JPS63503196A - 除草性グルタミンシンテタ−ゼ阻害剤に対し耐性の植物細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ４、　除草性ＧＳ阻害剤がＰＰＴである、請求の範囲第１項、第２項又は第３項 記載の植物細胞。

５、　未形質転換状態において除草性ＧＳ阻害剤感受性である、請求の範囲第１ 項記載の遺伝子配列組合せ体を有する形質転換除草性ＧＳ阻害剤耐性植物細胞。

６、　除草性ＧＳ阻害剤がＰＰＴである、請求の範囲第５項記載の植物細胞。

７、　所定の植物細胞中において作動可能な遺伝子配列組合せ体であって、 （ａ）　下記第二遺伝子配列と作動可能に結合せしめられ、植物細胞中で機能す るゲノムグルタミンシンテターゼについてコードする第一遺伝子配列、（ｂ）　 組合せ体が除草性ＧＳ阻害剤感受性植物細胞中に存在する場合において該細胞が 除草性ＧＳ阻害剤に対して実質上耐性となるように上記第一配列の発現レベルを 増加させうる第二遺伝子配列、 を含んでなる遺伝子配列組合せ体。

８、　第二遺伝子配列がプロモーターである、請求の範囲第７項記載の遺伝子配 列組合せ体。

９、　植物細胞のゲノム中に組込まれる、請求の範囲第７項又は第８項記載の遺 伝子配列組合せ体。

１０、　アグロバクテリウム・ツメファシェンスのＴｉプラスミド中に存在する 、請求の範囲第７項又は第８項記載の遺伝子配列組合せ体。

１１、　除草性ＧＳ阻害剤がＰＰＴである、請求の範囲第７項又は第８項記載の 遺伝子配列組合せ体。

１２６　請求の範囲第１項、第２項又は第３項記載の細胞からなる除草性ＧＳ阻 害剤耐性植物。

１３、除草性ＧＳ阻害剤がＰＰＴである、請求の範囲第１２項記載の植物。

１４、　請求の範囲第５項記載の細胞からなる植物。

１５、植物細胞に除草性ＧＳ阻害剤耐性を付与する方法であって、 該細胞を請求の範囲第７項記載の遺伝子配列組合せ体で形質転換することからな る方法。

１６、除草性ＧＳ阻害剤がＰＰＴである、請求の範囲第１５項記載の方法。

１７、除草性ＧＳ阻害剤感受性植物の感受性制御方法であって、 除草性ＧＳ阻害剤感受性植物を植物制御量の除草性ＧＳ阻害剤と接触させ、 該接触を請求の範囲第１２項記載の除草性ＧＳ阻害剤耐性植物を同時に接触させ ながら行う、ことからなる方法。

１８、除草性ＧＳ阻害剤がＰＰＴである、請求の範囲第１７項記載の方法。

１９、　ゲノムグルタミンシンテターゼについてコードする遺伝子配列を含んで なる組換えＤＮＡ分子。

２０、植物細胞を形質転換しうるビヒクルである、請求の範囲第１９項記載の分 子。

２１、第４図に示されるようなゲノムグルタミンシンテターゼについてコードす る遺伝子配列を含んでなる組換えＤＮＡ　（ｒＤＮＡ）分子。

２２、イントロン及びゲノムグルタミンシンテターゼについてコードするエクソ ンの遺伝子配列を含んでなる組換えＤＮＡ　（ｒＤＮＡ）分子であって、■ｌ、 、Ｉ１３で示される該イントロン及びグルタミンシンテターゼについてコードす る該エクソンが下記ポリペｌｌ５−工１ｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−工１ａ− Ｔｒ−工２−ｐ−１１ａ−Ｇｌ２−ｐ−１１ａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−６ｅｒ−Ｇｌ ｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌａｕ−Ａｒ人１ａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−１１ａ− Ｐｈａ−Ｓｅｒ−１（ｉｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−工１ｅ−Ａｓｎ −工１ａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−工１ｅ−入ｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｍａｔ −Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ−１８−Ｔｒｐ−ｃｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ− Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−人ｒｇ−Ａｒｇ−（上記式中、■１は第一エクソンの 前に位置する第一イントロンであり、１１３は最終エクソンの後に位置する最終 イントロンであり、１２〜■１２は残余のエクソン間に位置するイントロンであ って、該イントロンの各々は約１０〜約７５０個のヌクレオチドからなる）を含 んでなることを特徴とする分子。

除草性グルタミンシンテターゼ阻害剤に対し耐性の植物細胞 明細書 技術分野 本発明は植物細胞形質転換のための組換えＤＮＡ技術の利用に関し、更に詳しく はホスフィノスリシンのような除草性植物グルタミンシンテターゼ阻害剤に耐性 の植物細胞の設計と造成に関する。

背景技術 グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）は、アンモニアの同化及び窒素代謝の調節に関 して中心的役割を果たす植物酵素である。大半の植物においそグルタミンシンテ ターゼは、硝酸還元、アミノ酸分解又は光呼吸によって放出されるアンモニアを グルタミンシンテターゼ／グルタミン酸シンテターゼ経路（第１図）で解毒する 唯一の有効な方法であることから、植物はグルタミンシンテターゼの有効な阻害 剤に対して非常に影響をうけ易い。

現在公知の最も有効なグルタミンシンテターゼ阻害剤の１つは、ホスフィノスリ シン（１）（以下ＰＰＴという）である： ＰＰＴはグルタミン酸類縁体である。化合物は、ストレプトミセス・ピリドクロ モゲネス（ＳＬｒｅｐＬｏｍｙｃｅｓｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ　） から生産されるトリペプチド抗生物質の中から最初に単離された〔バイエル・イ ーら、ヘルベチカ拳キミカＱアク汐、第５５巻、第２２４頁。

１９７２年（Ｂａｙｅｒ、　Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｈｅ１ｖｅｔｌｃａ　Ｃｈ ｉｍｌｃａＡＣｔａ、　５５　：　２２４　（１９７２）　）　、及び西独特許 公開第２７１７４４０号明細書、ヘキスト社（Ｈｏｅｃｈｓｔ、　Ａ、Ｇ、　） 参照）。ＰＰＴは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｌｃｈｌａ　ｃｏｌｉ）グルタミンシ ンテターゼに対するＫｉ＝０．００５９ｍＭの有効な競合的阻害剤である。

シュウエルドル・エフ（Ｓｃｈｗｅｒｄｔｌｅ　Ｐ、）　［植物の病気及び植物 の保護に関する雑誌、第９巻、第４３１−４４０頁、１９８１年（ｚｅｌｔｓｃ ｈｒｉｆｔ　ｆｕｒ　Ｐｆｌａｎｚｅｎ−Ｋｒａｎｋｈｅｉｔｅｎ　ａｎｄ　Ｐ ｆｌａｎｚｅｎｓｃｈｕｔｚ、　ＩＸ、　４３１−４４０（１９８１）））は、 ＰＰＴは、農作物が最小で直接条播される果樹園、ぶどう園及び農園における望 ましくない単子葉及び双子葉植物を制御するための収穫補助としての非選択的葉 類除草剤であることを証明した。西ドイツ、スペイン、南アフリカ、アメリカ及 び日本での野外試験では、大半の双子植物類が十分に制御されることを示した。

単子葉植物類の場合にはやや多い量が良好な制御のために必要であった０　リー ズン・エム（Ｌｅａｓｏｎ、Ｍ、　）ら〔フィトケミストリー、第２１巻、第８ ５５−８５７頁、１９８２年（Ｐｈｙｔｏｅｈｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｖｏｌｕｍｅ 　２１　：　８５５−８５７　（１９８２））　）は、ＰＰＴがエントウ葉グル タミンシンテターゼに対する見掛けＫｉ値０．０７３ｍＭの混合型競合阻害剤で あることを明らかにした。

いずれの市販除草剤ＰＰＴも前記の如く非選択的であって除草選択性が全く欠け ていることから、ＰＰＴ及び他のＧＳ阻害剤に対する耐性を選択された植物に付 与しうることが、非常に重要となるのである。

他の化合物に対するグルタミンシンテターゼ耐性の存在例がある。他のグルタミ ン酸類縁体であるメチオニンスルホキシイミン（ＭＳＯ）はエントウ葉グルタミ ンシンテターゼの混合型競合阻害剤（Ｋｉ値０．１６ｍＭ）であることが知られ ている（リーズン・エムら、フィトケミストリー、第２１巻、第８５５−８５７ 頁。

１９８２年）。ミラー・イー中ニス（Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｅ、Ｓ、）及びブレンク レー・ジエイ・イー（Ｂｒｅｎｃｈｌｅｙ、　Ｊ、Ｅ、）　（ザ串ジャーナル中 オブ・バイオロジカル・ケミストリー。

第２５６巻、第１１３０７−１１３２１頁、１９８１年（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａ ｌ　ｏｒＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５６　：　１１３０７ −１１３２１　（１９８１））　］は、ＭＳＯに耐性の数種のサルモネラ（Ｓａ ｌｍｏｎｅｌ　ｌａ）変異株の性質について研究した。１つの変異がアンモニア 結合ドメインにおいてグルタミンシンテターゼを明らかに変えて、ＭＳＯ耐性を 付与したのである。更に最近になり、ヤング（Ｙｏｕｎｇ）及びリンゴールド（ Ｒｉｎｇｏ！ｄ　）　（同上、第２５８巻、第１１２６０−１１２６６頁、１９ ８３年〕は、ＭＳＯ存在下で増殖せしめられたマウス３Ｔ６細胞かそれに対する 耐性を獲得したことを報告した。ＭＳＯ耐性細胞はグルタミンシンテターゼに関 するｍＲＮＡに富んでおり、著者はこの観察が遺伝子の増幅を意味することを示 唆した。サンダース（Ｓａｎｄｅｒｓ　）及びウィルソン（Ｗｌｌｓｏｎ）　、 　ＥＭＢＯ。

