ES2626456T3 - Procedimiento enzimático para producir beta-santaleno y la enzima correspondiente - Google Patents

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Abstract

Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 60 % de identidad con la SEC ID N.º: 2, o un fragmento polipeptídico de la misma, que tiene una actividad ß-santaleno sintasa y en el que el ß-santaleno es al menos el 20 % de sesquiterpenos producidos.

Description

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atribuibles a proteólisis incluyen, por ejemplo, diferencias en los extremos N-terminal o C-terminal después de la expresión en diferentes tipos de células huésped, debido a la eliminación proteolítica de uno o más aminoácidos terminales de los polipéptidos de la invención. Los polipéptidos codificados por un ácido nucleico obtenido mediante mutación natural o artificial de un ácido nucleico de la invención, tal como se describen más adelante, también están abarcados por la invención.
Las variantes polipeptídicas que resultan de una fusión de secuencias de péptidos adicionales en los extremos amino-terminal y carboxi-terminal están también comprendidas por los polipéptidos de la presente invención. En particular una fusión tal puede potenciar la expresión de los polipéptidos, ser útil en la purificación de la proteína o mejorar la actividad enzimática del polipéptido en un ambiente deseado o en un sistema de expresión deseado. Tales secuencias peptídicas adicionales pueden ser péptidos señal, por ejemplo. De acuerdo con ello, la presente invención comprende variantes de los polipéptidos de la invención, tales como aquellos obtenidos por fusión con otros oligopéptidos o polipéptidos y/o aquellos que están unidos a péptidos señal. Los polipéptidos que resultan de una fusión con otra proteína funcional, tal como otra proteína de la ruta de la biosíntesis de terpenos, están también comprendidos por los polipéptidos de la invención.
Como se ha mencionado anteriormente, el ácido nucleico que codifica el polipéptido de la invención es una herramienta útil para modificar organismos huéspedes no humanos o células deseadas para usarse cuando el procedimiento se lleva a cabo in vivo.
Un ácido nucleico que codifica un polipéptido de acuerdo con cualesquiera de las realizaciones descritas anteriormente es por lo tanto también un objeto de la presente invención.
El ácido nucleido de la invención se establece en la reivindicación 3 y el ácido nucleido para su uso en un procedimiento de la invención se define en la reivindicación 5.
De acuerdo con una realización preferida, el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos al menos el 65 %, preferentemente al menos el 70 %, preferentemente al menos el 75 %, preferentemente al menos el 80 %, preferentemente al menos el 85 %, preferentemente al menos el 90 %, más preferentemente al menos el 95 % e incluso más preferentemente al menos el 98 % idéntica a la SEC ID N.º: 2 o al complemento de la misma. De acuerdo con una realización más preferida, el ácido nucleido comprende la secuencia de nucleótidos SEC ID N.º: 2, o el complemento de la misma.
De acuerdo con otra realización preferida, el ácido nucleico consiste en una secuencia de nucleótidos al menos el 65 %, preferentemente al menos el 70 %, preferentemente al menos el 75 %, preferentemente al menos el 80 %, preferentemente al menos el 85 %, preferentemente al menos el 90 %, más preferentemente al menos el 95 % e incluso más preferentemente al menos el 98 % idéntica a la SEC ID N.º: 2 o al complemento de la misma. De acuerdo con una realización incluso más preferida, el ácido nucleido consiste en la secuencia de nucleótidos SEC ID N.º: 2, o el complemento de la misma.
De acuerdo con otra realización, el ácido nucleico está aislado de una planta de las especies de Santalum, preferentemente de Santalum album.
El ácido nucleico de la invención se puede definir como que incluye polímeros de desoxirribonucleótidos o de ribonucleótidos bien en forma de cadena simple o bien en forma de cadena doble (ADN y/o ARN). Los términos "secuencia de nucleótidos" deben entenderse también como que comprenden una molécula polinucleotídica o una molécula oligonucleotídica en forma de un fragmento separado o como un componente de un ácido nucleico más grande. Los ácidos nucleicos de la invención también abarcan ciertas secuencias de nucleótidos aisladas que incluyen aquellas que están sustancialmente libres de material endógeno contaminante. El ácido nucleico de la invención puede truncarse, siempre que codifique un polipéptido comprendido por la presente invención, como se ha descrito anteriormente.
