JPS62500769A - 除草性グルタミンシンテタ−ゼ阻害剤に対して耐性がある植物細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ！、遺遺伝子配列台せ体が： （、）　植物細胞において機能するグルタミンシンテターゼ（ａＳ）についてコ ードし、第二の遺伝子配列に操作可能なように結合せしめられた第一の遺伝子配 列 （ｂ）　上記組合せ体が他の状態において除草性ＧＳ阻害剤感受性である植物細 胞に存在していや場合（′！。

該細胞が該除草性ＧＳ阻害剤に対して実質的に耐性となるように、上記第一の遺 伝子配列の発現レベルを増加させることができる第二の遺伝子配列を含んで構成 されるものであって、この組合せ体を有する、請求の範囲第７項記載の植物細胞 。

６、組合せ体が植物細胞のゲノムにおいて組合わされ７、組合せ体がアグロバク テリウム−Ｓｆメフ丁シエンスので１プラスミドに存在している、請求の範囲第 ３項記載の植物細胞。

ｒ、除草性Ｇ８阻害剤がＰＰＴである、請求の範囲第１、λ、３、ｊ、６又は７ 項記載の植物細胞。

り、未形質転換状態において除草性ＧＳ阻害剤感受性である、形質転換された除 草性ＧＳ阻害剤耐性植物細胞。

１０、除草性ａＳ阻害剤がＰＰＴである、請求の範囲第り項記載の植物細胞。

１１、所定の植物細胞において操作可能な遺伝子配列組合せ体であって、 （論）植物細胞において機能するグルタミンシンテターゼについてコードし、第 二の遺伝子配列に操作可能なよ５に結合せしめられた第一の遺伝子配列（ｂ）　 上記組合せ体が他の状態において除草性Ｇ８阻害剤感受性である植物細胞に存在 している場合（−該細胞が該除草性ＧＳ阻害剤に対して実質的に面性となるよう Ｋ、上記第一の遺伝子配列の発現しベルを増加させることができる第二の遺伝子 配夕を含んで構成される遺伝子配列組合せ体。

／コ、第二の遺伝子配列がプロモーターである１、請求σ範囲第１／項記載の遺 伝子配列組合せ体。

／Ｊ、植物細胞のゲノムにおいて組合わされている、請求の範囲第１／項又は第 １２項記載の遺伝子配列塩合せ体。

１４Ｉ−、アグロバクテリウム・ツメフ〒シェンスので１ンラスミドに存在して いる、請求の範囲第１／項又←づ第１２項記載の遺伝子配列組合せ体。

ｌ！、除草性ＧＳ阻害剤がＰＰＴである、請求の範囲算ＩＩ項又は第７２項記載 の遺伝子配列組合せ体。

／６．請求の範囲第７、コ、３、Ｊ、Ａ又は７項記載シ細胞を含んでなる除草性 ａＳ阻害剤耐性植物。

１７゜除草性ａＳ阻害剤がＰＰＴである、請求の範囲第１６項記載の植物。

／ｒ、請求の範囲第２項記載のｍＦＩｊｌを含んでなる植物。

ｌり、除草性Ｇ８阻害剤耐性を他の状態において除草性ＧＳ阻害剤感受性である 植物細胞に付与するためら方法であって、 上記感受性植物細胞に存在する野生型ＧＳ遺伝子の複製物を増加させることを特 徴とする方法。

）’！、　２σ、除草性ＧＳ阻害剤耐性がＰＰＴ耐性である、請求針　の範囲第 １９項記載の方法。

Ｌ／　、２／、除草性ＧＳＳ阻害剤性性植物細胞に付与するため列　の方法であ って、 上記細胞を請求の範囲第１／項記載の遺伝子配列の　組合せ体によシ形質転換さ せることを特徴とする方法。

清　２２．除草性Ｏ８阻害剤がＰＰＴである、請求の範囲第＠　２１項記載の方 法。

２３、除草性ａＳ阻害剤感受性植物を植物制御量の除草プ　性ＧＳ阻害剤と接触 せしめることからなる除草性Ｇ・１　Ｓ阻害剤感受性植物の選択的制御方法であ って、上記接触が請求の範囲第７６項記載の除草性ＧＳ屏　阻害剤耐性植物にも 同時に接触させながら実施せしめられることを特徴とする方法。

７）　−弘、除草性ＧＳ阻害剤がＰＰＴである、請求の範囲第２３項記載の方法 。

容２Ｚ、グルタミンシンテターゼについてコードする遺伝子配列を含んで構成さ れる組換えＤＮＡ分子。

、コロ、植物細胞を形質転換することができるビヒクルで生　ある、請求の範囲 第２を項記載の分子。

Ｏ２７，グルタミンシンテターゼについてコードする遺伝子配列を含んで構成さ れる組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡＦ−）分子でありて、 上記グルタミンシンテターゼが下記のポリペプチド式を含むものであることを特 徴とする組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）分子。

Ｍｅｔ−６ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−ＡＳｐ−Ｌｅｕ−１１ｅ−ＡＳｎ− ’Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−ＧＬｕ−Ｔｈｒ−’Ｉ’ｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌ ｙｓ−１１ｅ−工１ｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−’Ｉ’ｙｒ（ｌｅ−Ｔｒｐ−工１ｅ− Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−５ｅｒ− Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ− Ｔｈｒ−−′Ａｓｐ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇｉｎ　−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔ ｒｐ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇ ｌｎ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａ　１− 　Ｉ　ｌｅ−工１ｅ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−工１ｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙ ｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−工１ ｅ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ−’ｒｙｒ−’ｒｈｒ− Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−工１ｅ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ− Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ　−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−’Ｌｙｓ−工１ｅ−Ｐｈ ｅ−５ｅｒ−ｆ！１ｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｖ ａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ　−Ｇｌｙ−工１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ− Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−１１ｅ−Ａｓｎ− Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＧＬｙ−Ｇｌｙ− Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ− Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ− Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−工１ｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−６ｅｒ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ− Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（ｌｅ−Ａｓｎ−工 １ｅ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−工１ｅ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｐ ｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐ ｒｏ−５ｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−１１ｅ−５ｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇ ｌｕ−１１ｅ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｒｑ−Ｔｙｒ−工１ｅ−Ｌｅｕ−Ｇ Ｌｕ−Ａｒｇ−工Ｌｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖ ａｌ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−工１ｅ−Ｌ ｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｈ ｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ａ ｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−ＧＬｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−工１ｅ−Ｌ ｅｕ−Ｔ、＋ｙｓ−Ａｌａ−工１ｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ −Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−１１ｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｙｒ −Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ −Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ　−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−工１ｅ−Ａｓ ｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−ＧＬｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｒ ｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−５ｅｒ（ｌａ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｓｐ −Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ −Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ −Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ｍｅｔ−１１ｅ −Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−工１ｅ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒ。

明　細　書 除草性グルタミンシンテターゼ阻害剤に対して耐性がある植物細胞 技術分野 本発明は植物細胞を形質転換するための組換えＤＮＡ技術の応用に関し、更に詳 しくは、ホスフィノ）　ＩＪシンのような除草性植物グルタミンシンテターゼ阻 害剤に対して耐性がある植物細胞のデザインと構成とにグルタミンシンテターゼ （ＧＳ　）は、アンモニアの同化及び窒素代謝の調節において中心的役割を果た す植物酵素である。はとんどの植物において、グルタミンシンテターゼは、グル タミンシンテターゼ／グルタミン酸シンターゼ経路（第７図）を介して硝酸塩還 元、アミノ酸分解又は光呼吸によシ放出されるアンモニアを解毒化する唯一の有 効な手段であるため、植物は有効なグルタミンシンテターゼ阻害剤に対して感受 性が強い。

現在知られている最も有効なグルタミンシンセターゼ阻害剤の一つは、ホスフィ ノトリシン（１）（以下、ＰＰＴという）： ＯＯＨ である。

ＰＰＴはグルタミン酸類似体である。この化合物は、ストレプトミセス・ピリド クロモゲネス（Ｓｔｒ＊ｐｔｏｍｙｅｓｓｖｉｒｉｄｏｅｈｒｏｍｏｇｅｎｓ＋ ｓ　）　（バイエル１イーら會ゞルベチカ０キミカ・アクタ、第ｊｊ巻、第２２ μ頁、／９７２年（Ｂｕｙｅｒ、　ＴＦ：、ａｔ　ａｌ、、　Ｈｅ１ｖ＠ｔｌｅ ａ　Ｃｈｌｍｌｃｍ　Ａｃｔａ。

ｚｓ：２２４Ａ（ｔり７コ））、及び、西独特許公開公報筒コア７７弘４ＡＱ号 、ヘキスト・アー・ゲー（！（ｏｅｅｈｓｔ　、　Ａ、　Ｇ、）参照〕から産生 されるトリペプチド抗生物質から当初は単離された。ＰＰＴは、Ｋｌ　が０．０ ０！９ｍＭの、大腸菌由来グルタミンシンテターゼに対する有効な競合的阻害剤 である。

シェベルドル・エフ（Ｓｃｈｗｅｒｄ命１ｅ、　Ｆ、　）　（植物の病気と植物 の予防に関する本（Ｚａｉｔｓｅｂｒｉｆａ　ｆｕｒＰｆｌａｎｚｅｎ　−Ｋｒ ａｎｋｂｓｉｔｅｎ　ｕｎｄ　Ｐｆｌａｎｚｅｎｍｅｈｕｔｚ　）、第り巻、第 弘Ｊ／−ａ４！ｏ頁、／９１／年〕は、ｐｐＴは、最小の耕作面積であって、直 接条播きしている果樹園、ブドウ園及び農園において望ましくない単子葉類及び 双子葉類植物を制御するための、更には収穫介助物としての、非選択的葉類除草 剤であることを明りカ及び日本での野外試験では、はとんどの双子葉類が十分に 制御されることを示した。単子葉類の場合は、やや多い量が、良好な制御のため Ｋは必要であった。

リーズン・エム（Ｌｅｓｓｏｎ、　Ｍ、　）ら〔植物化学（Ｐｈｙｔｏｅｈｅｍ ｌｓｔｒｙ　）、第２ノ巻、第１１！−１１７頁、／？ｒ２’４〕は、ＰＰＴは 、見かげ上のに１値が０．０７３ｍＭの、エントウ葉グルタミンシンテターゼに 対する混合型競合的阻害剤であることを明らかにした。

ＰＰＴ、並びにその他のＧＳ阻害剤に対する耐性を、選択された植物に付与する ことが可能であることが非常に重要となろプが、その理由は、除草選択性があら ゆる市販の除草剤において非常に乏しいからである。

上記ＰＰＴは非選択性である。

他の化合物に対して耐性があるグルタミンシンテターゼについての存在例がある 。メチオニンスルホキシミン（ＭＳＯ）はも５一つのグルタミン酸類似体であっ て、エンドク葉グルタミンシンテターゼの混合型競合的阻害剤（Ｋｌ値Ｏ，ｚｘ ｍＭ）であることが知られている〔リーズン・エムら、植物化学、第λ）巻、第 ｒ！！−ｒ！７頂、ｉｙｒコ年（Ｌｅｓｓｏｎ、　Ｍ、、　ａｔ　ｍｌ、。

