JP2911450B2 - 除草性グルタミンシンテターゼ阻害剤に対し耐性の植物細胞 - Google Patents
除草性グルタミンシンテターゼ阻害剤に対し耐性の植物細胞Info
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Description
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は植物細胞形質転換のための組換えDNA技術の
利用に関し、更に詳しくはホスフィノスリシンのような
除草性植物グルタミンシンテターゼ阻害剤に耐性の植物
細胞の設計と造成に関する。 背景技術 グルタミンシンテターゼ（GS）は、アンモニアの同化
及び窒素代謝の調節に関して中心的役割を果たす植物酸
素である。大半の植物においてグルタミンシンテターゼ
は、硝酸還元、アミノ酸分解又は光吸収によって放出さ
れるアンモニアをグルタミンシンテターゼ／グルタミン
酸シンテターゼ経路（第１図）で解毒する唯一の有効な
方法であることから、植物はグルタミンシンテターゼの
有効な阻害剤に対して非常に影響をうけ易い。 現在公知の最も有効なグルタミンシンテターゼ阻害剤
の１つは、ホスフィノスリシン（１）（以下PPTとい
う）である： PPTはグルタミン酸類縁体である。化合物は、ストレ
プトミセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces virid
ochromogenes）から生産されるトリペプチド抗生物質の
中から最初に単離された〔バイエル・イーら，ヘルベチ
カ・キミカ・アクタ，第55巻，第224頁,1972年（Bayer,
E.et al.,Helvetica Chimica Acta,55:224（1972））、
及び西独特許公開第2717440号明細書、ヘキスト社（Hoe
chst,A.G.）参照〕。PPTは、大腸菌（Escherichia col
i）グルタミンシンテターゼに対するKi＝0.0059mMの有
効な競合的阻害剤である。 シュウェルドル・エフ（Schwerdtle F.）〔植物の病
気及び植物の保護に関する雑誌、第９巻，第431−440
頁,1981年（zeitschrift fur Pflanzen−Krankheiten a
nd Pflanzenschutz,IX,431−440（1981））〕は、PPT
は、農作物が最小で直接条播される果樹園、ぶどう園及
び農園における望ましくない単子葉及び双子葉植物を制
御するための収穫補助としての非選択的葉類除草剤であ
ることを証明した。西ドイツ、スペイン、南アフリカ、
アメリカ及び日本での野外試験では、大半の双子植物類
が十分に制御されることを示した。単子葉植物類の場合
にはやや多い量が良好な制御のために必要であった。リ
ーズン・エム（Leason,M.）ら〔フィトケミストリー，
第21巻，第855−857頁,1982年（Photochemistry,Volume
21:855−857（1982））〕は、PPTがエンドウ葉グルタ
ミンシンテターゼに対する見掛けKi値0.073mMの混合型
競合阻害剤であることを明らかにした。 いずれの市販除草剤PPTも前記の如く非選択的であっ
て除草選択性が全く欠けていることから、PPT及び他のG
S阻害剤に対する耐性を選択された植物に付与しうるこ
とが、非常に重要となるのである。 他の化合物に対するグルタミンシンテターゼ耐性の存
在例がある。他のグルタミン酸類縁体であるメチオニン
スルホキシイミン（MSO）はエンドウ葉グルタミンシン
テターゼの混合型競合阻害剤（Ki値0.16mM）であること
が知られている（リーズン・エムら，フィトケミストリ
ー、第21巻，第855−857頁,1982年）。ミラー・イー・
エス（Miller,E.S.）及びブレンクレー・ジェイ・イー
（Brenchley,J.E.）〔ザ・ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー，第256巻，第11307−11321頁,19
81年（The Journal of Biological Chemisry 256:11307
−11321（1981））〕は、MSOに耐性の数種のサルモネラ
（Salmonella）変異株の性質について研究した。１つの
変異がアンモニア結合ドメインにおいてグルタミンシン
テターゼを明らかに変えて、MSO耐性を付与したのであ
る。更に最近になり、ヤング（Young）及びリンゴール
ド（Ringold）〔同上，第258巻，第11260−11266頁,198
3年〕は、MSO存在下で増殖せしめられたマウス3T6細胞
かそれに対する耐性を獲得したことを報告した。MSO耐
性細胞はグルタミンシンテターゼに関するmRNAに富んで
おり、著者はこの観察が遺伝子の増幅を意味することを
示唆した。サンダース（Sanders）及びウィルソン（Wil
son）,EMBO.ジャーナル，第３巻，第65−71頁,1984年参
照。しかしながら、ミラー、ヤング及びサンダースの研
究ではいずれも植物GSに関しては報告していなかった。 しかも、本発明以前において、植物細胞のグルタミン
シンテターゼ遺伝子を操作することによりPPTのような
除草性GS阻害剤に対する耐性を付与した研究については
報告がなかった。 したがって、植物細胞のグルタミンシンテターゼ遺伝
子を操作することにより、PPTのような除草性GS阻害剤
に対して耐性の植物細胞を開発することが望まれるので
ある。かかる方法によれば、いかなる植物にも除草剤選
択性を付与することができる。 発明の開示 本発明は、植物のPPT耐性がグルタミンシンテターゼ
の過剰生産に起因するという発見から派生したものであ
り、かかる現象は初期実験によると基礎的な遺伝子増幅
メカニズムに起因することが示された。組織培養された
植物細胞に選択圧を適用することにより、PPT耐性株を
単離することができた。しかしながら耐性は、PPTに対
する親和性の低い構造変異グルタミンシンテターゼの存
在に基づくのではなく、むしろ植物細胞中における遺伝
子増幅及びそれに伴う酸素濃度の増加に基づくものであ
った。これらの初期観察から、遺伝子増幅により又は遺
伝子増幅以外の他の異なるメカニズムによってグルタミ
ンシンテターゼを過剰生産する（したがって、除草性GS
阻害剤耐性を示す）植物細胞を開発しようとする本発明
の概念が生まれた。 したがって本発明は、除草性グルタミンシンテターゼ
（GS）阻害剤に対して耐性の植物細胞を製造することを
基礎とするものであって、ここにおいて該耐性は、除草
性GS阻害剤感受性植物細胞中に存在する場合に該細胞を
実質上該除草性GS阻害剤に対して耐性とさせるような植
物細胞GS活性レベルによって獲得される。 本発明は様々な方法によって実現しうることから、様
々な態様を包含している。例えば一態様において、本発
明は下記組合せ遺伝子を有する植物細胞を製造すること
に関する： Ａ） 下記第二遺伝子配列と作働可能に結合せしめられ
る植物細胞中で機能するグルタミンシンテターゼ（GS）
についてコードする第一遺伝子配列、 Ｂ） 組合せ体が除草性GS阻害剤感受性植物細胞中に存
在する場合において該細胞が除草性GS阻害剤に対して実
質上耐性となるように上記第一遺伝子配列の発現レベル
を増加させうる第二遺伝子配列。 本発明は更に、上記第一もしくは第二遺伝子配列又は
双方にとって異種である植物種のゲノム又は染色体外複
製要素中に存在する組合せ遺伝子にも関する。 更には、対応する感受性細胞よりも著しく多く野生型
遺伝子コピーを有する耐性植物細胞は、多発現性野生型
GS遺伝子コピーを、複製可能な適切な染色体要素に又は
植物細胞自体のゲノムに導入することによって得ること
ができる。これは細胞培養段階又は全体植物段階におけ
る形質転換によって発現することができる。野生型GS遺
伝子を有する安定なマルチコピー細胞器官も、著しく多
数のGS遺伝子を細胞に導入するために利用しうる。 更に本発明は、未形質転換段階において除草性GS阻害
剤感受性である除草性GS阻害剤耐性形質転換植物細胞自
体にも関する。除草性GS阻害剤耐性たる全体植物も包含
される。 本発明はまた、除草性GS阻害剤耐性を付与しうる前記
遺伝情報をもった植物細胞形質転換ベクターとして機能
しうる中間ビヒクル、及び植物細胞に耐性を付与する方
法にも関する。 更に本発明は、前記方法によって除草剤に対する耐性
を獲得した植物の存在下でかつ同時にそれと接触させな
がら、除草性GS除草剤感受性植物を植物制御量の除草性
GS阻害剤と接触させることにより実現される植物制御方
法に関する。 図面の簡単な説明 本発明は添付図面を参照するとより良く理解されるで
あろう。 第１図は、グルタミンシンテターゼ／グルタミン酸シ
ンターゼサイクルを示したものであって、ATPからADP及
び無機リン酸への加水分解に伴い進行する反応において
GSがグルタミン酸及びアンモニアからのグルタミンの生
成を触媒することが示されている。グルタミンのアミド
窒素は多くの生合成反応のための窒素源を供給するので
あるが、そのことは窒素代謝においてGSが中心的役割を
果たすことを示唆している。除草性GS阻害剤はGSを阻害
することによりグルタミン生合成を妨害し、もってアン
モニア解毒を妨げる。 第２図は、Ｌ−PPTの非存在下（○）及び25（△）、5
0（●）、100（□）μｍ存在下における野生型（PPT感
受性）アルファルファ細胞系の増殖特性を示す。 第３図は、Ｌ−PPTの非存在下（○）及び100（△）、
200（●）、500（□）μｍ存在下における変異PTT耐性
アルファルファ細胞系の増殖特性を示す。 第４図は、グルタミンシンテターゼの完全機能性ゲノ
ム配列を示す。 発明を実施するための最良の形態 下記の説明において、組換えDNA、植物遺伝子技術及
び本発明において用いられているいくつかの用語は広い
意味で用いられている。明細書及び請求の範囲の明確か
つ矛盾のない理解を与えるために、かかる用語の適用範
囲を含めて下記定義が与えられる： ヌクレオチド 糖部分、リン酸及び含窒素ヘテロ環塩基
からなるDNA又はRNAのモノマー単位。塩基はグリコシド
炭素（ペントースの１′位炭素）を介して糖部分と結合
せしめられている。塩基及び糖の組合せはヌクレオシド
と呼ばれる。各ヌクレオシドはその塩基に特徴がある。
４種のDNA塩基はアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シ
トシン（Ｃ）及びチミン（Ｔ）である。４種のRNA塩基
はＡ、Ｇ、Ｃ及びウラシル（Ｕ）である。 遺伝子配列 隣接ペントースの３′及び５′炭素間のホ
スホジエステル結合により互いに結合せしめられたヌク
レオチドの直鎖配列。 機能性遺伝子配列 配列がポリペプチドの完全鎖長配列
の場合よりも短いか又は長いかにかかわらず、所望の活
性をもつポリペプチドについてコードする遺伝子配列。
これは“機能性遺伝子”とも呼ばれる。 コドン又はトリプレット mRNAを介しアミノ酸について
コードするヌクレオチド３個のDNA配列、翻訳開始シグ
ナル又は翻訳終結シグナル。例えば、コドンTTA、TTG、
CTT、CTC、CTA及びCTGはアミノ酸ロイシンについてコー
ドする。TAG、TAA及びTGAは翻訳終結シグナルであり、A
TGは翻訳開始シグナルである。 エクソン アミノ酸配列に翻訳される遺伝子配列。 イントロン アミノ酸配列に翻訳されない、エクソン間
に介在する遺伝子配列。 ゲノム配列、翻訳エクソン及び介在非翻訳イントロン双
方を含めた所定のポリペプチドについての完全遺伝子配
列。 読取り枠 mRNAからアミノ酸配列への翻訳の際における
コドンのグループ分け。翻訳に際しては、適切な読取り
枠が維持されていなければならない。例えば、配列GCTG
GTTGTAAGは、Ｇ、Ｃ又はＴで始まるか否かによって３種
の読取り枠又はフレーズに翻訳され、したがって３種の
異なるペプチド生成物を生じる。 ２つの配列は、それらがまるで独立して存在している
かのように双方とも一緒になって作働するよう、１つの
配列の読取り枠が他のものと結合している場合には、作
動可能な結合状態にある。 転写 機能性遺伝子からmRNAを製造するプロセス。 翻訳 mRNAからポリペプチドを製造するプロセス。 発現 機能性遺伝子から開始してそのポリペプチドを製
造するプロセスであって、転写及び翻訳の組合せからな
るプロセス。 クローニングビヒクル 宿主細胞中で複製しうるプラス
ミド、ファージDNA又は他のDNA配列のことであって、こ
れらは１つもしくは少数のエンドヌクレアーゼ認識部位
を有することを特徴とし、その部位においてかかるDNA
配列がDNAの必須生物学的機能の損失を伴うことなく決
定可能な方法で切断され、しかもこれらは形質転換細胞
の同定のために適したマーカーを有している。代表例は
抗生物質耐性マーカーである。“ベクター”という語も
クローニングビヒクルの代わりに時々使用される。 発現ビヒクル ビヒクル中に存在してポリペプチドにつ
いてコードする機能性遺伝子の発現によるポリペプチド
の宿主細胞内製造のために特に用いられる、クローニン
グビヒクルに類似したビヒクル。 複製ビヒクル クローニング又は発現ビヒクル。 ファージ又はバクテリオファージ タンパク質エンベロ
ープ又は皮膜で被われたDNA配列からなりうる細菌ウイ
ルス。 プラスミド 完全“レプリコン”を有する非染色体性二
重鎖DNA配列のことであって、プラスミドは宿主細胞の
ゲノムで複製されるか又はそれに組込まれる。プラスミ
ドが単細胞又は多細胞生物中に存在する場合には、かか
る生物の特性はプラスミドDNAによって変化又は形質転
換せしめられる。例えば、カナマイシン耐性に関する遺
伝子をもつプラスミドは、以前はカナマイシン感受性で
あった細胞をそれに耐性の細胞に形質転換させる。 クローニング 無性生殖によって１つの生物又はDNA配
列から多数のかかる生物又は配列を得るためのプロセ
ス。 発現制御配列 機能性遺伝子配列と作働可能に結合した
場合にそれら配列の発現を制御調節する遺伝子配列。そ
れらはその発現を調節する領域を制御することが知られ
た配列も有している。それらはプロモーター及びターミ
ネーター配列を双方とも有する。 植物プロモーター かかるプロモーターに作働可能に結
合した同種又は異種の遺伝子配列を植物中で発現させう
る発現制御配列。 過剰生産植物プロモーター（OPP） OPPで形質転換され
ていない宿主細胞において自然に観察されるレベルより
も実質上高いレベルで（mRNA又はポリペプチドの量から
測定される）作働可能に結合した機能性遺伝子配列を形
質転換植物細胞中で発現させうる植物プロモーター。 縮重 各アミノ酸が性質上２以上のコドンによってコー
ドされうることから生じる情報上の現象。例えば、ロイ
シンはTTG、TTA、CTA、CTT、CTC又はCTGによってコード
されうる。 本出願及び請求の範囲で用いられている縮重変異と
は、遺伝子コードの縮重によるポリヌクレオチド断片の
あらゆる変異を意味する。例えば、得られる物質がなお
機能性GS又はその一部についてコードしている限り、か
かる物質は本発明に包含されると考えられる。 グルタミンシンテターゼ（GS） この酵素の定義は機能
性本位であって、GSサイクルでグルタミン酸をグルタミ
ンに変換させるように所望の植物中で機能しうるあらゆ
るグルタミンシンテターゼを包含する。したがってかか
る用語は、遺伝子形質転換された特定の植物種からの酵
素を包含するのみならず、GSが形質転換植物細胞中で機
能しうる場合には、他の植物種又は微生物からの、更に
は他の真核生物からのGSをも包含する。更にこの用語
は、天然植物GSの全構造鎖長よりも長いか又は短いタン
パク質又はポリペプチド、例えばGSの機能性部分断片又
はそれらの類縁体をも包含する。 ホスフィノスリシン（PPT） 生物学的活性型の前記式
（１）の化合物。これはＬ−もしくはＤ−又はD,L−型
であって、PPT活性を阻害しない他の不活性もしくは活