El ácido nucleico de la invención puede o bien estar presente de forma natural en plantas de la especie Sandalum u otras especies, o bien puede obtenerse modificando la SEC ID N.º: 2, o el complemento de la misma. Preferentemente dicho ácido nucleico consiste en una secuencia de nucleótidos que se ha obtenido modificando la SEC ID N.º: 2, o el complemento de la misma.
Los ácidos nucleicos que comporende una secuencia obtenida mediante mutación de la SEC ID N.º: 2, o el complemento de la misma están abarcados por la invención, siempre que las secuencias que comprenden compartan al menos el porcentaje de identidad definido con los fragmentos correspondientes de SEC ID N.º: 2, o el complemento de la misma y siempre que codifiquen un polipéptido que tenga actividad β-santaleno sintasa, tal como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones anteriores. Las mutaciones pueden ser cualquier clase de mutaciones de estos ácidos nucleicos, tales como mutaciones puntuales, mutaciones de deleción, mutaciones de inserción y/o mutaciones de cambio de fase. Se puede preparar un ácido nucleico variante con el fin de adaptar su secuencia de nucleótidos a un sistema de expresión específico. Por ejemplo, se sabe que los sistemas de expresión bacterianos expresan más eficientemente polipéptidos si los aminoácidos se codifican por un codón preferido. Debido a la degeneración del código genético, en el que más de un codón puede codificar el mismo aminoácido, múltiples secuencias de ADN pueden codificar para el mismo polipéptido, estando todas estas secuencias de ADN comprendidas por la invención.
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humano y/o célula huésped no humana de tal forma que dé como resultado un sistema recombinante estable. Cualquier procedimiento de integración cromosómica conocido en la técnica se puede usar en la práctica de la invención, incluyendo pero no limitado a intercambio de casetes mediado por recombinasas (RMCE), inserción cromosómica específica de sitio, adenovirus e inyección pronuclear.
Con el fin de llevar a cabo el procedimiento de producción de ß-santaleno in vitro, como se expone anteriormente en el presente documento, es muy ventajoso proporcionar un procedimiento de fabricación de al menos un polipéptido que tenga una actividad ß-santaleno sintasa según se describe en cualquier realización de la invención. Por lo tanto, la invención proporciona un procedimiento de producción de al menos un polipéptido de acuerdo con cualquier realización de la invención tal como se establece en la reivindicación 16.
De acuerdo con una realización preferida, dicho procedimiento comprende adicionalmente, antes de la etapa a), transformar un organismo huésped no humano o una célula huésped no humana con el vector de expresión de la invención, de forma que albergue un ácido nucleico de acuerdo con la invención y exprese o sobreexprese el polipéptido de la invención.
Se puede usar un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente.
La transformación y el cultivo del organismo huésped no humano o de la célula huésped no humana se puede llevar a cabo según se describe anteriormente por el procedimiento de producción de ß-santaleno in vivo. La etapa b) se puede llevar a cabo usando cualquier técnica bien conocida en la técnica para aislar un polipéptido particular a partir de un organismo o célula.
Una "variante polipeptídica", tal como se denomina en el presente documento, significa un polipéptido que tiene una actividad β-santaleno sintasa y que es sustancialmente homóloga al polipéptido de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, pero que tiene una secuencia de aminoácidos diferente de la codificada por cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de la invención debido a una o más deleciones, inserciones o sustituciones.
Las variantes de polipéptido abarcadas por la invención son tal como se definen en la reivindicación 1. Las variantes pueden comprender secuencias sustituidas conservativamente, que significa que un residuo de aminoácido dado está reemplazado por un residuo que tiene características fisicoquímicas similares. Los ejemplos de sustituciones conservativas incluyen la sustitución de un residuo alifático por otro, tal como Ile, Val, Leu o Ala por otro, o sustituciones de un residuo polar por otro, tal como entre Lys y Arg; Glu y Asp; o Gln y Asn. Véase Zubay, Biochemistry, 1983, Addison-Wesley Pub. Co. Los efectos de dichas sustituciones pueden calculares usando matrices de clasificación de sustituiciones tales como PAM-120, PAM-200 y PAM-250 tal como se aborda en Altschul, J. Mol. Biol., 1991, 219, 555-565. Otras sustituciones conservativas de este tipo, por ejemplo sustituciones de regiones enteras que tienen características de hidrofobicidad similares, son bien conocidas.