ＰｈｙｔｏｃｈｓｍＬａｔｒｙ　２　／　：　ｒ　ｊ　ｊ　−ｒ　ｊ　７　（／ りｊ４））〕。ミラー豐イーｅニス（Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｅ、Ｓ、　）及びブレン チレイ・ジェイ・イー（Ｂｒ＠ｎｃｂｌｅｙ、　Ｊ、Ｅ、　）　（ザ・ジャーナ ルーオブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２５ル巻、第１／３０７−ｌ／７ ２７頁、ｌり１１年（Ｔｂｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　 Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２ｒ６’、ｌ／３０７−／／３２／（／９１／））”Ｊは、 ＭＳＯ耐性である数種のサルモネラ変異体の性質について研究した。ある変異で は、アンモニア結合領域におけるグルタミンシンテターゼを明らかに変化させて 、ＭＳＯ耐性を付与せしめた。更に最近になると、ヤング（Ｙｏｕｎｇ　）及び リンゴールド（Ｒｌｎｇｏｌｄ　）　（同上、第ｉｒｒ巻、第１／２４０−／／ ＪＡＡ）ｉ、ｌ／ｌｒＪ年〕は、ＭＳＯ存在下で増殖したマウスＪＴＡ細胞はそ れに対する耐性を更に高めた、と報告した。ＭＳＯ討性紙性細胞ルタミンシンテ ターゼについてのｍ　ＲＮ　Ａを増加させたが、著者らはこの観察結果が遺伝子 増幅を意味することを示唆した。更Ｋ、サンダース及びウィルソン、ＥＭＢＯ， ジャーナル、第３巻、第Ａｊ−７／’ｊｉ、／９ｒ参年（５ｅｎｄｅｒｓ　ａｎ ｄ　Ｗｌｌｓｏｎ、　ＥＭＢＯ。

Ｊ、、Ｊ　：ｘｔ−７／　＜ｔｙｒｅ））参照。Ｌ　カＬ、　ナカう、ミラー、 ヤングのみならず、す／ダースの研究でも植物Ｇ３については報告していなかっ た。

更に１本発明以前においては、植物細胞のグルタミンシンテターゼ遺伝子を操作 するととによって、ＰＰＴのよ５な除草性ＧＳ阻害剤に対する耐性を付与せしめ る試みに関しての研究は報告されてぃなかった。

したがって、上記細胞の植物グルタミンシンテターゼ遺伝子を操作することによ りて、ＰＰＴのよ５なＧＳの除草性阻害剤に対して耐性がある植物細胞を開発す ることが望まれるのである。このような方法により、所定のあらゆる植物に対し て除草選択性を付与することが可能になるであろう。

発明の開示 本発明は、植物におけるＰＰＴ耐性がグルタミンシンテターゼの過剰生産によシ 生じ得るという発見から生まれたものであって、その現象は初期の実験によると 基本的な遺伝子増幅機構に起因していることが示された。組織培養された一定の 植物細胞から強制的に選択すると、ＰＰＴ耐性株を単離することができた。耐性 は、しかしながら、ＰＰＴに対する親和性がよシ少ないグルタミンシンテターゼ 構造変異体が存在しているためではなく、むしろ遺伝子増幅と植物細胞中の酵素 濃度を増加させるその他の理由とに基づくものであった。これらの初期観察から 、遺伝子増幅又は遺伝子増幅以外の他の別の機構によりグルタミンシンテターゼ を過剰生産する（このようにして、除草性Ｇ８阻害剤耐性を示す）植物細胞を開 発する本発明の概念が生まれた。

本発明は、したがりて、除草性グルタミンシン７″ターゼ（ＧＳ　）阻害剤に対 して耐性がある植物細胞を産生ずることを基本としており、上記耐性は、他の状 態において除草性ＧＳ阻害剤感受性である植物細胞に存在している場合は、該細 胞を実質的に該除草性ＧＳ阻害剤に対して耐性にするよ５な植物細胞のＧＳ活性 レベルとすることによって生じる。

本発明は各種の方法によって実施することができるため、様々な態様を含んでい る。例えば、一つの態様において、本発明は遺伝子組合せ体をもつ植物細胞を産 生ずることに基づいており、その組合せ体は二Ａ）該植物細胞において機能する グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）Ｋついてコードし、第二の遺伝子配列に操作可 能なように結合せしめられた第一の遺伝子配列、 Ｂ）上記組合せ体が他の状態において除草性ＧＳ阻害剤感受性である植物細胞に 存在している場合は、該細胞が該除草性ＧＳ阻害剤に対して実質的に耐性となる よりに、上記第一の遺伝子配列の発現レベルを増加させることができる第二の遺 伝子配列、を含んで構成される。

本発明は、更に、該第−もしくは第二の遺伝子配列又は双方について異なってい る植物種のゲノム中又は複製染色体外因子中に存在する上記遺伝子組合せ体から なる。

別の態様では、本発明は、相当する除草性Ｇ８阻害剤感受性植物細抱よりも野生 型ＧＳ遺伝子の複製物を著しく多く有することによって極めて増加したＧＳ活性 レベルをもつよ５になった除草性ＧＳ阻害剤耐性植物細胞を産生ずることを基本 とする。この態様では、植物は、細胞培養での強制的な選択ＫＪ））ＧＳ遺伝子 増幅を誘発させて耐性変異体又は株を得、次いで、それを増殖・成長させてカル ス及び十分に成長した植物とし、更にそれを有性生殖させることによって得るこ とができる。あるいは、植物は、耐性ドナー変異体又は株の細胞培養での選択に よりＧＳ遺伝子増幅を誘発させ、次いで、ドナー細胞と適切なアクセプター細胞 とのプロトプラスト融合によって更に増殖・成長し得る形態形成ハイブリッドを 産生させることＫより得ることができる。

もう一つの態様として、相当する感受性細胞よりも野生型遺伝子の複製物を著し く多く有する耐性植物細胞は、多数発現が可能な野生型ＧＳ遺伝子の複製物を複 板可能で適切な染色体外因子又は植物細胞自体のゲノム中に導入することによっ て得ることができる。これは、細胞培養段階又は全体的植物段階で形質転換させ ることによシ実施できる。ＧＳ野生型遺伝子をもつ適切な多数複製物（ｍｕｌｔ ｌｅｏｐｙ　）オルガネラも、著しく多数のＧＳ遺伝子を細胞内に導入させるた めに使用することができる。

本発明は、更に、他の未形質転換状態では除草性ＧＳ阻害剤感受性である、それ 自体が形質転換された除草性ＧＳ阻害剤耐性の植物細胞からなる。除草性ＧＳ阻 害剤耐性である植物全体も含まれる。

本発明は、更に、上記遺伝子情報をもつ植物細胞のための形質転換ベクターとし て作用し、除草性ＧＳ阻害剤耐性を付与することができる中間体ビヒクル、並び に植物細胞に耐性を付与する方法からもなっている。

本発明は、更に、除草性ＧＳ阻害剤感受性植物を、上記方法によって該除草剤に 対する耐性を獲得した植物の存在下でかつ該植物にも同時に接触させながら、植 物抑制量の除草性ＧＳ阻害剤と接触させることＫよシ達成される、植物抑制方法 からなる。

図面の簡単な説明 本発明は添付図面を参考にすると理解し易くなる。

第１図はグルタミンシンテターゼ／グルタミン酸シンターゼサイクルを示し、そ こではＧ５１ｉＡＴＰからＡＤＰ及び無機リン酸への加水分解に伴５反応におい てグルタミン酸及びアンモニアからのグルタミンの形成を触媒することが示され ている。グルタミンのアミド窒素は多くの生合成反応のだめの窒素源を提供して おシ、窒素代謝におけるＧＳに関して中心的役割を果たしている。除草性ＧＳ阻 害剤はＧＳを阻害することによってグルタミンの生合成を妨げ、°これによシア ンモニアの解毒化を妨げる。

第１図は、Ｌ−ＰＰＴが存在せず（○）、更にはＬ−ＰＰＴが２１１１Ｍ（△） 、ｊｏμＭ（・）及び１００μＭ（ロ）で存在する場合における、野生型（ｐｐ Ｔ感受性）アルファルフ丁細胞系の増殖特性について示す。

第３図は、Ｌ−ＰＰＴが存在せず（○）、更にはＬ−ＰＰＴが１００μＭ（△） 、２００μＭ（・）及び１ｏｏｐＭ（ロ）で存在する場合における、変異ＰＰＴ 耐性アルファルファ細抱系の増殖特性について示す。

発明を実施するための最良の態様 下記記載において、組換えＤＮＡ、植物遺伝子技術において使用され、かつ本発 明においても使用されるいくつかの用語は、広く用いられているものである。

明細書及び請求の範囲について明瞭かつ一貫した理解を得るために、このような 用語が意味する範囲とともに下記の定義が与えられる： ヌクレオチド：糖部分、リン酸及び窒素へテロ環式塩基からなるＤＮＡ又はＲＮ Ａのモノマー単位。塩基はグリコシド炭素（ペントースの７７位炭素）を介して 糖部分と結合している。塩基及び糖の組合せ体はヌクレオシドと呼ばれる。各ヌ クレオチドはその塩基によりて特徴づげられる。μ種のＤＮＡ塩基は、アデニン （Ａ）、グアニンＣＧ）、シトシン（Ｃ）及びチミ／（Ｔ）である。μ種のＲＮ Ａ塩基は、Ａ％Ｇ、Ｃ及びウラシル（Ｕ）である。

遺伝子配列：隣接ペントースの３′位及び１位炭素間におけるホスホジエステル 結合によってもう一つと互いに結合したヌクレオチドの直線的配列。

機能的遺伝子配列：配列が十分な長さのポリペプチド配列よりは短いか又は長い かとい５ことには無関係に１望ましい活性をもったポリペプチドについてコード する遺伝子配列。それはまた、“機能的遺伝子”とも呼ばれる。

コドン又はトリブレット：ｍＲＮＡを通じて、アミノ酸、翻訳開始シグナル及び 翻訳終結シグナルをコードする３つのヌクレオチドのＤＮＡ配列。例えば、コド ンＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ，ＣＴＡ及びＣＴＧはアミノ酸のロイシンに ついてコー　ドする。ＴＡＧ、ＴＡＡ及びＴＧＡは翻訳停止シグナルであシ、Ａ ＴＧは翻訳開始シグナルである。

読取り枠：　ｒｎ　ＲＮ　Ａからアミノ酸配列に翻訳する過程におけるコドン群 。翻訳中は、正確な読取り枠が維持されていなければならない。例えば、配列Ｇ ＣＴＧＧＴＴＧＴＡＡＧは、Ｇ％Ｃ又はＴから開始されるか否かによって３通り の読取シ枠もしくは句に翻訳される可能性があるため、３１！の異なるペプチド 産物を生じることがある。