ジャーナル、第３巻、第６５−７°１頁、１９８４年参照。

しかしながら、ミラー、ヤング及びサンダースの研究ではいずれも植物ＧＳに関 しては報告していなかった。

しかも、本発明以前において、植物細胞のグルタミンシンテターゼ遺伝子を操作 することによりＰＰＴのような除草性ＧＳ阻害剤に対する耐性を付与した研究に ついては報告がなかった。

したがって、植物細胞のグルタミンシンテターゼ遺伝子を操作することにより、 ＰＰＴのような除草性ＧＳ阻害剤に対して耐性の植物細胞を開発することが望ま れるのである。かかる方法によれば、いかなる植物にも除草剤選択性を付与する ことができる。

発明の開示 本発明は、植物のＰＰＴ耐性がグルタミンシンテターゼの過剰生産に起因すると いう発見から派生したものであり、かかる現象は初期実験によると基礎的な遺伝 子増幅メカニズムに起因することが示された。組織培養された植物細胞に選択圧 を適用することにより、ＰＰＴ耐性株を単離することができた。しかしながら耐 性は、ＰＰＴに対する親和性の低い構造変異グルタミンシンテターゼの存在に基 づくのではなく、むしろ植物細胞中における遺伝子増幅及びそれに伴う酵素濃度 の増加に基づくものであった。これらの初期観察から、遺伝子増幅により又は遺 伝子増幅以外の他の異なるメカニズムによってグルタミンシンテターゼを過剰生 産する（したがって、除草性ＧＳ阻害剤耐性を示す）植物細胞を開発しようとす る本発明の概念が生まれた。

したがって本発明は、除草性グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）阻害剤に対して耐 性の植物細胞を製造することを基礎とするものであって、ここにおいて該耐性は 、除草性ＧＳＳ阻害悪感受性植物細胞中存在する場合に該細胞を実質上該除草性 ＧＳ阻害剤に対して耐性とさせるような植物細胞ＧＳ活性レベルによって獲得さ れる。

本発明は様々な方法によって実現しつることから、様々な態様を包含している。

例えば−態様において、本発明は下記組合せ遺伝子を有する植物細胞を製造する ことに関する： Ａ）　下記第二遺伝子配列と作動可能に結合せしめられる植物細胞中で機能する グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）についてコードする第一遺伝子配列、Ｂ）　組 合せ体が除草性ＧＳ阻害剤感受性植物細胞中に存在する場合において該細胞が除 草性ＧＳ阻害剤に対して実質上耐性となるように上記第一遺伝子配列の発現レベ ルを増加させうる第二遺伝子配列。

本発明は更に、上記第一もしくは第二遺伝子配列又は双方にとって異種である植 物種のゲノム又は染色体外複製要素中に存在する組合せ遺伝子にも関する。

更には、対応する感受性細胞よりも著しく多く野生型遺伝子コピーを有する耐性 植物細胞は、多発現性野生型ＧＳ遺伝子コピーを、複製可能な適切な染色体要素 に又は植物細胞自体のゲノムに導入することによって得ることができる。これは 細胞培養段階又は全体植物段階における形質転換によって発現することができる 。野生型ＧＳ遺伝子を有する安定なマルチコピー細胞器官も、著しく多数のＧＳ 遺伝子を細胞に導入するために利用しうる。

更に本発明は、未形質転換段階において除草性ＧＳ阻害剤感受性である除草性Ｇ Ｓ阻害剤耐性形質転換植物細胞自体にも関する。除草性ＧＳ阻害剤耐性たる全体 植物も包含される。

本発明はまた、除草性ＧＳ阻害剤耐性を付与しうる前記遺伝情報をもった植物細 胞形質転換ベクターとして゛機能しうる中間ビヒクル、及び植物細胞に耐性を付 与する方法にも関する。

更に本発明は、前記方法によって除草剤に対する耐性を獲得した植物の存在下で かつ同時にそれと接触させながら、除草性ＧＳ除草剤感受性植物を植物制御量の 除草性ＧＳ阻害剤と接触させることにより実現される植物制御方法に関する。

図面の簡単な説明 本発明は添付図面を参照するとより良（理解されるであろう。

第１図は、グルタミンシンテタ：ゼ／グルタミン酸シンターゼサイクルを示した ものであって、ＡＴＰからＡＤＰ及び無機リン酸への加水分解に伴い進行する反 応においてＧＳがグルタミン酸及びアンモニアからのグルタミンの生成を触媒す ることが示されている。グルタミンのアミド窒素は多くの生合成反応のための窒 素源を供給するのであるが、そのことは窒素代謝においてＧＳが中心的役割を果 たすことを示唆している。除草性ＧＳ阻害剤はＧＳを阻害することによりグルタ ミン生合成を妨害し、もってアンモニア解毒を妨げる。

第２図は、Ｌ　−ＰＰＴの非存在下（０）及び２５（△）、５０（・）、１００ （ロ）μｍ存在下における野生型（ＰＰＴ感受性）アルファルファ細胞系の増殖 特性を示す。

第３図は、Ｌ−ＰＰＴの非存在下（○）及び１００（△）　、２００　（・）　 、５００　（ロ）μｍ存在下における変異ＰＴＴ耐性アルファルファ細胞系の増 殖特性を示す。

第４図は、グルタミンシンテターゼの完全機能性ゲノム配列を示す。

発明を実施するための最良の形態 下記の説明において、組換えＤＮＡ、植物遺伝子技術及び本発明において用いら れているいくつかの用語は広い意味で用いられている。明細書及び請求の範囲の 明確かつ矛盾のない理解を与えるために、かかる用語の適用範囲を含めて下記定 義が与えられる： ヌクレオチド　糖部分、リン酸及び含窒素へテロ環塩基からなるＤＮＡ又はＲＮ Ａのモノマー単位。塩基はグリコシド炭素（ペントースの１′位炭素）を介して 糖部分と結合せしめられている。塩基及び糖の組合せはヌクレオシドと呼ばれる 。各ヌクレオシドはその塩基に特徴がある。４種のＤＮＡ塩基はアデニン（Ａ） 、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）及びチミン（Ｔ）である。４種のＲＮＡ塩基 はＡ、Ｇ、Ｃ及びウラシル（Ｕ）である。

ホスホジエステル結合により互いに結合せしめられたヌクレオチドの直鎖配列。

機能性遺伝子配列　配列がポリペプチドの完全鎖長配列の場合よりも短いか又は 長いかにかかわらず、所望の活性をもつポリペプチドについてコードする遺伝子 配列。

これは“機能性遺伝子″とも呼ばれる。

コドン又はトリプレット　ｍＲＮＡを介しアミノ酸についてコードするヌクレオ チド３個のＤＮＡ配列、翻訳開始シグナル又は翻訳終結シグナル。例えば、コド ンＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴＳＣＴＣ，ＣＴＡ及びＣＴＧはアミノ酸ロイシンにつ いてコードする。ＴＡＧ、ＴＡＡ及びＴＧＡは翻訳終結シグナルであり、ＡＴＧ は翻訳開始シグナルである。

間に介在する遺伝子配列。

ゲノム配列、翻訳エクソン及び介在非翻訳イントロン双方を含めた所定のポリペ プチドについての完全遺伝子配列。

読取り枠　ｍＲＮＡからアミノ酸配列への翻訳の際におけるコドンのグループ分 け。翻訳に際しては、適切な読取り枠が維持されていなければならない。例えば 、配列ＧＣＴＧＧＴＴＧＴＡＡＧは、ＧＳＣ又はＴで始まるか否かによって３種 の読取り枠又はフレーズに翻訳され、したがって３種の異なるペプチド生成物を 生じる。

２つの配列は、それらがまるで独立して存在しているかのように双方とも一緒に なって作動するよう、１つの配列の読取り枠が他のものと結合している場合には 、作動可能な結合状態にある。

製造するプロセスであって、転写及び翻訳の組合せからスミド、ファージＤＮＡ 又は他のＤＮＡ配列のことであって、これらは１つもしくは少数のエンドヌクレ アーゼ認識部位を有することを特徴とし、その部位においてかかるＤＮＡ配列が ＤＮＡの必須生物学的機能の損失を伴うことなく決定可能な方法で切断され、し かもこれらは形質転換細胞の同定のために適したマーカーを有している。代表例 は抗生物質耐性マーカーである。“ベクター”という語もクローニングビヒクル の代わりに時々使用される。

発現ビヒクル　ビヒクル中に存在してポリペプチドについてコードする機能性遺 伝子の発現によるポリペプチドの宿主細胞内製造のために特に用いられる、クロ ーニングビヒクルに類似したビヒクル。

複製ビヒクル　クローニング又は発現ビヒクル。

ローブ又は皮膜で被われたＤＮＡ配列からなりうる細菌二重鎖ＤＮＡ配列のこと であって、プラスミドは宿主細胞のゲノムで複製されるか又はそれに組込まれる 。プラスミドが単細胞又は多細胞生物中に存在する場合には、かかる生物の特性 はプラスミドＤＮＡによって変化又は形質転換せしめられる。例えば、カナマイ シン耐性に関する遺伝子をもつプラスミドは、以前はカナマイシン感受性であっ た細胞をそれに耐性の細胞に形質転換させる。

ＤＮＡ配列から多数のかかる生物又は配列を得るためのた場合にそれら配列の発 現を制御調節する遺伝子配列。

それらはその発現を調節する領域を制御することが知られた配列も有している。

それらはプロモーター及びターミネータ−配列を双方とも有する。

植物プロモーター　かかるプロモーターに作動可能に結合した同種又は異種の遺 伝子配列を植物中で発現させうる発現制御配列。

転換されていない宿主細胞において自然に観察されるレベルよりも実質上高いレ ベルで（ｍＲＮＡ又はポリペプチドの量から測定される）作動可能に結合した機 能性遺伝子配列を形質転換植物細胞中で発現させうる植物ブロードされうろこと から生じる情報上の現象。例えば、ロイシンはＴＴＧ、ＴＴＡ、ＣＴＡ、ＣＴＴ 、ＣＴＣ又はＣＴＧによってコードされうる。