Las variantes de péptidos de origen natural también están abarcadas por la invención. Los ejemplos de dichas variantes son proteínas que se obtienen a partir de eventos de ayuste de ARNm alternos o a partir de escisión proteolítica de los polipéptidos descritos en el presente documento. Las variaciones atribuibles a proteólisis incluyen, por ejemplo, diferencias en los extremos N-terminal o C-terminal después de la expresión en diferentes tipos de células huésped, debido a la eliminación proteolítica de uno o más aminoácidos terminales de los polipéptidos codificados por las secuencias de la invención.
Las variantes de los polipéptidos de la invención pueden usarse para conseguir, por ejemplo, la actividad enzimática potenciada o reducida deseada, regioquímica o estereoquímica modificada, o utilización de sustrato alterada o distribución de producto alterada, afinidad aumentada por el sustrato, especificidad mejorada para la producción de uno o más compuestos deseados, velocidad aumentada de la reacción enzimática, actividad o estabilidad superior en un ambiente específico (pH, temperatura, disolvente, etc.) o nivel de expresión mejorado en un sistema de expresión deseado. Una variante o un mutante dirigido a sitio pueden producirse mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica. Las variantes y los derivados de polipéptidos nativos pueden obtenerse aislando variantes de origen natural,
o la secuencia de nucleótidos de variantes, de otras o las mismas líneas o especies vegetales, por ejemplo plantas de la especie Santalum, o programando artificialmente mutaciones de secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos de la invención. Las alteraciones de la secuencia de aminoácidos nativa pueden realizarse mediante cualquiera de una serie de procedimientos convencionales.
Las variantes polipeptídicas que resultan de una fusión de secuencias peptídicas adicionales en los extremos amino-terminales y carboxi-terminales de los polipéptidos de la invención se pueden usar para potenciar la expresión de los polipéptidos, ser útiles en la purificación de la proteína o mejorar la actividad enzimática del polipéptido en un ambiente deseado o en un sistema de expresión deseado. Tales secuencias peptídicas adicionales pueden ser péptidos señal, por ejemplo. De acuerdo con ello, la presente invención comprende variantes de los polipéptidos de la invención, tales como aquellos obtenidos por fusión con otros oligopéptidos o polipéptidos y/o aquellos que están unidos a péptidos señal. El polipéptido de fusión comprendido por la invención también comprende polipéptidos de fusión que resultan de una fusión de otras proteínas funcionales, tales como otras proteínas de la ruta de biosíntesis de terpenos.
Por lo tanto, en una realización, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar un polipéptido
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variante que tiene una actividad β-santaleno sintasa, tal como se establece en la reivindicación 18.
De acuerdo con una realización preferida, el polipéptido variante preparado es capaz de producir una mezcla de sesquiterpenos en la que ß-santaleno representa al menos el 20 %, preferentemente al menos el 30 %, preferentemente al menos el 35 %, de los sesquiterpenos producidos.
En la etapa (b), se pueden crear un gran número de secuencias de ácidos nucleicos mutantes, por ejemplo por mutagénesis aleatorias, mutagénesis específicas de sitio, o reorganización del ADN. Los procedimientos detallados de reorganización de genes se encuentran en Stemmer, DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro recombination for molecular evolution. Proc Natl Acad Sci EE.UU., 1994, 91(22). 10747-1075. Resumiendo, reorganización de ADN se refiere a un procedimiento de recombinación aleatoria de secuencias conocidas in vitro, que implican al menos dos ácidos nucleicos seleccionados para la recombinación. Por ejemplo se pueden introducir mutaciones en loci particulares sintetizando oligonucleótidos que contienen una secuencia mutante, flanqueada por sitios de restricción que permiten ligación a fragmentos de la secuencia nativa. Tras la ligación, la secuencia reconstruida resultante codifica un análogo que tiene la inserción, sustitución o deleción aminoacídica deseada. Alternativamente, se pueden emplear procedimientos de mutagénesis específica de sitio dirigida a oligonucleótidos para proporcionar un gen alterado en los que se pueden alterar codones predeterminados por sustitución, deleción o inserción.