一つの配列は、一つの配列の読取シ枠がもう一つのものと、それらが組合わされ てはいるもののあたかも独立して存在しているかの如く操作可能なように結合さ れている場合にあっては、操作可能な結合状態にある。

転写：機能的遺伝子からｍＲＮＡを産生ずる過程。

翻訳：ｍＲＮＡからポリペプチドを産生ずる過程。

を産生する、転写及び翻訳が組合わされた過程。

クローニングビヒクル：宿主細胞内で複製することができ、ＤＮＡの本質的な生 物学的機能を失な５ことなく決定可能な方法でＤＮＡ配列が切断され得るよ５な １つもしくは少数のエンドヌクレアーゼ認識部位によって特徴づけられ、形質転 換細胞の同定に際しての使用に適したマーカーを含有している、プラスミド、フ ァージＤＮＡその他のＤＮＡ配列。代表例は抗生物質耐性マーカーである。“ベ クター”という用語は、クローニングビヒクルについて用いられることもある。

発現ビヒクル：ビヒクル中に存在してポリペプチドをコードする機能的遺伝子の 発現によってポリペプチドを宿主細胞内で産生させるために特に利用される、ク ローニングビヒクルに類似したビヒクル。

ペロープ又は外被で包まれたＤＮＡ配列を有していてもよい細菌ウィルス。

プラスミド：プラスミドが宿主細胞のゲノム内で複製されるか又は宿主細胞のゲ ノムに組込まれるよ５に完全“レプリコン”を含む非染色体性二重鎖ＤＮＡ配列 。プラスミドが単細胞又は多細胞生物内に存在する場合は、該生物の特性はプラ スミドＤＮＡによって変化又は形質転換させることができる。例えば、カナマイ シン耐性のための遺伝子をもつプラスミドは、以前はカナマイシンに対して感受 性であった細胞を、それに対して耐性がある細胞に形質転換させる。

クローニング；無性生殖によって生物又はＤＮＡ配列の１つに由来する生物又は ＤＮＡ配列を多数得るための方法。

発現制御配列：機能的遺伝子配列と操作可能なように結合された場合に、それら の配列の発現を制御・調節する遺伝子配列。それらは、かかる発現の調節領域を 制御することが知られている配列を含む。それらはプロモーター及びターミネー タ−配列の双方を有する。

植物プロモーター：このよ５なプロモーターと操作可能なよ５に結合されたあら ゆる同種又は異種の遺伝子配列を該植物内で、発現させることができる発現制御 配列。

過剰産生植物プロモーター（ｏｐｐ）：該ＯＰＰで形質転換されていない宿主細 胞内で自然に観察されるレベルよりも実質的に高いＣｍＲＮＡ又はポリペプチド の量から測定される）レベルにまで、操作可能に結合されたあらゆる機能的遺伝 子配列を形質転換植物細胞内で発現させることができる植物プロモーター。

縮重：天然の各アミノ酸が７種以上のコドンでコードされ得るという情報上の性 質。例えば、ロイシンは、ＴＴＧ、ＴＴＡ％ＣＴＡ、ＣＴＴ、ＣＴＣ又はＧＴＧ によってコードすることができる。

本発明の明細書及び請求の範囲において使用される縮重変異体とは、遺伝子コー ドの縮重による本発明のポリヌクレオチドフラグメントのあらゆる変異体を意味 する。例えば、得られる物質が機能的ＧＳ又はその部分についてなおもコードし ている限シ、このような物質は本発明に包含される。

グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）：この酵素の定義は機能本位であって、所定の 望ましい植物内で機能してＧＳサイクルにおいてグルタミン酸をグルタミンに変 えることができ處るあらゆるグルタミンシンテターゼを含む。したがって、その 用語は、遺伝的に形質転換された特定の植物種由来の酵素だけではなく、このよ ５なＧＳが形質転換植物細胞内で機能することができるならば、池の植物種、微 生物その他の真核生物由来のＧＳを含んでいてもよい。その用語は、機能的な部 分的ＧＳフラグメント又はそれらの類似体のように、天然植物ＧＳの全体的構造 の長さよυも長いか又は短かいタンパク質又はポリペプチドを含む。

ホスフィノトリシン（ＰＰＴ　：生物学的活性型の前記式（１）の化合物。それ はＬ−もしくはＤ−型でもり。

Ｌ−型であってもよく、更には、単独でも、あるいはＰＰＴ活性を阻害しない他 の不活性もしくは活性化合物と組合わされてもよい。

本発明は、その最も基本的なレベルにおいては、除草性グルタミンシンテターゼ 阻害剤に対して耐性の植物細胞からなり、ここにおいて、耐性は、他の状態にお いて除草性ＧＳ阻害剤感受性である植物細胞に存在している場合は、その細胞を 除草性ＧＳ阻害剤に対して実質的に耐性にさせることができるようなＧＳ活性レ ベルとすることによシ生じる。

“除草性グルタミンシンテターゼ阻害剤“とい５用語は、所定の植物細胞種のグ ルタミンシンテターゼ活性を著しく減少させ、その結果、植物細胞において除草 効果を発揮する、競合的又は非競合的なあらゆる阻害剤を含んだ意味をもつ。除 草剤耐性の植物細胞又は植物全体は、同一種の野生型（ツ体に対する致命的な除 草性ＧＳ阻害剤濃度であっても、不可逆的なダメージを受けることなく生存する 。通常、除草性Ｇｓ阻害剤耐性が！倍以上増加することが必要と考えられる。し かしながら、この値は植物種及び除草剤毎によって変わる。したがって、本発明 の対象となるいくつかの植物種及び除草剤のすべてについて指標値を与えること は不可能である。このようなイ直は、しかしながら、当業者であれば容易に確認 することができる。

本発明の対象となる除草剤ＧＳ阻害剤としては、ホスフィノトリシン、メチオニ ンスル水キシミン並びにその他のグルタミン酸類似体がある。

グルタミンシンテターゼは、形質転換される特定の植物細胞に由来していても、 又はそれに由来していなくてもよい。必要であるのは、その酵素についての遺伝 子配列が発現せしめられて、最終的植物細胞内で機能的酵素を産生ずることだけ である。このように、本発明は、同ｆ１０ＧＳ遺伝子又は異種のＧＳ遺伝子のい ずれか（及びそれらの各発現産物）を有する植物細胞からなる。広義には、酵素 は他の植物種のものでも、あるいは、微生物又は動物由来の酵素であってもよい 。

好ましくは、植物グルタミンシンテターゼ遺伝子及びそれらの発現産物である。

特に重要なのは、遺伝子操作において宿主として機能する特定の植物種由来のグ ルタミンシンテターゼ遺伝子、即ち同種のＧＳ遺伝子である。本発明のｒ　ＤＮ Ａ分子に利用可能なこのよ５なグルタミンシンテターゼ遺伝子の一つは例２に示 されている。

除草性ＧＳ阻害剤に対し感受性であって、本発明の遺伝子構造体又は方法による 遺伝子操作をうけることができ、しかも該構造体を発現させることができる植物 細胞はすべて、本発明において使用可能である。双子葉類植物の中には、各種の ジャガイモ（ソラタム・ルシコン・エスクシンツム、　Ｌｙｃｏｐｅｒｓｌｅｏ ｎ　ｅａｃｕｌｅｎ−ｔｕｔａ　）　；コシヨウ（カブシクム・アニュム、Ｃａ ｐｓｌｃｕｍａｎｎｕｍｍ　）　、＋　タバコにコチアナ・タバクム、　Ｎ１ｃ ｏ−ｔｌａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ　）　ｔ　各種のアブラナ、特に菜種（ブラシ カ°ナプス、Ｂｒａａａｌｃａ　ｎａｐｕａ　）　、各種の豆果類、例えばアル ファルファ（メジカゴ・サチバ、Ｍ・ｄｌｃｍ−ｇｏ　５ａｔｌｖａ　）、クロ ーバ−（トリホリウム・スペク。

Ｔｒｌｆｏｌｉｕｍ　ａｐｓｅ、）　、大豆（グリシンＮ　ｆｆ　ツクス。

Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｎ＋ａｘ　）　、グランドナツツ（アラキス・ヒボガエア、Ａ ｒａｃｈｌａ　ｈｙｐｏｇａｅａ　）、各種の豆類（ファセオルス・スペク、　 Ｐｂａａｅｏｌｕａ　ａｐｏｃ、　；ビシア・スベク・Ｖｌｃｌａ　ｓｐ＠ｃ＋ ；　ビグナースベク、　ｖｌｇｎａ　ａｐｓｅ、　）、エントウ類（ビスム・サ チブム、　Ｐｉａｕｒｎ　ａａｔｌｖｕｒｎ）、ヒート類のよ５な需根作物（ペ タ・ブルガリス。

Ｂｅｔａ　ｖｕｌｇａｒｉｍ　）、　ニンジン類（ダククス・カロタ。

Ｄａｕｃｕｓ　ｅａｒｏｔａ　）　及びサツマイモ類（イボモエアーバタツス、 Ｉｐｏｒｎｏｅａ　ｂａｔａｔｕｓ　）　が含まれる。

本発明の広範囲な概念の中には、様々な態様が包含される。除草性ＧＳ阻害剤耐 性植物細胞は、様々な機構及び／又は遺伝子構造体のいずれかによってＧＳ活性 を著しく高いレベルで有するよ５になる。

例えば、本発明は、その一つの態様において、２種おいて機能スるグルタミンシ ンテターゼについてコードし、第二の遺伝子配列の下流に操作可能なように結合 せしめられた第一の遺伝子配列、並びに、（ｂ）組合せ体が他の状態において除 草性ＧＳ阻害剤感受性である植物細胞に存在している場合は、該細胞が該除草性 ＧＳ阻害剤に対して実質的に耐性となるように、上記第一の配列の遺伝子生成物 レベルを増加させることができる第二の遺伝子配列、を含んで構成される組合せ 体からなる。

第二の遺伝子配列はプロモーター配列でもエン−・ンサー配列であってもよい。

プロモーターである場合は、ＧＳプロモーターでも他の構造遺伝子のプロモータ ーであってもよい。後のλつの事例ではいずれも、組合せ体に用いられるプロモ ーターは過剰産生植物プロモーターである。そのよ５なプロモーターにおける唯 一の本質的な特徴は、グルタミンシンテターゼの遺伝子配列に操作可能なように 結合された場合において、組合せ体が他の状態において除草性ＧＳ阻害剤感受性 である植物細胞に存在している場合は、その細胞が該ＧＳ阻害剤に対して実質的 に耐性となるよったレベルまで、上記グルタミンシンテターゼの発現を促進する ことができることである。こりよ５に、使用される植物プロモーターの選択は機 能的な観点から決定される。

