60％、优选至少70％、优选至少90％同一性的核苷酸序列。
11.表达载体，其包含权利要求9或10所述的核酸。
12.经转化以包含至少一种权利要求9或10所述的核酸的非人宿主生物体或细胞，从而其异源表达或过表达至少一种权利要求8所述的多肽。
13.权利要求12所述的非人宿主生物体，其中所述非人宿主生物体为植物、原核生物或真菌。
14.权利要求13所述的非人宿主生物体，其中所述非人宿主生物体为微生物，优选细菌或酵母。
15.权利要求14所述的非人宿主生物体，其中所述细菌为大肠杆菌并且所述酵母为酿酒酵母。
16.一种生产至少一种权利要求8所述的多肽的方法，包含：
a)培养用权利要求11所述表达载体转化的非人宿主生物体或细胞，以便使其包含权利要求9或10所述的核酸并且表达或过表达权利要求8所述的多肽；
b)从在步骤a)中培养的非人宿主生物体或细胞中分离该多肽。
17.权利要求16所述的方法，其进一步包含在步骤a)之前，用权利要求11所述的表达载体转化非人宿主生物体或细胞，以便使其包含权利要求9或10所述的核酸并且表达或过表达权利要求8所述的多肽。
18.一种制备具有β-檀香萜合酶活性的变体多肽的方法，该方法包含步骤：
(a)选择权利要求9或10所述的核酸；
(b)修饰所选择的核酸以获得至少一种突变核酸；
(c)用突变核酸序列转化宿主细胞或单细胞生物体以表达用该突变核酸序列编码的多肽；
(d)按照至少一种修饰的性质筛选该多肽；和，
(e)非强制选择地，如果该多肽不具有期望的变体β-檀香萜合酶活性，则重复步骤(a)至(d)直到获得具有所期望的变体β-檀香萜合酶活性的多肽；
(f)非强制选择地，如果在步骤(d)中鉴别出具有所期望的变体β-檀香萜合酶活性的多肽，则分离在步骤(c)中获得的相应突变核酸。
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