性化合物と併用されても又は単独であってもよい。 本発明は、その最も基本的なレベルにおいては、除草
性グルタミンシンテターゼ阻害剤に耐性である植物細胞
に関し、その際除草性GS阻害剤感受性植物細胞に存在す
る場合には実質上細胞を除草性GS阻害剤に対して耐性に
変えるようなGS活性レベルとすることによって耐性が生
じる。 “除草性グルタミンシンテターゼ阻害剤”という語
は、所定種の植物細胞のグルタミンシンテターゼ活性を
著しく低下させ、その結果植物細胞において除草効果を
発揮する、競合型又は非競合型のいずれの阻害剤をも含
む意味を有する。除草剤耐性植物細胞又は全体植物は、
同種の野生型個体にとって致死的な除草性GS阻害剤濃度
でも不可逆的障害をうけることなく生存しうる。通常、
除草性GS阻害剤耐性に関し５倍以上の増加が有意である
と考えられる。しかしながら、この数値は植物種毎に、
及び除草剤毎に変わる。したがって、本発明に包含され
る数種の植物種及び除草剤のすべてについて同一基準を
適用することは不可能である。しかしこのような基準は
当業者であれば容易に確認することができる。 本発明に包含される除草性GS阻害剤としては、ホスフ
ィノスリシン、メチオニンスルホキシイミン及び他のグ
ルタミン酸類縁体がある。 グルタミンシンテターゼは形質転換される特定の植物
細胞からなるものであってもよいし、そうでなくともよ
い。必要なのは、酵素に関する遺伝子配列が発現せしめ
られて、最終植物細胞中で機能性酵素を生産することの
みである。したがって本発明は、同種GS遺伝子又は異種
GS遺伝子（及びそれらの各々の発現生成物）を有する植
物細胞を包含する。広義には、酵素は他の植物種のもの
であっても、又は微生物もしくは動物のような異なる生
物からの酵素であってもよい。好ましくは、植物グルタ
ミンシンテターゼ遺伝子及びそれらの発現生成物であ
る。特に必要なのは、遺伝子操作において宿主として機
能する特定の植物種からのグルタミンシンテターゼ遺伝
子、即ち同種GS遺伝子である。本発明のrDNA分子に用い
られる１つのかかるグルタミンシンテターゼ遺伝子は、
例２で説明されている。 除草性GS阻害剤に対し感受性であって、本発明の遺伝
子構造体又は方法による遺伝子操作をうけることがで
き、しかも該構造体を発現させることができる植物細胞
であれば、いずれも本発明で使用することができる。双
子葉植物としては、様々な種類のポテト〔ソラヌム・ツ
ベロスム（Solanum tuberosum）〕；トマト〔リコペル
シコン・エスクレンツム（Lycopersicon esculentu
m）〕；コショウ〔カプシクム・アンヌム（Capsicum an
numm）〕；タバコ〔ニコチアナ・タバウム（Nicotiana
tabacum）〕；様々な種類のアブラナ、特に菜種〔ブラ
シカ・ナプス（Brassica napus）〕、様々な豆果類、例
えばアルファルファ〔メジカゴ・サチバ（Medicago sat
iva）〕、クローバー〔トリホリウム種（Trifolium spe
c.）〕、大豆〔グリシン・マックス（Glycine ma
x）〕、グランドナッツ〔アラチス・ヒポガエア（Arach
is Hypogaea）〕、様々な種類の豆類〔フォセオルス種
（Phaseolus spec.）、ビシア種（Vicia spec.）、ヒグ
ナ種（Vigna spec.）〕、エンドウ類〔ピスム・サチブ
ム（Pisum sativum）〕、ビートのような根菜作物〔ベ
タ・ブルガリス（Beta vulgaris）〕、ニンジン類〔ダ
ウクス・カロタ（Doucus carota）〕及びサツマイモ類
〔イポモエア・バタツス（Ipomoea batatus）〕があ
る。 本発明の広義の概念には様々な態様が含まれている。
除草性GS阻害剤耐性植物細胞は、様々なメカニズム及び
／又は遺伝子造成のいずれかによって有意に高レベルの
GS活性を有することができる。 例えば、本発明はその態様の一つにおいて、２種の遺
伝子配列の組合せ、即ち（ａ）下記第二遺伝子配列の下
流に作働可能に結合せしめられる、所定の植物細胞中で
機能するゲノムグルタミンシンテターゼについてコード
する第一遺伝子配列、（ｂ）組合せ体が除草性GS阻害剤
感受性植物細胞中に存在する場合において該細胞が除草
性GS阻害剤に対して実質上耐性となるように上記第一配
列の遺伝子生成物のレベルを増加させうる第二遺伝子配
列からなる。 第二遺伝子配列はプロモーターでもエンハンサー（en
hancer）配列でもよい。プロモーターである場合には、
それはGSプロモーターでも又は他の構造遺伝子のプロモ
ーターであってもよい。後者２つのいずれの場合であっ
ても、組合せ体に用いられるプロモーターは過剰生産植
物プロモーターである。かかるプロモーターの唯一の必
須の特性は、グルタミンシンテターゼの遺伝子配列と作
働可能に結合した場合において、組合せ体が除草性GS阻
害剤感受性植物細胞中に存在するときに細胞がGS阻害剤
に対して実質上耐性となるようなレベルにまで前記グル
タミンシンテターゼの発現量を高めることが可能である
ことである。したがって、使用される植物プロモーター
として何を選択するかは、機能を考慮して決定される。
植物プロモーターは宿主細胞にとって異種でも同種であ
ってもよい。宿主細胞の天然内存性プロモーターはGS過
剰生産による耐性を生じさせることができないが、その
理由はかかる天然プロモーターは通常適用される植物制
御濃度の阻害剤によって実質上又は完全に阻害されるほ
ど低いレベルでしか通常GS発現を促進しえないからであ
る。したがって、本発明の一態様においては、天然プロ
モーターはOPPで置換される。 有効なOPPとしては、リブロース二リン酸カルボキシ
ラーゼ及びクロロフィルa/b結合タンパク質の小サブユ
ニット（ss）のプロモーターがある。これら２種の遺伝
子の発現は、緑色組織での転写段階において光誘導され
ることが明らかにされた〔例えば、植物の遺伝子工学，
農業の展望，エー・キャッシュモア，プレナム，ニュー
ヨーク,1983年，第29−38頁（Genetic Engineering of
plants,An Agricultural Perspective,A.Cashmore,Plen
um,New York 1983,pages 29−38）；コルッジ・ジー
ら，ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー，第258巻、第1399頁,1983年（Coruzzi,G.,et al.,
The Journal of Biological Chemistry 258:1399（198
3））；又はダンスミア・ピーら，ジャーナル・オブ・
モレキュラー・アンド・アプライド・ゲネティクス，第
２巻，第285頁,1983年（Dunsmuir.P.,et al.,Journal o
f Molecular and Applied Genetics.,2:285（1983））
参照〕。 本発明は、記載された方法に従い修正される、又は除
草性GS阻害剤耐性を生じる他のいずれの方法によって修
正されるあらゆる植物細胞にまで拡張される。植物細胞
は、単独で、組織培養で、又は多細胞植物もしくはその
部分の一部として生存するものでも又はそうでないもの
であってもよい。未形質転換状態で除草性GS阻害剤感受
性であるかかる多細胞植物は、その細胞が本発明に従い
耐性とされた場合に耐性化する。 花、種子、葉、枝、果実等のような植物の部分は、こ
れらの部分が前記の如き除草性GS阻害耐性細胞を有する
限り、本発明に含まれる。特に、植物の部分は生存して
いても、又はそうでなくともよい。したがって、耐性ト
マト、ニンジン又はタバコ植物から得られる遺伝的に修
正されたトマト、ニンジン又はタバコの葉は、たとえ元
の植物から分離された場合であっても、本発明に含まれ
る。 製造方法及びそこで用いられる中間体 様々な方法論が、本発明の各種態様を実施する上で適
用可能である。例えば、除草性GS阻害剤耐性が構造GS遺
伝子のコピー数を著しく増加させることによって獲得さ
れるのであれば、適用可能な方法論としては、GS遺伝子
の増幅、又はゲノムもしくは複製染色体外要素中への多
数のGS遺伝子コピーの導入によって耐性を獲得した細胞
を選択する方法がある。 選択は、培地中段階的に量を高めた除草性GS阻害剤の
存在下で植物細胞を培養することにより、適切な培地中
で実施される。所定時間、例えば数週間〜数か月が経過
した後、原植物細胞よりも除草性GS阻害剤に対して数倍
高い耐性を有する細胞群を選択することができる。例え
ば、細胞がアルファルファで、阻害剤がPPTである場合
には、段階的にPPTを増加させて１年後に、原系よりもP
PTに対して20倍高い耐性を有するPPT耐性アルファルフ
ァ細胞系を得ることができた。耐性系が阻害剤非存在下
で数か月間継代培養された場合、耐性細胞率の若干の減
少が阻害剤含有寒天培地でのプレート実験中に観察され
たが、６か月間以上の経過後には高度に耐性の細胞クロ
ーンを依然と再選択することが可能であった。これは野
生型細胞を培養した場合には不可能であった。 組織培養細胞からのカルス及び成長した植物の再生法
は当業者に公知であって、これは種毎に異なる。例え
ば、参考のため本明細書に組込まれる1982年シェパード
（Sheperd）のサイエンティフィック・アメリカン（Sci
entific American）参照。通常、多数のGS遺伝子コピー
を含有し又は組合せ遺伝子配列を含有する原形質体の懸
濁物が最初に準備される。次いで胚形成が、天然胚とし
て発芽する段階まで、原形質体懸濁物から誘導されう
る。培地は通常様々なアミノ酸類、並びにオーキシン及
びサイトカイニンのようなホルモン類を含有する。特に
トウモロコシ及びアルファルファのような種の場合に
は、グルタミン酸及びプロリンを培地に加えることが有
利である。苗条及び根は通常同時に発生する。有効な再
生法であるか否かは、培地、遺伝子型及び培養経歴に依
存する。これら３つの変動要件が制御される場合には、
再生は十分に再現かつ反復が可能である。 タバコ、アルファルファ、ポテト、トマト、ペチュニ
ア、大豆、菜種、数種の果樹及びニンジンのようないく
つかの種の遺伝子型の場合には、再生法は先行技術にお
いて明確に説明されていた。このような再生法は、適切
な遺伝子型及び系統がスクリーニングにより選択される
場合には十分に当業界の技術範囲に属する。通常継代培
養の約１年経過後になると、植物の再生効率は所定の細
胞培養の場合よりも低下する。したがって再生は、適切
な耐性細胞の培養後早期に開始した場合が、通常最も成
功しやすい。 しかしながら、数か月又は１年以上経た細胞培養物が
特に使用される場合には、増幅せしめられたGS遺伝子が
交雑及び／又は融合によって再生系に組込まれる。例え
ば、参考のため本明細書に組込まれるクッキングら，ネ
ーチャー，第293巻，第265頁,1981年〔Coking et al.,N
ature,293:265（1981）〕参照。この方法では、除草性G
S阻害剤耐性細胞系は選択によって得られ、急速に分裂
する細胞の培養懸濁物が当業者に周知の方法により得ら
れる。原形質体はそこから単離され、完全に不可逆な障
害とならないのであれば、宿主細胞を不活化させるため
に十分な放射線量及び時間にわたり放射線照射すること
が好ましい。例えば20キロラッドのＸ線照射が有利に適
用される。ドナー原形質体に放射線照射した後、それは
適切な感受性細胞からのアクセプター原形質体と融合せ
しめられる。例えば、ポリエチレングリコール融合、高
カルシウム処理、双方の組合せ又は最近の電気融合のよ
うな様々な方法が融合体を得るために存在する。融合処
理後、融合生成物は除草性GS阻害剤耐性になっているは
ずであるから、融合生成物の選択的増殖が行なわれう
る。特にもはや形態形成しないドナーが用いられる場合
（即ち、ドナー培養物が最初の選択から既に数か月又は
１年以上経過しているような場合）には、除草性GS阻害
剤含有培地中で簡単な選択が行なわれるだけでよい。 遺伝物質を植物細胞中に導入するもう１つの方法は、
植物の受傷葉を形質転換アグロバクテリウム・ツメファ
シエンス（Agrobacterium tumefaciens）細菌で感染さ
せることである。適切な増殖条件下でカルス環が受傷部
周辺で生成する。次いでカルスは増殖培地に移され、苗
条、根を形成して、更に植物まで生長する。又は、全体
植物への接ぎ木を行なってもよい。 多数のGS遺伝子コピーを植物細胞中に導入するための
もう１つの方法は、組換えDNA技術における当業者に周
知の方法によって、機能性GS（ゲノム又はcDNA）構造遺
伝子のコピーを自己結合させることである。各々が個々
のプロモーターを有する構造遺伝子群は適切なリンカー
によって互いに作働可能に結合せしめられ、ある場合に
おいて各遺伝子の10〜30個のコピーがTiプラスミドのよ
うな適切な複製可能な発現ビヒクル中に導入される。又
は、遺伝物質は植物胚細胞中に直接微量注射することが
できる。単子葉植物の場合には、花粉は全DNAで又は耐
性をもつ適切な機能性クローンで形質転換され、次いで
花粉は有性生殖により子孫を残すために使用される。 勿論、細胞を除草性GS・Ｓ阻害剤耐性とするようなレ
ベルまで所定細胞のGS活性を高めるために適用可能なも
のであれば他のいかなる方法も利用することができる。
本発明において特に重要なことは、構造GS遺伝子につい
てコードする機能性ゲノム配列を、自己から得られる遺
伝子生成物の過剰生産が可能な別の遺伝子配列に作働可
能に結合させることである。遺伝子配列のこの結合は、
例えばTiプラスミドによって適切な植物細胞中に導入す
ることができる。 特にアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agroba
cterium tumefaciens）の所謂腫瘍誘導性（Ti）プラス
ミドの使用による、植物細胞中への遺伝物質の導入は、
再現可能かつ予測可能な技術である〔例えば、カプラン
・エーら，“植物細胞中への遺伝物質の導入",サイエン
ス，第815−821頁,1983年11月（Caplan,A..et al.,“In
troduction of Genetic Material into Plant cells",S
cience:815−821（November 1983））；シェル・ジェイ
及びヴァン モンタギュー・エム，“植物における天然
の及び実用的な遺伝子ベクターとしてのTiプラスミド”
バイオテクノロジー,1983年４月，第175−180頁（Schel
l,J.,and Van Montagu,M.,“The Ti Plasmid as Natura
l and as Practical Gene Vector for Plants,"Bio/Tec
hnology:April 1983.pp.175−180）；ホーシュら，“植
物における機能性外来遺伝子の遺伝承継",サイエンス，
第233巻，第496−498頁,1984年（Horsh et al.,“Inher
itance of Functional Foreign Genes in Plants",Scie
nsce:233,496−498（1984））；フレリー・アール・テ
ーら，プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス USA,第80巻，第4803頁,1983年
（Fraley,R.T.,et al.,Proceeding of National Academ
y of Science USA 80:4803（1983））；ワトソンら，組
換えDNA;ショート・コース，サイエンティフィック・ア
メリカン・ブックス,1983年，第164−173頁（Watson et
al.,Recombinant DNA.A Short Course,Scientific Ame
rican Books,1983,pp.164−173）；オールド及びプリム