植物プロモーターは宿主細胞と同種か又は異種である。

該宿主細胞の天然内存型プロモーターはＧＳの過剰産生によって耐性を生じさせ ることができないが、その理由は、このような天然プロモーターは通常使用され る植物制御除草剤濃度で実質的に又は完全に阻害される程度の低いレベルまでし か通常はＧＳ発現を促進できないからである。したがって、本発明の一つの態様 においては、天然プロモーターはＯＰＰで置き換えられる。

使用される０ＰＰＯ中には、リブロースニリン酸カルボキシラーゼ及びクロロフ ィルａ　／　ｂ結合タンハク質の小すプユニツ）（ａａ）のプロモータが含まれ る。

これら２つの遺伝子の発現は、緑色組織の転写レベルで簡単に誘導されることが 示された〔例えば、植物の遺伝子工学、農業の展望、ニー・キャッシュモアー。

ブレナム社、ニューヨーク、ｌり？３年、第コター３？頁（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅ ｎｇｌｎａｅｒｌｎｇｏｆ　Ｐｌａｎｔｓ、　Ａｎ　Ａｇｒｉ−ｃｕｌｔｕｒａ ｌ　Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ、　Ａ、　Ｃａａｈｒｎｏｒｅ、Ｐｌｅｎｕｍ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　／　９’　ｔ　ｊ　、　ｐａｇｅ＠２ター３ｔ）、コラッジ ・ジーら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第、２ｚｒ 巻、第１３タタ頁、１Ｐｙ３年（Ｃｏｒｕｚｚｌ　Ｇ、　ａｔ　ａｌ−、Ｔｈｅ 　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｌｏｌｏ−ｇｌｅａｌ　Ｃｈｅｍｌｓｔｒｙ、　２ ５ｔｈｉ３タタ（ｌＰｒ３））又はダンスミュア−・ビーら、ジャーナル・オブ ・モレキスラー・アンド・アプライド・ジェネティクス。

第λ巻、第２Ｊｒｊ頁、／りｔ３年（Ｄｕｎａｍｕｌｒ、　Ｐ、、　ａｔａｌ、 、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　ＡｐｐＨａｄ　Ｇａｎ ｅ−口ｃｓ、　Ｊ　：コｒ！（／りｒ３））参照。

本発明は、記載された方法に従い修正され、あるいは、除草性ＧＳ阻害剤耐性を 生じさせる他のすべての方法によって修正されたすべての植物細胞にまで拡張さ れる。植物細胞は、単独で、組織培養中で、多細胞植物もしくはその一部の部分 として生きていても、あるいはそ５でなくともよい。未形質転換状態において除 草性ＧＳ阻害剤感受性であるとのよ５な多細胞植物は、その細胞が本発明によっ て耐性にされた場合に耐性となる。

花、種子、葉、枝、果実その池のよ５に植物から得られる部分も、これらの部分 が言及した如く除草性ＧＳ阻害剤耐性細胞からなっている限り、本発明に包含さ れる。特に、植物の部分は生きていてもそうでなくてもよい。したがって、耐性 トマト、ニンジン又はタバコの植物から得られる、全体的に修正されたトマト、 ニンジン又はタバコは、たとえ原種物から分離されていたとしても、本発明に含 まれる。

産生方法及びそこで使用される中間体 様々な方法が本発明の各種態様を実施する際に適用可能である。例えば、除草性 ＧＳ阻害剤耐性が構造ＧＳ遺伝子の複製物を著しく増加させることによりて生じ る場合は、（前記野生型遺伝子の過剰産生とは異なう、）利用可能な方法として 、ＧＳ遺伝子の増幅によシ耐性となる細胞を選択する方法、あるいは多数のＧＳ Ｓ遺伝子複動物ゲノム又は複製染色体外因子中に導入する方法がある。

選択は、適切な培地において、該培地中逐次増量する除草性ＧＳ阻害剤の存在下 で植物細胞を培養することＫよシ実施される。所定の期間、例えば数週間〜数か 月間経過後、除草性ａＳ阻害剤に対する耐性が原種物細胞の数倍もある細胞群を 選択することができる。

例えば、細胞がアルファルファで、阻害剤がＰＰＴである場合は、１年間の逐次 ＰＰＴ増加後、ＰＰＴに対する耐性が原糸の２０倍になったＰＰＴ耐性アルファ ルファ細胞系を得ることができた。耐性系が阻害剤不存在下で数か月間継代培養 された場合は、耐性細胞の比率が徐々に低下していくことが阻害剤含有寒天培地 での培養実験において観察されたが、６か月以上経過後は耐性の高い細胞クロー ンを再選択することがなおも可能であった。これは野生壓細胞の培養によっては 不可能であった。

組織培養によるカルス及び成長植物の再生法は当業者において公知であって、種 間において異なる。例えば、本明細書において参考のために紹介される、シェパ ード、サイエンティフィック・アメリカン、／り２２年（５ｈｅｐｅｒｄ　、　 ５ｃｌｅｎｔｌｆｌｃ　Ａｒｎｅｒｌｅａｎ　、　／２ｒりを参照。一般に、多 数のＧＳ遺伝子複製物を含有するか又は遺伝子配列組合せ体を含有するプロトプ ラスト悲濁液が最初に調製される。胚形成は、次いで、天然胚として成長し発芽 する段階まで、プロトプラスト懸濁液から誘導することができる。培地は一般に 、各種のアミノ酸類及びオーキシン、サイトカイニンのよ５なホルモン類を含有 する。特にトウモロコシ及びアルファルファのような種については、培地にグル タミン酸及びプロリンを加えることが有利である。地上部及゛び地下部は通常同 時に成長する。効果的な再生は、培地、遺伝子凰及び培養物の由来によって圧右 される。

これら３種の不定要素が制御される場合は、再生は十分に再現及び繰返しが可能 である。

タバコ、アルファルファ、ジャガイモ、トマト、ペチ、エア、大豆、菜種、並び に数種の果樹類及びニンジン類のような数種類の遺伝子型に関する再生について は、従来の技術で十分に明らかにされてきた。このような再生は、適切な遺伝子 型及び由来を有するものがスクリーニングで選択された場合、当業者にとって満 足すべきものとなる。一般に、約１年以上の継代培養後は、植物再生能は所定の 細胞培養のときよりも低下する。したがって、再生は、一定期間の適切な耐性細 胞培養後直ちに開始された場合が、通常は最も好結果が得られる。

あるいは、数か月又は７年以上経過した細胞培養物について特に実施する場合は 、増幅ＧＳ遺伝子は交配及び／又は融合によって再生系に導入することができる 。例えば、本明細書において参考のために紹介される、クツキングら、ネーチャ ー、第λり３巻、第２６ｊ頁、ｌり１１年（Ｃｏｃｋｉｎｇ、　ａｔ　ａｌ、、 　Ｎａｔｕｒｅ、　２り３：２６よ（ｌりｒり〕を参照。この方法では、除草性 ＣＳ阻害剤耐性細細胞は選択により得られ、急速に分割する細胞の培養＠ＩＢｉ は当業者に周知の方法によって調製される。プロトプラストはそこから単離され 、好ましくは、完全に不可逆的なダメージをうけないのであれば、宿主細胞を不 活化するために十分な量の放射線が十分な時間照射される。例えば、コ０Ｋｒａ ｄのＸ線照射を利用することが有利である。ドナーグロトプラストに照射した後 、それは適切な感受性細胞のアクセプタープロトプラストと融合される。様々な 方法、例えばポリエチレングリコール融合法、高カルシウム処理法、それらの混 合法又は最近では電気融合法のような方法が、融合体を得るために存在する。融 合開始後は、融合産物が除草性ＧＳ阻害剤耐性であるため、融合産物の選択的増 殖が実施可能となる。特に、もはや形態形成していないドナーが用いられる場合 （即ち、ドナー培養物の生育年月が最初の選択後数か月から／／４以上経過して いるよ５な場合）は、除草性ＧＳ阻害剤含有培地で簡単に選択することができる 。

遺伝物質を植物細胞内に導入するもう一つの方法は、植物の傷ついた葉を形質転 換されたアグロバクテリウ”０ツメフアシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｓｒｌｕｍ 　ｔｕｍｅｆａｃｉａｎｓ）細菌で感染させることである。適切な増殖条件下で は、カルス環が傷のまわりに形成される。カルスは次いで増殖培地に移されて、 地上部及び地下部を形成し、更には植物にまで成長する。あるいは全体的植物に 接木することもできる。

多数のＧＳ遺伝子複製物を植物細胞に導入するための別の方法は、組換えＤＮＡ 技術における当業者間で周知の方法を用いて、機能的ＧＳ（ゲノム又ｃＤＮＡの ）構造遺伝子複製物を自己結合させることである。

それぞれがプロモーターをもった各構造遺伝子は適切なリンカ−によって互いに 操作可能となるように詰合せしめられ、１０〜３０個の各遺伝子の複製物は、一 定の場合において、Ｔｌ　プラスミドのような適切な複製可能な発現ビヒクルに 導入することができる。あるいは、遺伝物質は植物胚細胞内に直接微量注入する ことができる。重子葉類植物の場合に、花粉は耐性を獲得させるようなりＮＡ全 全体は適切な機能的クローンによって形質転換させることができ、その花粉は次 いで有性生殖による子孫金主のために利用される。

勿論、細胞を除草性ＧＳ阻害剤耐性とするよ５なレベルまで所定の細胞のＧＳ活 性を増加させるために利用できるのであれば、他のいかなる方法が利用されても よい。本発明において特に重要なのは、ＧＳ構造遺伝子についてコードする遺伝 子配列と、それから誘導される遺伝子産物の過剰産生が可能なもう一つの遺伝子 配列との操作可能な結合である。この遺伝子配列結合体は例えばＴＩプラスミド によって適切な植物細胞内に導入することができる。

遺伝物質の植物細胞内への導入、特に所謂アグロバクテリウム・ツメファシェン スのａｍ誘発（、ＴＩ）プラスミドの使用による導入は、再現予測が可能な技術 である〔例えば、キャブラン・ニーら、“植物細胞内への遺伝物質の導入”サイ エンス、第ｒｉｇ−ｒ２ｉ頁、ｌりｔ３年／／月（Ｃａｐｌａｎ、人、　ａｔ　 ａｌ、、“Ｉｎｔｒｏ　−ｄｕｃｔｌｏｎ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｌｅ　Ｍｓ＋ｔｅ ｒｉａｌ　１ｎｔｏ　ＰｌａｎｔＣｅｌｌｓ　”　５ｃｉｅｎｃｅ　：　ｒ　／ 　ｊ−１２／　（Ｎｏｖｅｍｂｓｒ、　／りｒＪ））；シェル・ジェイ及びパン ・モンタギ島−°エム、′植物についての天然で実用的な遺伝子ベクターとして のＴｌプラスミドバイオテクノロジー、／９１３年μ月、第１７ｊ−／　、ｒ　 Ｏｆ４　（８ｃｈｅｌｌ、　Ｊ。