本出願及び請求の範囲で用いられている縮重変異とは、遺伝子コードの縮重によ るポリヌクレオチド断片のあらゆる変異を意味する。例えば、得られる物質がな お機能性ＧＳ又はその一部についてコードしている限り、かかる物質は本発明に 包含されると考えられる。

グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）　この酵素の定義は機能性本位であって、ＧＳ サイクルでグルタミン酸をグルタミンに変換させるように所望の植物中で機能し うるあらゆるグルタミンシンテターゼを包含する。したがってかかる用語は、遺 伝的形質転換された特定の植物種からの酵素を包含するのみならず、ＧＳが形質 転換植物細胞中で機能しつる場合には、他の植物種又は微生物からの、更には他 の真核生物からのＧＳをも包含する。更にこの用語は、天然植物ＧＳの全構造鎖 長よりも長いか又は短いタンパク質又はポリペプチド、例えばＧＳの機能性部分 断片又はそれらの類縁体をも包含する。

ホスフィノスリシン（ＰＰＴ）　生物学的活性型の前記式（１）の化合物。これ はＬ−もしくはＤ−又はり。

Ｌ−型であって、ＰＰＴ活性を阻害しない他の不活性もしくは活性化合物と併用 されても又は単独であってもよい。

本発明は、その最も基本的なレベルにおいては、除草性グルタミンシンテターゼ 阻害剤に耐性である植物細胞に関し、その際除草性ＧＳ阻害剤感受性植物細胞に 存在する場合には実質上細胞を除草性ＧＳ阻害剤に対して耐性に変えるようなＧ Ｓ活性レベルとすることによって耐性が生じる。

“除草性グルタミンシンテターゼ阻害剤”という語は、所定種の植物細胞のグル タミンシンテターゼ活性を著しく低下させ、その結果植物細胞において除草効果 を発揮する、競合型又は非競合型のいずれの阻害剤をも含む意味を有する。除草 剤耐性植物細胞又は全体植物は、同種の野生型個体にとって致死的な除草性ＧＳ 阻害剤濃度でも不可逆的障害をうけることなく生存しうる。通常、除草性ＧＳ阻 害剤耐性に関し５倍以上の増加が有意であると考えられる。しかしながら、この 数値は植物種毎に、及び除草剤毎に変わる。したがって、本発明に包含される数 種の植物種及び除草剤のすべてについて同一基準を適用することは不可能である 。しかしこのような基準は当業者であれば容品に確認することができる。

本発明に包含される除草性ＧＳ阻害剤としては、ホスフィノスリシン、メチオニ ンスルホキシイミン及び他のグルタミン酸類縁体がある。

グルタミンシンテターゼは形質転換される特定の植物細胞からのものであっても よいし、そうでなくともよい。

必要なのは、酵素に関する遺伝子配列が発現せしめられて、最終植物細胞中で機 能性酵素を生産することのみである。したがって本発明は、同種ＧＳ遺伝子又は 異種ＧＳ遺伝子（及びそれらの各々の発現生成物）を有する植物細胞を包含する 。広義には、酵素は他の植物種のものであっても、又は微生物もしくは動物のよ うな異なる生物からの酵素であってもよい。好ましくは、植物グルタミンシンテ ターゼ遺伝子及びそれらの発現生成物である。特に必要なのは、遺伝子操作にお いて宿主として機能する特定の植物種からのグルタミンシンテターゼ遺伝子、即 ち同種ＧＳ遺伝子である。本発明のｒＤＮＡ分子に用いられる１つのかかるグル タミンシンテターゼ遺伝子は、例２で説明されている。

除草性ＧＳ阻害剤に対し感受性であって、本発明の遺伝子構造体又は方法による 遺伝子操作をうけることができ、しかも該構造体を発現させることができる植物 細胞であれば、いずれも本発明で使用することができる。双子葉植物としては、 様々な種類のポテト〔ソラヌム・ツベロスム（Ｓｏｌａｎｕａ＋　ｔｕｂｅｒｏ ｓｕｉ　）　）　；　）マド〔リコベル’７　ニア　”７−　：Ｌスクレンツム （Ｌｙｃｏｐｅｒｓｌｃｏｎ　ｅｓｅｕｌｅｎｔｕｍ）：ｌ　；コシヨウ〔カプ シクム・アンヌム（Ｃａｐｓｉｃｕｍ　ａｎｎｕｍｍ））　；タバコ〔ニコチア ナφタバウム（Ｎｌｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｗ））　；様々な種類のアブ ラナ、特に菜種〔ブラシカ・ナブス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ）　）　、 様々な豆果類、例えばアルファルファ〔メジカゴ・サチバ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ　 ５ａｔｉｖａ　）　）　、クローバ−〔トリホリウム種（Ｔｒｉｒｏｌｉｕｍ　 ５ｐｅｃ、　）　）　％大豆［グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ａａｘ　 ）　］　、グランドナツツ〔アラチス・ヒボガエア（Ａｒａｃｈｉｓ　Ｈｙｐｏ ｇａｅａ）　）、様々な種類の豆類〔ファセオルス種（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　５ ｐｅｃ、）、ビシア種（ＶｌｃＩａ　５ｐｅｃ、　）　、ビグナ種（Ｖｌｇｎａ 　５ｐｅｃ、））、エントウ類〔ピスム拳すチブム（Ｐｌｓｕｍ　５ａｔｉｖｕ Ｉ１１）　）、ビートのような根菜作物〔ベタ・ブルガリス（Ｂｅｔａ　ｖｕ− Ｉｇａｒｌｓ）　）　、ニンジン類〔ダウクス・力ロタ（Ｄｏｕｃｕｓｃａｒｏ ｔａ）　）及びサツマイモ類〔イボモニア・バタツス（ｌｐｏｗｏｅａ　ｂａｔ ａｔｕｓ　）　）がある。

本発明の広義の概念には様々な態様が含まれている。

除草性ＧＳ阻害剤耐性植物細胞は、様々なメカニズム及び／又は遺伝子造成のい ずれかによって有意に高レベルのＧＳ活性を有することができる。

例えば、本発明はその態様の一つにおいて、２種の遺伝子配列の組合せ、即ち（ ａ）下記第二遺伝子配列の下流に作動可能に結合せしめられる、所定の植物細胞 中で機能するゲノムグルタミンシンテターゼについてコードする第一遺伝子配列 、（ｂ）組合せ体が除草性ＧＳ阻害剤感受性植物細胞中に存在する場合において 該細胞が除草性ＧＳ阻害剤に対して実質上耐性となるように上記第一配列の遺伝 子生成物のレベルを増加させうる第二遺伝子配列からなる。

第二遺伝子配列はプロモーターでもエンハンサ−（ｅｎｈａｎｃｅｒ）配列でも よい。プロモーターである場合には、それはＧＳプロモーターでも又は他の構造 遺伝子のプロモーターであってもよい。後者２つのいずれの場合であっても、組 合せ体に用いられるプロモーターは過剰生産植物プロモーターである。かかるプ ロモーターの唯一の必須の特性は、グルタミンシンテターゼの遺伝子配性ＧＳ阻 害剤感受性植物細胞中に存在するときに細胞がＧＳ阻害剤に対して実質上耐性と なるようなレベルにまで前記グルタミンシンテターゼの発現量を高めることが可 能であることである。したがって、使用される植物プロモーターとして何を選択 するかは、機能を考慮して決定サレる。植物プロモーターは宿主細胞にとって異 種でも同種であってもよい。宿主細胞の天然内在性プロモーターはＧＳ過剰生産 による耐性を生じさせることができないが、その理由はかかる天然プロモーター は通常適用される植物制御濃度の阻害剤によって実質上又は完全に阻害されるほ ど低いレベルでしか通常ＧＳ発現を促進しえないからである。したがって、本発 明の一態様においては、天然プロモーターはＯＰＰで置換される。

有効なＯＰＰとしては、リブロースニリン酸カルボキシラーゼ及びクロロフィル ａ　／　ｂ結合タンパク質の小サブユニット（Ｓ　Ｓ）のプロモーターがある。

これら２種の遺伝子の発現は、緑色組織での転写段階において光誘導されること が明らかにされた〔例えば、植物の遺伝子工学、農業の展望、ニー・キャッシュ モア、ブレナム。

ニューヨーク、１９８３年、第２９−３８頁（ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒ ｉｎｇ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔｓ、　Ａｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｐｅｒｓｐ ｅｃｔｉｖｅ。

Ａ、Ｃａｓｈｍｏｒｅ、　Ｐｌｅｎｕｍ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９８３．　ｐ ａｇｅｓ　２９−３８）　；コルッジ・ジーら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオ ロジカル・ケミストリー、第２５８巻、′第１３９９頁。

１９８３年（Ｃｏｒｕｚｚｊ、　Ｇ、、　ａｔ　ａｌ、、　Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎ ａｌ　ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５８　：　１３９９ 　（１９８３））　；又はダンスミア・ビーら、ジャーナル・オブ・モレキュラ ー・アンド・アプライド・ゲネティクス、第２巻、第２８５頁。

１９８３年　（Ｄｕｎｓｍｕｌｒ、Ｐ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ 　Ｍｏ１ｅ−ｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔ４ｃｓ、　２　 ：　２８５　（１９８３））参照〕。

本発明は、記載された方法に従い修正される、又は除草性ＧＳ阻害剤耐性を生じ る他のいずれの方法によって修正されるあらゆる植物細胞にまで拡張される。植 物細胞は、単独で、組織培養で、又は多細胞植物もしくはその部分の一部として 生存するものでも又はそうでないものであってもよい。未形質転換状態で除草性 ＧＳ阻害剤感受性であるかかる多細胞植物は、その細胞が本発明に従い耐性とさ れた場合に耐性化する。