ローズ，遺伝子操作原理，第２版，ユー・カル・プレ
ス,1981年，第138−156頁（Old and Primrose,Principl
es of Gene Manipulation,2d Ed.,U.Cal.Press,1981,p
p.138−156）参照；これらは参考のため本明細書に組込
まれる〕。 Tiプラスミドは形質転換細胞の製造のために必要な２
つの領域を有する。これらのうち１つは転移DNA（Ｔ−D
NA）と呼ばれ、腫瘍形成を誘導する。もう１つはビルレ
ント（virulent）領域と呼ばれ、腫瘍の維持ではなく形
成のために必要である。植物ゲノムに転移する転移DNA
は、その転移能が影響をうけないのであれば、本発明の
多数結合GS遺伝子又は組合せ遺伝子の挿入によってサイ
ズを拡大させることができる。腫瘍形成遺伝子がもはや
干渉しないようにそれらを取除いた場合には、修正され
たTiプラスミドは適切な植物細胞中に本発明の遺伝子構
造体を転移させるためのベクターとして用いることがで
きる。挿入される外来DNAは、Ｔ領域の側面に位置する
両末端配列間に通常導入される。 特に有用なTiプラスミドベクターは、ノパリンTiプラ
スミドC58の非腫瘍形成誘導体たるpGV3850である（カプ
ランら，同上参照）。このベクターはTiプラスミドの自
然転移性を利用している。未分換クラウンゴール（crow
gall）表現型を決定する内在Ｔ−DNA遺伝子は削除され
ており、通常のクローニングビヒクル（例えばpBR322）
で置換されている。Ｔ−DNAボーダー領域間のクローニ
ングビヒクル配列は、同一クローニングビヒクルの誘導
体でクローニングされた外来DNAを再導入するための組
換え用相同性領域として機能する。したがって、かかる
プラスミドでクローニングされる本発明の遺伝子構造体
はいずれも相同配列の１回の組換えでpGV3850中に挿入
させることができる。抗生物質耐性マーカーは、組換え
体を選択するためにプラスミドに加えることができる。
除草剤耐性も勿論付随して又は独立して利用することが
できる。このベクター中にノパリンシンターゼ（nos）
遺伝子が存在する場合は、pGV3850を用いた形質転換の
有効性をモニターすることが容易になる。その際、組織
培養中のカルスがノパリンの存在について試験される。 植物細胞又は植物の形質転換後、それらは抗生物質耐
性又は更に適切には除草剤耐性のような適切なマーカー
の補助により選択され、次いで慣用的方法で増殖せしめ
られる。タバコの場合、原形質体単離後３〜５日目の原
形質体培養物が、Ｔ−DNA領域に前記ハイブリッドGS遺
伝子をもつ適切なTiプラスミドを保有したアグロバクテ
リア（Agrobacteria）による形質転換の場合に適する。
原形質体保有細胞及びアグロバクテリアの同時培養２日
後、植物細胞は遠心分離及び新鮮培地への懸濁によって
数回洗浄される。これにより大半の細菌を取除く。残っ
た細胞は適切な抗生物質によって殺されるが、例えばセ
ホタキシム（400〜1,000μg/ml）が原形質体培地に加え
られる。細胞は、それらが可視的な細胞凝集物（カル
ス）を形成するまで、非選択的培地で培養される。次い
でそれらは、すべての野生型細胞を殺すような適度の除
草剤濃度の培地上で培養される。組込まれたGSハイブリ
ッド遺伝子を発現する形質転換体のみが存在し、かつ増
殖を続ける。これらのカルスは、６−ベンジルアデニン
1mg/及びナフタレン酢酸0.1mg/含有のムラシゲ・シ
ューグ（Murashige−Shoog）培地に移された場合に、苗
条を再生するよう容易に誘導される。苗条は無ホルモン
MS培地に又は直接パーラントもしくはポーミキュライト
に根付くことができ、ポットに移し替えられる。苗木は
温室で生長しうる状態となり、除草剤耐性に関して試験
することができる。 カリフラワ−モザイクウイルスCaMVのような他の系
〔ホーン・ビーら，“植物腫瘍の分子生物学",アカデミ
ックプレス，ニューヨーク,1982年，第549−560頁（Hho
n,B.,et al.,“Molecular Biology of Plant Tumors",A
cademic Press,Now York,1982,pp.549−560）；及びホ
ーウェル（Howell）の米国特許第4,407,956号明細書〕
も使用可能である。完全CaMVウイルスDNAゲノムは、細
菌中で増殖されうる組換えDNA分子を得るため、親細菌
プラスミドに挿入される。クローニング後、組換えプラ
スミドは、本発明の組合せ遺伝子の挿入のために、組換
えプラスミドのウイルス部分においてランダムに又は独
特な部位で制限酵素により切断される。リンカーと称さ
れ独特な制限部位をもつ小オリゴヌクレオチドも挿入さ
せることができる。修正組換えプラスミドは再度クロー
ニングされ、リンカーの独特な制限部位へのより大きな
遺伝子構造片の導入によって更に修正される。組換えプ
ラスミドの修正ウイルス部分は次いで親細菌プラスミド
から切除されて、植物細胞又は植物に接種するために使
用される。このウイルスは、前記ホーウェルの特許明細
書において、高タンパク質生産、ストレスに対する高耐
性、ペスト及び農薬に対する耐性、窒素固定その他を可
能にする遺伝子の挿入のためには特に有効であると記載
されている。 通常、望ましいGS配列は、公知の組換え方法によっ
て、互いに又は過剰生産プロモーターにインビトロで作
働可能に結合せしめられる。例えば、GSの構造遺伝子、
通常そのゲノム遺伝子は、その正常なプロモーター及び
開始AUGコドン間の領域上の制限によって、かかるプロ
モーターから分離される。次いで、例えばリブロース二
リン酸カルボキシラーゼの小サブユニットとの転写融合
が行なわれる。しかる後、構造体が植物ビヒクルの適切
な制限部位中に挿入される。 例えば、ビヒクルとしてCaMV DNAを用いた場合、遺伝
子構造体は、ウイルスDNAの感染性又は植物全体にわた
るその可動性を消失させることなく、ウイルスDNA上の
部位に挿入される。したがって、構造体は様々な制限部
位に挿入させることができ、生成物をクローニングし
て、ウイルスの必須の特性が残存するか否かにつき調べ
られる。この方法では、感染性及び可動性についてスク
リーニングすることが可能な比較的多量の修正ウイルス
を迅速に単離しうるようになる。ハイブリッドDNAプラ
スミドのウイルス部分が修正された後、修正ウイルスは
ハイブリッドDNAプラスミドから取除かれ、直鎖型で直
接又は環化結合した型で植物に接種させるために使用さ
れる。 様々な技術が、植物細胞をCaMVビヒクルで感染させる
ために使用しうる。若葉は穏やかに表皮剥離され、次い
でウイルスDNAと接触せしめられる。感染後、ウイルスD
NAはアブラムシ（aphid）によって媒介させることがで
きるが、アブラムシ媒介遺伝子は機能的に作働する。機
械的技術も適用可能である。又は、組織もしくは単細胞
を感染させてもよい。 用 途 本発明の遺伝子構造体を有するビヒクルの用途は、除
草剤耐性植物細胞及び全体植物の製造に際しての中間体
としてのものである。したがって、本発明の方法により
耐性を獲得した植物細胞のみならず、ビヒクル又はベク
ターのすべては、最終生成物、即ち全体植物の有用性か
ら自らの有用性が導かれる。 本発明に従い除草剤耐性を獲得した全体植物の有用性
は明らかである。かかる植物は、植物制御又は抑制量の
除草剤と接触せしめられた場合に、それに対し耐性であ
る。これによって、いずれかの望ましい植物又は植物群
のみを選択する除草剤処理が可能になる。 更に、除草剤に対する耐性は、植物又はその細胞に他
の遺伝子を導入した場合の選択可能マーカーとして使用
することが可能になる。 “除草性GS阻害剤の植物制御量”という語は、所定の
植物の増殖又は生長に影響を与えうる機能面からの除草
剤量を意味する。したがって、量は増殖もしくは生長を
単に低下もしくは抑制するにしかすぎない少量であって
もよく、又は量は感受性細胞を不可逆的に破壊するのに
十分な多量であってもよい。通常、双子葉植物及び草類
は、0.5〜1.5kg/haの空中散布割合で制御される。単子
葉植物の場合は、0.5〜2.0kg/haの空中散布割合が通常
適用される。当然除草剤は周知のスプレー又はスプレッ
ド方法によって適当な植物と接触せしめられる。例えば
PPTによる草類の制御のために先行技術で用いられた葉
面投与法も、本発明に属するPPT耐性植物の場合には適
用可能である。 本発明は更に、除草性GS阻害剤感受性植物細胞又は植
物を植物制御量の除草性GS阻害剤と接触させる植物制御
方法にも関するが、接触は本発明の除草性GS阻害剤耐性
植物細胞又は植物と同時に又はそれらの中に感受性植物
細胞又は植物が存在する場合に行なわれる。したがっ
て、野外又は栽培地における植物の葉面除草剤処理にお
いて、植物が除草剤耐性植物細胞からなる植物及び除草
剤感受性植物細胞からなる植物の双方を含み、双方が処
理作業中に除草性GS阻害剤と同時に接触せしめられる場
合には、かかる草面除草剤処理は、本発明に包含される
方法である。 本発明について概括的に説明してきたが、本発明は具
体例を参照することより明確に理解されるようになるの
であって、これらの例は説明のみの目的で記載されてお
り、特に指示のない限り限定のためのものではない。 例１ PPT耐性アルファルファ細胞培養物の単離及び特徴付け 培地中Ｌ−ホスフィノスリシン3mM存在下で増殖しう
るアルファルファ細胞系を選択した。アルファルファ
は、単一の単離細胞又は原形質体から全体植物が容易に
再生しうるモデル植物の１つであることから、選択され
た。 ホスファノスリシン耐性アルファルファ系の選択は、
液体培地中の阻害剤濃度を段階的に高めることにより行
なった。６か月以内に原細胞系よりもホスフィノスリシ
ンに対して少なくとも20倍高い耐性を有する細胞群を選
択した。懸濁培養物中の圧縮細胞容量測定によると、野
生型細胞は2.5×10-5MのＬ−ホスフィノスリシンで完全
に阻害された。耐性細胞は、化合物５×10-4M存在下で
その非存在下の場合と同様良好に増殖した（第２図及び
第３図）。 感受性及び耐性の細胞系の粗細胞抽出物のタンパク質
パターンをSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により
比較した場合に、分子量40〜42KDのポリペプチドの過剰
生産がPPT耐性細胞系において観察された。アルファル
ファの精製GSも同様の分子量を有する。細胞抽出物の酵
素活性を合わせて測定した。耐性細胞の特異的GS活性
は、野生型細胞の場合よりも５〜10倍高かった。PPT耐
性細胞系におけるGS特異的活性は、効率的二窒素固定マ
メ科植物のすべての根粒組織と同様に高GS活性を有する
アルファルファの根粒組織の場合と同程度である。様々
な量のホスフィノスリシン存在下におけるGS活性の測定
では、いずれの細胞型でもPPTにより同程度の酵素阻害
性を示したが、このことはGSタンパク質の構造的変化が
耐性変異体の選択時に起こらなかったことを示唆してい
る。 メッセンジャーRNAをイソチオシアン酸グアニジニウ
ムRNA抽出法によって野生型及び耐性細胞から単離し、
次いでオリゴdTセルロースカラムに通してmRNAを分離し
た。mRNA4μｇが細胞物質1gにつき単離された。両細胞
系から単離されたmRNAのインビトロ翻訳では、35S−メ
チオニン標識抽出物から得られるインビボパターンと同
様のポリペプチドパターンを示した。このことは単離さ
れたmRNAがほぼ未変化であることを示唆した。インビボ
標識タンパク質では40〜42KDポリペプチドの量において
顕著な差異を示したが、インビトロ翻訳タンパク質パタ
ーンにおける野生型及び変異細胞系間の差異はみられな
かった。 第一及び第二の鎖状cDNAをPPT耐性変異体のmRNA集団
から合成した。cDNAのS1−切断及びポリＣ−尾部形成の
後に、DNAをポリＧ−尾部形成pBR322ベクターDNAとアニ
ーリングした。大腸菌MC1061株を再環化ベクターで形質
転換させた。 3.5×104個のコロニーをアニーリングベクターDNA1g
当たり得た。80％のコロニーはアンピシリン（amp）感
受性であって、amp感受性クローンの50％はプラスミド
のPst消化により検出されうる挿入物を有していた。挿
入物の10％は1000以上の塩基対を有していた。 コロニー1800個をニトロセルロースフィルター上で増
殖させ、GS特異的配列の割合が高い32P標識第一鎖cDNA
プローブでフィルターをプローブ化した。かかるクロー
ンの中からGS特異的cDNAクローンを見出しうると期待さ
れた。根粒のmRNAから製造されたファセオルス（Phaseo
lus）cDNAライブラリー中のGS−cDNAクローンを外部供
給源から入手した。このGS−cDNAクローンはcDNAライブ
ラリー中の１つのアルファルファcDNAクローンを同定す
ることができたが、これはファセオルスGS−DANと強く
ハイブリッド形成する。 アルファルファGS−cDNAクローンの挿入DNAを配列決
定した。次いで、アルファルファ及びファセオルスGS−
cDNAを、野生アルファルファ細胞及び変異GS過剰生産細
胞間の差異を明らかにするため、プローブとして使用し
た。 全ゲノムDNAを、アルファルファ葉、野生型細胞系、
６×10-4M、２×10-3M及び３×10-3M L−ホスフィノス
リシン存在下で選択された耐性細胞系の３つの亜系から
取出した。DNAをBamH I、EcoR I、Hind III及び２種の
酵素の組合せにより消化した。消化されたDNAのアガロ
ースゲル電気泳動後、DNA断片をサウザーンブロット法
によりニトロセルロースフィルター上に移した。フィル
ター結合DNAをアルファルファ及びファセオルスGS−ク
ローンの32P標識cDNA挿入物とハイブリッド形成させ
た。同一サイズのDNAは双方のプローブとハイブリッド
形成した。１つの主なバンドは、５種すべてのDNAサン
プルにおいて同様の強度でアルファルファプローブとハ
イブリッド形成した。第二のバンドは、野生型DNA消化
物の場合にほとんど目に見えないが、耐性細胞系のDNA
と強くハイブリッド形成する。最も強いハイブリッド形
成は高度の耐性細胞系のDNAの場合に観察されたが、こ
のことは耐性獲得時におけるDNA断片の増幅を示唆して
いる。アルファルファcDNAプローブは増幅DNA断片と強
くハイブリッド形成し、GS相同性の増幅DNAとはそれよ
りも弱くハイブリッド形成した。 変異アルファルファ細胞系がPPT耐性になった理由を
確認するため、野生型及び変異細胞系を用いてノザーン
及びサウザーンブロット法を繰返した。ノザーンブロッ
ト法では、野生型の場合よりもグルタミンシンテターゼ
mRNAが約８倍多いことを示した。サウザーンブロット法
が双方の細胞系のゲノムDNAを用いて行なわれた場合に
は、変異アルファルファ細胞系においてグルタミンシン
テターゼ遺伝子の重複が明らかに示された。重複度は、
ハイブリッド形成により評価すると、未重複グルタミン
シンテターゼ遺伝子の場合よりも５〜15倍高いようであ
る。それはまた正確に重複しているようであって、即ち
１つのバンドのみがハイブリッド形成能に関して７〜11
倍高まっていた。 例２ PPT耐性細胞培養物からのグルタミンシンテターゼの単
離及び特性付け 物性及び方法 CNBr切断 グルタミンシンテターゼ（12nmol）を70％ギ酸1mlに
溶解させ、CNBr 5mgを加え、室温で24時間切断を進めた
〔グロス，メソッズ・イン・エンザイモロジー，第11
巻，第238−255頁,1967年（Gross,Methods in Enzymolo
gy 11:238−255（1967））〕。蒸留水（6ml）で稀釈
後、混合液を２回凍結乾燥させた。 CNBrペプチドの高速液体クロマトグラフィー 逆相高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を、ウルト
ラポア（Ultrapore）RPSC（内径0.46cm×7.5cm）で、0.