ａｎｄ　Ｖａ＋ｓ　Ｍｏｎｔａｇｕ、　Ｍ、、　’　Ｔｈ＠Ｔｉ　Ｐｌｍｇｍｌ ｄ　ａｓＮａｔｕｒａｌ　ａｎｄ　ａｍ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｅｎ・　Ｖｅ ｃｔｏｒ　ｆｏｒＰｌａｎｔｓ”Ｂｌｏ／　Ｔ＠ｃｂｎｏｌｏｇｙ　：　Ａｐｒ ｌｌ　／りｆｆｊ、ｐｐｓ。

１７！−１１０）；ホーシュら、“植物における機能的外来遺伝子の遺伝”サイ エンス、第２３３巻、第弘２６−φりｒ頁、ｌりｒａ年（Ｈｏｒｓｅｈ　ａｔ　 ａｌ、、　”Ｉｎｂｅｒｌｔａｎｅｅ　ｏｆ　Ｆｕｎｅｔｌｏｎｍｆ　Ｆｏｒｅ ｌｇｎ　Ｇａｎ＠ｓ　１ｎＰｌａｎｔｓ　”５ｃｉｅｎｃｅ　：　２３３．　’ Ａｔ＆−４Ａ９ｒ　（／Ｐｒｕ＞＞；フラワー・アール・チーら、プロシーディ ンゲス・オブーザ・ナシ璽ナル・アカデミ−・オプ・サイエンセス・オブｅザー ユナイテッドΦステーツーオブ・アメリカ、第ｒＯ巻、第ｕｒｏ３７ｉ４、／９ １３Ｎａｔｌｏｎｍｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｌｅｎｃ＠ｓ　ｏｆ　ｔｈ ＠　Ｕｎｉｔ＠ｄＳｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍ＠ｒｉｃａ：ｒ　Ｑ　、１ＬｒＯＪ 　（／りＴ３　））；ワトン／ら、“組換えＤＮＡ”ア・シ璽−ト・コース、サ イエンティフィック・アメリカン・プックス、ｌりＴ３年、第１　Ａｄ−／７Ｊ ｌ（Ｗａｔｓｏｎ、　ａｔ　ｓｌ、。

“　Ｒ＊ｅｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｄ　Ｎ　Ａ　″　Ａ　５ｈｏｒｔ　Ｃｏｕｒｓｅ 　。

５ｃｉｅｎｔｌｆｌｅ　Ａｎ＊ｒｉｅａｎ　Ｂｏｏｋｓ、／　ＰＪｒ　Ｊ　、ｐ ｐ、／４４に−／　ｙ　３１　）　；並びに、オールド及びプリムローズ、遺伝 子操作の原理、第二版、ニー書カル・プレス、１２ＩＩ年、第１　ｊ　ｒ　−／ 　！　Ａ　Ｊｉ　（Ｏｌｄ　ａｎｄ　Ｐｒｉｍｒｏｔｅ。

Ｐｒ１ｎｅｌｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｇｅｍ＠Ｍａｎｌｐｕｌａｔｌｏｎ、　２　ｄ　 Ｅｄ、。

Ｕ、　（’ｍｌ、　Ｐｒｅｓｓ、　／　９１１．ｐｐ、　／　３！−／　１６　 ）参照。これらは本明細書中に参考のために参照される〕。

Ｔ１プラスミドは、形質転換細胞の産生に必要なλつの領域を有している。これ らのうち一つは転移ＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）と呼ばれ、腫瘍形成を誘発する。も５ 一つはとルレント領域と呼ばれ、腫瘍の維持ではなくて形成のために必要である 。植物ゲノムに転移する転移ＤＮＡは、その転移能が影響を５汁ないように、多 数の結合ＧＳ遺伝子又は本発明の遺伝子組合せ体を挿入することにより、その大 きさを増加させることができる。腫瘍形成遺伝子がもはや影響しなくなるように それらを除去した場合は、その修正されたＴＩプラスミドは本発明の遺伝子構造 体を適切な植物細胞に移すためのベクターとして使用することができる。挿入さ れる外来ＤＮＡは、Ｔ領域の隣シの末端配列に通常導入される。

特に使用されるＴＩプラスきドベクターは、ｐａｖ３ｒｒｏ、即ち、ツバリンＴ ｌプラスミドＣｊｊの非Ｗ１瘍形成誘導体である（前記キャブランら参照）、こ のベクターはＴ１プラスミドの自然の転移特性を利用している。画一的なりラウ ンゴール表現型を決定する内在Ｔ−ＤＮＡ遺伝子は除去されて、通常使用される クローニングビヒクル（例えば、ｐ　ＢＲＪ２２　）によって置き換えられる。

Ｔ−ＤＮＡの境界領域に含まれるクローニングビヒクル配列は、同一のクローニ ングビヒクルの誘導により複製された外来ＤＮＡを再導入するだめの組換え用相 同領域として機能する。このようなプラスミドで複製された本発明のいずれの遺 伝子構造体も、したがって、相同的配列の１回の組換えによって、ｐＧＶ３ｒ！ ０に挿入することができる。抗生物質耐性マーカーは、組換え体を選択するため に、プラスミドに加えることができる。除草剤耐性マーカーも、勿論、同時に又 は独立して使用することができる。このベクターにツバリンシンターゼ（ｎＯＳ 　）遺伝子が存在していることが、ｐＧＶ３ｒ！０を用いる形質転換の有効性確 認を容易化している。組織培養されたカルスでは、このため、ツバリンの存在に ついて試験することができる。

植物細胞又は植物の形質転換後、形質転換体は、抗生物質耐性又は更に適切には 除草剤耐性のような適切なマーカーの助けをかりて選択することができ、次いで 従来の方法で生育される。タバコにおいて、プロトプラスト単離後３〜ｊ日目の プロトプラスト培養物は、Ｔ−ＤＮＡ領域に前記ハイブリッドＧＳ遺伝子を有す る適切なＴＩプラスミドをもった土壌細菌による形質転換に適している。プロト プラスト由来細胞及び土壌細菌を同時培養した２日後に、植物細胞は、３回、遠 心分離により洗浄し、新しい培地に再懸濁することができる。これによって、は とんどの細菌を除去する。

残った細菌はセホタキシム（弘００〜／、　０００．４ｇ／ｍｌ）のような適切 な抗生物質で殺され、プロトプラスト培地に加えられる。細胞は、それらが目に 見えるほどの細胞凝集物（カルス）を形成するまで、非選択的培地で培養される 。次いで、それらは、すべての野生屋細胞を殺すほどの適度な除草剤濃度を含有 した培地で培養される。組込まれたＧＳハイブリッド遺伝子を発現する形質転換 細胞のみが生存し続けて、増殖する。

これらのカルスは、６−ベンジルアデニン／　ｍｇ／　１　及ヒナフタレン酢酸 ０．　／　ｒｎｇ　／　ｌ含有のムラシゲ（Ｍｕｒｍｓｂｉｇｅ　）及びシェー ブ（Ｓｈｏｏｇ　）−培地に移された場合に、地上部の再生を容易に誘発するこ とができる。地上部は、無ホルモンＭＳ培地に、又は直接パーライトもしくはバ ーミキュライト上に定着させることができ、次いでポットに移される。苗木は温 室ですぐに生長し、除草剤耐性について試験することができる。

カリフラワーモザイクウィルスＣｍ　Ｍ　Ｖ　（ホーン・ヒ（Ｈｏｈｎ、　Ｂ、 　）　ら、“植物腫瘍の分子生物学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｌｏｌｏｇｙ　ｏ ｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｔｕｍｏｒｓ　）　”、アカデミツクΦプレス（Ａｃａｄｅｍ ｉｃ　Ｐｒｅ＋ｓｓ　）　、　二ｍ−ヨ１り、１９１２年、第ｊ弘ターｊ６０貞 ；及び、ホーウェル（Ｈｏｖｅｌｌ　）、米国特許第４４，４ＬＯ７，り！６号 明細書〕のような他の系も利用することができる。　完全ＣＭＭＶウィルスＤＮ Ａゲノムは、細菌中で複製可能な組換えＤＮＡ分子を産生ずる親細菌プラスミド に挿入される。クローニング後、組換えプラスミドは、本発明の遺伝子組合せ体 の挿入のために、組換えプラスミドのウィルス部分において、ランダムに又は独 自のオチドが挿入されてもよい。修正された組換えプラスミドは再度複製されて もよく、更には、大きな遺伝子構造物片をリンカ−の独自の制限部位に導入する ことによシ修正されてもよい。組換えプラスミドの修正ウィルス部分は、次いで 、親細菌プラスミドから除去され、植物細胞又は植物に接種するために使用され る。

このウィルスは、前記ホーウェルの特許に記載されておシ、そこでは、タンパク 質産生を高め、ストレスに対する耐性及び害虫、農薬、窒素固定その他に対する 耐性を高めることができる遺伝子を挿入するためには特に良好であると述べてい る。

通常、望ましいＧＳ配列は、公知の組換え技術によって、互いに又は過剰産生プ ロモーターに、操作可能となるようにイン・ビトロで結合−される。例えば、Ｇ Ｓの構造遺伝子、通常そのゲノム変換体は、その正常のプロモーター及び開始Ａ ＵＧコドン間の領域での制限により、七のよ５なプロモーターから分離される。

例えばりブロースニリン酸カルボキシラーゼの小さなサブユニットとの転写融合 が次いで行なわれる。構造体はしかる後、植物ビヒクルの適切な制限部位に挿入 される。

例えば、ビヒクルとしてＣｍＭＶ　ＤＮＡを用いた場合は、遺伝子構造体は、ウ ィルスＤＮＡの感染性又は植物全体にわたるその移動性を破壊させることなく、 ウィルスＤＮＡ部位に挿入される。このように１構造体は様々な制限部位に挿入 されて、産物を複製し、ウィルスの本質的特性の残存性について調べることがで きるようになる。この方法では、感染性及び移動性について調べることができる ほどの比較的多量の修正ウィルスを迅速に単離することができる。ハイブリッド ＤＮＡプラスミドのウィルス部分が修正された後、修正ウィルスはハイブリッド ＤＮＡプラスミドから除去されてもよいし、更には直線的な形態で直接植物に接 種されても、又は環状に結合せしめられてもよい。

様々な技術が植物細胞をＣａＭＶビヒクルで感染させるために利用できる。若葉 は徐々に損傷され、しかる後ウィルスＤＮＡと接触せしめられてもよい。感染後 、ウィルスＤＮＡは、アリマキ伝播性遺伝子が操作可能である場合は、アリマキ によって伝播されてもよい。機械的技術も利用することができる。あるいは、組 織又は単一細胞が感染されてもよい。

用途 本発明の遺伝子構造物を有するビヒクルの用途は、全体的に除草剤耐性の植物細 胞及び植物を産生ずる際の媒体としてである。このように、本発明の方法によシ 耐性とされた植物細胞だけに限らず、ビヒクル又はベクターのすべては、最終産 物、植物全体の有用性に基づき、それらの有用性が導き出される。