花、種子、葉、技、果実等のような植物の部分は、これらの部分が前記の如き除 草性ＧＳ阻害耐性細胞を有する限り、本発明に含まれる。特に、植物の部分は生 存していても、又はそうでなくともよい。したがって、耐性トマト、ニンジン又 はタバコ植物から得られる遺伝的に修正されたトマト、ニンジン又はタバコの葉 は、たとえ元の植物から分離された場合であっても、本発明に含まれる。

製造方法及びそこで用いられる中間体 様々な方法論が、本発明の各種態様を実施する上で適用可能である。例えば、除 草性ＧＳ阻害剤耐性が構造ＧＳ遺伝子のコピー数を著しく増加させることによっ て獲得されるのであれば、適用可能な方法論としては、ＧＳ遺伝子の増幅、又は ゲノムもしくは複製染色体外要素中への多数のＧＳ遺伝子コピーの導入によって 耐性を獲得した細胞を選択する方法がある。

選択は、培地中段階的に量を高めた除草性ＧＳ阻害剤の存在下で植物細胞を培養 することにより、適切な培地中で実施される。所定時間、例えば数週間〜数か月 が経過した後、原植物細胞よりも除草性ＧＳ阻害剤に対して数倍高い耐性を有す る細胞群を選択することができる。

例えば、細胞がアルファルファで、阻害剤がＰＰＴである場合には、段階的にＰ ＰＴを増加させて１年後に、原糸よりもＰＰＴに対して２０倍高い耐性を有する ＰＰＴ耐性アルファルファ細胞系を得ることができた。耐性系が阻害剤非存在下 で数か月間継代培養された場合、耐性細胞率の若干の減少が阻害剤含有寒天培地 でのプレート実験中に観察されたが、６か月間以上の経過後には高度に耐性の細 胞クローンを依然と再選択することが可能であった。これは野生型細胞を培養し た場合には不可能であった。

組織培養細胞からのカルス及び成長した植物の再生法は当業者に公知であって、 これは種母に異なる。例えば、参考のため本明細書に組込まれ乞１ｃ＋ｓ２年シ ェパード（Ｓｈｅｐｅｒｄ　）のサイエンティフィックΦアメリカン（Ｓｃｉｅ ｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　）参照。通常、多数のＧＳ遺伝子コピーを含 有し又は組合せ遺伝子配列を含有する原形質体の懸濁物が最初に準備される。次 いで胚形成が、天然胚として発芽する段階まで、原形質体懸濁物から誘導されう る。培地は通常様々なアミノ酸類、並びにオーキシン及びサイトカイニンのよう なホルモン類を含有する。

特にトウモロコシ及びアルファルファのような種の場合には、グルタミン酸及び プロリンを培地に加えることが合判である。苗条及び根は通常同時に発生する。

有効な再生法であるか否かは、培地、遺伝子型及び培養経歴に依存する。これら ３つの変動要件が制御される場合には、再生は十分に再現かつ反復が可能である 。

タバコ、アルファルファ、ポテト、トマト、ペチュニア、大豆、菜種、数種の果 樹及びニンジンのようないくつかの種の遺伝子型の場合には、再生法は先行技術 において明確に説明されていた。このような再生法は、適切な遺伝子型及び系統 がスクリーニングにより選択される場合には十分に当業界の技術範囲に属する。

通常継代培養の約１年経過後になると、植物の再生効率は所定の細胞培養の場合 よりも低下する。したがって再生は、適切な耐性細胞の培養後早期に開始した場 合が、通常最も成功しやすい。

しかしながら、数か月又は１年以上経た細胞培養物が特に使用される場合には、 増幅せしめられたＧＳ遺伝子が交雑及び／又は融合によって再生系に組込まれる 。例えば、参考のため本明細書に組込まれるクツキングら。

ネーチャー、第２９３巻、第２６５頁、１９８１年（Ｃｏｋｌｎｇ　ｅｔ　ａｌ 、、　Ｎａｔｕｒｅ、　２９３　：　２８５　（１９８１）　）参照。

この方法では、除草性ＧＳ阻害剤耐性細胞系は選択によって得られ、急速に分裂 する細胞の培養懸濁物が当業者に周知の方法により得られる。原形質体はそこか ら単離され、完全に不可逆な障害とならないのであれば、宿主細胞を不活化させ るために十分な放射線量及び時間にわたり放射線照射することが好ましい。例え ば２０キロラツドのＸ線照射が有利に適用される。ドナー原形質体に放射線照射 した後、それは適切な感受性細胞がらのアクセプター原形質体と融合せしめられ る。例えば、ポリエチレングリコール融合、高カルシウム処理、双方の組合せ又 は最近の電気融合のような様々な方法が融合体を得るために存在する。融合終了 後、融合生成物は除草性ＧＳ阻害剤耐性になっているはずであるから、融合生成 物の選択的増殖が行なわれうる。特にもはや形態形成しないドナーが用いられる 場合（即ち、ドナー培養物が最初の選択から既に数か月又は１年以上経過してい るような場合）には、除草性ＧＳ阻害剤含有培地中で簡単な選択が行なわれるだ けでよい。

遺伝物質を植物細胞中に導入するもう１つの方法は、植物の受傷葉を形質転換ア グロバクテリウム・ツメファシェンス（＾ｇｒｏｂａｃｔｅｒｌｕ１１ｔｕｍｅ ｆ’ａｃｌｅｎｓ　）細菌で感染させることである。適切な増殖条件下でカルス 環が受傷部周辺で生成する。次いでカルスは増殖培地に移され、苗条、根を形成 して、更に植物にまで生長する。又は、全体植物への接ぎ木を行なってもよい。

多数のＧＳ遺伝子コピーを植物細胞中に導入するためのもう１つの方法は、組換 えＤＮＡ技術における当業者に周知の方法によって、機能性ＧＳ（ゲノム又はｃ ＤＮＡ）構造遺伝子のコピーを自己結合させることである。各々が個々のプロモ ーターを有する構造遺伝子群は適切なリンカ−によって互いに作動可能に結合せ しめられ、ある場合において各遺伝子の１０〜３０個のコピーがＴｉプラスミド のような適切な複製可能な発現ビヒクル中に導入される。又は、遺伝物質は植物 胚細胞中に直接微量注射することができる。単子葉植物の場合には、花粉は全Ｄ ＮＡで又は耐性をもつ適切な機能性クローンで形質転換され、次いで花粉は有性 生殖により子孫を残すために使用される。

勿論、細胞を除草性ＧＳ・阻害剤耐性とするようなレベルまで所定細胞のＧＳ活 性を高めるために適用可能なものであれば他のいかなる方法も利用することがで きる。

本発明において特に重要なことは、構造ＧＳ遺伝子についてコードする機能性ゲ ノム配列を、自己から得られる遺伝子生成物の過剰生産が可能な別の遺伝子配列 に作動可能に結合させることである。遺伝子配列のこの結合は、例えばＴｉプラ スミドによって適切な植物細胞中に導入することができる。

特にアグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏ−ｂａｃｔｃｒｉｕｍ　 ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の所謂腫瘍誘導性（Ｔｉ）プラスミドの使用による、 植物細胞中への遺伝物質の導入は、再現可能かつ予測可能な技術である〔例えば 、カブラン・ニーら、　“植物細胞中への遺伝物質の導入′、サイエンス、第８ １５−８２１頁、１９８３年１１月（Ｃａｐｌａｎ。

Ａ、、　ｅｔ　ａｔ、、”Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆＧｅｎｅｔｉｃ　Ｍ ａｔｅｒｉａｌ　ｉｎｔ。

Ｐｌａｎｔ　ｃｅｌｌｓ”、　５ｃｉｅｎｃｅ　：　８１５−８２１　（Ｎｏｖ ｅｍｂｅｒ　１９８３））　；シェル串ジエイ及びヴアン　モンタギュー・エム 、　“植物における天然の及び実用的な遺伝子ベクターとしてのＴｉブラスミビ バイオテクノロジー、１９８３年４月。

第１７５−１８０頁（Ｓｃｈｅｌｌ、Ｊ、、　ａｎｄ　Ｖａｎ　Ｍｏｎｔａｇｕ 、　Ｍ、。

ゴｈｅ　Ｔｉ　ＰＩａｓｍｌｄ　ａｓ　Ｎａｔｕｒａｌ　ａｎｄ　ａｓ　Ｐｒａ ｃｔｉｃａｌ　ＧｅｎｅＶｅｃｔｏｒ　ｆｏｒ　Ｐｌａｎｔｓ、　＋Ｂ１ｏ／Ｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　：　Ａｐｒｉｌ　１９８３゜ｐｐ、１７５−１８０）　； ホーシュら、　“植物における機能性外来遺伝子の遺伝承継”、サイエンス、第 ２３３巻、第４９６−４９８頁、１９８４年（Ｈａｒｓｈ　ｅｔ　ａｌ、、”１ ｎｈｅｒ−１【ａｎｃｅ　ｏｆ’　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｆｏｒｅｉｇｎ　Ｇ ｅｎｅｓ　Ｉｎ　Ｐｌａｎｔｓ’。

５ｃｉｅｎｃｅ　：　２３３．４９Ｂ−４９８（１９８４）　）　；フレリー・ アール・チーら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ イエンス　ＵＳＡ、第８０巻、第４８０３頁、１９８３年（Ｆｒａｌｅｙ、　Ｒ ，Ｔ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏ−ｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆＮａｔｉｏｎａｌ　 ＡｃａｄｅｒＡｙ　ｏｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　ＵＳＡ　８０　：４８０３　（１９ ８３）　）　；ワトソンら１組換えＤＮＡ、　ショート・コース、サイエンティ フィック・アメリカンφブックス、１９８３年、第１６４−１７３頁（Ｗａｔｓ ｏｎ　ｅｔ　ａｌ、＋Ｒｃｃｏｗｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ、　Ａ　５ｈｏｒｔ　Ｃ ｏｕｒｓｅ、　５ｃｉｅｎｔ１ｆ１ｃ　Ａｍｅｒｉ−ｃａｎ　Ｂｏｏｋｓ、　１ ９８３．　ｐｐ、１Ｂ４−１７３　）　；オールド及びプリムローズ、遺伝子操 作原理、第２版、ニー・カル・プレス。