1％トリフルオロ酢酸（TFA）を用い40℃で０〜60％アセ
トニトリル直線勾配（30分間；流速0.5ml/min）により
行なった。〔ベネットら，バイオケミカル・ジャーナ
ル，第168巻，第９−13頁,1977年（Bennet et al.,Bioc
hemical Journal 168:9−13（1977））〕。CNBrペプチ
ドを最小容量の0.1％TFA中6M塩酸ゲアニジンに溶解させ
た。数回に分け分取したクロマトグラフィーピークを手
で回収し、プールし、凍結乾燥させた。ベックマン（Be
ckman）160検出器を用いて214nmで検出を行なった。 アミノ酸分析 アミノ酸組成は、常時沸騰したHCl（0.025ml）中110
℃で24時間、シールされ、排気されたチューブ〔パイレ
ックス（Pyrex ），培養，基，縁なし,6×50mm〕中に
おけるサンプルの酸加水分解後に調べた〔ムーア，ペプ
チドの化学及び生物学，アン・アーバー・サイエンス，
アン・アーバー、ミシガン，第629−653頁,1972年（Moo
re,Chemical and Biology of Peptides,Ann Arbor Scie
nce,Ann Arbor,Michigan,629−653（1972））〕。ヒュ
ーレット−パッカード（Hewlett−Packard）3390A積分
器２個装備のベックマン（Beckman）6300アミノ酸アナ
ライザー、ニンヒドリン及び２チャンネル（440及び570
nm）積分を用いて、100pmol/アミノ酸における信頼値１
〜７％、最小検出限度25pmolでトリプトファン、システ
ィン、アスパラギン及びグルタミン以外のすべてのアミ
ノ酸を分析した。分析は各サンプル及びバックグラウン
ドコントロールについて３〜５回繰返した。 タンパク質配列分析： 自動エドマン分解をアプライド・バイオシステムス47
0Aシークエンサー（Applied Biosystems 470A sequence
r）で行なった。配列決定プログラムは、気液固相ペプ
チド及びタンパク質配列決定法として既に開発済である
〔ヘウィックら，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー，第256巻，第7990−7997頁,1981年（Hewi
ck et al.,Journal of Biochemical Chemistry,256:799
0−7997（1981））〕。プログラムは、１つのカップリ
ング工程（44℃,26分間）及び単一切断工程（44℃,4.7
分間）を含む。２−アニリノ−５−チアゾリノン誘導体
（Pth−アミノ酸）の自動変換には、25％トリフルオロ
酢酸（50℃,33分間）を用いる。ポリブレン（Polybrene
）（1.5mg）〔タールら，アナリティカル・バイオケ
ミストリー，第84巻，第622−627頁,1978年（Torr et a
l.,Analytical Biochemistry 84:622−627（1978）；ク
ラッパー（Klapper）ら，同上，第85巻，第126−131頁,
1978年〕をタンパク質またはペプチドの分解前にカート
リッジ式ガラスフィルターディスクに加え、ポリブレン
由来の汚染物質を減少させるために配列決定サイクルを
５回繰返した。アンギオテンシンII（1mol）をカートリ
ッジフィルターに加え、次いで分解サイクルを終えた。
アンギオテンシンを配列決定により、未知物質の配列決
定前にシークエンサーの化学的及び機械的操作性につい
て評価した。マッコウクジラアポミオグロビン（100〜2
00pmol）のタンパク質配列分析では、通常、初期収率45
−55％、平均繰返し収率92〜93％及び１サイクル当たり
の平均ラグ２〜３％であった。すべてのPth−アミノ酸
は、ハンカピラー及びフッド，メソッズ・イン・エンザ
イモロジー、第91巻，第486−493頁,1983年〔Hunkapill
er and Hood Methods in Enzymology 91:486−493（198
3）〕により開発された系に基づき、15mM酢酸ナトリウ
ム緩衝液（pH5.5）及びアセトニトリル／メタノール（9
2.5:7.5;v/v）複合勾配を用いて、シアノカラム（0.45
×25cm）での逆相高速液体クロマトグラフィーによって
同定された。このHPLC系は、ジチオスレイトール付加
物、Ｎ−ジメチル−N1−フェニルチオ尿素及びジフェニ
ルチオ尿素の主な汚染物質からPth−アミノ酸及び内部
標準（Pth−Gluのメチルエステル）を分離した。メチオ
ニン及びプロリンは慣用手続きによっては分離されなか
ったが、修正勾配にいよればこれら２種のPth−アミノ
酸を分離することができた。内部標準（200mmol）を各
サイクル回収物に加え、サンプルをRH100−６ローター
装備スピードバック・コンセントレーター（Speedvac C
oncentrator）で乾燥させた。乾燥サンプルを水／アセ
トニトリル（80:20,v/v）0.025mlに溶解させ、一部（0.
017ml）（全サンプルの68％）を自動注入した。Pth−ア
ミノ酸をベックマン160検出器により254nmにおけるUV吸
光度によって検出した。 凍結変異アルファルファ組織培養細胞100gをトライア
イスと混合し、ブレンダーで微粉末に粉砕した。解凍
後、混合物を４℃で20分間8,000rpmで回転させた。硫酸
プロタミン沈殿を上澄で行ない、核酸を除去した。MgSO
4濃度を10mMとし、β−メルカプトエタノール（BMe）を
7mMとし、pHを1N酢酸で6.8に調整した。粗抽出物をヒド
ロキシアパタイト（H.A.）に結合させた。H.A.をpH7.5
の10mMトリス、0.28M MgSO4及び10％エチレングリコー
ルでバッチ毎に５回洗浄した。グルタミンシンテターゼ
をMgSO4濃度0.5Mとすることにより溶離した。バッチ溶
離を５回行なった。pH7.5の10mMトリス、10mM MgSO4で
透析後、Ｇ−200カラムに供した。グルタミンシンテタ
ーゼ活性を有する画分をプールした。SDSアクリルアミ
ドゲル及び銀染色によると、タンパク質は純度95％以上
であった。アミノ酸組成は、アルファルファグルタミン
シンテターゼの組成が大豆に関して公表された組成の場
合とほぼ同様であることを示した（第１表）。配列決定 配列決定に際しての最初の試みは、精製された天然タ
ンパク質を用いて開始された。入手可能な配列がなかっ
たが、このことはNH2末端が天然ではブロックされてい
ることを示していた。CNBr切断を行ない、断片をHPLCに
より分離した。タンパク質のアミノ酸組成は、２〜５個
のみのメチオニンが存在することを示した。２つのHPLC
分離CNBr断片は有用な配列情報を与えた。 次いで、精製されたグルタミンシンテターゼ断片の配
列決定を行なった。結果は下記のとおりである： この配列は、Gly残基が環化していること以外には、
完全変異アルファルファcDNAクローンから得られる配列
の一部に相当する。推定タンパク質配列は下記に示され
ている。 グルタミンシンテターゼについてコードする機能的ゲノ
ム配列の製造 全ゼノムDNAを、ファセオルス根粒のゲノムを得るた
めに用いられたプロトコール〔カリモアー・ジェイ・デ
ー及びミフリン・ビー・ジェイ，フェデレーション・オ
ブ・ヨーロピアン・バイオケミカル・ソサエテーズ・レ
ターズ，第158巻，第107−112頁,1983年（Cullimore,J.