本発明によって阻害剤耐性となった植物全体の有用性は明らかである。そのよう な植物は、耐性ではない植物を制御又は抑制する量の除草剤と接触させた場合、 それに対して耐性である。このことによシ、すべての望ましい植物又は植物群に ついて除草剤処理法を選択することができるようになる。

更に、除草剤に対する耐性は、植物又はその細胞に他の遺伝子を移す場合におい て、選択マーカーとして利用できるようになる。

“除草性ＧＳ阻害剤の植物制御量”という用語は、所定の植物の成長又は発育に 影響を及ぼすことができる除草剤の量を機能的な面で含む意味である。このよ５ に、その量は成長もしくは発育を単に減退又は抑制するのに足シるよ５な少量で あってもよいし、あるいは、その量は感受性植物を不可逆的に破壊するほどの大 量であってもよい。通常、はとんどの双子葉類植物及び草類は０．　ｊ　〜／、 　ｊ　ｋｇ／ｈａ　ｍｌ　（空間へクタール）の割合で制御することができる。

重子葉類植物の場合は、０．１　ｋｇ／ｈａ　ａｉ　〜約２．２ｋｇ／ｈｔｍｌ の割合で通常用いられる。除草剤は、勿論、周知のスプレー法又は散布法によっ て適切な植物と接触させることができる。

例えば、草類の制御のために従来適用されていたｐｐＴによる葉面投与は、本発 明に包含されるＰＰＴ耐性植物に適用することができる。

本発明は、除草性ＧＳ阻害剤感受性の植物細胞又は植物を植物制御量の除草性Ｇ Ｆ３阻害剤と接触させることからなる植物抑制方法をも包含しておシ、その方法 においては、感受性植物細胞又は植物が本発明の除草性ＧＦ３阻害剤耐性植物細 胞又は植物と同時に又はそれらの間に存在しているような状態で接触が行なわれ もこのよ５に、植物群が除草剤耐性植物細胞を有する植物と除草剤感受性植物細 胞を有する植物とからなシ、双方が処理操作中に除草性Ｇ８阻害剤と同時に接触 するような野原又は栽培地においての植物群の葉面除草剤処理は、本発明に包含 される方法である。

ここまで本発明を一般的に説明してきたが、本発明は一定の具体的実施例を参考 にすると一層よく理解されるようになシ、一方かかる実施例は本明細書において 他に指示のない限υ説明するためだけのものであって、限定を加えるためのもの ではない。

例／ ＰＰＴ耐性アルファルフ丁細胞培養物の単離及び特性づゆ 培地中ＪｍＭのＬ−ホスフィノトリシン存在下で増殖することができるアルファ ルファ細胞系を選択しｔ−アルファルファは、単一の単ａｍ胞又はプロトプラス トからの植物全体の再生が容易に達成し得るモデル植物の一つであるとい５理由 から選択された。

ホスフィノトリシン耐性アルファルファ系の選択は液体培地における阻害剤濃度 を逐次増加させることにより実施された。６か月以内で、ホスフィノトリシン耐 性が原細用系よりも少なくとも２０倍になった細抱群を選択した。懸濁培養液中 の充填細胞容量の測定では、野生型細胞が２．ｊＸｌｏ　Ｍのし一ホスフィノト リシンによって完全に阻害されることを示した。耐性細胞は、１×１０　Ｍの化 合物の存在下でもそれが存在していない場合と同様に増殖した（第２図及び第３ 図）。

感受性及び耐性の細胞系の粗細胞抽出物のタンパク質パターンをＳＤＳポリアク リルアミドゲル電気泳動で比較した場合、分子量範囲！Ａｏ〜≠ＪＫＤ　（キロ ドルトン）のポリペプチドのＡ剰産生をＰＰＴ耐性細胞系で観察することができ た。アルファルファの精製ＧＳも同一の分子量をもつ。細塊抽出物の酵素活性を 同時に調べた。耐性細胞の特異的ＧＳ活性は野生型細胞の場合よりも３〜１０倍 高かった。ＰＰＴ耐性細胞系におけるＧＳの特異的活性は、効果的Ｎ２固定をす るマメ科植物のすべての根粒組織のように高いＧＳ活性をもつアルファルファの 根粒組織と同じ大きさのオーダーであるＯ様々な量のホスフィノトリシン存在下 でＧＳ活性を測定すると、両細胞系においてｐｐ’ｒｉｃよる同程度の酵素阻害 を示したことから、ＧＳタンパク質の構造的変化は耐性変異体の選択中に生じて いなかったことが示唆された。

メツセンジャーＲＮＡを、グアニジウムインチオシアネートＲＮＡ抽出法を適用 し、しかる後オリゴｄＴ−セルロースカラムでｍＲＮＡを分離することによって 、野生型及び耐性の細胞から単離した。弘μｇのｍＲＮＡを細胞物質ｉｇ当たり から単離することができた。両細胞系から単離されたｍＲＮＡのイン−ビトロ翻 訳によυ、Ｓ−メチオニン標識化抽出物で得られるイン・ビボパターンと類似し たパターンのポリペプチドを産生させた。このことは、単離されたｍＲＮＡが全 く損傷をうけていないことを示した。イン・ビボでの標識化タンパク質は弘θ〜 ４ＬコＫＤポリペプチドにおける量の点で著しい差異を示したが、イン優ビトロ で翻訳されたタンパク質パターンの点に関する野生型及び変異型細胞系間での差 異はさほどではなかった。

第−及び第二の鎖状ｅＤＮＡをＰＰＴ耐性変異体のｍ　ＲＮ　Ａ群から合成した 。ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの８１切断及びポリＣ−テーリング後、そのＤＮＡをボ１７　 Ｇ−テールのｐＢＲ３２２ベクターＤＮＡに再結合させた。大腸菌ＭＣ１０４／ 株を再現化ベクターで形質転換した。

３、！Ｘ１０個のコロニーを再結合ベクターＤＮＡ／ｌ！Ｉｇ　から得た。コロ ニーの、ｒｏ４はアンピシリン（鳳ｒａｐ　）感受性であり、島ｍｐ感受性クロ ーンの３０％はプラスミドのＰａｔ切断による検出が可能な挿入物を有していた 。挿入物の１０ｅ４はｉ、ｏｏｏ塩基対以上の長さであったＯ ｔ、ｔｏｏ個（１’）コロニーをニトロセルロースフィルター上で増殖させ、フ ィルターを　Ｐで標識化された第一の鎖状ｃＤＮＡプローブで調べたところ、Ｇ Ｓ特異的配列の割合を増加させていた。このようなりローンの中からＧＳ特異的 ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを発見できるものと期待された。根粒のｍＲＮＡから得られた７ 丁セオルス属（Ｐｂａｓｅｏｌｕｓ　）　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリー由来のＧ Ｓ−ｃＤＮＡクローンを外部供給源から人手した。このＧＳ−ｅＤＮＡクローン はｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーの点に関し一つのアルファルファｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ クローンと同一であることが確認でき、そのクローンはファセオルス属Ｇ５−Ｄ ＮＡと強くハイブリッド形成した。

アルファルフ丁ＧＳ−ｅＤＮＡクローンの挿入ＤＮＡを配列化した。アルファル ファ及び７丁セオルス属のＧＳ−ｅＤＮＡを次いでプローブとして用い、野生型 アルファルファ細胞と変異体、即ちＧＳ過剰産生細胞との差異を明らかにした。

ゲノムＤＮＡ全体を、アルファルファの葉、野生型細胞、並びに、ｌ、×ＩＯＭ 、λ×１０　Ｍ及び３Ｘ１Ｑ　ＭのＬ−ホスフィノ）　ＩＪシンの存在下で選択 された耐性細胞系の３種の継代系から得た。ＤＮＡを、ＢａｍＨＩ％ＥｅｏＲＩ 、　Ｈｌｎｄ　ｍ及びこれらのうちの二つの酵素の組合せ体で切断した。切断さ れたＤＮＡのアガロースゲル電気泳動後、ＤＮＡフラグメントをサザン法（５ｏ ｕｔｂａｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ　）によりセルロースフィルター上に移した。

フィルター結合ＤＮＡを、アルファルファ及び７丁セオルス属ＧＳクローンの３ ２ｐ−ａ識化ｅＤＮＡ挿入物とノ・イブリッド形成させた。同一サイズのＤＮＡ を両プローブと−・イブリッド形成させた。一つの支配的なバンドは、１種すべ てのＤＮＡ試料において、同一の強さでアルファルファプローブとハイブリッド 形成する。野生ＷＤＮ人切断切断物ってほとんど目で見ることができない第二の バンドは、耐性細胞系のＤＮＡと強くハイブリッド形成する。最も強度の高い− ・イブリッド形成が高耐性細胞系のＤＮＡで観察されたとい５ことは、耐性獲得 過程におゆるＤＮＡフラグメントの増幅化を示している。アルファルファｃ　Ｄ 　Ｎ　Ａプローツブは、増幅ＤＮＡフラグメントと強くハイブリッド形成し、更 に、より弱い程度で、ＧＳ相同性のある非増幅ＤＮ人とハイブリッド形成した。

変異アルファルファ細胞系がＰＰＴ耐性になった理由を確かめるために、ノザン 法（Ｎｏｒｔｈａｒｎ　ｂｌｏｔｓ　）及びサザン法を、野生似及び変異製細胞 系を用いて繰返した。ノザン法では、野生型由来のグルタミンシンテターゼｍＲ ＮＡＫついて約ｒ倍の増加があることを示した。両細胞系由来のゲノムＤＮＡを 用いてサザン法を実施した場合は、変異アルファルファ細塊系においてグルタミ ンシンテターゼ遺伝子の重複化が明らかに示された。重複化は、−・イブリッド 形成によりて評価されたように、非重複化グルタミンシンテターゼ遺伝子の３〜 ／ｊ倍もあるのである。それはしかも正確な重複化のよ５であるが、即ち、一つ のバンドのみがハイブリッド形成において７〜ＩＩ倍増加したからである。

例λ ＰＰＴ耐性細胞培養物由来グルタミンシンテターゼグルタミンシンテターゼ（ｌ コｎｍａｌ　）を７０％ギ酸／　ｍｌ　Ｋ溶解し、ＣＮ　Ｂ　ｒ　！　ｍｇを加 え、切断を室温で、２≠時間継続した〔クロス、メソッズ学エンザイモロジー、 第７）巻、第２３１−２！！頁、１２６７年（Ｇｒｏｓｓ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　 Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　／／　：ココ１−コ！５（ｔｙｂ７））〕−蒸留水（ Ａｍｌ）　で希釈後、混合物を４回凍結乾燥した。