１９８１年、第１３８−１５６頁（Ｏｌｄ　ａｎｄ　Ｐｒｉｍｒｏｓｅ。

Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏ（’　Ｇｅｎｅ　Ｍａｎｌｐｕｌａｔｌｏｎ、２ｄ　 Ｅｄ、、Ｕ、Ｃａｔ。

Ｐｒｅｓｓ、　１９８１．　ｐｐ、１３８−１５６　）参照；これらは参考のた め本明細書に組込まれる〕。

Ｔｉプラスミドは形質転換細胞の製造のために必要な２つの領域を有する。これ らのうち１つは転移ＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）と呼ばれ、腫瘍形成を誘導する。もう １つはビルレント（ｖｉｒｕｌｅｎｔ）領域と呼ばれ、腫瘍の維持ではなく形成 のために必要である。植物ゲノムに転移する転移ＤＮＡは、その転移能が影響を うけないのであれば、本発明の多数結合ＧＳ遺伝子又は組合せ遺伝子の挿入によ ってサイズを拡大させることができる。腫瘍形成遺伝子がもはや干渉しないよう にそれらを取除いた場合には、修正されたＴｉプラスミドは適切な植物細胞中に 本発明の遺伝子構造体を転移させるためのベクターとして用いることができる。

挿入される外来ＤＮＡは、Ｔ領域の側面に位置する両末端配列間に通常導入され る。

特に有用なＴｉプラスミドベクターは、ツバリンＴｉプラスミドＣ５８の非腫瘍 形成誘導体たるｐＧｖ３８５０である（カブランら、同上参照）。このベクター はＴｉプラスミドの自然転移性を利用している。未分化クラウンゴール（ｃｒｏ ｗｎ　ｇａｌｌ）表現型を決定する内在Ｔ−ＤＮＡ遺伝子は削除されており、通 常のクローニングビヒクル（例えばｐＢＲ３２２）で置換されている。

Ｔ−ＤＮＡボーダー領域間のクローニングビヒクル配列は、同一クローニングビ ヒクルの誘導体でクローニングされた外来ＤＮＡを再導入するための組換え用相 同性領域として機能する。したがって、かかるプラスミドでクローニングされる 本発明の遺伝子構造体はいずれもＦ目間配列の１回の組換えでｐＧＶ３８５０中 に挿入させることができる。抗生物質耐性マーカーは、組換え体を選択するため にプラスミドに加えることができる。除草剤耐性も勿論付随して又は独立して利 用することができる。

このベクター中にツバリンシンターゼ（ｎｏｓ　）遺伝子が存在する場合は、ｐ ＧＶ３８５０を用いた形質転換の有効性をモニターすることが容易になる。その 際、組織培養中のカルスがツバリンの存在について試験される。

植物細胞又は植物の形質転換後、それらは抗生物質耐性又は更に適切には除草剤 耐性のような適切なマーカーの補助により選択され、次いで慣用的方法で増殖せ しめられる。タバコの場合、原形質体単離後３〜５日目の原形質体培養物が、Ｔ −ＤＮＡ領域に前記ハイブリッドＧＳ遺伝子をもつ適切なＴｉプラスミドを保有 したアゲロバクチリア（Ａｇｒｏｂａｅｔｏｒｌａ）による形質転換の場合に適 する。原形質体保有細胞及びアゲロバクチリアの同時培養２日後、植物細胞は遠 心分離及び新鮮培地への懸濁によって数回洗浄される。これにより大半の細菌を 取除く。残った細胞は適切な抗生物質によって殺されるが、例えばセホタキシム （４００〜１．０００μｇ／ｍｌ）が原形置体培地に加えられる。細胞は、それ らが可視的な細胞凝集物（カルス）を形成するまで、非選択的培地で培養される 。次いでそれらは、すべての野生型細胞を殺すような適度の除草剤濃度の培地上 で培養される。組込まれたＧＳハイブリッド遺伝子を発現する形質転換体のみが 生存し、かつ増殖を続ける。これらのカルスは、６−ベンジルアデニン１ｍｇ／ ｊ！及びナフタレン酢酸０．　ｌｌｌ１ｇ／ｇ含有のムラシゲ−シューブ（Ｍｕ ｒａｓｈｉｇｃ−８ｈｏｏｇ　）培地に移された場合に、苗条を再生するよう容 易に誘導される。苗条は無ホルモンＭＳ培地に又は直接バーラントもしくはバー ミキユライトに根付くことができ、ポットに移し替えられる。苗木は温室で生長 しうる状態となり、除草剤耐性に関して試験することができる。

カリフラワーモザイクウィルスＣａＰｖＩＶのような他の系〔ホーン・ビーら、 　“植物腫瘍の分子生物学″、アカデミツクプレス、ニューヨーク、１９８２年 、第５４９−５６０頁（Ｈｈｏｎ、Ｂ、、　ｅｔ　ａｌ、、”Ｍｏ１ｅｃｕｌａ ｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ’Ｐｌａｎｔ　Ｔｕｍｏｒｓ’、　Ａｃａｄｅｍｉｃ 　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８２゜ｐｐ、５４９−５６０）　； 及びホーウェル（ｌｏｖｅｌｌ）の米国特許第４．４０７．９５６号明細書〕も 使用可能である。完全ＣａＭＶウィルスＤＮＡゲノムは、細菌中で増殖されうる 組換えＤＮＡ分子を得るため、親細菌プラスミドに挿入される。クローニング後 、組換えプラスミドは、本発明の組合せ遺伝子の挿入のために、組換えプラスミ ドのウィルス部分においてランダムに又は独特な部位で制限酵素により切断され る。リンカ−と称され独特な制限部位をもつ小オリゴヌクレオチドも挿入させる ことができる。修正組換えプラスミドは再度クローニングされ、リンカ−の独特 な制限部位へのより大きな遺伝子構造片の導入によって更に修正される。組換え プラスミドの修正ウィルス部分は次いで親細菌プラスミドから切除されて、植物 細胞又は植物に接種するために使用される。このウィルスは、前記ホーウェルの 特許明細書において、高タンパク質生産、ストレスに対する高耐性、ペスト及び 農薬に対する耐性、窒素固定その他を可能にする遺伝子の挿入のためには特に有 効であると記載されている。

通常、望ましいＧＳ配列は、公知の組換え方法によって、互いに又は過剰生産プ ロモニターにインビトロで作動可能に結合せしめられる。例えば、ＧＳの構造遺 伝子、通常そのゲノム遺伝子は、その正常なプロモーター及び開始ＡＵＧコドン 間の領域上の制限によって、かかるプロモーターから分離される。次いで、例え ばリブロースニリン酸カルボキシラーゼの小サブユニットとの転写融合が行なわ れる。しかる後、構造体が植物ビヒクルの適切な制限部位中に挿入される。

例えば、ビヒクルとしてＣａＭＶ　ＤＮＡを用いた場合、遺伝子構造体は、ウィ ルスＤＮＡの感染性又は植物全体にわたるその可動性を消失させることなく、ウ ィルスＤＮＡ上の部位に挿入される。したがって、構造体は様々な制限部位に挿 入させることができ、生成物をクローニングして、ウィルスの必須の特性が残存 するか否かにつき調べられる。この方法では、感染性及び可動性についてスクリ ーニングすることが可能な比較的多量の修正ウィルスを迅速に単離しうるように なる。ハイブリッドＤＮＡプラスミドのウィルス部分が修正された後、修正ウィ ルスはハイブリッドＤＮＡプラスミドから取除かれ、直鎖型で直接又は環化結合 した型で植物に接種させるために使用される。

様々な技術が、植物細胞をＣａ　Ｍ　Ｖビヒクルで感染させるために使用しうる 。若葉は穏やかに表皮剥離され、次いでウィルスＤＮＡと接触せしめられる。感 染後、ウィルスＤＮＡはアブラムシ（ａｐｈｉｄ　）によって媒介させることが できるが、アブラムシ媒介遺伝子は機能的に作動する。機械的技術も適用可能で ある。又は、組織もしくは単細胞を感染させてもよい。

用途 本発明の遺伝子構造体を有するビヒクルの用途は、除草剤耐性植物細胞及び全体 植物の製造に際しての中間体としてのものである。したがって、本発明の方法に より耐性を獲得した植物細胞のみならず、ビヒクル又はベクターのすべては、最 終生成物、即ち全体植物の有用性から自らの有用性が導かれる。

本発明に従い除草剤耐性を獲得した全体植物の有用性は明らかである。かかる植 物は、植物制御又は抑制量の除草剤と接触せしめられた場合に、それに対し耐性 である。これによって、いずれかの望ましい植物又は植物群のみを選択する除草 剤処理が可能になる。

更に、除草剤に対する耐性は、植物又はその細胞に他の遺伝子を導入した場合の 選択可能マーカーとして使用することが可能になる。

“除草性ＧＳ阻害剤の植物制御量”という語は、所定の植物の増殖又は生長に影 響を与えうる機能面からの除草剤量を意味する。したがって、量は増殖もしくは 生長を単に低下もしくは抑制するにしかすぎない少量であってもよく、又は量は 感受性細胞を不可逆的に破壊するのに十分な多量であってもよい。通常、双子葉 植物及び草類は、０．５〜１．　５ｋｇ／ｈａの空中散布割合で制御される。単 子葉植物の場合は、０．５〜２．　０ｋｇ／ｈａの空中散布割合が通常適用され る。当然除草剤は周知のスプレー又はスプレッド方法によって適当な植物と接触 せしめられる。例えばＰＰＴによる草類の制御のために先行技術で用いられた葉 面投与法も、本発明に属するＰＰＴ耐性植物の場合には適用可能である。