D.and Miflin,B.J.,Federation of European Biochemic
al Societies Letters 158:107−112（1983））〕に類
似したプロトコールを用いてアルファルファ組織培養物
から得、全大敵にBamH Iで消化した。次いで物質を酢酸
カリウム５〜20％勾配中でサイズ分別し、いくつかの部
分に分けた。しかる後各部分を１％アガロースゲル上で
操作し、上記コード配列プローブのPst切断により得ら
れるcDNAグルタミンシンテターゼプローブとサウザーン
・トランスファー系でプローブ化させた。大きさが4kb
以上の断片について選択された陽性ハイブリッド形成画
分をBV−２λベクターに結合させた。ファージ100,000
個を培養し、上記グルタミンシンテターゼcDNAプローブ
でプローブ化させた。４つの陽性プラークを得た。次い
でこれらを増殖させ、３〜４回にわたるプラークハイブ
リッド形成によって精製した。精製された4kbゲノムク
ローンを単離し、M13mp9に再結合させた。このクローン
を両末端から配列決定した。更にクローンをHae IIIで
断片化し、M13mp9に組込んでサブクローニングし、再度
配列決定した。 この方法により、この4kb5′断片（ゲノムDNAの消化
によっても得られる8kb3′断片の一部と同様に）完全に
配列決定した。これら断片は一緒になって完全な機能性
遺伝子となるが、その読取り枠は手元のタンパク質配列
情報、既知GS分子量及び３種ありうる読取り枠における
停止トリプレットの相対的発生率から予測される。イン
トロン及びエキソン領域を含むグルタミンシンテターゼ
の完全ゲノム配列は第４図に示されている。手元のGSに
関する完全機能性配列は前記いずれかの方法によって発
現させることができる。 第４図は、完全ゲノム配列中に13個のイントロンが存
在することを示す。第一エキソンの前に１個のイントロ
ン、最終エキソンの後に１個のイントロン、及びエキソ
ン12個の間に11個のイントロンが存在する。以下におい
ては、ゲノム配列中におけるそれらの位置を示すため
に、イントロンをI1〜I13で標識する。かかるイントロ
ンがコドン又はトリプレットの第一及び第二ヌクレオチ
ド間に位置する場合、そのトリプレットに対応するアミ
ノ酸は例えばチロシンのときＴ−IX−yrと記載される。
イントロンがコドンの第二及び第三ヌクレオチド間に位
置する場合、対応するアミノ酸は例えばTy−IX−ｒと記
載される。 イントロンは様々な鎖長を有しており、最小及び最大
の鎖長はいずれも立体障害の程度によって決定される。
イントロンの適切なループ化及びエキソンの適切な切
断、結合のためにはイントロン中に十分なヌクレオチド
が存在していなければならない。例えば第４図におい
て、最大のイントロンは第一エキソンの前に位置するI1
であって、740個のヌクレオチド鎖長である。 以上のように本発明を十分に説明してきたが、本発明
は、その精神もしくは範囲又はそのいずれかの態様に影
響を与えない限り、構造、生成物、方法及び用途に関し
て広汎かつ等価な範囲にわたり実施し得ると理解される
であろう。
利用に関し、更に詳しくはホスフィノスリシンのような
除草性植物グルタミンシンテターゼ阻害剤に耐性の植物
細胞の設計と造成に関する。 背景技術 グルタミンシンテターゼ（GS）は、アンモニアの同化
及び窒素代謝の調節に関して中心的役割を果たす植物酸
素である。大半の植物においてグルタミンシンテターゼ
は、硝酸還元、アミノ酸分解又は光吸収によって放出さ
れるアンモニアをグルタミンシンテターゼ／グルタミン
酸シンテターゼ経路（第１図）で解毒する唯一の有効な
方法であることから、植物はグルタミンシンテターゼの
有効な阻害剤に対して非常に影響をうけ易い。 現在公知の最も有効なグルタミンシンテターゼ阻害剤
の１つは、ホスフィノスリシン（１）（以下PPTとい
う）である： PPTはグルタミン酸類縁体である。化合物は、ストレ
プトミセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces virid
ochromogenes）から生産されるトリペプチド抗生物質の
中から最初に単離された〔バイエル・イーら，ヘルベチ
カ・キミカ・アクタ，第55巻，第224頁,1972年（Bayer,
E.et al.,Helvetica Chimica Acta,55:224（1972））、
及び西独特許公開第2717440号明細書、ヘキスト社（Hoe
chst,A.G.）参照〕。PPTは、大腸菌（Escherichia col
i）グルタミンシンテターゼに対するKi＝0.0059mMの有
効な競合的阻害剤である。 シュウェルドル・エフ（Schwerdtle F.）〔植物の病
気及び植物の保護に関する雑誌、第９巻，第431−440
頁,1981年（zeitschrift fur Pflanzen−Krankheiten a
nd Pflanzenschutz,IX,431−440（1981））〕は、PPT
は、農作物が最小で直接条播される果樹園、ぶどう園及
び農園における望ましくない単子葉及び双子葉植物を制
御するための収穫補助としての非選択的葉類除草剤であ
ることを証明した。西ドイツ、スペイン、南アフリカ、
アメリカ及び日本での野外試験では、大半の双子植物類
が十分に制御されることを示した。単子葉植物類の場合
にはやや多い量が良好な制御のために必要であった。リ
ーズン・エム（Leason,M.）ら〔フィトケミストリー，
第21巻，第855−857頁,1982年（Photochemistry,Volume
21:855−857（1982））〕は、PPTがエンドウ葉グルタ
ミンシンテターゼに対する見掛けKi値0.073mMの混合型
競合阻害剤であることを明らかにした。 いずれの市販除草剤PPTも前記の如く非選択的であっ
て除草選択性が全く欠けていることから、PPT及び他のG
S阻害剤に対する耐性を選択された植物に付与しうるこ
とが、非常に重要となるのである。 他の化合物に対するグルタミンシンテターゼ耐性の存
在例がある。他のグルタミン酸類縁体であるメチオニン
スルホキシイミン（MSO）はエンドウ葉グルタミンシン
テターゼの混合型競合阻害剤（Ki値0.16mM）であること
が知られている（リーズン・エムら，フィトケミストリ
ー、第21巻，第855−857頁,1982年）。ミラー・イー・
エス（Miller,E.S.）及びブレンクレー・ジェイ・イー
（Brenchley,J.E.）〔ザ・ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー，第256巻，第11307−11321頁,19
81年（The Journal of Biological Chemisry 256:11307
−11321（1981））〕は、MSOに耐性の数種のサルモネラ
（Salmonella）変異株の性質について研究した。１つの
変異がアンモニア結合ドメインにおいてグルタミンシン
テターゼを明らかに変えて、MSO耐性を付与したのであ
る。更に最近になり、ヤング（Young）及びリンゴール
ド（Ringold）〔同上，第258巻，第11260−11266頁,198
3年〕は、MSO存在下で増殖せしめられたマウス3T6細胞
かそれに対する耐性を獲得したことを報告した。MSO耐
性細胞はグルタミンシンテターゼに関するmRNAに富んで
おり、著者はこの観察が遺伝子の増幅を意味することを
示唆した。サンダース（Sanders）及びウィルソン（Wil
son）,EMBO.ジャーナル，第３巻，第65−71頁,1984年参
照。しかしながら、ミラー、ヤング及びサンダースの研
究ではいずれも植物GSに関しては報告していなかった。 しかも、本発明以前において、植物細胞のグルタミン
シンテターゼ遺伝子を操作することによりPPTのような
除草性GS阻害剤に対する耐性を付与した研究については
報告がなかった。 したがって、植物細胞のグルタミンシンテターゼ遺伝
子を操作することにより、PPTのような除草性GS阻害剤
に対して耐性の植物細胞を開発することが望まれるので
ある。かかる方法によれば、いかなる植物にも除草剤選
択性を付与することができる。 発明の開示 本発明は、植物のPPT耐性がグルタミンシンテターゼ
の過剰生産に起因するという発見から派生したものであ
り、かかる現象は初期実験によると基礎的な遺伝子増幅
メカニズムに起因することが示された。組織培養された
植物細胞に選択圧を適用することにより、PPT耐性株を
単離することができた。しかしながら耐性は、PPTに対
する親和性の低い構造変異グルタミンシンテターゼの存
在に基づくのではなく、むしろ植物細胞中における遺伝
子増幅及びそれに伴う酸素濃度の増加に基づくものであ
った。これらの初期観察から、遺伝子増幅により又は遺
伝子増幅以外の他の異なるメカニズムによってグルタミ
ンシンテターゼを過剰生産する（したがって、除草性GS
阻害剤耐性を示す）植物細胞を開発しようとする本発明
の概念が生まれた。 したがって本発明は、除草性グルタミンシンテターゼ
（GS）阻害剤に対して耐性の植物細胞を製造することを
基礎とするものであって、ここにおいて該耐性は、除草
性GS阻害剤感受性植物細胞中に存在する場合に該細胞を
実質上該除草性GS阻害剤に対して耐性とさせるような植
物細胞GS活性レベルによって獲得される。 本発明は様々な方法によって実現しうることから、様
々な態様を包含している。例えば一態様において、本発
明は下記組合せ遺伝子を有する植物細胞を製造すること
に関する： Ａ） 下記第二遺伝子配列と作働可能に結合せしめられ
る植物細胞中で機能するグルタミンシンテターゼ（GS）
についてコードする第一遺伝子配列、 Ｂ） 組合せ体が除草性GS阻害剤感受性植物細胞中に存
在する場合において該細胞が除草性GS阻害剤に対して実
質上耐性となるように上記第一遺伝子配列の発現レベル
を増加させうる第二遺伝子配列。 本発明は更に、上記第一もしくは第二遺伝子配列又は
双方にとって異種である植物種のゲノム又は染色体外複
製要素中に存在する組合せ遺伝子にも関する。 更には、対応する感受性細胞よりも著しく多く野生型
遺伝子コピーを有する耐性植物細胞は、多発現性野生型
GS遺伝子コピーを、複製可能な適切な染色体要素に又は
植物細胞自体のゲノムに導入することによって得ること
ができる。これは細胞培養段階又は全体植物段階におけ
る形質転換によって発現することができる。野生型GS遺
伝子を有する安定なマルチコピー細胞器官も、著しく多
数のGS遺伝子を細胞に導入するために利用しうる。 更に本発明は、未形質転換段階において除草性GS阻害
剤感受性である除草性GS阻害剤耐性形質転換植物細胞自
体にも関する。除草性GS阻害剤耐性たる全体植物も包含
される。 本発明はまた、除草性GS阻害剤耐性を付与しうる前記
遺伝情報をもった植物細胞形質転換ベクターとして機能
しうる中間ビヒクル、及び植物細胞に耐性を付与する方
法にも関する。 更に本発明は、前記方法によって除草剤に対する耐性
を獲得した植物の存在下でかつ同時にそれと接触させな
がら、除草性GS除草剤感受性植物を植物制御量の除草性
GS阻害剤と接触させることにより実現される植物制御方
法に関する。 図面の簡単な説明 本発明は添付図面を参照するとより良く理解されるで
あろう。 第１図は、グルタミンシンテターゼ／グルタミン酸シ
ンターゼサイクルを示したものであって、ATPからADP及
び無機リン酸への加水分解に伴い進行する反応において
GSがグルタミン酸及びアンモニアからのグルタミンの生
成を触媒することが示されている。グルタミンのアミド
窒素は多くの生合成反応のための窒素源を供給するので
あるが、そのことは窒素代謝においてGSが中心的役割を
果たすことを示唆している。除草性GS阻害剤はGSを阻害
することによりグルタミン生合成を妨害し、もってアン
モニア解毒を妨げる。 第２図は、Ｌ−PPTの非存在下（○）及び25（△）、5
0（●）、100（□）μｍ存在下における野生型（PPT感
受性）アルファルファ細胞系の増殖特性を示す。 第３図は、Ｌ−PPTの非存在下（○）及び100（△）、
200（●）、500（□）μｍ存在下における変異PTT耐性
アルファルファ細胞系の増殖特性を示す。 第４図は、グルタミンシンテターゼの完全機能性ゲノ
ム配列を示す。 発明を実施するための最良の形態 下記の説明において、組換えDNA、植物遺伝子技術及
び本発明において用いられているいくつかの用語は広い
意味で用いられている。明細書及び請求の範囲の明確か
つ矛盾のない理解を与えるために、かかる用語の適用範
囲を含めて下記定義が与えられる： ヌクレオチド 糖部分、リン酸及び含窒素ヘテロ環塩基
からなるDNA又はRNAのモノマー単位。塩基はグリコシド
炭素（ペントースの１′位炭素）を介して糖部分と結合
せしめられている。塩基及び糖の組合せはヌクレオシド
と呼ばれる。各ヌクレオシドはその塩基に特徴がある。
４種のDNA塩基はアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シ
トシン（Ｃ）及びチミン（Ｔ）である。４種のRNA塩基
はＡ、Ｇ、Ｃ及びウラシル（Ｕ）である。 遺伝子配列 隣接ペントースの３′及び５′炭素間のホ
スホジエステル結合により互いに結合せしめられたヌク
レオチドの直鎖配列。 機能性遺伝子配列 配列がポリペプチドの完全鎖長配列
の場合よりも短いか又は長いかにかかわらず、所望の活
性をもつポリペプチドについてコードする遺伝子配列。
これは“機能性遺伝子”とも呼ばれる。 コドン又はトリプレット mRNAを介しアミノ酸について
コードするヌクレオチド３個のDNA配列、翻訳開始シグ
ナル又は翻訳終結シグナル。例えば、コドンTTA、TTG、
CTT、CTC、CTA及びCTGはアミノ酸ロイシンについてコー
ドする。TAG、TAA及びTGAは翻訳終結シグナルであり、A
TGは翻訳開始シグナルである。 エクソン アミノ酸配列に翻訳される遺伝子配列。 イントロン アミノ酸配列に翻訳されない、エクソン間
に介在する遺伝子配列。 ゲノム配列、翻訳エクソン及び介在非翻訳イントロン双
方を含めた所定のポリペプチドについての完全遺伝子配
列。 読取り枠 mRNAからアミノ酸配列への翻訳の際における
コドンのグループ分け。翻訳に際しては、適切な読取り
枠が維持されていなければならない。例えば、配列GCTG
GTTGTAAGは、Ｇ、Ｃ又はＴで始まるか否かによって３種
の読取り枠又はフレーズに翻訳され、したがって３種の
異なるペプチド生成物を生じる。 ２つの配列は、それらがまるで独立して存在している
かのように双方とも一緒になって作働するよう、１つの
配列の読取り枠が他のものと結合している場合には、作
動可能な結合状態にある。 転写 機能性遺伝子からmRNAを製造するプロセス。 翻訳 mRNAからポリペプチドを製造するプロセス。 発現 機能性遺伝子から開始してそのポリペプチドを製
造するプロセスであって、転写及び翻訳の組合せからな
るプロセス。 クローニングビヒクル 宿主細胞中で複製しうるプラス
ミド、ファージDNA又は他のDNA配列のことであって、こ
れらは１つもしくは少数のエンドヌクレアーゼ認識部位
を有することを特徴とし、その部位においてかかるDNA
配列がDNAの必須生物学的機能の損失を伴うことなく決
定可能な方法で切断され、しかもこれらは形質転換細胞
の同定のために適したマーカーを有している。代表例は
抗生物質耐性マーカーである。“ベクター”という語も
クローニングビヒクルの代わりに時々使用される。 発現ビヒクル ビヒクル中に存在してポリペプチドにつ
いてコードする機能性遺伝子の発現によるポリペプチド
の宿主細胞内製造のために特に用いられる、クローニン
グビヒクルに類似したビヒクル。 複製ビヒクル クローニング又は発現ビヒクル。 ファージ又はバクテリオファージ タンパク質エンベロ
ープ又は皮膜で被われたDNA配列からなりうる細菌ウイ
ルス。 プラスミド 完全“レプリコン”を有する非染色体性二
重鎖DNA配列のことであって、プラスミドは宿主細胞の
ゲノムで複製されるか又はそれに組込まれる。プラスミ
ドが単細胞又は多細胞生物中に存在する場合には、かか
る生物の特性はプラスミドDNAによって変化又は形質転
換せしめられる。例えば、カナマイシン耐性に関する遺
伝子をもつプラスミドは、以前はカナマイシン感受性で
あった細胞をそれに耐性の細胞に形質転換させる。 クローニング 無性生殖によって１つの生物又はDNA配
列から多数のかかる生物又は配列を得るためのプロセ
ス。 発現制御配列 機能性遺伝子配列と作働可能に結合した
場合にそれら配列の発現を制御調節する遺伝子配列。そ
れらはその発現を調節する領域を制御することが知られ
た配列も有している。それらはプロモーター及びターミ
ネーター配列を双方とも有する。 植物プロモーター かかるプロモーターに作働可能に結