De acuerdo con ello, el polipéptido se puede recombinar con cualesquiera otros ácidos nucleicos que codifiquen sesquiterpeno sintasa, por ejemplo aislados a partir de un microorganismo distinto de Santalum album. Así, se pueden obtener y separar ácidos nucleicos mutantes que se pueden usar para transformar una célula huésped de acuerdo con procedimientos estándar, por ejemplo tal como se divulga en los presentes ejemplos.
En la etapa (d), el polipéptido obtenido en la etapa (c) se criba para que tenga al menos una propiedad modificada, por ejemplo una actividad enzimática modificada deseada, pero que incluya al menos la comprobación de que posee actividad -santaleno sintasa. Ejemplos de actividades enzimáticas deseadas, por las que se puede cribar un polipéptido deseado, incluyen actividad enzimática potenciada o reducida, según se mide por valor de KM o Vmáx, regioquímica o estereoquímica modificada y utilización de sustrato alterado o de distribución de producto alterada. El cribado de la actividad enzimática se puede llevar a cabo de acuerdo con procedimientos familiares para el experto y de acuerdo con aquellos procedimientos divulgados en los presentes ejemplos. La etapa (e) proporciona repetición de las etapas (a)-(d) del procedimiento, lo que se lleva a cabo preferentemente en paralelo. De acuerdo con ello, creando un número significativo de ácidos nucleicos mutantes, se pueden transformar muchas células huéspedes con diferentes ácidos nucleicos al mismo tiempo, permitiendo el cribado subsiguiente de un número elevado de polipéptidos. Las probabilidades de obtener un polipéptido variante deseado pueden incrementarse así a la discreción de la persona experta.
Descripción de los dibujos
Figura 1: análisis de CG-EM del sesquiterpeno producido por la santaleno sintasa, recombinante de Santalum album (SaSantS).
Parte 1: Cromatograma iónico total. 1, α-santaleno; 2, trans-α-bergamoteno; 3, epi-ß-santaleno; 4, ß-santaleno; 5, ß-farneseno
Partes 2 a 4: Espectros de masas de los picos identificados como sesquiterpenos.
Figura 2: Estructura molecular de ß-santaleno y ß-santalol.
Ejemplos:
Ejemplo 1
Construcción de biblioteca de ADN, secuenciación y extracción de las secuencias relacionadas de terpeno sintasa
Se usaron segmentos de hipocotilos jóvenes obtenidos de semillas germinadas asépticamente de Santalum album L. (de 5 semanas de edad) induciendo formación de callos. Las semillas de S. album se obtuvieron de B&T World Seeds (Aigues-Vives, Francia) y de Sandeman Seeds (Lalongue, Francia). Las semillas se esterilizaron en superficie primero en HClO al 2,5 % durante 120 minutos y se aclararon tres veces en agua estéril ultrapura. Las semillas se descascararon después y se situaron en un medio basal de MS (Murashige & Skoog, 1962, Physiologia Plantarum 15, 473-497) suplementado con 15 g/l de sacarosa y 7,8 g/l de agar, pH 5,7. La germinación se observó típicamente después de 9 a 18 días con un rendimiento de aproximadamente el 40 %. Las plántulas se dejaron crecer in vitro durante 2 a 3 meses en una habitación de cultivo a una temperatura de 27 °C, con frío, luz fluorescente blanca y con 16 horas de fotoperiodo. Induciendo la formación de callo verde, los fragmentos de hipocotilos se cortaron en 3-4 mm segmentos transversos que se situaron en medio basal Gbg (Gamborg y cols., 1968, Exp Cell Res. 50(1), 151-158) suplementado con 2,4D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético, Sigma-Aldrich Co.) 0,5 µM y Kin (cinetina, Sigma-Aldrich Co.) 10 µM en placas de Petri. El crecimiento del callo se perpetuó transfiriendo el tejido cada cuatro semanas a medio recién preparado en placas de Petri. Todos los cultivos de callos se llevaron a cabo en una cámara de crecimiento en
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