本発明は更に、除草性ＧＳ阻害剤感受性植物細胞又は植物を植物制御量の除草性 ＧＳ阻害剤と接触させる植物制御方法にも関するが、接触は本発明の除草性ＧＳ 阻害剤耐性植物細胞又は植物と同時に又はそれらの中に感受性植物細胞又は植物 が存在する場合に行なわれる。したがって、野外又は栽培地における植物の葉面 除草剤処理において、植物が除草剤耐性植物細胞からなる植物及び除草剤感受性 植物細胞からなる植物の双方を含み、双方が処理作業中に除草性ＧＳ阻害剤と同 時に接触せしめられる場合には、かかる草面除草剤処理は、本発明に包含される 方法である。

本発明について概括的に説明してきたが、本発明は具体例を参照することより明 確に理解されるようになるのであって、これらの例は説明のみの目的で記載され ており、特に指示のない限り限定のためのものではない。

例Ｉ ＰＰＴ耐性アルファルファ細胞培養物の単離及び特徴付は 培地中Ｌ−ホスフィノスリシン３ｍＭ存在下で増殖しつるアルファルファ細胞系 を選択した。アルファルファは、単一の単離細胞又は原形質体から全体植物が容 易に再生しうるモデル植物の１つであることから、選択された。

ホスファノスリシン耐性アルファルファ系の選択は、液体培地中の阻害剤濃度を 段階的に高めることにより行なった。６か月以内に原細胞系よりもホスフィノス リシンに対して少なくとも２０倍高い耐性を有する細胞群を選択した。懸濁培養 物中の圧縮細胞容量測定によると、野生型細胞は２．５Ｘ１０’ＭのＬ−ホスフ ィノスリシンで完全に阻害された。耐性細胞は、化合物５Ｘ１０−４Ｍ存在下で その非存在下の場合と同様良好に増殖した（第２図及び第３図）。

感受性及び耐性の細胞系の粗細胞抽出物のタンパク質パターンをＳＤＳポリアク リルアミドゲル電気泳動により比較した場合に、分子量４０〜４２ＫＤのポリペ プチドの過剰生産がＰＰＴ耐性細胞系において観察された。

アルファルファの精製ＧＳも同様の分子量を有する。細胞抽出物の酵素活性も合 わせて測定した。耐性細胞の特異的ＧＳ活性は、野生型細胞の場合よりも５〜１ ０倍高かった。ＰＰＴ耐性細胞系におけるＧＳ特異的活性は、効率的二窒素固定 マメ科植物のすべての根粒組織と同様に高ＧＳ活性を有するアルファルファの根 粒組織の場合と同程度である。様々な量のホスフィノスリジン存在下におけるＧ Ｓ活性の測定では、いずれの細胞型でもＰＰＴにより同程度の酵素阻害性を示し たが、このことはＧＳタンパク質の構造的変化が耐性変異体の選択時に起こらな かったことを示唆している。

メツセンジャーＲＮＡをイソチオシアン酸グアニジニウムＲＮＡ抽出法によって 野生型及び耐性細胞から単離し、次いでオリゴｄＴセルロースカラムに通してｍ ＲＮＡを分離した。ｍＲＮＡ集団ｇが細胞物質１ｇにつき単離された。両細胞系 から単離されたｍＲＮＡのインビトロ翻訳では、３５Ｓ−メチオニン標識抽出物 から得られるインビボパターンと同様のポリペプチドバークンを示した。このこ とは単離されたｍＲＮＡがほぼ未変化であることを示唆した。インビボ標識タン パク質では４０〜４２ＫＤポリペプチドの量において顕著な差異を示したが、イ ンビトロ翻訳タンパク質パターンにおける野生型及び変異細胞系間の差異はみら れなかった。

第−及び第二の鎖状ｃＤＮＡをＰＰＴ耐性変異体のｍＲＮＡ集団から合成した。

ｃＤＮＡのＳｌ−切断及びポリＣ−尾部形成の後に、ＤＮＡをポリＧ−尾部形成 ｐＢＲ３２２ベクターＤＮＡとアニーリングした。大腸菌ＭＣ１０６１株を再環 化ベクターで形質転換させた。

３．５Ｘ１０’個のコロニーをア゛ニーリングベクターＤＮＡ１ｇ当たり得た。

８０％のコロニーはアンピシリン（ａｍｐ）感受性であって、ａｍｐ感受性クロ ーンの５０％はプラスミドのＰｓｔ消化により検出されうる挿入物を有していた 。挿入物の１０２６は１０００以上の塩基対を有していた。

コロニー１８００個をニトロセルロースフィルター上で増殖させ、ＧＳ特異的配 列の割合が高い３２Ｐ標識第−鎖ｃＤＮＡプローブでフィルターをプローブ化し た。かかるクローンの中からＧＳ特異的ｃＤＮＡクローンを見出しうると期待さ れた。根粒のｍＲＮＡから製造されたファセオルス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　）　 ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリー中のＧＳ　−ｃＤＮＡクローンを外部供給源から入 手した。このＧＳ　−ｃＤＮＡクローンはｃＤＮＡライブラリー中の１つのアル ファルファｃＤＮＡクローンを同定することができたが、これはファセオルスＧ ５−ＤＮＡと強くハイブリッド形成する。

アルファルファＧＳ　−ｃＤＮＡクローンの挿入ＤＮＡを配列決定した。次いで 、アルファルファ及びファセオルスＧＳ　−ｃＤＮＡを、野生アルファルファ細 胞及び変異ＧＳ過剰生産細胞間の差異を明らかにするため、プローブとして使用 した。

全ゲノムＤＮＡを、アルファルファ葉、野生型細胞系、６Ｘ１０　Ｍ、２Ｘ１０ −”Ｍ及び３ｘ１０−３Ｍ　Ｌ−ホスフイノスリシン存在下で選択された耐性細 胞系の３つの亜系から取出した。ＤＮＡをＢａｍＨＩ％ＥｃｏＲＩ。

ＨｉｎｄＩｆｆ及び２種の酵素の組合せにより消化した。消化されたＤＮＡのア ガロースゲル電気泳動後、ＤＮＡ断片をサウザーンプロット法によりニトロセル ロースフィルター上に移した。フィルター結合ＤＮＡをアルファルファ及びファ セオルスＧＳ−クローンの３２Ｐ標識ｃＤＮＡ挿入物とハイブリッド形成させた 。同一サイズのＤＮＡは双方のプローブとハイブリッド形成した。１つの主なバ ンドは、５種すべてのＤＮＡサンプルにおいて同様の強度でアルファルファプロ ーブとハイブリッド形成した。第二のバンドは、野生型ＤＮＡ消化物の場合にほ とんど目に見えないが、耐性細胞系のＤＮＡと強くハイブリッド形成する。最も 強いハイブリッド形成は高度の耐性細胞系のＤＮＡの場合に観察されたが、この ことは耐性獲得時におけるＤＮＡ断片の増幅を示唆している。アルファルファｃ ＤＮＡプローブは増幅ＤＮＡ断片と強くハイブリッド形成し、ＧＳ相同性の増幅 ＤＮＡとはそれよりも弱くハイブリッド形成した。

変異アルファルファ細胞系がＰＰＴ耐性になった理由を確認するため、野生型及 び変異細胞系を用いてノザーン及びサウザーンプロット法を繰返した。ノザーン プロット法では、野生型の場合よりもグルタミンシンテターゼｍＲＮＡが約８倍 多いことを示した。サウザーンプロット法が双方の細胞系のゲノムＤＮＡを用い て行なわれた場合には、変異アルファルファ細胞系においてグルタミンシンテタ ーゼ遺伝子の重複が明らかに示された。重複度は、ハイブリッド形成により評価 すると、未重複グルタミンシンテターゼ遺伝子の場合よりも５〜１５倍高いよう である。それはまた正確に）ＩＩ（ｆｆｌしているようであって、即ち１つのバ ンドのみが７１イブ１月ノド形成能に関して７〜１１倍高まっていた。

例２ ＰＰＴ耐性細胞培養物からのグルタミンジングルタミンシンテターゼ（１２ｎ１ １ｏ１）を７０％ギ酸１ｍｌに溶解させ、ＣＮＢｒ３ｌｌ１ｇを加え、室温で２ ４時間切断を進めた〔グロス、メソッズ・イン・エンザイモロジー、第１１巻、 第２３８−２５５頁、１９６７年（Ｇｒｏｓｓ＋Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｅｎｚ ｙＩＩｌｏｌｏｇｙ　１１　：　２３ｇ−２５５（１９６７）　）　）　、蒸留 水（６ｍｌ　）で稀釈後、混合液を２回凍結乾燥させた。

ＣＮＢ　ｒペプチドの高速液体クロマトグラフィー逆相高速液体クロマトグラフ ィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）を、ウルトラボア（Ｕｌｕａｐｏｒｅ　）　ＲＰ　Ｓ　Ｃ （内径０．４６ｃｍＸ７．５ｃｍ）で、０．１％トリフルオロ酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ ）を用い４０℃で０〜６０％アセトニトリル直線勾配（３０分間；流速０．　５ ｍｌ／ｍ１ｎ）により行なった〔ベネットら。

バイオケミカル・ジャーナル、第１６８巻、第９−１３頁、１９７７年（Ｂｅｎ ｎｅｔ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｂｊｏｃｈｅｍｌｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａ１１Ｂ８　： 　９−１３（１９７７））　）　、　ＣＮＢ　ｒペプチドを最小容量の０６１％ ＴＦＡ中６Ｍ塩酸グアニジンに溶解させた。数回に分は分取したクロマトグラフ ィーピークを手で回収し、プールし、凍結乾燥させた。ベックマン（Ｂｅｃｌｖ ａｎ）１６０検出器を用いて２１４ｎｍで検出を行なった。