合した同種又は異種の遺伝子配列を植物中で発現させう
る発現制御配列。 過剰生産植物プロモーター（OPP） OPPで形質転換され
ていない宿主細胞において自然に観察されるレベルより
も実質上高いレベルで（mRNA又はポリペプチドの量から
測定される）作働可能に結合した機能性遺伝子配列を形
質転換植物細胞中で発現させうる植物プロモーター。 縮重 各アミノ酸が性質上２以上のコドンによってコー
ドされうることから生じる情報上の現象。例えば、ロイ
シンはTTG、TTA、CTA、CTT、CTC又はCTGによってコード
されうる。 本出願及び請求の範囲で用いられている縮重変異と
は、遺伝子コードの縮重によるポリヌクレオチド断片の
あらゆる変異を意味する。例えば、得られる物質がなお
機能性GS又はその一部についてコードしている限り、か
かる物質は本発明に包含されると考えられる。 グルタミンシンテターゼ（GS） この酵素の定義は機能
性本位であって、GSサイクルでグルタミン酸をグルタミ
ンに変換させるように所望の植物中で機能しうるあらゆ
るグルタミンシンテターゼを包含する。したがってかか
る用語は、遺伝子形質転換された特定の植物種からの酵
素を包含するのみならず、GSが形質転換植物細胞中で機
能しうる場合には、他の植物種又は微生物からの、更に
は他の真核生物からのGSをも包含する。更にこの用語
は、天然植物GSの全構造鎖長よりも長いか又は短いタン
パク質又はポリペプチド、例えばGSの機能性部分断片又
はそれらの類縁体をも包含する。 ホスフィノスリシン（PPT） 生物学的活性型の前記式
（１）の化合物。これはＬ−もしくはＤ−又はD,L−型
であって、PPT活性を阻害しない他の不活性もしくは活
性化合物と併用されても又は単独であってもよい。 本発明は、その最も基本的なレベルにおいては、除草
性グルタミンシンテターゼ阻害剤に耐性である植物細胞
に関し、その際除草性GS阻害剤感受性植物細胞に存在す
る場合には実質上細胞を除草性GS阻害剤に対して耐性に
変えるようなGS活性レベルとすることによって耐性が生
じる。 “除草性グルタミンシンテターゼ阻害剤”という語
は、所定種の植物細胞のグルタミンシンテターゼ活性を
著しく低下させ、その結果植物細胞において除草効果を
発揮する、競合型又は非競合型のいずれの阻害剤をも含
む意味を有する。除草剤耐性植物細胞又は全体植物は、
同種の野生型個体にとって致死的な除草性GS阻害剤濃度
でも不可逆的障害をうけることなく生存しうる。通常、
除草性GS阻害剤耐性に関し５倍以上の増加が有意である
と考えられる。しかしながら、この数値は植物種毎に、
及び除草剤毎に変わる。したがって、本発明に包含され
る数種の植物種及び除草剤のすべてについて同一基準を
適用することは不可能である。しかしこのような基準は
当業者であれば容易に確認することができる。 本発明に包含される除草性GS阻害剤としては、ホスフ
ィノスリシン、メチオニンスルホキシイミン及び他のグ
ルタミン酸類縁体がある。 グルタミンシンテターゼは形質転換される特定の植物
細胞からなるものであってもよいし、そうでなくともよ
い。必要なのは、酵素に関する遺伝子配列が発現せしめ
られて、最終植物細胞中で機能性酵素を生産することの
みである。したがって本発明は、同種GS遺伝子又は異種
GS遺伝子（及びそれらの各々の発現生成物）を有する植
物細胞を包含する。広義には、酵素は他の植物種のもの
であっても、又は微生物もしくは動物のような異なる生
物からの酵素であってもよい。好ましくは、植物グルタ
ミンシンテターゼ遺伝子及びそれらの発現生成物であ
る。特に必要なのは、遺伝子操作において宿主として機
能する特定の植物種からのグルタミンシンテターゼ遺伝
子、即ち同種GS遺伝子である。本発明のrDNA分子に用い
られる１つのかかるグルタミンシンテターゼ遺伝子は、
例２で説明されている。 除草性GS阻害剤に対し感受性であって、本発明の遺伝
子構造体又は方法による遺伝子操作をうけることがで
き、しかも該構造体を発現させることができる植物細胞
であれば、いずれも本発明で使用することができる。双
子葉植物としては、様々な種類のポテト〔ソラヌム・ツ
ベロスム（Solanum tuberosum）〕；トマト〔リコペル
シコン・エスクレンツム（Lycopersicon esculentu
m）〕；コショウ〔カプシクム・アンヌム（Capsicum an
numm）〕；タバコ〔ニコチアナ・タバウム（Nicotiana
tabacum）〕；様々な種類のアブラナ、特に菜種〔ブラ
シカ・ナプス（Brassica napus）〕、様々な豆果類、例
えばアルファルファ〔メジカゴ・サチバ（Medicago sat
iva）〕、クローバー〔トリホリウム種（Trifolium spe
c.）〕、大豆〔グリシン・マックス（Glycine ma
x）〕、グランドナッツ〔アラチス・ヒポガエア（Arach
is Hypogaea）〕、様々な種類の豆類〔フォセオルス種
（Phaseolus spec.）、ビシア種（Vicia spec.）、ヒグ
ナ種（Vigna spec.）〕、エンドウ類〔ピスム・サチブ
ム（Pisum sativum）〕、ビートのような根菜作物〔ベ
タ・ブルガリス（Beta vulgaris）〕、ニンジン類〔ダ
ウクス・カロタ（Doucus carota）〕及びサツマイモ類
〔イポモエア・バタツス（Ipomoea batatus）〕があ
る。 本発明の広義の概念には様々な態様が含まれている。
除草性GS阻害剤耐性植物細胞は、様々なメカニズム及び
／又は遺伝子造成のいずれかによって有意に高レベルの
GS活性を有することができる。 例えば、本発明はその態様の一つにおいて、２種の遺
伝子配列の組合せ、即ち（ａ）下記第二遺伝子配列の下
流に作働可能に結合せしめられる、所定の植物細胞中で
機能するゲノムグルタミンシンテターゼについてコード
する第一遺伝子配列、（ｂ）組合せ体が除草性GS阻害剤
感受性植物細胞中に存在する場合において該細胞が除草
性GS阻害剤に対して実質上耐性となるように上記第一配
列の遺伝子生成物のレベルを増加させうる第二遺伝子配
列からなる。 第二遺伝子配列はプロモーターでもエンハンサー（en
hancer）配列でもよい。プロモーターである場合には、
それはGSプロモーターでも又は他の構造遺伝子のプロモ
ーターであってもよい。後者２つのいずれの場合であっ
ても、組合せ体に用いられるプロモーターは過剰生産植
物プロモーターである。かかるプロモーターの唯一の必
須の特性は、グルタミンシンテターゼの遺伝子配列と作
働可能に結合した場合において、組合せ体が除草性GS阻
害剤感受性植物細胞中に存在するときに細胞がGS阻害剤
に対して実質上耐性となるようなレベルにまで前記グル
タミンシンテターゼの発現量を高めることが可能である
ことである。したがって、使用される植物プロモーター
として何を選択するかは、機能を考慮して決定される。
植物プロモーターは宿主細胞にとって異種でも同種であ
ってもよい。宿主細胞の天然内存性プロモーターはGS過
剰生産による耐性を生じさせることができないが、その
理由はかかる天然プロモーターは通常適用される植物制
御濃度の阻害剤によって実質上又は完全に阻害されるほ
ど低いレベルでしか通常GS発現を促進しえないからであ
る。したがって、本発明の一態様においては、天然プロ
モーターはOPPで置換される。 有効なOPPとしては、リブロース二リン酸カルボキシ
ラーゼ及びクロロフィルa/b結合タンパク質の小サブユ
ニット（ss）のプロモーターがある。これら２種の遺伝
子の発現は、緑色組織での転写段階において光誘導され
ることが明らかにされた〔例えば、植物の遺伝子工学，
農業の展望，エー・キャッシュモア，プレナム，ニュー
ヨーク,1983年，第29−38頁（Genetic Engineering of
plants,An Agricultural Perspective,A.Cashmore,Plen
um,New York 1983,pages 29−38）；コルッジ・ジー
ら，ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー，第258巻、第1399頁,1983年（Coruzzi,G.,et al.,
The Journal of Biological Chemistry 258:1399（198
3））；又はダンスミア・ピーら，ジャーナル・オブ・
モレキュラー・アンド・アプライド・ゲネティクス，第
２巻，第285頁,1983年（Dunsmuir.P.,et al.,Journal o
f Molecular and Applied Genetics.,2:285（1983））
参照〕。 本発明は、記載された方法に従い修正される、又は除
草性GS阻害剤耐性を生じる他のいずれの方法によって修
正されるあらゆる植物細胞にまで拡張される。植物細胞
は、単独で、組織培養で、又は多細胞植物もしくはその
部分の一部として生存するものでも又はそうでないもの
であってもよい。未形質転換状態で除草性GS阻害剤感受
性であるかかる多細胞植物は、その細胞が本発明に従い
耐性とされた場合に耐性化する。 花、種子、葉、枝、果実等のような植物の部分は、こ
れらの部分が前記の如き除草性GS阻害耐性細胞を有する
限り、本発明に含まれる。特に、植物の部分は生存して
いても、又はそうでなくともよい。したがって、耐性ト
マト、ニンジン又はタバコ植物から得られる遺伝的に修
正されたトマト、ニンジン又はタバコの葉は、たとえ元
の植物から分離された場合であっても、本発明に含まれ
る。 製造方法及びそこで用いられる中間体 様々な方法論が、本発明の各種態様を実施する上で適
用可能である。例えば、除草性GS阻害剤耐性が構造GS遺
伝子のコピー数を著しく増加させることによって獲得さ
れるのであれば、適用可能な方法論としては、GS遺伝子
の増幅、又はゲノムもしくは複製染色体外要素中への多
数のGS遺伝子コピーの導入によって耐性を獲得した細胞
を選択する方法がある。 選択は、培地中段階的に量を高めた除草性GS阻害剤の
存在下で植物細胞を培養することにより、適切な培地中
で実施される。所定時間、例えば数週間〜数か月が経過
した後、原植物細胞よりも除草性GS阻害剤に対して数倍
高い耐性を有する細胞群を選択することができる。例え
ば、細胞がアルファルファで、阻害剤がPPTである場合
には、段階的にPPTを増加させて１年後に、原系よりもP
PTに対して20倍高い耐性を有するPPT耐性アルファルフ
ァ細胞系を得ることができた。耐性系が阻害剤非存在下
で数か月間継代培養された場合、耐性細胞率の若干の減
少が阻害剤含有寒天培地でのプレート実験中に観察され
たが、６か月間以上の経過後には高度に耐性の細胞クロ
ーンを依然と再選択することが可能であった。これは野
生型細胞を培養した場合には不可能であった。 組織培養細胞からのカルス及び成長した植物の再生法
は当業者に公知であって、これは種毎に異なる。例え
ば、参考のため本明細書に組込まれる1982年シェパード
（Sheperd）のサイエンティフィック・アメリカン（Sci
entific American）参照。通常、多数のGS遺伝子コピー
を含有し又は組合せ遺伝子配列を含有する原形質体の懸
濁物が最初に準備される。次いで胚形成が、天然胚とし
て発芽する段階まで、原形質体懸濁物から誘導されう
る。培地は通常様々なアミノ酸類、並びにオーキシン及
びサイトカイニンのようなホルモン類を含有する。特に
トウモロコシ及びアルファルファのような種の場合に
は、グルタミン酸及びプロリンを培地に加えることが有
利である。苗条及び根は通常同時に発生する。有効な再
生法であるか否かは、培地、遺伝子型及び培養経歴に依
存する。これら３つの変動要件が制御される場合には、
再生は十分に再現かつ反復が可能である。 タバコ、アルファルファ、ポテト、トマト、ペチュニ
ア、大豆、菜種、数種の果樹及びニンジンのようないく
つかの種の遺伝子型の場合には、再生法は先行技術にお
いて明確に説明されていた。このような再生法は、適切
な遺伝子型及び系統がスクリーニングにより選択される
場合には十分に当業界の技術範囲に属する。通常継代培
養の約１年経過後になると、植物の再生効率は所定の細
胞培養の場合よりも低下する。したがって再生は、適切
な耐性細胞の培養後早期に開始した場合が、通常最も成
功しやすい。 しかしながら、数か月又は１年以上経た細胞培養物が
特に使用される場合には、増幅せしめられたGS遺伝子が
交雑及び／又は融合によって再生系に組込まれる。例え
ば、参考のため本明細書に組込まれるクッキングら，ネ
ーチャー，第293巻，第265頁,1981年〔Coking et al.,N
ature,293:265（1981）〕参照。この方法では、除草性G
S阻害剤耐性細胞系は選択によって得られ、急速に分裂
する細胞の培養懸濁物が当業者に周知の方法により得ら
れる。原形質体はそこから単離され、完全に不可逆な障
害とならないのであれば、宿主細胞を不活化させるため
に十分な放射線量及び時間にわたり放射線照射すること
が好ましい。例えば20キロラッドのＸ線照射が有利に適
用される。ドナー原形質体に放射線照射した後、それは
適切な感受性細胞からのアクセプター原形質体と融合せ
しめられる。例えば、ポリエチレングリコール融合、高
カルシウム処理、双方の組合せ又は最近の電気融合のよ
うな様々な方法が融合体を得るために存在する。融合処
理後、融合生成物は除草性GS阻害剤耐性になっているは
ずであるから、融合生成物の選択的増殖が行なわれう
る。特にもはや形態形成しないドナーが用いられる場合
（即ち、ドナー培養物が最初の選択から既に数か月又は
１年以上経過しているような場合）には、除草性GS阻害
剤含有培地中で簡単な選択が行なわれるだけでよい。 遺伝物質を植物細胞中に導入するもう１つの方法は、
植物の受傷葉を形質転換アグロバクテリウム・ツメファ
シエンス（Agrobacterium tumefaciens）細菌で感染さ
せることである。適切な増殖条件下でカルス環が受傷部
周辺で生成する。次いでカルスは増殖培地に移され、苗
条、根を形成して、更に植物まで生長する。又は、全体
植物への接ぎ木を行なってもよい。 多数のGS遺伝子コピーを植物細胞中に導入するための
もう１つの方法は、組換えDNA技術における当業者に周
知の方法によって、機能性GS（ゲノム又はcDNA）構造遺
伝子のコピーを自己結合させることである。各々が個々
のプロモーターを有する構造遺伝子群は適切なリンカー
によって互いに作働可能に結合せしめられ、ある場合に
おいて各遺伝子の10〜30個のコピーがTiプラスミドのよ
うな適切な複製可能な発現ビヒクル中に導入される。又
は、遺伝物質は植物胚細胞中に直接微量注射することが
できる。単子葉植物の場合には、花粉は全DNAで又は耐
性をもつ適切な機能性クローンで形質転換され、次いで
花粉は有性生殖により子孫を残すために使用される。 勿論、細胞を除草性GS・Ｓ阻害剤耐性とするようなレ
ベルまで所定細胞のGS活性を高めるために適用可能なも
のであれば他のいかなる方法も利用することができる。
本発明において特に重要なことは、構造GS遺伝子につい
てコードする機能性ゲノム配列を、自己から得られる遺
伝子生成物の過剰生産が可能な別の遺伝子配列に作働可
能に結合させることである。遺伝子配列のこの結合は、
例えばTiプラスミドによって適切な植物細胞中に導入す
ることができる。 特にアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agroba
cterium tumefaciens）の所謂腫瘍誘導性（Ti）プラス
ミドの使用による、植物細胞中への遺伝物質の導入は、
再現可能かつ予測可能な技術である〔例えば、カプラン
・エーら，“植物細胞中への遺伝物質の導入",サイエン
ス，第815−821頁,1983年11月（Caplan,A..et al.,“In
troduction of Genetic Material into Plant cells",S
cience:815−821（November 1983））；シェル・ジェイ
及びヴァン モンタギュー・エム，“植物における天然
の及び実用的な遺伝子ベクターとしてのTiプラスミド”
バイオテクノロジー,1983年４月，第175−180頁（Schel
l,J.,and Van Montagu,M.,“The Ti Plasmid as Natura
l and as Practical Gene Vector for Plants,"Bio/Tec
hnology:April 1983.pp.175−180）；ホーシュら，“植
物における機能性外来遺伝子の遺伝承継",サイエンス，
第233巻，第496−498頁,1984年（Horsh et al.,“Inher
itance of Functional Foreign Genes in Plants",Scie