ＣＮＢｒペプチドの高性能液体クロマトグラフィー逆相高性能液体クロマトグラ フィー（ＨＰＬＣ）を、１７、／９Ｇトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及びθ〜６０ チアセトニトリルの直線的勾配を用い（３０分間；流速ｏ、　！　ｍｌ　／ｍｉ ｎ　）、ａｏ℃でウルトラボア（Ｕｌｔｒａｐｏｒｓ）Ｒｐｓｃ（内径０４ＡＸ ７、ｊ　ｅｍ　）　にて行なった〔ベネクトら、バイオケミカル壷ジャーナル、 第１ｔｔ巻、第ター／Ｊｊｉ、ｌり７７年（Ｂ＠ｎｎｅｔｔ　ａｔ　ｍｌ、。

Ｂｌｏｅｂｅｍｉｅｍｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ、　／　ｔ　Ｉ　ａター／Ｊ（／り７ ７））〕。ＣＮＢｒペプチドを最小容量の０．　／　％　Ｔ　Ｆ人中ＡＭ塩酸グ アニジンに溶解した。いくつかの分離物からのクロマトグラフィー的ピーク物を 手操作で集ヘプールし、凍結乾燥した。ペックマｙ（Ｂ・ｅｋｍａｎ　）　／６ ０検出装置を用い、２　／　４’　ｎｍ　で検出した。

アミノ酸分析 アミノ酸組成を、常時沸騰したＨＣＩ　（０，０２ｊ　ｒｎｌ）中、１１０℃で ２≠時間、密封脱気された管（パイレックス（Ｐｙｒｅｘ■）、培養基、縁なし 、４Ｘｊ（７ｍｍ〕内での試料の酸加水分解後、決定した〔ムーア、ペプチドの 化学と生物学、アンロアーバー・サイエンス、アンロアーバー、ミシガン、第６ ２５’−６ｊＪ貞、ｌり７λ年（Ｍｏｏｒｅ、　Ｃｈｅｍｌｓｔｒｙ　ａｎｄ　 Ｂｌｏｌｏｇｙ　ｏｆＰｅｐｔｉｄｅｓ、　Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ　５ａｌｅｎａ ＠、　Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ。

Ｍｌｃｈｉｇｉｎ、　６コターＡｊＪ（／Ｆ７ｊ）））。コ個のヒエ−レット− パラカード（Ｈｅｖｌｅｔｔ　−Ｐａｃｋａｒｄ　）　Ｊ３りＯ人種分器を装備 したベックマン６３００アミノ酸分析装置、ニンヒドリン及びλチャンネル（４ Ａ弘Ｑ及びｊ７　ｏ　ｎｍ　）　積分を用い、／　００　ｐｍｏｌ／アミノ酸で の信頼値ｌ〜７チ、検出限界２　！　ｐｍｏ！　で、トリプトファン、システィ ン、アスパラギン及びグルタミン以外のすべてのアミノ酸を分析した。分析は各 試料及びバックグランドのコントロールについて３輪！回行なわれた。

タンパク質配列分析 自動エドマン（Ｆ；ｄｍａｎ　）分解を、アブライドーバイオシステムスｔＡ７ ０人配列分析装Ｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ　−ｓｙ＠Ｌ＊ｍ＠ＩＡ　７０　Ａ 　ｍ＊ｑｕｅｎｅａｒ　）で行なった◎配列分析プログラムをガス液体固相ペプ チド及びタンパク質配列分析装置用に作成した〔ヒーーウィククら、ジャーナル ・オブーバイオロジカル“ケミストリー１第２よ６巻、第７９９０−７９９７頁 、１ｙｒｉ年（Ｈｅｗｌｃｋ　ａｔ　畠１．．　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏ ｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｂｓｃａｉｓｔｒｙ。

２！Ａ”、７９９０−７９９７（／９Ｊｒ／））〕。プログラムは、一つの結合 工程（弘弘℃、コＡ　ｍｉｎ　）　ト一つの切断工程（４Ａμ℃、Ａ、７ｍ１ｎ ）とを有する。コーアニリノ＝よ一チアゾリノン誘導体（Ｐｔｈ−アミノ酸）の 自動的変換のために２ｊ％トリフルオロ酢ｍ（ｊＯ℃、ＪＪｆｆｉｉｎ）を用い る。ポリブレン（Ｐｏ１ｙｂｒｅｎｅ■）（／、ｊｍｇ）（タールら、アナライ ティカル・バイオケミストリー、第ｒｐ巻、第６．２−一６２７貞、ｌタ　’　 ｒ　’ｉｉ−（Ｔａｒｒ　ａｔ　ｍ　Ｌ、　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈ ＠ｍ１ｓｔｒｙ。

ｒ４Ａｆｔ、ココ−４Ｊ７（／り７．ｒ））；クラツパー（Ｋｔａｐｐ＊ｒ　） ら、同上、第ｒｓ巻、第１２４−／３／７Ａ、ｌり７ｊ年〕を、タンパク質又は ペプチドの分解前にカートリッジ式のガラスフィルターディスクに加え、配列分 析サイクルを５回繰返して、ポリブレン由来の汚染物質を減少させた。アンギオ テンシンＩＩ（／ｎｍｏｔ）をカートリッジフィルターに加え、分解サイクルを ７０回終了させた。未知物質の配列分析前に、アンギオテンシンの配列分析によ って、配列分析装置におげろ化学的及び機械的操作の評価を行なった。マッコウ クジラアボミオグロビン（７００〜２００ｐｍｏｔ）　のタンパク質配列分析で は、ｌＡ！−ｊｊ４の開始収率、９２〜り３嗟の平均再現収率及び２〜３係の平 均サイクル間差を通常は示した。ノ〜ンクアビラー及びフッド、メンツズ・エン ザイモロジー、ｔｇｙｔ巻、第ｔｔｒｔｈ−弘り３貞、Ｉ？ｒｊ年（Ｈｕｎｋａ ｐｉｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｈｏｏｄ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、タｌ：ａｒｔ、−４Ａｙｉｃ／りｒ３ ）〕により開発されたシステムに基づき、／ｊｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ｊ、ｊ）及びアセトニトリル／メタノールの複合勾耐（タコ、ｊ：ｙ、ｚ、マ／ ｖ）を用いて、すべ【のｐｔｈ−アミノ酸をシアノカラム（０、弘ｔＸコｊ　ｃ ｍ　）　での逆相高性能液体クロマトグラフィーにより同定、した。このＨＰＬ Ｃシステムによシ、主な汚染物質、即ち、ジテオスレイトール付加物、Ｎ−ジメ チル−マーフェニルチオ尿素及びジフェニ〃チオ尿素からｐｔｈ−アミノ酸及び 内部標準（Ｐｔｈ　−Ｇｌｕのメチルエステル）を分離した。メチオニン及びプ ロリンは通常では分離されなかったが、勾配を修正してこれらλつのｐｔｈ−ア ミノ酸を分離した。内部標準（，２ｏｏｐｒｎｏｘ）　を各サイクルでの収集物 に加え、試料をＲＨｌｏｏ−４０−ターにてスピードバック・コンセントレータ −（Ｓｐｅｅｄｖｍｃ　Ｃｏｎｃ＊ｎｔｒｍｔｏｒ　）中で乾燥サセた。乾燥試 料を水／アセトニトリル（１０：２０ｖ／ｖ　）　０．０λｔｍｌｌｃｆｆｌ解 し、その一部（０，０１７ｍ１）（＃３試料のＡＩＤ）を自動的に注入した。ベ ックマン／１，０検出装置を用いて２！≠ｔＩｍ　のＵＶ吸収により　ｐｔｂ− アミノ酸を検出した。

精製の概略図 ９製方法は下記図のように簡潔に要約される：／　００ｇの凍結細胞 凍結された変異アルファルフ丁組織培養細胞１００ｇをト′ライアイスと混合し 、ブレンダーで微細粉末に粉砕した。解凍後、混合物をψ℃で２０分間ｒ、００ ０ｒｐｍで回転させた。上Ｕから硫酸プロタミンを沈殿させ、核酸を除去した。

Ｍｇ５Ｏ１１度を１０ｍＭとし、Ｂ　Ｍ　ｅを７ｍＭとし、ｐＨをＩＮ酢酸でＡ 、ｒに調整しｔム粗抽出物をＨ８Ａ、に結合させた。Ｈ，Ａ、を、ｐＨ７，ｊの １０　ｍ　Ｍ　）リス、０．２　ｒ　Ｍ　Ｍｇ５Ｏ１１及び１０％ｘｆｖンｆリ コールでバッチ毎に５回洗浄した。Ｍｇ５ｏ４濃度をｏ、　ｓ　Ｍまで上げるこ とにより、グルタミンシンテターゼを抽出した。ｐＨ７，ｊの／　ＯｒｒＩＭ　 ）リス、１０ｍＭＭｇ５Ｏζで透析した後、それをＧ−２００カラムに入れた。

良好なグルタミンシンテターゼ活性を示す両分をプールした。ＳＤＳアクリルア ミドゲル及び銀染色により、タンパク質なり５％以上の純度にした。アぐノ酸徂 成では、アルファルファグルタぐンシンテターゼの組成が、公表された大豆由来 のその組成とほぼ同一であることを示した（表１）。

表１ アルファルファグルタミンシンテターゼのアミノ酸組成人１ａ　ｒ４　６．タ　 ｔ、７（±ｏ、ａ）Ａｒｇ　！、６　ｔＡ、０　！、０（±０．ｔ）Ａ　ｓ　ｘ 　１０．＋Ｌ！０．７　１／、ｕ　（±０．６）Ｃｙ　ａ　Ｏ，Ｉ　Ｎ、Ｄ、　 Ｎ、Ｄ。

Ｇｌｘ　１０，０　１０．／　５’、Ｆ（±θ、りＧ　１　ｙ　１０，１！１１ ？、／　／Ｊ！　（±０．７）Ｈｌ　ｓ　コ、　２　Ｊ、　Ａ　ｊ、　／Ｉ　１ 　ｅ　Ａ、Ａ　ｊＡ　ｊ４ｃ（ｆｃｌｌＡ）Ｌｅｕ　６，７　＆、ｊ　７ｊ（± ０．り）Ｌ　７１　ｊ、５Ｆ　ｊ、７　４３　（−ｋＯｏＪ　）Ｍａｔ　／、Ａ 　Ｎ、Ｄ、　０．ＡＣ±。５３）Ｐｂｅ　２，１　２．＆　２−Ｊ Ｐｒｏ　ｔ、／　ｒｊ　ｒ、ｏ（±ｖ、ｇ）Ｓ　＠ｒ　ｊ、４４　７．ｒ　Ａ、 ｊ　（±ｏ、４’）Ｔｈｒ　！、／　４１−、タ　ｊｊ（±０．３）Ｔ　ｒ　ｐ 　／、ｊ　Ｎ、Ｄ、　Ｎ、ＱＴｙｒ　Ｊ、？　０．ｊ　Ｊ、弘（±０．７）Ｖａ ｌ　Ａ、Ｊ　Ｊｒ　殻１１（±１．ｊ）☆アール・エッチ舎マクバーランドラ、 バイオケミカル・ジャーナル、１２７６年、第１ｊ３巻、第！り７−ｔＯ１頁（ Ｒ，Ｈ，ＭｅＰａｒｌａｎｄ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｌｏ　−ｃｂａｍｌｅａｌ　 Ｊｏｕｒｎａｌ　（〕　タ　７３）／！、３：ｊ’１７　−６０ｔ　〕 Ｎ、　Ｄ、　：未削除 ｃ、ｖ、　＝信頼値（標準偏差／平均）配列分析 配列分析における最初の操作を精製された天然タンパク質を用いて開始した。人 手できた配列がなかったとい５ことは、ＮＨ２末端が自然に保護されていたこと を示していた。ＣＮＢｒ切断を行ない、フラグメントをＨＰＬＣで分離した。タ ンパク質のアミノ酸組成で＆転λ〜ｊ個のメチオニンのみの存在を示した。ＨＰ ＬＣで分離されたコ個のＣＮＢｒフラグメントは有用な配列情報をもたらした。