アミノ酸分析 アミノ酸組成は、常時沸騰したＨＣＩ　（０，０２５ｍ１）中１１０℃で２４時 間、シールされ、排気されたチューブ〔パイレックス（Ｐｙｒｅｘ■）、培養、 基、縁なし、６Ｘ５０ｍｍ）中におけるサンプルの酸加水分解後に調べた〔ムー ア、ペプチドの化学及び生物学、アン・アーバー・サイエンス、アン・アーバー 、ミシガン、第６２９−６５３頁、１９７２年（Ｍｏｏｒｅ、　Ｃｈｅｍｉｃａ ｌ　ａｎｄ　ＢｉｏｌｏｇｙｏｆＰｅｐｔＩｄｅｓ、　Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ　５ ｃｉｅｎｃｅ、　Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ、　Ｍｉｃｈｉ−ｇａｎ、　６２９−６５ ３　（１９７２）　）　）。ヒユーレット−パラカード（ＨｅｗｌｅｔＬ−Ｐａ ｃｋａｒｄ　）　３３９０　Ａ積分器２個装備のべ・ンクマン（ＢｅｃｋＩＩｌ ａｎ　）　６３００アミノ酸アナライザー、ニンヒドリン及び２チヤンネル（４ ４０及び５７０ｎｍ）積分を用いて、１００　ｐｍｏｌ／アミノ酸における信頼 値１〜７％、最小検出限度２５ｐＩＩｌｏｌでトリプトファン、システィン、ア スパラギン及びグルタミン以外のすべてのアミノ酸を分析した。分析は各サンプ ル及びバックグラウンドコントロールについて３〜５回繰返シタ。

タンパク質配列分析： 自動エドマン分解をアプライド・バイオシステムス４７０Ａシークエンサー（Ａ ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４７０Ａｓｃｑｕｃｎｃｃｒ　）で行な った。配列決定プログラムは、気液固相ペプチド及びタンパク質配列決定法とし て既に開発法である〔ヘライックら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ ストリー、第２５６巻、第７９９０−７９９７頁、１９８１年（ｌｌｅｗｉｃｋ 　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏ「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ！　Ｃｈｅｌｌ ｉｓｔｒｙ、　２５［ｉ　：　７９９０−７９９７　（１９８１）　）　）。

プログラムは、１つのカップリング工程（４４℃、２６分間）及び単一切断工程 （４４℃、６．７分間）を含む。

２−アニリノ−５−チアゾリノン誘導体（ｐｔｈ−アミノ酸）の自動変換には、 ２５％トリフルオロ酢酸（５０℃、３３分間）を用いる。ポリブレン（Ｐｏｌｙ ｂｒｅｎｅ■）（１，５ａ＋ｇ）　（タールら、アナリティカル・バイオケミス トリー、第８４巻、第６２２−６２７頁、１９７８年（Ｔｏｒｒ　ｅｔ　ａｌ、 、　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂ４ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　８４：　６２２−６２ ７（１９７ｇ）　、クラッパ−（Ｋｌａｐｐｅｒ　）ら、同上、第８５巻。

第１２６−１３１頁、１９７８年〕をタンパク質またはイスクに加え、ポリブレ ン由来の汚染物質を減少させるために配列決定サイクルを５回繰返した。アンギ オテンシンＩＩ　（１ｎａ＋ｏｌ）をカートリッジフィルターに加え、次いで分 解サイクルを終えた。アンギオテンシンの配列決定により、未知物質の配列決定 前にシークエンサーの化学的及び機械的操作性について評価した。マツコラクジ ラアポミオグロビン（１００〜２００　ｐｏｏ＋）のタンパク質配列分析では、 通常、初期収率４５−５５％、平均繰返し収率９２〜９３２６及び１サイクル当 たりの平均ラグ２〜３２６であった。すべてのｐｔｈ−アミノ酸は、／＼ンカピ ラー及びフッド、メソッズ・イン・エンザイモロジー、第９１巻、第４８６−４ ９３頁、１９８３年［Ｈｕｎ−ｋａｐｉｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｈｏｏｄ　Ｍｅｔｈ ｏｄｓ　Ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　９１　：　４８Ｂ−４９３（１９８３） ）により開発された系に基づき、１５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，５） 及びアセトニトリル／メタノール（９２，５：　７．　５．　ｖ／ｖ）複合勾配 を用いて、シアノカラム（０，４５Ｘ２５ｃｍ）での逆相高速液体クロマトグラ フィーによって同定された。このＨＰＬＣ系は、ジチオスレイトール付加物、Ｎ −ジメチル−Ｎｌ−フェニルチオ尿素及びジフェニルチオ尿素の主な汚染物質か らｐｔｈ−アミノ酸及び内部標準（Ｐｔｈ−Ｇｌｕのメチルエステル）を分離し た。メチオニン及びプロリンは慣用手続きによっては分離されなかったが、修正 勾配によればこれら２種のｐｔｈ−アミノ酸を分離することができた。内部標準 （２００ｍｍｏｌ）を各サイクル回収物に加え、サンプルをＲＨｌｏｏ−６０− ター装備スピードバック・コンセントレータ−（Ｓｐｅｅｄｖａｃ　Ｃｏｎｃｅ ｎｔｒａｔｏｒ　）で乾燥させた。乾燥サンプルを水／アセトニトリル（８０： 　２０．ｖ／ｖ）０．０２５ｍ１に溶解させ、一部（０，０１７ｍ１）（全サン プルの６８％）を自動注入した。ｐｔｈ−アミノ酸をベックマン１６０検出器に より２５４ｎｍにおけるＵＶ吸光度によって検出した。

特表昭６３−５０３１９６　（１２） 精製経路 精製プロセスは簡単には下記経路で要約される：凍結細胞１００ｇ ５０ｍＭトリス−ｐＨ７，５を添加 ↓ 低速（３０秒間）ブレンターの使用 ８ＫｒｐＨ，５℃、１０分間の回転 ↓ ７９６硫酸プロタミン７．５９６ｖ／ｖ上澄８Ｋｒｐｍ、５℃、１０分間の回転 ↓ ４℃、１５分間　Ｈ，Ａ、との結合 ↓ ５０ｍＭｔ−リス−ｐＨ７，５で５回Ｈ，Ａ、の洗浄５０ｍＭ）リス−ｐＨ７， ５で５回　ＧＳの溶離溶離分画のプール、１０ｍＭ）リス−ｐＨ６，８で透析１ ０ｍＭ　Ｍｇ ＭｇＳＯ４ ↓ Ｇ−２００カラム、活性ピークのプール凍結変異アルファルファ組織培養細胞１ ００ｇをドライアイスと混合し、ブレンターで微粉末に粉砕した。解凍後、混合 物を４℃で２０分間８．００Ｏｒｐｍで回転させた。硫酸プロタミン沈殿を上澄 で行ない、核酸を除去した。ＭｇＳＯ４濃度を１０ｍＭとし、−メルカプトエタ ノール（Ｂ　Ｍ　ｅ　）を７ｍＭとし、ｐＨをＩＮ酢酸で６．８に調整した。粗 抽出物をヒドロキシアパタイト（Ｈ，Ａ、　）に結合させた。Ｈ，Ａ、をｐＨ７ ，５の１０ｍＭトリス、０．２８Ｍ　Ｍｇ５ｏ４及び１０％エチレングリコール でバッチ毎に５回洗浄した。グルタミンシンテターゼをＭｇＳＯ４濃度０．５Ｍ とすることにより溶離した。バッチ溶離を５回行なった。ｐＨ７，５の１０ｍＭ ）リス、１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４で透析後、Ｇ−２００カラムに供した。グルタミ ンシンテターゼ活性を有する両分をプールした。ＳＤＳアクリルアミドゲル及び 銀染色によると、タンパク質は純度９５％以上であった。アミノ酸組成は、アル ファルファグルタミンシンテターゼの組成が大豆に関して公表された組成の場合 とほぼ同様であることを示した（第１表）。

第１表 大豆根本　エントウ葉　アルファルファＡｌａ　８．４　６．９　８．７（±０ ．４）Ａｒｇ　５．６　４．０　５．０（±０．５）Ａｓｘ　１０．４　１０． ７　１１．４（±０．６）Ｃｙｘ　Ｏ，８Ｎ、Ｄ、　Ｎ、Ｄ。

Ｇｌｘ　１０．０　１０．１　９．９　（±０．５）Ｇｌｙ　１０．６　１９． １　１３．５（±Ｏｏ　７）Ｈｉｓ　２．２　３．６　３．１ １１ｅ　６．６　５．６　８．４（±０．４）Ｌｅｕ　６．７　６．５　７．６ （±０，９）Ｌｙｓ　５．９　５．７　・　６．８（±０．３）Ｍｅｔ　１．６ 　Ｎ、Ｄ、　０．６（±０．３）Ｐｈｅ　２．８　２．６　２．３ Ｐｒｏ　６．１　８．８　８．０（±０．６）Ｓｅｔ　５．４　７．８　６．５ （±０．４）Ｔｈｒ　５．１　４．９　５．６（±０．３）Ｔｒｐ　１．５　Ｎ 、Ｄ、　Ｎ、Ｄ。

Ｔｙｒ　３．９　０．５　３．４（±０，７）ｖａｔ　６．３　４．８　４．４ （±１．５）零アール・エッチ・マクバーランドら、バイオケミカル・ジャーナ ル、１９７６年、第１５３巻、第５９７−６０６頁（Ｒ，Ｈ，ＭｃＰａｒｌａｎ ｄ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｊｏｕｒ−ｎａｌ　（１９７Ｇ ）　＋５３　：　５９７−６０８）Ｎ、　Ｄ、−測定されず Ｃ０Ｖ、−信頼値（標準偏差／平均） 配列決定 配列決定に際しての最初の試みは、精製された天然タンパク質を用いて開始され た。入手可能な配列がなかったが、このことはＮ　Ｈ２末端が天然ではブロック されていることを示していた。ＣＮＢ　ｒ切断を行ない、断片をＨＰＬＣにより 分離した。タンパク質のアミノ酸組成は、２〜５個のみのメチオニンが存在する ことを示した。２つのＨＰＬＣ分離ＣＮＢｒ断片は有用な配列情報を与えた。