nsce:233,496−498（1984））；フレリー・アール・テ
ーら，プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス USA,第80巻，第4803頁,1983年
（Fraley,R.T.,et al.,Proceeding of National Academ
y of Science USA 80:4803（1983））；ワトソンら，組
換えDNA;ショート・コース，サイエンティフィック・ア
メリカン・ブックス,1983年，第164−173頁（Watson et
al.,Recombinant DNA.A Short Course,Scientific Ame
rican Books,1983,pp.164−173）；オールド及びプリム
ローズ，遺伝子操作原理，第２版，ユー・カル・プレ
ス,1981年，第138−156頁（Old and Primrose,Principl
es of Gene Manipulation,2d Ed.,U.Cal.Press,1981,p
p.138−156）参照；これらは参考のため本明細書に組込
まれる〕。 Tiプラスミドは形質転換細胞の製造のために必要な２
つの領域を有する。これらのうち１つは転移DNA（Ｔ−D
NA）と呼ばれ、腫瘍形成を誘導する。もう１つはビルレ
ント（virulent）領域と呼ばれ、腫瘍の維持ではなく形
成のために必要である。植物ゲノムに転移する転移DNA
は、その転移能が影響をうけないのであれば、本発明の
多数結合GS遺伝子又は組合せ遺伝子の挿入によってサイ
ズを拡大させることができる。腫瘍形成遺伝子がもはや
干渉しないようにそれらを取除いた場合には、修正され
たTiプラスミドは適切な植物細胞中に本発明の遺伝子構
造体を転移させるためのベクターとして用いることがで
きる。挿入される外来DNAは、Ｔ領域の側面に位置する
両末端配列間に通常導入される。 特に有用なTiプラスミドベクターは、ノパリンTiプラ
スミドC58の非腫瘍形成誘導体たるpGV3850である（カプ
ランら，同上参照）。このベクターはTiプラスミドの自
然転移性を利用している。未分換クラウンゴール（crow
gall）表現型を決定する内在Ｔ−DNA遺伝子は削除され
ており、通常のクローニングビヒクル（例えばpBR322）
で置換されている。Ｔ−DNAボーダー領域間のクローニ
ングビヒクル配列は、同一クローニングビヒクルの誘導
体でクローニングされた外来DNAを再導入するための組
換え用相同性領域として機能する。したがって、かかる
プラスミドでクローニングされる本発明の遺伝子構造体
はいずれも相同配列の１回の組換えでpGV3850中に挿入
させることができる。抗生物質耐性マーカーは、組換え
体を選択するためにプラスミドに加えることができる。
除草剤耐性も勿論付随して又は独立して利用することが
できる。このベクター中にノパリンシンターゼ（nos）
遺伝子が存在する場合は、pGV3850を用いた形質転換の
有効性をモニターすることが容易になる。その際、組織
培養中のカルスがノパリンの存在について試験される。 植物細胞又は植物の形質転換後、それらは抗生物質耐
性又は更に適切には除草剤耐性のような適切なマーカー
の補助により選択され、次いで慣用的方法で増殖せしめ
られる。タバコの場合、原形質体単離後３〜５日目の原
形質体培養物が、Ｔ−DNA領域に前記ハイブリッドGS遺
伝子をもつ適切なTiプラスミドを保有したアグロバクテ
リア（Agrobacteria）による形質転換の場合に適する。
原形質体保有細胞及びアグロバクテリアの同時培養２日
後、植物細胞は遠心分離及び新鮮培地への懸濁によって
数回洗浄される。これにより大半の細菌を取除く。残っ
た細胞は適切な抗生物質によって殺されるが、例えばセ
ホタキシム（400〜1,000μg/ml）が原形質体培地に加え
られる。細胞は、それらが可視的な細胞凝集物（カル
ス）を形成するまで、非選択的培地で培養される。次い
でそれらは、すべての野生型細胞を殺すような適度の除
草剤濃度の培地上で培養される。組込まれたGSハイブリ
ッド遺伝子を発現する形質転換体のみが存在し、かつ増
殖を続ける。これらのカルスは、６−ベンジルアデニン
1mg/及びナフタレン酢酸0.1mg/含有のムラシゲ・シ
ューグ（Murashige−Shoog）培地に移された場合に、苗
条を再生するよう容易に誘導される。苗条は無ホルモン
MS培地に又は直接パーラントもしくはポーミキュライト
に根付くことができ、ポットに移し替えられる。苗木は
温室で生長しうる状態となり、除草剤耐性に関して試験
することができる。 カリフラワ−モザイクウイルスCaMVのような他の系
〔ホーン・ビーら，“植物腫瘍の分子生物学",アカデミ
ックプレス，ニューヨーク,1982年，第549−560頁（Hho
n,B.,et al.,“Molecular Biology of Plant Tumors",A
cademic Press,Now York,1982,pp.549−560）；及びホ
ーウェル（Howell）の米国特許第4,407,956号明細書〕
も使用可能である。完全CaMVウイルスDNAゲノムは、細
菌中で増殖されうる組換えDNA分子を得るため、親細菌
プラスミドに挿入される。クローニング後、組換えプラ
スミドは、本発明の組合せ遺伝子の挿入のために、組換
えプラスミドのウイルス部分においてランダムに又は独
特な部位で制限酵素により切断される。リンカーと称さ
れ独特な制限部位をもつ小オリゴヌクレオチドも挿入さ
せることができる。修正組換えプラスミドは再度クロー
ニングされ、リンカーの独特な制限部位へのより大きな
遺伝子構造片の導入によって更に修正される。組換えプ
ラスミドの修正ウイルス部分は次いで親細菌プラスミド
から切除されて、植物細胞又は植物に接種するために使
用される。このウイルスは、前記ホーウェルの特許明細
書において、高タンパク質生産、ストレスに対する高耐
性、ペスト及び農薬に対する耐性、窒素固定その他を可
能にする遺伝子の挿入のためには特に有効であると記載
されている。 通常、望ましいGS配列は、公知の組換え方法によっ
て、互いに又は過剰生産プロモーターにインビトロで作
働可能に結合せしめられる。例えば、GSの構造遺伝子、
通常そのゲノム遺伝子は、その正常なプロモーター及び
開始AUGコドン間の領域上の制限によって、かかるプロ
モーターから分離される。次いで、例えばリブロース二
リン酸カルボキシラーゼの小サブユニットとの転写融合
が行なわれる。しかる後、構造体が植物ビヒクルの適切
な制限部位中に挿入される。 例えば、ビヒクルとしてCaMV DNAを用いた場合、遺伝
子構造体は、ウイルスDNAの感染性又は植物全体にわた
るその可動性を消失させることなく、ウイルスDNA上の
部位に挿入される。したがって、構造体は様々な制限部
位に挿入させることができ、生成物をクローニングし
て、ウイルスの必須の特性が残存するか否かにつき調べ
られる。この方法では、感染性及び可動性についてスク
リーニングすることが可能な比較的多量の修正ウイルス
を迅速に単離しうるようになる。ハイブリッドDNAプラ
スミドのウイルス部分が修正された後、修正ウイルスは
ハイブリッドDNAプラスミドから取除かれ、直鎖型で直
接又は環化結合した型で植物に接種させるために使用さ
れる。 様々な技術が、植物細胞をCaMVビヒクルで感染させる
ために使用しうる。若葉は穏やかに表皮剥離され、次い
でウイルスDNAと接触せしめられる。感染後、ウイルスD
NAはアブラムシ（aphid）によって媒介させることがで
きるが、アブラムシ媒介遺伝子は機能的に作働する。機
械的技術も適用可能である。又は、組織もしくは単細胞
を感染させてもよい。 用 途 本発明の遺伝子構造体を有するビヒクルの用途は、除
草剤耐性植物細胞及び全体植物の製造に際しての中間体
としてのものである。したがって、本発明の方法により
耐性を獲得した植物細胞のみならず、ビヒクル又はベク
ターのすべては、最終生成物、即ち全体植物の有用性か
ら自らの有用性が導かれる。 本発明に従い除草剤耐性を獲得した全体植物の有用性
は明らかである。かかる植物は、植物制御又は抑制量の
除草剤と接触せしめられた場合に、それに対し耐性であ
る。これによって、いずれかの望ましい植物又は植物群
のみを選択する除草剤処理が可能になる。 更に、除草剤に対する耐性は、植物又はその細胞に他
の遺伝子を導入した場合の選択可能マーカーとして使用
することが可能になる。 “除草性GS阻害剤の植物制御量”という語は、所定の
植物の増殖又は生長に影響を与えうる機能面からの除草
剤量を意味する。したがって、量は増殖もしくは生長を
単に低下もしくは抑制するにしかすぎない少量であって
もよく、又は量は感受性細胞を不可逆的に破壊するのに
十分な多量であってもよい。通常、双子葉植物及び草類
は、0.5〜1.5kg/haの空中散布割合で制御される。単子
葉植物の場合は、0.5〜2.0kg/haの空中散布割合が通常
適用される。当然除草剤は周知のスプレー又はスプレッ
ド方法によって適当な植物と接触せしめられる。例えば
PPTによる草類の制御のために先行技術で用いられた葉
面投与法も、本発明に属するPPT耐性植物の場合には適
用可能である。 本発明は更に、除草性GS阻害剤感受性植物細胞又は植
物を植物制御量の除草性GS阻害剤と接触させる植物制御
方法にも関するが、接触は本発明の除草性GS阻害剤耐性
植物細胞又は植物と同時に又はそれらの中に感受性植物
細胞又は植物が存在する場合に行なわれる。したがっ
て、野外又は栽培地における植物の葉面除草剤処理にお
いて、植物が除草剤耐性植物細胞からなる植物及び除草
剤感受性植物細胞からなる植物の双方を含み、双方が処
理作業中に除草性GS阻害剤と同時に接触せしめられる場
合には、かかる草面除草剤処理は、本発明に包含される
方法である。 本発明について概括的に説明してきたが、本発明は具
体例を参照することより明確に理解されるようになるの
であって、これらの例は説明のみの目的で記載されてお
り、特に指示のない限り限定のためのものではない。 例１ PPT耐性アルファルファ細胞培養物の単離及び特徴付け 培地中Ｌ−ホスフィノスリシン3mM存在下で増殖しう
るアルファルファ細胞系を選択した。アルファルファ
は、単一の単離細胞又は原形質体から全体植物が容易に
再生しうるモデル植物の１つであることから、選択され
た。 ホスファノスリシン耐性アルファルファ系の選択は、
液体培地中の阻害剤濃度を段階的に高めることにより行
なった。６か月以内に原細胞系よりもホスフィノスリシ
ンに対して少なくとも20倍高い耐性を有する細胞群を選
択した。懸濁培養物中の圧縮細胞容量測定によると、野
生型細胞は2.5×10-5MのＬ−ホスフィノスリシンで完全
に阻害された。耐性細胞は、化合物５×10-4M存在下で
その非存在下の場合と同様良好に増殖した（第２図及び
第３図）。 感受性及び耐性の細胞系の粗細胞抽出物のタンパク質
パターンをSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により
比較した場合に、分子量40〜42KDのポリペプチドの過剰
生産がPPT耐性細胞系において観察された。アルファル
ファの精製GSも同様の分子量を有する。細胞抽出物の酵
素活性を合わせて測定した。耐性細胞の特異的GS活性
は、野生型細胞の場合よりも５〜10倍高かった。PPT耐
性細胞系におけるGS特異的活性は、効率的二窒素固定マ
メ科植物のすべての根粒組織と同様に高GS活性を有する
アルファルファの根粒組織の場合と同程度である。様々
な量のホスフィノスリシン存在下におけるGS活性の測定
では、いずれの細胞型でもPPTにより同程度の酵素阻害
性を示したが、このことはGSタンパク質の構造的変化が
耐性変異体の選択時に起こらなかったことを示唆してい
る。 メッセンジャーRNAをイソチオシアン酸グアニジニウ
ムRNA抽出法によって野生型及び耐性細胞から単離し、
次いでオリゴdTセルロースカラムに通してmRNAを分離し
た。mRNA4μｇが細胞物質1gにつき単離された。両細胞
系から単離されたmRNAのインビトロ翻訳では、35S−メ
チオニン標識抽出物から得られるインビボパターンと同
様のポリペプチドパターンを示した。このことは単離さ
れたmRNAがほぼ未変化であることを示唆した。インビボ
標識タンパク質では40〜42KDポリペプチドの量において
顕著な差異を示したが、インビトロ翻訳タンパク質パタ
ーンにおける野生型及び変異細胞系間の差異はみられな
かった。 第一及び第二の鎖状cDNAをPPT耐性変異体のmRNA集団
から合成した。cDNAのS1−切断及びポリＣ−尾部形成の
後に、DNAをポリＧ−尾部形成pBR322ベクターDNAとアニ
ーリングした。大腸菌MC1061株を再環化ベクターで形質
転換させた。 3.5×104個のコロニーをアニーリングベクターDNA1g
当たり得た。80％のコロニーはアンピシリン（amp）感
受性であって、amp感受性クローンの50％はプラスミド
のPst消化により検出されうる挿入物を有していた。挿
入物の10％は1000以上の塩基対を有していた。 コロニー1800個をニトロセルロースフィルター上で増
殖させ、GS特異的配列の割合が高い32P標識第一鎖cDNA
プローブでフィルターをプローブ化した。かかるクロー
ンの中からGS特異的cDNAクローンを見出しうると期待さ
れた。根粒のmRNAから製造されたファセオルス（Phaseo
lus）cDNAライブラリー中のGS−cDNAクローンを外部供
給源から入手した。このGS−cDNAクローンはcDNAライブ
ラリー中の１つのアルファルファcDNAクローンを同定す
ることができたが、これはファセオルスGS−DANと強く
ハイブリッド形成する。 アルファルファGS−cDNAクローンの挿入DNAを配列決
定した。次いで、アルファルファ及びファセオルスGS−
cDNAを、野生アルファルファ細胞及び変異GS過剰生産細
胞間の差異を明らかにするため、プローブとして使用し
た。 全ゲノムDNAを、アルファルファ葉、野生型細胞系、
６×10-4M、２×10-3M及び３×10-3M L−ホスフィノス
リシン存在下で選択された耐性細胞系の３つの亜系から
取出した。DNAをBamH I、EcoR I、Hind III及び２種の
酵素の組合せにより消化した。消化されたDNAのアガロ
ースゲル電気泳動後、DNA断片をサウザーンブロット法
によりニトロセルロースフィルター上に移した。フィル
ター結合DNAをアルファルファ及びファセオルスGS−ク
ローンの32P標識cDNA挿入物とハイブリッド形成させ
た。同一サイズのDNAは双方のプローブとハイブリッド
形成した。１つの主なバンドは、５種すべてのDNAサン
プルにおいて同様の強度でアルファルファプローブとハ
イブリッド形成した。第二のバンドは、野生型DNA消化
物の場合にほとんど目に見えないが、耐性細胞系のDNA
と強くハイブリッド形成する。最も強いハイブリッド形
成は高度の耐性細胞系のDNAの場合に観察されたが、こ
のことは耐性獲得時におけるDNA断片の増幅を示唆して
いる。アルファルファcDNAプローブは増幅DNA断片と強
くハイブリッド形成し、GS相同性の増幅DNAとはそれよ
りも弱くハイブリッド形成した。 変異アルファルファ細胞系がPPT耐性になった理由を
確認するため、野生型及び変異細胞系を用いてノザーン
及びサウザーンブロット法を繰返した。ノザーンブロッ
ト法では、野生型の場合よりもグルタミンシンテターゼ
mRNAが約８倍多いことを示した。サウザーンブロット法
が双方の細胞系のゲノムDNAを用いて行なわれた場合に
は、変異アルファルファ細胞系においてグルタミンシン
テターゼ遺伝子の重複が明らかに示された。重複度は、
ハイブリッド形成により評価すると、未重複グルタミン
シンテターゼ遺伝子の場合よりも５〜15倍高いようであ
る。それはまた正確に重複しているようであって、即ち
１つのバンドのみがハイブリッド形成能に関して７〜11
倍高まっていた。 例２ PPT耐性細胞培養物からのグルタミンシンテターゼの単
離及び特性付け 物性及び方法 CNBr切断 グルタミンシンテターゼ（12nmol）を70％ギ酸1mlに
溶解させ、CNBr 5mgを加え、室温で24時間切断を進めた
〔グロス，メソッズ・イン・エンザイモロジー，第11
巻，第238−255頁,1967年（Gross,Methods in Enzymolo
gy 11:238−255（1967））〕。蒸留水（6ml）で稀釈
後、混合液を２回凍結乾燥させた。 CNBrペプチドの高速液体クロマトグラフィー 逆相高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を、ウルト
ラポア（Ultrapore）RPSC（内径0.46cm×7.5cm）で、0.