精製されたグルタミンシンテターゼフラグメントの配列分析を次いで行なった。

結果は下記のとお〕である： Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−ｖａｌ−１１ｓ− Ｌｅｕ−Ｌｙｍ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｍ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｉ− Ｌｙｓ−（Ｇｌｕ／Ｈ１ａ）−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｈｌｍ−１１＊−Ａｌａ−Ａｌ ａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎこの配列は、完全変異アルファル ファｃＤＮＡクローンから得た配列の一部に相当する。解明されたタンパク質配 列を次ページに示す。

Ｐｒｏ　＋＋６　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｌｙａ　＾「９　…四　＾１０　＾ １ｏ　Ａｌａ　ＬｙｓＧｌｕ　Ｖａｔ＾Ｉａ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ 　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ＾ｓｎ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　 Ｌｙｓ　Ｓ＠ｒ　Ｍ＠ｔ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　ＧｌｙＬｙＩＩ　 Ｈｌｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　ｌｌｅ　Ａｌａ　＾ｔｏ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　 Ｇｌｕ　（ｌｉｌｙＩＩ＠＾ｓｎ　Ｔｈｒ　Ｐｈ＠Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｖ ａｔ　Ａｌａ）　Ａｓｎ＾ｒｇ　Ｇｌｙ１１ｅＰ＋ Ｐｒｏ　Ｉ Ｔｙｒ　Ｇ ＾ｓｎＧ ＾１ａｓ グルタミンシンテターゼについてコードする機能的ゲノム配列の調製 ゲノムＤＮＡ全体を、ファ七オルス属根粒の該ＤＮＡを得るために利用されたも のと類似したプロトコールによって、アルファルファ組織培養物から得〔クリモ アー・ジェイ・デー及びミツリン・ビー・ジェイ。

フェプスーｖｐ−ズ、第１１１巻＋　＠　’　０７−　ｉ　／　２頁；／りｒ３ 年（Ｃｕｌｌｌｍｏｒｅ、　Ｊ、　Ｄ、、　ａｎｄ　Ｍｉｆｌｌｎ。

Ｂ、Ｊ、、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　／　ｊｌ　：　／　０７−／　／λ （１５’ｒｊ）））、ＢａｍＨＩで全体的に切断した。その物質を次いで酢酸カ リウムのよ〜コＯＳ勾配でサイズ分画し、更にこれをいくつかに分けた。各部分 を次いで７％アガロースゲルにて処理し、上記コード配列グローブのＰａｔ切断 によシ得られたｃ　Ｄ　Ｎ　Ａグルタミンシンテターゼプローブを用いてサザノ 系によりｘべた。

次いで、≠Ｋｂ（キロベース）以上の大きさのフラグメントについてハイブリッ ド形成するものを選択した。

これらをＢＹ−コラムダベクターと結合し、１００゜０００個のファージを培養 し、上記グルタミンシンテターゼｃ　ＤＮＡグローブで調べた。≠つの陽性プラ ークを得た。これらを次いで増殖させ、プラークハイブリッド形成体を３〜μ回 Ｎ製した。精製された≠Ｋｂのゲノムクローンを単離し、Ｍ　／　３　ｍ　ｐり に再結合させた。このクローンを両末端から配列化させた。更に、クローンもＨ ａｅＩ［Ｉで断片化し、ＭＰ−Ｆで継代増殖させ、再度配列化させた。

この方法では、≠Ｋｂの！フラグメント（並びに、ゲノムＤＮＡの切断にょシ得 られるｒＫｂの！フラグメント）を完全に配列化させることができる。これらの 両フラグメントは一緒になって完全な機能的遺伝子となるが、その読取り粋につ いては、手元のタンパク質配列情報、公知のＧＳ分子没及び停止トリプレットの 相対的発現性から、可能な３通シの読取シ枠のいずれであるかが予、測される。

手元にあるＧＳの完全な機能的配列に関しても、同様のことが前記方法のいずれ かによって明らかにすることができる。

ここまで本発明を十分に説明してきたが、本発明の精神もしくは範囲又はそのい ずれかの態様に影響を及ぼさない限シ、構造、産物、方法及び用途について人混 かつ同等の範囲内で同様のことを実施するととができる、とい５よ５に理解Ｉ− て欲しい。

浄書（内容（こ変更なし） ＺンムクＳ’−／０盗　７　／ｐ六：／西変ＦＩＧ、１ ダンＵＺミ５；ンｇブ≦２シシ、グローブ「”７４２ノド浄書（内容（こ変更な し） 日 手続ネ山　正　書　（方式） 昭和６２年１　月２７０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．除草性グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）阻害剤に対して耐性の植物細胞であ って、 上記耐性は、他の状態において除草性ＧＳ阻害剤感受性である植物細胞に存在し ている場合は該細胞を該除草性ＧＳ阻害剤に対して実質的に耐性にさせるＧＳ活 性の植物細胞レベルとすることによって生ぜしめられるものである植物細胞。 ２．ＧＳ活性レベルが、相当する感受性植物細胞よりも著しく多数の野生型ＧＳ 遺伝子の複製物を有する植物細胞によって存在するものである、請求の範囲第１ 項記載の耐性植物細胞。 ３．植物細胞における野生型ＧＳ遺伝子複製物の数が、それにより生じるＧＳ活 性レベルが該細胞を除草性ＧＳ阻害剤に対して実質的に耐性にさせるような数で ある、請求の範囲第２項記載の植物細胞。 ４．植物細胞のＧＳについての野生型遺伝子が実質的に増幅される、請求の範囲 第１項又は第２項記載の植物細胞。 ５．遺伝子配列組合せ体が： （ａ）植物細胞において機能するグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）についてコー ドし、第二の遺伝子配列に操作可能なように結合せしめられた第一の遺伝子配列 （ｂ）上記組合せ体が他の状態において除草性ＧＳ阻害剤感受性である植物細胞 に存在している場合は該細胞が該除草性ＧＳ阻害剤に対して実質的に耐性となる ように、上記第一の遺伝子配列の発現レベルを増加させることができる第二の遺 伝子配列を含んで構成されるものであって、この組合せ体を有する、請求の範囲 第１項記載の植物細胞。 ６．組合せ体が植物細胞のゲノムにおいて組合わされている、請求の範囲第５項 記載の植物細胞。 ） ７．組合せ体がアグロバクテリウム・ツメファシエンスのＴ１プラスミドに存在 している、請求の範囲第５項記載の植物細胞。 ８．除草性ＧＳ阻害剤がＰＰＴである、請求の範囲第１、２、３、５、６又は７ 項記載の植物細胞。 ９．未形質転換状態において除草性ＧＳ阻害剤感受性てある、形質転換された除 草性ＧＳ阻害剤耐性植物細胞。 １０．除草性ＧＳ阻害剤がＰＰＴである、請求の範囲第９項記載の植物細胞。 １１．所定の植物細胞において操作可能な遺伝子配列組合せ体であって、 （ａ）植物細胞において機能するグルタミンシンテターゼについてコードし、第 二の遺伝子配列に操作可能なように結合せしめられた第一の遺伝子配列（ｂ）上 記組合せ体が他の状態において除草性ＧＳ阻害剤感受性である植物細胞に存在し ている場合は該細胞が該除草性ＧＳ阻害剤に対して実質的に耐性となるように、 上記第一の遺伝子配列の発現レベルを増加させることができる第二の遺伝子配列 を含んで構成される遺伝子配列組合せ体。 １２．第二の遺伝子配列がプロモーターである、請求の範囲第１１項記載の遺伝 子配列組合せ体。 １３．植物細胞のゲノムにおいて組合わされている、請求の範囲第１１項又は第 １２項記載の遺伝子配列組合せ体。 １４．アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＴ１プラスミドに存在している 、請求の範囲第１１項又は第１２項記載の遺伝子配列組合せ体。 １５．除草性ＧＳ阻害剤がＰＰＴである、請求の範囲第１１項又は第１２項記載 の遺伝子配列組合せ体。 １６．請求の範囲第１、２、３、５、６又は７項記載の細胞を含んでなる除草性 ＧＳ阻害剤耐性植物。 １７．除草性ＧＳ阻害剤がＰＰＴである、請求の範囲第１６項記載の植物。 １８．請求の範囲第９項記載の細胞を含んでなる植物。 １７．除草住ＧＳ阻害剤耐性を他の状態において除草性ＧＳ阻害剤感受性てある 植物細胞に付与するための方法であって、 上記感受性植物細胞に存在する野生型ＧＳ遺伝子の複製物を増加させることを特 徴とする方法。 ２０．除草性ＧＳ阻害剤耐性がＰＰＴ耐性である、請求の範囲第１９項記載の方 法。 ２１．除草性ＧＳ阻害剤耐性を植物細胞に付与するための方法であって、 上記細胞を請求の範囲第１１項記載の遺伝子配列組合せ体により形質転換させる ことを特徴とする方法。 ２２．除草性ＧＳ阻害剤がＰＰＴである、請求の範囲第２１項記載の方法。 ２３．除草性ＧＳ阻害剤感受性植物を植物制御量の除草性ＧＳ阻害剤と接触せし めることからなる除草性ＧＳ阻害剤感受性植物の選択的制御方法であって、上記 接触が請求の範囲第１６項記載の除草性ＧＳ阻害剤耐性植物にも同時に接触させ ながら実施せしめられることを特徴とする方法。 ２４．除草性ＧＳ阻害剤がＰＰＴである、請求の範囲第２３項記載の方法。 ２５．グルタミンシンテターゼについてコードする遺伝子配列を含んで構成され る組換えＤＮＡ分子。 ２６．植物細胞を形質転換することができるビヒクルである、請求の範囲第２５ 項記載の分子。 ２７．グルタミンシンテターゼについてコードする遺伝子配列を含んで構成され る組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）分子であって、 上記グルタミンシンテターゼが下記のポリペプチド式を含むものであることを特 徴とする組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）分子。【配列があります】発明の詳細な説明