次いで、精製されたグルタミンシンテターゼ断片の配列決定を行なった。結果は 下記のとおりである：Ａｈａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎこの配 列は、Ｇｌｙ残基が環化していること以外には、完全変異アルファルファｃＤＮ Ａクローンから得られる配列の一部に相当する。推定タンパク質配列は下記に示 されている。

グルタミンシンテターゼについてコードする機能的ゲノム配列の製造 全ゼノムＤＮＡを、ファセオルス根粒のゲノムを得るために用いられたプロトコ ール〔カリモアーψジエイ・デー及びミツリンやビーφジエイ、フエデレーショ ン０オブ・ヨーロピアン・バイオケミカル・ソサエテーズ・レターズ、第１５８ 巻、第１０７−１１２頁、１９８３年（Ｃｕｌｌｉｍｏｒｅ、　Ｊ、Ｄ、　ａｎ ｄ　Ｍｉｒｌｉｎ、　Ｂ、Ｊ、、　Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎｏｆ’　Ｅｕｒｏｐｅ ａｎ　ＢＩｏｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｉｅｓ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　１５８ ：　１０７−１１２　（１９８３）　）　）に類似したプロトコールを用いてア ルファルファ組織培養物から得、全天敵にＢａｍＨＩで消化した。次いで物質を 酢酸カリウム°５〜２０％勾配中でサイズ分別し、いくつかの部分に分けた。し かる後各部分を１％アガロースゲル上で操作し、上記コード配列プローブのＰｓ ｔ切断により得られるｃＤＮＡＤＮＡグルタミンシンテターゼプローブザーン・ トランスファー系でプローブ化させた。大きさが４ｋｂ以上の断片について選択 された陽性ハイブリッド形成画分をＢＶ−２λベクターに結合させた。ファージ １００，０００個を培養し、上記グルタミンシンテターゼｃＤＮＡプローブでプ ローブ化させた。４つの陽性プラークを得た。次いでこれらを増殖させ、３〜４ 回にわたるプラークハイブリッド形成によって精製した。精製された４ｋｂゲノ ムクローンを単離し、Ｍ１３ｒｒ１９に再結合させた。このクローンを両末端か ら配列決定した。更にクローンをＨａｅ■で断片化し、Ｍ１３ｍｐ９に組込んで サブクローニングし、再度配列決定した。

この方法により、この４　ｋ　ｂ　５’断片（ゲノムＤＮＡの消化によっても得 られる８ｋｂ３’断片の一部と同様に）を完全に配列決定した。これら断片は一 緒になって完全な機能性遺伝子となるが、その読取り枠は手元のタンパク質配列 情報、既知ＧＳ分子量及び３種ありうる読取り枠における停止トリプレットの相 対的発生率から予測される。イントロン及びエキソン領域を含むグルタミンシン テターゼの完全ゲノム配列は第４図に示されている。手元のＧＳに関する完全機 能性配列は前記いずれか第４図は、完全ゲノム配列中に１３個のイントロンが存 在することを示す。第一エキソンの前に１個のイントロン、最終エキソンの後に １個のイントロン、及びエキ７２１２個の間に１１個のイントロンが存在する。

以下においては、ゲノム配列中におけるそれらの位置を示すために、イントロン を１１〜ＩＩ３で標識する。かがるイントロンがコドン又はトリプレットの第− 及び第二ヌクレオチド間に位置する場合、そのトリプレットに対応するアミノ酸 は例えばチロシンのときＴ−１ｘ−ｙｒと記載される。イントロンがコドンの第 二及び第三ヌクレオチド間に位置する場合、対応するアミノ酸は例えばＴｙ−Ｉ ”−ｒと記載される。

イントロンは様々な鎖長を有しており、最小及び最大の鎖長はいずれも立体障害 の程度によって決定される。

イントロンの適切なループ化及びエキソンの適切な切断、結合のためにはイント ロン中に十分なヌクレオチドが存在していなければならない。例えば第４図にお いて、最大のイントロンは第一エキソンの前に位置する１１であって、７４０個 のヌクレオチド鎖長である。

以上のように本発明を十分に説明してきたが、本発明は、その精神もしくは範囲 又はそのいずれかの態様に影響を与えない限り、構造、生成物、方法及び用途に 関しであろう。

７”ｔムクξ；風受５ン；？−ｔ”７４）／ム２″／ムクζＪ文　！ンムＺミ、 ンｎ交手続補正書（方幻 昭和６３年曾月３１　日

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．除草性グルクミンシンテターゼ（ＧＳ）阻害剤に耐性の植物細胞であって、 該耐性が、除草性ＧＳ阻害剤、感受性植物細胞中に存在する場合に、該細胞を実 質上上記除草性ＧＳ阻害剤に耐性とさせるようなＧＳ活性の植物細胞レベルによ って生ぜしめられ； 該植物細胞が下記からなる遺伝子配列組合せ体：（ａ）下記第二遺伝子配列と作 働可能に結合せしめられ、上記植物細胞中で機能するゲノムグルクミンシンテタ ーゼ（ＧＳ）についてコードする第一遺伝子配列、（ｂ）組合せ体が除草性ＧＳ 阻害剤感受性植物細胞中に存在する場合において該細胞が除草性ＧＳ除草剤に対 して実質上耐性となるように上記第一遺伝子配列の発現レベルを増加させうる第 二遺伝子配列、を有することを特徴とする植物細胞。
2. ２．組合せ体が植物細胞のゲノムに組込まれている、請求の範囲第１項記載の植 物細胞。
3. ３．組合せ体がアグロバクテリウム・ツメファシエンスのＴｉプラスミド中に存 在する、請求の範囲第１項記載の植物細胞。
4. ４．除草性ＧＳ阻害剤がＰＰＴである、請求の範囲第１項、第２項又は第３項記 載の植物細胞。
5. ５．未形質転換状態において除草性ＧＳ阻害剤感受性である、請求の範囲第１項 記載の遺伝子配列組合せ体を有する形質転換除草性ＧＳ阻害剤耐性植物細胞。
6. ６．除草性ＧＳ阻害剤がＰＰＴである、請求の範囲第５項記載の植物細胞。
7. ７．所定の植物細胞中において作働可能な遺伝子配列組合せ体であって、 （ａ）下記第二遺伝子配列と作働可能に結合せしめられ、植物細胞中で機能する ゲノムグルタミンシンテターゼについてコードする第一遺伝子配列、（ｂ）組合 せ体が除草性ＧＳ阻害剤感受性植物細胞中に存在する場合において該細胞が除草 性ＧＳ阻害剤に対して実質上耐性となるように上記第一配列の発現レベルを増加 させうる第二遺伝子配列、 を含ｈでなる遺伝子配列組合せ体。
8. ８．第二遺伝子配列がプロモーターである、請求の範囲第７項記載の遺伝子配列 組合せ体。
9. ９．植物細胞のゲノム中に組込まれる、請求の範囲第７項又は第８項記載の遺伝 子配列組合せ体。
10. １０．アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＴｉプラスミド中に存在する、 請求の範囲第７項又は第８項記載の遺伝子配列組合せ体。
11. １１．除草性ＧＳ阻害剤がＰＰＴである、請求の範囲第７項又は第８項記載の遺 伝子配列組合せ体。
12. １２．請求の範囲第１項、第２項又は第３項記載の細胞からなる除草性ＧＳ阻害 剤耐性植物。
13. １３．除草性ＧＳ阻害剤がＰＰＳである、請求の範囲第１２項記載の植物。
14. １４．請求の範囲第５項記載の細胞からなる植物。
15. １５．植物細胞に除草性ＧＳ阻害剤耐性を付与する方法であって、 該細胞を請求の範囲第７項記載の遺伝子配列組合せ体で形質転換することからな る方法。
16. １６．除草性ＧＳ阻害剤がＰＰＴである、請求の範囲第１５項記載の方法。
17. １７．除草性ＧＳ阻害剤感受性植物の感受性制御方法であって、 除草性ＧＳ阻害剤感受性植物を植物制御量の除草性ＧＳ阻害剤と接触させ、 該接触を請求の範囲第１２項記載の除草性ＧＳ阻害剤耐性植物を同時に接触させ ながら行う、ことからなる方法。
18. １８．除草性ＧＳ阻害剤がＰＰＴである、請求の範囲第１７項記載の方法。
19. １９．ゲノムグルタミンシンテターゼについてコードする遺伝子配列を含ｈでな る組換えＤＮＡ分子。
20. ２０．植物細胞を形質転換しうるビヒクルである、請求の範囲第１９項記載の分 子。
21. ２１．第４図に示されるようなゲノムグルタミンシンテターゼについてコードす る遺伝子配列を含ｈでなる組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）分子。
22. ２２．イントロン及びゲノムグルタミンシンテターゼについてコードするエクソ ンの遺伝子配列を含ｈでなる組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）分子であって、Ｉ１〜Ｉ １３で示される該イントロン及びグルタミンシンテクーゼについてコードする該 エクソンが下記ポリペプチド式 【配列があります】 （上記式中、Ｉ１は第一エクソンの前に位置する第一イントロンであり、Ｉ１３ は最終エクソンの後に位置する最終イントロンであり、Ｉ２〜Ｉ１２は残余のエ クソン間に位置するイントロンであって、該イントロンの各々は約１０〜約７５ ０個のヌクレオチドからなる）を含ｈでなることを特徴とする分子。