1％トリフルオロ酢酸（TFA）を用い40℃で０〜60％アセ
トニトリル直線勾配（30分間；流速0.5ml/min）により
行なった。〔ベネットら，バイオケミカル・ジャーナ
ル，第168巻，第９−13頁,1977年（Bennet et al.,Bioc
hemical Journal 168:9−13（1977））〕。CNBrペプチ
ドを最小容量の0.1％TFA中6M塩酸ゲアニジンに溶解させ
た。数回に分け分取したクロマトグラフィーピークを手
で回収し、プールし、凍結乾燥させた。ベックマン（Be
ckman）160検出器を用いて214nmで検出を行なった。 アミノ酸分析 アミノ酸組成は、常時沸騰したHCl（0.025ml）中110
℃で24時間、シールされ、排気されたチューブ〔パイレ
ックス（Pyrex ），培養，基，縁なし,6×50mm〕中に
おけるサンプルの酸加水分解後に調べた〔ムーア，ペプ
チドの化学及び生物学，アン・アーバー・サイエンス，
アン・アーバー、ミシガン，第629−653頁,1972年（Moo
re,Chemical and Biology of Peptides,Ann Arbor Scie
nce,Ann Arbor,Michigan,629−653（1972））〕。ヒュ
ーレット−パッカード（Hewlett−Packard）3390A積分
器２個装備のベックマン（Beckman）6300アミノ酸アナ
ライザー、ニンヒドリン及び２チャンネル（440及び570
nm）積分を用いて、100pmol/アミノ酸における信頼値１
〜７％、最小検出限度25pmolでトリプトファン、システ
ィン、アスパラギン及びグルタミン以外のすべてのアミ
ノ酸を分析した。分析は各サンプル及びバックグラウン
ドコントロールについて３〜５回繰返した。 タンパク質配列分析： 自動エドマン分解をアプライド・バイオシステムス47
0Aシークエンサー（Applied Biosystems 470A sequence
r）で行なった。配列決定プログラムは、気液固相ペプ
チド及びタンパク質配列決定法として既に開発済である
〔ヘウィックら，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー，第256巻，第7990−7997頁,1981年（Hewi
ck et al.,Journal of Biochemical Chemistry,256:799
0−7997（1981））〕。プログラムは、１つのカップリ
ング工程（44℃,26分間）及び単一切断工程（44℃,4.7
分間）を含む。２−アニリノ−５−チアゾリノン誘導体
（Pth−アミノ酸）の自動変換には、25％トリフルオロ
酢酸（50℃,33分間）を用いる。ポリブレン（Polybrene
）（1.5mg）〔タールら，アナリティカル・バイオケ
ミストリー，第84巻，第622−627頁,1978年（Torr et a
l.,Analytical Biochemistry 84:622−627（1978）；ク
ラッパー（Klapper）ら，同上，第85巻，第126−131頁,
1978年〕をタンパク質またはペプチドの分解前にカート
リッジ式ガラスフィルターディスクに加え、ポリブレン
由来の汚染物質を減少させるために配列決定サイクルを
５回繰返した。アンギオテンシンII（1mol）をカートリ
ッジフィルターに加え、次いで分解サイクルを終えた。
アンギオテンシンを配列決定により、未知物質の配列決
定前にシークエンサーの化学的及び機械的操作性につい
て評価した。マッコウクジラアポミオグロビン（100〜2
00pmol）のタンパク質配列分析では、通常、初期収率45
−55％、平均繰返し収率92〜93％及び１サイクル当たり
の平均ラグ２〜３％であった。すべてのPth−アミノ酸
は、ハンカピラー及びフッド，メソッズ・イン・エンザ
イモロジー、第91巻，第486−493頁,1983年〔Hunkapill
er and Hood Methods in Enzymology 91:486−493（198
3）〕により開発された系に基づき、15mM酢酸ナトリウ
ム緩衝液（pH5.5）及びアセトニトリル／メタノール（9
2.5:7.5;v/v）複合勾配を用いて、シアノカラム（0.45
×25cm）での逆相高速液体クロマトグラフィーによって
同定された。このHPLC系は、ジチオスレイトール付加
物、Ｎ−ジメチル−N1−フェニルチオ尿素及びジフェニ
ルチオ尿素の主な汚染物質からPth−アミノ酸及び内部
標準（Pth−Gluのメチルエステル）を分離した。メチオ
ニン及びプロリンは慣用手続きによっては分離されなか
ったが、修正勾配にいよればこれら２種のPth−アミノ
酸を分離することができた。内部標準（200mmol）を各
サイクル回収物に加え、サンプルをRH100−６ローター
装備スピードバック・コンセントレーター（Speedvac C
oncentrator）で乾燥させた。乾燥サンプルを水／アセ
トニトリル（80:20,v/v）0.025mlに溶解させ、一部（0.
017ml）（全サンプルの68％）を自動注入した。Pth−ア
ミノ酸をベックマン160検出器により254nmにおけるUV吸
光度によって検出した。 凍結変異アルファルファ組織培養細胞100gをトライア
イスと混合し、ブレンダーで微粉末に粉砕した。解凍
後、混合物を４℃で20分間8,000rpmで回転させた。硫酸
プロタミン沈殿を上澄で行ない、核酸を除去した。MgSO
4濃度を10mMとし、β−メルカプトエタノール（BMe）を
7mMとし、pHを1N酢酸で6.8に調整した。粗抽出物をヒド
ロキシアパタイト（H.A.）に結合させた。H.A.をpH7.5
の10mMトリス、0.28M MgSO4及び10％エチレングリコー
ルでバッチ毎に５回洗浄した。グルタミンシンテターゼ
をMgSO4濃度0.5Mとすることにより溶離した。バッチ溶
離を５回行なった。pH7.5の10mMトリス、10mM MgSO4で
透析後、Ｇ−200カラムに供した。グルタミンシンテタ
ーゼ活性を有する画分をプールした。SDSアクリルアミ
ドゲル及び銀染色によると、タンパク質は純度95％以上
であった。アミノ酸組成は、アルファルファグルタミン
シンテターゼの組成が大豆に関して公表された組成の場
合とほぼ同様であることを示した（第１表）。配列決定 配列決定に際しての最初の試みは、精製された天然タ
ンパク質を用いて開始された。入手可能な配列がなかっ
たが、このことはNH2末端が天然ではブロックされてい
ることを示していた。CNBr切断を行ない、断片をHPLCに
より分離した。タンパク質のアミノ酸組成は、２〜５個
のみのメチオニンが存在することを示した。２つのHPLC
分離CNBr断片は有用な配列情報を与えた。 次いで、精製されたグルタミンシンテターゼ断片の配
列決定を行なった。結果は下記のとおりである： この配列は、Gly残基が環化していること以外には、
完全変異アルファルファcDNAクローンから得られる配列
の一部に相当する。推定タンパク質配列は下記に示され
ている。 グルタミンシンテターゼについてコードする機能的ゲノ
ム配列の製造 全ゼノムDNAを、ファセオルス根粒のゲノムを得るた
めに用いられたプロトコール〔カリモアー・ジェイ・デ
ー及びミフリン・ビー・ジェイ，フェデレーション・オ
ブ・ヨーロピアン・バイオケミカル・ソサエテーズ・レ
ターズ，第158巻，第107−112頁,1983年（Cullimore,J.
D.and Miflin,B.J.,Federation of European Biochemic
al Societies Letters 158:107−112（1983））〕に類
似したプロトコールを用いてアルファルファ組織培養物
から得、全大敵にBamH Iで消化した。次いで物質を酢酸
カリウム５〜20％勾配中でサイズ分別し、いくつかの部
分に分けた。しかる後各部分を１％アガロースゲル上で
操作し、上記コード配列プローブのPst切断により得ら
れるcDNAグルタミンシンテターゼプローブとサウザーン
・トランスファー系でプローブ化させた。大きさが4kb
以上の断片について選択された陽性ハイブリッド形成画
分をBV−２λベクターに結合させた。ファージ100,000
個を培養し、上記グルタミンシンテターゼcDNAプローブ
でプローブ化させた。４つの陽性プラークを得た。次い
でこれらを増殖させ、３〜４回にわたるプラークハイブ
リッド形成によって精製した。精製された4kbゲノムク
ローンを単離し、M13mp9に再結合させた。このクローン
を両末端から配列決定した。更にクローンをHae IIIで
断片化し、M13mp9に組込んでサブクローニングし、再度
配列決定した。 この方法により、この4kb5′断片（ゲノムDNAの消化
によっても得られる8kb3′断片の一部と同様に）完全に
配列決定した。これら断片は一緒になって完全な機能性
遺伝子となるが、その読取り枠は手元のタンパク質配列
情報、既知GS分子量及び３種ありうる読取り枠における
停止トリプレットの相対的発生率から予測される。イン
トロン及びエキソン領域を含むグルタミンシンテターゼ
の完全ゲノム配列は第４図に示されている。手元のGSに
関する完全機能性配列は前記いずれかの方法によって発
現させることができる。 第４図は、完全ゲノム配列中に13個のイントロンが存
在することを示す。第一エキソンの前に１個のイントロ
ン、最終エキソンの後に１個のイントロン、及びエキソ
ン12個の間に11個のイントロンが存在する。以下におい
ては、ゲノム配列中におけるそれらの位置を示すため
に、イントロンをI1〜I13で標識する。かかるイントロ
ンがコドン又はトリプレットの第一及び第二ヌクレオチ
ド間に位置する場合、そのトリプレットに対応するアミ
ノ酸は例えばチロシンのときＴ−IX−yrと記載される。
イントロンがコドンの第二及び第三ヌクレオチド間に位
置する場合、対応するアミノ酸は例えばTy−IX−ｒと記
載される。 イントロンは様々な鎖長を有しており、最小及び最大
の鎖長はいずれも立体障害の程度によって決定される。
イントロンの適切なループ化及びエキソンの適切な切
断、結合のためにはイントロン中に十分なヌクレオチド
が存在していなければならない。例えば第４図におい
て、最大のイントロンは第一エキソンの前に位置するI1
であって、740個のヌクレオチド鎖長である。 以上のように本発明を十分に説明してきたが、本発明
は、その精神もしくは範囲又はそのいずれかの態様に影
響を与えない限り、構造、生成物、方法及び用途に関し
て広汎かつ等価な範囲にわたり実施し得ると理解される
であろう。
フロントページの続き
(72)発明者 ドン，グンター
ドイツ連邦共和国ホーフハイム、ザクセ
ンリング、35
(56)参考文献 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ，ｖｏｌ．２，Ｎｏ．６
ｐ．621−635（1985)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．下記に示したゲノムグルタミンシンテターゼについ
てコードする遺伝子配列を含んでなる組換えDNA（rDN
A）分子： ２．植物細胞を形質転換しうるビヒクルである、請求の
範囲第１項記載の分子。
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